BR112019022379A2 - 20-hidroxiecdisona e seus derivados - Google Patents

Abstract

a invenção refere-se a 20-hidroxiecdisona e seus derivados, para uso no tratamento de miopatias genéticas.

Description

“20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS”

Campo Da Invenção

[001] A presente invenção relaciona-se com o uso de 20hidroxiecdisona natural purificada (20E) ou de derivados sintéticos para o tratamento de miopatias e em particular distrofias musculares de origem genética.

Antecedentes da Invenção

[002] As miopatias são doenças que afetam diretamente o músculo. Existem diferentes formas das mesmas de acordo com os sintomas e mecanismos de envolvimento muscular. Existem duas categorias: miopatias genéticas e miopatias adquiridas.

[003] As miopatias genéticas são subdivididas em:

- distrofias musculares progressivas (distrofias musculares de Duchenne e Becker, distrofias musculares da cintura pélvica e dos membros e distrofia facioescapulohumeral), ou distrofias congênitas,

- miopatias metabólicas, como glicogenose e lipidose, bem como miopatias mitocondriais,

- distrofias miotônicas como a miopatia de Steinert (MD1),

- miopatias congênitas multi-minicêntricas ou de núcleo central, nemalina ou miopatia centronuclear e miotubular.

[004] As miopatias adquiridas incluem:

- miopatias tóxicas,

- miopatias inflamatórias,

- miopatias endócrinas.

[005] As miopatias se manifestam como fraqueza muscular progressiva ou estável. Elas são geralmente caracterizadas por uma perda de massa muscular (atrofia). Durante a progressão da doença, o tecido muscular é progressivamente substituído por tecido fibroso (fibrose).

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[006] Existem mais de trinta formas de distrofias musculares que diferem particularmente pelo tipo de músculo afetado. Eles são de mais ou menos de início precoce e afetam os músculos esqueléticos de diferentes partes do corpo. Em alguns casos, danos progressivos nos músculos respiratório e cardíaco reduzem a expectativa de vida dos pacientes.

[007] Várias dezenas de genes diferentes estão envolvidos nas distrofias musculares. Na maioria das vezes, esses são os genes responsáveis pela síntese de proteínas situadas na membrana das células musculares ou ligadas a elas e essenciais para manter a estrutura e a função muscular. A título de exemplo:

- a distrofina está envolvida na distrofia muscular de Duchenne (DMD) e distrofia muscular de Becker (DMO),

- calpina, disferlina e sarcoglicanas estão envolvidas em distrofias musculares da cintura pélvica,

- merosina, alfa-distroglicana ou selenoproteina N estão envolvidas no caso de distrofias musculares congênitas (CMD).

[008] DMD é a forma mais frequente de distrofia muscular. Afeta um em cada 3.500 rapazes e é o resultado de mutações que afetam o gene da distrofina, localizado no cromossomo X. Uma forma menos grave, a DMO, também envolve o gene da distrofina e afeta 1 em cada 18.000 rapazes. DMD é uma condição genética séria que afeta toda a estrutura muscular. Nesta doença, a fragilidade das fibras musculares leva à sua destruição, induzindo necrose do tecido muscular. Quando os mecanismos de regeneração estão sobrecarregados, a degeneração assume a indução de uma perda de força muscular e intolerância ao esforço (Barnabei et al. 2011). As fibras musculares são então substituídas por tecido conjuntivo (fibrose). A fraqueza muscular atinge progressivamente os membros inferiores de crianças acima de 3 anos de idade. A doença desenvolve-se posteriormente nos músculos das costas,

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3/31 membros superiores e, finalmente, nos músculos respiratórios.

[009] Não há atualmente nenhum tratamento curativo para DMD e BMD, mas os tratamentos paliativos ortopédico e respiratório melhoram a qualidade de vida e risco de vida. Atualmente, o tratamento do paciente baseiase na otimização de suas capacidades musculares, bem como na prevenção e tratamento de complicações cardíacas e respiratórias. O uso de corticosteroides ajuda a prolongar o período de caminhada em dois anos, em média. No entanto, no entanto, algumas crianças não respondem a este tratamento que provoca mais efeitos adversos, particularmente enfraquecimento ósseo significativo. A proteção cardíaca parcial é obtida por meio de uma combinação de inibidores da enzima de conversão e betabloqueadores.

[0010] Novos tratamentos estão em fase de desenvolvimento clínico. O salto do exon consiste em forçar a célula a produzir uma versão mais curta, porém funcional, da distrofina do que a proteína normal. Uma outra abordagem do mesmo tipo consiste em substituir uma mutação que interrompe a síntese de distrofina prematuramente. No entanto, esse tipo de terapia é direcionado apenas a um pequeno número de pacientes, de acordo com a natureza exata das mutações que causam sua doença. Finalmente, a terapia gênica, que oferece a possibilidade de sintetizar versões curtas de distrofina (mini-distrofinas ou micro-distrofinas) em pacientes, é confrontado com um problema principal da resposta imune contra estas proteínas consideradas irrelevantes pelo corpo.

[0011] Além de uma diminuição irreversível da força muscular apendicular e o início da intolerância ao esforço, uma das principais complicações da doença é o aparecimento de fibrose, que afeta particularmente o coração, levando à insuficiência cardíaca (acompanhada de hipertrofia dilatada). Este dano é fatal para os pacientes. O aparecimento de

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4/31 fibrose é consequentemente um desenvolvimento irreversível que deve ser bloqueado para preservar a função muscular. Nesse sentido, as abordagens terapêuticas devem concentrar seus esforços em:

- manutenção da tolerância ao esforço,

- manutenção da força muscular,

- e prevenção do aparecimento de fibrose.

[0012] Fitoecdiesteroides representam uma importante família de esterois polihidroxilados. Essas moléculas são produzidas por várias espécies de plantas (samambaias, gimnospermas, angiospermas) e estão envolvidas na defesa dessas plantas contra pragas.

[0013] A patente FR3 021318 divulga que fitoecdiesteroides, e mais particularmente 20-hidroxiecdisona (20E), têm sido objeto de numerosos estudos farmacológicos. Esses estudos destacaram as propriedades antidiabéticas e anabolizantes dessa molécula. Os efeitos estimulantes dos mesmos sobre a síntese proteica nos músculos são observados em camundongos in vivo (Syrov et al., 2000; Tóth et al., 2008; Lawrence et al., 2012) e nos miotubos de camundongo C2C12 in vitro (Gorelick-Feldman et al. de 2008). Isso consiste em um efeito no nível da tradução, que envolve a fosforilação da proteína ribossômica p70S6K, após uma cascata envolvendo a proteína quinase Akt/ PkB, uma via também usada pelo IGF-1 para estimular a síntese proteica.

