CN111568938B

CN111568938B - 有机酸在促进旱莲草提取物止凝血活性中的应用

Info

Publication number: CN111568938B
Application number: CN202010416759.3A
Authority: CN
Inventors: 张炳火; 刘怀; 过七根; 杨建远
Original assignee: Jiujiang University
Current assignee: Jiujiang University
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-05-18
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2040-05-18
Also published as: CN111568938A

Abstract

本发明公开了有机酸在促进旱莲草提取物止凝血活性中的应用，旱莲草提取物具有良好的止血凝血效果，有机酸可作为所述旱莲草提取物的安全添加剂，能够极显著促进旱莲草提取物对红细胞的凝集活性，并促进可溶性纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，进一步提升制剂的止凝血效果。并在相同的止凝血活性下极大降低旱莲草提取物的使用剂量，为利用旱莲草提取物研制廉价、高效的外伤止凝血制剂提供新方法和思路，具有普及化的潜力。

Description

有机酸在促进旱莲草提取物止凝血活性中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药制剂研究领域，具体涉及有机酸在促进旱莲草提取物止凝血活性中的应用。

背景技术

旱莲草是一种重要的药用植物，是民间最常用的止血中草药，最早用于止血，常用来治疗阴虚血热、吐血、血衄、尿血、血痢、崩漏下血以及外伤出血等出血性病症，其止血功能在临床中药复方制剂方面已得到了一些应用，它是宁环片、功血宁冲剂和明目止血片等临床常用止血中药制剂的主要成分之一，但目前还没有纯粹利用旱莲草开发的止凝血药物。

申请人和发明人团队对旱莲草止凝血活性成分进行了研究和有效提取，并已对旱莲草止凝血活性成分的提取方法和应用申请了中国发明专利（专利申请号：201911322326.5）。申请人和发明人团队在进一步的研究中发现，在添加特定物质后，上述旱莲草提取物的止凝血活性会极显著增强，该发现将进一步促进利用旱莲草止凝血活性成分研制相关外伤止血药物，有利于提高其止血效果和降低生产成本等。

有机酸是一些具有酸性的有机物，在自然界中普遍存在，最常见的有机酸是羧酸，其酸性来源于羧基（-COOH）。有机酸不但在生物体内的代谢中具有重要的生理功能，在工农业生产等方面也具有多种用途，现有技术中有机酸主要应用包括：动物饲料添加剂和抑菌剂、食品饮料等调味剂和防腐剂、医用消毒和防腐剂、生产抗生素等多种药品的原料、作为中药的重要有效成分（如绿原酸）或本身就具有重要的生理活性（如抗坏血酸）、生产香料染料和塑料的原料等领域，虽对有机酸的应用对象和范围各领域研究人员均在不断的研究和公布，但是作为促止凝血成分的添加剂或催化剂的应用目前未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种有机酸在促进旱莲草提取物止凝血活性中的应用，添加有机酸后，可以极显著促进旱莲草提取物对红细胞的凝集活性和将可溶性纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白的活性，从而提高旱莲草提取物的止凝血效果。

本发明的技术方案为：

有机酸在促进旱莲草提取物止凝血活性中的应用。

所述有机酸为酒石酸、柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸、丙二酸、抗坏血酸和马来酸中的一种或多种。

所述有机酸在旱莲草提取物中的添加剂量为旱莲草提取物质量的4%~137%。

所述有机酸作为旱莲草提取物的止凝血添加剂时，在旱莲草使用剂量降低85%~95%时，对血样中红细胞凝集率可达90%以上。

所述有机酸作为旱莲草提取物的止凝血添加剂时，血浆中出现明显的絮状物。

有机酸在制备旱莲草提取物止凝血药物的应用。

本发明应用的技术效果：

1、旱莲草提取物具有良好的止凝血作用，本发明应用所述的有机酸作为添加剂，能够极显著促进旱莲草提取物对红细胞的凝集活性，并促进可溶性纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，进一步提升制剂的止凝血效果，增加了有机酸在医药领域的应用。

