WO2018066588A1 - 赤血球の凝集方法及び分離方法並びに赤血球凝集用試薬 - Google Patents

赤血球の凝集方法及び分離方法並びに赤血球凝集用試薬 Download PDF

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志野 村松
加藤　大介
友洋 服部
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Definitions

  • the present invention relates to a method for agglutinating and separating erythrocytes and a reagent for agglutination of erythrocytes.
  • Blood is used for diagnosis of various diseases and judgment of treatment, and consists of blood cell components such as red blood cells, white blood cells and platelets, and plasma which is a liquid component.
  • Plasma liquid component contained in this blood and serum obtained by removing blood cell components and fibrin from blood contain various components necessary for maintaining biological functions such as proteins, saccharides, lipids, etc. It is used as an analytical sample for biochemical tests for diagnosis and treatment.
  • a blood cell component is present in a sample for analysis when performing a biochemical test, the blood cell component may interfere with the test.
  • red blood cells May affect the color and turbidity of the sample and inhibit the test.
  • plasma or serum obtained by separating blood cell components such as red blood cells from a whole blood sample in advance is used as an analysis sample.
  • a method for separating blood cell components from plasma or serum a method is used in which blood collected from a patient using a blood collection needle is placed in a blood collection tube, and the blood collection tube containing the blood is centrifuged using a centrifuge.
  • separation using such a centrifuge requires a long time and has problems such as complicated procedures, and a simpler separation method has been demanded.
  • a separation method other than centrifugation there is a method using a special filter such as a blood cell separation membrane, a blood cell separation material, or a hollow fiber.
  • a filter composed of solid support particles, a solid support binder film, and a hemagglutinin to generate plasma.
  • red blood cells Another method for removing red blood cells from whole blood is for red blood cells to agglutinate a solution containing an acid selected from the group consisting of acetic acid, citric acid, ascorbic acid, lactic acid, maleic acid, malic acid and malonic acid.
  • an acid selected from the group consisting of acetic acid, citric acid, ascorbic acid, lactic acid, maleic acid, malic acid and malonic acid.
  • cholic acid surfactants which are a type of surfactant, are anionic surfactants used for extraction and separation of membrane proteins.
  • concentration of hemoglobin is measured using a device equipped with a biosensor. It has been reported that a cholic acid surfactant is used as a hemolytic agent when measuring (Patent Document 3).
  • Patent Document 3 no example of using a cholic acid surfactant in agglutinating erythrocytes has been reported so far.
  • the conventional centrifugal separation method and the red blood cell separation method using a special filter have a complicated operation requiring a long time, and there are problems of hemolysis and blood scattering.
  • the size of the aggregated red blood cells is so small that the separation of red blood cells is incomplete, and it is not suitable as an analytical reagent for biochemical examination. It was enough.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and its purpose is to be able to agglomerate erythrocytes from a blood sample instantaneously with a sufficient size and to completely separate erythrocytes from a blood sample.
  • An object of the present invention is to provide a method for agglutinating and separating red blood cells and a reagent for agglutination of red blood cells.
  • the present inventors have added a conventional acid only by adding a solution containing a cholic acid surfactant together with an acid to a blood sample in a method of aggregating red blood cells in a blood sample.
  • a conventional acid only by adding a solution containing a cholic acid surfactant together with an acid to a blood sample in a method of aggregating red blood cells in a blood sample.
  • erythrocyte agglutination method it was found that erythrocytes having a sufficiently large size can be agglomerated instantly, and the present invention has been completed.
  • Cholic acid surfactants are conventionally known as hemolytic agents, but when erythrocytes are aggregated, a solution containing a cholic acid surfactant in combination with an acid is added to a blood sample to cause hemolysis.
  • a solution containing a cholic acid surfactant in combination with an acid is added to a blood sample to cause hemolysis.
  • the fact that erythrocytes could be instantly aggregated to a sufficient size without waking up is a fact that could not be expected in the past.
  • the present invention provides a method for agglutinating red blood cells, which comprises adding a solution containing a cholic acid surfactant and an acid to a blood sample.
  • the present invention also provides a method for separating red blood cells from a blood sample, comprising separating red blood cells aggregated by the method of the present invention.
  • the present invention provides a hemagglutination reagent containing a cholic acid surfactant and an acid.
  • the present invention provides the use of the reagent of the present invention as a reagent for agglutinating red blood cells.