[0014] Alguns dos efeitos descritos acima em modelos animais foram observados em estudos clínicos ainda menos numerosos. Assim, a 20hidroxiecdisona aumenta a massa muscular em atletas jovens (Simakin et al., 1988).

[0015] Finalmente, a patente francesa FR 3 021 318 descreve o uso de 20-hidroxiecdisona e seus derivados, para o tratamento e prevenção de sarcopenia e obesidade sarcopênica (Lafont et al. 2017).

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Matéria Objeto da Invenção

[0016] Os inventores descobriram que 20-hidroxiecdisona e os seus derivados melhoram significativamente os desempenhos físicos in-toto, bem como a força muscular in situ de mamíferos que sofrem de miopatia. Os desempenhos físicos in toto e a força muscular in situ são determinados, respectivamente, medindo a distância máxima percorrida e a força isométrica máxima absoluta do músculo anterior tibial. Esses efeitos tomam possível aumentar a mobilidade em mamíferos que sofrem de miopatia e, principalmente, distrofias musculares.

[0017] A presente invenção refere-se a 20-hidroxiecdisona e seus derivados destinados a serem utilizados no tratamento de miopatia resultante de uma alteração genética.

[0018] A seguir, na descrição, o termo 20-hidroxiecdisona e seus derivados denota 20-hidroxiecdisona, seus derivados, extratos vegetais ricos em 20-hidroxiecdisona e seus derivados, e composições contendo como meio de agente ativo 20-hidroxiecdisona, seus derivados e/ou extratos vegetais ricos em 20-hidroxiecdisona e seus derivados.

[0019] Os derivados da 20-hidroxiecdisona são obtidos por hemissíntese.

[0020] A 20-hidroxiecdisona e seus derivados são vantajosamente purificados para grau farmacêutico.

[0021] Mais particularmente, a invenção refere-se a 20hidroxiecdisona e seus derivados, destinados a serem utilizados no tratamento de condições resultantes de comprometimento da função muscular induzida por uma miopatia genética.

[0022] A função muscular é a do músculo esquelético estriado ou do miocárdio.

[0023] Mais particularmente, o comprometimento da função

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6/31 muscular é a hipertrofia do miocárdio.

[0024] Ainda mais em particularmente, a invenção refere-se a 20hidroxiecdisona e os seus derivados, destinados a serem utilizados no tratamento de qualquer miopatia em que a função do músculo é, pelo menos em parte prejudicada pelo aparecimento progressivo de fibrose.

[0025] A invenção refere-se a 20-hidroxiecdisona e seus derivados, destinados a serem utilizados no tratamento de miopatia resultante de uma alteração genética.

[0026] Por alteração genética é entendida uma mutação, um nucleotídeo de inserção ou um nucleotídeo deleção.

[0027] A invenção refere-se a 20-hidroxiecdisona e seus derivados, destinados a serem utilizados no tratamento, por exemplo, de distrofia muscular de Duchenne (DMD) e/ ou distrofia muscular de Becker (BMD).

[0028] De acordo com a invenção, 20-hidroxiecdisona e os seus derivados, destinam-se a ser utilizados no tratamento de qualquer miopatia resultante de uma mutação do gene da distrofina.

[0029] De acordo com uma característica, 20-hidroxiecdisona é um composto de fórmula (I):

OH

(I)

[0030] Vantajosamente, o composto de fórmula (I) é purificado para grau farmacêutico.

[0031] Particularmente, a 20-hidroxiecdisona é um extrato de uma

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7/31 planta ou de uma parte de uma planta, sendo a referida planta escolhida a partir de plantas que contêm pelo menos 0,5% de 20-hidroxiecdisona de fórmula (I) em peso seco da referida planta, o referido extrato compreendendo pelo menos 95%, e preferencialmente pelo menos 97% de 20-hidroxiecdisona de fórmula (I).

[0032] É feita referência à purificação para grau farmacêutico.

[0033] O extrato é daqui em diante referido como BIO101. É notavelmente compreendido entre 0 e 0,05%, em peso seco do extrato, de impurezas, tais como compostos minoritários, susceptível de afetar a segurança, a disponibilidade ou a eficácia de uma aplicação farmacêutica do referido extrato.

[0034] De acordo com uma característica da invenção, as impurezas são compostos com 19 ou 21 átomos de carbono, tais como Rubrosterona, Dihidrorubrosterona o r Poststerona.

[0035] A planta da qual ο BIO101 é produzido é vantajosamente escolhida a partir de Stemmacantha carthamoides (também denominada Leuzea carthamoides), Cyanotis arachnoidea e Cyanotis vaga.

[0036] A invenção se concentra especialmente no uso de um extrato de raiz de Stemmacantha carthamoides compreendendo pelo menos 95% e, de preferência, pelo menos 97%, de 20-hidroxiecdisona de fórmula (I).

[0037] Neste extrato, a 20-hidroxiecdisona é purificada para grau farmacêutico.

[0038] Mais particularmente, o extrato é administrado a uma taxa de 3 a 15 mg/ kg * dia.

[0039] Mais particularmente, o extrato é administrado a uma taxa de 200 a 1000 mg/ dia, em uma ou várias doses, para um paciente adulto, e uma dose de 70 a 350 mg/ dia, em uma ou várias doses, para uma criança.

[0040] Além disso, a invenção refere-se a uma composição compreendendo BIO101 por meio de agente ativo.

[0041] A composição contém de preferência entre 200 e 1000 mg

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8/31 de agente ativo (BIO101).

[0042] De acordo com uma característica adicional, um derivado da 20-hidroxiecdisona é um composto da fórmula geral (II):

VU é uma ligação carbono-carbono simples e Y é um grupo hidroxila ou hidrogênio, ou V-U é uma ligação etileno C=C;

X é um oxigênio,

Q é um grupo carbonila;

R¹ é selecionado a partir de: um grupo (Ci-C6)W(Ci-Ce); um grupo (Ci-C6)W(Ci-C6)W(Ci-Ce); um grupo (Ci-C6)W(Ci-C6)CO2(Ci-Ce); um grupo (CiCe)A, A representando um heterociclo opcionalmente substituído por um grupo do tipo OH, OMe, (C-i-Ce), N(Ci-Ce), CO2(Ci- Ce); um grupo CH2Br;

W sendo um heteroátomo escolhido a partir de N, O e S, preferencialmente O, e ainda mais preferencialmente S.

