KR102363109B1 - 적혈구의 응집 방법 및 분리 방법, 및 적혈구 응집용 시약 - Google Patents

적혈구의 응집 방법 및 분리 방법, 및 적혈구 응집용 시약 Download PDF

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Abstract

혈액 시료로부터 적혈구를 순시에 충분한 크기로 응집시킬 수 있고, 혈액 시료로부터 적혈구를 완전히 분리시킬 수 있는, 적혈구의 응집 방법 및 분리 방법 및 적혈구 응집용 시약을 제공한다. 본 발명의 적혈구 응집 방법은 혈액 시료에, 콜산계 계면활성제 및 산을 함유하는 용액을 첨가하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 적혈구의 분리 방법은 상기 본 발명의 방법에 의해 응집시킨 적혈구를 분리하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 적혈구 응집용 시약은 콜산계 계면활성제 및 산을 함유한다.

Description

적혈구의 응집 방법 및 분리 방법, 및 적혈구 응집용 시약
본 발명은 적혈구의 응집 방법 및 분리 방법, 및 적혈구 응집용 시약에 관한 것이다.
혈액은 다양한 질환의 진단이나 치료의 판정에 사용되고 있고, 적혈구, 백혈구 및 혈소판 등의 혈구 성분과, 액체 성분인 혈장으로 이루어진다. 이 혈액에 포함되는 혈장(액체 성분)이나, 혈액으로부터 혈구 성분과 피브린을 제외한 혈청은 단백질, 당류, 지방질 등의 생체의 기능 유지에 필요한 다양한 성분을 포함하고 있고, 내장계 질환 등의 진단이나 치료를 행하기 위한 생화학 검사용의 분석용 시료로서 사용되고 있다.
그러나, 생화학 검사를 행할 때에 혈구 성분이 분석용 시료 중에 존재하면, 혈구 성분이 검사를 저해하는 경우가 있고, 특히 비색 분석 등을 이용하여 생화학 검사를 행하는 경우에는 적혈구가 시료의 색이나 탁도에 영향을 주어 검사를 저해하는 경우가 있었다.
그 때문에, 생화학 검사에 있어서는 전혈 시료로부터 적혈구 등의 혈구 성분을 미리 분리한 혈장 또는 혈청이 분석용 시료로서 사용되고 있다. 혈구 성분을 혈장 또는 혈청과 분리하는 방법으로서는 환자로부터 채혈 바늘을 사용하여 채혈한 혈액을 채혈관에 넣고, 혈액을 포함하는 채혈관을 원심분리기에 걸어서 원심분리하는 방법이 사용되고 있다. 그러나, 이러한 원심분리기를 사용한 분리는 장시간을 요하고 손기술이 번잡한 등의 문제점이 있어, 보다 간편한 분리 방법이 요구되고 있었다.
또한 원심분리 이외의 분리 방법으로서, 혈구 분리막, 혈구 분리재, 중공사라고 한 특수한 필터를 사용하는 방법이 있다. 예를 들면, 고층 지지체 입자, 고층 지지체 결합제 막, 적혈구 응집소로 이루어지는 필터를 사용하고, 전체 혈액 샘플로부터 적혈구를 분리하여 혈장을 생성하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 1).
그러나, 이들의 필터를 사용한 경우에는 적하한 혈액 시료가 필터 내에 침투하여 확대되고, 필터 중에 혈장 또는 혈청이 잔존하는 것이 된다. 그 때문에, 혈액 시료가 소량인 경우에는 적혈구를 분리한 후의 혈장 또는 혈청의 양이 적어지고, 생화학 검사를 행하는데 충분한 양의 분석용 시료를 얻을 수 없다는 문제가 있었다. 또한, 분리 조작의 과정에 있어서 필터에 어떠한 압력이 걸림으로써, 용혈이 생기거나 혈액이 비산하는 등의 문제가 있었다.
