WO2006109685A1 - 血漿または血清の採取方法 - Google Patents

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WO2006109685A1
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plasma
serum
blood
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PCT/JP2006/307353
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Inventor
Yoshihiko Umegae
Reiko Machida
Yayoi Irie
Toshio Tanabe
Original Assignee
Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5002—Partitioning blood components

Definitions

  • the present invention relates to a method that enables plasma and serum to be efficiently separated and collected even from a very small amount of blood.
  • Patent Document 1 reports the use of an aqueous solution of an inorganic salt or amino acid
  • Patent Document 2 reports the use of an inorganic salt, amino acid or saccharide.
  • Patent Document 1 The method described in Patent Document 1 is a method in which a blood cell component is filtered after adding an aqueous solution of an inorganic salt or amino acid having a constant concentration to whole blood, and is effective only as an aqueous solution.
  • a blood cell component is filtered after adding an aqueous solution of an inorganic salt or amino acid having a constant concentration to whole blood, and is effective only as an aqueous solution.
  • Patent Document 2 The method described in Patent Document 2 is a method in which an inorganic salt, amino acid or saccharide is held in advance in a porous material, and is brought into contact with whole blood to separate blood cell components. There is a dosage form restriction only in a dry state, The effect is weaker than in the case of an aqueous solution.
  • Patent Document 1 JP 09-196908 A
  • Patent Document 2 International Publication 01Z092886 Pamphlet
  • An object of the present invention is to separate more plasma and serum from less blood. Another object is to provide a blood cell separation method that can be applied to blood adjustment methods and blood component analysis methods under various conditions where there are no restrictions on the dosage form and form to be used.
  • the present inventors have promoted the separation of blood cells when whole blood is brought into contact with an organic compound having one or two groups selected from carboxyl group, phosphate group and sulfonate group.
  • the present inventors have found that plasma and serum can be collected efficiently and have completed the present invention.
  • the present invention provides
  • the collected whole blood has one or two groups selected from a carboxyl group, a phosphate group, and a sulfonate group, and carries an organic acid compound other than amino acids or a salt thereof.
  • the organic acid compound is a ketoeenol type carboxylic acid compound, a divalent or higher carboxylic acid compound, a divalent or higher organic phosphoric acid compound or a divalent or higher organic compound.
  • Organic acid compounds are phosphoenolpyruvate, ⁇ -ketoglutaric acid, oxacin acetic acid, acetylylphosphoric acid, pyruvic acid, 3-phosphoglyceric acid, malic acid, oxalic acid, adenosine-5'-diphosphate, adenosine 5 ' —Triphosphate, acid-valued or reduced nicotinamide adenine dinuretide, acid-valued or reduced nicotinamide adenine dinucleotidic acid, ethylenediammine tetraacetic acid, piperazine 1,4 bis (2 ethanesolephonic acid) and pipera
  • One or more compounds selected from the group of compounds consisting of gin 1,4 bis (2 hydroxy 3 propane sulfonic acid) dihydrate are described in any one of (1) to (4) above.
  • the carboxyl group, phosphate group, and sulfonate group used in the plasma or serum collection method of the present invention have one or two groups selected, and an organic acid compound other than an amino acid or a salt thereof is It exhibits unprecedented sharp blood cell separation, and “high hematocrit blood” with high blood viscosity has the same effect and is sometimes called a blood cell separation promoter.
  • the method for collecting plasma or serum of the present invention comprises whole blood collected and one or two groups selected from a carboxyl group, a phosphate group and a sulfonate group, and an organic other than amino acids.
  • a blood cell is separated by contacting with an acid compound or a salt thereof.
  • the whole blood to which the present invention is applied is not particularly limited as long as it is blood collected from vital force, and there are no particular limitations on the collection method, such as anticoagulants such as heparin and sodium fluoride, and glycolysis inhibitors. It may be included.
  • Amino acids include normal ⁇ - or j8-amino acids, including D-amino acids and L-amino acids.
  • the contact with whole blood refers to collected whole blood and one or two groups selected from carboxyl group, phosphate group and sulfonate group, and an organic acid compound other than amino acid or its group
  • a method of mixing a salt or a solution thereof, or collected whole blood with one or two groups selected from a carboxyl group, a phosphate group and a sulfonate group, and an organic substance other than amino acids There is a method of adding to a blood cell separation membrane carrying an acid compound or a salt thereof.
  • the organic acid compound other than amino acids has one or two groups selected from carboxyl group, phosphate group and sulfonate group.
  • ketoeenolic carboxylic acid compounds such as pyruvic acid, a-ketoglutaric acid, oxalic acetic acid; succinic acid, fumaric acid, maleic acid, malonic acid, phosphonic acid, succinic acid, tartaric acid, adipic acid, daltaric acid
  • Dicarboxylic acid compounds such as formic acid, acetic acid, darconic acid, lactic acid, propionic acid, glycolic acid, daroxylic acid, hydroxybutyric acid, glyceric acid, crotonic acid, shikimic acid, ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) ); 2, 3 Diphosphoglyceric acid, adenosine-5 'diphosphate (80?), Adenosine
  • the salt of the organic acid compound used in the present invention is not particularly limited, and sodium salt , Potassium salts, ammonium salts, cyclohexyl ammonium salts, etc., which may be anhydrous or hydrated! /.