[0043] Mais particularmente, na fórmula (II):

Y é um grupo hidroxila;

R¹ é selecionado a partir de: um grupo (Ci-Ce)W(Ci-Ce); um grupo (Ci-C6)W(Ci-C6)W(Ci-Ce); um grupo (Ci-C6)W(Ci-C6)CO2(Ci-Ce); um grupo (CiCe)A, A representando um heterociclo opcionalmente substituído por um grupo do tipo OH, OMe, (Ci-C₆), N(Ci- C₆), CO₂(Ci-C₆);

W sendo um heteroátomo escolhido a partir de N, O e S,

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9/31 preferencialmente 0, e ainda mais preferencialmente de S;

Em particular, os compostos de fórmula (II) são escolhidos entre:

- No. 1: (2S,3R,5R, 10R, 13R, 14S, 17S)-2,3,14-trihidroxi-10,13dimetil-17-(2-morpholinoacetil)-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 Hciclopenta[a] fenantren-6-ona;

- No. 2: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-tri-hidroxi-17-[2-(3h idroxipirrol id in-1 -i l)aceti l]-10,13-d im eti I-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 Hciclopenta[a]fenantren-6-ona;

- No. 3: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(4hidroxi-1 -piperid i l)acetil]-10,13-d im eti I-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 Hciclopenta[a]fenantren-6-ona;

- No. 4: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-[4-(2hidroximetil)-1 -piperidil] acetil]-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17- decahidro-1 H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona;

No. 5: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-[2-(3dimetilaminopropil(metil)amino)acetil]-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona;

- No. 6: 2-[2-oxo-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14- trih idroxi-10,13-dimetil-6-oxo-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 Hciclopenta[a]fenantren-17-il]etil] etil sulfanilacetato;

- No. 7: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-etilsulfanilacetil)-

2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 Hciclopenta[a]fenantren-6-ona;

-No. 8: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(2h idroxieti Isu Ifani l)aceti l]-10,13-d imeti I-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 Hciclopenta[a]fenantren-6-ona.

[0044] Mais particularmente, o fitoecdisteroide é um composto de fórmula (III):

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(III)

[0045] Este composto é a seguir designado como BIO103.

Breve Descrição das Figuras

[0046] Outras vantagens, objetivos e características particulares da presente invenção emergirão da descrição não limitativa a seguir de pelo menos uma forma de realização específica dos dispositivos de acordo com a presente invenção, com referência aos desenhos anexos, em que:

- A Figura 1A é um diagrama representativo da tolerância ao esforço de grupos de camundongos do pool gênico C57BL10: mdx saudável (C57) e não tratado (mutado no gene da distrofina),

- A Figura 1B é um diagrama representativo da tolerância ao esforço dos grupos de camundongos: mdx não tratado, mdx tratado com BI0101 e mdx tratado com BIO103 após dois meses de tratamento,

- A Figura 2A é um diagrama representativo da força isométrica máxima absoluta do músculo tibial anterior dos grupos de camundongos do pool gênico C57BL10: mdx saudável (C57) e não tratado,

- A Figura 2B é um diagrama representativo da força isométrica absoluta máxima do músculo tibial anterior dos grupos de camundongos: mdx não tratado, mdx tratado com BIO101 e mdx tratado com BIO103 após dois meses de tratamento,

- As Figuras 3A e 3B são diagramas representativos da expressão gênica (RNAm) dos marcadores de fibrose CTGF (factor de crescimento do

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11/31 tecido conjuntivo) e COL1A1 (colágeno 1)a partir do coração de vários grupos de camundongos do pool gênico C57BL10: saudável (C57) , mdx não tratado, mdx tratado com BIO101 e mdx tratado com BIO103, após dois meses de tratamento,

- Figuras 3C e 3D são diagramas representativos da expressão gênica (RNAm) dos marcadores de hipertrofia MYH7 (cadeia pesada de beta miosina) e BMP4 (proteína morfogenética óssea 4) do coração de vários grupos de camundongos a partir do conjunto de genes C57BL10: mdx não tratado, saudável (C57), mdx tratado com BI0101 e mdx tratado com BI0103, após dois meses de tratamento,

- Figura 4A é uma imagem representativa de uma secção histológica de músculos tibialis anterior de camundongos saudáveis do pool gênico C57BL10 (C57), corada com hematoxilina e eosina (HE),

- A Figura 4B é uma imagem representativa de uma seção histológica do músculo tibial anterior de camundongos mdx C57BL10 não tratados (mdx), corados com hematoxilina eosina (HE),

- A Figura 4C é uma imagem representativa de uma secção histológica de músculo tibial anterior de camundongos pool gênico mdx C57BL10 tratados com BIO101 (mdx + BIO101), corada com hematoxilina eosina (HE),

- A Figura 4D é uma imagem representativa de uma secção histológica do músculo tibial anterior de camundongos do pool gênico mdx C57BL10 tratados com BIO103 (mdx + BIO103), corada com hematoxilina eosina (HE),

- As Figures 5A e 5B são secções histológicas representativas de músculo tibial anterior coradas com Sirius Red (SR) dos grupos de saudável (C57) e camundongos mdx (mdx) não tratados a partir do pool gênico C57BL10, respectivamente,

- A Figura 5C é um diagrama representativo da quantificação das

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12/31 zonas fibróticas dos grupos de camundongos saudáveis (C57) e não tratados com mdx (mdx) do pool gênico C57BL10,

- As Figuras 5D e 5E são secções histológicas representativas de músculo tibial anterior coradas com Sirius Red (SR) dos grupos de camundongos mdx tratados com BIO101 (mdx BIO101) e camundongos mdx tratados com BIO103 (BIO103mdx),

- A Figura 5F é um diagrama representativo da quantificação das zonas fibróticas dos grupos de camundongos mdx tratados com BIO101 (mdx BIO101) e camundongos mdx tratados com BIO103 (mdx BIO103),

- A Figura 6A mostra a expressão da proteína, detectada por Western Blot, do marcador de fibrose colágeno 1 (COL1A1) do músculo gastrocnêmio dos grupos de camundongos do pool gênico C57BL10: saudável (C57), não tratado mdx (mdx),

- A Figura 6B mostra a expressão da proteína, detectada por Western Blot, com o mesmo marcador de fibrose do músculo gastrocnêmio dos grupos de camundongos do pool gênico C57BL10: não tratado mdx (mdx), mdx tratados com BIO101 e mdx tratados com BIO103, após dois meses de tratamento,

- A Figura 7A é um diagrama representativo do índice de fusão de mioblastos em miotubos. Os mioblastos humanos utilizados foram obtidos de pacientes com DMD. Os mioblastos diferenciadores foram tratados com BIO101 ou veículo por 3 dias,

- A Figura 7B é um diagrama representativo do número de núcleos por miotubo. Os mioblastos humanos utilizados foram obtidos de pacientes com DMD. Os mioblastos diferenciadores foram tratados com BIO101 ou veículo por 3 dias,

- A Figura 7C é um diagrama representativo do diâmetro do miotubo. Os mioblastos humanos utilizados foram obtidos de pacientes com DMD. Os