  • red blood cell By using the method and reagent of the present invention, a sufficiently large red blood cell can be instantaneously aggregated from a blood sample, and a conventional long-time centrifugation or separation method using a special filter is used. Without them, red blood cells can be completely separated, and components including serum and plasma and red blood cells can be easily and conveniently separated.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of a hemagglutination confirmation experiment conducted in Comparative Example 1-1, Comparative Example 1-2, and Example 1.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of a hemagglutination confirmation experiment conducted in Comparative Example 2-1, Comparative Example 2-2, and Example 2.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of a hemagglutination confirmation experiment conducted in Comparative Example 3-1, Comparative Example 3-2 and Example 3.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of a hemagglutination confirmation experiment conducted in Comparative Example 4-1, Comparative Example 4-2, and Example 4.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of a hemagglutination confirmation experiment conducted in Comparative Example 1-1, Comparative Example 1-2, and Example 1.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of a hemagglutination confirmation experiment conducted in Comparative Example 2-1, Comparative Example 1-2, and Example 1.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results
  • the method for agglutinating red blood cells according to the present invention is characterized in that a solution containing a cholic acid surfactant and an acid is added to a blood sample.
  • a blood sample is a sample containing red blood cells obtained by blood collection from a human or animal subject.
  • the whole blood collected from the subject may be used as it is, or a sample obtained by diluting the collected whole blood with physiological saline or the like may be used. It is preferable to use the whole blood collected from the examiner as it is.
  • the amount of blood sample used in the method of the present invention is usually 10 ⁇ l to 50 ml, desirably 10 ⁇ l to 1 ml, more desirably 10 ⁇ l to 100 ⁇ l.
  • the cholic acid-based surfactant used in the present invention is a surfactant having a steroid skeleton in the molecule, specifically, a surfactant having a structure of cholic acid or a derivative of cholic acid.
  • the cholic acid derivative means any compound derived from cholic acid, and specific examples include dehydroxyl group compounds such as deoxycholic acid, substituted amide compounds such as taurodeoxycholic acid, and the like. .
  • the cholic acid surfactant used in the present invention is preferably cholic acid, sodium cholate, deoxycholic acid, sodium deoxycholic acid, sodium taurodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, sodium chenodeoxycholic acid, glycocholic acid, glycosyl.
  • Nonionic surfactants such as polyoxyethylene cholesteryl ether and N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) colamide (BIGCHAPS)
  • BIGCHAPS polyoxyethylene cholesteryl ether and N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) colamide
  • Surfactant selected from the group consisting of zwitterionic surfactants such as sulfuric acid-3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propane (CHAPS), or hydrates thereof Is.
  • cholic acid-based surfactants may be used alone or in combination of two or more.
  • anionic cole such as sodium cholate, sodium deoxycholate, sodium taurodeoxycholate and their hydrates from the viewpoint of aggregation rate and more complete separation of erythrocytes.
  • Acid-based surfactants are desirable, and in particular, sodium taurodeoxycholate and its hydrate are desirable.
  • the acid used in the present invention may be any substance that emits hydrogen ions (H + ) in an aqueous solution.
  • Specific examples include inorganic acids and organic acids and salts thereof.
  • the inorganic acid include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, sulfamic acid, phosphoric acid, nitric acid and the like.
  • organic acid examples include acetic acid, propionic acid, succinic acid, glycolic acid, stearic acid, lactic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, malonic acid, ascorbic acid, pamonic acid, maleic acid, adipic acid, alginic acid, aspartic acid, Hydroxymaleic acid, phenylacetic acid, glutamic acid, benzoic acid, salicylic acid, sulfanilic acid, 2-acetoxybenzoic acid, fumaric acid, benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, 2-naphthalenesulfonic acid, ethanedisulfonic acid, oxalic acid , Isethionic acid, glucoheptanoic acid, glyceroline salt, hemisulfuric acid, heptanoic acid, hexanoic acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroch
  • the acid used in the present invention is preferably an organic acid from the viewpoint of aggregation rate and more complete separation of erythrocytes, and among them, an organic acid selected from the group consisting of acetic acid, tartaric acid, malonic acid, malic acid and citric acid is desirable. Furthermore, a polyvalent carboxylic acid is desirable, and citric acid is particularly preferable.
  • red blood cells are aggregated by adding a solution containing the cholic acid surfactant and acid to the blood sample.
  • a solution containing a cholic acid surfactant and an acid which is added to a blood sample, can be used as a reagent for agglutinating red blood cells (reagent for red blood cell aggregation).
  • Such a cholic acid surfactant and a solution containing an acid are prepared by adding a cholic acid surfactant to an acid aqueous solution obtained by diluting an acid with physiological saline or the like. It can prepare by the method of adding.