2、我国旱莲草原料丰富，且获得的有效提取物占旱莲草干重相对较高，同时各类有机酸均为水溶性物质，生产工艺成熟高效。最终研制成本相对较低，并在相同的止凝血活性下极大降低旱莲草提取物的使用剂量，为利用旱莲草提取物研制廉价、高效的外伤凝血止血制剂提供新方法和思路，具有普及化的潜力。

具体实施方式

下面对本发明作进一步清楚、完整的说明。

实施例1

不同酸碱度的盐对旱莲草提取物凝血活性的影响，试验过程如下：

（1）分别配制0.15 mol/L的强酸强碱盐（KCl、Na₂SO₄、KNO₃中的任一种）、强酸弱碱盐（KH₂PO₄、NaH₂PO₄、FeSO₄、ZnSO₄中的任一种）和弱酸强碱盐（K₂HPO₄、Na₂HPO₄、Na₂CO₃和乙酸钠中的任一种）溶液，备用；

（2）用50%的乙醇水溶液配制0.05~2.0μg/μL的旱莲草提取物溶液，备用；

（3）用一次性注射器采集人体静脉血，并立即用0.9%的无菌生理盐水稀释50倍，备用；

（4）取3.5μL样品溶液于洁净的载玻片上，待溶剂完全挥发后，加入1μL盐溶液（以等体积的0.9%生理盐水作为空白对照组）和2.5μL稀释血样，混合均匀后置于光学显微镜下观察，如果红细胞凝集成团，则说明有凝血活性。

试验结果如下表1中所示。旱莲草提取物与强酸强碱盐溶液混合后，对上述稀释血样中的红细胞的凝集活性没有明显影响；旱莲草提取物与强酸弱碱盐溶液混合后，则能提高旱莲草提取物对红细胞的凝集活性；而旱莲草提取物与弱酸强碱盐混合后，则导致旱莲草提取物凝集红细胞的活性降低甚至丧失。

表1 不同类型的盐对旱莲草提取物凝集红细胞活性的影响

注：+的个数越多表明凝血活性越强；-表明没有凝血活性。

以上试验结果说明，盐提供的pH值环境可能是导致旱莲草提取物凝集红细胞活性改变的原因，酸性条件会增强旱莲草提取物凝血活性，碱性条件会导致旱莲草提取物凝血活性降低甚至丧失。

实施例2

强酸和强碱的稀溶液对旱莲草提取物凝血活性的影响，试验过程如下：

分别配制浓度为0.001~0.00025 mol/L的硫酸、盐酸和NaOH溶液，取1μL上述溶液分别与旱莲草提取物样品混合后，再分别加入2.5μL稀释50倍的血样，混合均匀后在显微镜下观察。

结果发现，硫酸和盐酸稀溶液能够提高旱莲草提取物凝集红细胞的活性，且盐酸极易导致红细胞裂解，NaOH稀溶液则导致旱莲草提取物凝血活性丧失，这进一步说明旱莲草提取物的凝血活性在酸性条件更佳。

实施例3

有机酸及其衍生物对红细胞的凝集作用，试验过程如下：

分别配制浓度分别为2、5和10 mmol/L的有机酸及其衍生物溶液（包括草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、马来酸、乙酸、丙二酸、丙酸和抗坏血酸等11种有机酸，以及组氨酸、精氨酸和赖氨酸3种碱性氨基酸，谷氨酸1种酸性氨基酸，丝氨酸和苏氨酸2种中性氨基酸），分别取1μL上述浓度的有机酸及其衍生物溶液和2.5μL血样，于洁净的载玻片上混合均匀（混合后上述有机酸及其衍生物的浓度分别为0.57、1.43和2.86 mmol/L），置于显微镜下观察红细胞凝集情况。