  • organic acid compounds or salts thereof may be used alone or in combination.
  • the organic acid compound or salt thereof used in the method for collecting plasma or serum of the present invention rapidly separates plasma or serum from blood cells such as erythrocytes when contacted with whole blood, thereby coagulating blood. Hemolysis does not occur and more plasma or serum can be collected. Collecting also includes separating plasma or serum from blood cells without removing them. Further, it may have an action of lowering hematocrit or contracting cells by the action of osmotic pressure. Further, it may have an action of changing the polarity of the erythrocyte surface to promote clotting or aggregation of erythrocytes.
  • Methods for separating blood cells from whole blood include a method by centrifugation, a blood cell separation membrane, a method using a filter paper or a hydrophilic polymer membrane, and the like.
  • the method for collecting plasma or serum of the present invention is any of these methods. Applicable to methods.
  • the organic acid compound or a salt thereof can be used in a solution state such as an aqueous solution, a semi-liquid state such as a sol gel, a semi-solid state, or a solid state such as a powder.
  • the above-mentioned organic acid compound or a salt thereof and an anticoagulant are mixed within 2 minutes after blood collection, and about 15 minutes at 3000 rpm ( (4 ° C) Method of obtaining plasma by centrifugation; whole blood collected and the above-mentioned organic acid compound or its salt are mixed, allowed to stand at room temperature for about 30 minutes, and then rotated at 3000 rpm for about 15 minutes (4 ° C) There is a method of obtaining serum by centrifugation.
  • Whole blood is mixed with the above organic acid compound or a salt thereof and an anticoagulant.
  • a certain blood is mixed with whole blood and the above organic acid compound or a salt thereof at room temperature for about 30 minutes.
  • an anticoagulant is supported in advance on a blood cell separation membrane, filter paper, or a hydrophilic polymer membrane, whole blood and the above-mentioned organic acid compound or a salt thereof can be obtained.
  • the blood cell separation operation proceeds to obtain plasma.
  • organic acid compound or a salt thereof and in the case of plasma, an anticoagulant is previously supported on a blood cell separation membrane, filter paper, or a hydrophilic polymer membrane, and the collected whole blood is added to the plasma or serum.
  • an anticoagulant is previously supported on a blood cell separation membrane, filter paper, or a hydrophilic polymer membrane, and the collected whole blood is added to the plasma or serum.
  • the pH is not particularly limited. ⁇ If the pH is too low, the blood coagulates, and preferably about pH 3.5 to pH 12 More preferably, the pH is 4.0 to pH 10.0.
  • the concentration of the organic acid compound or its salt when mixed with whole blood is preferably about 0.02 molZL to 0.6 molZL, more preferably about 0.1 molZL to 0.5 molZL.
  • the amount of whole blood mixed with the organic acid compound or salt thereof is not particularly limited, but the method of the present invention is useful when the amount is difficult to separate, for example, 1 mL or less. Smaller amounts are preferred! /, But considering the amount that can be collected, 0.1 ⁇ L to 200 ⁇ L is preferred.
  • the blood cell separation membrane commercially available glass fiber filter paper, fluorine-containing polymer whose surface has been hydrophilized, microporous material such as polysulfone, and the like can be used. Also, it can be a laminate that combines them.
  • the present invention can also be used for blood cell separation using a hydrophilic polymer layer formed on the surface of an electrode such as a biosensor for blood glucose measurement, which allows only low molecular weight substances to pass through and excludes high molecular weight substances such as blood cells. is there.
  • blood cell separation membranes, hydrophilic polymer membranes, and their laminates are placed in the column channel and applied to blood cell separation performed by allowing blood to pass through capillarity, attraction and pressurization. Is possible.
  • additives other than the aforementioned organic acid compound or a salt thereof may be used.
  • the additives include emulsifiers and wetting agents, preservatives and stabilizers that enable long-term storage, surfactants for the purpose of preventing drying and concentration, and buffers for the purpose of adjusting pH.
  • various compounds such as glucose can be selectively eliminated or converted as a pretreatment reagent for 1,5-anhydroglucitol measurement. It can also be used with a reagent or the like.
  • aqueous solution (0.5 mol / L) of the following organic acid compound to a pH of about 6-7 to 200 L of whole blood collected with a blood collection tube for plasma or serum, and add 50 L with a micropipette. About 2/3 of this was placed in a hematocrit capillary tube (for plasma) or a non-treated hematocrit capillary tube (for serum), and one end was capped with a putty.
  • erythrocyte layer (%) erythrocyte layer length Z total layer length xlOO.
  • erythrocyte layer (%) erythrocyte layer length Z total layer length xlOO was determined. The results are shown in Table 1.