  • the acid concentration in the erythrocyte agglutination reagent is usually 1 mM to 1 M, preferably 5 mM to 500 mM, more preferably 10 mM to 200 mM.
  • the pH is desirably 2.0 to 5.0, more desirably 2.2 to 4.5, and even more desirably 2.5 to 4.0.
  • the pH of the hemagglutination reagent can be measured using a commercially available pH meter by the glass electrode method.
  • the hemagglutination reagent may contain a surfactant that does not cause hemolysis (for example, a surfactant such as Tween 20 and Emulgen A500), a reagent, and the like.
  • the concentration of the cholic acid surfactant in the hemagglutination reagent is usually 0.05 to 15.0% by weight, preferably 0.06 to 13.0% by weight, and 0.075 to 8.0% by weight. More desirable is 0.1 to 6.0% by weight.
  • the ratio (molar ratio) of cholic acid surfactant to acid in the hemagglutination reagent is usually 1: 7 to 1: 2000 from the viewpoint of aggregation rate and more complete separation of erythrocytes. 1: 1667 is desirable, 1:13 to 1: 1333 is more desirable, and 1:17 to 1: 1000 is particularly desirable.
  • the addition amount (volume ratio) of the hemagglutination reagent to the blood sample to be used is usually 1: 4 to 1:80, preferably 1: 8 to 1:20, more preferably 1:10 to 1:13.
  • Red blood cell aggregation method In the present invention, if the above-mentioned hemagglutination reagent is added to a blood sample as it is at room temperature, the erythrocytes are aggregated instantaneously to a sufficient size. The mixture is allowed to stand for 5 seconds to 30 seconds, preferably about 5 seconds, and then mixed by inversion several times. By aggregating red blood cells in this manner, an aggregate having a sufficient size can be obtained.
  • the erythrocytes aggregated using the method and reagent of the present invention have a sufficient size, they can be easily and easily separated from a blood sample.
  • the method for separating the aggregated erythrocytes include a method for recovering the supernatant after precipitation of erythrocyte aggregates and a method for separating by filtration using filter paper. Since the serum component and the plasma component after separating red blood cells in this manner do not substantially contain red blood cells, they can be used as analytical samples for biochemical examinations.
  • TDOC 10% w / v taurodeoxycholate hydrate
  • 10 mL of 10 mL of 1M citric acid, 9 mL of 10% w / v sodium chloride are added to 71 mL of distilled water, and the final concentration is 100 mM citric acid, 1% TDOC.
  • a solution (reagent for erythrocyte aggregation) to be 0.9% sodium chloride was prepared.
  • the solution (reagent for erythrocyte aggregation) which does not add TDOC and / or sodium chloride was prepared similarly, and the influence which the presence or absence of a cholic acid type surfactant and a salt and a pH range had on the aggregation of erythrocytes was compared.
  • erythrocyte aggregation reagent 60 ⁇ L of whole blood sample was added to 400 ⁇ L of erythrocyte aggregation reagent, and the erythrocyte aggregation rate was visually confirmed. Based on the criteria described below, the agglutination rate was +++> ++> +> ⁇ in order from the fastest, and was ⁇ when hemolysis occurred without agglutination.
  • the agglutination rate was +++>++>+> ⁇ in order from the fastest, and was ⁇ when hemolysis occurred without agglutination.
  • the following criteria are the same as those in Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1-1 to 4-2.
  • Red blood cells immediately aggregated to a sufficient size, and red blood cell aggregates precipitated ++: Red blood cells began to aggregate after standing for several seconds, and then red blood cell aggregates gradually precipitated: +: Red blood cell aggregation occurred The agglomerates were minute and the aggregation was incomplete ⁇ : the aggregation of erythrocytes was negligible—: the results of hemolysis without aggregation were shown in Table 2 below.
  • Example 8 Hemagglutination by concentration of cholic acid-based surfactant.
  • Sodium taurodeoxycholate hydrate (TDOC) and citric acid (100 mM) were added to physiological saline, and a reagent for hemagglutination (pH 3.0).
  • TDOC Sodium taurodeoxycholate hydrate
  • citric acid 100 mM
  • the aggregation rate was +++> ++> +> ⁇ in descending order, and was ⁇ when hemolysis occurred without aggregation.
  • the following criteria are the same as those in Examples 1 to 7 and Comparative Examples 1-1 to 4-2.

