KR102340553B1 - 개선된 재프로그래밍 방법 및 세포 배양 플랫폼 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 만능세포의 제조를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 기저상태 만능성을 지니는 만능세포의 제조를 위한 개선된 배양 플랫폼을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 부분적으로 (a) Wnt 경로 효현제; (b) MEK 저해제; 및 (c) ROCK 저해제를 포함하는 조성물을 상정한다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 bFGF 또는 LIF를 추가로 포함한다.

Description

개선된 재프로그래밍 방법 및 세포 배양 플랫폼{IMPROVED REPROGRAMMING METHODS AND CELL CULTURE PLATFORMS}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 미국 특허법(35 U.S.C. § 119(e)) 하에서 2014년 3월 4일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/947,979호의 유익을 주장하며, 이 기초출원은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 포함된다.
서열 목록에 관한 언급
본 출원과 관련된 서열목록은 종이 복사물을 대신하여 텍스트 형식으로 제공되며, 본 명세서에 참고로 포함된다. 서열목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은 FATE_122_01WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 8KB이며, 2015년 3월 4일자에 생성되었고, 본 명세서의 출원과 동시에 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 만능세포를 제조하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 기저상태 만능성을 지니는 만능세포의 제조를 위한 개선된 배양 플랫폼에 관한 것이다.
오늘날의 만능 줄기 세포-기반 질환 및 독성 선별 노력 및 미래의 자발/동종이계 만능 줄기 세포 요법은 인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem cell: hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포(human induced pluripotent stem cell: hiPSC)의 세포주 생성 및 확장의 강하고, 재현할 수 있는 방법을 필요로 한다. hiPSC는 게놈-통합 레트로- 및 렌티바이러스 발현 시스템을 통해 도입된 만능성 인자의 이소성(ectopic) 발현에 의해 생성되었다. 가능한 다수의 통합 사건을 제거하기 위한 노력은 소분자 저해제를 다수의 재프로그래밍 인자로 치환하는 것을 포함하였다. 추가로, 비통합적 방법은 비효율적이고 노동 집약적인 것으로 증명되었는데, 이는 추가적인 재프로그래밍 인자를 필요로 하거나 또는 모든 체세포를 재프로그래밍함에 있어서 효과적이지 않다(Lee et al., 2013).
만능 줄기 세포의 배양과 관련된 몇몇 도전은 세포가 미래의 산업 및 임상 적용분야에 적합하게 되도록 아직 처리되지 않았다. 가장 통상적으로 사용되는 전통적인 배양 시스템에서, hESC 및 hiPSC는 피더 세포(feeder cell) 상에서 유지되는 한편, 광대한 세포사 및 게놈 이상을 방지하기 위해 무리로 계대되었다(Thomson et al., 1998). 무 피더(feeder-free: FF) 환경에서 단일 세포 배양 hiPSC에 대한 불능은 잠재적 산업 규모 선별 또는 세포 요법 적용을 심하게 제한한다(Skottman et al., 2007; Valamehr et al., 2011). 추가로, hiPSC를 개선시키는 것에 대한 최근의 노력은 이러한 노력의 치료적 관련성을 제한하는 무 이식유전자(transgene-free)가 아닌 렌티바이러스 유래 hiPSC에 집중되었다.
게놈 변형 외에 아직까지 성공적으로 처리되지 않은 다른 도전은 배양에서 인간 만능 줄기 세포의 자발적 분화를 위한 경향이다(Pera and Trounson, 2004; Sathananthan and Trounson, 2005; Valamehr et al., 2011).
hESC 및 hiPSC의 연구가 기재되었지만, 만능성 유전자의 연속적 이소성은 산업- 및 임상-등급 만능세포에 적합하지 않은 게놈 변형 인간 만능 줄기 세포를 초래하는 기저상태를 유지하는데 필수적이다(Hanna et al., 2010a).
따라서, 인간 만능세포 산물의 고속대량, 이식유전자 또는 유전체 비삽입형(footprint free) 생성을 위한 조성물 및 방법의 부재는 이제까지는 장래의 만능 줄기 세포 요법의 개발 및 상업화에서 실질적인 장애가 되는 것으로 증명되었다.
본 발명은 일반적으로 개선된 세포 배양 플랫폼을 제공한다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 부분적으로 (a) Wnt 경로 효현제; (b) MEK 저해제; 및 (c) ROCK 저해제를 포함하는 조성물을 상정하되, 조성물은 TGFβR 저해제를 포함하지 않는다.
특정 실시형태에서, Wnt 경로 효현제는 GSK3 저해제이다.
특정 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99021 또는 BIO이다.
추가적인 실시형태에서, MEK 저해제는 PD98059 또는 PD032901이다.
추가적인 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이다.
일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99021이고; MEK 저해제는 PD032901이며; ROCK 저해제는 티아조비빈이다.
특정 실시형태에서, 임의의 앞서 언급한 조성물은 추가로 bFGF 또는 LIF를 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 임의의 앞서 언급한 조성물은 추가로 bFGF 및 LIF를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 임의의 앞서 언급한 조성물을 포함하는 배양 배지가 제공되되, 배지는 TGFβR 저해제를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 만능세포를 배양시키는 방법은 임의의 앞서 언급한 배양 배지에 따라 세포 배양 배지에서 하나 이상의 만능세포를 배양시키는 단계를 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 하나 이상의 만능세포는 배아 줄기 세포(embryonic stem cell: ESC) 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)이다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 만능세포는 iPSC이다.
특정 실시형태에서, 조성물은 만능세포의 집단을 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 만능세포의 집단은 균일한 만능세포의 집단이다.
특정 실시형태에서, 만능세포의 집단의 적어도 95%는 SSEA4-FITC 및 TRA1-81 또는 TRA1-60을 발현시킨다.
일부 실시형태에서, 만능세포의 집단의 5% 이하는 α-평활근 액틴(SMA), TUJ1 또는 FoxA2를 발현시킨다.
특정 실시형태에서, 만능세포는 TGFβR 저해제를 포함하는 세포 배양 배지에서 사전에 배양되었다.
추가적인 실시형태에서, 세포 배양 배지에서 만능세포를 배양시키는 단계는 배양된 세포의 자발적 분화를 감소시킨다.
일 실시형태에서, 배양된 세포에서 하나 이상의 분화 마커 유전자의 발현은 TGFβR 저해제를 포함하는 배지에서 배양된 만능세포에서의 하나 이상의 분화 마커 유전자의 발현에 비해 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 감소되되, 분화 마커 유전자는 FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(단미증(Brachyury)) 및 ZIC1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 하나 이상의 분화 마커 유전자는 T 유전자, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 및 TUJ1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 2개 이상의 분화 마커 유전자의 발현은 TGFβR 저해제를 포함하는 배지에서 배양된 만능세포에서의 2개 이상의 분화 마커 유전자의 발현에 비해 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 배양된 세포에서 감소되되, 분화 마커 유전자는 FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(단미증) 및 ZIC1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 2개 이상의 분화 마커 유전자는 T 유전자, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 및 TUJ1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 3개 이상의 분화 마커 유전자의 발현은 TGFβR 저해제를 포함하는 배지에서 배양된 만능 세포에서의 3개 이상의 분화 마커 유전자의 발현에 비해 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 배양된 세포에서 감소되되, 분화 마커 유전자는 FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(단미증) 및 ZIC1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 3개 이상의 분화 마커 유전자는 T 유전자, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 및 TUJ1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 실시형태에서, 5개 이상의 분화 마커 유전자의 발현은 TGFβR 저해제를 포함하는 배지에서 배양된 만능세포에서의 5개 이상의 분화 마커 유전자의 발현에 비해 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 배양된 세포에서 감소되되, 분화 마커 유전자는 FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(단미증) 및 ZIC1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시형태에서, 5개 이상의 분화 마커 유전자는 T 유전자, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 및 TUJ1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 세포 배양 배지에서 만능세포를 배양시키는 단계는 만능성의 기저상태를 유지하거나 또는 유도한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 만능세포의 만능성의 기저상태는 적어도 5회 계대 동안 유지된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 만능세포의 만능성의 기저상태는 적어도 10회 계대 동안 유지된다.
추가적인 특정 실시형태에서, 하나 이상의 만능세포의 만능성의 기저상태는 적어도 50회 계대 동안 유지된다.
추가적인 특정 실시형태에서, 하나 이상의 만능세포의 만능성의 기저상태는 적어도 100회 계대 동안 유지된다.
다양한 실시형태에서, 앞서 언급한 방법은 계대 동안 하나 이상의 만능세포를 해리시키는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 만능세포의 생존도는 계대 동안 유지된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 만능세포는 정상 핵형을 포함한다.
특정의 추가적인 실시형태에서, 하나 이상의 만능세포 무 피더 환경에서 배양된다.
특정의 추가적인 실시형태에서, 하나 이상의 만능세포의 게놈 안정성은 적어도 10회 계대 동안 유지된다.
특정 관련된 실시형태에서, 하나 이상의 만능세포의 게놈 안정성은 적어도 50회 계대 동안 유지된다.
특정 다른 실시형태에서, 하나 이상의 만능세포의 게놈 안정성은 적어도 100회 계대 동안 유지된다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 부분적으로 (a) 피더 세포의 존재 하에 배양된 하나 이상의 만능세포를 단리시키는 단계; (b) Wnt 경로 효현제; MEK 저해제; 및 ROCK 저해제를 포함하는 화학적으로 한정된 세포 배양 배지에서 하나 이상의 만능세포를 배양시키는 단계를 포함하는 무 피더 배양에 대해 만능세포를 적합화시키는 방법을 상정하되, 선택적으로 Wnt 경로 효현제는 GSK3 저해제이고; 배지는 TGFβR 저해제를 포함하지 않는다.
다양한 특정 실시형태에서, 본 발명은 (a) 단일 만능세포를 계대시키기 위해 하나 이상의 만능세포를 효소적으로 처리하는 단계; (b) 무 피더 환경에서 단일 만능세포를 배양시키는 단계; (c) Wnt 경로 효현제, MEK 저해제; 및 ROCK 저해제를 포함하는 화학적으로 한정된 세포 배양 배지에서 단일 만능세포를 배양시키는 단계를 포함하는 단일 세포로서 효소적으로 계대된 만능세포를 배양시키는 방법을 상정하되, Wnt 경로 효현제는 GSK3 저해제이고; 배지는 TGFβR 저해제를 포함하지 않는다.
다양한 특정 실시형태에서, 본 발명은 부분적으로 (a) 무 피더 환경에서 하나 이상의 만능세포를 배양시키는 단계; (b) Wnt 경로 효현제; MEK 저해제; 및 ROCK 저해제를 포함하는 화학적으로 한정된 세포 배양 배지에서 하나 이상의 만능세포를 배양시키는 단계를 포함하는 하나 이상의 만능세포의 자발적 분화를 감소시키는 방법을 상정하되, 선택적으로, Wnt 경로 효현제는 GSK3 저해제이고, 배지는 TGFβR 저해제를 포함하지 않는다.
다양한 추가적인 실시형태에서, 본 발명은 부분적으로, (a) 하나 이상의 비-만능세포를 얻는 단계; (b) 하나 이상의 비-만능세포를 만능성 상태로 재프로그래밍하는 단계; (c) TGFβR 저해제를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 만능세포를 배양시킴으로써 iPSC를 생성하는 단계를 포함하는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 제조하는 방법을 상정한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 비-만능세포는 체세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-만능세포는 성체 줄기 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 비-만능세포는 세포에서 내인성 OCT4의 발현을 증가시킴으로써 만능성 상태로 재프로그래밍된다.
추가적인 실시형태에서, 하나 이상의 비-만능세포를 만능성 상태로 재프로그래밍하는 단계는 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB 및 SV40LT로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 하나 이상의 비-만능세포를 만능성 상태로 재프로그래밍하는 단계는 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB 및 SV40LT로 이루어진 군으로부터 선택되는 재프로그래밍 인자의 하나 이상의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 비-만능세포를 만능성 상태로 재프로그래밍하는 단계는 OCT4, SOX2 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택되는 재프로그래밍 인자의 하나 이상의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 비-만능세포를 만능성 상태로 재프로그래밍하는 단계는 OCT4, NANOG, ECAT1, UTF1 및 ESRRB로 이루어진 군으로부터 선택되는 재프로그래밍 인자의 하나 이상의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 비-만능세포를 만능성 상태로 재프로그래밍하는 단계는 OCT4, ECAT1 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 재프로그래밍 인자의 하나 이상의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 에피솜 벡터이다.
관련된 특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 Wnt 경로 효현제; MEK 저해제; 및 ROCK 저해제를 포함하되, 선택적으로 Wnt 경로 효현제는 GSK3 저해제이다.
추가적인 특정 실시형태에서, 하나 이상의 비-만능세포를 재프로그래밍하는 단계는 하나 이상의 비-만능세포를 Wnt 경로 효현제; MEK 저해제; 및 TGFβR 저해제, 및 선택적으로 ROCK 저해제와 접촉시키는 단계를 포함하되, 선택적으로 Wnt 경로 효현제는 GSK3 저해제이다.
추가적인 실시형태에서, iPSC는 iPSC의 집단을 포함한다.
특정 실시형태에서, iPSC의 집단은 iPSC의 균일한 집단이다.
특정 실시형태에서, iPSC의 집단의 적어도 95%는 SSEA4 및 TRA1-81 또는 TRA1-60을 발현시킨다.
특정 실시형태에서, 만능세포의 집단의 5% 이하는 α-평활근 액틴(SMA), TUJ1 또는 FoxA2를 발현시킨다.
특정 실시형태에서, 세포 배양 배지에서 만능세포를 배양시키는 단계는 자발적 분화를 감소시키거나, 만능성의 기저상태를 유지 또는 유도한다.
추가적인 실시형태에서, 1개 이상의, 2개 이상의, 3개 이상의, 4개 이상의, 또는 5개 이상의 분화 마커 유전자의 발현은 TGFβR 저해제를 포함하는 배지에서 배양된 iPSC에서의 하나 이상의 분화 마커 유전자의 발현에 비해 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 iPSC를 감소시키되, 분화 마커 유전자는 FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(단미증) 및 ZIC1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 분화 마커 유전자는 T 유전자, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 및 TUJ1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 자발적 분화의 감소는 적어도 5회 계대 동안 유지된다.
다른 실시형태에서, 자발적 분화의 감소는 적어도 10회 계대 동안 유지된다.
특정 실시형태에서, 자발적 분화의 감소는 적어도 50회 계대 동안 유지된다.
추가적인 실시형태에서, 자발적 분화의 감소는 적어도 100회 계대 동안 유지된다.
추가적인 실시형태에서, 앞서 언급한 방법은 계대 동안 iPSC를 해리시키는 단계를 포함한다.
추가적인 실시형태에서, iPSC의 생존도는 계대 동안 유지된다.
특정 실시형태에서, iPSC는 정상 핵형을 포함한다.
다른 실시형태에서, iPSC는 무 피더 환경에서 배양된다.
특정 실시형태에서, iPSC의 게놈 안정성은 적어도 10회 계대 동안 유지된다.
추가적인 실시형태에서, iPSC의 게놈 안정성은 적어도 50회 계대 동안 유지된다.
특히 추가적인 실시형태에서, iPSC의 게놈 안정성은 적어도 100회 계대 동안 유지된다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 부분적으로 앞서 언급한 실시형태 중 임의의 하나에 따라 생성된 기저상태 만능성을 포함하는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 제공한다.
다양한 특정 실시형태에서, 본 발명은 부분적으로 기저상태 만능성을 포함하는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 제공하되, iPSC는 재프로그래밍 인자 폴리펩타이드를 암호화하는 외인성으로 도입된 폴리펩타이드를 포함하지 않는다.
다양한 특정 실시형태에서, 본 발명은 부분적으로: a) 하나 이상의 만능 줄기 세포를 얻는 단계; (b) TGFβR 저해제를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 하나 이상의 만능 줄기 세포를 배양시킴으로써 기저상태 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 단계를 포함하는 iPSC를 제조하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC는 재프로그래밍된 체세포를 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC는 재프로그래밍된 성체 줄기 세포를 포함한다.
다른 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC는 하나 이상의 iPSC에서 내인성 OCT4의 발현을 증가시킴으로써 만능성 상태로 재프로그래밍되었다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC는 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB 및 SV40LT로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입함으로써 재프로그래밍되었다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC는 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB 및 SV40LT로 이루어진 군으로부터 선택되는 재프로그래밍 인자의 하나 이상의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입함으로써 재프로그래밍되었다.
추가적인 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC는 OCT4, SOX2 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택되는 재프로그래밍 인자의 하나 이상의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입함으로써 재프로그래밍되었다.
추가적인 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC는 OCT4, NANOG, ECAT1, UTF1 및 ESRRB로 이루어진 군으로부터 선택되는 재프로그래밍 인자의 하나 이상의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입함으로써 재프로그래밍되었다.
다른 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC는 OCT4, ECAT1 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 재프로그래밍 인자의 하나 이상의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입함으로써 재프로그래밍되었다.
다양한 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 에피솜 벡터는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 실시형태에서, 세포 배양 배지는 Wnt 경로 효현제; MEK 저해제; 및 ROCK 저해제를 포함하되, 선택적으로 Wnt 경로 효현제는 GSK3 저해제이다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC를 얻는 단계는 하나 이상의 비-만능세포 또는 부분적 만능세포를 Wnt 경로 효현제; MEK 저해제; 및 TGFβR 저해제, 및 선택적으로 ROCK 저해제와 접촉시켜 하나 이상의 iPSC를 생성하는 단계를 포함하되, 선택적으로 Wnt 경로 효현제는 GSK3 저해제이다.
추가적인 실시형태에서, iPSC는 iPSC의 집단을 포함한다.
추가적인 실시형태에서, iPSC의 집단은 균일한 iPSC의 집단이다.
특정 실시형태에서, iPSC의 집단의 적어도 95%는 SSEA4 및 TRA1-81 또는 TRA1-60을 발현시킨다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC는 만능세포의 집단을 재프로그래밍함으로써 얻어지되, 만능세포의 집단의 5% 이하는 α-평활근 액틴(SMA), TUJ1 또는 FoxA2를 발현시킨다.
추가적인 실시형태에서, 앞서 언급한 방법은 세포 배양 배지에서 하나 이상의 iPSC를 배양시키는 단계를 포함하되, 상기 단계는 자발절 분화를 감소시키거나 또는 만능성의 기저상태를 유지 또는 유도한다.
특정 실시형태에서, 감소된 자발적 분화를 지니는 iPSC는 유전자 발현을 포함하되, 1개 이상의, 2개 이상의, 3개 이상의, 4개 이상의, 또는 5개 이상의 분화 마커 유전자의 발현은 TGFβR 저해제를 포함하는 배지에서 iPSC에서의 하나 이상의 분화 마커 유전자의 발현에 비해 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 iPSC에서 감소되며, 분화 마커 유전자는 FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(단미증) 및 ZIC1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 실시형태에서, 하나 이상의 분화 마커 유전자는 T 유전자, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 및 TUJ1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 감소된 자발적 분화는 적어도 5회 계대 동안 유지된다.
특정 실시형태에서, 감소된 자발적 분화는 적어도 10회 계대 동안 유지된다.
추가적인 실시형태에서, 감소된 자발적 분화는 적어도 50회 계대 동안 유지된다.
특정 실시형태에서, 감소된 자발적 분화는 적어도 100회 계대 동안 유지된다.
추가적인 실시형태에서, 앞서 언급한 방법은 계대 동안 하나 이상의 iPSC를 해리시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC의 생존도는 계대 동안 유지된다.
다른 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC는 정상 핵형을 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC는 무 피더 환경에서 배양된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC의 게놈 안정성은 적어도 10회 계대 동안 유지된다.
추가적인 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC의 게놈 안정성은 적어도 50회 계대 동안 유지된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 iPSC의 게놈 안정성은 적어도 100회 계대 동안 유지된다.
다양한 특정 실시형태에서, 본 발명은 부분적으로 앞서 언급한 실시형태 중 임의의 하나에 따라 생성된 기저상태 만능성을 포함하는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 제공한다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 부분적으로 기저상태 만능성을 포함하는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 제공하되, iPSC는 재프로그래밍 인자 폴리펩타이드를 암호화하는 외인성으로 도입된 폴리펩타이드를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 비만능세포 내로 (i) OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 또는 (ii) OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드를 도입함으로써 비-만능세포를 만능세포로 재프로그래밍하는 단계를 포함하는 비-만능세포를 만능세포로 재프로그래밍하는 방법이 제공된다.
특정 실시형태에서, 도입하는 단계는 (i) OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계, 또는 (ii) OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드를 도입하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 도입하는 단계는 (i) OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, 및 UTF1 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계, 또는 (ii) OCT-4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, 및 UTF1 폴리펩타이드를 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클(mini-circle), 발현 카세트를 지니는 벡터 시스템 또는 mRNA에 의해 도입된다.
특정 실시형태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다.
다른 실시형태에서, 만능세포는 외인성 폴리뉴클레오타이드가 없다.
다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 CRE-매개 절단에 의해 절단된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 비-만능세포 내로 (i) SV40LT 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 (ii) SV40LT 폴리펩타이드를 도입하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 비만능세포를 TGFβR 저해제, Wnt 경로 효현제, MEK 저해제 및 ROCK 저해제 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계를 포함하되, Wnt 경로 효현제는 선택적으로 GSK3 저해제이다.
다른 실시형태에서, 비만능세포는 TGFβR 저해제, Wnt 경로 효현제, MEK 저해제 및 ROCK 저해제와 접촉되되, Wnt 경로 효현제는 선택적으로 GSK3 저해제이다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 Wnt 경로 효현제, MEK 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 배양 배지에서 만능세포를 배양시키는 단계를 포함하되, Wnt 경로 효현제는 선택적으로 GSK3 저해제이고, 배양 배지는 TGFβR 저해제를 함유하지 않는다.
일부 실시형태에서, Rock 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이거나, TGFβR 저해제는 A-83-01 또는 SB431542이거나, GSK3 저해제는 CHIR99021 또는 BIO이거나, 또는 MEK 저해제는 PD98059 또는 PD032901이다.
다른 실시형태에서, 만능세포의 만능성은 적어도 5회 세포 분열 또는 적어도 10회 세포 분열 동안 유지된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 2A 펩타이드에 의해 분리된 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 다시스트론성 벡터(polycistronic vector)로서 도입된다.
일 실시형태에서, 다시스트론성 벡터는 OCT4 폴리펩타이드를 암호화하는 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 만능세포에서 OCT4 발현을 위해 선택함으로써 만능세포를 동정하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, OCT4 발현을 위해 선택하는 단계는 이소성 Oct-4 발현을 위해 선택하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 배양시키는 단계는 만능 줄기 세포의 집단을 생성한다.
다른 실시형태에서, 만능 줄기 세포의 집단은 적어도 70% 균일, 적어도 80% 균일 또는 적어도 90% 균일하다.
또 다른 실시형태에서, 만능세포의 집단의 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 SSEA 및 Tra-181을 발현시킨다.
실시형태에서, 만능세포 또는 만능세포의 집단은 단일 세포 계대될 수 있다.
일 실시형태에서, 단일 세포 계대에 의해 생성된 세포는 정상 핵형을 가진다.
일 실시형태에서, 본 발명은 상기 방법 중 임의의 하나의 방법에 따라 생성된 만능세포를 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 (i) OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드, 또는 (ii) OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드로부터 선택된 적어도 하나의 외인성 폴리펩타이드를 포함하는 단리된 비-만능세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 세포는 (i) OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드 중 적어도 둘을 암호화하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드, 또는 (ii) OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드로부터 선택된 적어도 두 외인성 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 실시형태에서, 세포는 (i) OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드 중 적어도 셋을 암호화하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드, 또는 (ii) OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드로부터 선택된 적어도 셋의 외인성 폴리펩타이드를 포함한다.
하나의 특정 실시형태에서, 세포는 (i) OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드, 또는 (ii) 외인성 OCT4 폴리펩타이드, 외인성 ECAT1 폴리펩타이드, 외인성 UTF1 폴리펩타이드, 외인성 NANOG 폴리펩타이드 및 외인성 ESRRB 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 실시형태에서, 세포는 OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, 및 UTF1 폴리펩타이드, 또는 외인성 OCT4 폴리펩타이드, 외인성 ECAT1 폴리펩타이드 및 외인성 UTF1 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, 세포는 TGFβR 저해제, GSK3 저해제, MEK 저해제 및 ROCK 저해제 중 적어도 하나와 접촉된다.
다른 실시형태에서, 세포는 TGFβR 저해제, Wnt 경로 활성제, MEK 저해제 및 ROCK 저해제와 접촉되되, Wnt 경로 활성제는 선택적으로 GSK3 저해제이다.
특정 실시형태에서, Rock 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이거나, TGFβR 저해제는 A-83-01 또는 SB431542이거나, GSK3 저해제는 CHIR99021 또는 BIO이거나, 또는 MEK 저해제는 PD98059 또는 PD032901이다.
다른 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클, 발현 카세트를 지니는 벡터 시스템 또는 mRNA에 의해 비-만능세포에 도입된다.
다른 실시형태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다.
특정 실시형태에서, 세포는 외인성 폴리뉴클레오타이드가 없다.
실시형태에서, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 CRE-매개 절단에 의해 제거된다.
다른 실시형태에서, 세포는 SV40LT 항원 폴리펩타이드, 또는 외인성 SV40LT 항원 폴리펩타이드를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 2A 펩타이드에 의해 분리된 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 다시스트론성 벡터로서 도입된다.
다른 실시형태에서, 다시스트론성 벡터는 OCT4 폴리펩타이드를 암호화하는 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
실시형태에서, OCT4 폴리펩타이드를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드는 선택가능한 마커에 연결된다.
하나의 특정 실시형태에서, 본 발명은 (i) OCT4 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA, (ii) ECAT1 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA, (iii) UTF1 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA, (iv) NANOG 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA, 및 (v) ESRRB 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 셋으로 이루어진 조성물을 제공한다.
실시형태에서, 조성물은 OCT4 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA, ECAT1 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA, UTF1 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA, NANOG 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA, 및 ESRRB 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 조성물은은 OCT4 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA, ECAT1 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA, 및 UTF1 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 각각의 cDNA는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클, 발현 카세트를 지니는 벡터 시스템 또는 mRNA에서 암호화된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 재프로그래밍 인자 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 OCT 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드를 암호화한다.
다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 OCT 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드 및 UTF1 폴리펩타이드를 암호화한다.
다른 특정 실시형태에서, 벡터는 추가로 SV40LT 항원 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, 벡터는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클, 발현 카세트를 지니는 벡터 시스템 또는 mRNA이다.
일 실시형태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다.
하나의 특정 실시형태에서, 본 발명은 비-만능세포를 만능세포로 재프로그래밍하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드, 또는 ESRRB 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는 OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드, 또는 ESRRB 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드; 및 TGFβR 저해제, Wnt 경로 활성제, MEK 저해제 및 ROCK 저해제 중 적어도 하나를 포함하되, Wnt 경로 활성제는 선택적으로 GSK3 저해제이다.
실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드를 암호화하거나, 또는 적어도 하나의 폴리펩타이드는 OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, UTF1 폴리펩타이드, NANOG 폴리펩타이드 및 ESRRB 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, 및 UTF1 폴리펩타이드를 암호화하거나, 또는 적어도 하나의 폴리펩타이드는 OCT4 폴리펩타이드, ECAT1 폴리펩타이드, 및 UTF1 폴리펩타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, 키트는 SV40LT 항원 폴리펩타이드, 또는 SV40LT 항원 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 실시형태에서, 키트는 TGFβR 저해제, Wnt 경로 활성제, MEK 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하되, Wnt 경로 활성제는 선택적으로 GSK3 저해제이다.
일 실시형태에서, Rock 저해제는 티아조비빈 또는 Y27632이거나, TGFβR 저해제는 A-83-01 또는 SB431542이거나, GSK3 저해제는 CHIR99021 또는 BIO이거나, 또는 MEK 저해제는 PD98059 또는 PD032901이다.
다른 실시형태에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클, 발현 카세트를 지니는 벡터 시스템 또는 mRNA에서 암호화된다.
다른 실시형태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 다시스트론성 벡터에서 암호화되며, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 2A 펩타이드에 의해 분리된다.
또 다른 실시형태에서, 다시스트론성 벡터는 OCT4 폴리펩타이드를 암호화하는 2 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, OCT4 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 선택가능한 마커에 연결된다.
다른 특정 실시형태에서, 본 발명은 비-만능세포의 집단을 제공하는 단계; 비-만능세포의 집단 내로 선택가능한 마커에 연결된 OCT4 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계; 비-만능세포 집단의 적어도 일부를 만능세포로 재프로그래밍하기에 충분한 조건 하에서 비-만능세포를 폴리뉴클레오타이드와 함께 인큐베이션시키는 단계; 선택가능한 마커를 발현시키는 세포를 선택함으로써 만능 줄기 세포 집단을 제공하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포 집단을 생성하는 방법을 제공한다.
다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 OCT4 폴리펩타이드를 암호화하는 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 다시스트론성 벡터로서 도입된다.
일 실시형태에서, 복수의 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 2A 펩타이드에 의해 분리된다.
또 다른 실시형태에서, 세포 집단에서 세포의 적어도 10%는 SSEA 및 TRA-181을 발현시킨다.
