KR102652803B1 - 근육병증의 치료에서 20-히드록시엑디손 및 그의 유도체의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자 근육병증의 치료에서 사용하기 위한, 20-히드록시엑디손 및 그의 유도체에 관한 것이다.
[대표도]
도 1B
[대표도]
도 1B
Description
본 발명은 근육병증, 특히 유전 기원의 근이영양증의 치료를 위한 정제된 천연 20-히드록시엑디손 (20E) 또는 합성 유도체의 용도에 관한 것이다.
근육병증은 근육에 직접 영향을 미치는 질환이다. 근육 관여의 증상 및 메커니즘에 따라 그의 상이한 형태가 있다. 유전성 근육병증 및 후천성 근육병증의 두 가지 범주가 있다.
유전성 근육병증은 다음과 같이 세분된다:
- 진행성 근이영양증 (듀시엔형(Duchenne) 및 베커형(Becker) 근이영양증, 지대형(limb-girdle) 근이영양증 및 안면견갑상완 이영양증(facioscapulohumeral dystrophy), 또는 선천성 이영양증,
- 대사성 근육병증 예컨대 글리코겐증 및 지질증뿐만 아니라 미토콘드리아 근육병증,
- 근긴장성 이영양증 예컨대 스타이네르트(Steinert) 근육병증 (MD1),
- 중심 코어(central core), 네말린, 다발-미니코어(multi-minicore) 선천성 근육병증 또는 중심핵 및 근세관성 근육병증,
후천성 근육병증은 다음을 포함한다:
- 독성 근육병증,
- 염증성 근육병증,
- 내분비 근육병증.
근육병증은 진행성 또는 안정적인 근력 저하로서 그 자체를 나타낸다. 근육병증은 일반적으로 근육량의 손실 (위축)을 특징으로 한다. 질환이 진행되는 동안에, 근육 조직은 점차적으로 섬유 조직에 의해 대체된다 (섬유증).
30 가지가 넘는 형태의 근이영양증이 있으며 이는 특히 영향을 받는 근육의 유형에 따라 상이하다. 근이영양증은 다소 초기에 발병되며 신체의 상이한 부분의 골격근에 영향을 미친다. 일부 경우에, 진행성 호흡기 및 심장 근육 손상이 환자의 기대 수명을 감소시킨다.
근이영양증에는 수십 가지의 상이한 유전자가 관여한다. 가장 흔히, 이들 유전자는 근육 세포의 막에 위치하거나 그에 결합된 단백질의 합성에 책임이 있으며 구조를 유지하고 근육 기능을 위해 필수적인 유전자이다. 예를 들어:
- 디스트로핀은 듀시엔형 근이영양증 (DMD) 및 베커형 근이영양증 (BMD)에 관여하고,
- 칼페인, 디스페를린 및 사르코글리칸이 지대형 근이영양증에 관여하고,
- 메로신, 알파-디스트로글리칸 또는 셀레노단백질 N이 선천성 근이영양증 (CMD)의 경우에 관여한다.
DMD는 가장 빈번한 형태의 근이영양증이다. 그것은 매 3,500명의 소년들 중 1명에게 영향을 미치며 X 염색체에 위치한 디스트로핀 유전자에 영향을 미치는 돌연변이의 결과이다. 덜 심각한 형태인 BMD는 또한 디스트로핀 유전자를 수반하며 매 18,000명의 소년들 중 1명에게 영향을 미친다. DMD는 전체 근육 구조에 영향을 미치는 심각한 유전성 병태이다. 이 질환에서, 근섬유 취약성은 근육 조직 괴사를 유도하는 그의 파괴를 야기한다. 재생 메커니즘이 과도하게 부담되는 경우, 퇴행은 근력의 손실 및 활동 불내성의 유발을 인계받는다 (Barnabei et al. 2011). 이어서 근섬유는 결합 조직에 의해 대체된다 (섬유증). 근력 저하는 3세가 넘은 소아의 하지에 점차적으로 도달한다. 그 후에 상기 질환은 등, 상지의 근육 및 마지막으로 호흡기 근육에서 발생한다.
현재 DMD 및 BMD에 대한 어떠한 치유적 치료도 없으나, 정형외과적 및 호흡기 완화적 치료는 삶의 질 및 생명-위협 위험을 개선한다. 환자 치료는 현재 그의 근육 용량의 최적화뿐만 아니라 심장 및 호흡기 합병증 예방 및 치료를 기반으로 한다. 코르티코스테로이드의 사용은 보행 기간을 평균 2년 연장하는데 도움이 된다. 그러나, 일부 소아는 이 치료에 반응하지 않아 유해 효과, 특히 유의한 뼈 약화를 추가로 야기한다. 부분 심장 보호는 전환 효소 억제제 및 베타-차단제의 조합에 의해 수득된다.
신규 치료는 임상 개발 단계에 있다. 엑손 스키핑은 세포가 정상 단백질보다 더 짧으나, 그럼에도 불구하고 기능적인 형태의 디스트로핀을 생성하도록 강제하는 것으로 이루어진다. 동일한 유형의 추가 접근법은 디스트로핀 합성을 시기 상조로 중단시키는 돌연변이를 무효화하는 것으로 이루어진다. 그러나, 이러한 유형의 요법은 단지, 그의 질환을 야기하는 돌연변이의 정확한 성질에 따라 소수의 환자를 목표로 한다. 마지막으로, 환자에서 짧은 형태의 디스트로핀 (미니-디스트로핀 또는 마이크로-디스트로핀)을 합성할 가능성을 제공하는 유전자 요법은, 신체에 의해 외래인 것으로 간주되는 이들 단백질에 대한 면역 반응의 주요 문제에 직면하고 있다.
팔다리 근력의 비가역적 감소 및 활동 불내성의 발병 외에, 상기 질환의 주요 합병증 중 하나는 섬유증의 발병이며, 이는 특히 심부전을 야기하는 심장에 영향을 미친다 (확장 비대가 동반된다). 이 손상은 환자의 생명을 위협한다. 결과적으로 섬유증의 발병은 근육 기능을 보존하기 위해 차단되어야 하는 비가역적 발달이다. 이러한 의미에서, 치료적 접근법은 하기에 대한 그의 노력에 집중하여야 한다:
- 활동 내성 유지
- 근력 유지
- 및 섬유증의 발병 예방.
피토엑디스테로이드는 폴리히드록실화 스테롤의 주요 패밀리를 나타낸다. 이들 분자는 다양한 식물 종 (양치류, 겉씨식물, 속씨식물)에 의해 생성되며 해충으로부터 이들 식물을 방어하는 데 관여한다.
특허 FR3 021318은 피토엑디스테로이드, 그리고 보다 특히 20-히드록시엑디손 (20E)이, 수많은 약리학적 연구의 대상이었다는 것을 개시한다. 이들 연구는 이 분자의 항당뇨병 및 동화작용 특성을 강조하였다. 근육에서의 단백질 합성에 대한 그의 자극제 효과는 생체내 래트에서 (Syrov et al., 2000; Tth et al., 2008; Lawrence et al., 2012) 및 시험관내 C2C12 마우스 근관(myotube) (Gorelick-Feldman et al., 2008) 상에서 관찰된다. 상기 효과는 단백질 합성을 자극하기 위해 IGF-1에 의해 또한 사용되는 경로인, 단백질 키나제 Akt/PkB를 수반하는 캐스케이드 후에, 리보솜 단백질 p70S6K의 인산화를 수반하는, 번역 수준에서의 효과로 이루어진다.
동물 모델에서 상기에 기재된 효과 중 일부는 훨씬 적은 수많은 임상 연구에서 관찰되었다. 따라서 20-히드록시엑디손은 어린 운동 선수의 근육량을 증가시킨다 (Simakin et al., 1988).