전혈로부터 적혈구를 제거하는 다른 방법으로서는 아세트산, 시트르산, 아스코르브산, 락트산, 말레산, 말산 및 말론산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 산을 포함하는 용액을, 적혈구가 응집하는데 효과적인 조건 하에서 전혈 시료와 접촉시키고, 이어서 섬유 형상 재료를 사용하여 여과하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 2).
한편, 계면활성제의 일종인 콜산계 계면활성제는 막 단백질의 추출이나 분리에 사용되는 음이온성 계면활성제이며, 예를 들면 바이오센서를 구비한 장치를 사용하여 헤모글로빈 농도를 측정할 때에, 콜산계 계면활성제를 용혈제로서 사용하는 것이 보고되어 있다(특허문헌 3). 그러나, 적혈구를 응집시킬 때에 콜산계 계면활성제를 사용한 예는 지금까지 보고되어 있지 않다.
미국 특허 제5981294호 미국 특허 제5118428호 일본 특허 공개 2014-102143
상술한 바와 같이, 종래의 원심분리법이나 특수한 필터를 사용한 적혈구의 분리법에서는 장시간을 요하는 복잡한 조작이거나, 용혈이나 혈액의 비산의 문제가 있었다. 또한, 산을 사용하여 적혈구를 응집시키는 방법(특허문헌 2)의 경우에도, 응집한 적혈구의 크기가 미세하기 때문에 적혈구의 분리가 불완전하여, 생화학 검사를 위한 분석용 시약으로서는 불충분했다.
본 발명은 이상의 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 그 목적은 혈액 시료로부터 적혈구를 순시에 충분한 크기로 응집시킬 수 있고, 혈액 시료로부터 적혈구를 완전히 분리시킬 수 있는, 적혈구의 응집 방법 및 분리 방법 및 적혈구 응집용 시약을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 예의검토를 거듭한 결과, 혈액 시료 중의 적혈구를 응집시키는 방법에 있어서, 산과 함께 콜산계 계면활성제를 포함하는 용액을 혈액 시료에 첨가함으로써, 종래의 산만을 첨가하는 적혈구 응집법에 비해 순시에 충분한 크기의 적혈구의 응집시킬 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
콜산계 계면활성제는, 종래 용혈제로서 알려져 있었지만, 적혈구를 응집시킬 때에 콜산계 계면활성제를 산과 조합시켜 포함하는 용액을 혈액 시료에 첨가함으로써, 용혈을 일으키지 않고 적혈구를 순시에 충분한 크기로 응집시킬 수 있었던 것은, 종래는 예상할 수 없었던 사실이다.
즉, 본 발명은 혈액 시료에, 콜산계 계면활성제 및 산을 함유하는 용액을 첨가하는 것을 포함하는, 적혈구의 응집 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명 방법에 의해 응집시킨 적혈구를 분리하는 것을 포함하는, 혈액 시료로부터의 적혈구의 분리 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 콜산계 계면활성제 및 산을 함유하는 적혈구 응집용 시약을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 시약의, 적혈구를 응집시키기 위한 시약으로서의 사용을 제공한다.
(발명의 효과)
본 발명의 방법 및 시약을 사용함으로써, 혈액 시료로부터 충분한 크기의 적혈구를 순시에 응집시킬 수 있고, 종래와 같은 장시간의 원심분리나 특수한 필터를 사용한 분리법을 사용하지 않고도 적혈구를 완전히 분리할 수 있고, 혈청 및 혈장을 포함하는 성분과 적혈구를 용이하게 또한 간편하게 분리할 수 있다.
도 1은 비교예 1-1, 비교예 1-2 및 실시예 1에서 행한 적혈구 응집 확인 실험의 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 비교예 2-1, 비교예 2-2 및 실시예 2에서 행한 적혈구 응집 확인 실험의 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 비교예 3-1, 비교예 3-2 및 실시예 3에서 행한 적혈구 응집 확인 실험의 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 비교예 4-1, 비교예 4-2 및 실시예 4에서 행한 적혈구 응집 확인 실험의 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명에 의한 적혈구의 응집 방법은 혈액 시료에, 콜산계 계면활성제 및 산을 포함하는 용액을 첨가하는 것을 특징으로 한다.