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Abstract

血液試料から赤血球を瞬時に十分な大きさで凝集させることができ、血液試料から赤血球を完全に分離することが出来る、赤血球の凝集方法及び分離方法並びに赤血球凝集用試薬を提供する。本発明の赤血球の凝集方法は、血液試料に、コール酸系界面活性剤及び酸を含有する溶液を添加することを含む。また、本発明の赤血球の分離方法は、前記本発明の方法により凝集させた赤血球を分離することを含む。更に、本発明の赤血球凝集用試薬は、コール酸系界面活性剤及び酸を含有する。

Description

赤血球の凝集方法及び分離方法並びに赤血球凝集用試薬
　本発明は、赤血球の凝集方法及び分離方法並びに赤血球凝集用試薬に関する。
　血液は様々な疾患の診断や治療の判定に使用されており、赤血球、白血球及び血小板等の血球成分と、液体成分である血漿からなる。この血液に含まれる血漿（液体成分）や、血液から血球成分とフィブリンを除いた血清は、タンパク質、糖類、脂質等の生体の機能維持に必要な様々な成分を含んでおり、内臓系疾患等の診断や治療を行うための生化学検査用の分析用試料として用いられている。
　しかしながら、生化学検査を行う際に血球成分が分析用試料中に存在すると、血球成分が検査を阻害する場合があり、特に比色分析等を利用して生化学検査を行う場合には、赤血球が試料の色や濁度に影響を与え検査を阻害する場合があった。
　そのため、生化学検査においては、全血試料から赤血球等の血球成分を予め分離した血漿又は血清が分析用試料として使用されている。血球成分を血漿又は血清と分離する方法としては、患者から採血針を用いて採血した血液を採血管に入れ、血液を含む採血管を遠心分離器に掛けて遠心分離する方法が用いられている。しかし、このような遠心分離器を用いた分離は長時間を要し、手技が煩雑である等の問題点があり、より簡便な分離方法が求められていた。
　また遠心分離以外の分離方法として、血球分離膜、血球分離材、中空糸といった特殊なフィルタを使用する方法がある。例えば、固層支持体粒子、固層支持体結合剤膜、赤血球凝集素からなるフィルタを用いて、全血液サンプルから赤血球を分離し、血漿を生成する方法が報告されている（特許文献１）。
　しかしながら、これらのフィルタを用いた場合には、滴下した血液試料がフィルタ内に浸透して広がり、フィルタ中に血漿又は血清が残存することとなる。そのため、血液試料が少量の場合には、赤血球を分離した後の血漿又は血清の量が少なくなり、生化学検査を行うのに十分な量の分析用試料が得られないという問題があった。更に、分離操作の過程においてフィルタに何らかの圧力が掛かることから、溶血が生じたり、血液が飛散する等の問題があった。
　全血から赤血球を除去する他の方法としては、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸及びマロン酸からなる群から選択される酸を含む溶液を、赤血球が凝集するのに効果的な条件下で全血試料と接触させ、次いで繊維状材料を用いてろ過する方法が報告されている（特許文献２）。
　一方、界面活性剤の一種であるコール酸系界面活性剤は、膜タンパク質の抽出や分離に使用される陰イオン性界面活性剤であり、例えば、バイオセンサを備えた装置を用いてヘモグロビン濃度を測定する際に、コール酸系界面活性剤を溶血剤として用いることが報告されている（特許文献３）。しかし、赤血球を凝集させる際にコール酸系界面活性剤を用いた例は、これまで報告されていない。
米国特許第５９８１２９４号 米国特許第５１１８４２８号 特開２０１４－１０２１４３
　上述のように、従来の遠心分離法や特殊なフィルタを用いた赤血球の分離法では、長時間を要する複雑な操作であったり、溶血や血液の飛散の問題があった。また、酸を用いて赤血球を凝集させる方法（特許文献２）の場合でも、凝集した赤血球の大きさが細かいため赤血球の分離が不完全であり、生化学検査のための分析用試薬としては不十分であった。
　本発明は、以上の事情に鑑みなされたものであって、その目的は、血液試料から赤血球を瞬時に十分な大きさで凝集させることができ、血液試料から赤血球を完全に分離することが出来る、赤血球の凝集方法及び分離方法並びに赤血球凝集用試薬を提供することにある。
　本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、血液試料中の赤血球を凝集させる方法において、酸と共にコール酸系界面活性剤を含む溶液を血液試料に添加することにより、従来の酸のみを添加する赤血球凝集法に比べ、瞬時に十分な大きさの赤血球の凝集させることが出来ることを見出し、本発明を完成した。
　コール酸系界面活性剤は、従来、溶血剤として知られていたが、赤血球を凝集させる際に、コール酸系界面活性剤を酸と組み合わせて含む溶液を血液試料に添加することにより、溶血を起こすことなく、赤血球を瞬時に十分な大きさで凝集させることが出来たことは、従来は予想出来なかった事実である。
　すなわち、本発明は、血液試料に、コール酸系界面活性剤及び酸を含有する溶液を添加することを含む、赤血球の凝集方法を提供する。また、本発明は、前記本発明方法により凝集させた赤血球を分離することを含む、血液試料からの赤血球の分離方法を提供する。更に、本発明は、コール酸系界面活性剤及び酸を含有する赤血球凝集用試薬を提供する。更に、本発明は、本発明の試薬の、赤血球を凝集させるための試薬としての使用を提供する。