试验结果显示，（1）草酸、酒石酸、柠檬酸和苹果酸在混合后浓度为1.43~2.86mmol/L时，会使血样中出现少量由2-10个红细胞组成的凝集团、极少数由10-20个左右的红细胞组成的凝集团，但不会形成更大的红细胞凝集团；（2）丙二酸、琥珀酸、马来酸、乳酸和抗坏血酸在混合后浓度为2.86 mmol/L时，血样中出现少量红细胞凝集的类似上述（1）中的情况，而在混合后浓度为0.57~1.43 mmol/L时不会导致红细胞出现明显凝集情况；（3）其他有机酸在混合后0.57~2.86 mmol/L的浓度下均未使红细胞出现明显的凝集现象。

实施例4

旱莲草提取物单独作用时的凝血活性，试验过程如下：

取旱莲草提取物50%乙醇水溶液于洁净的载玻片上（空白对照组不加），待溶剂完全挥发后先加1μL生理盐水，再加2.5μL血样与之混合均匀，置于光学显微镜下观察并拍照。每个载玻片样品拍10个视野，计算未凝集的红细胞数，根据未凝集的红细胞数、红细胞凝集情况和空白对照组红细胞数，计算红细胞凝集效率，计算公式如下：A=(1-b/c)×100%，（其中A为红细胞凝集率，b为试验组红细胞数目，c为空白对照组红细胞数目），每个样品浓度做3个载玻片重复。

试验结果显示，旱莲草提取物在单独作用时，在0.05~0.3μg/μL的浓度下不能导致红细胞凝集，即使是在0.7μg/μL的浓度下，对红细胞的凝集率也只有30%左右，当旱莲草提取物浓度增加到1.9μg/μL时，对红细胞的凝集率达到96%左右（见下表2）。

表2 旱莲草提取物单独作用对红细胞的凝集效率（平均数±标准偏差，n=3）

实施例5

有机酸及其衍生物处理对旱莲草提取物凝血活性的影响，试验过程如下：

取浓度为0.05~0.4μg/μL的旱莲草提取物溶液3.5μL于洁净载玻片上，待溶剂完全挥发后，加入与上述实施例3中相同的有机酸或其衍生物溶液（浓度分别为2、5和10 mmol/L）各1μL于旱莲草样品处，并与之混合均匀（混合后有机酸和旱莲草提取物的质量比为0.043~1.37:1），而后加入2.5μL血样，并与上述溶液混合均匀（混合后有机酸浓度为0.57~2.86 mmol/L），采用如实施例4的方法计算样品凝集红细胞的效率。

试验结果显示，碱性氨基酸导致旱莲草提取物凝集红细胞的活性降低甚至丧失，中性氨基酸对旱莲草提取物凝集红细胞的活性没有明显影响，而酸性氨基酸和其他有机酸能使旱莲草提取物凝集红细胞的活性增强，甚至单个凝集团的红细胞数量可超过300-500个，即使是在0.05~0.1μg/μL浓度下，对红细胞的凝集率也可达到90%以上。试验结果还显示，不同有机酸对旱莲草提取物凝集红细胞的活性的促进作用不同，具体如下。

（1）草酸和酒石酸处理浓度为2 mmol/L（与旱莲草样品和血样混合后有机酸浓度即为0.57 mmol/L）时，即能使浓度≥0.2μg/μL的旱莲草样品对红细胞的凝集率达到90%以上，当它们的处理浓度增加到5~10 mmol/L时（与旱莲草样品和血样混合后有机酸浓度即为1.43~2.86 mmol/L），可使浓度≥0.05μg/μL的旱莲草样品对红细胞的凝集率达到90%以上（见表3）。

表3 草酸、酒石酸和柠檬酸处理后旱莲草提取物对红细胞的凝集率

（平均数±标准偏差，n=3）

（2）柠檬酸处理浓度为2 mmol/L（与旱莲草样品和血样混合后有机酸浓度即为0.57 mmol/L）时，能够使浓度≥0.3μg/μL的旱莲草样品对红细胞的凝集率达到90%以上，当柠檬酸处理浓度增加到5~10 mmol/L时（与旱莲草样品和血样混合后有机酸浓度即为1.43~2.86 mmol/L），可使浓度≥0.1μg/μL的旱莲草样品对红细胞的凝集率达到90%以上（见表3）。