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13/31 mioblastos diferenciadores foram tratados com BIO101 ou veículo por 3 dias,

- As Figuras 8A e 8B mostram a expressão proteica, detectada pelo Western Blot, das formas fosforiladas das proteínas AKT e ERK1/2 em mioblastos humanos de um paciente que sofre de DMD. Os mioblastos diferenciadores foram tratados com BI0101 por um período entre 10 minutos e 24 horas,

- As Figuras 9A e 9B mostram, respectivamente, a respiração basal e máxima dos mioblastos humanos, obtida de um paciente que sofre de DMD. Os mioblastos diferenciadores foram tratados com o veículo ou BIO101 em doses diferentes por três dias. A respiração celular é determinada pela medição da taxa de consumo de oxigênio,

- A Figura 10A é um diagrama representativo da quantificação dos vasos sanguíneos que envolvem cada fibra muscular dos grupos de camundongos do gene mdx C57BL10 saudáveis (C57) e não tratados,

- A Figura 10B é um diagrama representativo da quantificação de vasos sanguíneos que rodeiam cada fibra muscular dos grupos de camundongos mdx tratados com o veículo (mdx), BIO101 (mdx BIO101) e camundongos mdx tratados com BIO103 (mdx BIO103).

Descrição Detalhada da Invenção

[0047] A presente descrição fornecida é não limitativa.

1. Processo de purificação de BIO101

[0048] Ο BIO101 é preparado a partir de uma preparação de aproximadamente 20% de 20-hidroxiecdisona pura, de acordo com as seguintes etapas:

a) Dissolução a quente de aproximadamente 90% de 20hidroxiecdisona pura em álcool, filtração e concentração parcial,

b) Uma adição de 3 volumes de acetona,

c) Resfriamento a uma temperatura entre 0 e 5 °C, com agitação,

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d) Filtragem do precipitado obtido,

e) Lavagens sucessivas com acetona e água, e

f) Secagem.

[0049] Esta purificação envolve um processo recristalização adequado para esta molécula capaz de ser realizado em uma escala industrial.

[0050] A filtragem da etapa a) é realizada por meio de um filtro de partículas de 0,2 μΜ (micrometres).

[0051 ] A concentração parcial da etapa a) é vantajosamente realizada por destilação sob vácuo, a uma temperatura da ordem de 50 °C, na presença de MeOH.

[0052] A etapa de secagem f) é realizada em um vácuo a uma temperatura da ordem de 50 °C.

2. Processo de síntese de BIQ103

BIO101

[0053] Ο BIO103 é obtido por hemi-síntese de 20-hidroxiecdisona seguido por purificação para grau farmacêutica de acordo com o seguinte processo de preparação.

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[0054] O diagrama de síntese de BIO103 em 3 etapas:

1) divagem oxidativa da cadeia lateral de 20-hidroxiecdisona entre os carbonos C20 e C22 para obter posesterona (protocolo conhecido dos técnicos no assunto),

2) introdução de um átomo de bromo na posição C21,

3) reação do derivado bromado com etano-tiol.

3. Atividade biológica de BIO1Q1 e BIQ103

[0055] Embora os efeitos anabolizantes de 20E presente na preparação comercial já terem sido demonstrados em animais jovens, o efeito de 20E em um contexto de um mamífero sofrendo de miopatia em que o aparecimento progressivo de fibrose contribui para a deterioração da função do músculo não é conhecido. O modelo animal da miopatia de Duchenne usando camundongos mdx, a partir do pool gênico C57BL10, apresentando-se com uma mutação no gene distrofina, foi utilizado (Bulfield et al. 1984; Sicinski et al. 1989).

[0056] O pool de gene C57BL10 de doze semanas de idade (camundongos selvagens referidos como C57 nas figuras) e camundongos machos C57BL10 mdx (modelo de camundongo da distrofia muscular de Duchenne, referido como mdx nas figuras), produzidos em Charles Rivers, foram usados. Dois grupos de mdx foram expostos cronicamente por via oral ao BIO101 (número de camundongos n = 9) ou ao BIO103 (número de camundongos n = 9) na dose de 50 mg/ kg * dia. Um grupo de camundongos C57 (número de camundongos n = 5) e um grupo de camundongos mdx (número de camundongos n = 15) receberam o veículo, isto é, sem tratamento. Os animais de todos os grupos foram testados quanto à sua capacidade funcional (teste de tolerância ao esforço) após dois meses de tratamento. O teste de tolerância ao esforço consiste em medir a distância máxima percorrida (atividade in-toto', Figuras 1A e 1B). Além disso, as medições da força isométrica absoluta máxima do músculo tibial anterior (atividade in situ, Figuras 2A e 2B) foram feitas

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16/31 após dois meses de tratamento.

[0057] O tratamento oral de dois meses consiste em alimentação forçada durante cinco dias por semana e em água potável dois dias por semana.

Teste de tolerância ao esforço (estudo funcional in toto: Figuras 1A e 1B)

[0058] O teste de tolerância ao esforço é um exercício de esteira motorada forçada. É um método não invasivo para avaliar a função esquelética in toto. É o método padrão-ouro no campo (Ferry et al. 1992, 1993; Hadj-Said et al. 2012).

[0059] O período de aclimatação dos animais é de pelo menos 48 horas antes da sessão, durante a qual a distância máxima de corrida é medida. Durante o teste, o camundongo é colocado em um corredor de corrida em uma esteira motorizada que permite um exercício controlado pelo testador na intensidade e duração do mesmo. A esteira termina com uma grelha horizontal que administra um choque eléctrico (0,4 mA) se o animal está em contato durante mais de um segundo com a grelha.

[0060] A sessão de corrida começa com um período de aquecimento de 2 minutos, durante o qual a velocidade é aumentada de 0 a 20 cm/ s. Posteriormente, a velocidade de execução é aumentada em 5 cm/ s a cada 10 minutos até o limite das capacidades de pico do camundongo. Quando é submetido a 5 choques em menos de 10 segundos, o teste é interrompido. A distância percorrida é anotada.

[0061] Como esperado, observa-se que os animais que apresentam uma mutação no distrofina do gene (mdx) executam significativamente menos (-80,4%, p < 0,001, teste de Mann Whitney) do que os animais saudáveis (C57) (Figura 1A). Após dois meses de exposição diária (Figura 1B), os animais mdx que receberam BIO101 ou BIO103 correram significativamente mais do que os animais mdx que receberam o veículo. O BIO101 e ο BIO103 melhoram significativamente (p < 0,001 e p < 0,05,

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17/31 respectivamente, t teste não pareado) a distância percorrida em +136% e +67%, respectivamente, em comparação com animais mdx não tratados (veículo). De forma importante, demonstramos aqui que o tratamento dos animais mdx com BIO101 ou BIO103 parcialmente compensa a perda funcional significativa observada nos animais com uma mutação no gene da distrofina (mdx). As performances físicas globais (atividade in toto) dos animais que sofrem de miopatia são muito significativamente melhoradas por BIO101 (2,4 vezes) e BIO103 (1,7 vezes).