  • Phosphoenolpyruvate cyclohexylammonium salt (PEP—Cyclohexl-NH
  • Phosphoenolpyruvate sodium salt Phosphoenolpyruvate sodium salt
  • Phosphoenolpyruvate potassium salt Phosphoenolpyruvate potassium salt
  • Shinoic acid Malic acid, ⁇ -Ketoglutaric acid, Oxaguchi acetic acid, Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), Acetyl phosphate, 3-phosphoglycerate, adenosine 5'-diphosphate, adenosine 5'-triphosphate, nicotinamide adenine dinucleide ( ⁇ AD), nicotinamide adenine dinucletide (NADP), piperazine 1, 4 Bis (2 ethanesnorephonic acid) (PIPES), Piperazine mono 1,4 Bis (2 hydroxy mono 3-propanosulfonic acid) dihydrate (POPSO)
  • Example 1 the red blood cell layer (%) is lower than that in Comparative Example 1. That is, the ratio of plasma layer or serum layer (%) is increased, indicating that more plasma or serum can be collected.
  • Hematocrit (Hct) value (hematocrit value is the volume ratio of erythrocytes to whole blood, and the normal value is 40-50% for men. , 35% to 45% in women) was measured and found to be 45%. A portion of the sample was centrifuged and the plasma was extracted to prepare whole blood with a high Hct value. In addition, plasma was added to the whole blood to prepare a low Hct blood.
  • Phosphoenolpyruvate cyclohexylammonium salt (PEP—Cyclohexl-NH
  • Example 3 In the same experiment as in Example 3, no organic acid compound was added. 10 ⁇ L of 87.5 mM phosphoric acid bu ffer (pH 7.0) alone and whole blood collected with a blood collection tube for plasma were collected using a micropipette. Equal amounts of each were mixed, and then the same procedure as in Example 3 was followed to determine the red blood cell layer (%).
  • Reagents containing phosphoenolpyruvate sodium salt shown in Table 5 below were prepared, impregnated into Hemasep L (PALL), which is a blood cell separation membrane, and then dried in hot air.
  • PALL Hemasep L
  • 10 L of whole blood collected with a blood collection tube for plasma or serum was dropped with a micropipette. After standing for 5 minutes, the red blood cell and plasma or The erythrocyte partial length A (mm) of Hemasep L, which was separated into the serum part and became all wet, was measured from the left end.
  • the erythrocyte layer (%) AZl5xlOO was determined and shown in Table 6. The measurement was performed twice with the same operation.
  • the organic acid compound of the present invention exerts an effect by contacting with whole blood in a liquid state or a solid state.

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Abstract