마지막으로, 프랑스 특허 FR3021318은 근육감소증 및 근육감소성 비만의 치료 및 예방을 위한, 20-히드록시엑디손 및 그의 유도체의 용도를 기재한다 (Lafont et al. 2017).
본 발명자들은 20-히드록시엑디손 및 그의 유도체가 근육병증을 앓고 있는 포유동물의 전체(in-toto) 신체 기능(physical performance) 뿐만 아니라 계내 근력을 유의하게 증진시킨다는 것을 밝혀냈다. 전체 신체 기능 및 계내 근력은 각각 이동한 최대 거리에 의해 그리고 앞정강근의 최대 절대 등척력(maximum absolute isometric strength)에 의해 측정되어 결정된다. 이들 효과는 근육병증, 특히 근이영양증을 앓고 있는 포유동물의 이동성을 증진시키는 것을 가능하게 한다.
본 발명은 유전자 변경으로부터 발생한 근육병증의 치료에서 사용되도록 의도된 20-히드록시엑디손 및 그의 유도체에 관한 것이다.
이하에 설명에서, 용어 20-히드록시엑디손 및 그의 유도체는 20-히드록시엑디손, 상기 유도체, 20-히드록시엑디손 및 그의 유도체가 풍부한 식물 추출물, 및 활성제로서 20-히드록시엑디손, 그의 유도체 및/또는 20-히드록시엑디손 및 그의 유도체가 풍부한 식물 추출물을 함유하는 조성물을 의미한다.
20-히드록시엑디손의 유도체는 반합성(hemisynthesis)에 의해 수득된다.
20-히드록시엑디손 및 그의 유도체는 유리하게는 제약 등급으로 정제된다.
보다 특히, 본 발명은 유전자 근육병증에 의해 유발된 근육 기능 장애로부터 발생한 병태의 치료에서 사용되도록 의도된, 20-히드록시엑디손 및 그의 유도체에 관한 것이다.
근육 기능은 가로무늬 골격근 또는 심근의 기능이다.
보다 특히, 근육 기능 장애는 심근 비대이다.
훨씬 보다 특히, 본 발명은 근육 기능이 섬유증의 진행성 발병에 의해 적어도 부분적으로 손상된 임의의 근육병증의 치료에서 사용되도록 의도된, 20-히드록시엑디손 및 그의 유도체에 관한 것이다.
본 발명은, 유전자 변경으로부터 발생한 근육병증의 치료에서 사용되도록 의도된, 20-히드록시엑디손 및 그의 유도체에 관한 것이다.
유전자 변경이란 돌연변이, 뉴클레오티드 삽입 또는 뉴클레오티드 결실로 이해된다.
본 발명은 예를 들어 듀시엔형 근이영양증 (DMD) 및/또는 베커형 근이영양증 (BMD)의 치료에서 사용되도록 의도된 20-히드록시엑디손 및 그의 유도체에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 20-히드록시엑디손 및 그의 유도체는 디스트로핀 유전자 돌연변이로부터 발생한 임의의 근육병증의 치료에서 사용되도록 의도된다.
한 특징에 따르면, 20-히드록시엑디손은 화학식 (I)의 화합물이다:
유리하게는, 화학식 (I)의 화합물은 제약 등급으로 정제된다.
특히, 20-히드록시엑디손은 식물의 추출물 또는 식물의 일부로부터의 추출물이고, 상기 식물은 상기 식물의 건조 중량으로 적어도 0.5%의 화학식 (I)의 20-히드록시엑디손을 함유하는 식물로부터 선택되고, 상기 추출물은 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%의, 화학식 (I)의 20-히드록시엑디손을 포함한다.
제약 등급으로의 정제를 참조한다.
추출물은 이하에 BIO101로 지칭된다. 그것은 추출물의 건조 중량으로 0 내지 0.05%의, 상기 추출물의 제약 적용의 안전성, 이용가능성 또는 효능에 영향을 미치기 쉬운 불순물, 예컨대 미량의 화합물을 포함한다.
본 발명의 특징에 따르면, 불순물은 19 또는 21개의 탄소 원자를 가진 화합물, 예컨대 루브로스테론, 디히드로루브로스테론 또는 포스트스테론이다.
BIO101이 생산되는 식물은 스템마칸타 카르타모이데스(Stemmacantha carthamoides) (류제아 카르타모이데스(Leuzea carthamoides)로도 지칭됨), 시아노티스 아라크노이데아(Cyanotis arachnoidea) 및 시아노티스 바가(Cyanotis vaga)로부터 유리하게 선택된다.
본 발명은 특별히 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%의, 화학식 (I)의 20-히드록시엑디손을 포함하는 스템마칸타 카르타모이데스 뿌리 추출물의 용도에 중점을 둔다.
이 추출물에서, 20-히드록시엑디손은 제약 등급으로 정제된다.
보다 특히, 추출물은 3 내지 15 mg/kg*일의 양으로 투여된다.
가장 특히, 추출물은 성인 환자의 경우, 200 내지 1000 mg/일의 양으로, 1회 또는 복수회의 용량으로, 그리고 소아의 경우, 70 내지 350 mg/일의 용량으로, 1회 또는 복수회의 용량으로 투여된다.
더욱이, 본 발명은 활성제로서 BIO101을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
조성물은 바람직하게는 200 내지 1000 mg의 활성제 (BIO101)를 함유한다.
추가 특징에 따르면, 20-히드록시엑디손의 유도체는 화학식 (II)의 화합물이다:
여기서,
V-U는 단일 탄소-탄소 결합이고 Y는 히드록실 기 또는 수소이거나, V-U는 C=C 에틸렌 결합이고;
X는 산소이고,
Q는 카르보닐 기이고;
R 1 은 기 (C1-C6)W(C1-C6); 기 (C1-C6)W(C1-C6)W(C1-C6); 기 (C1-C6)W(C1-C6)CO2(C1-C6); 기 (C1-C6)A로부터 선택되고, A는 유형 OH, OMe, (C1-C6), N(C1-C6), CO2(C1-C6)의 기; CH2Br 기에 의해 임의로 치환된 헤테로시클릴을 나타내고;
W는 N, O 및 S, 바람직하게는 O, 훨씬 보다 우선적으로 S로부터 선택된 헤테로원자이다.
보다 특히, 화학식 (II)에서:
Y는 히드록실 기이고;
R 1 은 기 (C1-C6)W(C1-C6); 기 (C1-C6)W(C1-C6)W(C1-C6); 기 (C1-C6)W(C1-C6)CO2(C1-C6); 기 (C1-C6)A로부터 선택되고, A는 유형 OH, OMe, (C1-C6), N(C1-C6), CO2(C1-C6)의 기에 의해 임의로 치환된 헤테로시클릴을 나타내고;
W는 N, O 및 S, 바람직하게는 O, 훨씬 보다 우선적으로 S로부터 선택된 헤테로원자이다.
특히, 화학식 (II)의 화합물은 다음으로부터 선택된다:
- 번호 1: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-트리히드록시-10,13-디메틸-17-(2-모르폴리노아세틸)-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-6-온,
- 번호 2: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-트리히드록시-17-[2-(3-히드록시피롤리딘-1-일)아세틸]-10,13-디메틸-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-6-온;
- 번호 3: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-트리히드록시-17-[2-(4-히드록시-1-피페리딜)아세틸]-10,13-디메틸-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-6-온;
- 번호 4: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-트리히드록시-17-[2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페리딜]아세틸]-10,13-디메틸-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-6-온;
- 번호 5: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-[2-(3-디메틸아미노프로필(메틸)아미노)아세틸]-2,3,14-트리히드록시-10,13-디메틸-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-6-온;
- 번호 6: 2-[2-옥소-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-트리히드록시-10,13-디메틸-6-옥소-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-17-일]에틸]에틸 술파닐아세테이트;
- 번호 7: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-에틸술파닐아세틸)-2,3,14-트리히드록시-10,13-디메틸-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-6-온;
- 번호 8: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-트리히드록시-17-[2-(2-히드록시에틸술파닐)아세틸]-10,13-디메틸-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-6-온.