[0062] Este estudo demonstra que o tratamento com BIO101 ou BIO103 resulta em uma melhoria funcional caracterizada por uma melhoria significativa na tolerância ao esforço em um modelo de miopatia animal (Figuras 1Ae 1B).

Força isométrica absoluta máxima do músculo tibial anterior (estudo funcional in situ: Figura 2)

[0063] Uma avaliação da contratilidade in situ do músculo anterior tibial é realizada no final do protocolo, isto é, após dois meses de tratamento.

[0064] No dia do sacrifício, o camundongo é anestesiado com uma injeção peritoneal de pentobarbital (55 mg/ kg, 0,1 ml/ 10 g de peso corporal) antes de medir a força in situ do músculo tibial anterior (TA). Uma incisão é realizada na pele no topo da pata, revelando o tendão que é cortado na extremidade distal do mesmo. O tendão distal do TA é acoplado à alavanca do servomotor (alavanca de modo duplo 305B, Aurora Scientific). Uma incisão é realizada na pele do lado da coxa, revelando o nervo ciático, entre 2 grupos musculares. O nervo ciático é estimulado com um eletrodo bipolar (pulso de onda quadrada supramáxima de 10 V, 0,1 ms). A força é medida durante as contrações em resposta à estimulação elétrica (frequência de 75 a 150 Hz, duração de 500 ms). A temperatura do camundongo é mantida a 37 °C usando uma lâmpada radiante. A força tetânica isométrica absoluta máxima é medida.

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[0065] Como esperado, observa-se que os animais mdx têm uma contração isométrica máxima absoluta significativamente inferior (p < 0,05, teste t não pareado) do que a de animais saudável C57 (Figura 2A). Após dois meses de tratamento, um aumento significativo na força isométrica absoluta máxima do músculo tibial anterior é observado nos animais mdx tratados com BIO101 (15,3%, p < 0,05, teste t não pareado) e com BIO103 (22,5%, p < 0,001, teste t não pareado) a uma dose de 50 mg/ kg * dia em comparação com os animais mdx que receberam o veículo (Figura 2B).

[0066] Este estudo demonstra que o tratamento com BIO101 ou BIO103 resulta em uma melhoria funcional caracterizada por um aumento significativo da força isométrica absoluta máxima do músculo tibial anterior em um modelo de miopatia animal (Figuras 2A e 2B).

Fibrose miocárdica e hipertrofia cardíaca (estudo molecular: Figuras 3A, 3B, 3C, 3D)

[0067] Uma avaliação dos marcadores de fibrose e hipertrofia cardíaca é realizada no final do protocolo, isto é, após dois meses de tratamento. No dia do sacrifício, os camundongos são submetidos a eutanásia por decaptação e o coração é removido em seguida, imediatamente congelado em nitrogênio líquido. O RNA total é extraído com o reagente TRIzol® lysis (Life technologies) e um homogeneizador de tecidos (Bio-Gen PRO200). O RNA extraído é é quantificado por espectrofotometria, depois a qualidade do mesmo é verificada e validada com o Kit de Análise Experion RNA StdSens (Bio-Rad). O cDNA é então sintetizado com o kit de síntese de cDNA do RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific). Finalmente, a análise semi-quantitativa por PCR foi realizada usando SYBR® Green (Roche), um agente de intercalação de DNA e um aparelho LightCycler® 480 Real Time PCR (Roche) em placas de 384 poços. Os marcadores moleculares medidos são os seguintes:

- CTGF e colágeno I: fator de crescimento do tecido conjuntivo

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19/31 (CTGF) está associado com a cura e com muitos processos fibróticos patológicos, incluindo DMD (Brigstock 2010; Song Y. 2017). O aumento da expressão gênica do CTGF está associado à fibrose cardíaca em camundongos mdx (Au 2011). O CTGF estimula a síntese de colágeno (dos quais colágeno I) nos fibroblastos cardíacos e contribui para a fibrose miocárdica (Wang 2010),

- myh7: a expressão aumentada de mRNA da cadeia pesada da beta miosina (myh7) está ligada à hipertrofia cardíaca. Essa isoforma embrionária é expressa no miocárdio adulto em resposta ao aparecimento de insuficiência cardíaca (Yin et al. 2014). Além disso, a expressão aumentada de myh7 é particularmente demonstrada em DMD (Murphy et al. 2016) e em cardiomiopatia arritmogênica, ambos caracterizados por perda de cardiomiócitos e aparecimento de fibrose miocárdica (Gerçek 2017),

- BMP4: a proteína morfogênica óssea 4 (BMP4) é um importante repressor da diferenciação miogênica. Isso interfere no processo de regeneração muscular na DMD (Shi 2011).

[0068] A análise de marcadores moleculares ligados com o início da fibrose cardíaca em DMD confirmam um aumento significativo na expressão gênica de CTGF e colágeno I (Col1a1) em animais mdx em comparação com os animais saudáveis (p < 0,001 e p < 0,05, respectivamente, teste t não pareado, Figura 3A). O tratamento de dois meses com BI0101 na dose de 50 mg/ kg * dia impede (p = 0,0506, teste t não pareado) a expressão gênica de CTGF em animais mdx tratados com BIO101 em comparação aos animais mdx controle, recebendo o veículo (Figura 3B). O tratamento de animais mdx com BIO103 na mesma dose tende a impedir a expressão gênica de Col1a1 em comparação com animais mdx controle (Figura 3B).

[0069] A expressão gênica do myh7 é aumentada significativamente (p < 0,05, teste t não pareado) em animais mdx em comparação com C57 animais selvagens (Figura 3C). Tratar animais mdx com

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BIO101 e BIO103 a uma dosagem de 50 mg/ kg * dia reduz significativamente a expressão de MYH7 (p < 0,01, teste t não pareado) em comparação com animais mdx que receberam o veículo (Figura 3D). Além disso, ο BIO101 reduz a expressão gênica de BMP4 (p = 0,0529, teste t não pareado) comparado com os animais mdx controle, recebendo o veículo (Figura 3D).

Fibrose do músculo esquelético (estudo histolóqico: Figuras 4 e 5)

[0070] Uma avaliação da fibrose muscular por estudo histológico é realizada no músculo tibial anterior (abreviado como TA). As secções histológicas (7 pm) são produzidas e coradas tanto com hematoxilina eosina (HE) ou com Sirius Red (SR).