도 1a 내지 도 1e는 향상된 재프로그래밍 및 hiPSC 유지를 위한 다단계 배양 플랫폼으로부터의 결과를 도시한 도면. (1a) 렌티바이러스 생성 hiPSC 클론 FTi088은 SMC4에서 비분화세포의 동종성 집단을 유지한 반면, 자발적 분화는 SMC4에서 배양된 렌티바이러스 생성 hiPSC 계통 FTi096에서 보였다. 형태(상부 패널) 및 SSEA4 및 TRA1-81에 대한 유세포 분석(하부 패널)에 의해 나타낸 바와 같이 3회 계대 동안 FTi096이 FMM으로 전이될 때 자발적 분화는 최소화되었다. (1b) 바이러스 요소 WPRE의 이식유전자 발현을 위한 qRT-PCR. 발현을 GAPDH에 대해 그리고 렌티바이러스 감염 4일 후(제4일 P.I.)에 모 섬유아세포 계통의 WPRE 발현에 대해 정규화하였다. 비감염 섬유아세포 계통(섬유아세포) 및 인간 ESC 계통 HUES9를 음성 대조군으로서 사용하였다. 각각의 세트의 값을 막대 위에 나타낸다. (1c) 10회 계대; SB431542(-TGFβRi)의 제거, 10 내지 100ng/㎖ bFGF의 증가, 10ng/㎖ LIF의 첨가 후 무 이식유전자 렌티바이러스-유도 hiPSC의 SSEA4 및 TRA1-81 집단에 대한 다양한 배지 성분 효과의 선별. (1d) 섬유아세포 세포주를 유전자 세트 OCT4/KLF4/SOX2를 함유하는 렌티바이러스 작제물로 형질감염시키고, 다양한 배지(전통적인 배지; Conv.)로 분할시키고 나서, 17일 동안 배양시키고, 제17일에 SSEA4 및 TRA1-81 이중 양성 집단에 대해 분류하였다. 분류 게이트를 청색으로 강조한다. FMM 및 SMC4로 분할된 SMC4 세트를 제외하고 각각의 배지에서 추가 10일 동안 각각의 세트를 배양시켰다. 제27일에, 배양물을 SSEA4 및 TRA1-81 이중 양성 집단에 대해 재분류하고 나서, 분류 사건의 정규화 밀도에서 파종하고, 추가 9일 동안 각각의 배지에서 유지하였다. 전통적인 배양 세트 게이팅을 확장하여 정규화된 수의 세포를 달성하였다. 제36일에, 각각의 배양물을 OCT4 및 NANOG 발현에 대해 염색하였다. 대표적인 면역세포화학 이미지를 각각의 세트에 대해 우측 패널에 나타내었다. (1e) (1d)에서 논의한 바와 같은 제36일 염색의 콜로니 계수. 오차막대는 FRM 내지 FMM 및 FRM에 대해 3회 중복을 나타내고, FMM 및 hESC에 대해 2회 중복을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2e는 개개 에피솜 재프로그래밍된 hiPSC를 효율적으로 선택하고 클론 확장을 위해 96-웰 플레이트에서 파종하였다는 것을 도시한 도면. (2a) 에피솜 유도, 다단계 배양 플랫폼, 유세포 분석 분류 및 클론 확장의 개략적 시기 도시. (2b) 형질감염 후 표시한 일자에 FF 배양물(2a에서 약술함)에서 FRM의 FMM로의 전이에서 유지된 에피솜 유도 재프로그래밍의 유세포 분석 프로파일. 각각의 모 계통(SSEA4+/TRA1-81+/CD30+집단)에 대해 사용한 분류 게이팅 전략을 개개 hiPSC 클론을 함유하는 96-웰 플레이트의 백분율을 나타내는 하부 히스토그램 패널에 대응하는 각각의 색으로 도시한다. 다중 클론 또는 분화 클론을 함유하는 웰을 스코어링하지 않았다. 실선은 모든 도출 중의 평균 백분율을 나타내며 점선은 표준 편차를 나타낸다. (2c) MEF 세포의 존재 하에 전통적인 배지에서 유지한 형질감염 후 19일에 재프로그래밍을 위해 유도한 FTC007의 유동 프로파일. 유도 집단을 (2b)의 FTC007의 동일 집단으로부터 취하였지만, 그 이후에 상이한 배양으로 처리하였다. (2d) 96-웰 플레이트에서 분류한 콜로니의 다양한 만능성 마커의 면역세포화학 분석. 우측 모서리의 패널은 DAPI 염색을 나타낸다. (2e) 웰 당 3개 세포로 SSEA4/TRA1-81/CD30 직접 분류(FACS) 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 대해 NANOG 발현에 대한 qRT-PCR. 발현 범위는 범례에 기재하고 GAPDH에 대해 정규화한 바와 같이 H1 인간 ESC에 대해 0 내지 4배 발현이다.
도 3a 내지 도 3f는 에피솜 재프로그래밍된 hiPSC 클론이 그들의 비분화 상태를 유지하고 이식유전자 서열이 없음을 도시한 도면. (3a) 단일 세포 계대 후 24시간에 hiPSC 클론의 전형적인 형태. (3b) 배양 동안 hiPSC 클론의 대표적인 이미지. (3c) 다양한 hiPSC 클론으로부터 유래된 에피솜 DNA에 대한 PCR 분석. 레인 1, FTC007-c1 p4; 레인 2, FTC007-c21 p4; 레인 3, FTC016-c25 p5; 레인 4, FTC016-c36 p5; 레인 5, FTC017-c11 p7; 레인 6, FTC017-c14 p7; 레인 7, FTC017-c17 p6(양성 대조군으로서 사용한 에피솜 작제물을 유지하는 계통); 레인 8, 비형질감염 FTC007; 레인 9, 렌티바이러스 작제물을 이용하여 생성한 hiPSC(교차 오염에 대한 대조군으로서 작용함); 레인 10, 양성 대조군으로서 사용한 에피솜 벡터. 100ng 게놈 DNA의 입력 및 35회 PCR 주기를 모든 설정에 대해 사용하였다. (3d) OCT4, NANOG, TRA1-81 및 TRA160의 발현에 대해 면역형광에 의해 검출한 만능성 마커. (3e) 다양한 모 계통으로부터 선택한 hiPSC 클론에 대한 유세포분석 프로파일. 상부 행 프로파일 SSEA4/TRA1-81 표면 발현. 하부 행 프로파일 OCT4/NANOG 세포내 발현. (3f) 내인성 만능성 유전자 발현에 대한 qRT-PCR 분석. 데이터를 GAPDH에 대해 그리고 HUES9 hESC에 대해 정규화시켰다. KLF4 발현의 경우에, 두 데이터 지점은 HUES9보다 15배 더 컸고, 그래프 상에서 주목되었다. 오차 막대는 복제물의 표준 편차를 나타낸다.
도 4a 내지 도 4e는 게놈 안정성 및 만능성이 연속적 단일 세포 및 FF 배양 동안 유지된다는 것을 도시한 도면. (4a) FF 및 단일 세포 배양에서 유지한 다양한 hiPSC 클론으로부터의 20 내지 40 G-밴드 중기 세포에 대한 세포유전학 분석. (4b) FF 및 단일 세포 배양에서 장기간 계대시킨(p25 내지 30) hiPSC 클론의 유세포 분석 프로파일 및 세포 유전학 분석. (4c) FTC017-c11의 3 내지 4일 직접 분화. (4d) 다분화능(trilineage differentiation)을 입증하는 hiPSC 클론의 배양체 형성 및 분화. 면역세포화학을 분화 28일 후에 수행하였다: 외배엽, TUJ1; 중배엽, 알파 평활근 액틴(aSMA); 내배엽, AFP. (4e) 각각의 체세포 계통을 나타내는 FTC007-c21 및 FTC016-c25로부터 유래된 기형종의 조직학적 부문. 검정색 화살표, 내배엽; 흰색 화살표, 외배엽; 회색 화살표, 중배엽.
도 5a 내지 도 5j는 최소 수의 재프로그래밍 인자를 지니는 hiPSC 클론의 유래를 도시한 도면. (5a) OCT4, SOX2 및 NANOG를 다양한 형식으로 pCEP4로 클로닝시켰다. 표는 벡터 시스템 및 약어를 나타낸다. (5b) 유도 13일 후에 다양한 유전자 조합에 의해 유도된 재프로그래밍 역학의 SSEA4 및 TRA1-81 유세포 분석 프로파일. (5c) 웰 당 3 및 9개 세포로 96-웰 플레이트의 웰에서 TRA1-81 양성 hiPSC 클론의 존재를 나타내는 효율 히스토그램. (5d) 다양한 hiPSC 클론으로부터 유래된 에피솜 DNA에 대한 PCR 분석. 레인 1 2xO+OS+ONS+T-c7 p6; 레인 2, 2xO+OS+ONS+T-c10 p6; 레인 3, 2xO+ONS+T-c5 p5; 레인 4, 2xO+ONS+T-c9 p5; 레인 5, 2xO+OS+T-c7 p7; 레인 6, 2xO+OS+T-c9 p6; 레인 7, 비형질감염 FTC007; 레인 8, 렌티바이러스 작제물을 이용하여 생성한 hiPSC; 레인 9, 양성 대조군으로서 사용한 에피솜 벡터. 100ng 게놈 DNA의 유입 및 35회 PCR 주기를 모든 세트에 대해 사용하였다. (5e) 2xO+OS+T로부터 유래된 클론 9의 형태. (5f) OCT4, NANOG, TRA1-81 및 TRA160의 발현에 대해 면역형광에 의해 검출된 만능성 마커. 10x 확대로 촬영한 이미지. (5g) 선택한 유전자 세트로부터 유래된 hiPSC 클론의 유동 프로파일. 상부 행은 SSEA4/TRA1-81 표면 발현을 나타낸다. 하부 행은 OCT4/NANOG 세포내 발현을 나타낸다. (5h) 유도 후 대략 72 내지 96시간에 선택된 hiPSC 클론의 직접 분화. (5i) FF 및 단일 세포 배양에서 유지한 다양한 hiPSC 클론으로부터의 G-밴드 중기 세포의 세포유전학 분석. (5j) 각각의 체세포 계통을 나타내는 hiPSC 클론 2xO+OS+ONS+T-c10으로부터 유래된 기형종의 조직학적 부문. 좌측 패널, 내배엽; 중간 패널, 중배엽; 우측 패널, 외배엽.
도 6a 내지 도 6b는 FMM에서 최소 인자 에피솜-유도 hiPSC의 상대적 유전자 발현 프로파일을 도시한 도면. 통상적으로 유지되는 hiPSC 계통, 통상적으로 유지되는 H1 hESC, 및 FMM에서 유지된 다양한 유전자 조합을 이용하여 유래된 에피솜 hiPSC 계통의 만능성(6a) 및 분화(6b) 유전자의 상대적 유전자 발현 수준(RQ)을 도시하는 플루이다임(Fluidigm) 동적 배열로부터 유래된 히트맵 결과. 각각의 계통에 대한 상대적 유전자 발현을 각각의 박스 내에 언급하고, 범례(하부 우측)에 요약된 3개의 발현 수준에 기반하여 색상을 코딩하였다. 모든 세트를 2회 중복하여 수행하였고, 두 하우스키핑 유전자(GAPDH 및 HPRT1)의 평균 발현에 대해 정규화하고 나서, 1x 값을 나타내는 6가지 대조군 통상적인 계통(MEF에 대해 OSK hiPSC 및 H1 hESC)의 중앙값 수준에 대해 언급하였다.
도 7a 내지 도 7g은 FMM 유지 hiPSC가 감소된 발현의 분화 유전자를 가지며, 기저 상태를 나타낸다는 것을 도시한 도면. (7a) 총 339개의 프로브 세트를 전통적인 배양물과 FMM 배양물 사이에 2.5배 초과 또는 미만만큼 차별적으로 발현시켰다. 유클리드 거리 측정에 기반한 완전 연결 방법을 이용하는 339개의 프로브 세트에 대한 계층 클러스터링. (7b) 전통적인 배양에 의해 (FMM 배양에 비해) 2.5-배 이상 상향 조절된 213개의 프로브 세트의 유전자 존재 생물학적 과정 농화 분석(Gene ontology biological process enrichment analysis)(D.A.V.I.D.). (7c) 유전자는 기저 또는 준안정(metastable) 만능성 상태의 대표를 열거한다. 목록은 본문에서 언급한 참고문헌으로부터 유래된다. (7c) 유클리드 거리 측정에 기반한 완전 연결 방법을 이용함에 있어서 7(d) 유전자에 대응하는 231개 프로브 세트에 대한 계층 클러스터링. (7e) (7c)의 유전자에 대응하는 프로브 세트에 대한 RMA(log2) 강도. 좌측 패널은 기저상태에 대한 39개 프로브 세트를 나타내고, 우측 패널은 준안정 상태에 대한 188개 프로브 세트를 나타낸다. 평균 전통적인 배양물 강도 수준을 X-축 상에 플롯팅하는 한편, 평균 FMM/SMC4 강도는 Y-축 상에 있는데, 검정색 계통은 동일한 발현을 나타낸다. (7f) 전통적인 배지 배양물에서 유래 및 배양시킨 hiPSC 클론과 애피메트릭스사(Affymetrix) 프로브 세트를 이용하여 SMC4 배양물에 적합화한 그의 상대 사이의 X 염색체 위치 유전자의 유전자 발현 비교. XIST 유전자 발현과 관련된 프로브 세트를 강조한다. (7g) 5회 계대 동안 FMM에서 유지한 또는 전통적인 배양에 적합화한 hiPSC 클론에 대한 HEK27me3의 대표적인 이미지. 좌측 패널의 점선 화살표는 H3K27me3 염색이 없는 대표적인 핵을 나타내는 반면, 우측 패널의 실선 화살표는 H3K27me3 염색에 대해 양성인 핵을 나타낸다. 핵 양성 염색의 백분율은 각각의 패널의 하부 좌측에 나타낸다. FMM 배양된 세포는 더 큰 핵을 가진다. 기준자 = 50㎛.
도 8a 내지 도 8d는 FRM 및 FMM를 이용하는 에피솜 유도 재프로그래밍을 나타낸다. (8a) 재프로그래밍 풀의 제10일 SSEA4 및 TRA1-81 유동 프로파일. (8b) 재프로그래밍 동안 보인 전형적인 콜로니의 대표적인 형태. 형질감염 후 13일에 촬영한 이미지. (8c) 처음 14일 동안 FRM에서 유지한 에피솜 재프로그래밍된 섬유아세포를 분할하고, FRM에서 유지하거나 또는 FMM으로 전환하였다. 이어서, 재프로그래밍 배양물을 형질감염 후 21일에 SSEA4/TRA1-81/CD30에 대해 분류하였고, 분석 전 추가 10일 동안 FRM 또는 FMM에서 유지하였다. (8d) FRM 또는 FMM에서 대표적인 배양물의 형태 및 유동 프로파일. 흰색 화살표는 비분화 집단과 분화 집단의 혼합물로 이루어진 배양물에서 비분화 세포의 영역을 나타낸다. 검정색 화살표는 거의 비분화된 집단의 선명한 에지를 나타낸다. 하부 패널은 대표적인 유동 프로파일이다. FSC; 전방측 산란.
도 9a 내지 도 9b는 다양한 모 계통의 재프로그래밍을 나타낸다. (9a) 이 연구에서 사용한 시작 세포주의 요약 표. 각각의 라인과 관련된 구체적 정보에 추가로, 에피솜 형질감염 후 정렬 시간에 양성 SSEA4/TRA1-81/CD30 집단의 백분율을 주목한다. (9b) CD34 농후 제대혈 세포의 분류 및 배양물을 도시한 도면. 사전에 은행에서 유지한 0.5㎖ 용적의 제대혈을 사용하여 65,000개 CD34+CD45+Lin- 세포를 추출하고, 이를 에피솜 형질감염 전에 6일 동안 현탁액 중에서 배양시켰다.
도 10a 내지 도 10g는 재프로그래밍 및 유지 과정 동안 hiPSC의 특징을 도시한 도면. (10a) 단일 세포 96-웰 플레이트 분류 3일 후 전형적인 콜로니 형태. 기준자는 400㎛를 나타낸다. (10b) 다양한 시작 세포로부터의 분류 후 7 내지 9일에 단일 세포 유래 hiPSC-유사 콜로니의 대표적인 형태. 기준자는 1000㎛를 나타낸다. (10c) 96-웰 플레이트에서 hiPSC-유사 콜로니의 NANOG에 대한 면역세포화학. (10d) 재프로그래밍을 위해 유도하고, 매트리겔(매트리겔) 또는 비트로넥틴 코팅 배양 플레이트 상에서 유지한 FTC007의 제16일 유동 프로파일 분석. (10e) 명시야(Bright-field) 이미지, (10f) OCT4 및 NANOG에 대한 면역형광 또는 (10g) 매트리겔에 대해 연속적으로 또는 비트로넥틴에 대해 5회 계대 동안 FMM에서 유지한 FTC016-c28의 SSEA4 및 TRA1-81에 대한 유세포 분석.
도 11a 내지 도 11c는 FMM 배양 플랫폼을 이용하는 최소 유전자 재프로그래밍의 예를 도시한 도면. (11a) 하이그로마이신 선택 카세트를 함유하는 에피솜 작제물을 이용하는 형질감염 후 2일 내지 5일에 하이그로마이신으로 처리한 세포의 형태. (11b) 재프로그래밍 풀을 더 긴 지속기간 동안 유지하고 나서, 형질감염 후 16일에 프로파일링하였다. (11c) 매트리겔 또는 비트로넥틴에 대해 유지한 배양물의 외관.
도 12a 내지 도 12e는 다중 조건에서 배양시킨 hiPSC의 특징을 도시한 도면. (12a) 렌티바이러스 유래 및 SMC4 유지 FTi111은 만능성의 특징을 나타내며, 게놈 무결성을 유지하였다. (12b) FTi111 p43의 해동 전략의 도시. 단일 바이알을 주목한 바와 같은 4가지 배양 환경으로 해동시켰다. 살아있는 배양물을 피더 세포 상에서 티아조비빈으로 보충한 전통적인 배양물을 제외하고 각각의 배양물에서 계대시켰고, 이를 피더 세포의 존재 하에 티아조비빈이 없는 전통적인 배양물에 이동시키고 클럼프로서 계대시켰다. (12c) 해동 후 다양한 배양물에서 회수 세포의 형태. 피더 세포의 존재 하에 티아조비빈이 없는 전통적인 배양물에서 살아있는 세포는 동정되지 않았다. (12d) 해동 후 3회 계대 시 배양물의 형태를 설정한다. 더 큰 콜로니 형태는 전통적인 배양과 관련되었다. 기준자 1000㎛. (12e) 각각의 배양물 세트의 내인성 만능성 유전자 발현에 대한 qRT-PCR 분석. 데이터를 GAPDH에 대해 그리고 H1 hESC에 대해 정규화시켰다.
도 13a 내지 도 13e는 다양한 조건에서 배양한 hiPSC의 유전자 발현 프로파일의 유전자 존재를 도시한 도면. (13a) 전반적인 유전자 발현 연구에서 기재한 각각의 계통의 유도 및 유지를 기재한 표. (13b) 총 300개의 프로브 세트를 2.5배 초과 또는 미만까지 전통적인 분자와 소분자(FMM 및 SMC4) 배양 조건 사이에서 차별적으로 발현시켰다. 유클리드 거리 측정에 기반한 완전 계통 방법을 이용하는 300개 프로브 세트에 대한 계층 클러스터링. (13c) (소분자 배양에 비해) 전통적인 배양에 의해 2.5배 이상 상향조절된 133개 프로브 세트의 유전자 존재 생물학적 과정 농화 분석(D.A.V.I.D.). (13d) (전통적인 배양에 비해) 소분자 배양에 의해 2.5배 이상 상향조절된 167개 프로브 세트의 유전자 존재 생물학적 과정 농화 분석(D.A.V.I.D.). (13e) (전통적인 배양에 비해) FMM 배양에 의해 2.5배 이상 상향조절된 126개 프로브 세트의 유전자 존재 생물학적 과정 농화 분석.
도 14a 내지 도 14f는 재프로그래밍을 위해 사용한 렌티바이러스 작제물(도 14a 내지 도 14b) 및 에피솜 작제물(도 14c 내지 도 14f)의 예를 도시한 클로닝 맵을 도시한 도면. 렌티바이러스 작제물은 이식유전자의 CRE-매개 절단을 위해 EF1α 프로모터 및 LOXP 부위를 포함한다. 에피솜 작제물은 또한 EF1α 프로모터를 포함한다.
도 15a 내지 도 15c는 제8일 내지 제15일에 다양한 재프로그래밍 인자 조합에 대한 대표적인 유동 분석을 도시한 도면. 인간 섬유아세포를 OCT4, ECAT1 및 UTF1을 포함하는 렌티바이러스 매개 재프로그래밍 인자의 다양한 조합을 이용하여 유도하였다.
도 16a 내지 도 16d는 제21일 내지 제27일에 다양한 재프로그래밍 인자 조합에 대한 대표적인 유동 분석 및 iPSC 형태 특징을 도시한 도면. 데이터는 독특한 재프로그래밍 조합이 SSEA4+/TRA181+ hiPSC를 유도하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 17a 내지 도 17b는 유동 분석(SSEA4+/TRA181+ 및 CD30+ 집단) 및 iPSC 형태 특징에 의해 도시한 바와 같은 고도로 향상된 렌티바이러스 재프로그래밍 효율을 도시한 도면. 인간 섬유아세포를 Oct4, Ecat1, UTF1, Esrrb, 및 Nanog를 이용하여 재프로그래밍하였다. 세포를 FRM을 이용하여 재프로그래밍하고 나서, FMM에서 유지하였다.
도 18a 내지 도 18d는 96-웰 분류 후 7 내지 9회 계대 후에 확립된 4종의 iPSC 클론의 대표적인 유동 분석 및 상 이미지를 도시한 도면. 클론을 FRM을 이용하여 렌티바이러스 재프로그래밍 인자(OCT4, ECAT1, UTF1, ESRRB 및 NANOG)에 의해 생성하고 나서, FMM에서 유지하였다. 높은 SSEA4+/TRA181+를 발현시키는 집단은 만능성을 나타낸다.
도 19a 내지 도 19b는 렌티바이러스 재프로그래밍 인자 Oct4, Ecat1, UTF1, Nanog 및 Esrrb를 이용하여 재프로그래밍된 인간 섬유아세포에서 OCT4 및 NANOG의 발현을 위한 대표적인 유동 분석을 도시한 도면. FRM을 이용하여 클론을 재프로그래밍하고 나서, FMM에서 유지하였다. 높은 OCT4+/NANOG+를 발현시키는 집단은 만능성을 나타낸다.
도 20a 내지 도 20c는 렌티바이러스 재프로그래밍 인자 Oct4, Ecat1, UTF1, Nanog 및 Esrrb를 이용하여 재프로그래밍된 인간 섬유아세포로부터 유래된 hIPSC 클론의 핵형 분석을 도시한 도면. 클론을 FRM을 이용하여 재프로그래밍하고, FMM에서 유지하였다. 클론은 정상, 남성 핵형을 나타낸다.
도 21은 재프로그래밍 인자 조합 OCT4/NANOG/SOX2/LARGE T에 비교한 재프로그래밍 인자 조합 OCT4/ESRRB/NANOG/ECAT1/UTF1의 96웰 플레이트 분류 효율을 도시한 도면.
도 22a 내지 도 22b는 (22a) 제4일, 제6일 및 제11일에 OCT4-P2A-OCT4 / NANOG-P2A-ESRRB-T2A-LIN28 / ECAT1-T2A-UTF1, 및 (22b) 제7일에 2개 웰 및 제10일에 1개 웰에 대해 OCT4-P2A-ESRRB / OCT4-P2A-NANOG / ECAT1-T2A-UTF1을 이용하여 재프로그래밍된 세포에 대해 96 웰의 확장 동안 콜로니의 이미지를 도시한 도면.
도 23a 내지 도 23c는 (23a) 재프로그래밍 인자 화학량론의 효과 및 이소성 OCT4 발현을 이용하는 세포의 선택을 위한 유전자 마커의 사용을 입증하는 유동 분석 결과의 요약, (23b) 에피솜 OCT4-P2A-NANOG-T2A-SOX2 / OCT4의 선택이 없는 SV40 거대 T 항원을 이용하여 재프로그래밍된 인간 섬유아세포에 대한 유동 분석 및 (23C) 에피솜 OCT4-P2A-NANOG-T2A-SOX2 / SV40 거대 T 항원 / OCT2-P2A-OCT4-퓨로마이신을 이용하여 재프로그래밍된 인간 섬유아세포에 대한 유동 분석.
도 24는 청색에서 DAPI를 이용하여 만능성 마커 OCT4(녹색) 및 TRA181(적색)에 대해 염색한 유도된 iPSC 클론의 면역형광 분석을 도시한 도면.
도 25는 CRE-매개 절단 후 SSEA4+/TRA181+/CD30+ 96-웰 플레이트 분류된 클론의 이미지를 도시한 도면. 콜로니를 렌티바이러스 인자 OCT4, ECAT1, UTF1, NANOG 및 ESRRB를 이용하여 재프로그래밍된 인간 섬유아세포로부터 본래 유래된 iPSC 클론으로부터 분류하고, 이어서, 이식유전자에 대해 절단하였다. 분류된 콜로니는 iPSC 표현형을 나타낸다.
A. 개요
만능세포의 생성 및 유지를 위한 현재의 방법은 아직 자발적 분화가 없고 고분해능/고클론성 단일 세포 계대 및 대규모 확장이 쉬운 유전체 비삽입형 만능세포의 균일한 배양을 실현시키지 못 하였다. 기저상태 만능세포는 이들 도전을 극복하는 품질 및 특성을 부여할 수 있다. 그러나, 지금까지, 무 피더 조건에서 기저상태 만능세포의 고속 대량 생성을 위한 실현가능하거나 또는 강한 방법은 존재하지 않는다. 따라서, 현재의 방법은 산업- 및 임상-등급 만능세포의 생성에 적합하지 않을 수도 있다. 본 명세서에 상정된 본 발명은 기저상태 만능성의 특징에서 또는 기저상태 만능성의 특징을 지니는 안정한 만능세포의 강한 생성을 위한 필요를 처리하고, 산업 및 임상적 사용에 적합한 안정한 만능세포의 제조에서 문제를 해결한다.
일반적으로, 본 발명은 만능세포, 특히 기저상태 만능세포를 포함하는, 감소된 자발적 분화를 지니는 세포의 개선된 제조를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 단계 특이적 방식으로 세포의 신호 형질도입 경로의 소분자 조절제를 이용하며, 만능세포를 배양하는 방법 및 유도하는 방법이 더 이상 하류의 사용을 위한 가변성 및/또는 개폐 활성의 공급원이 아닌 지점에 대해 만능세포 유도 및 유지를 가능하게 하는 다단계 배양 플랫폼에 관한 것이다. 게다가, 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 개선된 게놈 안정성, 개선된 비분화 상태, 감소된 자발적 분화, 개선된 배양 균질성, 개선된 배양에서 생존, 해리 및 단일 만능세포의 계대 및 기저상태 만능성에 대한 이식유전자 또는 유전체 비삽입 재프로그래밍 세포의 개선된 방법을 이용하여 무 피더 조건에서 만능세포의 유도 및 유지를 가능하게 한다. 따라서, 본 명세서에 상정된 조성물 및 방법은 산업 및 임상 용도에 적절한 만능세포 및/또는 기저상태 만능세포의 제조를 가능하게 한다.
지금까지 소분자 유발 플랫폼이 인간 세포로부터 유래된 유전체 비삽입 유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 재프로그래밍을 향상시키고 단일 세포 및 FF 배양을 지지하는 능력은 입증되지 않았다(Nichols and Smith, 2012). 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 부분적으로 만능 줄기 세포의 빠르고 강한 재프로그래밍 및 안정한 장기간의 배양을 가능하게 하는 단계-특이적 방식으로 소분자 저해제의 특이적 조합물의 용도를 제공한다. 다양한 실시형태에서, 기저상태 만능성을 포함하는 개선된 비분화 만능성 상태를 유도 또는 유지하기 위한 배양 플랫폼이 제공된다. 본 명세서에 상정된 플랫폼은 또한 인간 iPSC(hiPSC)에서 기저상태 만능성의 생성 및 유지를 위한 강한 배양 시스템을 제공한다. 일 실시형태에서, 배양 플랫폼은 재프로그래밍의 이식유전자 또는 유전체 비삽입 방법을 가능하게 한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 플랫폼은 무 이식유전자 hiPSC의 다중복합 유도 및 유지에서의 중요한 도전을 극복하는 hiPSC의 제조를 위한 개선된 방법을 나타낸다.