가장 특히, 피토엑디스테로이드는 화학식 (III)의 화합물이다:
이 화합물은 이하에 BIO103으로 지칭된다.
본 발명의 추가 이점, 목적 및 특정한 특징은 첨부 도면을 참조하여, 본 발명에 따른 장치의 적어도 하나의 특정한 실시양태에 대한 다음의 비제한적인 설명으로부터 나타날 것이며,
- 도 1A는 C57BL10 유전자 풀: 건강한 (C57) 및 미처리 mdx (디스트로핀 유전자 상에서 돌연변이됨)로부터의 마우스의 군의 활동 내성의 대표적인 도표이고,
- 도 1B는 2개월 처리 후 마우스의 군: 미처리 mdx, BIO101로 처리된 mdx 및 BIO103으로 처리된 mdx의 활동 내성의 대표적인 도표이고,
- 도 2A는 C57BL10 유전자 풀: 건강한 (C57) 및 미처리 mdx로부터의 마우스의 군의 앞정강근의 최대 절대 등척력의 대표적인 도표이고,
- 도 2B는 2개월 처리 후 마우스의 군: 미처리 mdx, BIO101로 처리된 mdx 및 BIO103으로 처리된 mdx의 앞정강근의 최대 절대 등척력의 대표적인 도표이고,
- 도 3A 및 3B는 2개월 처리 후, C57BL10 유전자 풀: 건강한 (C57), 미처리 mdx, BIO101로 처리된 mdx 및 BIO103으로 처리된 mdx로부터의 마우스의 다양한 군의 심장으로부터의 섬유증 마커 CTGF (결합 조직 성장 인자) 및 Col1a1 (콜라겐 1)의 유전자 발현 (mRNA)의 대표적인 도표이고,
- 도 3C 및 3D는 2개월 처리 후, C57BL10 유전자 풀: 건강한 (C57), 미처리 mdx, BIO101로 처리된 mdx 및 BIO103으로 처리된 mdx로부터의 마우스의 다양한 군의 심장으로부터의 비대 마커 myh7 (베타 미오신 중쇄) 및 BMP4 (골 형태형성 단백질 4)의 유전자 발현 (mRNA)의 대표적인 도표이고,
- 도 4A는 헤마톡실린 에오신 (HE)으로 염색된, 건강한 C57BL10 유전자 풀 마우스 (C57)의 앞정강근의 조직학적 절편의 대표적인 영상이고,
- 도 4B는 헤마톡실린 에오신 (HE)으로 염색된, 미처리 mdx C57BL10 유전자 풀 마우스 (mdx)의 앞정강근의 조직학적 절편의 대표적인 영상이고,
- 도 4C는 헤마톡실린 에오신 (HE)으로 염색된, BIO101로 처리된 mdx C57BL10 유전자 풀 마우스 (mdx+BIO101)의 앞정강근의 조직학적 절편의 대표적인 영상이고
- 도 4D는 헤마톡실린 에오신 (HE)으로 염색된, BIO103으로 처리된 mdx C57BL10 유전자 풀 마우스 (mdx+BIO103)의 앞정강근의 조직학적 절편의 대표적인 영상이고,
- 도 5A 및 5B는 각각 C57BL10 유전자 풀로부터 건강한 (C57) 및 미처리 mdx (mdx) 마우스의 군의 시리우스 레드(Sirius Red) (SR)로 염색된 앞정강근의 대표적인 조직학적 절편이며,
- 도 5C는 C57BL10 유전자 풀로부터의 건강한 (C57) 및 미처리 mdx (mdx) 마우스의 군의 섬유증 구역의 정량화의 대표적인 도표이고,
- 도 5D 및 5E는 BIO101로 처리된 mdx 마우스 (mdx BIO101) 및 BIO103으로 처리된 mdx 마우스 (mdx BIO103)의 군의 시리우스 레드 (SR)로 염색된 앞정강근의 대표적인 조직학적 절편이고,
- 도 5F는 BIO101로 처리된 mdx 마우스 (mdx BIO101) 및 BIO103으로 처리된 mdx 마우스 (mdx BIO103)의 군의 섬유증 구역의 정량화의 대표적인 도표이고,
- 도 6A는 C57BL10 유전자 풀: 건강한 (C57), 미처리 mdx (mdx)의 마우스의 군의 비복근의 섬유증 마커 콜라겐 1 (Col1a1)의, 웨스턴 블롯에 의해 검출된 단백질 발현을 나타내고,
-도 6B는 2개월 처리 후, C57BL10 유전자 풀: 미처리 mdx (mdx), BIO101로 처리된 mdx 및 BIO103으로 처리된 mdx의 마우스의 군의 비복근의 동일한 섬유증 마커의, 웨스턴 블롯에 의해 검출된 단백질 발현을 나타내고
- 도 7A는 근관으로의 근모세포 융합 지수의 대표적인 도표이다. 사용된 인간 근모세포는 DMD를 앓고 있는 환자로부터 수득하였다. 분화 근모세포는 BIO101 또는 비히클로 3일 동안 처리하였고,
-도 7B는 근관당 핵의 수의 대표적인 도표이다. 사용된 인간 근모세포는 DMD를 앓고 있는 환자로부터 수득하였다. 분화 근모세포는 BIO101 또는 비히클로 3일 동안 처리하였고,
- 도 7C는 근관 직경의 대표적인 도표이다. 사용된 인간 근모세포는 DMD를 앓고 있는 환자로부터 수득하였다. 분화 근모세포는 BIO101 또는 비히클로 3일 동안 처리하였고,
- 도 8A 및 8B는 DMD를 앓고 있는 환자로부터 인간 근모세포에서 AKT 및 ERK1/2 단백질의 인산화된 형태의, 웨스턴 블롯에 의해 검출된 단백질 발현을 나타낸다. 분화 근모세포는 10분 내지 24시간의 지속시간 동안에 BIO101로 처리하였다.
- 도 9A 및 9B는 각각 DMD를 앓고 있는 환자로부터 수득한 인간 근모세포의 기저 및 최대 호흡을 나타낸다. 분화 근모세포는 3일 동안 상이한 용량으로 비히클 또는 BIO101로 처리하였다. 세포 호흡은 산소 소비율을 측정함으로써 결정한다.
- 도 10A는 건강한 (C57) 및 미처리 mdx C57BL10 유전자 마우스의 군의 각각의 근섬유를 둘러싼 혈관의 정량화의 대표적인 도표이고,
- 도 10B는 비히클로 처리된 mdx 마우스 (mdx), BIO101로 처리된 mdx 마우스 (mdx BIO101) 및 BIO103으로 처리된 mdx 마우스 (mdx BIO103)의 군의 각각의 근섬유를 둘러싼 혈관의 정량화의 대표적인 도표이다.