　本発明の方法及び試薬を用いることにより、血液試料から、十分な大きさの赤血球を瞬時に凝集させることができ、従来のような長時間の遠心分離や特殊なフィルタを用いた分離法を用いなくても、赤血球を完全に分離することが出来、血清及び血漿を含む成分と赤血球とを容易にかつ簡便に分離することが出来る。
比較例１－１、比較例１－２及び実施例１で行った赤血球凝集確認実験の結果を示す写真である。 比較例２－１、比較例２－２及び実施例２で行った赤血球凝集確認実験の結果を示す写真である。 比較例３－１、比較例３－２及び実施例３で行った赤血球凝集確認実験の結果を示す写真である。 比較例４－１、比較例４－２及び実施例４で行った赤血球凝集確認実験の結果を示す写真である。
　本発明にかかる赤血球の凝集方法は、血液試料に、コール酸系界面活性剤及び酸を含む溶液を添加することを特徴とする。
（血液試料）
　本発明において、血液試料とは、ヒト又は動物の被検者から採血により取得した、赤血球が含まれる試料である。血液試料としては、被検者から採血した全血をそのまま使用してもよく、採取した全血を生理食塩水等で希釈した試料を用いてもよいが、操作の簡便性の点から、被検者から採血した全血をそのまま使用するのが好ましい。本発明の方法において使用する血液試料の量は、通常１０μｌ～５０ｍｌであり、望ましくは１０μｌ～１ｍｌであり、より望ましくは１０μｌ～１００μｌである。
（コール酸系界面活性剤）
　本発明で使用するコール酸系界面活性剤とは、分子内にステロイド骨格を有する界面活性剤であり、具体的にはコール酸又はコール酸の誘導体の構造を有する界面活性剤である。ここで、コール酸誘導体とは、コール酸から誘導されるあらゆる化合物を意味するが、具体的には、デオキシコール酸等の脱ヒドロキシル基化合物、タウロデオキシコール酸等の置換アミド化合物等が挙げられる。
　本発明で使用するコール酸系界面活性剤は、望ましくは、コール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸、グリココール酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸ナトリウム、グリコリトコール酸、グリコリトコール酸ナトリウム、リトコール酸、リトコール酸ナトリウム、タウロコール酸、タウロコール酸ナトリウム、タウロウルソデオキシコール酸、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤；ポリオキシエチレンコレステリルエーテル、Ｎ，Ｎ－ビス（３－Ｄ－グルコンアミドプロピル）コラミド（ＢＩＧＣＨＡＰＳ）等の非イオン性界面活性剤；硫酸－３－〔（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕－１－プロパン（ＣＨＡＰＳ）等の両イオン性界面活性剤、又はこれらの水和物から成る群から選択されるものである。これらのコール酸系界面活性剤は、単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
　コール酸系界面活性剤としては、中でも、凝集速度と赤血球のより完全な分離の観点から、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム及びそれらの水和物等の陰イオン性コール酸系界面活性剤が望ましく、特には、タウロデオキシコール酸ナトリウム及びその水和物が望ましい。
（酸）
　本発明で使用する酸としては、水溶液中で水素イオン（Ｈ＋）を出す物質であればよい。具体的には、無機酸及び有機酸並びにそれらの塩が挙げられる。無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等が挙げられる。有機酸としては、例えば酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、マロン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、アジピン酸、アルギン酸、アスパラギン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、グルコヘプタン酸、グリセロリン塩、ヘミスルファニックアシッド（ｈｅｍｉｓｕｌｆａｎｉｃ　ａｃｉｄ）、ヘプタン酸、ヘキサン酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、ペクチニン酸、リン酸、硫酸、３－フェニルプロピオン酸、ピクリン酸、ピバル酸、チオシアン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酪酸、カンフル酸、ショウノウスルホン酸、ジグルコン酸、シクロペンタンプロピオン酸、双硫酸、ドデシル硫酸、エタンスルホン酸、及びウンデカン酸等が挙げられる。本発明において酸は、単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
　本発明で用いる酸としては、凝集速度と赤血球のより完全な分離の観点から、有機酸が望ましく、中でも、酢酸、酒石酸、マロン酸、リンゴ酸及びクエン酸からなる群から選ばれる有機酸が望ましく、更には多価カルボン酸が望ましく、特にはクエン酸が好ましい。
（赤血球凝集用試薬）