（3）苹果酸、琥珀酸、马来酸、丙二酸和抗坏血酸处理浓度分别为10和5 mmol/L（与旱莲草样品和血样混合后有机酸浓度即分别为2.86和1.43 mmol/L）时，能够使浓度分别为0.1和0.3μg/μL旱莲草样品对红细胞的凝集率在90%以上；乳酸处理浓度分别为10和5mmol/L（与旱莲草样品和血样混合后有机酸浓度即分别为2.86和1.43 mmol/L）时，能够使浓度分别为0.2和0.3μg/μL旱莲草样品对红细胞的凝集率在90%以上；但这些有机酸处理浓度为2 mmol/L（与旱莲草样品和血样混合后有机酸浓度即为0.57 mmol/L）时,即使旱莲草样品浓度为0.4μg/μL时，对红细胞的凝集率也均低于90%（见表4）。

表4 苹果酸等6种有机酸处理后旱莲草提取物对红细胞的凝集率

（平均数±标准偏差，n=3）

（4）乙酸、谷氨酸和丙酸对旱莲草提取物凝血活性的促进作用较弱。即使处理浓度为10 mmol/L（与旱莲草样品和血样混合后有机酸浓度即为2.86 mmol/L），旱莲草提取物在浓度为0.05~0.1μg/μL时，对红细胞也没有凝集活性，即使旱莲草提取物浓度增加到0.4μg/μL，红细胞的凝集率也只有90%左右（见表5）。

表5 乙酸、丙酸和谷氨酸处理后旱莲草提取物对红细胞的凝集率

（平均数±标准偏差，n=3）

实施例6

有机酸对旱莲草提取物导致纤维蛋白原转变为纤维蛋白的促进作用，试验过程如下：

采用真空采血器（含抗凝剂枸橼酸钠）采集人体静脉血，4℃、2000 r/min离心10min，取上清，即得血浆，用0.9%的生理盐水将血浆稀释10倍，取3.5μL于洁净的载玻片上，与旱莲草提取物（空白对照组和有机酸对照组不加旱莲草提取物）和有机酸溶液混合均匀，并置于显微镜下观察，结果如下表6所示。

在试验浓度下，有机酸单独作用时不能够导致血浆出现絮状物，旱莲草提取物单独作用时，只有在0.5μg/μL的浓度下才会导致血浆出现少量絮状物。而在有机酸联合作用下，旱莲草提取物在0.2μg/μL的浓度下，即能够导致血浆中出现明显的絮状物，在0.5μg/μL的浓度下出现大量絮状物，有机酸浓度为2.86 mmol/L时，絮状物甚至连成片。

表6 有机酸和旱莲草提取物联合作用对血浆的影响

注：-表明没有絮状物出现；（+）表明絮状物不明显；+表明有絮状物出现，且+越多絮状物越多。

上述试验结果表明，有机酸还可提高旱莲草提取物促使可溶性纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白的活性，从而增强旱莲草提取物的止凝血效果，减少止凝血制剂的用量。

上述未例举的组合，若本领域技术人员参见本发明能够显而易见得到，应在本发明的保护范围之内。

Claims

1.有机酸在制备促进旱莲草提取物止凝血活性药物或添加剂中的应用，所述有机酸在旱莲草提取物中的添加剂量为旱莲草提取物质量的4%~137%；

2.根据权利要求1所述的应用，所述有机酸作为旱莲草提取物的止凝血添加剂时，旱莲草使用剂量降低85%~95%，对血样中红细胞凝集率可达90%以上。

3.根据权利要求1所述的应用，所述有机酸作为旱莲草提取物的止凝血添加剂时，血浆中出现明显的絮状物。