(혈액 시료)
본 발명에 있어서, 혈액 시료란 인간 또는 동물의 피험자로부터 채혈에 의해 취득한 적혈구가 포함되는 시료이다. 혈액 시료로서는 피험자로부터 채혈한 전혈을 그대로 사용해도 좋고, 채취한 전혈을 생리식염수 등으로 희석한 시료를 사용해도 좋지만, 조작의 간편성의 점에서 피험자로부터 채혈한 전혈을 그대로 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 있어서 사용하는 혈액 시료의 양은, 통상 10㎕~50ml이고, 바람직하게는 10㎕~1ml이고, 보다 바람직하게는 10㎕~100㎕이다.
(콜산계 계면활성제)
본 발명에서 사용하는 콜산계 계면활성제란 분자 내에 스테로이드 골격을 갖는 계면활성제이며, 구체적으로는 콜산 또는 콜산의 유도체의 구조를 갖는 계면활성제이다. 여기에서, 콜산유도체란 콜산으로부터 유도되는 모든 화합물을 의미하지만, 구체적으로는 데옥시콜산 등의 탈히드록실기 화합물, 타우로데옥시콜산 등의 치환 아미드 화합물 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 콜산계 계면활성제는, 바람직하게는 콜산, 콜산 나트륨, 데옥시콜산, 데옥시콜산 나트륨, 타우로데옥시콜산 나트륨, 케노데옥시콜산, 케노데옥시콜산 나트륨, 글리코콜산, 글리코콜산 나트륨, 글리코데옥시콜산, 글리코데옥시콜산 나트륨, 글리토콜산, 글리토콜산 나트륨, 리토콜산, 리토콜산 나트륨, 타우로콜산, 타우로콜산 나트륨, 타우로우르소데옥시콜산, 타우로우르소데옥시콜산 나트륨 등의 음이온성 계면활성제; 폴리옥시에틸렌콜레스테릴에테르, N,N-비스(3-D-글루콘아미드프로필)코라미드(BIGCHAPS) 등의 비이온성 계면활성제; 황산-3-〔(3-콜아미드프로필)디메틸암모니오〕-1-프로판(CHAPS) 등의 양쪽 이온성 계면활성제, 또는 이들의 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다. 이들의 콜산계 계면활성제는 단독으로 사용해도 좋고, 2종류 이상을 조합시켜 사용해도 좋다.
콜산계 계면활성제로서는, 그 중에서도 응집 속도와 적혈구의 보다 완전한 분리의 관점에서 콜산 나트륨, 데옥시콜산 나트륨, 타우로데옥시콜산 나트륨 및 그들의 수화물 등의 음이온성 콜산계 계면활성제가 바람직하고, 특히는 타우로데옥시콜산 나트륨 및 그 수화물이 바람직하다.
(산)
본 발명에서 사용하는 산으로서는 수용액 중에서 수소 이온(H＋)을 내는 물질이면 좋다. 구체적으로는, 무기산 및 유기산 및 그들의 염을 들 수 있다. 무기산으로서는 염산, 브롬화수소산, 황산, 술파민산, 인산, 질산 등을 들 수 있다. 유기산으로서는, 예를 들면 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아린산, 락트산, 말산, 주석산, 시트르산, 말론산, 아스코르브산, 팜산, 말레산, 아디프산, 알긴산, 아스파르트산, 히드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 술파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸말산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 에탄디술폰산, 옥살산, 이세티온산, 글루코헵탄산, 글리세로인염, 헤미술파닉에시드(hemisulfanic acid), 헵탄산, 헥산산, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 2-히드록시에탄술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 펙티닌산, 인산, 황산, 3-페닐프로피온산, 피크르산, 피발산, 티오시안산, p-톨루엔술폰산, 부티르산, 캄퍼산, 캄퍼술폰산, 디글루콘산, 시클로펜탄프로피온산, 이중황산, 도데실황산, 에탄술폰산 및 운데칸산 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 산은 단독으로 사용해도 좋고, 2종류 이상을 조합시켜 사용해도 좋다.