［課題］血液を用いる検査では、通常、全血を血球分離し、血漿または血清を検体として測定されている。検査に用いられる血液の量は少ないほど好ましい。このため、微量な血液から血漿や血清を効率よく採取可能な血球分離方法が望まれている。 ［解決手段］採取した全血と、カルボキシル基、リン酸基及びスルホン酸基から選ばれる１種若しくは２種の基を有し、アミノ酸以外の有機酸化合物またはその塩とを接触させて血球を分離することを特徴とする血漿または血清の採取方法を提供する。

Description

明 細 書
血漿または血清の採取方法
技術分野
[0001] 本発明は、微量な血液からでも血漿や血清を効率よく分離、採取可能とする方法 に関するものである。
背景技術
[0002] 人の健康状態を調べる手段として、血液中に含まれる代謝産物、タンパク質、脂質 、電解質、酵素、抗原、抗体等の検出あるいは測定は広く行われている。しかし、これ らの検出あるいは測定は、通常、全血では困難であり血漿または血清を検体としてい る。
全血から血漿または血清を得る方法としては、
1.遠心分離機を用いる遠心分離法、
2.ガラス繊維濾紙などの血球濾過材料を用いる方法などが知られて ヽる。
さらに、この際、特許文献 1には無機塩若しくはアミノ酸の水溶液の、特許文献 2に は無機塩、アミノ酸若しくは糖類の使用が報告されている。
[0003] 特許文献 1に記載の方法は、全血に一定濃度の無機塩若しくはアミノ酸の水溶液 を添加した後に血球成分を濾別する方法で、水溶液としてのみ有効であり、使用す る剤形に制約がある。ガラス繊維濾紙に含浸させて使用した場合は溶血をおこすこと が記載されている。
特許文献 2に記載の方法は、予め無機塩、アミノ酸若しくは糖類を多孔性材料に担 持させておき、全血と接触させ血球成分を分離する方法で、乾燥状態のみの剤形制 約があり、その効果は水溶液の場合に比べ弱い。
[0004] 特許文献 1 :特開平 09— 196908号公報
特許文献 2：国際公開 01Z092886号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の目的は、より少ない血液から、より多くの血漿や血清を分離することであり 、使用する剤形や形態に制約がなぐ様々な条件の血液調整方法や血液成分分析 方法などへ応用可能な血球分離の方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者等は鋭意研究の結果、全血をカルボキシル基、リン酸基及びスルホン酸 基力 選ばれる 1種若しくは 2種の基を有する有機化合物と接触させると血球の分離 が促進され、効率よく血漿や血清が採取できることを見出し、本発明を完成させた。
[0007] 即ち、本発明は
(1)採取した全血と、カルボキシル基、リン酸基及びスルホン酸基カゝら選ばれる 1種 若しくは 2種の基を有し、アミノ酸以外の有機酸ィ匕合物またはその塩とを接触させて 血球を分離することを特徴とする血漿または血清の採取方法；
(2)採取した全血と、カルボキシル基、リン酸基及びスルホン酸基カゝら選ばれる 1種 若しくは 2種の基を有し、アミノ酸以外の有機酸ィ匕合物またはその塩あるいはその溶 液とを混合して血球を分離することを特徴とする上記（1)記載の血漿または血清の採 取方法；
(3)血球の分離に血球分離膜を使用する上記 (2)記載の血漿または血清の採取方 法；
(4)採取した全血を、カルボキシル基、リン酸基及びスルホン酸基カゝら選ばれる 1種 若しくは 2種の基を有し、アミノ酸以外の有機酸ィ匕合物またはその塩を担持させた血 球分離膜に添加して血球を分離することを特徴とする上記（1)記載の血漿または血 清の採取方法；
[0008] (5)有機酸ィ匕合物がケトーエノール型カルボン酸ィ匕合物、二価以上のカルボン酸ィ匕 合物、二価以上の有機リン酸ィ匕合物または二価以上の有機スルホン酸ィ匕合物である 上記（1)〜 (4)の 、ずれか一項に記載の血漿または血清の採取方法；
(6)有機酸化合物がホスホェノールピルビン酸、 α—ケトグルタル酸、ォキザ口酢酸 、ァセチルリン酸、ピルビン酸、 3—ホスホグリセリン酸、リンゴ酸、蓚酸、アデノシン— 5'—二リン酸、アデノシン 5'—三リン酸、酸価型または還元型のニコチンアミドアデ ニンジヌタレチド、酸価型または還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレチドリン酸、 エチレンジァミン四酢酸、ピぺラジン 1, 4 ビス（2 エタンスノレホン酸）及びピペラ ジン 1 , 4 ビス（2 ヒドロキシ 3 プロパンスルホン酸）二水和物からなる化合 物群より選択される 1種あるいは 2種以上である上記（1)〜 (4)の 、ずれか一項に記 載の血漿または血清の採取方法；
(7)上記（1)〜 (4)の 、ずれか一項に記載の血漿または血清の採取方法における力 ルポキシル基、リン酸基及びスルホン酸基カゝら選ばれる 1種若しくは 2種の基を有し、 アミノ酸以外の有機酸ィ匕合物またはその塩；
に関する。
発明の効果
[0009] 本発明により、より少ない血液から、より多くの血漿や血清を分離することが可能と なり、また、低コストで簡便で且つ迅速な血液成分分析が可能となった。さらに、本発 明の血漿または血清の採取方法に使用するカルボキシル基、リン酸基及びスルホン 酸基力 選ばれる 1種若しくは 2種の基を有し、アミノ酸以外の有機酸化合物または その塩は、これまでになかった切れ味の鋭い血球の分離を示し、血液の粘度が高い 「高へマトクリット血液」であっても同様の効果を有するもので、血球分離促進剤と呼 ばれることちある。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明の血漿または血清の採取方法は、採取した全血と、カルボキシル基、リン酸 基及びスルホン酸基カゝら選ばれる 1種若しくは 2種の基を有し、アミノ酸以外の有機 酸ィ匕合物またはその塩とを接触させて血球を分離することを特徴とする。