본 발명의 실행은 대조적인 것으로 구체적으로 나타나지 않는 한, 당업계의 기술 범위 내에 있는 화학, 생화학, 유기 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기법, 유전학, 면역학, 세포생물학, 줄기세포 프로토콜, 세포 배양 및 이식유전자 생물학의 전통적인 방법을 사용할 수 있으며, 이들 다수는 예시의 목적을 위해 이하에 기재된다. 이러한 기법은 문헌에서 완전하게 설명된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand,　Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Guthrie and Fink,　Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, Ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Fire et al., RNA Interference Technology: From Basic Science to Drug Development (Cambridge University Press, Cambridge, 2005); Schepers, RNA Interference in Practice (Wiley-VCH, 2005); Engelke, RNA Interference ( RNAi ): The Nuts & Bolts of siRNA Technology (DNA Press, 2003); Gott, RNA Interference, Editing, and Modification: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology; Human Press, Totowa, NJ, 2004); Sohail, Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC, 2004); Clarke and Sanseau, microRNA : Biology, Function & Expression (Nuts & Bolts series; DNA Press, 2006); Immobilized Cells And Enzymes 　(IRL Press, 1986); 상기 treatise,　Methods In Enzymology 　(Academic Press, Inc., N.Y.);　Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells 　(J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);　Harlow and Lane,　Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology 　(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987);　Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. Blackwell, eds., 1986); Riott,　Essential Immunology, 　6th Edition, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2002); Embryonic Stem Cell Protocols: Volume I: Isolation and Characterization (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Embryonic Stem Cell Protocols: Volume II: Differentiation Models (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Human Embryonic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kursad Turksen Ed., 2006); Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney, and Bruce A. Bunnell Eds., 2008); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Medicine) (Christopher A. Klug, and Craig T. Jordan Eds., 2001); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kevin D. Bunting Ed., 2008) Neural Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Leslie P. Weiner Ed., 2008); Hogan et al., Methods of Manipulating the Mouse Embyro (2nd Edition, 1994); Nagy et al., Methods of Manipulating the Mouse Embryo (3rd Edition, 2002), 및 The Zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish 　(Danio rerio), 4th Ed., (Univ. of Oregon Press, Eugene, OR, 2000)] 참조.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
B. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 발명의 목적을 위해, 다음의 용어를 이하에 정의한다.
단수의 용어는 본 명세서에서 단수 용어의 문법적 대상 중 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "구성요소"는 하나의 구성요소 또는 하나 초과의 구성요소를 의미한다.
대안의 사용(예를 들어, "또는")은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "및/또는"은 대안 중 하나, 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 다른 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2%, 또는 ± 1%의 범위를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로" 또는 "본질적으로"는 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 더 큰 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "본질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 동일한"은 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 거의 동일한 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 없는" 및 "본질적으로 없는"은 상호호환적으로 사용되며, 세포 집단 또는 배양 배지와 같은 조성물을 기재하기 위해 사용될 때, 구체화된 물질이 없는, 예컨대 구체화된 물질 중 95%가 없는, 96%가 없는, 97%가 없는, 98%가 없는, 99%가 없거나, 또는 전통적인 수단에 의해 측정하여 검출가능하지 않은 조성물을 지칭한다. 조성물의 특정 물질 또는 성분의 부재를 지칭하기 위해 사용되는 용어 "부재"에 유사한 의미가 적용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "주목할 만한"은 하나 이상의 표준 방법에 의해 용이하게 검출가능한 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 또는 사건의 범위를 지칭한다. 용어 "주목할 만하지 않은" 및 "주목할 만하지 않은" 및 동의어는 검출가능하지 않거나 또는 표준 방법에 의해 검출가능하지 않은 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 또는 사건의 범위를 지칭한다. 일 실시형태에서, 사건은 그것이 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001% 이하의 시간에 일어난다면, 주목할 만하지 않다.
본 명세서 전체적으로, 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"은 임의의 다른 단계 또는 구성요소 또는 단계들 또는 구송요소들의 그룹을 제외하지 않고 언급된 단계 또는 구성요소 또는 단계들 또는 구성요소들의 그룹의 포함을 나타내는 것으로 이해될 것이다. 특정 실시형태에서, 용어 "포함하다", "가지다", "함유하다" 및 "포함하다"는 동의어로 사용된다.
"이루어진"은 어구 "이루어진" 다음에 오는 것들을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "이루어진"은 열거된 구성요소가 필요하거나 또는 의무적이고 다른 구성요소가 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다.
"본질적으로 이루어진"은 어구 다음에 열거된 임의의 구성요소를 포함하는 것을 의미하며, 열거된 구성요소의 개시에서 구체화된 활성 또는 작용을 방해하지 않는 또는 활성 또는 작용에 기여하지 않는 다른 구성요소로 제한된다. 따라서, 어구 "본질적으로 이루어진"은 열거된 구성요소가 필요하거나 또는 의무적이지만, 다른 구성요소는 선택적이지 않고 그들이 열거된 구성요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 아닌지의 여부에 따라서 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다.
본 명세서 전체적으로 "일 실시형태", "실시형태", "특정 실시형태", "관련된 실시형태", "특정 실시형태", "추가적인 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체적으로 다양한 곳에서 앞서 언급한 어구의 출현은 필수적으로 모두 동일한 실시형태에 대한 언급은 아니다. 더 나아가, 특정 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
용어 "생체밖"은 일반적으로 바람직하게는 천연 조건의 최소 변형을 지니는 유기체 밖의 인공 환경에서 살아있는 조직 내에서 또는 살아있는 조직 상에서 행해진 실험 또는 측정과 같이 유기체 밖에서 일어난 활성을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "생체밖" 절차는 유기체로부터 취한 살아있는 세포 또는 조직을 수반하며, 보통 멸균 조건 하에서 그리고 전형적으로 상황에 따라서 몇 시간 동안 또는 약 24시간까지(그러나 48시간 또는 72시간까지를 포함함) 실험 장치에서 배양된다. 특정 실시형태에서, 이러한 조직 또는 세포는 수집되고 냉동될 수 있으며, 이후에 생체밖 처리를 위해 해동된다. 살아있는 세포 또는 조직을 이용하여 며칠 이상 지속되는 조직 배양 실험 또는 절차는 전형적으로 "시험관내"(특정 실시형태에서 이 용어가 생체밖과 상호호환적으로 사용될 수는 있지만)인 것으로 고려된다.
용어 "생체내"는 일반적으로 유기체 내에서 생기는 활성을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재프로그래밍" 또는 "탈분화" 또는 "증가하는 세포 효능" 또는 "증가하는 발생적 효능"은 세포 효능을 증가하는 방법 또는 세포를 덜 분화된 상태로 탈분화시키는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 증가된 세포 효능을 갖는 세포는 비-재프로그래밍된 상태의 동일 세포에 비해 더 발생적인 가소성을 가진다(즉, 더 많은 세포 유형으로 분화할 수 있다). 다시 말해서, 재프로그래밍된 세포는 비-재프로그래밍된 상태에서 동일 세포보다 덜 분화된 상태인 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "효능"은 세포에 접근가능한 모든 발생적 선택(즉, 발생적 효능)의 합을 지칭한다. 당업자는 세포 효능이 가장 가소성인 세포, 최소 가소성 세포에 대해 가장 발생적인 효능을 갖는 전능성 줄기 세포, 최소 발생 효능을 갖는 최종적으로 분화된 세포의 범위에서 연속적이라는 것을 인식한다. 세포 효능의 연속은 전능성 세포, 만능세포, 다분화능 세포, 소능 세포, 단분화능 세포, 및 말기에 분화된 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "만능성"은 신체 또는 세포체(soma)(즉, 적절한 배아)의 모든 계통을 형성하는 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 배아 줄기 세포는 각각의 3가지의 초기배(germ) 층(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로부터 세포를 형성할 수 있는 만능 줄기 세포의 유형이다.
만능성은 부분적으로 세포의 만능성 특징을 평가함으로써 결정될 수 있다. 만능성 특징은: (i) 만능 줄기 세포 형태; (ii) 비제한 자기 재현을 위한 가능성 (iii) SSEA1(마우스 단독), SSEA3/4; SSEA5, TRA1-60/81; TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 및/또는 CD50을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 만능 줄기 세포 마커의 발현; (iv) 모두 3가지 체세포 계통(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로 분화하는 능력 (v) 3가지 체세포 계통으로 이루어진 기형종 형성; 및 (vi) 3가지 체세포 계통으로부터의 세포로 이루어진 배아체의 형성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다;
만능성의 두 유형은 앞서 기재되었다: 후기 배반포의 외배반 줄기세포(EpiSC)와 유사한 만능성의 "프라이밍된" 또는 "준안정" 상태 및 초기/사전이식 배반포의 내부 세포 덩어리와 유사한 만능성의 "나이브" 또는 "기저" 상태. 만능성 상태는 둘 다 상기 기재한 바와 같은 특징을 나타내지만, 나이브 또는 기저상태는 추가로 (i) 암컷 세포에서 X-염색체의 사전불활성화 또는 재활성화 (ii) 단일 세포 배양 동안 개선된 클론성 및 생존 (iii) DNA 메틸화의 전반적인 감소, (iv) 발생 조절 유전자 프로모터에 대한 H3K27me3 억압적 염색질 침착의 감소, 및 (v) 프라이밍 상태 만능세포에 대한 분화 마커의 감소된 발현을 나타낸다. 외인성 만능성 유전자가 체세포에 도입되고, 발현된 다음 침묵으로 되거나 또는 얻어진 만능 세포로부터 제거된 세포 재프로그래밍의 표준 방법은 일반적으로 만능성의 프라이밍 상태의 특징을 갖는 것으로 알려져 있다. 표준 만능세포 배양 조건 하에서, 이러한 세포는 외인성 이식유전자 발현이 유지되지 않는 한 프라이밍된 상태로 남아있으며, 기저상태의 특징이 관찰된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "만능 줄기 세포 형태"는 배아 줄기 세포의 고전적 형태 특징을 지칭한다. 정상 배아 줄기 세포 형태는 형상이 둥글고 작으며, 높은 핵 대 세포질 비, 핵소체의 주목할 만한 존재 및 전형적인 세포내 간격을 지니는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 발현 프로파일", "유전자 발현 서명", "유전자 발현 패널", "유전자 패널" 또는 "유전자 서명"은 세포 또는 세포의 집단을 다른 세포 또는 세포 집단과 구별하는 역할을 하는 복수의 유전자의 발현 또는 발현 수준을 지칭한다. 예를 들어, 자발적 분화를 방지하기 위해 배지에서 유지되는 만능세포의 집단은 동일 배지에서 유지되지 않은 동일 유래의 대조군 만능세포의 집단에 비해 분화 유전자의 감소된 발현을 포함하는 유전자 발현 프로파일을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "분화 마커 유전자" 또는 "분화 유전자"는 발현이 만능세포와 같은 세포 내에서 생기는 세포 분화를 나타내는 유전자를 지칭한다. 분화 마커 유전자는 다음의 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(단미증) 및 ZIC1.
본 명세서에서 사용되는 용어 "분화 마커 유전자 프로파일" 또는 "분화 유전자 프로파일", "분화 유전자 발현 프로파일", "분화 유전자 발현 서명", "분화 유전자 발현 패널", "분화 유전자 패널", 또는 "분화 유전자 서명"은 복수의 분화 마커 유전자의 발현 또는 발현 수준을 지칭한다.
특정 실시형태에서, 감소된 자발적 분화를 나타내는 만능세포의 집단은 분화 마커 유전자 또는 분화 마커 유전자 프로파일의 발현 감소를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 만능세포 또는 만능세포의 집단에서 감소된 자발적 분화는 배양 조건의 주어진 세트가 동일한 배양 조건이 없는 대조군 만능세포 또는 만능세포의 집단의 분화 마커 유전자의 발현에 비해 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 분화 마커 유전자 중 하나 이상의 발현의 감소를 야기하는 경우에 나타날 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "유전자 발현"은 만능세포 또는 만능세포를 포함하는 세포 집단과 같은 생물학적 샘플에서 유전자의 상대적 발현 수준 및/또는 발현 패턴을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 만능세포는 iPSC이다.
본 발명의 세포를 특성규명하는 유전자의 발현을 검출하기 위해 당업계에서 입수가능한 임의의 방법이 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "발현을 검출하는"은 유전자의 RNA 전사체 또는 그의 발현 산물의 양 또는 존재를 결정하는 것을 의미한다. 유전자의 발현을 검출하는 방법, 즉, 유전자 발현 프로파일링은 폴리뉴클레오타이드의 혼성화 분석에 기반한 방법, 폴리뉴클레오타이드의 서열분석에 기반한 방법, 면역조직화학 방법 및 프로테오믹스-기반 방법을 포함한다. 상기 방법은 일반적으로 관심 대상의 유전자의 발현 산물(예를 들어, mRNA)을 검출한다. 일부 실시형태에서, PCR-기반 방법, 예컨대 역전사 PCR(RT-PCR)(Weis et al., TIG 8:263-64, 1992), 및 어레이 기반 방법, 예컨대 마이크로어레이(Schena et al., Science 270:467-70, 1995)가 사용된다.
"접착"은 용기에 부착하는 세포, 예를 들어 적절한 배양 배지의 존재 하에 멸균 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱) 세포 배양 접시 또는 플라스크에 부착하는 세포를 지칭한다. 특정 부류의 세포는 그들이 세포 배양 용기에 접착되지 않는 한, 배양물에서 지속되지 않거나 또는 성장하지 않는다. 특정 부류의 세포("비접착 세포")는 접착이 없는 배양물에서 유지되고/되거나 증식된다.
"배양" 또는 "세포 배양"은 시험관내 환경에서의 세포의 유지, 성장 및/또는 분화를 지칭한다. "세포 배양 배지", "배양 배지"(각각의 경우에 단수 "배지"), "보충물" 및 "배지 보충물"은 세포 배양물을 배양시키는 영양 조성물을 지칭한다.
"배양시키다"는, 예를 들어 멸균 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱) 세포 배양 접시 또는 플라스크에서 조직 또는 신체 외부의 세포의 지속, 증식(성장) 및/또는 분화를 지칭한다. "배양"은 세포를 증식 및/또는 지속시키는 것을 도울 수 있는 영양소, 호르몬 및/또는 다른 인자의 공급원으로서 배양 배지를 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "해리된" 세포는 다른 세포로부터 또는 표면(예를 들어, 배양 플레이트 표면)으로부터 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 세포는 기계적 또는 효소적 방법에 의해 동물 또는 조직으로부터 해리될 수 있다. 대안적으로, 시험관내에서 응집하는 세포는 효소적으로 또는 기계적으로, 예컨대 클러스터, 단일 세포 또는 단일 세포와 클러스터의 혼합물의 현탁액으로 해리에 의해 서로로부터 해리될 수 있다. 또 다른 대안의 실시형태에서, 접착 세포는 배양 플레이트 또는 다른 표면으로부터 해리된다. 이렇게 해서 해리는 세포외 기질(ECM) 및 물질(예를 들어, 배양 표면)과의 세포 상호작용을 파괴하는 것, 또는 세포 사이의 ECM을 파괴하는 것을 수반할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "농후화 하다" 및 "농후화"는 세포의 조성물과 같은 조성물에서 구체화된 성분의 양을 증가시키는 것을 지칭하고, 세포 집단과 같은 세포 조성물을 설명하기 위해 사용될 때, 농후화되기 전에 세포 집단에서의 이러한 성분의 비율에 비해 구체화된 성분의 비례적으로 증가된 양을 갖는 세포 집단을 지칭한다. 예를 들어, 세포 집단과 같은 조성물은 표적 세포 유형(즉, 구체화된 특징을 갖는 세포)에 대해 농후화될 수 있고, 따라서 농후화되기 전의 세포 집단에 존재하는 표적 세포의 비율에 비해 표적 세포 유형의 증가된 비율 또는 백분율을 가진다. 세포 집단은 당업계에 공지된 세포 선택 및 분류 방법에 의해 표적 세포 유형에 대해 농후화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 집단은 본 명세서의 실시예에 기재된 바와 같은 분류 또는 선택 과정에 의해 농후화된다. 특정 실시형태에서, 표적 세포 집단을 농후화하는 방법은 적어도 약 20%만큼 표적 세포 집단에 대해 세포 집단을 농후화하는데, 이는 집단이 농후화되기 전에 집단에서보다 농후화된 세포 집단이 표적 세포 유형의 약 20% 초과를 비례적으로 포함한다는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 표적 세포 집단을 농후화하는 방법은 적어도 약 30+%, 40+%, 50+%, 60+%, 70+%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%, 또는 적어도 약 98%, 또는 특정 실시형태에서, 약 99%만큼 비례적으로 표적 세포 집단에 대해 세포 집단을 농후화한다.
특정 실시형태에서, 세포의 집단은 만능성 특징을 나타내는 만능세포 또는 세포의 양에 대해 농후화된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 재프로그래밍을 겪는 세포의 집단은 SSEA3, SSEA4, TRA 1-60, TRA-1-81, CD30 또는 CD50을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 만능성 마커의 발현과 같은 만능성 특징을 갖는 표적 세포에 대해 농후화된다.
특정 실시형태에서, 세포 집단, 예컨대 재프로그래밍을 겪는 세포의 집단은, 예를 들어, CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46, 또는 CD7을 포함할 수 있는 분화된 세포 계통 또는 비만능세포에 특이적인 표면 마커를 이용하여 비만능세포가 고갈된다. 따라서 얻어진 세포 집단은 만능세포 농후 세포 집단으로서 기재될 수 있다.
특정 실시형태에서, 농후화된 세포는 별도의 유전자 또는 단백질 발현 프로파일, 예를 들어, 적어도 2개의 만능성 마커, 예컨대 SSEA3, SSEA4, TRA 1-60, TRA-1-81, CD30 및 CD50의 세포 표면 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 농후화된 세포는 2 이상의 만능성 마커를 포함한다. 특정 실시형태에서, 농후화된 세포는 TRA-181 또는 TRA-160 중 하나와 조합하여 SSEA4를 발현시킨다. 더 구체적인 실시형태에서, 농후화된 세포는 SSEA4, TRA181 및 CD30을 발현시킨다. 일 실시형태에서, 세포의 집단은 만능세포와 같은 농후화된 세포의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 만능세포에 대한 세포 집단을 농후화하는 방법은 만능성 마커, 예컨대 SSEA3, SSEA4, TRA 1-60, TRA-1-81, CD30 및 CD50의 세포 표면 발현에 기반하여 세포 집단을 분류하는 단계, 및 만능세포 농후 세포 집단을 얻기 위해 이러한 마커를 발현시키는 세포의 분획을 수집하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포 집단은 CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 및 CD7와 같은 분화 중인 또는 분화된 세포 마커의 세포 표면 발현에 기반하여 세포 집단을 분류하는 단계, 및 만능세포 농후 세포 집단을 얻기 위해 이러한 세포의 세포 집단을 고갈시키는 단계에 의해 만능세포가 농후화된다. 특정 실시형태에서, 세포 집단은 CD13의 발현에 기반하여 분류되며, CD13+ 세포는 만능세포 농후 세포 집단을 얻기 위해 세포 집단으로부터 제거된다.
본 명세서에서 사용되는 "피더 세포" 또는 "피더"는, 피더 세포가 제2 세포 유형의 지원을 위해 성장 인자 및 영양소를 제공하기 때문에, 제2 유형의 세포가 성장하는 환경을 제공하도록 제2 유형의 세포와 공동 배양되는 일 유형의 세포를 기재하기 위해 사용되는 용어이다. 피더 세포는 선택적으로 그들이 지지하는 세포와 상이한 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 줄기 세포를 포함하는 특정 유형의 인간 세포는 마우스 배아 섬유아세포 및 불멸 마우스 배아 섬유아세포의 1차 배양물에 의해 지지될 수 있다. 피더 세포는 전형적으로 조사(irradiation) 또는 미토마이신 c와 같은 유사분열방지제에 의한 처리에 의해 다른 세포와 공동배양할 때 비활성화되어 그들이 지지하는 세포보다 그들이 더 커지는 것을 방지할 수 있다. 앞서 언급한 것으로 제한되는 일 없이, 하나의 특이적 피더 세포 유형은 인간 피부 섬유아세포와 같은 인가 피더 세포일 수 있다. 다른 피더 세포 유형은 마우스 배아 섬유아세포(MEF)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "무 피더"(FF) 환경은 피더 세포가 본질적으로 없고/없거나 피더 세포의 배양에 의해 사전 조건화되지 않는 세포 배양물 또는 배양 배지와 같은 환경을 지칭한다. "사전 조건화된" 배지는 피더 세포가 일정 기간 동안, 예컨대 적어도 1일 동안 배지 내에서 배양된 후에 채취된 배지를 지칭한다. 사전 조건화된 배지는 배지 내에서 배양된 피더 세포에 의해 분비된 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 다수의 매개 물질을 함유한다.
게놈 안정성은 DNA를 정확히 복제하기 위한 그리고 DNA 복제 과정의 완전함을 유지하기 위한 세포의 능력을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "게놈적으로 안정한 세포" 및 "게놈 안정성을 갖는 세포"는 정상 인간 체세포에 대해 돌연변이 및 염색체 이상 빈도가 실질적으로 유사한 돌연변이 및 염색체 이상(예컨대, 전좌, 염색체 이수성, 복제수 변화 및 중복)의 빈도를 나타내는 세포를 지칭한다.
"성분"은 세포의 성장 및/또는 분화를 유지 및/또는 촉진하기 위해 세포 배양 배지에서 사용될 수 있는 화학적 유래이든 또는 생물학적 유래이든, 임의의 화합물 또는 다른 물질을 지칭한다. 용어 "성분", "영양소" 및 "구성성분"은 상호호환적으로 사용될 수 있다. 세포 배양 배지에 대해 사용되는 전통적인 구성성분은 아미노산, 염, 금속, 당, 지질, 핵산, 호르몬, 비타민, 지방산, 단백질 등을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 생체밖 세포의 배양을 촉진 및/또는 유지하는 다른 구성성분은 목적으로 하는 효과에 필요하다면 당업자에 의해 선택될 수 있다.
"단리하다" 또는 "단리하는"은 조성물 또는 물질을 그의 천연 환경으로부터 분리 및 수집하는 것, 예컨대 개개 세포 또는 세포 배양물을 조직 또는 신체로부터 분리시키는 것을 지칭한다. 일 양태에서, 세포의 집단 또는 조성물은 천연에서 그것이 관련된 세포 및 물질이 실질적으로 없다. 세포의 표적 집단에 대해 "단리된" 또는 "정제된" 또는 "실질적으로 순수한"은 전체 세포 집단을 구성하는 표적 세포에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 그리고 특정 실시형태에서, 적어도 약 95% 순수한 세포의 집단을 지칭한다. 세포의 집단 또는 조성물의 순도는 당업계에 잘 공지된 적절한 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 순수한 만능세포의 집단은 전체 세포 집단을 구성하는 만능세포에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 그리고 특정 실시형태에서 적어도 약 95%, 그리고 특정 실시형태에서 약 98% 순수한 세포 집단을 지칭한다. 용어 "본질적으로 순수한"은 본 명세서에서 "실질적으로 순수한"과 상호호환적으로 사용된다.
"계대" 또는 "계대하는"은 세포가 목적으로 하는 정도로 증식될 때 세포를 다중 세포 배양 표면 또는 용기 내로 다시 분할되고 플레이팅되는 작용을 지칭한다. 일부 실시형태에서 "계대" 또는 "계대하는"은 세포를 다시 분할하고, 희석하고 나서, 플레이팅하는 것을 지칭한다. 세포가 1차 배양물 표면 또는 용기로부터 후속 세트의 표면 또는 용기 내로 계대됨에 따라, 후속 배양은 본 명세서에서 "2차 배양" 또는 "제1 계대" 등으로서 지칭될 수 있다. 새로운 배양 용기 내로 다시 분할되고 플레이팅되는 각각의 작용은 1회 계대로서 고려된다.
"플레이팅"은 세포가 세포 배양 용기에 접착되고 퍼지도록 배양 용기 내에 세포 또는 세포들을 배치시키는 것을 지칭한다.
"만능성 인자"는 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 세포의 발생 효능을 증가시킬 수 있는 제제를 지칭한다. 만능성 인자는 세포의 발생 효능을 증가시킬 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 만능성 인자는, 예를 들어 전사 인자 및 소분자 재프로그래밍 제제를 포함한다.
"증식하다"는 하나의 세포가 2개의 본질적으로 동일한 세포 또는 세포의 집단으로 분할되어 수가 증가하는(예를 들어, 재현되는) 특성을 지칭한다.
"증식"은 조직 또는 신체 밖의, 예를 들어 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱) 세포 배양 접시 또는 플라스크와 같은 멸균 용기에서 세포를 성장시키는 것(예를 들어, 세포 증식을 통해 재현시키는 것)을 지칭한다.
"1차 배양물"은 단리된 세포가 배양 배지를 지니는 제1 배양 용기 내에 위치되는 세포, 조직 및/또는 배양물을 지칭한다. 세포, 조직 및/또는 배양물은 지속될 수 있고/있거나 증식될 수 있지만, 세포, 조직 및/또는 배양물이 제1 용기 내에 남아있다면, 세포, 조직 및/또는 배양물은 1차 배양물로서 지칭된다.
용어 "소분자 재프로그래밍 제제" 또는 "소분자 재프로그래밍 화합물"은 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되고, 단독으로 또는 다른 만능성 인자와 조합하여 세포의 발생 효능을 증가시킬 수 있는 소분자를 지칭한다. "소분자"는 분자량이 약 5kD 미만, 약 4kD 미만, 약 3kD 미만, 약 2kD 미만, 약 1kD 미만, 또는 약 0.5kD 미만인 제제를 지칭한다. 소분자는 핵산, 펩티도미메틱, 펩토이드, 탄수화물, 지질 또는 다른 유기 또는 무기 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 화학적 및/또는 생물학적 혼합물, 예컨대 진균, 박테리아 또는 조류 추출물의 라이브러리는 당업계에 공지되어 있으며, 특정 실시형태에서 소분자의 공급원으로서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 소분자 재프로그래밍 제제는 분자량이 10,000 달톤 미만, 예를 들어, 8000, 6000, 4000, 2000 달톤 미만, 예를 들어, 50 내지 1500, 500 내지 1500, 200 내지 2000, 500 내지 5000 달톤 미만이다.
C. 세포
특정 실시형태에서, 하나 이상의 세포는 본 명세서에 상정된 조성물 및 방법을 이용하여 배양, 해리 및 계대될 수 있다. 일 실시형태에서, 단일 세포는 본 명세서에 상정된 조성물 및 방법을 이용하여 배양, 해리 및 계대된다. 다른 실시형태에서, 세포 또는 복수의 세포의 집단은 본 명세서에 상정된 조성물 및 방법을 이용하여 배양, 해리 및 계대된다.
특정 실시형태에서 사용하는데 적합한 세포의 시작 집단은 본질적으로 임의의 적합한 공급원으로부터 유래될 수 있고, 세포 유형 또는 만능성 상태에 대해 이종성 또는 동종일 수 있다. 적합한 세포는 태아 세포 및 성체 세포를 포함한다. 추가로, 적합한 세포는 포유류 유래, 예를 들어 설치류, 고양이, 개, 돼지, 염소, 양, 말, 소 또는 영장류 유래일 수 있다. 일 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다.
세포는 체세포, 비-만능성, 불완전 또는 부분적 만능 줄기 세포, 다분화능 세포, 소능 세포, 단분화능 세포, 종말적으로 분화된 세포, 또는 앞서 언급한 것의 임의의 조합을 포함하는 세포의 혼합 집단일 수 있다. 특정 실시형태에서 사용하는데 적합한 만능세포는 천연 유래 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 iPSC를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 세포의 "혼합된" 집단은 다양한 정도의 발생 효능의 세포 집단이다. 예를 들어, 세포의 혼합된 집단은 재프로그래밍을 겪고 있는 세포를 포함할 수 있으며, 따라서, 혼합된 집단은 만능세포, 부분적 만능세포, 및 비-만능세포, 예컨대 완전히 분화된 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 세포의 시작 집단은 성체 또는 신생아 줄기/전구 세포로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 줄기/전구 세포의 시작 집단은 중배엽 줄기/전구 세포, 내배엽 줄기/전구 세포, 및 외배엽 줄기/전구 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
중배엽 줄기/전구 세포의 예시적 예는 중배엽 줄기/전구 세포, 내피 줄기/전구 세포, 골수 줄기/전구 세포, 제대 줄기/전구 세포, 지방조직 유래 줄기/전구 세포, 조혈 줄기/전구 세포(HSC), 간충직 줄기/전구 세포, 근육 줄기/전구 세포, 신장 줄기/전구 세포, 조골세포 줄기/전구 세포, 연골세포 줄기/전구 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
외배엽 줄기/전구 세포의 예시적 예는 신경 줄기/전구 세포, 망막 줄기/전구 세포, 피부 줄기/전구 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
내배엽 줄기/전구 세포의 예시적 예는 간 줄기/전구 세포, 췌장 줄기/전구 세포, 상피 줄기/전구 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 세포의 시작 집단은 췌장섬 세포, CNS 세포, PNS 세포, 심근 세포, 골격근세포, 평활근 세포, 조혈 세포, 골세포, 간 세포, 지방 세포, 신세포, 폐 세포, 연골세포, 피부 세포, 여포성 세포, 혈관 세포, 상피 세포, 면역 세포, 내피 세포 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포의 이종성 또는 동종성 집단일 수 있다.