[0071] Um estudo anatomopatológico das secções do músculo tibial anterior coradas com HE toma possível avaliar o grau de envolvimento das fibras musculares. Imagens representativas de secções do músculo tibial anterior coradas com HE obtidas a partir de animais C57 (Figura 4A), animais mdx (Figura 4B), animais mdx tratados com BIO101 (Figura 4C) e animais mdx tratados com BIO103 (Figura 4D) são mostradas. As barras de escala correspondem a 200 pm. Os músculos TA de camundongos C57 não mostram lesões musculares (Figura 4A). Os músculos TA de camundongos mdx não tratados mostram uma ampla diversidade de perfis de lesões: anisocitose moderada com numerosas fibras necróticas. Alguns músculos exibem em sua parte anisocitose pronunciada a grave, multifocal, com atrofia de uma grande proporção de miócitos, assim como grandes focos inflamatórios crônicos com fibrose associada (Figura 4B) e infiltrados de células mononucleares (essencialmente macrófagos). O sinal Δ indica os focos inflamatórios aos quais a fibrose está associada. Finalmente, alguns músculos exibem grandes placas necróticas agudas. Os músculos dos camundongos tratados com BIO101 exibem apenas dois tipos de perfis de lesão: um perfil de lesão menor com poucas anisocitoses, necrose ou inflamação (37,5%, 3 de 8 músculos TA) e um

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21/31 perfil de lesão acentuada com anisocitose, fibras necróticas dispersas e inflamação variável (62,5%, 5 em cada 8 músculos TA) (Figura 4C). Curiosamente, os músculos dos camundongos tratados com BIO103 exibem menos lesões musculares com um perfil de lesão menor. De fato, 67% (6 de 9 músculos TA) dos músculos tratados com B10103 podem ser classificados nesta categoria. Em termos histológicos, a grande maioria dos miócitos exibe núcleos centrais (indicadores de fenômenos de necrose-regeneração), variação mínima a leve no tamanho (anisocitose), alguns raros miócitos necróticos e hipercontratados (fase inicial da necrose, setas pretas, Figura 4D) e algumas células inflamatórias raras no endomísio. Os outros músculos tratados com BI0103 exibem quer um perfil de lesão acentuada com uma tendência um pouco necrótica (11% de músculos TA, 1 de 9 músculos TA) com anisocitose, fibras necróticas dispersas, e necrose aguda, isto é, um perfil pronunciado de lesão tendendo à atrofia com anisocitose significativa, sem fibra necrótica (11%, 1 em cada 9 músculos TA). Finalmente, um dos músculos TA exibe um perfil de lesão grave com grandes placas necróticas agudas sem ação regeneradora (11%, 1 em cada 9 músculos TA).

[0072] Uma análise anatomopatológica das seções do músculo tibial anterior coradas com SR torna possível quantificar a área fibrótica. A coloração com SR permite visualizar zonas fibróticas nos cortes histológicos (Rittié 2017). Imagens representativas das secções do músculo tibial anterior coradas com SR obtidas de animais C57 (Figura 5A), animais mdx (Figura 5B), animais mdx tratados com BI0101 (Figura 5D) e animais mdx C57 tratados com BI0103 (Figura 5E) são mostradas. A barra de escala representa 200 pm. A área de percentagem correspondente a fibrose é significativamente aumentada (p < 0,001, teste de Mann Whitney) no grupo mdx em comparação com o grupo C57 (Figura 5C). As setas pretas indicam as zonas que exibem fibrose muscular significativa. Os animais mdx tratados com BIO103 claramente tende a impedir

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22/31 (p = 0,0709, teste t não pareado) o aparecimento de fibrose em comparação com o grupo mdx controle, recebendo o veículo (Figura 5F).

Fibrose do músculo esquelético (estudo bioquímico: Figura 6)

[0073] Juntamente com as observações feitas no músculo tibial anterior, é realizada uma avaliação de um marcador de fibrose muscular no músculo gastrocnêmio. O músculo é dissociado com agitação moderada por 16 horas a 4 °C em tampão de lise RIPA. As proteínas são analisadas, resolvidas em gel de SDS PAGE antes de serem transferidas para a membrana de PVDF. O colágeno I é detectado por Western Blot, detectado por quimioluminescência então quantificado por densitometria após normalização com referência a detecção de GAPDH. Como esperado, a expressão da proteína de colágeno I é aumentada significativamente (p < 0,01; teste t não pareado) nos músculos gastrocnêmios de camundongos mdx em comparação com os músculos de camundongos saudáveis (C57). A expressão proteica do colágeno I é aumentada em 27 vezes (Figura 6 A). Tratar os camundongos mdx com BIO103 faz com que seja possível observar uma diminuição significativa (p < 0,01; teste t não pareado) na expressão da proteína de colágeno I em comparação com camundongos não tratados mdx (veículo) (Figura 6B).

[0074] Resultados experimentais adicionais relacionados à atividade biológica de BIO101 e BIO103 são dados na seção 5 da presente descrição, daqui em diante.

4. Atividade biológica in vitro de BIO1Q1 Diferenciação de mioblastos em miotubos

[0075] Sterrenburg et al. demonstraram que a regeneração muscular ineficaz nas células DMD é causada pela diferenciação prejudicada dos mioblastos e manutenção deficiente do miotubo (Turk et al., 2006). Uma combinação de proliferação reduzida, fusão prejudicada e manutenção deficiente de miotubos de DMD leva à regeneração muscular ineficaz e pode

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23/31 contribuir com o fenótipo grave de pacientes com DMD.

[0076] Vários parâmetros foram medidos para avaliar a diferenciação do miotubo. As células do músculo esquelético de DMD humanas (KM571DMD10FL CI1) foram diferenciadas por 3 dias e depois incubadas com ou sem BIO101 a 10 μΜ. O índice de fusão e o número de núcleos por miotubo foram validados como indicadores relevantes e sensíveis da diferenciação do miotubo.

[0077] O índice de fusão ilustrado na Figura 7A representa a porcentagem de núcleos celulares diferenciados em relação ao total celular.

[0078] O número de núcleos por miotubo é ilustrado na Figura 7B, foram contados 300 miotubos.

[0079] O diâmetro do miotubo é ilustrado na Figura 7C, foram medidos 150 miotubos por condição.

[0080] Foi observada na presença de BIO101 a diferenciação intensificada de mioblastos de DMD humanos em miotubos (Figuras 7A, 7B e 7C). Um aumento significativo de + 7% (p < 0,001) do índice de fusão é observado.

[0081] Isto é acompanhado por um aumento de 34% (p < 0,01) no número de núcleos por miotubo, e um aumento de 21% (p < 0,001) no diâmetro do miotubo.