本発明が適用される全血とは、通常、生体力 採取される血液であれば、採取方法 等は特に限定されず、へパリン、フッ化ナトリウムなどの抗凝固剤や解糖阻止剤など が含まれていてもよい。
アミノ酸には、通常の α—または j8—アミノ酸が含まれ、 D—アミノ酸も L—アミノ酸 も含まれる。
[0011] 全血と接触させるとは、採取した全血と、カルボキシル基、リン酸基及びスルホン酸 基力 選ばれる 1種若しくは 2種の基を有し、アミノ酸以外の有機酸化合物またはそ の塩あるいはその溶液とを混合する方法や採取した全血を、カルボキシル基、リン酸 基及びスルホン酸基カゝら選ばれる 1種若しくは 2種の基を有し、アミノ酸以外の有機 酸化合物またはその塩を担持させた血球分離膜に添加する方法等がある。
[0012] 本発明の血漿または血清の採取方法において、カルボキシル基、リン酸基及びス ルホン酸基力 選ばれる 1種若しくは 2種の基を有し、アミノ酸以外の有機酸化合物と しては特に限定されず、例えば、ピルビン酸、 aーケトグルタル酸、ォキザ口酢酸等 のケトーエノール型カルボン酸化合物；クェン酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、リ ンゴ酸、コハク酸、酒石酸、アジピン酸、ダルタル酸、ィタコン酸、蓚酸等の二価以上 のカルボン酸化合物；ギ酸、酢酸、ダルコン酸、乳酸、プロピオン酸、グリコール酸、 ダリオキシル酸、ヒドロキシ酪酸、グリセリン酸、クロトン酸、シキミ酸、エチレンジァミン 四酢酸（EDTA) ; 2、 3 ジホスホグリセリン酸、アデノシンー5' ニリン酸(八0?)、 アデノシン 5'—三リン酸 (ATP)、酸価型または還元型のニコチンアミドアデニンジ ヌクレチド、酸価型または還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレチドリン酸等の二 価以上の有機リン酸化合物；グルコースー6—リン酸、フルクトースー 6—リン酸、タレ ァチンリン酸、ァセチルリン酸 (Acetyl phosphate)、 2 ホスホグリセリン酸、 3 ホ スホグリセリン酸；ピぺラジン一 1, 4 ビス（2 エタンスルホン酸）（PIPES)、ピペラ ジン 1 , 4 ビス（2 ヒドロキシ 3 プロパンスルホン酸）二水和物（POPSO)等 の二価以上の有機スルホン酸化合物； 2—（N モルフォリノ）エタンスルホン酸 (ME S)、 2—[4一（2 ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュル]エタンスルホン酸（HEPES ) , N, N ビス（2—ヒドロキシェチル） 2—アミノエタンスルホン酸（BES)；ホスホェ ノールピルビン（PEP)酸、ァスコルビン酸、ァラボアスコルビン酸等が挙げられ、ケト ーェノール型カルボン酸ィ匕合物、二価以上のカルボン酸ィ匕合物、二価以上の有機リ ン酸ィ匕合物または二価以上の有機スルホン酸ィ匕合物が好ましぐ例えば、ホスホエノ ールピルビン酸、 a—ケトグルタル酸、ォキザ口酢酸、クレアチンリン酸、ァセチルリン 酸、ピルビン酸、 3—ホスホグリセリン酸、リンゴ酸、蓚酸、アデノシン一 5'—二リン酸、 アデノシン 5'—三リン酸、酸価型または還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレチ ド、酸価型または還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレチドリン酸、エチレンジアミ ン四酢酸、 PIPES, POPSO等が好ましぐ特にホスホェノールピルビン酸、クレアチ ンリン酸、ァセチルリン酸または 3—ホスホダリセリン酸が好ましい。
[0013] 本発明において使用する有機酸化合物の塩としては特に限定されず、ナトリウム塩 、カリウム塩、アンモ-ゥム塩、シクロへキシルアンモ-ゥム塩等が挙げられ、その無 水塩であっても水和物であってもよ！/、。
さらに、上記の有機酸ィ匕合物またはその塩は単独で用いても組み合わせて用いて ちょい。
[0014] 本発明の血漿または血清の採取方法に使用する有機酸ィ匕合物またはその塩は、 全血と接触すると、血漿または血清と、赤血球等の血球とを迅速に分離し、血液凝固 や溶血は起こさず、より多くの血漿または血清を採取可能とするものである。採取とは 、血漿または血清を取り出さず血球と分離することも含む。また、へマツトクリットを低 下させたり、浸透圧の作用により細胞を収縮させる作用を有していてもよい。さらには 、赤血球表面の極性を変化させ赤血球の凝固若しくは凝集を促進させる作用も有し ていてもよい。
[0015] 本発明の血漿または血清の採取方法についてさらに説明する。
全血から血球を分離する方法は、遠心分離による方法、血球分離膜、濾紙や親水 性の高分子膜を用いる方法などがあるが、本発明の血漿または血清の採取方法はこ れらのどの方法にも適用できる。
本発明において有機酸ィ匕合物またはその塩は、水溶液等の溶液状態、ゾルゃゲ ル状のような半液体や半固体状態または粉末などの固体状態で使用することができ る。
血漿または血清の採取方法として具体的には、例えば、採血後 2分以内に全血と 前記の有機酸ィ匕合物またはその塩と抗凝固剤とを混合し、 3000回転で約 15分 (4 °C)遠心分離して血漿を得る方法;採血した全血と前記の有機酸ィ匕合物またはその 塩とを混合し、室温で約 30分放置後、 3000回転で約 15分 (4°C)遠心分離して血清 を得る方法等がある。
全血と前記の有機酸ィ匕合物またはその塩と抗凝固剤とを混合して、ある ヽは全血と 前記の有機酸ィ匕合物またはその塩とを混合して室温で約 30分放置した後に、血球 分離膜や濾紙あるいは親水性の高分子膜を用い血漿または血清を得る方法もあり、 これらも本発明に含まれる。また、血球分離膜や濾紙あるいは親水性の高分子膜に あらかじめ抗凝固剤を担持させておけば、全血と前記の有機酸ィ匕合物またはその塩 を添加後すぐに血球分離操作が進行し血漿が得られる。