　本発明においては、血液試料に、前記コール酸系界面活性剤及び酸を含む溶液を添加することにより、赤血球を凝集させる。血液試料に添加する、このようなコール酸系界面活性剤及び酸を含む溶液は、赤血球を凝集させるための試薬（赤血球凝集用試薬）として用いることが出来る。
　このようなコール酸系界面活性剤及び酸を含む溶液（以下、「赤血球凝集試薬」とする）は、酸を生理食塩水等で希釈して得られた酸水溶液にコール酸系界面活性剤を添加する方法等により調製することが出来る。また、凝集速度と赤血球のより完全な分離の観点から、赤血球凝集試薬中の酸の濃度としては、通常１ｍＭ～１Ｍであり、５ｍＭ～５００ｍＭが望ましく、１０ｍＭ～２００ｍＭがより望ましく、赤血球凝集試薬のｐＨは、２．０～５．０が望ましく、２．２～４．５がより望ましく、２．５～４．０が更に望ましい。ここで、赤血球凝集試薬のｐＨは、ガラス電極法による市販のｐＨメーターを用いて測定することが出来る。赤血球凝集試薬には、前記酸、コール酸系界面活性剤、生理食塩水の他、溶血させない界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０やエマルゲンＡ５００等の界面活性剤）や試薬等を含んでいてもよい。
　赤血球凝集試薬中のコール酸系界面活性剤の濃度は、通常０．０５～１５．０重量％であり、０．０６～１３．０重量％が望ましく、０．０７５～８．０重量％がより望ましく、０．１～６．０重量％が特に望ましい。
　赤血球凝集試薬中のコール酸系界面活性剤と酸との比率（モル比）は、凝集速度と赤血球のより完全な分離の観点から、通常１：７～１：２０００であり、１：８～１：１６６７が望ましく、１：１３～１：１３３３がより望ましく、１：１７～１：１０００が特に望ましい。使用する血液試料に対する赤血球凝集試薬の添加量（体積比）は、通常１：４～１：８０好ましくは１：８～１：２０、より好ましくは１：１０～１：１３である。
（赤血球の凝集方法）
　本発明においては、血液試料に上記赤血球凝集試薬を室温でそのまま添加すれば、赤血球が十分な大きさに瞬時に凝集するが、凝集をより完全に進行させるためには、血液試料を赤血球凝集試薬と接触させた状態で、５秒～３０秒、望ましくは５秒程度静置後、数回転倒混和するのがよい。このようにして赤血球を凝集させることにより、十分な大きさを有する凝集物を得ることが出来る。
　本発明の方法及び試薬を用いて凝集させた赤血球は十分な大きさを有しているため、容易にかつ簡便に血液試料から分離することが出来る。凝集した赤血球の分離方法としては、赤血球の凝集物が沈殿した後の上清を回収する方法や、濾紙を用いた濾過により分離する方法が挙げられる。このようにして赤血球を分離した後の血清成分及び血漿成分は、実質的に赤血球を含まないため、生化学検査用の分析用試料として使用することが出来る。
　以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（実施例１～４、比較例１－１～４－２）
コール酸系界面活性剤及び塩の有無とｐＨ範囲による赤血球凝集
　７１ｍＬの蒸留水に１０％ｗ／ｖタウロデオキシコール酸ナトリウム水和物（ＴＤＯＣ）１０ｍＬと、１Ｍクエン酸１０ｍＬ、１０％ｗ／ｖ塩化ナトリウム９ｍＬを加え、終濃度が１００ｍＭクエン酸、１％ＴＤＯＣ、０．９％塩化ナトリウムとなる溶液（赤血球凝集用試薬）を調製した。また、ＴＤＯＣ及び／又は塩化ナトリウムを添加しない溶液（赤血球凝集用試薬）を同様に調製し、コール酸系界面活性剤及び塩の有無とｐＨ範囲が赤血球の凝集に与える影響を比較した。
　赤血球凝集用試薬４００μＬに全血検体６０μＬを添加して、赤血球の凝集速度を目視により確認した。凝集速度は以下に記載した基準に基づき、速い順に＋＋＋＞＋＋＞＋＞±とし、凝集せずに溶血した場合は－とした。
＋＋＋：赤血球が瞬時に十分な大きさに凝集し、赤血球の凝集物が沈殿した
＋＋：赤血球が数秒静置後に凝集しはじめ、次第に赤血球の凝集物が沈殿した
＋：赤血球の凝集は起こったが、凝集物は微小であり凝集が不完全であった
±：赤血球の凝集はごく僅かであった
－：凝集せずに溶血した
　結果を下記表１に示す。
　なお、赤血球凝集用試薬のｐＨは、ＨＯＲＩＢＡ　卓上型ｐＨメーターを用いて測定した（以下の実施例及び比較例において同様である）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果から、赤血球凝集用試薬がコール酸系界面活性剤と酸を含む場合には、ｐＨが２．５～５．０の範囲内において、ＮａＣｌの有無にかかわらず、凝集速度は「＋＋＋」となり、優れた凝集効果が見られた。一方、赤血球凝集用試薬がコール酸系界面活性剤を含まず、酸のみを含むか、又は酸と塩のみを場合には、凝集速度は「－」と又は「＋」となり、溶血が生じるか、又は赤血球の凝集は起こっても、凝集物が微小であり凝集が不完全であった。この結果から、赤血球の凝集においては、コール酸系界面活性剤の存在が大きな影響を与えることが分かる。
（実施例５～７）コール酸系界面活性剤と酸による赤血球凝集
　生理食塩水に各種コール酸系界面活性剤（１重量％）とクエン酸（１００ｍＭ）を添加して赤血球凝集用試薬（ｐＨ３．０）を調製し、赤血球の凝集能を比較した。
　赤血球凝集用試薬４００μＬに全血検体６０μＬを添加して、赤血球の凝集速度を確認した。凝集速度は以下に記載した基準に基づき、速い順に＋＋＋＞＋＋＞＋＞±とし、凝集せずに溶血した場合は－とした。なお、以下の基準は、上記実施例１～４、及び比較例１－１～４－２の基準と同一である。
＋＋＋：赤血球が瞬時に十分な大きさに凝集し、赤血球の凝集物が沈殿した