- 도 1A는 C57BL10 유전자 풀: 건강한 (C57) 및 미처리 mdx (디스트로핀 유전자 상에서 돌연변이됨)로부터의 마우스의 군의 활동 내성의 대표적인 도표이고,
- 도 1B는 2개월 처리 후 마우스의 군: 미처리 mdx, BIO101로 처리된 mdx 및 BIO103으로 처리된 mdx의 활동 내성의 대표적인 도표이고,
- 도 2A는 C57BL10 유전자 풀: 건강한 (C57) 및 미처리 mdx로부터의 마우스의 군의 앞정강근의 최대 절대 등척력의 대표적인 도표이고,
- 도 2B는 2개월 처리 후 마우스의 군: 미처리 mdx, BIO101로 처리된 mdx 및 BIO103으로 처리된 mdx의 앞정강근의 최대 절대 등척력의 대표적인 도표이고,
- 도 3A 및 3B는 2개월 처리 후, C57BL10 유전자 풀: 건강한 (C57), 미처리 mdx, BIO101로 처리된 mdx 및 BIO103으로 처리된 mdx로부터의 마우스의 다양한 군의 심장으로부터의 섬유증 마커 CTGF (결합 조직 성장 인자) 및 Col1a1 (콜라겐 1)의 유전자 발현 (mRNA)의 대표적인 도표이고,
- 도 3C 및 3D는 2개월 처리 후, C57BL10 유전자 풀: 건강한 (C57), 미처리 mdx, BIO101로 처리된 mdx 및 BIO103으로 처리된 mdx로부터의 마우스의 다양한 군의 심장으로부터의 비대 마커 myh7 (베타 미오신 중쇄) 및 BMP4 (골 형태형성 단백질 4)의 유전자 발현 (mRNA)의 대표적인 도표이고,
- 도 4A는 헤마톡실린 에오신 (HE)으로 염색된, 건강한 C57BL10 유전자 풀 마우스 (C57)의 앞정강근의 조직학적 절편의 대표적인 영상이고,
- 도 4B는 헤마톡실린 에오신 (HE)으로 염색된, 미처리 mdx C57BL10 유전자 풀 마우스 (mdx)의 앞정강근의 조직학적 절편의 대표적인 영상이고,
- 도 4C는 헤마톡실린 에오신 (HE)으로 염색된, BIO101로 처리된 mdx C57BL10 유전자 풀 마우스 (mdx+BIO101)의 앞정강근의 조직학적 절편의 대표적인 영상이고
- 도 4D는 헤마톡실린 에오신 (HE)으로 염색된, BIO103으로 처리된 mdx C57BL10 유전자 풀 마우스 (mdx+BIO103)의 앞정강근의 조직학적 절편의 대표적인 영상이고,
- 도 5A 및 5B는 각각 C57BL10 유전자 풀로부터 건강한 (C57) 및 미처리 mdx (mdx) 마우스의 군의 시리우스 레드(Sirius Red) (SR)로 염색된 앞정강근의 대표적인 조직학적 절편이며,
- 도 5C는 C57BL10 유전자 풀로부터의 건강한 (C57) 및 미처리 mdx (mdx) 마우스의 군의 섬유증 구역의 정량화의 대표적인 도표이고,
- 도 5D 및 5E는 BIO101로 처리된 mdx 마우스 (mdx BIO101) 및 BIO103으로 처리된 mdx 마우스 (mdx BIO103)의 군의 시리우스 레드 (SR)로 염색된 앞정강근의 대표적인 조직학적 절편이고,
- 도 5F는 BIO101로 처리된 mdx 마우스 (mdx BIO101) 및 BIO103으로 처리된 mdx 마우스 (mdx BIO103)의 군의 섬유증 구역의 정량화의 대표적인 도표이고,
- 도 6A는 C57BL10 유전자 풀: 건강한 (C57), 미처리 mdx (mdx)의 마우스의 군의 비복근의 섬유증 마커 콜라겐 1 (Col1a1)의, 웨스턴 블롯에 의해 검출된 단백질 발현을 나타내고,
-도 6B는 2개월 처리 후, C57BL10 유전자 풀: 미처리 mdx (mdx), BIO101로 처리된 mdx 및 BIO103으로 처리된 mdx의 마우스의 군의 비복근의 동일한 섬유증 마커의, 웨스턴 블롯에 의해 검출된 단백질 발현을 나타내고
- 도 7A는 근관으로의 근모세포 융합 지수의 대표적인 도표이다. 사용된 인간 근모세포는 DMD를 앓고 있는 환자로부터 수득하였다. 분화 근모세포는 BIO101 또는 비히클로 3일 동안 처리하였고,
-도 7B는 근관당 핵의 수의 대표적인 도표이다. 사용된 인간 근모세포는 DMD를 앓고 있는 환자로부터 수득하였다. 분화 근모세포는 BIO101 또는 비히클로 3일 동안 처리하였고,
- 도 7C는 근관 직경의 대표적인 도표이다. 사용된 인간 근모세포는 DMD를 앓고 있는 환자로부터 수득하였다. 분화 근모세포는 BIO101 또는 비히클로 3일 동안 처리하였고,
- 도 8A 및 8B는 DMD를 앓고 있는 환자로부터 인간 근모세포에서 AKT 및 ERK1/2 단백질의 인산화된 형태의, 웨스턴 블롯에 의해 검출된 단백질 발현을 나타낸다. 분화 근모세포는 10분 내지 24시간의 지속시간 동안에 BIO101로 처리하였다.
- 도 9A 및 9B는 각각 DMD를 앓고 있는 환자로부터 수득한 인간 근모세포의 기저 및 최대 호흡을 나타낸다. 분화 근모세포는 3일 동안 상이한 용량으로 비히클 또는 BIO101로 처리하였다. 세포 호흡은 산소 소비율을 측정함으로써 결정한다.
- 도 10A는 건강한 (C57) 및 미처리 mdx C57BL10 유전자 마우스의 군의 각각의 근섬유를 둘러싼 혈관의 정량화의 대표적인 도표이고,
- 도 10B는 비히클로 처리된 mdx 마우스 (mdx), BIO101로 처리된 mdx 마우스 (mdx BIO101) 및 BIO103으로 처리된 mdx 마우스 (mdx BIO103)의 군의 각각의 근섬유를 둘러싼 혈관의 정량화의 대표적인 도표이다.
주어진 본 설명은 비제한적이다.
1.
BIO101 정제 공정
BIO101은 하기 단계에 따라, 대략 90% 순수한 20-히드록시엑디손의 제조로부터 제조된다:
a) 메탄올 중 대략 90% 순수한 20-히드록시엑디손의 고온 용해, 여과 및 부분 농축,
b) 3 부피의 아세톤의 첨가,
c) 교반하면서, 0 내지 5℃의 온도로 냉각,
d) 수득된 침전물의 여과,
e) 아세톤과 물로 연속 세정, 및
f) 건조.
이 정제는 산업적 규모로 수행될 수 있는 이 분자에 대한 적합한 재결정화 공정을 수반한다.
단계 a)의 여과는 0.2 μm (마이크로미터) 입자 필터에 의해 수행된다.
단계 a)의 부분 농축은 유리하게는 MeOH의 존재하에, 대략 50℃의 온도에서, 진공 증류에 의해 수행된다.
건조 단계 f)는 대략 50℃의 온도에서 진공 중에서 수행된다.
2.
BIO103 합성 공정
BIO103은 20-히드록시엑디손으로부터의 반-합성에 이어서 하기 제조 공정에 따라 제약 등급으로 정제하여 수득한다:
3 단계의 BIO103 합성 도표:
1) 탄소 C20과 C22 사이의 20-히드록시엑디손의 측쇄의 산화적 절단으로 포스트스테론의 수득 (관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 프로토콜),
2) 위치 C21에 브로민 원자의 도입,
3) 브로민화 유도체와 에탄-티올의 반응.
3.
BIO101 및 BIO103의 생물학적 활성
시판 제제에 존재하는 20E의 동화작용 효과는 어린 동물에서 이미 입증되었지만, 섬유증의 진행성 발병이 근육 기능 장애의 한 원인이 되는 근육병증을 앓고 있는 포유동물의 맥락에서 20E의 효과는 공지되어 있지 않다. 디스트로핀 유전자 상에 돌연변이가 존재하는, C57BL10 유전자 풀로부터, mdx 마우스를 사용한 듀시엔형 근육병증의 동물 모드가 사용되었다 (Bulfield et al. 1984; Sicinski et al. 1989).
