JP2018086018A - 改善された再プログラム方法及び細胞培養基盤 - Google Patents
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Abstract
【課題】改善された再プログラム方法及び細胞培養基盤を提供すること。【解決手段】本発明は、多能性細胞を製造するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、基底状態多能性を有する多能性細胞を製造するための改善された培養基盤を提供する。様々な実施形態において、本発明は、部分的に、(a)Wnt経路アゴニストと;(b)MEK阻害剤と;(c)ROCK阻害剤とを含む組成物を企図する。ある特定の実施形態において、組成物は、bFGFまたはLIFをさらに含む。【選択図】図1E
Description
関連出願の相互参照
本出願は、35U.S.C.§119(e)に基づき、参照により全体が本明細書に組み込まれる2014年3月4日出願の米国仮特許出願第61/947,979号の利益を主張する。
本出願は、35U.S.C.§119(e)に基づき、参照により全体が本明細書に組み込まれる2014年3月4日出願の米国仮特許出願第61/947,979号の利益を主張する。
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙面の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、FATE_122_01WO_ST25.txtである。テキストファイルは、8KBであり、2015年3月4日に作成され、本明細書の出願と同時にEFS−Webを介して電子的に提出されている。
背景
本出願に関連する配列表は、紙面の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、FATE_122_01WO_ST25.txtである。テキストファイルは、8KBであり、2015年3月4日に作成され、本明細書の出願と同時にEFS−Webを介して電子的に提出されている。
背景
本発明は、概して、多能性細胞を製造するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、基底状態多能性を有する多能性細胞を製造するための改善された培養基盤に関する。
今日の多能性幹細胞に基づく疾患及び毒性学のスクリーニング研究、ならびに将来の自家/同種多能性幹細胞治療は、ヒト胚幹細胞(hESC)及びヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の細胞株生成及び拡大の、堅牢で再現性のある方法を必要とする。hiPSCは、ゲノムに組み込まれたレトロ及びレンチウイルス発現系を介して導入された多能性因子の異所性発現により生成されている。可能な限り多くの組み込みイベントを排除するための研究は、いくつかの再プログラミング因子を小分子阻害剤で置き換えることを含んでいた。さらに、非組み込み型の方法は、非効率的及び労働集約的であり、追加的な再プログラミング因子を必要とする、または全ての体細胞の再プログラムにおいて効果的ではないことが証明されている(Lee et al.,2013)。
細胞を将来の産業的及び臨床的用途に好適とならしめるためには、多能性幹細胞の培養に関連したいくつかの課題が依然として対処されなければならない。最も一般的に使用されている従来の培養系では、hESC及びhiPSCはフィーダー細胞上に維持されながら塊として継代され、広範囲の細胞死及びゲノム異常が防止される(Thomson et al.,1998)。フィーダーを含まない(FF)環境内でhiPSCの単一細胞培養を行えないことは、潜在的な産業規模でのスクリーニングまたは細胞治療用途を大幅に制限する(Skottman et al.,2007;Valamehr et al.,2011)。さらに、hiPSCの改善に関する最近の研究は、導入遺伝子不含ではないレンチウイルス誘導hiPSCに焦点を置いており、そのような研究の治療上の関連性が制限されている。
ゲノム修飾以外の依然として成功裏に対処されるべき別の課題は、培養中のヒト多能性幹細胞の自発的分化の傾向である(Pera and Trounson,2004;Sathananthan and Trounson,2005;Valamehr et al.,2011)。
hESC及びhiPSCにおける研究が説明されているが、ゲノム修飾ヒト多能性幹細胞をもたらす基底状態を維持するためには、多能性遺伝子の連続的異所性発現が必要であり(Hanna et al.,2010a)、これは産業及び臨床グレードの多能性細胞には不適切である。
したがって、ヒト多能性細胞生成物の、ハイスループットの導入遺伝子またはフットプリントを使用しない生成のための組成物及び方法が存在しないことは、これまで、将来の多能性幹細胞治療の開発及び商業化における大きな障害であることが明らかとなっている。
本発明は、概して、改善された細胞培養基盤を提供する。
様々な実施形態において、本発明は、部分的に、(a)Wnt経路アゴニストと;(b)MEK阻害剤と;(c)ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない組成物を企図する。
具体的実施形態において、Wnt経路アゴニストは、GSK3阻害剤である。
ある特定の実施形態において、GSK3阻害剤は、CHIR99021またはBIOである。
追加的実施形態において、MEK阻害剤は、PD98059またはPD032901である。
さらなる実施形態において、ROCK阻害剤は、チアゾビビンまたはY27632である。
いくつかの実施形態において、GSK3阻害剤は、CHIR99021であり、MEK阻害剤は、PD032901であり、ROCK阻害剤は、チアゾビビンである。
ある特定の実施形態において、上記組成物のいずれかは、bFGFまたはLIFをさらに含む。
さらなる実施形態において、上記組成物のいずれかは、bFGF及びLIFをさらに含む。
様々な実施形態において、上記組成物のいずれかを含み、TGFβR阻害剤を含まない培養培地が提供される。
いくつかの実施形態において、1つ以上の多能性細胞を培養する方法であって、1つ以上の多能性細胞を、上記培養培地のいずれかに従う細胞培養培地中で培養することを含む方法。
追加的実施形態において、1つ以上の多能性細胞は、胚幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)である。
具体的実施形態において、1つ以上の多能性細胞は、iPSCである。