D. 기저상태 만능성의 자발적 분화 및 유도를 감소시키기 위한 배양 플랫폼
세포 은행, 질환 모델링 및 세포 요법 적용은 고품질 만능세포에 대한 요구가 증가하고 있다. 예를 들어, 생성이 척도화된 시스템에서 유전체 비삽입형 iPSC 및 그들의 확장의 고속대량 유도는 기술적으로 파악하기 어려운 채로 남아있다. 특정 실시형태에서, 단계 특이적 배지 조성물에서 소분자 경로 저해제를 이용하는 만능세포의 빠른, 병용 생성, 선택 및 확장을 가능하게 하는 배양 플랫폼이 상정된다. 본 명세서에 상정된 플랫폼은 완전 무 피더 환경에서 최소 재프로그래밍 인자를 이용하여 효율적이며 촉진된 재프로그래밍을 지지하며; 단일 세포 배양 및 만능세포의 확장을 가능하게 하는 한편, 균일하고 게놈적으로 안정한 만능성 집단을 유지한다. 게다가, 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 유전자 배경과 관계없이 그리고 이식유전자 발현과 독립적으로, hESC 및 hiPSC를 포함하는 만능세포를 자발적 분화의 감소된 상태 및 통상적인 만능성의 기저상태로 배양시키는 것을 제공한다.
본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 부분적으로, 배양에서 감소된 자발적 분화를 갖는 산업- 또는 임상-등급 만능세포의 생성에 유용하다. 일 실시형태에서, 비-만능세포는 만능세포가 되도록 유도되고, 만능성을 유지하도록 배양된다. 다른 실시형태에서, 비-만능세포는 만능세포가 되도록 유도되고, 배양물에서 감소된 자발적 분화를 달성하고/하거나 유지하도록 배양된다. 다른 실시형태에서, 비-만능세포는 만능세포가 되도록 유도되고, 기저상태 만능성을 달성하고/하거나 유지하도록 배양된다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100회 이상의 계대(임의의 사이에 있는 수의 계대를 포함함)에 대해 하나 이상의 만능성 세포의 기저상태 만능성, 정상 핵형 및 게놈 안정성을 유지한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100회 이상의 계대(임의의 사이에 있는 수의 계대를 포함함)에 대해 하나 이상의 만능성에서 감소된 자발적 분화를 유지한다.
일 실시형태에서, 배양 플랫폼은 세포 배양 배지 및 GSK-3 저해제, MEK 저해제, 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 세포 배양 배지를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 세포 배양 배지는 TGFβ 수용체(TGFβR) 저해제 및 ALK5 저해제를 포함하는 TGFβ/액티빈 신호전달 경로의 저해제를 포함하지 않거나 또는 결여한다. 임의의 특정 이론에 구속되는 일 없이, 본 발명자는 놀랍게도, TGFβR/ALK5 저해제가 재프로그래밍의 효율을 증가시키지만, 이들 저해제가 만능세포 집단의 장기간 유지, 품질 및 균질성에 대응하며, 즉, TGFβ 경로 신호전달의 저해는 세포의 재프로그래밍 효율을 개선시켰지만, 이 저해의 제거는 시험관내 배양 시스템에서, 특히 감소된 자발적 분화를 지니는 동종 만능성 집단이 바람직한, 더 구체적으로는 이식유전자 발현이 없는 무 피더-세포 및 단일 세포, 효소적 계대를 이용하는 시스템에서 만능세포 집단의 후속적 유지를 필요로 한다는 것을 발견하였다. 추가로, GSK-3 저해제 및 MEK 저해제 및 선택적으로 ROCK 저해제를 포함하지만, 본 명세서에 개시된 바와 같은 TGFβR/ALK5 저해제가 없는 배지에서 준안정 만능세포, 즉, 감소된 자발적 분화 달성하고/하거나 기저상태 만능성을 달성하기 위한 이행 만능세포를 배양시킨다. 본 명세서에 상정된 배양 배지 플랫폼은 또한 무 피더 환경에서 만능세포의 효율적인 재프로그래밍 및 장기간 배양을 가능하게 한다. 추가로, "ALK5 저해제"는 비특이적 키나제 저해제를 포함하는 것으로 의도되지 않지만, "ALK5 저해제"는 ALK5에 추가로 ALK4 및/또는 ALK7을 저해하는 저해제, 예를 들어, SB-431542를 포함하는 것으로 이해되어야 한다(예를 들어, 문헌[Inman, et al., J Mol . Pharmacol. 62(1): 65-74 (2002] 참조).
바람직한 실시형태에서, 배양 플랫폼은 GSK-3 저해제, MEK 저해제, Rho 키나제(ROCK) 저해제, 및 선택적으로, LIF 및/또는 bFGF를 포함하는 세포 배양 배지를 포함하고, TGFβR 또는 ALK5 저해제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 TGFβ/액티빈 신호전달 경로의 소분자 저해제를 포함하지 않는다.
추가적인 실시형태에서, 세포는 배양 배지는 사이토카인 및/또는 성장인자가 실질적으로 없고, 선택적으로 무 피더 환경이다. 다른 실시형태에서, 세포는 배양 배지는 보충물, 예컨대 혈청, 추출물, 성장인자, 호르몬, 사이토카인 등을 함유한다.
일 바람직한 실시형태에서, 배양 플랫폼은 무 피더 배양물을 포함한다.
본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 또한 감소된 자발적 분화를 갖고/갖거나 기저상태 만능성을 달성하는 산업- 또는 임상-등급 만능세포의 균일한 집단을 제조하는 것과 같은 수많은 이점을 제공한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "균일한"은 세포 집단을 지칭하되, 각각의 세포는 집단 내 다른 세포와 동일 또는 실질적으로 동일하다. 일 실시형태에서, 각각의 세포가 본 명세서에 상정된 것과 동일한 만능성 마커, 예를 들어, SSEA4 및 TRA1-81 중 하나 이상을 발현시킨다면, 세포는 집단 내 다른 세포와 동일하다. 일 실시형태에서, 세포의 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상이 집단 내 다른 세포와 동일 또는 실질적으로 동일하다면, 집단은 균일하다.
1. TGFβ 수용체/ ALK5 저해제
TGFβ 수용체(예를 들어, ALK5) 저해제는 TGFβ 수용체(예를 들어, ALK5)의 우성 음성 변이체에 대한 그리고 발현을 억제하는 안티센스 핵산에 대한 항체를 포함할 수 있다. 예시적인 TGFβ 수용체/ALK5 저해제는 SB431542(예를 들어, 문헌[Inman, et al., Molecular Pharmacology 62(1):65-74 (2002)] 참조), 3-(6-메틸-2-피리딘일)-N-페닐-4-(4-퀴놀린일)-1H-피라졸-1-카보티오아마이드로서도 알려진 A-83-01(예를 들어, 문헌[Tojo, et al., Cancer Science 96(11):791-800 (2005)] 참조, 예를 들어, 토이크리스 바이오사이언스사(Toicris Bioscience)로부터 상업적으로 입수가능); 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘, Wnt3a/BIO(예를 들어, Dalton, et al., WO2008/094597 참조, 본 명세서에 참고로 포함됨), BMP4(Dalton, 상기 참조), GW788388(-{4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]피리딘-2-일}-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)벤즈아마이드)(예를 들어, 문헌[Gellibert, et al., Journal of Medicinal Chemistry 49(7):2210-2221 (2006)] 참조), SM16(예를 들어, 문헌[Suzuki, et al., Cancer Research 67(5):2351-2359 (2007)] 참조), IN-1130(3-((5-(6-메틸피리딘-2-일)-4-(퀴녹살린-6-일)-1H-이미다졸-2-일)메틸)벤즈아마이드)(예를 들어, 문헌[Kim, et al., Xenobiotica 38(3):325-339 (2008)] 참조), GW6604(2-페닐-4-(3-피리딘-2-일-1H-피라졸-4-일)피리딘)(예를 들어, 문헌[de Gouville, et al., Drug News Perspective 19(2):85-90 (2006)] 참조), SB-505124(2-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-2-tert-뷰틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드)(예를 들어, 문헌[DaCosta, et al., Molecular Pharmacology 65(3):744-752 (2004)] 참조) 및 피리미딘 유도체(예를 들어, Stiefl, et al., WO2008/006583에 열거된 것, 본 명세서에 참고로 포함됨)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가로, "ALK5 저해제"는 비-특이적 키나제 저해제를 포함하는 것으로 의도되지 않지만, "ALK5 저해제"는 ALK5에 추가로 ALK4 및/또는 ALK7을 저해하는 저해제, 예를 들어, SB-431542를 포함하는 것으로 이해되어야 한다(예를 들어, 문헌[Inman, et al., J, Mol. Pharmacol. 62(1): 65-74 (2002)] 참조). 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않지만, ALK5 저해제는 상피 전환/이행(MET) 과정에 대해 간충직에 영향을 미치는 것으로 믿어진다. TGFβ/액티빈 경로는 상피 간엽 이행(EMT)에 대한 유발자이다. 따라서, TGFβ/액티빈 경로를 저해하는 것은 MET(즉, 재프로그래밍) 과정을 용이하게 할 수 있다.
ALK5를 저해하는 효과를 나타내는 본 명세서의 데이터를 고려하여, TGFβ/액티빈 경로의 저해는 ALK5를 저해하는 것과 유사한 효과를 가질 것으로 믿어진다. 따라서, TGFβ/액티빈 경로의 임의의 저해제(예를 들어, 상류 또는 하류)는 본 명세서의 각각의 단락에 기재된 바와 같은 ALK5 저해제와 조합하여 또는 대신에 사용될 수 있다. 예시적인 TGFβ/액티빈 경로 저해제는 TGFβ 수용체 저해제, SMAD 2/3 인산화의 저해제, SMAD 2/3 및 SMAD 4의 상호작용 저해제, 및 SMAD 6 및 SMAD 7의 활성제/효현제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 더 나아가, 이하에 기재된 범주는 단지 유기적 목적을 위한 것이며, 당업자는 화합물이 경로 내의 하나 이상의 지점에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인식하고, 따라서 화합물은 하나 이상의 정해진 범주에서 작용할 수 있다는 것을 알 것이다.
TGFβ 수용체(TGFβR) 저해제는 TGFβ 수용체를 표적화하는 siRNA 또는 안티센스 핵산의 우성 음성 변이체에 대한 항체를 포함할 수 있다. TGFβ 수용체 저해제의 특이적 예는 SU5416; 2-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-2-tert-뷰틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드(SB-505124); 레르델리무맙(CAT-152); 메텔리무맙(CAT-192); GC-1008; ID11; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; Ki26894; SB-203580; SD-093; 글리벡; 3,5,7,2',4'-펜타하이드록시플라본(몰린(Morin)); 액티빈-M108A; P144; 가용성 TBR2-Fc; 및 TGFβ 수용체를 표적화하는 안티센스 형질감염 종양 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. (예를 들어, 문헌[Wrzesinski, et al., Clinical Cancer Research 13(18):5262-5270 (2007); Kaminska, et al., Acta Biochimica Polonica 52(2):329-337 (2005); 및 Chang, et al., Frontiers in Bioscience 12:4393-4401 (2007)] 참조).
SMAD 2/3 인산화의 저해제는 SMAD2 또는 SMAD3을 표적화하는 안티센스 핵산의 우성 음성 변이체에 대한 항체를 포함할 수 있다. 저해제의 구체적 예는 PD169316; SB203580; SB-431542; LY364947; A77-01; 및 3,5,7,2',4'-펜타하이드록시플라본(모린)을 포함한다. (예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Wrzesinski, 상기 참조; Kaminska, 상기 참조; Shimanuki, et al., Oncogene 26:3311-3320 (2007)]; 및 Kataoka, et al., 유럽 특허 제1992360호).
SMAD 2/3과 smad4의 상호작용의 저해제는 SMAD2, SMAD3 및/또는 smad4를 표적화하는 안티센스 핵산의 우성 음성 변이체에 대한 항체를 포함할 수 있다. SMAD 2/3과 SMAD4의 상호작용의 저해제의 구체적 예는 Trx-SARA, Trx-xFoxH1b 및 Trx-Lef1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. (예를 들어, 문헌[Cui, et al., Oncogene 24:3864-3874 (2005) 및 Zhao, et al., Molecular Biology of the Cell, 17:3819-3831 (2006)] 참조).
SMAD 6 및 SMAD 7의 활성제/효현제는 SMAD 6 또는 SMAD 7을 표적화하는 안티센스 핵산의 우성 음성 변이체에 대한 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 저해제의 구체적 예는 smad7-as PTO-올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다. (예를 들어, Miyazono, et al., 미국 특허 제6534476호, 및 Steinbrecher, et al., 미국 특허 제2005119203호, 이들 둘 다 본 명세서에 참고로 포함됨).
2. Wnt 경로 효현제
본 명세서에서 사용되는 용어 "Wnt 신호-촉진제", "Wnt 경로 활성화제" 또는 "Wnt 경로 효현제"는 Wntl, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt10a, Wntl0b, Wnt11, Wnt14, Wnt15 또는 Wnt16 중 하나 이상의 효현제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 Wnt 신호전달 경로의 효현제를 지칭한다. Wnt 경로 효현제는 추가로 다음의 폴리펩타이드 또는 이의 단편 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: Dkk 폴리펩타이드, 크레슨트(crescent) 폴리펩타이드, (케르베로스(cerberus) 폴리펩타이드, 악신(axin) 폴리펩타이드, Frzb 폴리펩타이드, T-세포 인자 폴리펩타이드, 또는 우성 음성 헝클어진(disheveled) 폴리펩타이드.
Wnt 경로 효현제의 비제한적 예는 추가로 다음 중 하나 이상을 포함한다: Wnt 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, Wnt 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 활성화된 Wnt 수용체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 활성화된 Wnt 수용체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, Wnt/β-카테닌 신호전달을 촉진하는 소분자, Wnt 길항제의 발현 또는 활성을 저해하는 소 유기 분자, Wnt 길항제의 발현을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, Wnt 길항제의 발현을 저해하는 리보자임, Wnt 길항제의 발현을 저해하는 RNAi 작제물, siRNA 또는 shRNA, Wnt 길항제에 결합하고 활성을 저해하는 항체, β-카테닌 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, β-카테닌 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, Lef-1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, Lef-1 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.　
Wnt 경로 효현제는 추가로, GSK3 저해제, 예를 들어, 우성 음성 GSK-3, GSK3α, 또는 GSK3β 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 우성 음성 GSK-3, GSK3α 또는 GSK3β 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3β에 결합하고 이의 발현 또는 활성을 저해하는 소 유기분자, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3β에 결합하고 이의 발현 또는 활성을 저해하는 RNAi 작제물, siRNA 또는 shRNA, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3β에 결합하고 이의 발현을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3β에 결합하고, 이의 발현 및/또는 활성을 저해하는 항체, GSK-3, GSK3α 또는 GSK3β에 결합하고 이의 발현을 저해하는 리보자임, 및 GSK-3 저해에 대한 효과가 유사한 β-카테닌 표적 유전자를 활성화하는 임의의 GSK-3-독립적 시약을 포함한다.　
3. GSK - 3β 저해제
GSK-3β 저해제는 본 명세서에 상정된 조성물에서 사용하는데 적합한 구체적인 예시적 Wnt 경로 효현제이고, 이는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 상정된 GSK-3β 저해제는 GSK-3β 발현 및/또는 GSK-3β 활성을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에 상정된 GSK-3β 저해제의 예시적 예는 항-GSK-3β 항체, 우성 음성 GSK-3β 변이체, siRNA, shRNA, miRNA 및 GSK-3β를 표적화하는 안티센스 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 예시적인 GSK-3β 저해제는 켄파울론, l-아자켄파울론, CHIR99021, CHIR98014, AR-A014418, CT 99021, CT 20026, SB216763, AR-A014418, 리튬, SB 415286, TDZD-8, BIO, BIO-아세톡심, (5-메틸-lH-피라졸-3-일)-(2-페닐퀴나졸린-4-일)아민, 피리도카바졸- 사이클로페나다이엔일루테늄 복합체, TDZD-8 4-벤질-2-메틸-l,2,4-티아다이아졸리딘-3,5-다이온, 2-티오(3-요오도벤질)-5-(l-피리딜)-[l,3,4]- 옥사다이아졸, OTDZT, 알파-4-다이브로모아세토페논, AR-AO 144-18, 3- (l-(3-하이드록시프로필)-lH-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-다이온; TWSl 19 피롤로피리미딘 화합물, L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2 또는 그의 미리스토일화된 형태; 2-클로로-l-(4,5-다이브로모-티오펜-2-일)-에탄온; GF109203X; RO318220; TDZD-8; TIBPO; 및 OTDZT를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특히 예시적인 실시형태에서, GSK-3β 저해제는 CHIR99021, BIO, 또는 켄파울론이다.
바람직한 실시형태에서, GSK-3β 저해제는 CHIR99021이다.
4. ERK /MEK 저해제
본 명세서에 상정된 조성물에서 사용하기에 적합한 ERK/MEK 저해제는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 상정된 ERK/MEK 저해제는 MEK 또는 ERK 발현 및/또는 MEK 또는 ERK 활성을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에 상정된 MEK/ERK 저해제의 예시적 실시예는 항- MEK 또는 항-ERK 항체, 우성 음성 MEK 또는 ERK 변이체, MEK 또는 ERK를 표적화하는 siRNA, shRNA, miRNA 및 안티센스 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 예시적인 ERK/MEK 저해제는 PD0325901, PD98059, UO126, SL327, ARRY- 162, PD184161, PD184352, 수니티닙, 소라페닙, 반데타닙, 파조파닙, 악시티닙, GSKl 120212, ARRY-438162, RO5126766, XL518, AZD8330, RDEAl 19, AZD6244, FR180204 및 PTK787을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
추가적인 예시적 MEK/ERK 저해제는 국제 특허 출원 공개 WO 99/01426, WO 02/06213, WO 03/077914, WO 05/051301 및 WO2007/044084에 개시된 해당 화합물을 포함한다.
MEK/ERK 저해제의 추가적인 예시적 예는 다음의 화합물을 포함한다: 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조가미다졸-5-카복실산(2,3-다이하이드록시-프로폭시)-아마이드; 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-(테트라하이드로-피란-2-일메틸)-3H-벤조가미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-에톡시)-아마이드, 1-[6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-일]-2-하이드록시-에탄온, 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조가미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-1,1-다이메틸-에톡시)-아마이드, 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-(테트라하이드로-푸란-2-일메틸)-3H-벤조가미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-에톡시)-아마이드, 6-(4-브로모-2-플루오로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조가미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-에톡시)-아마이드, 6-(2,4-다이클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조가미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-에톡시)-아마이드, 6-(4-브로모-2-클로로-페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조가미다졸-5-카복실산(2-하이드록시-에톡시)-아마이드, 본 명세서에서 이후에 MEK 저해제 1로서 지칭됨; 2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-N-(2-하이드록시에톡시)-1,5-다이메틸-6-옥소-1,6-다이하이드로피리딘-3-카복스아마이드; 본 명세서에서 이후에 MEK 저해제 2로서 지칭됨; 및 4-(4-브로모-2-플루오로페닐아미노)-N-(2-하이드록시에톡시)-1,5-다이메틸-6-옥소-1,6-다이하이드로피리다진-3-카복스아마이드 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염.
바람직한 실시형태에서, MEK/ERK 저해제는 PD98059이다.
5. ROCK 저해제
Rho 연관 키나제(ROCK)는 Rho 키나제(이의 3가지 동형이 존재한다--RhoA, RhoB 및 RhoC)의 하류의 효과기로서 작용하는 세린/트레오닌 키나제이다. 본 명세서에 상정된 조성물에서 사용하는데 적합한 ROCK 저해제는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 상정된 ROCK 저해제는 ROCK 발현 및/또는 ROCK 활성을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에 상정된 ROCK 저해제의 예시적 예는 항-ROCK 항체, 우성 음성 ROCK 변이체, ROCK을 표적화하는 siRNA, shRNA, miRNA 및 안티센스 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 상정된 예시적인 ROCK 저해제는 티아조비빈, Y27632, 파스우딜(Fasudil), AR122-86, Y27632 H-1152, Y-30141, Wf-536, HA-1077, 하이드록실-HA-1077, GSK269962A, SB-772077-B, N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트라이클로로페닐)유레아, 3-(4-피리딜)-1H-인돌, 및 (R)-(+)-트랜스-N-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-사이클로헥산카복스아마이드 및 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제8,044,201호에 개시된 ROCK 저해제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈, Y27632, 또는 피린테그린이다.
바람직한 실시형태에서, ROCK 저해제는 티아조비빈이다.
본 명세서에 상정된 조성물 및 세포 배양 배지에서 소분자의 양은 변할 수 있고, 사용되는 특이적 분자 및 조합물, 배지에서 배양 중인 세포의 유형, 및 구체적 용도를 포함하는 구체적 배양 조건에 따라 최적화될 수 있다. 일 실시형태에서, 소분자는 만능성을 유도하거나, 재프로그래밍의 효율을 개선시키거나, 세포 효능을 증가 또는 유지하거나, 또는 기저상태 만능성을 유도 또는 유지하기에 충분한 농도에서 조성물 중에 존재한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 세포 배양 배지에서 소분자의 바람직한 농도 및 조합물은 표 1에서 운명 유지 배지(Fate Maintenance Medium: FMM)로서 나타낸다. 배지의 성분은 표 1에서 나타낸 최적 농도의 최적 범위 내의 양으로 배지에 존재할 수 있다. 운명 재프로그래밍 배지(Fate Reprogramming Medium: FRM)는 세포의 재프로그래밍을 포함하지만, 기저상태 만능세포의 확립 및 장기간 유지에 충분하지 않은 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼에서 유용하다.
Figure 112016094741062-pct00001
6. 사이토카인 및 성장 인자
특정 실시형태에서, 본 발명의 세포는 배양 배지는 사이토카인 및/또는 성장인자가 실질적으로 없다. 특정 실시형태에서, 세포는 배양 배지는 혈청, 추출물, 성장인자, 호르몬, 사이토카인 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 보충물을 함유한다.
하나의 예시적 실시형태에서, 배양 배지는 ECM 단백질, 라미닌 1, 피브로넥틴, 콜라겐 IV 아이소타입, 프로테아제, 프로테아제 저해제, 세포 표면 접착 단백질, 세포 신호전달 단백질, 카데린, 클로라이드 세포내 통로 1, 막관통 수용체 PTK7, 인슐린-유사 성장 인자, 또는 인히빈 베타 A 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, TGFβ/액티빈/노달(nodal) 신호전달 경로, 및 액티빈 A의 유도자를 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 배지는 TGFβ/액티빈/노달 신호전달 경로의 유도자를 포함할 수 있다.
다른 예시적 실시형태에서, 배양 배지는 다음의 사이토카인 또는 성장인자: 표피성장인자(EGF), 산성 섬유아세포 성장인자(aFGF), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF), 백혈병 저해 인자(LIF), 간세포 성장인자(HGF), 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1), 인슐린-유사 성장 인자 2(IGF-2), 케라틴세포 성장인자(KGF), 신경 성장인자(NGF), 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 형질전환 성장인자 베타(TGF-β), 혈관 내피 세포 성장인자(VEGF) 트랜스페린, 다양한 인터류킨(예컨대 IL-1 내지 IL-18), 다양한 콜로니-자극 인자(예컨대 과립구/대식세포 증식 자극인자(GM-CSF)), 다양한 인터페론(예컨대, IFN-γ) 및 줄기 세포에 대해 효과를 갖는 다른 사이토카인, 예컨대 줄기 세포 인자(SCF) 및 에리스로포이에틴(Epo) 중 하나 이상을 포함한다. 이들 사이토카인은, 예를 들어 미네소타주 미네아폴리스에 소재한 알앤디 시스템즈사(R&D Systems)로부터 상업적으로 얻을 수 있으며, 천연 또는 재조합체일 수 있다. 특정 실시형태에서, 성장인자 및 사이토카인은 본 명세서에 상정된 농도로 첨가될 수 있다. 특정 실시형태에서 성장인자 및 사이토카인은 경험적으로 또는 확립된 사이토카인 기술에 의해 인도되는 바와 같이 결정되는 농도로 첨가될 수 있다.
7. 배양 기질
임의의 적합한 용기 또는 세포 배양 용기가 기본 배지 및/또는 세포 배양 보충물에서 세포 배양을 위한 지지체로서 사용될 수 있다. 지지체 상의 기질 코팅은 필수적이지 않다. 그러나, 접착-촉진 기층(예를 들어, 콜라겐, 피브로넥틴, RGD-함유 폴리펩타이드, 젤라틴 등)을 지니는 배양 용기의 표면을 코팅하는 것은 세포 부착을 촉진시키며, 특정 실시형태에서 본 명세서에 개시된 세포 배양 배지 및 보충물의 효과를 향상시킬 수 있다. 세포를 배양 및 계대하기 위한 적합한 기질은 당업계에 공지되어 있으며, 비트로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐, 엘라스틴, 오스테오폰틴, 천연 유래 세포주-생성 기질의 혼합물, 예컨대 매트리겔(매트리겔)(상표명) 및 합성 또는 인공 표면, 예컨대 폴리아민 단일층 및 카복시-말단 단일층을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 매트리겔(상표명) 또는 비트로넥틴을 포함하는 기질을 포함한다.
8. 무 피더 환경
만능세포를 배양하는 현재의 방법은 피더 세포에 또는 피더 세포를 이용하여 사전 조건화하고 소 태아 혈청을 함유하는 배지에 크게 의존하지만; 그러나, 이러한 환경은 임상 및 치료적 용도를 위한 세포를 생성하는데 적합하지 않을 수 있다. 예를 들어, 이러한 이종-오염 환경에서 배양된 세포는 일반적으로 인간 세포 이식에 부적합한 것으로 고려되는데, 동물 성분에 대한 노출이 면역 거부의 심각한 위험으로 존재할 수 있고, 치료 환자에 대해 비동정 병원균을 전달할 수 있고, 동물 레트로바이러스를 잠재적으로 재활성화할 수 있었기 때문이다. 무 동물 배양 배지를 이용하는 배양 시스템, 예컨대 본 명세서에 상정된 무 피더 환경은 임상-등급 세포주, 특히 hESC 및 hiPSC 세포주의 제조를 용이하게 한다.
특정 실시형태에서, 무 피더 환경은 마우스 배아 섬유아세포, 인간 섬유아세포, 케라틴세포 및 배아 줄기 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 인간 피더 세포가 본질적으로 없으며, 피더 세포에 의해 사전 조건화되지 않는다. 무 피더 세포 배양 배지는 만능세포, 재프로그래밍 세포, 단일-세포 배양, 해리 및 만능세포의 계대, 만능세포의 세포 분류, 기저상태 만능세포의 생성, 및 기저상태 만능성의 유지를 배양함에 있어서 사용하는데 적합하다. 특정 실시형태에서, 무 피더 환경은 만능성을 유도하고/하거나, 재프로그래밍 효율을 개선시키고/시키거나, 세포 효능을 증가 또는 유지하기 위해 사용된다. 특정 실시형태에서, 무 피더 환경은 사이토카인 및 bFGF을 포함하는 성장인자가 실질적으로 없다.
9. 해리
본 명세서에 상정된 배양 플랫폼에 의해 제공되는 이점 중 하나는 단일 기저상태 만능세포를 배양, 계대 및 해리시키는 것의 향상된 생존도 및 생존이다. 세포의 단일 세포로의, 예컨대 단일 세포 현탁액으로의 해리는 효소적 또는 기계적 수단에 의해 달성될 수 있다. 세포를 단일 세포로 해리시키기 위한 당업계에 공지된 효소적 제제는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 해리 제제는 트립신/EDTA, 트리플-셀렉트(TrypLE-Select), 콜라게나제 IV 및 디스파제로부터 선택된다.
킬레이터, 예컨대 EDTA, 아쿠타제(Accutase) 또는 아쿠맥스(AccuMax)는 또한 본 명세서에 상정된 방법에 따라 세포를 해리시킴에 있어서 단독으로 또는 효소 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 해리 제제는 무 칼슘 및 무 마그네슘 PBS 중에 용해되어 단일 세포로의 해리를 용이하게 할 수 있다.
해리 동안 그리고 해리 후에 세포의 생존을 향상시키기 위해, 생존 촉진 물질(예를 들어, 성장인자, 세포사 및 세포자멸사에 연루된 세포 경로의 저해제, 또는 조건화 배지), 예를 들어, 티아조비빈과 같은 ROCK 저해제가 첨가될 수 있다.
세포 배양 및 배지 수집에서의 기법은 문헌[Hu et al., Curr . Opin . Biotechnol. 8:148, 1997; K. Kitano, Biotechnology 17:73, 1991; Curr . Opin . Biotechnol. 2:375, 1991; Birch et al., Bioprocess Technol. 19:251, 1990; "Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach" (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); "Guide to Techniques in Mouse Development" (P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993); "Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro" (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); "Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy" (P. D. Rathjen et al., al., 1993)]에서 약술된다.
줄기 세포의 분화는 문헌[Robertson, Meth . Cell Biol. 75:173, 1997; 및 Pedersen, Reprod. Fertil. Dev. 10:31,1998]에서 검토된다.
10. 농후화 및 고갈 전략
특정 실시형태에서, 만능세포, 예를 들어, iPSC에 대해 세포 집단을 농후화하기 위한 전략이 제공된다. 일 실시형태에서, 농후화는 상대적으로 단시간에 클론 iPSC 콜로니를 유도함으로써 iPSC 생성 효율을 개선시키는 방법을 제공한다. 농후화는 재프로그래밍하도록 유도된 세포 집단을 분류하고, 만능성 마커를 발현시키는 세포를 동정하고 얻음으로써, 만능세포 농후 세포 집단을 얻는 것을 포함할 수 있다. 추가적인 농후화 방법은 농후화된 만능세포 집단을 얻기 위해 분화 또는 비-만능세포의 마커를 발현시키는 세포의 고갈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍이 약 4 내지 30일, 약 4 내지 24일, 약 6 내지 22일 또는 약 8 내지 약 12일 동안 유도된 후에, 세포가 배양된다.