찰스 리버스(Charles Rivers)에서 생산된, 12주령의 C57BL10 유전자 풀 (도면에서 "C57"로 지칭되는 야생 마우스) 및 C57BL10 mdx (도면에서 "mdx"로 지칭되는 듀시엔형 근이영양증의 마우스 모델) 수컷 마우스를 사용하였다. 두 군의 mdx를 50 mg/kg*일의 용량으로 BIO101 (마우스의 수 n=9) 또는 BIO103 (마우스의 수 n=9)에 경구로 만성적으로 노출시켰다. C57 마우스의 군 (마우스의 수 n=5) 및 mdx 마우스의 군 (마우스의 수 n=15)은 비히클을 받았으며, 즉 처리는 없었다. 모든 군의 동물을 2개월 처리 후 그들의 기능적 능력에 대해 시험 (활동 내성 시험)하였다. 활동 내성 시험은 이동한 최대 거리를 측정하는 것으로 이루어진다 (전체 활성: 도 1A 및 1B). 더욱이, 앞정강근의 최대 절대 등척력의 측정은 2개월 처리 후에 이루어졌다 (계내 활성; 도 2A 및 2B)
2개월 경구 처리는 1주 5일 동안의 강제 급식 및 1주 2일의 식수로 이루어졌다.
활동 내성 시험 (전체 기능성 연구: 도 1A 및 1B)
활동 내성 시험은 강제 모터 트레드밀 운동이다. 이는 전체 골격 기능을 평가하기 위한 비침습적 방법이다. 이는 관련 분야에서 골드(gold) 표준 방법이다 (Ferry et al. 1992, 1993; Hadj-Said et al. 2012).
동물의 순응 기간은 최대 러닝 거리가 측정되는 세션 이전 적어도 48시간이었다. 시험 동안에, 마우스는 전동 트레드밀 상의 러닝 회랑(running corridor)에 배치하여 그의 강도 및 지속시간에서 시험자에 의해 제어되는 운동을 가능하게 하였다. 트레드밀은 동물이 그리드(grid)와 1초 초과로 접촉하면 감전 (0.4 mA)을 투여하는 수평 그리드로 종료되었다.
러닝 세션은 2분의 웜-업 기간으로 시작하며 이 기간 동안 속도는 0에서 20 cm/s로 증가시켰다. 그 후, 러닝 속도는 10분마다 5 cm/s씩 마우스의 최대 용량의 한계까지 증가시켰다. 10초 미만 내에 5회 충격을 받으면, 시험을 중단시켰다. 이동한 거리를 기록하였다.
예상한 바와 같이, 디스트로핀 유전자 상에 돌연변이 (mdx)가 존재하는 동물은 건강한 동물 (C57)보다 유의하게 덜 달리는 것으로 관찰되었다 (-80.4%, p<0.001, 만 휘트니(Mann Whitney) 검정) (도 1A). 2개월의 매일 노출 후 (도 1B), BIO101 또는 BIO103을 받은 mdx 동물은 비히클을 받은 mdx 동물보다 유의하게 더 많이 달렸다. BIO101 및 BIO103은 미처리 mdx 동물 (비히클)의 이동한 거리와 비교하여, 각각 +136% 및 +67% 만큼 이동한 거리를 유의하게 개선시켰다 (각각 p<0.001 및 p<0.05, 비쌍형성(unpaired) t 검정). 중요하게도, 본 발명자들은 mdx 동물을 BIO101 또는 BIO103으로 처리하는 것이 디스트로핀 유전자 돌연변이 (mdx)를 가진 동물에서 관찰된 유의한 기능적 손실을 부분적으로 보상한다는 것을 본원에서 입증하였다. 근육병증을 앓고 있는 동물의 전반적인 신체 기능 체격 (전체 활성)은 BIO101 (2.4배) 및 BIO103 (1.7배)에 의해 매우 유의하게 개선되었다.
본 연구는 BIO101 또는 BIO103으로 처리하는 것이 동물 근육병증 모델에서 활동 내성에서의 유의한 개선을 특징으로 하는 기능적 개선을 발생시킨다는 것을 입증한다 (도 1A 및 1B).
앞정강근의 최대 절대 등척력 (계내 기능성 연구: 도 2)
앞정강근의 계내 수축성의 평가는 프로토콜의 종료시, 즉 2개월 처리 후 수행하였다.
희생 당일, 마우스는 앞정강근 (TA)의 계내 강도를 측정하기 전에 펜토바르비탈 (55 mg/kg, 0.1 mL/10 g의 체중)의 복강내 주사로 마취시켰. 발의 최상부의 피부 상에서 절개를 수행하여, 그의 원위 말단에서 커팅된 힘줄을 드러냈다. TA의 원위 힘줄은 서보모터 레버 (305B 듀얼-모드 레버(Dual-Mode Lever), 오로라 사이언티픽)에 부착시켰다. 허벅지의 측면 피부 상에 절개를 수행하여, 2개의 근육 군 사이에 좌골 신경을 드러냈다. 좌골 신경은 양극성 전극 (10V, 0.1 ms의 최대초과 구형파 펄스)으로 자극시켰다. 강도는 전기적 자극 (주파수 75-150 Hz, 지속시간 500 ms)에 반응하는 수축 동안에 측정하였다. 마우스의 온도는 방사 램프를 사용하여 37℃로 유지하였다. 최대 절대 등척성 강직성 강도(isometric tetanic strength)를 측정하였다.
예상한 바와 같이, mdx 동물은 건강한 C57 동물의 것보다 유의하게 더 낮은 최대 절대 등척성 수축 (p<0.05, 비쌍형성 t 검정)을 갖는 것으로 관찰되었다 (도 2A). 2개월 처리 후, 비히클을 받은 mdx 동물과 비교하여 50 mg/kg*일의 용량으로 BIO101로 처리된 mdx 동물 (+15.3%, p<0.05, 비쌍형성 t 검정) 및 BIO103으로 처리된 mdx 동물 (+22.5%, p<0.001, 비쌍형성 t 검정)에서, 앞정강근의 최대 절대 등척력의 유의한 증가가 관찰되었다 (도 2B).
본 연구는 BIO101 또는 BIO103으로 처리하는 것이 동물 근육병증 모델에서 앞정강근의 최대 절대 등척력에서의 유의한 증가를 특징으로 하는 기능적 개선을 발생시킨다는 것을 입증한다 (도 2A 및 2B).
심근 섬유증 및 심장 비대 (분자 연구: 도 3A, 3B, 3C, 3D)
섬유증 및 심장 비대의 마커의 평가는 프로토콜의 종료시, 즉 2개월 처리 후 수행하였다. 희생 당일, 마우스는 참수에 의해 안락사시키고 심장은 제거한 다음에 액체 질소에서 즉시 냉동시켰다. 전체 RNA는 TRIzol® 용해 시약 (라이프 테크놀로지즈(Life technologies)) 및 조직 균질화기 (바이오-겐(Bio-Gen) PRO200))로 추출시켰다. 추출물 RNA는 분광광도법에 의해 정량화시킨 다음에 그의 품질은 익스페리온(Experion) RNA StdSens 분석 키트 (바이오-라드(Bio-Rad))로 검증하고 실증하였다. 그 다음에 cDNA는 리버트에이드(RevertAid) 퍼스트 스트랜드(First Strand) cDNA 합성 키트 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))로 합성하였다. 마지막으로, 반-정량적 PCR 분석을 SYBR® 그린(Green) (로슈(Roche)), DNA 중격제 및 라이트시클러(LightCycler)® 480 실시간 PCR (로슈) 장치를 사용하여 384-웰 플레이트 상에서 수행하였다. 측정된 분자 마커는 다음과 같았다:
- CTGF 및 콜라겐 I: 결합 조직 성장 인자 (CTGF)는 치유와 그리고 DMD를 포함한 많은 병리학적 섬유증 과정과 연관이 있다 (Brigstock 2010; Song Y. 2017). CTGF의 증가된 유전자 발현은 mdx 마우스에서 심장 섬유증과 연관이 있다 (Au 2011). CTGF는 심장 섬유모세포에서 콜라겐 합성 (이 중 콜라겐 I)을 자극하고 심근 섬유증의 한 원인이 된다 (Wang 2010).