さらに、あらかじめ血球分離膜や濾紙あるいは親水性の高分子膜に前記の有機酸 化合物またはその塩、血漿の場合には抗凝固剤をも担持させ、採取した全血を添カロ して血漿または血清を得ることもでき、これらの方法も本発明に含まれる。
[0016] 前記の有機酸ィ匕合物またはその塩を全血と混在させる時の pHは特に制限はな ヽ 力 あまりに pHが低いと血液が凝固を起こすため、好ましくは pH3. 5〜pH12程度 であり、より好ましくは pH4. 0〜pH10. 0である。
全血と混在させる時の前記の有機酸ィ匕合物またはその塩の濃度についても特別な 制限はないが、低濃度側ではその効果が弱ぐ高濃度側では溶血が生じやすいため 、好ましくは全血と混合状態にある時、全血中における濃度が 0. 02molZL〜0. 6 molZL程度が好ましぐ 0. lmolZL〜0. 5molZL程度がより好ましい。
前記の有機酸ィ匕合物またはその塩と混合する全血の量は特に制限はないが、遠 心分離が困難な量、例えば、 lmL以下で本発明の方法は有用である。微量であるほ ど好まし!/、が、採取が可能な量を考慮すると 0. 1 μ L〜200 μ L程度が好ま 、。
[0017] 血球分離膜としては、市販のガラス繊維濾紙、表面が親水化処理された弗素含有 ポリマー、ポリスルホンなどの微多孔性材料等が使用可能である。また、それらを組 み合わせた積層体でもよ 、。
また、本発明は血糖測定用のバイオセンサなどの電極表面に形成され低分子物質 のみを透過させて血球等の高分子物質を排除する親水性高分子層を使用する血球 分離にも使用可能である。
さらに、カラムゃ流路中に血球分離膜や親水性高分子膜やそれらの積層体等を配 置して、毛細管現象、引圧や加圧などにより血液を通過させて行う血球分離にも応用 可能である。
[0018] 血漿または血清の採取の際に前記の有機酸ィ匕合物またはその塩以外の添加剤を 用いてもよい。該添加剤には乳化剤や湿潤剤、長期の保存を可能にする防腐剤や 安定化剤、乾燥や濃縮防止を目的とする界面活性剤、 pH調節を目的とする緩衝剤 などが挙げられる。さらに、検査の目的に応じて各種の化合物、例えば、 1, 5—アン ヒドログルシトール測定の前処理試薬である選択的にグルコースを消去したり変換し たりする試薬等とともに用いることもできる。
実施例
[0019] 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例 になんら制約されるものではな 、。
[0020] 実施例 1
血漿用または血清用の採血管で採取した全血 200 Lに、以下の有機酸化合物 の水溶液（0. 5mol/L)を pH約 6〜7に調製し、 50 Lをマイクロピペットで添カロし て混ぜ、へノ^ン処理済へマトクリット毛細管（血漿用）または未処理へマトクリット毛 細管 (血清用）にその約 3分の 2程度入れて片端をパテで栓をした。
血清用については室温で 30分以上放置した後、 3000回転で 10分間遠沈して、 赤血球層 (%) =赤血球層長 Z全層長 xlOOを求めた。
血漿用についてはすぐに 3000回転で 10分間遠沈して、赤血球層 (%) =赤血球 層長 Z全層長 xlOOを求めた。その結果を表 1に示す。
[0021] 有機酸ィ匕合物またはその塩
ホスホェノールピルビン酸シクロへキシルアンモ-ゥム塩（PEP— Cyclohexl-NH
3
+)、ホスホェノールピルビン酸ナトリウム塩（PEP— Na+)、ホスホェノールピルビン 酸カリウム塩（PEP— K+)、篠酸、リンゴ酸、 α—ケトグルタル酸、ォキザ口酢酸、ェ チレンジァミン四酢酸（EDTA)、ァセチルリン酸、 3—ホスホグリセリン酸、アデノシン 5'—二リン酸、アデノシン 5'—三リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレチド（Ν AD)、ニコチンアミドアデニンジヌクレチドリン酸（NADP)、ピペラジン 1, 4 ビス（ 2 エタンスノレホン酸）（PIPES)、ピペラジン一 1, 4 ビス（2 ヒドロキシ一 3 プロ パンスルホン酸）二水和物（POPSO)
[0022] [表 1] 赤血球/! f (%)
添加化合物 血笾用 血清用
P E P_ C y c l o h e x y l — NH3 + 25. 5 25. 7
P E P_ N a + 23. 3
P E P— K + 2 1. 9 28. 1 蓚酸 27. 9 リンゴ酸 25. 0 27. 3 α—ケトグルタル酸 26. 7 才キザ口酢酸 25. 0 25. 3
E DT A 26. 2
Ac e t y l p h o s p h a t e 26. 5
3—ホスホダリセリン酸 25. 3
A D P 28. 2 28. 7
AT P 28. 1
NAD 28. 6
N A D P 25. 4
P I P ES 29. 2 29. 5
P 0 P S 0 28. 6 結果から明らかなように赤血球層（％)は血漿で 21.9%〜29.2%、血清で 25.3 %〜29.5%であった。
[0023] 比較例 1
実施例 1の有機酸ィ匕合物に代えて、生理食塩水またはアミノ酸 (ァラニン若しくはセ リン)または糖類 (グルコース、マン-トール若しくはガラクトース）の水溶液 (0.5mol ZL)を用いて実施例 1と同様に赤血球層（％)を求めた。その結果を表 2に示す。
[0024] [表 2] 赤血球層 （％)
添加化合物 血漿用 血清用 生理食塩水 3 2 . 5 3 4 . 1 ァラニン 3 0 . 4 セリン 3 0 . 7 グルコース 3 9 . 5 4 0 . 7 マンニトール 3 0 . 3 3 3 . 3 ガラク卜ース 3 0 . 8 4 0 . 7 結果から明らかなように、赤血球層（％)は血漿で 30. 3%〜39. 5%、血清で 32.