일 실시형태에서, 만능세포에 대한 세포 집단을 농후화하는 것은 집단에서 세포를 해리시키고 세포를 재현탁시킴으로써 단일 세포 현탁액을 제조하는 것을 포함한다. 해리된 세포는 세포를 유지하거나 또는 세포 분류를 수행하기 위한 임의의 적합한 용액 또는 배지에서 재현탁될 수 있다. 특정 실시형태에서, 단일 세포 현탁액은 GSK3 저해제, MEK 저해제, 및 Rock 저해제를 함유하고, TFGβ 저해제는 없다. 특정 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99021이고, MEK 저해제는 PD0325901이며, Rock 저해제는 티아조비빈이다.
특정 실시형태에서, 세포 집단은 만능세포를 양성으로 선택하도록 분류되고/되거나, 집단은 비-재프로그래밍된 또는 비-만능세포를 고갈시킴으로써 만능세포가 농후화된 세포 집단을 얻는다. 일 실시형태에서, 단일 세포 현탁액이 제조되고, 이어서, 단일 세포는, 예를 들어, 적절한 항체를 이용하여, 만능성의 마커에 대한 염색과 같은 분류를 위해 제조된다. 세포는 분류 세포의 임의의 적합한 방법에 의해, 예컨대 자기 비드 또는 유세포 분석(FACS) 분류에 의해 분류될 수 있다.
세포는 SSEA3/4, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, SSEA1(마우스), CD30, SSEA5, CD90 및 CD50의 발현을 포함하는, 만능성의 다양한 마커에 기반하여 분류될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 세포는 만능성의 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 4가지의 마커에 기반하여 분류된다. 특정 실시형태에서, 세포는 SSEA4의 발현에 기반하여 분류되고, 특정 실시형태에서, TRA1-81 또는 TRA1-60과 조합한 SSEA4의 발현에 기반하여 분류된다. 특정 실시형태에서, 세포는 SSEA4, TRA1-81 또는 TRA1-60 및 CD30 발현에 기반하여 분류된다. 특정 실시형태에서, 세포는 CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46, 또는 CD7을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 분화 세포의 표면 마커를 이용하여 비-재프로그래밍 세포에 대해 초기에 고갈되고, 이어서, SSEA4, TRA1-81 및 CD30과 같은 만능성 마커가 농후화된다.
만능세포가 농후화된 집단은 세포 배양 시스템, 예컨대 전통적인 hESC 배지 또는 본 발명의 세포 배양 배지에 놓일 수 있다. 세포 배양 시스템은 피더 세포로 보충할 수 있거나, 또는 선택적으로 무 피더 환경일 수 있다. 일부 실시형태에서, 만능성 마커의 발현가능한 분류 세포는 피더 세포 보충 배양 시스템에 위치되고, 이어서, 무 피더 환경으로 옮겨진다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 무 피더 환경이고, GSK3 저해제, MEK 저해제, 및 Rock 저해제를 포함하며, TGFβ 저해제가 없다. 특정 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR99021이고, MEK 저해제는 PD0325901이며, Rock 저해제는 티아조비빈이다. 본 발명의 다른 특정 실시형태에서, 세포 배양 시스템은 매트리겔(상표명) 코팅 조직 플레이트를 포함하는 무 피더 환경이다. 일 실시형태에서, 세포 배양 시스템은 표 1에 기재된 FMM 배지를 포함한다.
농후화된 세포 집단은 전형적으로 분류 후 약 3일 내지 약 25일; 분류 후 약 5일 내지 9일, 또는 분류 후 약 5일 내지 7일에 나타나는 기저상태 iPSC 콜로니를 얻기 위해 본 명세서에 기재된 세포 배양 시스템에 배양될 수 있다. iPSC 콜로니는 클론 확장을 위해 선별 또는 분류될 수 있다. 본 명세서에 상정된 농후화 전략을 이용하여, 세포 집단은 만능세포에 대해 적어도 약 3배, 5배 또는 10배 이상 농후화된다.
일부 실시형태에서, 재프로그래밍 또는 만능세포의 집단을 겪은 세포 집단은 분화 세포가 고갈된다. 일 실시형태에서, 만능세포의 집단 또는 재프로그래밍을 위해 유도된 세포는 분화 세포의 세포 표면 마커를 갖는 세포가 고갈될 수 있다. 분화 세포의 세포 표면 마커의 예시적인 예는 CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 또는 CD7을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, CD13은 분화 세포의 표면 마커로서 사용된다.
다른 실시형태에서, 세포 집단은 목적으로 하는 계통으로 분화되도록 유도되고, 분화 중인 또는 분화된 세포의 농후화 집단을 얻기 위해 만능세포가 고갈된다. 일부 실시형태에서, 분화된 세포의 집단은 구체적 계통으로 분화되도록 유도된 ESC 또는 iPSC와 같은 세포 집단을 포함한다. 세포 집단은 상기 기재한 음성 세포 분류 기법("패닝(panning)"), 예컨대 만능성 마커에 기반한 자기 비드 또는 FAC에 따른 집단에서의 분류 세포를 이용하여 만능세포를 고갈시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 분화 세포를 포함하는 세포 집단은 만능성 마커를 이용하여 FAC에 의해 분류되고, 만능성 마커를 발현시키는 세포가 고갈된 분획이 얻어진다. 다른 실시형태에서, 세포 집단은 만능성의 마커가 고갈된 분획을 얻기 위해 계통-특이적 마커 유사 CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 또는 CD7과 같은 분화 마커에 기반하여 FAC에 의해 분류된다. CD13은 본 발명의 특정 실시형태에서 분화 세포의 표면 마커로서 사용된다.
E. 재프로그래밍 세포에 대한 배양 플랫폼
세포에서 만능성을 유도하거나 또는 효능을 증가시키기 위해(Takahashi, K., and Yamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006); Takahashi et al., Cell 131, 861-872 (2007); Yu et al., Science 318, 1917-1920 (2007); Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384 (2009); Kim et al., Cell Stem Cell 4, 472-476 (2009); Yamanaka et al., 2009; Saha, K., Jaenisch, R., Cell Stem Cell 5, 584-595 (2009)), 그리고 재프로그래밍의 효율을 개선시키기 위해(Shi et al., Cell Stem Cell 2, 525-528 (2008a); Shi et al., Cell Stem Cell 3, 568-574 (2008b); Huangfu et al., Nat Biotechnol 26, 795-797 (2008a); Huangfu et al., Nat Biotechnol 26, 1269-1275 (2008b); Silva et al., Plos Bio 6, e253. doi: 10.1371/journal. pbio. 0060253 (2008); Lyssiotis et al., PNAS 106, 8912-8917 (2009); Ichida et al., Cell Stem Cell 5, 491-503 (2009); Maherali, N., Hochedlinger, K., Curr Biol 19, 1718-1723 (2009b); Esteban et al., Cell Stem Cell 6, 71-79 (2010); Feng et al., Cell Stem Cell 4, 301-312 (2009)) 다양한 전략이 추구되고 있다. 그러나, 현재의 방법은 산업- 또는 임상-등급 만능세포, 즉, 동종 만능성을 지니는 클론 이식유전자가 없는 만능세포 집단의 제조를 위한 고속대량 용액, 유의한 자발적 분화 없음 및 단일 세포를 이용하여 세포 집단을 배양하고 확장하는 능력, 한정된, 무 이종성, 피더-세포 배양 시스템에서의 효소 계대를 아직 실현하지 못한다.
본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 부분적으로 고-등급 유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 생성에 유용하다. 일 실시형태에서, 비-만능세포는 만능성에 대해 재프로그래밍되고, 만능성을 유지하도록 배양된다. 다른 실시형태에서, iPSC는 기저상태 만능성에 대해 배양된다.
다양한 실시형태에서, 배양 플랫폼은 재프로그래밍의 이식유전자 및/또는 유전체 비삽입형 방법을 가능하게 한다. 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 hiPSC 생성에 필요한 시간 및 노력의 상당한 감소와 함께 고도로 효율적인 에피솜 재프로그래밍을 제공한다. 임의의 특정 이론으로 구속되는 일 없이, 재프로그래밍 과정에서 초기에 분화 신호를 차단하고 특이적 경로(MEK, ERK, TGFβ 및 ROCK)의 소분자 저해를 통해 간엽-대-상피 이행(MET)을 촉진함으로써, FF 및 단일 세포 배양 시스템에서 hiPSC 생성 효율이 에피솜 벡터를 이용할 때 상당히 개선된다는 것을 상정한다.
일 실시형태에서, 배양 플랫폼은 세포에서 내인성 OCT4의 발현을 증가시키는 것을 포함하는 하나 이상의 비-만능세포의 만능성 상태로의 재프로그래밍을 포함한다. 세포에서 내인성 OCT4의 발현은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 또는 OCT4 발현의 소분자 유도물질을 도입함으로써 증가될 수 있다. 일 실시형태에서, OCT4 또는 OCT4 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 세포 내로의 도입은 세포 내 OCT4의 내인성 발현을 유도하기에 충분하다.
일 실시형태에서, 배양 플랫폼은 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC 및 SV40LT로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입하는 것을 포함하는 하나 이상의 비-만능세포의 재프로그래밍을 포함한다. 다른 실시형태에서, 배양 플랫폼은 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 하나 이상의 비-만능세포의 재프로그래밍을 포함한다.
일 실시형태에서, 배양 플랫폼은 OCT4, NANOG, ESRRB, ECAT1 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입하는 것을 포함하는 하나 이상의 비-만능세포의 재프로그래밍을 포함한다. 다른 실시형태에서, 배양 플랫폼은 OCT4, NANOG, ESRRB, ECAT1 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입하는 것을 포함하는 하나 이상의 비-만능세포의 재프로그래밍을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "도입하는"은 세포를 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 소분자와 접촉시키는 단계를 포함하는 과정을 지칭한다. 도입하는 단계는 또한 폴리뉴클레오타이드 또한 폴리펩타이드의 세포 내로의 미세주입, 폴리뉴클레오타이드 또한 폴리펩타이드를 세포 내로 전달하기 위한 리포좀의 사용, 또는 세포 침투성 모이어티에 폴리뉴클레오타이드 또한 폴리펩타이드를 융합시켜 그들을 세포 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 재프로그래밍 인자 중 하나 이상의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 세포를 재프로그래밍하기 위해 비-만능세포 내로 도입될 수 있다. 세포 내로 도입된 각각의 재프로그래밍 인자의 복제수는 본 명세서에 상정된 바와 같은 기저상태 만능성을 달성하는데 적합한 임의의 조합과 동일 또는 상이할 수 있다.
일 실시형태에서, OCT4, SOX2 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택되는 재프로그래밍 인자 중 하나 이상의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 비-만능세포 내로 도입된다.
일 실시형태에서, 각각의 OCT4, SOX2 및 NANOG의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 비-만능세포 내로 도입된다.
일 실시형태에서, 각각의 OCT4 및 SOX2의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 비-만능세포 내로 도입된다.
일 실시형태에서, OCT4의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 비-만능세포 내로 도입된다.
일 실시형태에서, OCT4의 2개의 복제물, SOX2의 2개의 복제물, 및 NANOG의 2개의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 비-만능세포 내로 도입되며, SV40LT는 선택적으로 비-만능세포 내로 도입된다.
다른 실시형태에서, OCT4의 3개 복제물, SOX2의 2개 복제물, NANOG의 하나의 복제물, 및 UTF1의 하나의 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 비-만능세포 내로 도입된다.
다양한 예시적 실시형태에서, 비-만능세포를 재프로그래밍하는 것을 포함하는 배양 플랫폼은 OCT4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 1 내지 5개의 복제물; SOX2를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 1 내지 3개의 복제물, 및 선택적으로, NANOG를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 1 내지 2개의 복제물을 도입하는 것을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 더 큰 폴리뉴클레오타이드의 임의의 조합으로서 세포 내로 도입될 수 있다. 하나의 비제한적 실시예에서, OCT4의 1 내지 4개의 복제물, SOX2의 1 또는 2개의 복제물, 및 NANOG의 1개 복제물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 비-만능 세포 내로 도입된다. 다른 비제한적 예에서, 비-만능세포를 만능성 상태로 재프로그래밍하는 것은 OCT4의 2개 복제물을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드, OCT4의 1개 복제물 및 SOX2의 1개 복제물을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드; 및 OCT4의 1개 복제물, SOX2의 1개 복제물, 및 NANOG의 1개 복제물을 암호화하는 제3 폴리뉴클레오타이드를 비-만능세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 추가 비제한적 예에서, 하나 이상의 비-만능세포를 재프로그래밍하는 것은 OCT4의 2개 복제물을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 OCT4의 1개 복제물, SOX2의 1개 복제물 및 NANOG의 1개 복제물을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 또한 추가 비제한적 예에서, OCT4의 2개 복제물을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 OCT4의 1개 복제물 및 SOX2의 1개 복제물을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입되어 만능세포를 생성한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 재프로그래밍 인자의 임의의 수 및 조합을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단일 벡터는 비-만능세포 내로 도입되고, 세포를 만능성 상태로 재프로그래밍하기에 충분하다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 재프로그래밍 인자의 임의의 수 및 조합을 포함하는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터는 비-만능세포 내로 도입되고, 세포를 만능성 상태로 재프로그래밍하기에 충분하다.
바람직한 실시형태에서, 비-체세포를 재프로그래밍하기 위해 본 명세서에 상정된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하기 위해 사용되며, 세포를 재프로그래밍하기에 충분하다.
가장 바람직한 실시형태에서, 비-체세포를 재프로그래밍하기 위해 본 명세서에 상정된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 에피솜 벡터는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하기 위해 사용되고, 세포를 재프로그래밍하기에 충분하다. 감소된 자발적 분화 및/또는 기저상태를 나타내는 만능세포는 본 명세서에 상정된 바와 같은 에피솜 벡터에 의해 제조될 수 있고, 이어서, 재프로그래밍 인자를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하지 않는 감소된 자발적 분화 및/또는 기저상태를 나타내는 만능세포를 얻기 위한 벡터의 상실까지 배양된다.
이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터가 적어도 2개의 재프로그래밍 인자 또는 재프로그래밍 인자의 적어도 2개의 복제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 때, 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 상정된 각각의 재프로그래밍 인자 사이의 자가-절단 폴리뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 IRES 서열을 포함하는 것이 추가로 상정된다.
일부 양상에서, 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드가 비-만능세포 내로 도입된 후에 하나 이상의 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드의 이소성 발현에 대해 선택됨으로써 비-만능세포를 재프로그래밍하는 효율은 증가된다. 이러한 선택은, 예를 들어, 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 선택가능한 마커에 연결하고, 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드 및 선택가능한 마커를 비-만능세포 내로 도입하고, 선택가능한 마커를 발현시키는 해당 세포를 선택함으로써, 일어날 수 있되, 선택은 마커 및 그의 관련된 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드의 발현이 없는 세포에 비해 증가된 재프로그래밍 효율을 가는 세포를 동정한다. 특정 실시형태에서 당업자는 비-만능세포에 의해 도입된 재프로그래밍 폴리뉴클레오타이드의 발현을 동정하는 임의의 선택가능한 마커가 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
이러한 선택가능한 마커의 하나의 비제한적 예는 퓨로마이신 내성과 같은 항생물질 내성 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 선택가능한 마커는 다음의 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상과 연결될 수 있다: OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1 및 UTF1. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드의 구체적 조합은 다시스트론성 벡터로서 도입되고, 선택가능한 마커는 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드의 특이적 조합에 연결된다. 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드의 구체적 조합은 본 명세서에 개시된 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드의 2 이상의 복제물을 암호화할 수 있다.
하나의 비제한적 실시형태에서, 다시스트론성 벡터는 선택가능한 마커, 예컨대 퓨로마이신 내성을 암호화하는 유전자에 연결된 OCT4 폴리뉴클레오타이드의 2 이상의 복제물을 암호화한다.
일부 양상에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드 및 선택가능한 마커를 암호화하는 다시스트론성 벡터는 하나 이상의 별도의 재프로그래밍 인자 폴리뉴클레오타이드에 추가로 비-만능세포에 도입되되, 선택가능한 마커를 발현시키는 세포에 대한 선택은 선택가능한 마커의 발현이 없는 세포보다 더 큰 재프로그래밍 효율을 갖는 세포 집단을 생성한다.
이 선택 과정의 하나의 비제한적 예에서, OCT4, NANOG 및 SOX2 폴리뉴클레오타이드는 퓨로마이신 내성 유전자에 연결된 OCT4의 2 이상의 복제물을 암호화하는 다시스트론성 벡터에 추가로 비-만능세포에 도입된다. 선택가능한 마커를 발현시키는 비-만능세포의 후속 선택은 선택가능한 마커를 발현시키지 않는 비-만능세포에 비해 더 큰 재프로그래밍 효율을 지니는 비-만능세포를 동정한다. 선택된 세포를 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30% 또는 적어도 40%의 재프로그래밍 효율을 가질 수 있다.
소분자는 종종 특히 바람직한 실시형태의 재프로그래밍 단계에 포함된다. 임의의 특정 이론에 구속되는 일 없이, 다양한 분화 경로의 소분자 저해제를 포함하여 재프로그래밍의 효율 및 역할을 증가시킨다는 것이 상정된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 재프로그래밍 비-만능세포를 포함하는 배양 플랫폼은 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 본 명세서에 상정된 세포 내로 도입하는 것 및 세포를 GSK3 저해제; MEK 저해제; TGFβR 저해제, 및 ROCK 저해제와 접촉시키는 것을 포함한다.
재프로그래밍 효율의 개선은 (1) 만능세포의 재프로그래밍 및 생성에 필요한 시간의 감소(예를 들어, 소분자가 없는 유사 또는 동일한 과정에 비해 적어도 1일까지 만능세포를 생성하는 시간을 단축시킴으로써), 또는 대안적으로, 또는 조합하여, (2) 특정 과정에 의해 생성된 만능세포 수의 증가(예를 들어, 소분자가 없는 유사 또는 동일한 과정에 비해 적어도 10%, 30%, 50%, 100%, 200%, 500% 등만큼 주어진 시간에 재프로그래밍된 세포 수의 증가)에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 효율의 2배 내지 20배 개선이 관찰된다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 효율은 20배 초과만큼 개선된다. 일부 실시형태에서, 효율의 100배 초과의 개선이 소분자 재프로그래밍 제제가 없는 방법에 걸쳐 관찰된다(예를 들어, 생성된 만능세포 수의 100배 초과 증가).
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 본 명세서에 상정된 바와 같은 세포 내로 도입하고, 세포를 GSK3 저해제; MEK 저해제; 및 TGFβR 저해제, 및 선택적으로 ROCK 저해제와 접촉함으로써 비-만능세포를 재프로그래밍하는 것을 포함한다.
일 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 본 명세서에 상정된 바와 같은 세포 내로 도입하고, 세포를 GSK3 저해제; MEK 저해제; TGFβR 저해제, 및 ROCK 저해제와 접촉함으로써 비-만능세포를 재프로그래밍하는 것을 포함한다.
더 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼은 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 본 명세서에 상정된 바와 같은 세포 내로 도입하고, 세포를 GSK3 저해제; MEK 저해제; TGFβR 저해제, 및 ROCK 저해제와 접촉시킴으로써 비-만능세포를 재프로그래밍하는 것을 포함하되, ROCK 저해제는 티아조비빈이다.
그러나, 무 피더-세포에서 그리고 감소된 또는 상당한 자발적 분화가 없는 효소적 계대 배양 시스템에서 만능세포의 장기간 배양을 가능하게 하기 위해, iPSC는 GSK-3 저해제, MEK 저해제, 및 선택적으로 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 세포 배양 배지에서 후속 배양을 필요로 하되, 세포 배양 배지는 본 명세서에 상정된 바와 같은 TGFβ 수용체(TGFβR) 저해제 및 ALK5 저해제를 포함하는 TGFβ/액티빈 신호전달 경로의 저해제를 포함하지 않거나 또는 없다. 임의의 특정 이론에 구속되는 일 없이, TGFβR/ALK5 저해제와 함께 만능세포의 장기간 배양이 배양된 이식유전자가 없는 iPSC의 자발적 분화 및 궁극적으로 기저상태 만능성의 상실을 야기한다는 것이 상정된다.
다양한 실시형태에서, 2 단계 배양 플랫폼은 기저상태 만능성을 포함하는 배양에서의 감소된 자발적 분화를 달성하기 위해 체세포를 안정하게 재프로그래밍하는데 사용된다. 특정 실시형태에서, 비-만능세포는 당업계에 개시된 임의의 적합한 방법에 의해 재프로그래밍되고, 후속적으로, 재프로그래밍된 체세포는 GSK-3 저해제, MEK 저해제, 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 배양물에서 감소된 자발적 분화를 달성하도록 배양되되, 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 없다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍된 체세포는 기저상태 만능세포를 제공하도록 배양된다.
특정 실시형태에서, 비-만능세포는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 재프로그래밍되고, 후속적으로, 재프로그래밍된 체세포는 GSK-3 저해제, MEK 저해제, 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양시킴으로써 안정한 만능성의 기저상태로 배양되되, 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 없다.
일부 실시형태에서, 비-만능세포는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입함으로써 그리고 GSK-3 저해제, MEK 저해제, Rho 키나제(ROCK) 저해제, 및 TGFβR/ALK5 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양시킴으로써 재프로그래밍되고, 후속적으로 재프로그래밍된 체세포는 GSK-3 저해제, MEK 저해제, 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양시킴으로써 감소된 자발적 분화를 지니는 세포를 제공하도록 배양되되, 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 없다.
일부 실시형태에서, 비-만능세포는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입함으로써, 그리고 GSK-3 저해제, MEK 저해제, Rho 키나제(ROCK) 저해제, 및 TGFβR/ALK5 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양시킴으로써 재프로그래밍되고, 후속적으로, 재프로그래밍된 체세포는 GSK-3 저해제, MEK 저해제, 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양시킴으로써 안정한 만능성의 기저상태로 배양되되, 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 없다.
바람직한 실시형태에서, 비-만능세포는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입함으로써, 그리고 GSK-3 저해제, MEK 저해제, Rho 키나제(ROCK) 저해제, 및 TGFβR/ALK5 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양시킴으로써 재프로그래밍되고, 후속적으로, 재프로그래밍된 체세포는 GSK-3 저해제, MEK 저해제, 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양시킴으로써 안정한 만능성의 기저상태로 배양되되, 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 없고, 재프로그래밍 이식유전자의 상당한 잔여 발현이 없다.
일 실시형태에서, 비-만능세포는 본 명세서에 개시된 바와 같은 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입함으로써, 그리고 GSK-3 저해제, MEK 저해제, Rho 키나제(ROCK) 저해제, 및 TGFβR/ALK5 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양시킴으로써 재프로그래밍되며, 후속적으로, 재프로그래밍된 체세포는 GSK-3 저해제, MEK 저해제, 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 배양되되, 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 없다.
바람직한 실시형태에서, 비-만능세포는 본 명세서에 개시된 바와 같은 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1 및 UTF1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 도입함으로써 그리고 GSK-3 저해제, MEK 저해제, Rho 키나제(ROCK) 저해제, 및 TGFβR/ALK5 저해제를 포함하는 배지에서 세포를 배양시킴으로써 재프로그래밍되며, 후속적으로, 재프로그래밍된 체세포는 GSK-3 저해제, MEK 저해제, 및 Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함하는 배지에서 배양되되, Rock 저해제는 티아조비빈이고, 배지는 TGFβR/ALK5 저해제가 없다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 배양 플랫폼을 이용하여 감소된 자발적 분화를 지니는 만능세포 및/또는 기저상태 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 제조하는 방법이 제공된다.
특정 실시형태에서, 감소된 자발적 분화를 지니는 만능세포 및/또는 기저상태 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 하나 이상의 비-만능성 또는 부분적으로 만능 줄기 세포를 포함하는 출발 물질을 이용하고, TGFβR 저해제를 포함하지 않는 배양 배지에서 하나 이상의 만능성 또는 부분적으로-만능 줄기 세포를 배양시켜서 제조된다. 출발 물질은 얻어지거나 또는 생성될 수 있다. 예를 들어, 비-만능성 또는 부분적으로 만능 줄기 세포는 상업적 공급업자 또는 다른 공급원으로부터 제공될 수 있거나, 드노보(de novo)로 얻을 수 있다: 비-만능세포는 또한 조직 또는 기관으로부터 단리될 수 있고; 부분적으로 만능세포는 또한 재프로그래밍 체세포 또는 성체 줄기 세포에 의해 생성될 수 있었다. 일부 실시형태에서, 만능성 배아 줄기 세포, 또는 체세포 핵치환술(somatic nuclear transfer)에 의해 얻은 만능세포는 본 명세서에 기재된 배양 배지 및 플랫폼을 이용하여 기저상태 만능성을 달성하도록 유도될 수 있다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 IPSC의 집단은 재프로그래밍된 체세포 또는 재프로그래밍된 성체 줄기 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, IPSC는 상기 방법을 수행함으로써 또는 상기 방법에 의해 생성된 IPSC를 얻음으로써 임의의 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다.
IPSC를 생성하는 예시적인 방법은 비-만능세포에서 내인성 OCT4의 발현을 증가시키는 단계; 선택적으로 하나 이상의 복제물에서 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1 및 UTF1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입하는 단계; 또는 선택적으로 하나 이상의 복제물에서, OCT4, SOX2 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 비-만능세포 내로 도입하는 단계를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. IPSC를 생성하는 방법은 하나 이상의 비-만능세포 또는 부분적으로 만능세포를 GSK3 저해제; MEK 저해제; 및 TGFβR 저해제, 및 선택적으로 ROCK 저해제와 접촉시켜 하나 이상의 iPSC를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 GSK3 저해제; MEK 저해제; 및 ROCK 저해제를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 세포 배양 배지는 GSK3 저해제; MEK 저해제; 및 ROCK 저해제를 포함하되, ROCK 저해제는 티아조비빈이다.
특정 실시형태에서, 세포 배양 배지에서 하나 이상의 만능세포, 예를 들어, IPSC를 배양시키는 단계는 만능성의 기저상태, 생존도, 정상 핵형, 게놈 안정성, 및 적어도 5회 계대, 적어도 10회 계대, 적어도 50회 계대, 적어도 100회 계대, 또는 그 이상(임의의 그 사이에 있는 계대 수를 포함함)에 대해 유지될 수 있는 자발적 분화의 감소된 비율을 유지 또는 유도한다.
F. 만능세포의 특성규명
본 명세서에 상정된 배양 플랫폼을 이용하여 제조된 만능세포는, 예를 들어, 감소된 자발적 분화를 지니는 기저상태 만능세포 또는 만능세포를 포함하는 만능세포 산물의 선택 또는 확인을 추가로 포함할 수 있다. 만능세포는 본 명세서에 상정된 조성물 및 방법을 이용하는 재프로그래밍 및 후속적 배양 후에, 또는 만능 세포가 재프로그래밍되지 않았다면, 만능 세포가 본 명세서에 상정된 배양 방법으로 이행된 후에 선택 및/또는 확인될 수 있다. 세포의 만능성은 만능성과 관련된 적절하고 검출가능한 형태, 분자 및/또는 생화학적 변화에 기반하여 특성규명되고/되거나 선택될 수 있다.
모니터링될 수 있는 세포 만능성의 구체적 특징은 별도로 또는 조합하여 세포 효능을 평가함에 있어서, 유전자 발현, 메틸화, 및 생체내 및 시험관내 특징, 예컨대: i) 둥근 만능 줄기 세포 형태; ii) SSEA3/4(인간 만능 줄기 세포); TRA1-60/81; TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30, SSEA5, CD90 및/또는 CD50, 및 앞서 언급한 것들의 조합을 포함하는 만능 줄기 세포 마커의 발현; iii) 만능 줄기 세포의 기형종 형성; iv) 배아체의 형성 및 시험관내 다분화능: 및 v) 불활성 X 염색체 재활성화를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 임의의 상기 특징의 서브세트는 세포 효능을 모니터링하기 위해 사용된다. 일 실시형태에서, 만능세포는 둥근 콜로니 형태, SSEA4, TRA1-81, 및 OCT4의 발현, 및 배아체 및 기형종을 형성하는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다.
다른 실시형태에서, 시험관내 배양에서 감소된 자발적 분화를 갖는 만능세포는 TGFβR 저해제의 존재 하에 배양된 만능세포에 비해 다음의 분화 마커 유전자 중 하나 이상의 발현에서 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 감소를 포함하는 유전자 발현 서명에 의해 동정될 수 있다: FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(단미증) 및 ZIC1.