＋＋：赤血球が数秒静置後に凝集しはじめ、次第に赤血球の凝集物が沈殿した
＋：赤血球の凝集は起こったが、凝集物は微小であり凝集が不完全であった
±：赤血球の凝集はごく僅かであった
－：凝集せずに溶血した
　結果を下記表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の結果から、赤血球凝集用試薬が、酸と共に各種のコール酸系界面活性剤を含む場合でも、凝集速度は「＋＋」又は「＋＋＋」となり、優れた凝集効果が得られることが分かる。特にタウロデオキシコール酸ナトリウム水和物（ＴＤＯＣ）の赤血球凝集効果が最も顕著であった。
（実施例８）コール酸系界面活性剤の濃度による赤血球凝集
　生理食塩水にタウロデオキシコール酸ナトリウム水和物（ＴＤＯＣ）とクエン酸（１００ｍＭ）を添加して赤血球凝集用試薬（ｐＨ３．０）を調製し、下記表に示すＴＤＯＣの濃度範囲について赤血球の凝集能を比較した。
　赤血球凝集用試薬４００μＬに全血検体６０μＬを添加して、赤血球の凝集速度を確認した。凝集速度は以下の基準に基づき、速い順に＋＋＋＞＋＋＞＋＞±とし、凝集せずに溶血した場合は－とした。なお、以下の基準は、上記実施例１～７、及び比較例１－１～４－２の基準と同一である。
＋＋＋：赤血球が瞬時に十分な大きさに凝集し、赤血球の凝集物が沈殿した
＋＋：赤血球が数秒静置後に凝集しはじめ、次第に赤血球の凝集物が沈殿した
＋：赤血球の凝集は起こったが、凝集物は微小であり凝集が不完全であった
±：赤血球の凝集はごく僅かであった
－：凝集せずに溶血した
　結果を下記表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３の結果から、コール酸系界面活性剤の濃度が０．１～６．０重量％の場合には、凝集速度は「＋＋＋」となり、優れた凝集効果が得られることが分かる。
　また、上記実施例１～４において赤血球の凝集物が沈殿した後の上清を分離し、この分離した上清をイムノクロマトキット（ＱｕｉｃｋＮａｖｉ（登録商標）－Ｅｂｏｌａ）に滴下して、メンブレン上の移動を観察したところ、メンブレンは赤色に着色しなかった。この結果からも、上記分離後の上清は実質的に赤血球を含まず、生化学検査用の分析用試料として好適であることが裏付けられた。

Claims (8)

  1. 　血液試料に、コール酸系界面活性剤及び酸を含有する溶液を添加することを含む、赤血球の凝集方法。
  2. 　前記溶液のｐＨが、２．５～４．０である請求項１記載の方法。
  3. 　前記コール酸系界面活性剤が、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物である請求項１又は２記載の方法。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項記載の方法により凝集させた赤血球を分離することを含む、血液試料からの赤血球の分離方法。
  5. 　コール酸系界面活性剤及び酸を含有する赤血球凝集用試薬。
  6. 　前記試薬のｐＨが、２．５～４．０である請求項５記載の試薬。
  7. 　前記コール酸系界面活性剤が、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物である請求項５又は６記載の試薬。
  8. 　請求項５～７に記載の試薬の、赤血球を凝集させるための試薬としての使用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022259990A1 (ja) * 2021-06-07 2022-12-15 デンカ株式会社 糞便検体の検査方法及びそのためのイムノクロマト試験片
WO2023048112A1 (ja) * 2021-09-21 2023-03-30 日東紡績株式会社 分析用血球分離剤及び血球分離方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111568938B (zh) * 2020-03-02 2023-09-08 九江学院 有机酸在促进旱莲草提取物止凝血活性中的应用
KR20220151158A (ko) * 2020-03-11 2022-11-14 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 백혈구 농축 분리 디바이스, 혈액 채취 용기 및 백혈구의 분리 방법
CN118076891A (zh) 2021-09-21 2024-05-24 日东纺绩株式会社 血细胞分离剂及使用其的血细胞分离方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005114359A (ja) * 2003-10-02 2005-04-28 Matsushita Electric Ind Co Ltd 血液中のグルコースの測定方法およびそれに用いるセンサ
WO2006109685A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha 血漿または血清の採取方法
WO2013147307A1 (ja) * 2012-03-30 2013-10-03 積水メディカル株式会社 赤血球含有サンプル中の対象物を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップおよびイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法