5%〜40. 7%であった。
[0025] 実施例 1は比較例 1に比べて、赤血球層 (%)が低下している。即ち、血漿層または 血清層（％)の割合が増カロしており、血漿または血清がより多く採取可能であることが 示されている。
[0026] 実施例 2
健常女子から、 20mLの全血を血漿用採血管に採取してへマトクリット (Hct)値 (へ マトクリット値とは全血液に対する赤血球の容積比であり、正常値の目安は男性で 40 〜50%、女性で 35〜45%である。）を測定したところ、 45%であった。その一部を遠 心分離して血漿を抜き取り高い Hct値の全血を調製した。また、全血に血漿を添加し て低!、Hct値の全血を調製した。
このように調製した全血検体 6種類について、全血 200 Lあたり 50 /x Lの 0. 5mo 1ZLのホスホェノールピルビン酸カリウム塩溶液をマイクロピペットにて添加し、実施 例 1と同様にして赤血球層 (%)を計測し、血漿層 (%) = 100—赤血球層 (%)を求め た。結果を表 3に示す。
[0027] 比較例 2
実施例 2と同様の実験において、実施例 2の 0. 5molZLのホスホエノールビルビ ン酸カリウム塩溶液を生理食塩水に代えて血漿層（％)を求めた。結果を表 3に示す [0028] [表 3]
Figure imgf000011_0001
結果カゝら明らかなように、実施例 2で得られた血漿層 (%)は比較例 2で得られた血 漿層（％)より大きぐ血漿がより多く採取可能であることが示されている。さらに、実施 例 2で得られた血漿層 (%)と比較例 2で得られた血漿層 (%)との比は、検体の Hct 値（％)が増加するに伴って増加している。このことはより高い Hct値の全血ほど本発 明の効果が高 、ことを示して 、る。
[0029] 実施例 3
87. 5mM リン酸 buffer (pH7. 0)中に、表 4に記載の有機酸化合物を 87. 5mM となるように溶解し、 pHを 7. 0に再調製した液と、血漿用採血管で採取した全血とを マイクロピペットにて 10 Lずつ等量混合した後、血球分離膜であるへマセップ L (P ALL製） 5mmxl5mmの左端に 15 μ Lをマイクロピペットにより滴下した。 5分放置 後、赤血球部と血漿部に分離して全てが濡れた状態となったへマセップ Lの赤血球 部分長 A (mm)を左端より計測した。 AZl5xl00を赤血球層 (%)として求め、表 4 に示した。
[0030] 有機酸ィ匕合物またはその塩
ホスホェノールピルビン酸シクロへキシルアンモ-ゥム塩（PEP— Cyclohexl-NH
+ )、酢酸、クェン酸、フマル酸、ダルコン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、 蓚酸、プロピオン酸、ピルビン酸、コハク酸、酒石酸、ァスコルビン酸、ァラボアスコル ビン酸、グルコース 6—リン酸、フルクトースー 6—リン酸、 α—ケトグルタル酸、グリ コール酸、ダリオキシル酸、ヒドロキシ酪酸、ダルタル酸、ォキザ口酢酸、グリセリン酸 、ィタコン酸、クロトン酸、シキミ酸、エチレンジァミン四酢酸 2ナトリウム塩（EDTA' 2 Na)、アデノシン 5'—二リン酸 (ADP)、アデノシン 5'—三リン酸 (ATP)、還元型 ニコチンアミドアデニンジヌクレチドリン酸 (NADPH)、還元型ニコチンアミドアデニン ジヌクレチド（NADH)、ァセチルリン酸、 2、 3 ジホスホグリセリン酸、 3 ホスホグリ セリン酸、 2- (N モルフォリノ）エタンスルホン酸（MES)、ピペラジン一 1, 4 ビス (2 エタンスルホン酸） (PIPES) , 2- [4- (2 ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュ ル]エタンスルホン酸（HEPES)、 N, N ビス（2—ヒドロキシェチル） 2—アミノエタ ンスルホン酸（BES)
[0031] 比較例 3
実施例 3と同様の実験において、有機酸ィ匕合物を添加しない 87. 5mM リン酸 bu ffer (pH7. 0)のみと血漿用採血管で採取した全血とをマイクロピペットにて 10 μ L ずつ等量混合して行い、以下実施例 3と同様に操作して、赤血球層（％)を求め、表 4に示した。
[0032] [表 4]
PEP— Cyclohexyl- NH3 + 32. 7% グルタル酸 40. 0% 酢酸 33. 3% ォキザ口 Βΐ酸 30. 0% クェン酸 33. 3% グリセル酸 33. 3% フマル酸 40. 0% ィタコン酸 46. 7 % グルコン酸 36. 7% クロ卜ン酸 30. 0% 乳酸 30. 0% シキミ酸 30. 0% マレイン酸 33. 3% EDTA - 2Na 33. 3% リンゴ酸 30. 0% ADP 36. 7% マロン酸 33. 3% ATP 53. 3% 蓚酸 30. 0% β - NADPH 43. 3% プロピオン酸 33. 3% β - NADH 33. 3% ピルビン酸 36. 7% ァセチルリン酸 36.フ％ コハク酸 40. 0% 2. 3—ジホスホグリセリン酸 40. 0% 酒石酸 33. 3% 3—ホスホグリセリン酸 56.フ％ ァスコルビン酸 33. 3% MES 46.フ％ ァラボァスコルビン酸 40. 0% PIPES 43. 3% グルコース一 6—リン酸 30. 0% HEPES 40. 0% フルク! -—ス一 6—リン酸 30. 0% BES 33. 3% α—ケトグルタル酸 40. 0%