본 발명에서 사용하는 산으로서는 응집 속도와 적혈구의 보다 완전한 분리의 관점에서 유기산이 바람직하고, 그 중에서도 아세트산, 주석산, 말론산, 말산 및 시트르산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유기산이 바람직하고, 또한 다가카르복실산이 바람직하고, 특히는 시트르산이 바람직하다.
(적혈구 응집용 시약)
본 발명에 있어서는 혈액 시료에, 상기 콜산계 계면활성제 및 산을 포함하는 용액을 첨가함으로써 적혈구를 응집시킨다. 혈액 시료에 첨가하는, 이러한 콜산계 계면활성제 및 산을 포함하는 용액은 적혈구를 응집시키기 위한 시약(적혈구 응집용 시약)으로서 사용할 수 있다.
이러한 콜산계 계면활성제 및 산을 포함하는 용액(이하, 「적혈구 응집 시약」이라고 함)은 산을 생리식염수 등으로 희석하여 얻어진 산수용액에 콜산계 계면활성제를 첨가하는 방법 등에 의해 조제할 수 있다. 또한, 응집 속도와 적혈구의 보다 완전한 분리의 관점에서 적혈구 응집 시약 중의 산의 농도로서는, 통상 1mM~1M이고, 5mM~500mM이 바람직하고, 10mM~200mM이 보다 바람직하고, 적혈구 응집 시약의 pH는 2.0~5.0이 바람직하고, 2.2~4.5가 보다 바람직하고, 2.5~4.0이 더욱 바람직하다. 여기에서, 적혈구 응집 시약의 pH는 유리 전극법에 의한 시판의 pH 미터를 사용하여 측정할 수 있다. 적혈구 응집 시약에는 상기 산, 콜산계 계면활성제, 생리식염수 이외에, 용혈시키지 않은 계면활성제(예를 들면, Tween 20이나 Emulgen A500 등의 계면활성제)나 시약 등을 포함하고 있어도 좋다.
적혈구 응집 시약 중의 콜산계 계면활성제의 농도는, 통상 0.05~15.0중량%이며, 0.06~13.0중량%가 바람직하고, 0.075~8.0중량%가 보다 바람직하고, 0.1~6.0중량%가 특히 바람직하다.
적혈구 응집 시약 중의 콜산계 계면활성제와 산의 비율(몰비)은 응집 속도와 적혈구의 보다 완전한 분리의 관점에서, 통상 1:7~1:2000이며, 1:8~1:1667이 바람직하고, 1:13~1:1333이 보다 바람직하고, 1:17~1:1000이 특히 바람직하다. 사용하는 혈액 시료에 대한 적혈구 응집 시약의 첨가량(체적비)은, 통상 1:4~1:80, 바람직하게는 1:8~1:20, 보다 바람직하게는 1:10~1:13이다.
(적혈구의 응집 방법)
본 발명에 있어서는 혈액 시료에 상기 적혈구 응집 시약을 실온에서 그대로 첨가하면 적혈구가 충분한 크기로 순시에 응집하지만, 응집을 보다 완전히 진행시키기 위해서는 혈액 시료를 적혈구 응집 시약과 접촉시킨 상태에서 5초~30초, 바람직하게는 5초 정도 정치 후, 수회 전도 혼화하는 것이 좋다. 이와 같이 하여 적혈구를 응집시킴으로써, 충분한 크기를 갖는 응집물을 얻을 수 있다.