일 실시형태에서, 감소된 자발적 분화를 갖는 만능세포는 T 유전자, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 및 TUJ1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 분화 마커 유전자의 감소된 발현을 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 감소된 자발적 분화를 갖는 만능세포는 TGFβR 저해제의 존재 하에 배양된 만능세포에 비해 하나 이상의 분화 마커 유전자(예를 들어, T 유전자, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2, TUJ1)의 발현에서 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 감소를 포함하는 유전자 발현 서명에 의해 동정될 수 있다. [다른 특정 실시형태에서, 감소된 자발적 분화를 갖는 만능세포는 하나 이상의 분화 마커 유전자(예를 들어, T 유전자, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2, TUJ1)의 발현에서 적어도 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 감소를 포함하는 유전자 발현 서명에 의해 동정될 수 있다.
특정 실시형태에서, 기저상태 만능세포는 상당히 억제된 Xist 발현 및 분화된 세포, 예를 들어, Foxa2, Sox17, 및 단미증의 초기 마커의 발현을 가지는 반면, 전통적인 배양된 만능세포는 Xist 발현 및 초기 분화 마커의 상당한 발현의 보통의 억제만을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 기저상태 만능세포는 다중 세포 계대, 예를 들어, 적어도 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20회 이상의 계대에 대해 기저상태 만능성 특징을 보유한다.
G. 폴리뉴클레오타이드
다양한 예시적 실시형태에서, 본 발명은 부분적으로, 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 융합 폴리펩타이드, 및 이들을 포함하는 조성물을 상정한다. 다양한 다른 예시적 실시형태에서, 본 발명은 부분적으로 적어도 하나의 재프로그래밍 인자의 하나 이상의 복제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 지니는 비-만능세포를 재프로그래밍하는 것을 상정한다. 본 명세서에 기재된 배양 플랫폼과 함께 사용하기 위한 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1 및 UTF1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 제시된 바와 같은 재프로그래밍 인자의 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "유전자"는 인핸서, 프로모터, 인트론, 엑손 등을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 용어 "유전자"는 폴리뉴클레오타이드 서열이 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 서열과 동일한지의 여부와 상관없이, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 천연 유래 상태에서 그것에 측접하는 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 단편에 정상적으로 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 상보적 DNA(cDNA), 재조합 DNA 또는 천연에서 존재하지 않고 사람의 손에 의해 만들어진 다른 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 거대 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 벡터 내에서 임의의 적합한 순서로 배열될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 벡터는 에피솜 벡터이다.
암호 서열 그 자체의 길이에도 불구하고, 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드는 그들의 전체 길이가 상당히 다를 수 있도록, 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같은 또는 당업계에 공지된 바와 같은 다른 DNA 서열, 예컨대 발현 제어 서열, 프로모터 및/또는 인핸서, 비번역 영역(UTR), 코작 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 재조합효소 인식 부위(예를 들어, LoxP, FRT 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 신호 및 자기-절단 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 에피토프 태그와 조합될 수 있다. 따라서, 총 길이가 제조의 용이함 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 사용에 의해 바람직하게 제한되는 거의 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이 사용될 수 있다는 것이 상정된다.
폴리뉴클레오타이드는 당업계에서 공지되고 이용가능한 임의의 다양한 잘 확립된 기법을 이용하여 제조, 조작 및/또는 발현될 수 있다. 목적으로 하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적절한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 자율적 복제 서열, 및 전위 요소이다. 추가적인 예시적 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome: YAC), 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome: BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체(P1-derived artificial chromosome: PAC), 박테리오파지, 예컨대 람다 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 벡터로서 유용한 동물 바이러스 범주의 예는 레트로바이러스(렌티바이러스를 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순포진바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 파필로마바이러스 및 파포바이러스(예를 들어, SV40)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 발현 벡터의 예는 포유류 세포에서 발현을 위한 pClneo 벡터(프로메가(Promega)); 포유류 세포에서 렌티바이러스-매개 유전자 전달 및 발현을 위한 pLenti4/V5-DEST(상표명), pLenti6/V5-DEST(상표명), 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ(인비트로젠(Invitrogen))이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 암호 서열은 포유류 세포에서 폴리펩타이드의 발현을 위해 이러한 발현 벡터 내로 결찰될 수 있다.
특정 실시형태에서, 벡터는 염색체 외에서 유지된 에피솜 벡터 또는 벡터이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "에피솜"은 숙주의 염색체 DNA 내로의 결찰 없이 그리고 분화 숙주 세포로부터의 점진적 상실 없이 복제할 수 있는 벡터를 지칭하며, 또한 상기 벡터가 염색체 외로 또는 에피솜으로 복제한다는 것을 의미한다. 벡터는 림프친화 헤르페스 바이러스 또는 감마 헤르페스바이러스, 아데노바이러스, SV40, 소 유두종 바이러스, 또는 효모로부터의 DNA 복제 기점 또는 "ori", 구체적으로는 림프친화 헤르페스 바이러스의 복제기점 또는 EBV의 oriP에 대응하는 감마 헤르페스바이러스에 대한 서열 암호를 보유하도록 공학처리된다. 특정 양상에서, 림프구향성 헤르페스 바이러스는 엡스타인 바르 바이러스(EBV), 카포시 육종 헤르페스 바이러스(KSHV), 헤르페스 바이러스 사이미리(HS) 또는 마렉병 바이러스(MDV)일 수 있다. 엡스타인 바르 바이러스(EBV) 및 카포시 육종 헤르페스 바이러스(KSHV)는 또한 감마 헤르페스바이러스의 예이다. 전형적으로, 숙주 세포는 복제를 활성화하는 바이러스 복제 트랜스작용인자 단백질을 포함한다.
발현 벡터에 존재하는 "발현 제어 서열", "제어 요소" 또는 "조절 서열"은 벡터-복제기점의 해당되는 비-번역 영역, 선택 카세트, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(사인-달가르노(Shine Dalgarno) 서열 또는 코작(Kozak) 서열) 인트론, 폴리아데닐화 서열, 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주세포와 상호작용하는 5' 및 3' 비번역 영역이다. 이러한 요소는 그들의 강도 및 특이성이 다를 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라서, 흔한 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함하는 다수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다.
용어 "작동가능하게 결합된"은 기재된 성분이 그들을 의도된 방식으로 작동하게 하는 관계에 있는 접합위치를 지칭한다. 일 실시형태에서, 상기 용어는 발현 제어 서열(예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서)와 제2 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하되, 발현 제어 서열은 제2 서열에 대응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본 발명의 특정 실시형태에서 사용하는데 적합한 예시적인 흔한 발현 제어 서열은 사이토메갈로바이러스(CMV) 급속 초기 프로모터, 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 전기 또는 후기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순 헤르페스 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터, H5, P7.5, 및 백시니아 바이러스로부터의 P11 프로모터, 신장 인자 1-알파 (EF1a) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세르알데하이드 3-인산염 탈수소효소(GAPDH), 진핵생물 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열 충격 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열 충격 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1), 열 충격 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 좌위(Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세르산 키나제-1(PGK) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터, 및 β-액틴 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
유도성 프로모터/시스템의 예시적인 예는 스테로이드-유도성 프로모터, 예컨대 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체(대응하는 호르몬에 의한 처리에 의한 유도성)를 암호화하는 유전자에 대한 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속에 의한 처리에 의한 유도성), MX-1 프로모터(인터페론에 의한 유도성), "젠스위치(GeneSwitch)" 미페프리스톤-조절 시스템(Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), 쿠메이트 유도성 유전자 스위치(WO 2002/088346), 테트라사이클린-의존적 조절 시스템 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
조건 발현은 또한 부위 특이적 DNA 재조합효소에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 폴리뉴클레오타이드는 부위 특이적 재조합효소에 의해 매개된 재조합을 위한 적어도 하나의(전형적으로 2개의) 부위(들)를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합효소" 또는 "부위 특이적 재조합효소"는 야생형 단백질(문헌[Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)] 참조) 또는 이들의 돌연변이체, 유도체(예를 들어 재조합 단백질 서열 또는 이의 단편을 함유하는 융합 단백질), 단편 및 변이체일 수 있는, 하나 이상의 재조합 부위(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)를 수반하는 재조합 반응에 연루된 절단 또는 통합 단백질, 효소, 보조인자 또는 관련된 단백질을 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태에서 사용하는데 적합한 재조합효소의 예시적인 예는 Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 레솔바제(resolvase), TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 및 ParA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 각각 복수의 폴리펩타이드의 효율적인 번역을 달성하기 위해, 폴리뉴클레오타이드 서열은 자기-절단 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 IRES 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 분리될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "내부 리보솜 유입 부위" 또는 "IRES"는 시스트론(단백질 암호화 영역)의 ATG와 같은 개시 코돈에 대한 직접적 내부 리보솜 유입을 촉진시킴으로써, 유전자의 캡-의존적 번역을 야기하는 요소를 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) 및 Jackson and Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000] 참조. 일반적으로 당업자에 의해 사용되는 IRES의 예는 미국 특허 제6,692,736호에 기재된 것을 포함한다. 당업계에 공지된 "IRES"의 추가적인 예는 피코로나바이러스로부터 얻을 수 있는 IRES를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Jackson et al., 1990).
H. 폴리펩타이드
본 발명은 부분적으로 폴리펩타이드, 융합 폴리펩타이드, 및 폴리펩타이드를 발현시키는 벡터를 포함하는 조성물을 상정한다. 바람직한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. "폴리펩타이드", "폴리펩타이드 단편", "펩타이드" 및 "단백질"은 상호호환적으로 사용되고, 달리 대조적으로 구체화되지 않는 한, 전통적인 의미에 따라, 즉, 아미노산 서열로서 사용된다. 일 실시형태에서, "폴리펩타이드"는 융합 폴리펩타이드 및 다른 변이체를 포함한다. 폴리펩타이드는 임의의 다수의 잘 공지된 재조합체 및/또는 합성 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 폴리펩타이드는 구체적 길이로 제한되지 않으며, 예를 들어, 그들은 전장 단백질 서열, 전장 단백질의 단편, 또는 융합 단백질을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드의 번역 후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형(천연 유래와 비천연 유래 둘 다)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "단리된 펩타이드" 또는 "단리된 폴리펩타이드" 등은 세포 환경으로부터 그리고 세포의 다른 성분과의 회합으로부터의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자의 시험관내 단리 및/또는 정제를 지칭하며, 즉, 생체내 물질과 상당하게 관련되지 않는다.
일 실시형태에서, 2 이상의 폴리펩타이드의 발현이 요망되는 경우, 그들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 명세서의 다른 곳에 논의되는 바와 같은 IRES 서열에 의해 분리될 수 있다. 다른 실시형태에서, 2 이상의 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 각각의 폴리펩타이드 사이의 폴리펩타이드 절단 신호를 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 추가로, 폴리펩타이드 부위는 임의의 링커 펩타이드 서열 내로 더해질 수 있다. 예시적인 폴리펩타이드 절단 신호는 폴리펩타이드 절단 인식 부위, 예컨대 프로테아제 절단 부위, 뉴클레아제 절단 부위(예를 들어, 희귀 제한 효소 인식 부위, 자기 절단 리보자임 인식 부위), 및 자기-절단 바이러스 올리고펩타이드를 포함한다(문헌[deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26] 참조).
적합한 프로테아제 절단 부위 및 자기-절단 펩타이드는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594] 참조). 예시적인 프로테아제 절단 부위는 포티바이러스 NIa 프로테아제(예를 들어, 담배 식각 바이러스 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1(P35) 프로테아제, 비오바이러스(byovirus) NIa 프로테아제, 비오바이러스 RNA-2-암호화된 프로테아제, 아프타바이러스 L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 피코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스 24K 프로테아제, RTSV(벼 퉁그로 구형바이러스) 3C-유사 프로테아제, PYVF(파스닙 황색 얼룩 바이러스(parsnip yellow fleck virus)) 3C-유사 프로테아제, 헤파린, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나제의 절단 부위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 높은 절단 엄격함에 기인하여, TEV(담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 부위, 일 실시형태에서, 예를 들어, EXXYXQ(G/S)(서열번호 29), 예를 들어, ENLYFQG(서열번호 30) 및 ENLYFQS(서열번호 31)가 바람직하되, X는 임의의 아미노산을 나타낸다(TEV에 의한 절단은 Q와 G 또는 Q와 S 사이에서 일어난다).
특정 실시형태에서, 자가-절단 폴리펩타이드 부위는 2A 또는 2A-유사 부위, 서열 또는 도메인을 포함한다(Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041). 특정 실시형태에서, 바이러스 2A 펩타이드는 아프타바이러스 2A 펩타이드, 포티바이러스 2A 펩타이드 또는 카디오바이러스 2A 펩타이드이다.
일 실시형태에서, 바이러스 2A 펩타이드는 구제역 바이러스(FMDV) 2A 펩타이드, 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A 펩타이드, 토세아 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus)(TaV) 2A 펩타이드, 돼지 테스코바이러스-1(PTV-1) 2A 펩타이드, 테일로바이러스 2A 펩타이드 및 뇌척수 심근염 바이러스 2A 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Figure 112016094741062-pct00002
바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터는 각각의 재프로그래밍 인자 사이에 하나 이상의 동일 또는 상이한 프로테아제 절단 부위를 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 출원 및 발행된 특허는 각각의 개개 간행물, 특허 출원 또는 발행된 특허가 참고로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 같이 본 명세서에 참고로 포함된다.
앞서 언급한 발명이 이해의 명확함의 목적을 위해 예시 및 실시예의 방법에 의해 일부 상세하게 기재되었지만, 특정 변화 및 변형이 첨부되는 청구범위의 정신 또는 범주로부터 벗어나는 일 없이 그에 대해 이루어질 수 있다는 것은 본 발명의 교시에 비추어 당업자에게 용이하게 명확할 것이다. 다음의 실시예는 단지 예시의 방법에 의해 그리고 제한의 방법에 의하지 않고 제공된다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 수득하기 위해 변화 또는 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 매개변수를 용이하게 인식할 것이다.
실시예
본 명세서에 개시된 실시예는 단계 특이적 배지 조성물에서 소분자 경로 저해지를 이용하는 hiPSC의 빠른 병행 생성, 선택 및 확장을 위한 플랫폼을 동정하였다. 플랫폼은 완전 무 피더 환경에서 최소 재프로그래밍 인자를 이용하는 효율적이고 촉진된 에피솜 재프로그래밍을 지지하였다. 얻어진 hiPSC는 단일 세포로서 용이하게 배양 및 확장되는 한편 균일하고 게놈적으로 안정한 만능성 집단을 유지하는 이식유전자가 없었다. 실시예에서 상정된 배지 조성물에서 생성 또는 유지되는 hiPSC는 만능성의 기저상태와 관련된 특성을 나타내며, 균일한 산업- 또는 임상-등급 hiPSC의 제조를 위한 강한 고속대량 시스템을 나타낸다.
실시예 1
iPSC의 장기간 유지 및 확장을 위한 배지 플랫폼의 동정
개요
SMC4-보충 배양물에서 대다수의 렌티바이러스-유래 hiPSC 계통은 비분화세포의 동종 집단을 유지하지만; 그러나, 계통의 서브세트에서 이식유전자 재프로그래밍 인자의 침묵은 연장된 배양에서 다양한 정도의 자발적 분화를 나타내었다(도 1a 및 도 1b). 따라서, 잔여 이식유전자 발현과 상관없이, 연속 FF 배양 및 단일 세포 효소 계대 동안 만능성 유지를 위한 조건을 동정하기 위해 다양한 세포 배양 성분을 평가하였다. 재프로그래밍 및 유지 과정의 상이한 단계에서 독특한 경로를 표적화하는 다단계 배양 시스템을 hiPSC 생성에 대한 효율적이고 강한 접근으로서 동정하였다.
결과
장기간 유지 동안 TGFβ 경로의 저해를 침묵 이식유전자 발현을 지니는 hiPSC 계통의 자발적 분화에서 상당한 인자로서 동정하였다(도 1c). 자발적 분화를 겪는 것으로 발견된 iPSC 세포주 중 하나는 새로운 배지 제형인 운명 유지 배지(FMM)에서의 배양으로 이행되었다(표 1). 자발적 분화를 제거하고 나서 SSEA4/TRA1-81 양성 세포의 균일한 집단을 2 내지 3회 계대 내에서 확립하였다(도 1a).
전통적인 배양(MEF 피더 세포 상의 hESC 배지), FF 배양에서 SMC4-보충 배지 또는 FF 배양에서 새로 제형화된 FMM에서의 OCT4/KLF4/SOX2(OKS) 렌티바이러스 재프로그래밍(도 1d)을 또한 비교하였다. 렌티바이러스 재프로그래밍의 유도 17일 후에, SSEA4/TRA1-81 양성 세포를 FAC에 의해 선택하고 나서, 비교를 위해 SMC4 또는 FMM 중 하나에서 재플레이팅하였다(도 1d). SMC4는 재프로그래밍의 역학을 개선시켰고, 유도 17일 후에 FMM에 의해 재프로그래밍보다 상당히 더 많은 SSEA4/TRA1-81 양성 세포를 초래하였다(FMM에 대해 2.72% 대 0.76% 및 전통적인 배양에 대해 0.10%; 도 1d).
초기 분류 후에, 그들의 각각의 조건에서 10일 동안 유지시킨 다음, 제2 SSEA4/TRA1-81 양성 유세포 분석 선택이 이어졌다(도 1d). 추가 9일 동안(감염 후 총 36일) 배양을 유지하고 나서, OCT4 및 NANOG 공동 발현에 기반하여 비분화 콜로니에 대해 스코어링하였다(도 1d 및 도 1e). SMC4에서 초기 재프로그래밍 다음에 FMM에 대한 이행의 조합은 궁극적으로 SMC4에서의 지속적 유지에 비해 더 많은 OCT4/NANOG 양성 콜로니 및 상당히 감소된 수의 OCT4/NANOG 음성 콜로니를 초래하였다(도 1d 및 도 1e). OCT4/NANOG 양성 콜로니가 FMM에서 배타적으로 유지된 배양물에서 검출되었지만, 콜로니의 수 및 크기는 단계-특이적 배지 접근보다 낮게 나타났다.
이들 결과는 상이한 단계의 재프로그래밍 및 유지 과정에서 독특한 경로를 표적화하는 신규한 다단계 배양 시스템이 고품질 hiPSC의 효율적인 제조를 초래하였다는 것을 나타낸다.
실시예 2
단일 세포 계대 및 FF 형식에서 무 이식유전자 hiPSC의 제조를 위한 플랫폼
개요
에피솜 벡터 시스템을 이용하는 비-통합적 재프로그래밍 방법의 효율은 특히 FF 환경에서 극도로 낮다(0.001% 미만)(Narsinh et al., 2011; O'Doherty et al., 2013). 에피솜-유도를 2개의 배지를 포함하는 다단계 배양 시스템에서 시험하였다: SMC4를 함유하는 운명 재프로그래밍 배지(FRM) 및 재프로그래밍 및 FMM을 개선시키는 것으로 나타난 배지 첨가물(도 2a 및 표 1).
결과
유전자 조합 OCT4/SOX2/NANOG/KLF4/LIN28/MYC/SV40LT(OSNKLMT)로 이루어진 에피솜 발현 시스템을 사용하여 다양한 섬유아세포를 형질감염시켰다. 에피솜 발현 유도 24시간 후에, 재프로그래밍 배양을 FRM으로 이행하여 재프로그래밍 역학을 향상시킨다. 처음 1주 내에 초기 콜로니 형성을 관찰하였고, 10일까지 SSEA4/TRA1-81 양성 세포의 거대 집단을 검출하였다(1% 초과)(도 8a 및 도 8b). 제14일에, FRM에 의해 지지된 재프로그래밍 배양을 FRM 또는 FMM 배지로 분할하였다. 제21일에, FACS를 사용하여 배양물 내 SSEA4/TRA1-81/CD30 양성 세포를 동정하였다(도 8c). FRM 유지 배양물은 분화세포와 비분화세포를 둘 다 함유한 반면, FMM 배양물은 대부분 비분화세포를 함유하였다(도 8d).
이 접근의 처리량 및 강인성을 상이한 연령, 성별 및 민족성의 공여체로부터의 탯줄 제대혈로부터 확장한 섬유아세포 및 CD34+ 세포를 이용하여 시험하였다(도 9a 및 도 9b). 체세포 재프로그래밍을 에피솜 유전자 조합 세트 OSNKLMT를 이용하여 도 2a에 약술한 바와 같이 유도하고 나서, 96-웰 플레이트 유세포 분석을 제16일과 제21일 사이에 개개 hiPSC에 대해 분류하였다(도 2b). SSEA4/TRA1-81/CD30 양성 세포의 거대 집단을 시험한 대다수의 계통에 대해 관찰하였다. 전통적인 배지 및 피더 세포를 이용하는 병행 재프로그래밍 실험에 비하여, FRM 및 FMM 배지 시스템은 hiPSC 클론수의 상당한 증가를 초래하였다(FTC007 섬유아세포 계통에 대대 FRM/FMM에서 8.55% 대 전통적인 배양에서 0.02%; 도 2b 및 도 2c). SMC4 배지를 이용하는 렌티바이러스 재프로그래밍에 대해 다루기 힘든 것으로 이전에 관찰된 섬유아세포 FTC008을 포함하는 각각의 체세포 계통에 대해 96웰 플레이트 당 평균적으로 22개의 클론 hiPSC가 보였다(도 2b, 도 10a 및 도 10b). 콜로니를 후속적으로 NANOG에 대한 세포내 및 표면 마커 발현 및 직접 qRTPCR의 분석에 의해 진정한 hiPSC 클론으로서 확인하였다(도 2d, 도 2e 및 도 10c). 96-웰 분류 및 선택 과정을 이용하는 재프로그래밍의 효율이 또한 증가되었다(도 2e). 유사한 재프로그래밍 효율을 또한 한정된 표면 코팅 비트로넥틴을 이용하여 관찰하였다(도 10d).
이들 데이터는 에피솜 재프로그래밍에 적용될 때 플랫폼이 강하고 재현할 수 있으며, 다중 재프그래밍 실험이 최소의 노력으로 iPSC 최종 산물의 품질을 손상시키는 일 없이 고속 대량 방식으로 병행해서 수행되게 한다는 것을 나타내었다.
실시예 3
FMM에서 무 이식유전자 hiPSC 계통의 장기간 계대 및 확장
개요
FRM 및 FMM의 다단계 배지 플랫폼을 이용하는 hiPSC의 장기간 계대 및 확장을 실시예 2로부터 hiPSC 클론을 이용하여 연구하였고, FF 배양에서 단일 세포로서 확장하였다(도 3a 및 도 3b).
결과
실시예 2에 따라 재프로그래밍된 hiPSC 계통은 계대 4 내지 7까지 에피솜 DNA를 상실하였고, 따라서, 이식유전자-기반 재프로그래밍 인자와 독립적으로 만능성이다(도 3c). hiPSC 계통은 SSEA4, TRA1-81, OCT4 및 NANOG에 대해 비분화세포 양성의 동종성 집단을 유지하였다. 게다가, 이들 계통은 만능성 배양에서 통상적으로 이용하는(도 3d 및 도 3e) 임의의 세정 전략없이 만능성 특징을 유지하였다(도 3f). 일상적인 단일 세포 계대 배양 동안 매트리겔을 한정된 표면 코팅 비트로넥틴으로 대체할 때 균일한 hiPSC 배양의 유사한 확장을 관찰하였다(도 S10e 내지 도 10g).
FF 환경에서 단일 세포로서 배양한 hESC 및 hiPSC 계통에서 종종 게놈 이상이 검출된다(Laurent et al., 2011; Taapken et al., 2011). 모든 분석된 hiPSC 계통의 핵형 분석은 FMM 배양에서 게놈 안정성을 입증하였다(도 4a). 추가로, 단일 세포 및 FF는 장기간(25 내지 30회 계대) 동안 FMM에서 유지된 hiPSC 클론을 배양하였고, 배양 세정 또는 선택에 대한 필요 없이 그들의 비분화 프로파일 및 게놈 안성성을 유지하는 것을 계속하였다(도 4b).
FMM에서 유지한 에피솜-유래 hiPSC 클론은 또한 배아체를 통한 시험관내 분화, 및 기형종 형성에 의한 생체내 분화에서 모두 3가지 체세포 계통을 용이하게 생기게 하였다(도 4c 내지 도 4e).
이들 데이터는 FRM 및 FMM 다단계 배지 플랫폼이 무 이식유전자 hiPSC 클론가 FF 및 단일 세포 효소 계대에서 용이하게 생성 및 확장하는 한편 만능성 및 게놈적으로 안정한 세포의 동종 집단을 유지하게 할 수 있다는 것을 입증하였다.
실시예 4
다단계 배지 플랫폼은 최소 유전자를 지니는 에피솜 재프로그래밍을 가능하게 한다
개요
발암유전자, 예컨대 KLF4, MYC 및 LIN28에 대한 감소된 의존도 또는 재프로그래밍 과정에서 넉다운(knockdown) P53에 대한 필요를 지니는 효율적인 유전체 비삽입형 발현 시스템은 만능 줄기 세포 요법에 대해 큰 가치를 가질 것이다(Lee et al., 2013; Okita et al., 2011; Yu et al., 2009). 다단계 배지 플랫폼은 OSNKLMT 재프로그래밍 인자를 이용하는 무 이식유전자 hiPSC 세포의 생성 및 확장에 대해 극도로 효율적이고 강한 플랫폼을 입증하였기 때문에, 플랫폼의 강인성을 재프로그래밍 인자에 대한 필요에 대해 측정하였다.
결과
유전자 발현 조합 및 투약량을 변화시키는 시도에서 OCT4/NANOG/SOX2(ONS), OCT4/SOX2(OS) 또는 OCT4/OCT4(2xO)를 포함하는 최소 유전자 세트를 함유하는 몇몇 에피솜-발현 카세트를 수행하였다(도 5a). 섬유아세포 세포주를 OCT4, NANOG, SOX2 및 SV40LT의 조합을 이용하여 형질감염시키고, FRM/FMM 플랫폼을 이용하여 배양시켰다. SV40LT 단독은 재프로그래밍의 제13일에 임의의 진정한 SSEA4/TRA1-81 양성 세포를 생성하지 않지만, 형질감염 후 세포 생존을 개선시켰다(도 5b 및 도 11a). 다양한 재프로그래밍 인자 조합은 재프로그래밍 과정에서 초기에 SSEA4/TRA1-81 양성 집단의 발생에 의해 입증되는 바와 같이 효율적인 재프로그래밍을 초래하였다(OCT4/SOX2/SV40LT에 대해 0.5% 초과 및 제13일에 OCT4/NANOG/SOX2/SV40LT에 대해 3.5% 초과; 도 5b). 추가 일수 동안 재프로그래밍된 배양은 SSEA4/TRA1-81 양성 집단을 상당히 증가시켰다(제16일까지 OCT4/SOX2/SV40LT에 대해 4.0% 초과; 도 11b). 놀랍게도, 관찰한 재프로그래밍된 세포의 백분율은 발암유전자 KLF4 및 MYC를 함유하는 렌티바이러스 및 에피솜-유도 시스템과 비슷하였다(도 2b, 도 5b 및 도 11b).
몇몇 재프로그래밍 인자 조합을 차기로 넘기고, 개개 hiPSC 클론의 유세포 분석 분류 및 선택 전에 FMM으로 이행하였다. OSNKLMT 에피솜 재프로그래밍과 유사하게, 클론의 hiPSC 계통은 최소 유전자 OCT4, SOX2 및 SV40LT(2xO + OS + T)뿐만 아니라 다른 조합을 함유하는 조합으로부터 용이하게 유래되었다(도 5c). 계대 5 내지 7까지 이식유전자 및 에피솜 벡터 마커를 상실한 hiPSC 클론을 추가 분석을 위해 차기로 넘겼다(도 5d). 선택한 클론을 FF 환경에서 단일 세포로서 지속적으로 계대시키고, 게놈적으로 안정한 비분화세포의 동종 집단을 유지하였으며, 3가지 체세포 계통으로 효율적으로 분화하는 능력을 나타내었다(도 5e 내지 도 5j).
종합적으로, 이들 데이터는 hiPSC가 FRM/FMM, 유세포 분석-기반 재프로그래밍 플랫폼에서 최소 재프로그래밍 유전자의 일시적 발현에 의해 용이하게 생성되었다는 것을 나타내었다.
실시예 5
FMM 플랫폼은 기저상태 만능성을 지지한다
개요
FMM 플랫폼을 추가로 평가하기 위해, 현재의 방법에 의해 재프로그래밍된 체세포의 유전자 발현 특징을 본 명세서에 상정된 FMM 플랫폼을 이용하여 재프로그래밍된 체세포의 유전자 발현 특징과 비교하였다. 소분자와 통상적으로 유지되는 hiPSC 배양 사이의 유전자 발현 차이(Hanna et al., 2010b; Saha and Jaenisch, 2009)를 평가하였다.
결과
실험의 일 세트에서, 소분자 간의 유전자 발현 패턴을 매개하였고, 전통적인 배양을 평가하였다. 렌티바이러스-유도 hiPSC 클론 FTi111을 생성하고 소분자 배양에서 유지하였으며, 만능성이 되는 것을 나타내었다. 클론을 i) 피더 세포를 지니는 전통적인 배지 및 ii) 피더 세포를 지니는 또는 FF 표면 상의 소분자 저해제-함유 배지를 포함하는 다양한 배양 환경 내로 직접 해동시켰다(도 12a 및 도 12b). 전통적인 배양에서 hiPSC 콜로니를 단지 ROCK 저해제인 티아조비빈의 존재 하에 회수하였고, 후속적으로 회수된 세포를 클럼프 배양으로 전환시켰다(도 12b 및 도 12c). 배양 조건의 각각의 세트는 독특한 콜로니 형태(도 12d) 및 만능성 마커에 대한 유전자 발현의 별도의 패턴(도 12e)을 입증하였다. 피더 세포 상에서 통상적으로 유지되는 배양물은 소분자에서 유지한 그의 상대 배양보다 전통적 배양에서 유지한 hESC 대조군 H1 및 HUES9와 더 밀접하게 비슷하였다(도 12e). 이들 데이터는 소분자 매개 배양과 전통적인 배양 사이에 별도의 유전자 발현 패턴이 존재한다는 것을 나타내었다.