グリコール酸 33. 3% 比較例 3
グリオキシル酸 40. 0% 添加なし 60. 3% ヒドロキシ酪酸 46. 7%
[0033] 実施例 3のように上記有機酸ィ匕合物と血球分離膜を組み合わせることにより、比較 例 3に比べて赤血球層（％)の割合が低下しており、多くの血漿が採取可能、即ち少 量の全血にて検査可能であることを示して 、る。
[0034] 実施例 4
以下の表 5に示すホスホェノールピルビン酸 ナトリウム塩を含有する試薬を調製し 、血球分離膜であるへマセップ L (PALL製）に含浸後、温風乾燥した。こうして得ら れた血球分離膜 5mmxl 5mmの左端に、血漿用または血清用採血管で採取した 10 Lの全血をマイクロピペットにより滴下した。 5分放置後、赤血球部と血漿部または 血清部に分離して全てが濡れた状態となったへマセップ Lの赤血球部分長 A (mm )を左端より計測した。赤血球層 (%) = AZl5xlOOを求め、表 6に示した。同じ操作 にて測定は 2回行った。
[表 5]
試薬 濃度（mmolZL)
リン酸緩衝液 (ρΗ7. 0) 50
リンゴ酸 20
PEP" Na+ 200
[0035] 比較例 4
実施例 4における上記有機酸ィ匕合物を含浸して温風乾燥処理した血球分離膜の 代わりに、未処理の血球分離膜を使用して実施例 4と同様に行い、赤血球層（％)を 求め表 6に示した。
[0036] [表 6]
赤血球層（％) 実施例 4 比較例 4
血漿検体 測定 1 33. 0% 60. 0%
血漿検体 測定 2 33. 0% 60. 0%
血清検体 測定 1 53. 0% 73. 0%
血清検体 測定 2 53. 0% 73. 0%
[0037] 結果から明らかなように、上記有機酸化合物を血球分離膜上に温風乾燥状態にし て全血を添加しても、上記有機酸ィ匕合物を用いない比較例 4に比べて赤血球層 (% )の割合が低下していた。即ち、多くの血漿や血清が採取可能であることが明らかで ある。
本発明の上記有機酸化合物は、液体状態でも固体状態でも全血と接触させること で効果を発揮することが確認された。

Claims

請求の範囲
[1] 採取した全血と、カルボキシル基、リン酸基及びスルホン酸基カゝら選ばれる 1種若しく は 2種の基を有し、アミノ酸以外の有機酸化合物またはその塩とを接触させて血球を 分離することを特徴とする血漿または血清の採取方法。
[2] 採取した全血と、カルボキシル基、リン酸基及びスルホン酸基カゝら選ばれる 1種若しく は 2種の基を有し、アミノ酸以外の有機酸ィ匕合物またはその塩あるいはその溶液とを 混合して血球を分離することを特徴とする請求項 1記載の血漿または血清の採取方 法。
[3] 血球の分離に血球分離膜を使用する請求項 2記載の血漿または血清の採取方法。
[4] 採取した全血を、カルボキシル基、リン酸基及びスルホン酸基カゝら選ばれる 1種若しく は 2種の基を有し、アミノ酸以外の有機酸化合物またはその塩を担持させた血球分 離膜に添加して血球を分離することを特徴とする請求項 1記載の血漿または血清の 採取方法。
[5] 有機酸ィ匕合物がケトーエノール型カルボン酸ィ匕合物、二価以上のカルボン酸ィ匕合物 、二価以上の有機リン酸ィ匕合物または二価以上の有機スルホン酸ィ匕合物である請求 項 1〜4のいずれか一項に記載の血漿または血清の採取方法。
[6] 有機酸化合物がホスホェノールピルビン酸、 α—ケトグルタル酸、ォキザ口酢酸、ァ セチルリン酸、ピルビン酸、 3—ホスホグリセリン酸、リンゴ酸、蓚酸、アデノシン一 5'— 二リン酸、アデノシン 5'—三リン酸、酸価型または還元型のニコチンアミドアデニン ジヌタレチド、酸価型または還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレチドリン酸、ェチ レンジアミン四酢酸、ピぺラジン 1, 4 ビス（2 エタンスノレホン酸）及びピぺラジン 1 , 4 ビス（2 ヒドロキシ 3 プロパンスルホン酸）二水和物からなる化合物群 より選択される 1種あるいは 2種以上である請求項 1〜4のいずれか一項に記載の血 漿または血清の採取方法。
[7] 請求項 1〜4の 、ずれか一項に記載の血漿または血清の採取方法におけるカルボキ シル基、リン酸基及びスルホン酸基力 選ばれる 1種若しくは 2種の基を有し、ァミノ 酸以外の有機酸ィ匕合物またはその塩。
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