- myh7: 베타 미오신 중쇄 (myh7)의 증가된 mRNA 발현은 심장 비대와 관련이 있다. 이 배아 이소형은 심부전의 발병에 반응하여 성인 심근에서 발현된다 (Yin et al. 2014). 게다가, 증가된 myh7 발현은 특히 심근 섬유증의 발병 및 심근세포 손실 둘 다를 특징으로 하는 부정맥성 심근육병증 (Gerek 2017)에서 및 DMD (Murphy et al. 2016)에서 입증된다.
- BMP4: 골 형태형성 단백질 4 (BMP4)는 근원성 분화의 중요한 리프레서이다. 이는 DMD에서의 근육 재생 과정을 방해한다 (Shi 2011).
DMD에서 심장 섬유증의 발병과 관련된 분자 마커의 분석은 건강한 동물과 비교하여 mdx 동물에서 CTGF 및 콜라겐 I (Col1a1)의 유전자 발현에서의 유의한 증가를 확인해 주었다 (p<0.001 및 p<0.05, 각각, 비쌍형성 t 검정, 도 3A). 50 mg/kg*일의 용량으로 BIO101을 사용한 2개월 처리는 비히클을 받은 대조군 mdx 동물과 비교하여 BIO101로 처리된 mdx 동물에서 CTGF의 유전자 발현을 방지하였다 (p=0,0506, 비쌍형성 t 검정) (도 3B). 동일한 용량으로 BIO103으로 mdx 동물을 처리하는 것은 대조군 mdx 동물과 비교하여 Col1a1의 유전자 발현을 방지하는 경향이 있었다 (도 3B).
myh7의 유전자 발현은 야생 C57 동물과 비교하여 mdx 동물에서 유의하게 증가되었다 (p<0.05, 비쌍형성 t 검정) (도 3C). 50 mg/kg*일의 용량으로 BIO101 및 BIO103으로 mdx 동물을 처리하는 것은 비히클을 받은 mdx 동물과 비교하여 myh7의 발현을 유의하게 감소시켰다 (p<0.01, 비쌍형성 t 검정) (도 3D). 게다가, BIO101은 비히클을 받은 대조군 mdx 동물과 비교하여 BMP4의 유전자 발현을 감소시켰다 (p=0.0529, 비쌍형성 t 검정) (도 3D).
골격근 섬유증 (조직학적 연구: 도 4 및 5)
조직학적 연구에 의한 근육 섬유증의 평가는 앞정강근 (TA로 약칭됨) 상에서 수행하였다. 조직학적 절편 (7 μm)을 생성시키고 헤마톡실린 에오신 (HE) 또는 시리우스 레드 (SR)로 염색시켰다.
HE로 염색된 앞정강근의 절편의 해부병리학적 연구는 근섬유 관여의 정도를 평가할 수 있게 하였다. C57 동물 (도 4A), mdx 동물 (도 4B), BIO101로 처리된 mdx 동물 (도 4C) 및 BIO103으로 처리된 mdx 동물 (도 4D)로부터 수득된 HE로 염색된 앞정강근 절편의 대표적인 영상을 나타냈다. 스케일 바는 200 μm에 상응한다. C57 마우스의 TA 근육은 어떠한 근육 병변도 나타내지 않았다 (도 4A). 미처리 mdx 마우스의 TA 근육은 광범위하게 다양한 병변 프로파일: 수많은 괴사성 섬유를 가진 중등도 적혈구부동증을 나타냈다. 일부 근육은 중증, 다초점, 적혈구부동증으로 현저한 그의 부분을, 대부분의 근세포의 위축과 함께, 뿐만 아니라 거대 만성 염증성 병소를 연관이 있는 섬유증과 함께 (도 4B) 및 단핵 세포 침윤물 (본질적으로 대식세포)을 나타냈다. Δ 표시는 섬유증과 연관이 있는 염증성 병소를 나타낸다. 마지막으로, 일부 근육은 거대 급성 괴사 플라크를 나타냈다. BIO101로 처리된 마우스의 근육은 단지 2 가지 유형의 병변 프로파일: 적혈구부동증, 괴사 또는 염증이 거의 없는 적은 병변 프로파일 (37.5%, 8개의 TA 근육 중 3개) 및 적혈구부동증, 분산된 괴사성 섬유 및 가변성 염증을 가진 현저한 병변 프로파일 (62.5%, 8개의 TA 근육 중 5개)을 나타냈다 (도 4C). 흥미롭게도, BIO103으로 처리된 마우스의 근육은 적은 병변 프로파일을 가진 더 거의 없는 근육 병변을 나타냈다. 실제로, BIO103으로 처리된 근육의 67% (9개의 TA 근육 중 6개)가 이 범주로 분류될 수 있다. 조직학적 용어로, 대부분의 근세포는 중심핵 (괴사-재생 현상의 지표), 크기의 최소 내지 약간의 변화 (적혈구부동증), 일부 드문 괴사 및 과-수축된(hyper-contracted) 근세포 (괴사의 초기 상; 흑색 화살표, 도 4D), 및 근내막에서의 일부 드문 염증 세포를 나타냈다. BIO103으로 처리된 다른 근육은 적혈구부동증, 분산된 괴사성 섬유 및 급성 괴사를 가진 다소 괴사 경향이 있는 현저한 병변 프로파일 (TA 근육의 11%, 9개의 TA 근육 중 1개), 즉 유의한 적혈구부동증을 갖고, 어떠한 괴사성 섬유도 갖지 않는 위축에 대한 경향이 있는 현저한 병변 프로파일 (11%, 9개의 TA 근육 중 1개)을 나타냈다. 마지막으로, TA 근육 중 하나는 어떠한 재생성도 없는 거대 급성 괴사 플라크를 가진 중증 병변 프로파일 (11%, 9개의 TA 근육 중 1개)을 나타냈다.
SR로 염색된 앞정강근의 절편의 해부병리학적 분석은 섬유증 영역을 정량화할 수 있게 하였다. SR 염색은 조직학적 절편에서 섬유증 구역을 시각화할 수 있게 하였다 (Ritti 2017). C57 동물 (도 5A), mdx 동물 (도 5B), BIO101로 처리된 mdx 동물 (도 5D) 및 BIO103으로 처리된 mdx C57 동물 (도 5E)로부터 수득된 SR로 염색된 앞정강근의 절편의 대표적인 영상을 나타냈다. 스케일 바는 200 μm를 나타낸다. 섬유증에 상응하는 백분율 영역은 C57 군과 비교하여 mdx 군에서 유의하게 증가되었다 (p<0.001, 만 휘트니 검정) (도 5C). 흑색 화살표는 유의한 근육 섬유증을 나타내는 구역을 나타낸다. BIO103으로 mdx 동물을 처리하는 것이 비히클을 받은 대조군 mdx 군과 비교하여 섬유증의 발병을 분명히 방지하는 경향이 있었다 (p=0.0709, 비쌍형성 t 검정) (도 5F).