US20150204843A1 (en) * 2012-08-30 2015-07-23 Qiagen Gmbh Method for obtaining blood plasma from a whole blood sample

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4299726A (en) * 1979-05-07 1981-11-10 Coulter Electronics, Inc. Process for preparing whole blood reference controls having long term stability, preconditioning diluent and media therefor
US4987154A (en) * 1986-01-14 1991-01-22 Alliance Pharmaceutical Corp. Biocompatible, stable and concentrated fluorocarbon emulsions for contrast enhancement and oxygen transport in internal animal use
JPH0726960B2 (ja) * 1988-04-05 1995-03-29 富士写真フイルム株式会社 乾式全血分析要素
US5185264A (en) * 1990-11-09 1993-02-09 Abbott Laboratories Diluent buffer and method for diluting an assay component
US5118428A (en) 1990-11-13 1992-06-02 Quidel Method to remove red blood cells from whole blood samples
JPH05172816A (ja) * 1991-05-13 1993-07-13 Denka Seiken Co Ltd 抗原の測定方法
BR9305960A (pt) 1992-02-24 1997-10-21 Coulter Corp Produto de controle de hematologia e processo para utilizar meio de suspensão de célula
US5981294A (en) 1995-11-29 1999-11-09 Metrika, Inc. Device for blood separation in a diagnostic device
US6033866A (en) * 1997-12-08 2000-03-07 Biomedix, Inc. Highly sensitive amperometric bi-mediator-based glucose biosensor
CN1243251A (zh) * 1998-07-28 2000-02-02 华美生物工程公司郑州分公司 全血免疫检测试剂中红细胞和血清的分离方法
EP2096440B1 (en) * 2006-12-21 2012-04-18 Sekisui Medical Co., Ltd. Method for stabilizing alpha-thrombin in thrombin-containing solution
JP6036212B2 (ja) 2012-11-20 2016-11-30 ニプロ株式会社 ヘモグロビン測定装置およびヘモグロビン測定方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005114359A (ja) * 2003-10-02 2005-04-28 Matsushita Electric Ind Co Ltd 血液中のグルコースの測定方法およびそれに用いるセンサ
WO2006109685A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha 血漿または血清の採取方法
WO2013147307A1 (ja) * 2012-03-30 2013-10-03 積水メディカル株式会社 赤血球含有サンプル中の対象物を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップおよびイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法
US20150204843A1 (en) * 2012-08-30 2015-07-23 Qiagen Gmbh Method for obtaining blood plasma from a whole blood sample

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022259990A1 (ja) * 2021-06-07 2022-12-15 デンカ株式会社 糞便検体の検査方法及びそのためのイムノクロマト試験片
WO2023048112A1 (ja) * 2021-09-21 2023-03-30 日東紡績株式会社 分析用血球分離剤及び血球分離方法

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