[0082] Os resultados nas Figuras 7A, 7B e 7C mostram os dados médios medidos durante três experimentos independentes, mais ou menos o erro padrão (SEM). A análise estatística utilizando o teste de Mann Whitney mostra uma diferença significativa entre as células tratadas com BIO101 a uma concentração de 10 μΜ (micromols) e as células de controle não tratadas (anotadas como CTL na Figura 7), p < 0,01(**j; p < 0,001 (***).

Vias de sinalização

[0083] A via de sinalização PI3K/ AKT/ mTOR desempenha um

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24/31 papel essencial no crescimento celular, proliferação, motilidade, sobrevida, apoptose, autofagia e angiogênese (Hay et al., 2004).

[0084] As MAP quinases (abreviadas das proteínas quinases ativadas por mitígeno), incluindo ERK1 e ERK2, estão envolvidas em uma variedade de funções, como regeneração muscular, reestruturação e contrações. Em camundongos mdx, foi demonstrado (Roffe et al., 2010) que a ativação das vias PI3K/ Akt e MAPK nas células musculares estava particularmente associada a efeitos benéficos (Turgeman et al., 2008; Huebner et al., 2008).

[0085] As células do músculo esquelético DMD humanas (KM571DMD10FL CI1) foram diferenciadas por 5 dias, em seguida, opcionalmente incubadas com BIO101 a 10 μΜ por períodos de 10 minutos e 24 horas.

[0086] A análise densitométrica dos resultados de, pelo menos, 6 experimentos independentes de Western Blot descrevendo os efeitos de BIO101 na fosforilação de AKT (Figura 8 A) e ERK1/2 (Figura 8B) é mostrada, * p < 0,05 versus o controle não tratado.

[0087] Observa-se que ο BIO101 induz um aumento significativo de p-AKT e p-ERKI/2.

[0088] Ao ler os resultados mostrados, observa-se que ο BIO101 induz ativação precoce significativa das vias de sinalização AKT e MAPK nos miócitos da DMD humana.

Respiração celular

[0089] Sabe-se que existe uma diminuição na respiração mitocondrial basal nas fibras musculares de DMD (Schuh et al. 2015).

[0090] Curiosamente, nos miotubos de pacientes com DMD, as propriedades benéficas do BIO101 em termos de diferenciação dos mioblastos de um paciente com DMD (Figura 7) são acompanhadas por efeitos positivos no

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25/31 metabolismo energético.

[0091] Células musculares esqueléticas DMD humanas (KM571DMD10FL CI1) foram diferenciadas por 4 dias, em seguida, incubadas na presença ou ausência de BIO101 (1 ou 5 μΜ) por 2 dias. A taxa de consumo de oxigênio, também conhecida como OCR, que reflete a respiração mitocondrial das células foi medida usando um Seahorse XF Analyzer (marca registrada, Agilent).

[0092] A respiração basal é medida diretamente, enquanto a respiração máxima é medida após a adição de oligomicina seguida pela FCCP (Figura 9A e Figura 9B). Os resultados são referenciados ao OCR das células não tratadas e são mostrados na forma de médias mais ou menos o erro padrão (SEM).

[0093] Após dois dias de tratamento com BIO101, parece que as células de um paciente com DMD aumentaram significativamente as respirações basal e máxima em comparação com as células não tratadas.

[0094] Mais especificamente, uma respiração basal aumentada em 20% (p < 0,01) é observada em células tratadas com BIO101 a uma dosagem de 1 μΜ. Uma respiração basal aumentada em 21 % (p < 0,001) é observada nas células tratadas com BIO101 a uma dose de 5 μΜ. Uma respiração máxima aumentada em 51% (p < 0,05) é observada em células tratadas com BIO101 a uma dose de 1 μΜ. Uma respiração máxima aumentada em 22% (p = 0,13) é observada em células tratadas com BIO101 a uma dose de 5 μΜ.

[0095] Os resultados mostrados são obtidos de pelo menos quatro experimentos independentes.

[0096] O teste estatístico de Mann e Whitney tomou possível demonstrar uma diferença significativa entre as células tratadas com BIO101 a 1 e 5 μΜ e as células não tratadas, p < 0,05 (*), < 0,01 (**), 0,001 (***).

[0097] Ο BIO101 contribui para a melhoria do metabolismo

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26/31 energético das células musculares de pacientes com DMD.

5. Atividade biológica de BIO1Q1 e BIQ103 in vivo

[0098] O músculo esquelético estriado é um dos tecidos mais vascularizados do corpo e as células endoteliais são essenciais para os processos de regeneração muscular. A distrofina está presente no nível das células musculares lisas dos vasos e a sua ausência pode causar distúrbios na vascularização. De fato, foi demonstrado que em um músculo DMD, as fibras necróticas são frequentemente agrupadas e que esse fenômeno foi devido a uma redução no fluxo sanguíneo dos capilares comuns para esse agrupamento de fibras (Rando, 2001), induzindo necrose de fibras isquêmicas.

[0099] Além do fluxo sanguíneo, estudos mais recentes demonstraram uma redução na densidade vascular em camundongos mdx (Loufrani et al., 2004; Matsakas et al., 2013). Um estudo adicional também demonstrou que a angiogênese foi prejudicada no modelo de camundongo mdx (Palladino et al., 2013). Estes estudos mostram que existe uma lógica que indica que existe um defeito de vascularização em DMD tanto em termos da sua qualidade, quantidade do mesmo, bem como em termos de angiogênese, e que o tecido muscular é colocado sob condições isquêmicas.

Vascularização do músculo esquelético

[00100] O estudo de vascularização quantitativa foi realizado em secções do músculo tibial anterior (abreviado como TA) de camundongos saudáveis C57, bem como em camundongos mdx tratados com o veículo e camundongos mdx tratados com BIO101 ou BIO103.

[00101] Marcação por imunofluorescência dupla é realizada, marcação anti-laminina, com a função de identificação da membrana basal das fibras musculares e marcação anti-CD31 tendo a função de identificação do vaso. O número de vasos por fibra muscular é quantificado.

[00102] Como esperado, observa-se que os animais que

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27/31 apresentam uma mutação no gene da distrofina (mdx) têm um número reduzido de vasos por fibra muscular. A redução observada é 27,2% (p < 0,01) em comparação com os animais saudáveis (C57) (Figura 10A).

[00103] Os animais mdx receberam diariamente, por via oral, o veículo ou BI0101 (50mg/ kg * dia) ou BI0103 (50mg/ kg * dia). Os resultados da quantificação do número de fibras musculares após dois meses de exposição diária são mostrados na Figura 10B.