골격근 섬유증 (생화학적 연구: 도 6)
앞정강근에 대해 이루어진 관찰과 함께, 근육 섬유증의 마커의 평가를 비복근 상에서 수행하였다. 근육을 RIPA 용해 완충제 중에서 4℃에서 16시간 동안 적당히 교반하면서 해리시켰다. 단백질을 검정하고, PVDF 막으로 옮기기 전에 SDS PAGE 겔에서 분해시켰다. 콜라겐 I은 웨스턴 블롯에 의해 검출하고, 화학발광에 의해 검출시킨 다음에, GAPDH 검출을 참조하여 정규화 후에 밀도측정법에 의해 정량화시켰다. 예상한 바와 같이, 콜라겐 I의 단백질 발현은 건강한 마우스 (C57)의 근육과 비교하여 mdx 마우스의 비복근에서 유의하게 증가되었다 (p<0.01; 비쌍형성 t 검정). 콜라겐 I의 단백질 발현은 27배 증가되었다 (도 6A). BIO103으로 mdx 마우스를 처리하는 것은 미처리 mdx 마우스 (비히클)와 비교하여 콜라겐 I의 단백질 발현에서 유의한 감소 (p<0.01; 비쌍형성 t 검정)를 관찰할 수 있게 하였다 (도 6B).
BIO101 및 BIO103의 생물학적 활성과 관련된 추가 실험 결과는 이하에, 본 설명의 항목 5에 제공된다.
4.
BIO101의 시험관내 생물학적 활성
근관으로의 근모세포의 분화
스테렌뷔르흐(Sterrenburg) 등은 DMD 세포에서 비효과적인 근육 재생이 근모세포 분화 장애 및 근관 유지 부족에 기인한다는 것을 입증하였다 (Turk et al., 2006). 증식 감소, 융합 장애 및 DMD 근관의 유지 부족의 조합은 비효과적인 근육 재생을 야기하고 DMD 환자의 중증 표현형의 한 원인이 될 수 있다.
근관 분화를 평가하기 위해 다양한 파라미터를 측정하였다. 인간 DMD 골격근 세포 (KM571DMD10FL Cl1)를 3일 동안 분화시킨 다음에 10 μM에서 BIO101과 함께 또는 없이 인큐베이션하였다. 융합 지수 및 근관당 핵의 수는 근관 분화의 관련성 있고 민감한 지표로서 실증되었다.
도 7A에 도시된 융합 지수는 총 세포에 대한 분화된 세포 핵의 백분율을 나타낸다.
근관당 핵의 수는 도 7B에 도시되어 있으며, 300개의 근관이 계수되었다.
근관 직경은 도 7C에 도시되어 있으며, 병태당 150개 근관이 측정되었다.
BIO101의 존재하에 근관으로의 인간 DMD 근모세포의 증진된 분화가 관찰되었다 (도 7A, 7B 및 7C). 융합 지수의 +7%의 유의한 증가 (p < 0.001)가 관찰되었다.
이것은 근관당 핵의 수의 34% 증가 (p < 0.01), 및 근관 직경의 21% 증가 (p < 0.001)를 동반한다.
도 7A, 7B 및 7C에서의 결과는 3회의 독립적인 실험 동안에 측정된 평균 데이터 ± (SEM)를 나타낸다. 만-휘트니 검정을 사용한 통계 분석은 10 μM (마이크로몰)의 농도에서 BIO101로 처리된 세포와 미처리 대조군 세포 (도 7에서 "CTL"로 주석이 달림) 사이의 유의한 차이를 나타낸다, p <0.01 (** ); p <0.001 (***).
신호전달 경로
PI3K/AKT/mTOR 신호전달 경로는 세포 성장, 증식, 운동성, 생존, 아폽토시스, 자가포식 및 혈관신생에서 필수적인 역할을 한다 (Hay et al., 2004).
ERK1 및 ERK2를 포함한, MAP 키나제 (미토겐-활성화 단백질 키나제로부터 약칭됨)는 근육 재생, 재구조화 및 수축과 같은 여러 가지의 기능에 관여한다. mdx 마우스에서, 근육 세포에서 PI3K/Akt 및 MAPK 경로의 활성화가 특히 유리한 효과와 연관이 있다는 것 (Turgeman et al., 2008; Huebner et al., 2008)이 입증되었다 (Roffe et al., 2010).
인간 DMD 골격근 세포 (KM571DMD10FL Cl1)를 5일 동안 분화시킨 다음에, 10 분 내지 24시간의 기간 동안 10 μM에서 BIO101과 임의로 인큐베이션하였다.
AKT (도 8A) 및 ERK1/2 (도 8B)의 인산화에 대한 BIO101의 효과를 기재한 적어도 6개의 독립적인 웨스턴 블롯 실험의 결과의 밀도측정 분석을, 미처리 대조군과 비교하여 나타냈다, *p <0.05.
BIO101은 p-AKT 및 p-ERK1/2의 유의한 증가를 유도하는 것으로 관찰되었다.
나타낸 결과의 판독시, BIO101이 인간 DMD 근세포에서 AKT 및 MAPK 신호전달 경로의 유의한, 초기 활성화를 유도하는 것으로 관찰되었다.
세포 호흡
DMD 근섬유에서 기저 미토콘드리아 호흡의 감소가 존재하는 것으로 공지되어 있다 (Schuh et al. 2015).
흥미롭게도, DMD 환자의 근관 상에서, DMD 환자의 근모세포의 분화의 측면에서 BIO101의 유리한 특성 (도 7)은 에너지 대사에 긍정적인 영향을 수반하였다.
인간 DMD 골격근 세포 (KM571DMD10FL Cl1)를 4일 동안 분화시킨 다음에, BIO101 (1 또는 5 μM)의 존재 또는 부재하에 2일 동안 인큐베이션하였다. 세포의 미토콘드리아 호흡을 반영하는 산소 소비율 (OCR로도 공지됨)은 시호스(Seahorse) XF 분석기 (등록 상표, 아질런트(Agilent))를 사용하여 측정하였다.
기저 호흡은 직접 측정하며, 한편 최대 호흡은 올리고마이신에 이어서 FCCP를 추가한 후에 측정하였다 (도 9A 및 도 9B). 결과는 미처리 세포의 OCR을 기준으로 하며 평균 ± 표준 오차 (SEM)의 형태로 나타냈다.
BIO101로 2일 처리 후, DMD 환자의 세포는 미처리 세포의 것들과 비교하여 기저 및 최대 호흡을 유의하게 증가시킨 것으로 보였다.
보다 구체적으로, 1 μM의 용량으로 BIO101로 처리된 세포 상에서 20% 증가된 기저 호흡 (p < 0.01)이 관찰되었다. 5 μM의 용량으로 BIO101로 처리된 세포 상에서 21% 증가된 기저 호흡 (p < 0.001)이 관찰되었다. 1 μM의 용량으로 BIO101로 처리된 세포 상에서 51% 증가된 최대 호흡 (p<0.05)이 관찰되었다. 5 μM의 용량으로 BIO101로 처리된 세포 상에서 22% 증가된 최대 호흡 (p = 0.13)이 관찰되었다.
나타낸 결과는 적어도 4회의 독립적인 실험으로부터 수득하였다.
만 및 휘트니 통계 검정은 1 및 5 μM에서 BIO101로 처리된 세포와 미처리 세포 사이에 유의한 차이를 입증할 수 있게 하였다, p<0.05 (*), <0.01 (**), 0.001 (***).
BIO101은 DMD 환자의 근육 세포의 에너지 대사의 증진의 한 원인이 된다.
5.
BIO101 및 BIO103의 생체내 생물학적 활성
가로무늬 골격근은 신체의 가장 혈관화된 조직 중 하나이며 내피 세포는 근육 재생 과정에 필수적이다. 디스트로핀은 혈관의 평활근 세포의 수준으로 존재하며 그의 부재는 혈관화 장애를 야기할 수 있다. 실제로, DMD 근육에서, 괴사성 섬유는 매우 자주 군집화되고, 이 현상은 허혈성 섬유 괴사를 유도하는 섬유의 이 군집으로의 공통 모세관의 혈류 감소로 인한 것으로 입증되었다 (Rando, 2001).