렌티바이러스 유도 및 전통적인 ESC/피더 배양을 이용하여 유래된 hiPSC와 에피솜 유래 계통 사이의 유전자 발현의 차이를 또한 평가하였고, 추가로 FRM/FMM 플랫폼에서 유지한 재프로그래밍 인자의 상이한 조합에 의해 유래된 에피솜 계통 사이의 유전자 발현의 차이를 평가하였다. 고함량 qRT-PCR 분석을 사용하여 만능성 및 분화와 관련된 유전자 발현을 정량화하였다. 조사한 대다수의 만능성 유전자는 FMM 배양 또는 피더 세포를 함유하는 전통적인 배양에서 유지한 hiPSC 사이의 비슷한 발현 패턴을 나타내었다(도 6a). 그러나, 분화와 관련된 유전자 평가에 대해 세포주 사이의 차이를 관찰하였다(도 6b). FMM 유지 hiPSC는 전통적인 배지에서 그리고 피더 세포 상에서 유지한 hiPSC와 H1 hESC 둘 다에 비교할 때, 3가지 체세포 계통과 관련된 대부분의 유전자의 더 낮은 발현을 나타내었다. 에피솜 유전자 세트 OSNKLMT에 의해 유도된 계통의 서브세트는 외배엽 계통, OTX2 및 TUJ1의 발현 나타내는 것으로 나타난 반면, 이 발현은 Lin28, KLF4 및 c-MYC의 사용 없이 hiPSC 에피솜-유래에서 무시할 만하였다(도 6b). 놀랍게도, 시험한 모든 분화 유전자의 발현은 에피솜 최소 유전자 세트로부터 유래되고 FMM에서 유지된 모든 hiPSC에서 완전히 억제되었다(도 6b). 종합하면, 이들 데이터는 FRM/FMM 플랫폼이 에피솜-기반 재프로그래밍 인자가 거의 없는 세포를 강하게 재프로그래밍할 수 있고 안정한 기저 만능성 상태에서 hiPSC를 유지할 수 있다는 것을 나타내었다.
다음의 방법으로부터 유래된 hiPSC에 대해 전반적인 유전자 발현 패턴을 결정하였다: i) FMM에서 유지된 에피솜 유도, ii) FMM에서 유지되었지만 3회 계대 동안 전통적인 배지로 전환된 에피솜 유도, iii) SMC4에서 유지된 렌티바이러스 유도; 및 iv) 전통적인 배양에서 유지된 렌티바이러스 유도(도 13a, 도 13b). 유전자 발현 프로파일을 평가하기 전에, 모든 계통이 만능성이고 게놈적으로 안정하며; 모두 3개의 체세포 계통으로 분화될 수 있다는 것을 결정하였다. 소분자 배양과 전통적인 배양 사이에 발현된 분화적 유전자의 클러스터 분석은 hiPSC 계통이 현재의 배양 조건에 기반하여 그룹화된다(본래의 유도 방법 및 배양에 의해서는 아님)는 것을 나타내었다(도 13b). 주요 범주가 전통적인 배양 그룹에서 고도로 농후화되는 한편, 소분자 배양 그룹에서 상향조절된 유전자는 세포 증식 및 성 발생의 조절과 대부분 관련된다는 것을 나타내기 때문에 2.5배 발현 차이를 나타내는 300개 유전자의 유전자 존재 분류는 분화 및 발생을 동정하였다(도 13c 및 도 13d).
유전자 발현 분석을 반복하였고, FMM, 전통 또는 이행 배양 시스템을 직접 비교하였다(FMM, Conv, FMM→Conv, Conv→FMM; 도 13a). 두 그룹으로 생성된 클러스터 분석은 생성 방법 또는 사전 배양 시스템과 상관없이 현재의 배양 시스템에 기반하여 분리하였다(도 7a). 예를 들어, hiPSC 클론FTC016-c28을 전통적인 배양으로의 이행 전에 FRM/FMM 플랫폼 하에 생성하고 유지하였다. 이 클론을 전통적인 배양에서 배타적으로 유지한 배양에 의해 그룹화하였고(FMM에서 유지한 그의 모 계통에 의하지 않음); 전통적인 배양에서 생성한 OKS-렌티바이러스-유도 hiPSC 클론과 같은 계통에 의해 비슷한 결과를 알 수 있고, FMM 클러스터 내에서 그룹화할 때, FMM으로의 이행까지 전통적인 세트 내에서 그룹화한다(도 7a). 유전자 존재는 분화 및 발생과 관련된 유전자가 농후한 것으로 나타난 전통적인 배양을 범주화하였다(즉, p-값=2.2E-10, 패턴 명시 과정; 도 7b 및 도 13e). 종합적으로, 이들 데이터는 분화 성향과 관련된 유전자가 FMM 배양에서 상당히 감소되고, hiPSC가 자발적 분화 가능성을 감소시키기 위해 FMM 배양 플랫폼에 적합하게 될 수 있다는 것을 나타내었다.
유전자 목록은 인간 만능 줄기 세포의 기저상태 및 준안정 상태를 나타내도록 편집되었다(De Los Angeles et al., 2012; Han et al., 2011; Hanna et al., 2010a; Hirata et al., 2012; Nichols and Smith, 2012; Valamehr et al., 2012; Zhou et al., 2010)(도 7c). 이들 유전자 목록에 기반한 유전자 클러스터링을 FMM 또는 전통적인 배양에서 hiPSC 계통에 대해 수행하였다(도 7d). 전반적인 유전자 발현 비교와 유사하게, 집중된 유전자 클러스터링은 전환가능한 것으로 나타난 프로파일링에 의한 그들의 현재의 배양 조건에 기반하여 세포주의 분리를 나타내었다. 예를 들어, FMM으로부터 전통적인 배양으로 이행된 hiPSC 클론 FTC016-c28은 H1 hESC에 의해 그룹화하였다(FMM에서 유지한 그의 모 hiPSC 계통에 의하지 않음)(도 7d). 유사하게, 전통적인 배양에서 유지한 섬유아세포 계통으로부터 유래된 렌티바이러스 hiPSC 클론은 HUES9 hESC 및 전통적인 배양에서의 다른 hiPSC 클론에 의해 그룹화하였지만; 그러나, FMM으로 전환될 때, 그것은 탯줄 제대혈뿐만 아니라 다른 FMM 배양 계통으로부터 유래된 에피솜 hiPSC에 의해 그룹화하였다(도 7d). 두 클러스터 내의 기저 및 준안정 상태를 나타내는 유전자의 분포를 소분자(SMC4/FMM) 대 전통적인 배양에 대해 각각의 프로브 세트에 대한 평균 강도를 플롯팅함으로써 결정하였다(도 7e). 놀랍게도, 기저상태와 관련된 대다수의 유전자는 소분자 배양 클러스터에서 상승된 발현을 나타내었고, 준안정 상태와 관련된 유전자의 증가된 발현을 전통적인 배양 클러스터에서 검출하였다(도 7e).
전통적인 배양에서 배양하고 유지한 hiPSC의 X-불활성화 상태를 소분자 배양에 적합화시킨 그의 상대와 비교하고 나서, 10회 계대 동안 유지하였다(도 7f). 소분자 배양에서 유지한 hiPSC는 침묵 X 염색체의 재활성화를 제시한 전통적인 배양과 비교할 때 X 염색체 유전자 발현의 증가를 나타내었다(도 7f). 현저한 예외는 소분자 배양에 대한 전환에서 하향조절된 X-불활성 특이적 전사체(XIST)였다(도 7f). X 활성화의 추가적인 증가는 전통적인 배지에 적합한 그들의 상대 배양에 비해 FMM에서 배양한 hiPSC에서 H3K27me3의 차별적인 염색에 의해 제공되었다(도 7g). FMM에서 대다수의 hiPSC는 H3K27me3 염색이 없었던 반면; 전통적인 배양에서 대다수의 hiPSC는 감소된 핵 크기의 외관을 지니는 H3K27me3 핵 병소를 나타내었는데, 이는 X 불활성화를 시사하였다(전통적인 배양에서 90% 초과의 H3K27me3 염색에 비해 FMM에서 10% 미만의 H3K27me3 염색; 도 7g).
실시예 6
소분자 배양에서 HIPSC 유지
배양의 합류(confluency)가 일단 75 내지 90%에 도달된다면, 유래된 hiPSC(OCT4/NANOG/SOX2, OCT4/ECAT1/UTF1, 또는 OCT4/ECAT1/UTF1/ESRRB/NANOG를 포함하는 재프로그래밍 인자의 다양한 조합에 의해 유도된 섬유아세포 또는 혈액-세포)를 단일 세포로서 일상적으로 계대시켰다. 단일 세포 해리에 대해, hiPSC를 인산염 완충 식염수(PBS)(메디아테크(Mediatech))로 1회 세척하고 나서, 37℃에서 3 내지 5분 동안 아쿠타제(밀리포어(Millipore))로 처리한 다음, 피펫팅하여 단일 세포 해리를 보장하였다. 이어서, 단일 세포 현탁액을 동일 용적의 전통적인 배지와 혼합하고 나서, 225g에서 4분 동안 원심분리시키고, 운명 유지 배지(FMM)에서 재현탁시키고 나서, hESC-적합 매트리겔(코닝(Corning)) 코팅 표면 상에서 플레이팅하였다. 매트리겔을 제조하고 나서, 제조업자의 설명서에 따라 표면을 코팅하기 위해 사용하였다. 계대는 전형적으로 1:3 내지 1:6이었고, 조직 배양 플레이트를 1 내지 4시간 동안 37℃에서 매트리겔로 사전에 코팅하고 나서, FMM을 이용하여 2 내지 3일마다 공급하였다. 세포 배양물을 37℃ 및 5% CO2로 설정한 습한 인큐베이터에서 유지하였다. 전통적인 배지는 DMEM/F12(메디아테크(Mediatech)), 20% 넉아웃 혈청 대체물(라이프 테크놀로지즈(라이프 테크놀로지즈)), 1x 글루타그로(메디아테크), 1x 비필수 아미노산(NEAA)(메디아테크), 1x 페니실린/스트렙토마이신(Pen/Strep)(메디아테크), 및 100μM β-머캅토에탄올로 이루어진다. FMM은 5μM 티아조비빈(내부 합성), 0.4μM PD0325901(바이오비전(Biovision)), 1μM CHIR99021(바이오비전), 100ng/㎖ bFGF(라이프 테크놀로지즈) 및 10ng/㎖ hLIF(밀리포어)로 보충한 전통적인 배지로 이루어진다. FMM에서 확장한 배양물에 대한 유동 분석 및 형태를 도 18a 내지 도 18d 및 도 19a 내지 도 19b에서 제시한다. FMM에서 확장된 세포는 또한 도 20a 내지 도 20d에 나타낸 바와 같은 다중 계대에 걸쳐 정상 핵형을 입증하였다.
실시예 7
소분자 배양에서 최소 유전자를 이용하는 재프로그래밍
재프로그래밍을 개시하기 위해, 재프로그래밍 인자의 이소성 발현을 NIL을 이용하는 렌티바이러스 형질도입, 전통적인 통합 렌티바이러스, 또는 에피솜 벡터를 이용하는 전기천공법에 의해 유도하였다. 도 14a 내지 도 14b에 도시한 바와 같이, 렌티바이러스 발현 시스템은 통합된 이식 유전자를 CRE-매개 절단하도록 하기 위해 3' 말단에서 EF1α 프로모터, 특이적 유전자 조합(표 3) 및 LOXP 부위를 포함하는 몇몇 특징으로 이루어진다.　CRE-절단 시, 유래된 hiPSC 게놈은 더 이상 이식유전자를 함유하지 않았고, 본질적으로 유전체 비삽입형이었다.　도 14c 내지 도 14f에서 도시한 바와 같이, 에피솜 작제물은 EF1α 프로모터 및 독특한 재프로그래밍 인자를 포함하는 독특한 특징을 가졌다.　형질감염 시, 에피솜 작제물은 핵 내에 존재하였고, 게놈 내로 통합되지 않은 전이-매개 방식으로 작용하였다.
렌티바이러스 감염에 대해, 시작 인간 섬유아세포를 제조업자의 설명서에 따라 매트리겔(코닝)로 코팅한 6-웰 플레이트의 웰 당 7x104 내지 1x105개 세포로 파종하였다. 293T 세포로부터의 새로운 렌티바이러스 상청액을 1:2(일 부분 렌티바이러스 상청액:일 부분 섬유아세포 배지) 희석으로 시작 세포에 첨가하였다. NIL 바이러스 상청액을 1x 농도로 사용하고 나서, 희석하지 않았다. 앞서 냉동시킨 바이러스를 사용하였다면, 그것을 희석하지 않고 1x 농도로 사용하였다. 다양한 인자의 바이러스 상청액을 6-웰 당 총 2㎖의 배지까지 합하였다(표 3). 이를 5㎍/㎖ 폴리브렌(밀리포어) 및 10mM 헤페스(메디테크)로 보충한 다음, 교반감염시켰다. 6개 웰 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 나서, 90분 동안 32℃에서 600g으로 원심분리시켰다. 이어서, 플레이트를 12 내지 16시간 동안 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터로 옮겼다. 렌티바이러스와 함께 인큐베이션시킨 후에, 세포를 PBS로 세척하고 나서, 배양 배지를 일 부분 운명 재프로그래밍 배지(FRM) 및 일 부분 섬유아세포 배지를 함유하는 50/50 배지로 전환시켰다. 감염 후 4 내지 6일 사이에 배지를 FRM으로 완전히 전환시켰다. FRM은 5μM 티아조비빈(내부에서 합성), 0.4μM PD0325901(바이오비전), 1μM CHIR99021(바이오비전), 2μM SB431542(바이오비전), 100ng/㎖ bFGF(라이프 테크놀로지즈), 10ng/㎖ hLIF(밀리포어), 1x N2 보충물(라이프 테크놀로지즈), 및 1x B27 보충물(라이프 테크놀로지즈)로 보충한 전통적인 배지(상기 기재함)로 이루어진다. 일단 웰이 합류되면, 세포를 매트리겔로 사전에 코팅한 10㎝ 접시 상에서 계대시켰다. 계대는 매트리겔 코팅 표면(상기 기재한 바와 같음) 상에서 아쿠타제(밀리포어)에 의한 해리로 이루어졌다. 제14일과 제18일 사이에 또는 iPSC 콜로니가 존재할 때, 배양 배지를 FRM으로부터 FMM으로 전환시켰다. 단일 세포 해리된 세포를 FMM을 지니는 매트리겔 코팅 플레이트 상에 확장하고 나서, 유세포 분석 분류까지 유지하였다. hiPSC 표현형의 발현에 대한 결과를 표 3, 도 15a 내지 도 15c(8 내지 15일), 및 도 16a 내지 도 16d, 도 17a 내지 도 17b(4주에 Oct-4/Ecat1/UTF1/Esrrb/Nanog)에 제시한다.
Figure 112016094741062-pct00003
에피솜 벡터 재프로그래밍을 위해, 도 13에 도시한 플라스미드를 이용하는 섬유아세포 또는 제대혈세포의 형질감염을 NEON 형질감염 시스템(라이프 테크놀로지즈)을 이용하여 수행하였다. 대략, 산물 매뉴얼에 의해 기재된 바와 같은 적절한 완충제 중에허 셋팅 1650v/10ms/3펄스를 이용하여 재프로그래밍 인자를 함유하는 총 3㎍의 에피솜 플라스미드를 EBNA에 의해(mRNA의 형태로 또는 플라스미드 pCDNA를 클로닝함에 있어서 카세트로서) 5x105개 섬유아세포 또는 2.5x105개 제대혈 세포 내로 공동형질감염시켰다. 형질감염 세포를 항생물질 없이 4ng/㎖ bFGF 및 5㎍/㎖ 피브로넥틴(BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))으로 보충한 (세포 유형에 따라서) 섬유아세포 배지 또는 제대혈배양 배지를 함유하는 매트리겔로 코팅한 6-웰 플레이트의 웰 상에 직접적으로 파종하였다. 제대혈배양 배지는 SFMII + CC110(스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies))으로 이루어진다. 형질감염 24시간 후에, FRM을 동일 용적으로 배양물에 첨가하였다. 섬유아세포 배양을 위해, 형질감염 후 48시간에 50㎍/㎖ 하이그로마이신(코닝)을 배양물에 첨가하였다. 배양 배지를 제5일에 FRM으로 완전히 전환시키고, 하이그로마이신을 형질감염 후 7일에 제거하였다. 모든 재프로그래밍 배양을 형질감염 후 14일에 FMM으로 전환하였다. 제대혈 배양을 위해, 형질감염 후 24시간에, FRM을 동일 용적으로 첨가하고, 후속적으로 형질감염 14일 후까지 며칠마다 지속적으로 첨가하였으며, 배양물을 흡입하고 완전히 FMM으로 대체하였다. 두 경우 모두에서, 접착된 둥근 세포의 클러스터는 형질감염 후 대략 5 내지 7일에 보였다. 일단 FMM에서, 모든 재프로그래밍 배양을 유지하였고, 매트리겔 코팅 표면 상에서 아쿠타제를 이용하여(상기 기재함) 단일 세포를 계대시켰다. 단일 세포 해리 세포를 FMM을 지니는 매트리겔 코팅 플레이트 상에 확장시키고 나서, 유세포 분석 분류까지 유지하였다.
실시예 8
재프로그래밍 인자 및 그들의 화학량론의 영향
인간 섬유아세포를 몇몇 재프로그래밍 인자를 함유하는 렌티바이러스로 감염시켰다. 모든 샘플을 항생물질 선택 인자를 함유하지 않는 렌티바이러스 플라스미드를 이용하여 OCT4, SOX2, NANOG 및 SV40LT로 감염시켰다. 세포를 퓨로마이신 선택 카세트뿐만 아니라 다양한 재프로그래밍 인자를 함유하는 단일 렌티바이러스 플라스미드로 공동 감염시켰다. 이들 인자는 OCT4-P2A-SOX2, OCT4-P2A-NANOG-T2A-SOX2 또는 OCT4-P2A-OCT4 중 하나를 포함하였다. 감염 2일 후에, 50/50 배지에서 500ng/㎖의 퓨로마이신(라이프 테크놀로지즈)을 각각 웰에 첨가하였다. 제5일에, 퓨로마이신 선택의 3일 후에, 배지를 퓨로마이신 없이 FRM으로 바꾸었다. 제14일에, 배지를 FMM으로 전환하였다. 제24일 내지 제27일에, SSEA4+/TRA181+ 집단에 대해 유동 분석을 수행하였다. 증가된 OCT4 발현은 재프로그래밍 효율을 상당히 개선시킨다는 것을 관찰하였다(도 23a).
실시예 9
실험 절차
전통적인 배양 시스템에서 HIPSC 유지
전통적으로 배양시킨 hiPSC를 미토마이신 C 처리 MEF(밀리포어) 피더 세포 상에서 유지하고 나서, DMEM/F12(메디아테크), 20% v/v 넉아웃 혈청 대체물(라이프 테크놀로지즈), 1% v/v 비-필수 아미노산(메디아테크), 2mM L-글루타민(메디아테크), 100μM β-머캅토에탄올(라이프 테크놀로지즈) 및 10ng/㎖ bFGF(라이프 테크놀로지즈)를 함유하는 전통적인 배지(본문에서 전통적인 배지로서 지칭함)와 함께 배양시켰다. 합류 시, 전통적으로 배양시킨 hiPSC를 7분 동안 37℃에서 1㎎/㎖ 콜라게나제 IV(라이프 테크놀로지즈)를 이용하여 효소적으로 해리시킨 다음, 작은 조각으로 기계적으로 해리시키고(클럼프 계대로서 칭함), 수집하고 나서, 전통적인 배지의 매일의 첨가에 의해 5 내지 7일마다 새로 파종한 피더 세포 상에 1:3 내지 1:4로 계대희석시켰다. 과량의 자발적 분화의 경우에, 콜로니를 수동으로 선별하고 나서, 인슐린 주사기(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)) 팁을 이용하여 작은 조각으로 자르고, 새로 파종한 피더 세포에 옮겼다. 세포 배양물을 37℃ 및 5% CO2로 설정한 습한 인큐베이터에서 유지하였다.
체세포의 재프로그래밍
재프로그래밍을 개시하기 위해, 재프로그래밍 인자의 이소성 발현을 렌티바이러스 형질도입 또는 에피솜 벡터 형질감염에 의해 유도하였다. 렌티바이러스 형질감염은 앞서 기재한 바를 따랐다(Valamehr et al., 2012). 간략하게, 출발 세포를 매트리겔(BD 바이오사이언시즈) 코팅 표면 상에서 6-웰 플레이트의 웰 당 1x105개 세포로 플레이팅하였다. 구체화되지 않는 한, 모든 매트리겔 코팅은 조직 배양 표면에 매트리겔 용액(25㎖ DMEM/F12 중에서 재현탁된 매트리겔의 1 분취액)을 첨가하는 것 및 37℃에서 2 내지 4시간 인큐베이션시키는 것으로 이루어진다. 이식유전자 OCT4/SOX2/KLF4를 발현시키는 렌티바이러스를 생성하는 293T 세포로부터의 상청액을 1:2(일 부분 렌티바이러스 상청액:일 부분 섬유아세포 배지)의 희석으로 출발 세포에 첨가하고, 4㎍/㎖ 폴리브렌(밀리포어)으로 보충하고 나서, 37℃ 및 5% CO2로 12 내지 16시간 동안 옮겼다. 섬유아세포 배지: DMEM(메디아테크), 10% FBS(라이프 테크놀로지즈), 1x 글루타맥스(라이프 테크놀로지즈), 1x 비-필수 아미노산(메디아테크). 렌티바이러스와 함께 인큐베이션한 후에, 세포를 PBS로 3회 세척하고 나서, 섬유아세포 배지를 공급하였다. 형질감염 후 48시간에, 배양 배지를 일 부분은 FRM(또는 SMC4), 일 부분은 섬유아세포 배지를 함유하는 50/50 배지로 전환시켰다. 일단, 배양물을 더 큰 용기 내로 보통 감염 후 4일 내지 6일에 계대시키면, 배지를 FRM(또는 SMC4)으로 완전히 전환하였다. 계대는 매트리겔 코팅 표면 상에서 아쿠타제를 이용하는 해리로 이루어진다(이하에 기재함). 다음 적용까지 배양을 FRM(또는 SMC4)에서 유지하였다.
에피솜 벡터 재프로그래밍에 대해, 유전자 세트 OCT4/SOX2/NANOG/KLF4/LIN28/MYC/SV40LT(A14703, 라이프 테크놀로지즈)를 이용하는 섬유아세포 또는 제대혈세포의 형질감염을 NEON 형질감염 시스템(라이프 테크놀로지즈)을 이용하여 수행하였다. 대략 4㎍의 벡터 세트를 산물 조작에 의해 기재한 바와 같은 적절한 완충제 중에서 세팅 1650v/10ms/3펄스를 이용하여 5x105개 섬유아세포 또는 2.5x105개 제대혈 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염 세포를 항생물질 없이 10ng/㎖ bFGF 및 5㎍/㎖ 피브로넥틴(BD 바이오사이언시즈)으로 보충한 (세포 유형에 따라서) 섬유아세포 배지 또는 제대혈배양 배지 중 하나를 함유하고 매트리겔로 코팅한 10㎝ 접시(섬유아세포) 또는 6-웰 플레이트의 웰 상에 직접적으로 플레이팅하였다. 제대혈배양 배지: SFMII + CC110(스템셀 테크놀로지즈). 형질감염 후 24시간에, FRM을 동일 용적으로 배양물에 첨가하였다. 섬유아세포 배양을 위해, 형질감염 후 48시간에 50㎍/㎖ 하이그로마이신(메디아테크)을 배양물에 첨가하였다. 배양 배지를 제5일에 FRM으로 완전히 전환시키고, 하이그로마이신을 형질감염 후 7일에 제거하였다. 모든 재프로그래밍 배양을 형질감염 후 14일에 FMM으로 전환하였다. 제대혈 배양을 위해, 형질감염 후 24시간에, FRM을 동일 용적으로 첨가하고, 후속적으로 형질감염 14일 후까지 며칠마다 지속적으로 첨가하였으며, 배양물을 흡입하고 완전히 FMM으로 대체하였다. 두 경우 모두에서, 접착된 둥근 세포의 클러스터는 형질감염 후 대략 5 내지 7일에 보였다. 일단 FMM에서, 모든 재프로그래밍 배양을 유지하였고, 아쿠타제를 이용하여 단일 세포를 계대시켰다. 단일 세포 해리 세포를 FMM을 지니는 매트리겔 코팅 플레이트 상에 확장시키고 나서, 유세포 분석 분류까지 유지하였다. 비트로넥틴(라이프 테크놀로지즈) 표면 코팅 연구에서, 매트리겔을 비트로넥틴으로 치환한 것을 제외하고 모든 양상을 동일하게 유지하였다. 감소된 인자 에피솜 재프로그래밍에 대해, pCEP4(라이프 테크놀로지즈) 벡터 골격을 EF1α 프로모터의 조절 하에서 OCT4-P2A-OCT4, OCT4-P2A-SOX2 또는 OCT4-P2A-NANOG-T2A-SOX2를 함유하도록 구성하였다. 감소된 인자 에피솜 벡터의 형질감염은 소수의 변형을 제외하고 상기 기재한 것과 동일한 프로토콜을 따랐다. EBNA를 EBNA mRNA(20㎍) 또는 벡터 카세트(2㎍) 중 하나로서 공동형질감염시켰다(Howden et al., 2006). 하이그로마이신 선택을 10일 동안 유지하고 나서, FMM을 제16일에 도입하였다.
렌티바이러스의 생성
293T(ATCC)를 항생물질 없이 섬유아세포 배지에서 유지하고 나서, 80% 이상의 합류에 도달되게 하지 않았다. 섬유아세포 배지는 DMEM(메디아테크), 10% 소 태아 혈청(FBS)(라이프 테크놀로지즈), 1x 글루타그로(메디아테크), 및 1x NEAA(메디아테크)로 이루어졌다. PBS로 처음 세척함으로써 세포를 계대시킨 후에, 37℃에서 0.05% 트립신(메디아테크)과 함께 4분 동안 인큐베이션시켰다. 해리된 세포를 섬유아세포 배지에서 재현탁시키고, 225g에서 4분 동안 원심분리시키고 나서, 목적으로 하는 플레이트 상에 파종하였다. 통합 렌티바이러스를 생성하기 위해, 293T를 각각의 바이러스 제조를 위해 10㎝ 접시 당 3.5x106개 세포로 제1일에 계대시켰다. 제2일에, 배지를 형질감염 1시간 전에 10㎖의 새로운 섬유아세포 배지로 바꾸었다. DNA를 칼포스 키트(CalPhos Kit)(클론테크)를 이용하여 형질감염시켰다. 다음을 형질감염을 위해 합하였다: 관심 대상의 유전자(들)를 함유하는 5㎍의 렌티바이러스 클로닝 플라스미드, 3.2㎍의 패키징 플라스미드 pPAX, 630ng의 패키징 플라스미드 pMDG, 87㎕ 칼슘 용액, 및 700㎕까지의 물. 700㎕의 HBS 용액을 첨가하는 한편, 1㎖ 혈청학적 피펫을 이용하여 거품을 생성하였다. 이를 실온에서 15분 동안 인큐베이션시키고, 이어서, 293T의 10㎝ 플레이트에 적가하였다. 제3일에, 바이러스 상청액을 제거하고 나서, 폐기하고, 15㎖의 새로운 섬유아세포 배지를 플레이트에 첨가하였다. 제4일, 형질감염 후 48시간에, 바이러스 상청액을 수집하고, 4℃에서 저장하였다. 15㎖의 섬유아세포 배지를 플레이트에 첨가하였다. 제5일에, 형질감염 후 72시간에, 바이러스 상청액을 수집하고 나서, 제4일 상청액에 첨가하였다. 이 바이러스 풀을 0.45㎛ 필터를 이용하여 여과하고 나서, 렌티-X 코스틱스(Lenti-X GoStix)(클론테크)를 이용하여 역가에 대해 확인하였다. 바이러스를 감염을 위해 사용하거나 -80℃에서 분취액 중에서 냉동시켰다. 비-통합 렌티바이러스(NIL)(인비트로젠)를 생성하기 위해, 프로토콜은 각각의 바이러스 제조에 대해 T75 플라스크를 이용하여 제조업자 설명서에 따랐다. 바이러스 상청액을 형질감염 후 48, 72, 및 96시간에 수집하였고, 여과 후, 상기 기재한 바와 같이 적정하였다. NIL 바이러스를 감염을 위해 사용하거나 또는 -80℃에서 분취액 중에서 냉동시켰다.