[00104] Observou-se que os animais mdx que receberam BIO101 ou BIO103 exibem maior vascularização do que os animais mdx que receberam o veículo. Observa-se que ο BIO101 tende a melhorar o número de vasos por fibra muscular em um aumento de 14,1% (p = 0,13, teste t não pareado). De uma forma mais pronunciada, ο BIO103 aumenta significativamente, em 28,2% (p = 0,006, teste t não pareado) a vascularização muscular em comparação com os animais mdx não tratados (veículo).

[00105] Tratamentos com BIO101 e particularmente com BIO103 aumentam o número de vasos por fibra muscular.

[00106] Estes resultados demonstram uma eficácia de BIO101 e BIO103 em vários parâmetros musculares in vitro e in vivo. De fato, ο tratamento de células musculares de pacientes que sofrem de DMD com BIO101 ou BIO103 demonstra que eles aumentam a diferenciação, e o metabolismo energético (respiração mitocondrial) das células e que são capazes de aumentar a vascularização muscular in vivo, o que é importante para a adequada função do músculo.

Conclusão

[00107] Tendo em vista as propriedades do BIO101 e do BI0103 na função muscular e no aparecimento de fibrose muscular do miocárdio e esquelético em mamíferos que sofrem de miopatia, o uso de BIO101 e BIO103 pode, portanto, ser proposto, isoladamente ou em conjunto com um tratamento

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28/31 destinado a corrigir os efeitos de uma alteração genética, para preservar a função muscular, particularmente força muscular e tolerância ao esforço e, assim, retardar a progressão de miopatias que provoquem a deterioração da dita função muscular, e mais particularmente o aparecimento de fibrose. Essas miopatias incluem miopatias genéticas, particularmente a distrofia muscular de Duchenne.

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Claims (20)

1. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS, caracterizados por ser para uso no tratamento de miopatia resultante de uma alteração genética.

2,3,14-trih idroxi-10,13-d imeti I-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 Hciclopenta[a]fenantren-6-ona;

- No. 8: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(2h idroxieti Isu Ifan i l)aceti l]-10,13-d imeti I-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 Hciclopenta[a]fenantren-6-ona

2/5 aumentada.

2. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por ser no tratamento de condições resultantes de comprometimento da função muscular induzida por uma miopatia genética.

3/5 referido extrato.

3. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizados pela função muscular ser aquela do músculo esquelético estriado ou do miocárdio.

4/5 do tipo OH, OMe, (C-i-Ce), N(Ci-Ce), CO2(Ci-C6); um grupo CH2Br;

W sendo um heteroátomo escolhido a partir de N, O e S.

4. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizados pelo comprometimento da função muscular ser a hipertrofia do miocárdio.

5/5

- No. 6: 2-[2-oxo-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14- trih idroxi-10,13-dimetil-6-oxo-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 Hciclopenta[a]fenantren-17-il]etil] etil sulfanilacetato;

- No. 7: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-etilsulfanilacetil)-

5. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizados pela função muscular ser pelo menos em parte prejudicada pelo aparecimento progressivo de fibrose.

6. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizados pela alteração genética incluir uma mutação no gene da distrofina.

7. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizados pela miopatia resultante de uma alteração genética ser a distrofia muscular de Duchenne (DMD) e/ ou distrofia muscular de Becker (BMD).

8. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS destinados a serem utilizados, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizados pela respiração mitocondrial das células musculares ser

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9. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizados pelo número de vasos por fibra muscular ser aumentado.

10. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizados pela diferenciação de mioblastos em miotubos ser aumentada.

11. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizados pela 20hidroxiecdisona ser um composto de fórmula (I):

OH

12. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizados pelo 20hidroxiecdisona ser um extrato de planta ou um extrato de parte de uma planta, a referida planta sendo escolhida a partir de plantas que contenham, pelo menos, 0,5% de 20-hidroxiecdisona de fórmula (I) em peso seco da referida planta, compreendendo o referido extrato pelo menos 95% e, de preferência, pelo menos 97% de 20-hidroxiecdisona de fórmula (I).

13. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizados pelo extrato compreender entre 0 e 0,05%, em peso seco do extrato, de impurezas suscetíveis a afetar a segurança, disponibilidade ou eficácia de uma aplicação farmacêutica do

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14. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizados pela planta ser escolhida a partir de Stemmacantha carthamoides, Cyanotis arachnoidea e Cyanotis vaga.

15. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo 20hidroxiecdisona ser de um extrato de raiz de Stemmacantha carthamoides compreendendo pelo menos 95% e, de preferência, pelo menos 97%, de 20hidroxiecdisona de fórmula (I).

16. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por um derivado ser um composto da fórmula geral (II):

V-U é uma ligação carbono-carbono simples e Y é um grupo hidroxila ou hidrogênio, ou V-U é uma ligação etileno C=C;

X é um oxigênio,

Q é um grupo carbonila;

R¹ é selecionado a partir de: um grupo (Ci-C6)W(Ci-Ce); um grupo (Ci-C6)W(Ci-C6)W(Ci-Ce); um grupo (Ci-C6)W(Ci-C6)CO2(Ci-Ce); um grupo (CiCe)A, A representando um heterociclo opcionalmente substituído por um grupo

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17. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por na fórmula (II):

Y ser um grupo hidroxila;

R¹ ser selecionado a partir de: um grupo (Ci-C6)W(Ci-C6); um grupo (Ci-C6)W(Ci-C6)W(Ci-C6); um grupo (Ci-C6)W(Ci-C6)CO2(Ci-C6); um grupo (Ci-C6)A, A representando um heterociclo opcionalmente substituído por um grupo do tipo OH, OMe, (C-i-Ce), N(Ci-Ce), CO2(Ci-C6).

W ser um heteroátomo escolhido a partir de N, O e S.

18. 20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por serem escolhidos entre:

- No. 1: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-10,13dimetil-17-(2-morpholinoacetil)-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 Hciclopenta[a] fenantren-6-ona,

- No. 2: (2S,3R,5R,1 OR, 13R, 14S,17S)-2,3,14-tri-hidroxi-l 7-[2-(3h idroxipirrol id in-1 -i l)aceti l]-10,13-d im eti I-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 Hciclopenta[a]fenantren-6-ona;

- No. 3: (2S,3R,5R, 10R, 13R, 14S, 17S)-2,3,14-trihidroxi-17-(2-(4hidroxi-1 -piperid i l)acetil]-10,13-d im eti I-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 Hciclopenta[a]fenantren-6-ona;

- No. 4: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-[4-(2hidroximetil)-1 -piperidil] acetil]-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17- decahidro-1 H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona;

No. 5: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-[2-(3dimetilaminopropil(metil)amino)acetil]-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1 H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona;

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19.

20-HIDROXIECDISONA E SEUS DERIVADOS para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo derivado ser de fórmula (III):