혈류 이외에, 보다 최근의 연구는 mdx 마우스에서 혈관 밀도의 감소를 입증하였다 (Loufrani et al., 2004; Matsakas et al., 2013). 추가 연구는 또한 혈관신생이 mdx 마우스 모델에서 손상되었음을 입증하였다 (Palladino et al., 2013). 이들 연구는 그의 질, 그의 양의 측면 뿐만 아니라 혈관신생의 측면에서 DMD에 혈관화 결함이 있고, 근육 조직이 허혈성 조건하에 배치되어 있음을 나타내는 이론적 근거가 있음을 나타낸다.
골격근 혈관화
건강한 C57 마우스의 앞정강근 (TA로 약칭됨)의 절편 상에서 뿐만 아니라 비히클로 처리된 mdx 마우스 및 BIO101 또는 BIO103으로 처리된 mdx 마우스 상에서 정량적 혈관화 연구를 수행하였다.
이중 면역형광 표지화, 즉 근섬유의 기저막을 식별하는 기능을 가진 항-라미닌 표지화 및 혈관을 식별하는 기능을 갖는 항-CD31 표지화를 수행하였다. 근섬유당 혈관의 수를 정량화하였다.
예상한 바와 같이, 디스트로핀 유전자 상에 돌연변이 (mdx)를 나타내는 동물은 근섬유당 혈관의 수가 감소한 것으로 관찰되었다. 관찰된 감소는 건강한 동물 (C57)과 비교하여 27.2% (p<0.01)이었다 (도 10A).
mdx 동물은 매일 비히클 또는 BIO101 (50 mg/kg*일) 또는 BIO103 (50 mg/kg*일)을 경구로 받았다. 2개월의 매일 노출 후에 근섬유의 수의 정량화의 결과를 도 10B에 나타냈다.
BIO101 또는 BIO103을 받은 mdx 동물은 비히클을 받은 mdx 동물보다 더 큰 혈관화를 나타내는 것으로 관찰되었다. BIO101은 근섬유당 혈관의 수를 14.1% (p=0.13, 비쌍형성 t 검정)의 증가로 개선시키는 경향이 있는 것으로 관찰되었다. 보다 현저한 방식으로, BIO103은 미처리 mdx 동물 (비히클)과 비교하여 근육 혈관화를 28.2% (p=0.006, 비쌍형성 t 검정)로 유의하게 증가시켰다.
BIO101, 특히 BIO103으로의 치료는 근섬유당 혈관의 수를 증가시켰다.
이들 결과는 시험관내 및 생체내 다양한 근육 파라미터에 대한 BIO101 및 BIO103의 효능을 입증한다. 실제로, BIO101 또는 BIO103으로 DMD를 앓고 있는 환자의 근육 세포를 처리하는 것이 세포의 분화, 및 에너지 대사 (미토콘드리아 호흡)를 증진시키고, 적절한 근육 기능에 중요한, 생체내 근육 혈관화를 증가시킬 수 있음을 입증한다.
결론
따라서, 근육 기능에 대한 그리고 근육병증을 앓고 있는 포유동물에서 심근 및 골격근 섬유증의 발병에 대한 BIO101 및 BIO103의 특성을 고려하여, BIO101 및 BIO103의 사용은, 단독으로, 또는 근육 기능, 특히 근력 및 활동 내성을 보존하여 상기 근육 기능의 악화, 보다 특히 섬유증의 발병을 초래하는 근육병증의 진행을 둔화시키기 위해, 유전자 변경의 효과를 교정하는 것을 목표로 하는 치료와 함께, 제안될 수 있다. 이들 근육병증은 유전성 근육병증, 특히 듀시엔형 근이영양증을 포함한다.
참고문헌 목록
Claims (19)
- 20-히드록시엑디손 또는 그의 유도체를 포함하는, 디스트로핀 유전자 돌연변이를 포함하는 유전자 변경으로부터 발생한 근육병증의 치료에서 사용하기 위한 제약 조성물로서, 여기서 유도체는:
화학식 (II)의 화합물:
여기서,
R1 은 기 (C1-C6 알킬)W(C1-C6 알킬); 기 (C1-C6 알킬)W(C1-C6 알킬)W(C1-C6 알킬); 기 (C1-C6 알킬)W(C1-C6 알킬)CO2(C1-C6 알킬); 기 (C1-C6 알킬)W(C1-C6 알킬)CO(C1-C6 알킬); 기 (C1-C6 알킬)W(C1-C6 알킬)OH; 기 (C1-C6 알킬)A (A는 OH, OMe, (C1-C6 알킬), NH(C1-C6 알킬) 또는 N(C1-C6 알킬)2, CO2(C1-C6 알킬), 또는 (C1-C6 알킬)OH의 기에 의해 임의로 치환된 헤테로시클릴을 나타냄); 및 CH2Br 기로부터 선택되고,
W는 NH, N(C1-C6 알킬), O 및 S로부터 선택된 헤테로원자이고; 및
화학식 (III)의 화합물:
로부터 선택되는 것인 제약 조성물. - 제1항에 있어서, 유전자 근육병증에 의해 유발된 근육 기능 장애로부터 발생한 병태의 치료를 위한 제약 조성물.
- 제2항에 있어서, 근육 기능이 가로무늬 골격근 또는 심근의 기능인 제약 조성물.
- 제2항에 있어서, 근육 기능 장애가 심근 비대인 제약 조성물.
- 제2항에 있어서, 근육 기능이 섬유증의 진행성 발병에 의해 적어도 부분적으로 손상된 것인 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 변경으로부터 발생한 근육병증이 듀시엔형 근이영양증 (DMD) 및/또는 베커형 근이영양증 (BMD)인 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 근육 세포의 미토콘드리아 호흡을 증가시키는 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 근섬유당 혈관의 수를 증가시키는 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 근관으로의 근모세포 분화를 증가시키는 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 20-히드록시엑디손이 화학식 (I)의 화합물인 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
20-히드록시엑디손이 식물의 추출물 또는 식물의 일부로부터의 추출물이고,
상기 식물은, 상기 식물의 건조 중량을 기준으로 적어도 0.5%의 화학식 (I)의 20-히드록시엑디손을 함유하는 식물로부터 선택되고,
상기 추출물은 적어도 95%, 또는 적어도 97%의 화학식 (I)의 20-히드록시엑디손을 포함하는 것인
제약 조성물. - 제11항에 있어서,
추출물이, 상기 추출물의 건조 중량을 기준으로 0 내지 0.05%의 불순물을 포함하고,
상기 불순물은, 상기 추출물의 제약 적용의 안전성, 이용가능성 또는 효능에 영향을 미치기 쉬운 것인
제약 조성물. - 제11항에 있어서, 식물이 스템마칸타 카르타모이데스(Stemmacantha carthamoides), 시아노티스 아라크노이데아(Cyanotis arachnoidea) 및 시아노티스 바가(Cyanotis vaga)로부터 선택된 것인 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 20-히드록시엑디손이 적어도 95%, 또는 적어도 97%의 화학식 (I)의 20-히드록시엑디손을 포함하는 스템마칸타 카르타모이데스 뿌리 추출물인 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 유도체가
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- 번호 2: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-트리히드록시-17-[2-(3-히드록시피롤리딘-1-일)아세틸]-10,13-디메틸-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-6-온,
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- 번호 8: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-트리히드록시-17-[2-(2-히드록시에틸술파닐)아세틸]-10,13-디메틸-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-6-온
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