본 발명의 방법 및 시약을 사용하여 응집시킨 적혈구는 충분한 크기를 갖고 있기 때문에, 용이하게 또한 간편하게 혈액 시료로부터 분리할 수 있다. 응집한 적혈구의 분리 방법으로서는 적혈구의 응집물이 침전한 후의 상청을 회수하는 방법이나, 여지를 사용한 여과에 의해 분리하는 방법을 들 수 있다. 이와 같이 하여 적혈구를 분리한 후의 혈청 성분 및 혈장 성분은 실질적으로 적혈구를 포함하지 않기 때문에, 생화학 검사용의 분석용 시료로서 사용할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 무엇보다, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1~4, 비교예 1-1~4-2)
콜산계 계면활성제 및 염의 유무와 pH 범위에 의한 적혈구 응집
71mL의 증류수에 10%w/v 타우로데옥시콜산 나트륨 수화물(TDOC) 10mL과, 1M 시트르산 10mL, 10%w/v 염화나트륨 9mL을 첨가하고, 최종 농도가 100mM 시트르산, 1% TDOC, 0.9% 염화나트륨이 되는 용액(적혈구 응집용 시약)을 조제했다. 또한, TDOC 및/또는 염화나트륨을 첨가하지 않는 용액(적혈구 응집용 시약)을 마찬가지로 조제하고, 콜산계 계면활성제 및 염의 유무와 pH 범위가 적혈구의 응집에 주는 영향을 비교했다.
적혈구 응집용 시약 400㎕에 전혈 검체 60㎕을 첨가하여 적혈구의 응집 속도를 목시에 의해 확인했다. 응집 속도는 이하에 기재한 기준에 근거하여, 빠른 순으로 ＋＋＋＞＋＋＞＋＞±으로 하고, 응집하지 않고 용혈한 경우에는 ―로 했다.
＋＋＋: 적혈구가 순시에 충분한 크기로 응집하고, 적혈구의 응집물이 침전했다
＋＋: 적혈구가 수초 정치 후에 응집하기 시작하고, 점차 적혈구의 응집물이 침전했다
＋: 적혈구의 응집은 일어났지만, 응집물은 미소하여 응집이 불완전했다
±: 적혈구의 응집은 아주 조금이었다
―: 응집하지 않고 용혈했다
결과를 하기 표 1에 나타낸다.
또한, 적혈구 응집용 시약의 pH는 HORIBA 탁상형 pH 미터를 사용하여 측정했다(이하의 실시예 및 비교예에 있어서 동일함).
Figure 112019042074786-pct00001
표 1의 결과로부터, 적혈구 응집용 시약이 콜산계 계면활성제와 산을 포함하는 경우에는 pH가 2.5~5.0의 범위 내에 있어서, NaCl의 유무에 관계없이 응집 속도는 「＋＋＋」이 되고, 우수한 응집 효과를 보였다. 한편, 적혈구 응집용 시약이 콜산계 계면활성제를 포함하지 않고, 산만을 포함하거나 또는 산과 염만인 경우에는 응집 속도는 「―」으로 또는 「＋」가 되고, 용혈이 발생하거나, 또는 적혈구의 응집은 일어나더라도, 응집물이 미소하여 응집이 불완전했다. 이 결과로부터, 적혈구의 응집에 있어서는 콜산계 계면활성제의 존재가 큰 영향을 주는 것을 알았다.
(실시예 5~7) 콜산계 계면활성제와 산에 의한 적혈구 응집
생리식염수에 각종 콜산계 계면활성제(1중량%)와 시트르산(100mM)을 첨가하여 적혈구 응집용 시약(pH3.0)을 조제하고, 적혈구의 응집능을 비교했다.
적혈구 응집용 시약 400㎕에 전혈 검체 60㎕을 첨가하여 적혈구의 응집 속도를 확인했다. 응집 속도는 이하에 기재한 기준에 근거하여, 빠른 순으로 ＋＋＋＞＋＋＞＋＞±으로 하고, 응집하지 않고 용혈한 경우에는 ―로 했다. 또한, 이하의 기준은 상기 실시예 1~4, 및 비교예 1-1~4-2의 기준과 동일하다.