소분자 배양에서 HIPSC 유지
일단 배양의 합류가 75 내지 90%에 도달되면 유도된 hiPSC를 일상적으로 단일 세포로서 계대시켰다. 과합류는 분화를 초래할 수 있다는 것을 주목한다. 단일 세포 해리를 위해, hiPSC를 인산염 완충 식염수(PBS)(메디아테크)로 1회 세척하고 나서, 아쿠타제로 3 내지 5분 동안 37℃에서 처리한 다음, 피펫팅하여 단일 세포 해리를 보장하였다. 이어서, 단일 세포 현탁액을 동일 용적의 전통적인 배지와 혼합하고 나서, 225 g로 4분 동안 원심분리시키고, FMM에서 재현탁시키고 나서, 매트리겔 코팅 표면 상에서 플레이팅하였다. 계대는 전형적으로 1:4 내지 1:8이었고, 37℃에서 2 내지 4시간 동안 매트리겔로 앞서 코팅한 조직 배양 플레이트에 옮기고 나서, FMM을 이용하여 격일로 공급하였다. 세포 배양물을 37℃ 및 5% CO2에서 설정한 습한 인큐베이터에서 유지하였다. FMM 및 FRM에 대한 배지 제형을 표 1에서 기재한다. SMC4 배양은 이전에 논의된다(Valamehr et al., 2012). 간략하게, 소분자 0.4mM PD0325901(바이오비전), 1mM CHIR99021(바이오비전), 5mM 티아조비빈 및 2mM SB431542(바이오비전)을 전통적인 배양 배지에 첨가하고 나서, 프로토콜에 따라 계대시킨다.
유세포 분석 및 분류
해리된 단일 세포(상기 기재함) 재프로그래밍 풀을 행크스 균형 염 용액(메디아테크), 4% 소 태아 혈청(인비트로젠), 1x 페니실린/스트렙토마이신(메디아테크) 및 10mM 헤페스(메디아테크)를 함유하는 냉각 염색 완충제 중에서 재현탁시켰다. SSEA4-FITC, TRA1-81-알렉사 플루오르-647 및 CD30-PE(BD 바이오사이언시즈)를 포함하는 컨쥬게이팅된 1차 항체를 세포 용액에 첨가하고 나서, 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 모든 항체를 백만개의 세포 당 100㎕ 염색 완충제 중의 7 내지 10㎕에서 사용하였다. 용액을 염색 완충제로 1회 세척하고 나서, 225g에서 4분 동안 교반시키고, 10μM 티아조비빈을 함유하는 염색 완충제 중에서 재현탁시키고 나서, 유세포 분석 분류를 위해 얼음 상에서 유지하였다. 유세포 분석 분류를 상기 기재한 개폐 전략을 이용하여 FACS 아리아(Aria) II(BD 바이오사이언시즈) 상에서 수행하였다. 분류 세포를 웰 당 3 및 9개 사건의 농도로 100μM 노즐을 이용하여 96-웰 플레이트 내로 직접 배출하였다. 웰 당 3개 세포를 분류하는 것이 본 발명자들의 바람직한 농도인데, 본 발명자들은 분류된 사건이 분류 후 각각의 웰에서 보이는 실제 세포의 수와 반드시 상관관계가 있는 것이 아니며 웰 당 3개 세포는 본 발명자들에게 개개 콜로니를 함유하는 바람직한 수의 웰을 제공하는 것으로 본 발명자들이 주목하였기 때문이다. 각각의 웰을 5㎍/㎖ 피브로넥틴 및 1x 페니실린/스트렙토마이신(메디아테크)로 보충한 200㎕ FMM 배지로 사전에 채우고 나서, 5x 매트리겔로 밤새 사전 코팅하였다. 5x 매트리겔 사전 코팅은 5㎖의 DMEM/F12 내로 매트리겔의 1 분취액을 첨가한 다음, 적절하게 재현탁시키기 위해 밤새 4℃에서 인큐베이션시키고 나서, 최종적으로 웰 당 50㎕로 96-웰 플레이트에 첨가한 후, 밤새 37℃에서 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 각각의 웰에 대한 배지의 첨가 직전에 5x 매트리겔을 흡입한다. 분류의 완료 시, 96-웰 플레이트를 인큐베이션 전에 1 내지 2분 동안 225g에서 원심분리시켰다. 플레이트를 7일 동안 건드리지 않고 두었다. 제7일에, 150㎕의 배지를 각각의 웰로부터 제거하고 나서, 100㎕ FMM으로 대체하였다. 분류 10일 후에 추가 100㎕ FMM를 웰에 재공급하였다. 콜로니 형성을 2일 빨리 검출하고 나서, 대부분의 콜로니를 분류 후 7 내지 10일에 확장시켰다. 제1 계대에서, 웰을 PBS로 세척하고 나서, 37℃에서 대략 10분 동안 30㎕ 아쿠타제를 이용하여 해리시켰다. 연장된 아쿠타제 처리에 대한 필요는 연장된 지속기간 동안 배양에서 가만히 있는 콜로니의 빽빽함을 반영한다. 세포가 해리되는 것을 본 후에, 200㎕의 FMM을 각각의 웰에 첨가하고 나서, 몇번 피펫팅하여 콜로니를 파괴하였다. 해리된 콜로니를 5x 매트리겔로 앞서 코팅한 96-웰 플레이트의 다른 웰에 옮기고 나서, 이어서, 인큐베이션 전에 2분 동안 225g에서 원심분리시켰다. 초기 콜로니를 퍼지게 하기 위해 이런 1:1 계대를 수행한다. 3 내지 5분 동안 아쿠타제 처리 및 FMM에서 1x 매트리겔로 이전에 코팅한 더 큰 웰 내로의 1:4 확산을 이용하여 일상적으로 후속 계대를 행한다. 구아바 이지사이트 8 HT(Guava EasyCyte 8 HT)(밀리포어) 상에서 유세포 분석을 수행하였고, FCS 익스프레스 4(FCS Express 4)(드노보 소프트웨어)를 이용하여 분석하였다.
실시간 RT- PCR 및 플루이다임 분석
총 RNA를 피코 퓨어 RNA 단리 키트(라이프 테크놀로지즈)를 이용하여 단리시켰다. 상보적 DNA(cDNA)를 iScript cDNA 합성 키트(바이오-래드)를 이용하여 100ng의 단리시킨 총 RNA로부터 역전사시켰다. 이어서, TaqMan PreAmp 마스터 믹스 키트(라이프 테크놀로지즈) 및 풀링한 태그먼(TaqMan) 분석의 0.2x 농도를 이용하여 cDNA를 22개의 특이적 표적 유전자 및 2개의 기준 대조군 유전자의 사전 증폭을 위해 사용하였다. cDNA로부터의 특이적 표적 증폭(STA)을 제조업자의 프로토콜에서 언급한 표준 순환 조건에 의해 14주기의 증폭을 이용하여 수행하였다. 사전 증폭시킨 cDNA 반응(n=48)을 1:5(멸균수 중에서)로 희석하고 나서, 실시간 정량적 PCR 반응을 위해 주형으로서 사용하였다. 48.48 동적 배열(플루이다임)을 2회 중복해서 로딩한 태그먼 분석에 의한 나노플렉스 IFC 컨트롤러 MX(NanoFlex IFC Controller MX)(플루이다임)을 이용하여 로딩하고 나서, 바이오마크 실시간 PCR 시스템(플루이다임)을 이용하여 실시간 반응을 수행하였다. 바이오마크 실시간 PCR 분석 소프트웨어(플루이다임)를 이용하여 결과를 분석하였다. 32개 초과의 주기 역치(Ct)를 지니는 샘플을 계산으로부터 제외하였다. 평균 Ct를 2회 중복해서 분석으로부터 계산하고 나서, 델타-델타 Ct(ΔΔCt)를 6개 대조군 MEF 세포주(MEF 및 H1 ESC 상의 OSK hiPSC)의 중앙값에 대해 2개의 기준 유전자(GAPDH 및 HPRT1)의 평균을 이용하여 계산하였다. 상대적 유전자 발현(RQ) 결과를 히트맵 형식으로 엑셀(마이크로소프트)에 나타낸다.
Figure 112016094741062-pct00004
Figure 112016094741062-pct00005
이식유전자 존재의 시험
QIAamp(등록상표) DNA 미니 키트 및 프로테이나제 K 분해(퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 게놈 DNA를 단리시켰다. 태그 PCR 마스터 믹스 키트(퀴아젠)를 이용하는 이식유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여(이하의 표 5)(Yu et al., 2007) 100ng의 게놈 DNA를 증폭시켰다. PCR 반응을 35주기 동안 다음과 같이 실행하였다: 30초 동안 94℃(변성), 30초 동안 60 내지 64℃(어닐링) 및 1분 동안 72℃(연장). 렌티바이러스 방법을 이용하여 생성된 섬유아세포 및 hiPSC로부터의 게놈 DNA를 음성 대조군으로서 사용하였다. 에피솜 작제물의 DNA를 양성 대조군으로서 사용하였다.
Figure 112016094741062-pct00006
면역세포화학 분석
4% v/v 파라폼알데하이드(알파 에이사(Alfa Aesar))를 이용하여 세포를 고정하고 나서, 0.2% v/v 트윈(PBST)(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))을 함유하는 PBS로 3회 세척하고, PBS 중에서 1시간 동안 25℃에서 0.15% v/v 트리톤X-100(시그마 알드리치)을 이용하여 침투시켰다. 침투 후, 세포를 PBST(PBSTB)((피셔 사이언티픽) 중의 1% v/v BSA(인비트로젠)를 이용하여 25℃에서 30분 동안 차단시켰다. PBSTB의 부드러운 제거 후에, 세포를 PBSTB 중의 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 이 연구에서 사용한 1차 항체는 OCT4(산타 크루즈(Santa Cruz)), NANOG(산타 크루즈), TRA160(밀리포어), TRA1-81(밀리포어), SSEA4(밀리포어), β-III 튜불린(TUJ1, 알앤디 시스템즈), α-평활근 액틴(시그마(Sigma)), FoxA2(알앤디 시스템즈), Sox17(알앤디 시스템즈), NESTIN(앱캠(Abcam)) 및 알파-1-태아단백질(다코(Dako))을 포함한다. 밤새 인큐베이션 후에, 세포를 PBST로 3회 세척하고 나서, PBSTB 중에서 1시간 동안 37℃에서 1:250으로 희석시킨 2차 항체(알렉사 플루오르 488 또는 555; 인비트로젠)를 이용하여 염색하였다. 세포를 PBST 중에서 3회 세척하고 나서, 호크스트 염료(Hoechst dye)(인비트로젠)를 이용하여 염색하였다. H3K27me3 염색 분석을 위해, hiPSC를 커버 슬립 상에서 72 내지 96시간 성장시키고, PBS 중에서 4% 파라폼알데하이드(일렉트론 마이크로스코피 사이언스(Electron Microscopy Science), EMS)를 15분 동안 25℃에서 고정시켰다. PBS 1시간 동안 25℃에서 PBS 중의 0.1% 트리톤 X-100를 이용하여 세포 침투를 수행하였고, 이어서, 세포를 30분 동안 25℃에서 차단 용액(PBS 중의 1% BSA)과 함께 인큐베이션시켰다. 차단 후에, 커버 슬립을 4℃에서 밤새 차단 용액 중에서 항-트리메틸-히스톤 H3(Lys27) 항체(밀리포어 07-449, H3K27me3)의 1:1600 희석물과 함께 인큐베이션시켰다. 2차 항체는 알렉사 플루오르 555 염소-항-토끼 IgG(라이프 테크놀로지즈, A21429)였다. 핵을 DAPI로 반대염색하고 나서 악시오 관찰자 도립 현미경(Axio Observer Inverted Microscope)(Carl Zeiss)을 이용하여 관찰하였다. AxioVS40 v4.8.1.0(카를 제이스 이미징 솔루션 게엠베하(Carl Zeiss Imaging Solutions Gmbh))를 이용하여 이미지를 포획하였다.
실시예 7에 따라 재프로그래밍된 세포를 4% v/v 파라폼알데하이드(알파 에이서)를 이용하여 고정시키고 나서, PBS(메디아테크)로 세척하고, PBS 중에서 1시간 동안 25℃에서 0.15% v/v 트리톤X-100(시그마-알드리치)을 이용하여 침투시켰다. 침투 후에, 세포를 PBS(PBSB) 중에서 30분 동안 25℃에서 1% v/v BSA(시그마(Sigma))를 이용하여 차단시켰다. PBSB의 부드러운 제거 후에, 세포를 4℃에서 밤새 PBSB 중의 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 이 연구에서 사용한 1차 항체는 OCT4(산타 크루즈) 및 TRA181(밀리포어)을 포함한다. 밤새 인큐베이션한 후에, 세포를 PBS로 3회 세척하고 나서, 1시간 동안 37℃에서 PBSB 중에서 1:250으로 희석시킨 2차 항체(알렉사 플루오르 488 또는 555; 라이프 테크놀로지즈)로 염색하였다. 세포를 PBS 중에서 3회 세척하고 나서, 호크스트 염료(인비트로젠)를 이용하여 염색하였다. 염색한 세포를 악시오 관찰자 도립 현미경(카를 제이스)로 관찰하였다. 악시오VS40 v4.8.1.0(카를 제이스 이미징 솔루션즈 게엠베하)을 이용하여 이미지를 포획하였다.
분화 분석( EB 및 직접)
hiPSC는 DMEM/F12(메디아테크), 20% 소 태아 혈청(인비트로젠), 1% 비필수 아미노산(메디아테크), 2mM L-글루타민(메디아테크) 및 100μM β-머캅토에탄올을 함유하는 분화 배지에서 EB로서 분화되었다. 간략하게, EB 형성을 위해, hiPSC를 FMM에 파종하고, 세포를 프라이밍한 다음날 전통적인 배지로 전환시켰다. 전통적인 배지에서 3 내지 4일 후, 배양물을 아쿠타제(밀리포어)로 해리시키고 나서, 최종 농도 100,000개 세포/㎖로 10μM Y27632를 포함하는 분화 배지에서 재현탁시켰다. 티아조비빈 대신 ROCK 저해제 Y27632를 EB 형성을 위해 사용한다는 것을 주목한다. V-하부 96-웰 비-조직 배양 플레이트(눈크(Nunc))에서 100㎕/웰로 세포를 파종하고 나서, 950g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 다음날 빽빽한 "공-유사 클럼프"를 분화 배지에서 대략 30 내지 40개 EB/웰로 P1000을 이용하여 초-저 결합 6-웰 플레이트(코닝)에 전달하였다. 7일 후, EB를 1:1로 매트리겔 코팅 6-웰 플레이트에 옮기고 나서, 3일마다 분화 배지를 이용하여 공급하였다. 배양물에서 3주 후에, 세포를 고정시키고, 염색하였다. 직접 단일층 분화를 위해, hiPSC를 FMM에서 매트리겔 코팅 웰에 파종하여 다음날 50% 및 90% 합류를 전달하였다. 분화를 위해 밀도를 둘 다 유도하였다. 신경 유도를 위해, FMM 배지를 10μM SB431542 및 100nM LDN-193189(SMAD 저해제 둘 다, 바이오비전)로 보충한 hESC 배지로 대체하였다. 2일 후에, 분화 배지를 이중 SMAD 저해제에 추가로 3μM CHIR99021(바이오비전)로 보충하였다. 세포를 2일 후에 고정시키고, 네스틴(앱캠)에 대해 염색하였다. 중배엽 분화를 위해, 배지를 1x B27 배지 첨가제(라이프 테크놀로지즈), 3μM CHIR99021, 4ng/㎖ bFGF 및 10ng/㎖ BMP4로 보충한 RPMI(메디아테크)로 대체하였다. 배지를 격일로 바꾸고 나서, 세포를 4일째 고정시키고, αSMA(시그마)에 대해 염색하였다. 내배엽 분화를 인간 만능 줄기 세포 기능 동정 키트(알앤디 시스템즈)를 이용하여 수행하였다. hiPSC를 3일 동안 내배엽 분화와 함께 인큐베이션시키고 나서, 고정시키고, SOX17(알앤디 시스템즈)에 대해 염색하였다.
유전자 발현 분석
제조업자의 추천 프로토콜을 이용하여 RNA를 피코퓨어 RNA 단리 키트(PicoPure RNA Isolation kit)(라이프 테크놀로지즈)를 이용하여 추출하였다. 나노드롭 2000 스펙트로포토미터(Nanodrop 2000 Spectrophotometer)(써모 사이언티픽)를 이용하여 총 RNA를 정량화하였다. 간략하게, 바이오틴일화된 aRNA를 선택적 제2 라운드 증폭을 이용하는 MessageAmp II aRNA 증폭 키트(텍사스주 오스틴에 소재한 어플라이드 바이오시스템즈/앰비온(Applied Biosystems/Ambion))를 이용하여 거의 100ng의 총 RNA로부터 제조하였고, 이어서, 표준 프로토콜을 이용하여 MessageAmp II 바이오틴 인핸스드 키트(MessageAmp II Biotin Enhanced Kit)(텍사스주 오스틴에 소재한 어플라이드 바이오시스템즈/앰비온)를 이용하여 바이오틴 표지 aRNA로 전사시켰다. 바이오틴 표지된 aRNA를 정제하고 나서, 애피메트릭스사 권고에 따라 단편화시켰다. 20㎍의 단편화된 aRNA를 사용하여 45℃에서 16시간 동안 인간 게놈 U133-플러스-2.0 칩스(캘리포니아주 산타 클라라에 소재한 애피메트릭스사 인코포레이티드)에 혼성화시켰다. 어레이를 세척하고 나서, 애피메트릭스 플루이딕스 스테이션 450(Affymetrix Fluidics Station 450)에서 염색하고, 애피메트릭스사 유전자칩 스캐너 3000 7G를 이용하여 스캐닝하였다. 원 발현 데이터 파일을 유전자 발현 옴니버스(Gene Expression Omnibus)(GSE50868)에서 이용가능하다. 디폴트 분석 세팅을 이용하는 애피메트릭스 발현 콘솔 소프트웨어를 이용하여 이미지 데이터를 분석하였다. 로그 스케일 러버스터 멀티-어레이 분석(RMA, 애피메트릭스사)에 의해 정규화하고 나서, 유전체학용 스팟파이어 4.5(Spotfire for Genomics 4.5)(캘리포니아주 팔로알토에 소재한 팁코 스팟파이어(Tibco Spotfire))에서 시각화하였다. 분화적으로 발현된 프로브의 생물학적 경로 농후 분석을 주석, 시각화 및 통합된 발견을 위한 데이터베이스(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, DAVID v6.7)를 이용하여 유전자 온톨로지(Gene Ontology: GO) 데이터베이스(GO 바이올로지컬 프로세스에 대한 단일 농후화 및 0.01 미만의 p값)에 대해 수행하였다. 유클리드 거리 측정(유전체학용 스팟파이어 4.5)을 이용하는 완전 결합 클러스터링 방법을 이용하는 Log2 발현 수준에 기반한 샘플 간의 유전자 발현 프로파일을 비교하기 위해 계층 클러스터링를 수행하였다. 클러스터링에 대한 프로브 세트를 발현 수준의 전반적인 차이(>< 2.5-배) 또는 기저 또는 준안정 상태를 정하는 표적화된 유전자 목록 상의 존재에 의해 선택하였다. X 염색체 유전자 발현 비교를 위해, RMA 정규화된 애피메트릭스사 유전자 칩 강도를 2^[RMA log2 강도]를 취함으로써 선형 발현 값으로 전환하였다. 선형 발현비를 프라이밍된 발현 세트로 나눈 나이브 발현 세트로서 계산하였다. X 염색체에 대해 맵핑한 모든 프로브 세트에 대한 발현비를 강조한 2배 농후비와 다소 차이가 있는 프로브 세트를 이용하여 스팟파이어 4.5에서 시각화하였다.
핵형 분석
위셀 리서치 인스티튜트(WiCell Research Institute)(위스콘신주 메디슨에 소재)에 의해 20 내지 40개의 G-밴드 중기 세포 상에서 세포유전학 분석을 수행하였다.
기형종 형성
200㎕ 용액(100㎕ FMM 및 100㎕ 매트리겔) 당 50만 및 3백만개의 세포 농도로 단일 세포 해리 hiPSC를 NOD/SCID/γ 결핍(null) 마우스에 피하로 주사하였다. 5 내지 6주(3백만개 세포 주사) 및 7 내지 8주(50만개 세포 주사) 후에, 기형종을 PBS 중에서 채취하고 나서, 4% 파라폼알데하이드 중에서 실온에서 밤새 고정시키고, 이후에 가공을 위해 실온에서 70% 에탄올 중에서 유지하였다. 샘플을 절편화 및 헤마톡실린과 에오신 염색을 위해 UCSD 조직학 핵심 시설에 제출하였다. 절편을 시험하고 나서, 설명하고, 니콘(Nikon) DS-Fi1 카메라를 구비한 니콘 이클립스 TS100 현미경을 이용하여 촬영하였다.
통계학적 분석
표준 편차에 관한 통계학적 평가를 위해 스튜던트 t 검정을 사용하였다. 스텝원 소프트웨어 v2.2(StepOne Software v2.2)(라이프 테크놀로지즈)를 사용하여 qRTPCR 데이터에 관한 RQ 최소 및 최대값(오차막대)을 결정하였다.
일반적으로, 다음의 청구범위에서, 사용되는 용어는 본 명세서 및 청구범위에 개시된 구체적 실시형태로 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되지만, 이러한 청구범위가 자격을 부여하는 동등물의 완전한 범주와 함께 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> FATE THERAPEUTICS, INC. <120> IMPROVED REPROGRAMMING METHODS AND CELL CULTURE PLATFORMS <130> IPA161147-US <140> PCT/US2015/018801 <141> 2015-03-04 <150> US 61/947,979 <151> 2014-03-04 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 1 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 2 Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 3 Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 4 Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 1 5 10 15 Pro <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 5 Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 6 Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 7 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 7 Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro 1 5 10 15 Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys 20 25 30 Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr 35 40 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 8 Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 9 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 9 Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val 1 5 10 15 Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 20 25 30 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 35 40 <210> 10 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic made in lab <400> 10 Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu 1 5 10 15 Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 20 25 30 Pro <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gcccccaccc tttgtgtt 18 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ttgaaaactt tggcttcctt gtt 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 caggcccgaa agagaaagcg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 ggagggcctt ggaagcttag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 tatacacagg ccgatgtggg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 ttgaccggga ccttgtcttc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 gtggtccgag tgtggttctg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 gttctcctgg gccatcttgc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 aagcgcagat caaaaggaga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 ccccctgaac ctgaaacata 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 tgcttcccgt atggctttc 19 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 aaagggagat ccgactcgtc tg 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 atcgtcaaag ctgcacacag 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 cccaggagtc ccagtagtca 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 gtggacctga cctgccgtct 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 ggaggagtgg gtgtcgctgt 20 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequenceq <220> <223> Primer <400> 27 gggtttttgg gattaagttc ttca 24 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 agcctaaatg atggtgcttg gt 22 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide cleavage recognition site <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa represent any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa represent any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa represent any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Gly or Ser <400> 29 Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide cleavage recognition site <400> 30 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide cleavage recognition site <400> 31 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser 1 5

Claims (171)

  1. (a) 하나 이상의 비-만능세포를 얻는 단계로서, 상기 하나 이상의 비-만능세포는 인간 세포인, 단계;
    (b) (i) 하나 이상의 벡터에 포함되어 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 하나 이상의 재프로그래밍 인자의 하나 이상의 카피를, 상기 비-만능세포에 도입하는 단계로서, 상기 하나 이상의 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, ECAT1, UTF1, ESRRB, 및 SV40LT로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계; 및
    (ii) 상기 비-만능세포를 TGFβR 저해제인 SB431542, GSK3 저해제인 CHIR99021, MEK 저해제인 PD032901, 및 ROCK 저해제인 티아조비빈과 충분한 시간동안 접촉시키는 단계를 포함하는,
    하나 이상의 비-만능세포를 재프로그래밍하는 단계; 및
    (c) 적어도 한 번의 계대 동안 GSK3 저해제인 CHIR99021, MEK 저해제인 PD032901, 및 ROCK 저해제인 티아조비빈을 포함하지만 TGFβR 저해제인 SB431542는 포함하지 않는 조합물과, 단계 (b)로부터의 세포의 접촉을 유지하도록 하여, TGFβR 저해제인 SB431542를 제거하는 단계를 포함하고,
    그로써 단일 세포로 배양하였을 때 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)의 생존도를 증가시키거나, 자발적 분화를 감소시키거나, 게놈 안정성을 증가시키거나, iPSC 집단의 균질성을 증가시키는,
    인간 iPSCs의 집단의 생성 방법.
  2. (a) iPSCs의 집단을 수득하는 단계로서, 상기 iPSCs는 인간 iPSCs인, 단계; 및
    (b) GSK3 저해제인 CHIR99021, MEK 저해제인 PD032901, 및 ROCK 저해제인 티아조비빈을 포함하지만 TGFβR 저해제인 SB431542는 포함하지 않는 조합물과 상기 iPSCs를 접촉시키는 단계를 포함하고,
    그로써 단일 세포로 배양하였을 때 증가된 생존도를 가진 iPSCs를 생성하거나, 자발적 분화를 감소시키거나, 게놈 안정성을 증가시키거나, iPSC의 집단의 균질성을 증가시키는 단계를 포함하는,
    단일 세포로 배양하였을 때 증가된 생존도를 가진 인간 iPSCs의 집단의 생성 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조합물과 접촉한 iPSC의 집단은 적어도 70% 균질한, 적어도 80% 균질한, 또는 적어도 90% 균질한, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 비-만능세포는 체세포 또는 성체 줄기 세포를 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)로부터의 세포는 내인성 OCT4의 증가된 발현을 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 비-만능세포의 만능성 상태로의 재프로그래밍은 하나 이상의 벡터에 포함되어 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 하나 이상의 재프로그래밍 인자의 하나 이상의 카피를 도입하는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 재프로그래밍 인자는
    (i) OCT4, SOX2, 및 NANOG로 이루어진 군;
    (ii) OCT4, NANOG, ECAT1, UTF1, 및 ESRRB로 이루어진 군; 또는
    (iii) OCT4, ECAT1, 및 UTF1로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 벡터는
    (i) 적어도 하나의 2A 펩타이드에 의해 분리되는 복수의 다시스트론성(polycistronic) 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나,
    (ii) 복수의 폴리뉴클레오타이드는 Oct4 재프로그래밍 인자의 2 이상의 카피를 암호화하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클(mini-circle), 발현 카세트를 가진 벡터 시스템, 또는 mRNA에 의해 도입되는, 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조합물과 접촉하는 iPSC 집단이
    (i) 상기 조합물과 접촉하는 집단의 95% 이상이 TRA1-81 또는 TRA1-60, 및 SSEA4를 발현하거나,
    (ii) 상기 조합물과 접촉하는 집단의 최대 5%가 α-평활근 액틴 (SMA), TUJ1, 또는 FoxA2를 발현하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조합물과 접촉하는 iPSC 집단이 만능성의 기저상태로 유도되거나 유지되는, 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 계대를 위해 조합물과 접촉한 iPSCs를 해리시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 계대를 위해 조합물과 접촉한 iPSCs를 단일 세포로 해리시키고 단일 세포로 해리된 iPSCs를 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 단일 iPSC를 분리하고 이로부터 iPSC의 클론성 집단(clonal population)을 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 iPSCs가 적어도 5회 계대 동안, 적어도 10회 계대 동안, 적어도 50회 계대 동안, 또는 적어도 100회 계대 동안
    (i) 생존도;
    (ii) 자발적 분화 감소;
    (iii) 정상 핵형;
    (iv) 게놈 안정성; 또는
    (v) 만능성의 기저 상태를 유지하는, 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 iPSCs가 무 피더(feeder free) 환경에서 배양되는, 방법.
  16. GSK3 저해제인 CHIR99021, MEK 저해제인 PD032901, 및 ROCK 저해제인 티아조비빈을 포함하지만 TGFβR 저해제인 SB431542는 포함하지 않는 조합물; 및 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSCs)를 포함하는, 인간 iPSCs의 집단의 생성을 위한 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 iPSC가 OCT4, ECAT1, UTF1, NANOG, 및 ESRRB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드가 하기를 포함하는 벡터를 포함하는, 조성물:
    (i) OCT4 폴리뉴클레오타이드의 2개 이상의 카피, ECAT1 폴리뉴클레오타이드의 1개 카피, UTF1 폴리뉴클레오타이드의 1개 카피, NANOG 폴리뉴클레오타이드의 1개 카피, 및 ESRRB 폴리뉴클레오타이드의 1개 카피; 또는
    (ii) OCT4 폴리뉴클레오타이드의 1개 이상의 카피, ECAT1 폴리뉴클레오타이드의 1개 카피, 및 UTF1 폴리뉴클레오타이드의 1개 카피.
  19. 제17항에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드가
    (i) 레트로바이러스, 센다이 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니-서클(mini-circle), 발현 카세트를 가진 벡터 시스템, 또는 mRNA에 의해 세포로 도입되거나,
    (ii) 적어도 하나의 2A 펩타이드에 의해 분리되는 다시스트론성 (polycistronic) 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나,
    (iii) 각각이 OCT4 폴리펩타이드를 암호화하는 다시스트론성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
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