＋＋＋: 적혈구가 순시에 충분한 크기로 응집하고, 적혈구의 응집물이 침전했다
＋＋: 적혈구가 수초 정치 후에 응집하기 시작하고, 점차로 적혈구의 응집 물이 침전했다
＋: 적혈구의 응집은 일어났지만, 응집물은 미소하여 응집이 불완전했다
±: 적혈구의 응집은 아주 조금이었다
―: 응집하지 않고 용혈했다
결과를 하기 표 2에 나타낸다.
Figure 112019042074786-pct00002
표 2의 결과로부터, 적혈구 응집용 시약이 산과 함께 각종 콜산계 계면활성제를 포함하는 경우에도, 응집 속도는 「＋＋」 또는 「＋＋＋」이 되고, 우수한 응집 효과를 얻을 수 있는 것을 알았다. 특히, 타우로데옥시콜산 나트륨 수화물(TDOC)의 적혈구 응집 효과가 가장 현저했다.
(실시예 8) 콜산계 계면활성제의 농도에 의한 적혈구 응집
생리식염수에 타우로데옥시콜산 나트륨 수화물(TDOC)과 시트르산(100mM)을 첨가하여 적혈구 응집용 시약(pH3.0)을 조제하고, 하기 표에 나타내는 TDOC의 농도범위에 대해서 적혈구의 응집능을 비교했다.
적혈구 응집용 시약 400㎕에 전혈 검체 60㎕을 첨가하고, 적혈구의 응집 속도를 확인했다. 응집 속도는 이하의 기준에 근거하여, 빠른 순으로 ＋＋＋＞＋＋＞＋＞±으로 하고, 응집하지 않고 용혈한 경우에는 ―로 했다. 또한, 이하의 기준은 상기 실시예 1~7, 및 비교예 1-1~4-2의 기준과 동일하다.
＋＋＋: 적혈구가 순시에 충분한 크기로 응집하고, 적혈구의 응집물이 침전했다
＋＋: 적혈구가 수초 정치 후에 응집하기 시작하고, 점차로 적혈구의 응집 물이 침전했다
＋: 적혈구의 응집은 일어났지만, 응집물은 미소하여 응집이 불완전했다
±: 적혈구의 응집은 아주 조금이었다
―: 응집하지 않고 용혈했다
결과를 하기 표 3에 나타낸다.
Figure 112019042074786-pct00003
표 3의 결과로부터, 콜산계 계면활성제의 농도가 0.1~6.0중량%인 경우에는 응집 속도는 「＋＋＋」가 되고, 우수한 응집 효과를 얻을 수 있는 것을 알았다.
또한, 상기 실시예 1~4에 있어서 적혈구의 응집물이 침전한 후의 상청을 분리하고, 이 분리한 상청을 면역크로마토 키트(QuickNavi(등록상표)-Ebola)에 적하하여 멤브레인 상의 이동을 관찰한 바, 멤브레인은 적색으로 착색되지 않았다. 이 결과로부터, 상기 분리 후의 상청은 실질적으로 적혈구를 포함하지 않고, 생화학 검사용의 분석용 시료로서 바람직하다는 것이 뒷받침되었다.

Claims (8)

  1. 혈액 시료에, 콜산계 계면활성제 및 산을 함유하는 용액을 첨가하는 것을 포함하고,
    상기 용액의 pH가 2.5~4.0인, 적혈구의 응집 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 콜산계 계면활성제가 타우로데옥시콜산 나트륨 수화물인 방법.
  4. 제 1 항에 기재된 방법에 의해 응집시킨 적혈구를 분리하는 것을 포함하는, 혈액 시료로부터의 적혈구의 분리 방법.
  5. 콜산계 계면활성제 및 산을 함유하고,
    pH가 2.5~4.0인, 적혈구 응집용 시약.
  6. 삭제
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 콜산계 계면활성제가 타우로데옥시콜산 나트륨 수화물인 시약.
  8. 삭제
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