ある特定の実施形態において、組成物は、多能性細胞の集団を含む。
さらなる実施形態において、多能性細胞の集団は、多能性細胞の均質集団である。
具体的実施形態において、多能性細胞の集団の少なくとも95%は、SSEA4−FITC及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する。
いくつかの実施形態において、多能性細胞の集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する。
具体的実施形態において、多能性細胞は、TGFβR阻害剤を含む細胞培養培地中で事前に培養されている。
追加的実施形態において、多能性細胞を細胞培養培地中で培養することは、培養された細胞の自発的分化を低減する。
一実施形態において、培養された細胞における1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現は、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。
別の実施形態において、1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される。
さらに別の実施形態において、培養された細胞において、2つ以上の分化マーカー遺伝子の発現は、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における2つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。
さらに別の実施形態において、2つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からな
る群から選択される。
る群から選択される。
具体的実施形態において、培養された細胞において、3つ以上の分化マーカー遺伝子の発現は、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における3つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、3つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される。
追加的実施形態において、培養された細胞において、5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現は、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。
さらなる実施形態において、5つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、多能性細胞を細胞培養培地中で培養することは、多能性の基底状態を維持または誘引する。
具体的実施形態において、1つ以上の多能性細胞の多能性の基底状態は、少なくとも5継代の間維持される。
ある特定の具体的実施形態において、1つ以上の多能性細胞の多能性の基底状態は、少なくとも10継代の間維持される。
さらなる具体的実施形態において、1つ以上の多能性細胞の多能性の基底状態は、少なくとも50継代の間維持される。
追加的な具体的実施形態において、1つ以上の多能性細胞の多能性の基底状態は、少なくとも100継代の間維持される。
様々な実施形態において、上記方法は、継代の間、1つ以上の多能性細胞を解離させることをさらに含む。
ある特定の実施形態において、継代の間、1つ以上の多能性細胞の生存能力が維持される。
ある特定の具体的実施形態において、1つ以上の多能性細胞は、正常核型を含む。
ある特定の追加的実施形態において、1つ以上の多能性細胞は、フィーダーを含まない環境内で培養される。
ある特定のさらなる実施形態において、1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される。
ある特定の関連した実施形態において、1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される。
ある特定の他の実施形態において、1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される。
様々な実施形態において、本発明は、部分的に、多能性細胞をフィーダーを含まない培養に適合させる方法であって、(a)フィーダー細胞の存在下で培養される1つ以上の多能性細胞を単離することと、(b)1つ以上の多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で培養することとを含む方法を企図する。
様々な具体的実施形態において、本発明は、部分的に、単一細胞として酵素的に継代された多能性細胞を培養する方法であって、(a)1つ以上の多能性細胞を酵素的に処理して、単一多能性細胞を継代することと;(b)フィーダーを含まない環境内で単一多能性細胞を培養することと;(c)Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、単一多能性細胞を培養することとを含む方法を企図する。
様々なある特定の実施形態において、本発明は、部分的に、1つ以上の多能性細胞の自発的分化を低減する方法であって、(a)フィーダーを含まない環境内で1つ以上の多能性細胞を培養することと;(b)Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、1つ以上の多能性細胞を培養することとを含む方法を企図する。
様々な追加的実施形態において、本発明は、部分的に、人工多能性幹細胞(iPSC)を製造する方法であって、(a)1つ以上の非多能性細胞を得ることと;(b)1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることと;(c)TGFβR阻害剤を含
まない細胞培養培地中で多能性細胞を培養し、それによりiPSCを生成することとを含む方法を企図する。
まない細胞培養培地中で多能性細胞を培養し、それによりiPSCを生成することとを含む方法を企図する。
具体的実施形態において、1つ以上の非多能性細胞は、体細胞を含む。
いくつかの実施形態において、1つ以上の非多能性細胞は、成体幹細胞を含む。
ある特定の実施形態において、1つ以上の非多能性細胞は、細胞内の内在性OCT4の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされる。
さらなる実施形態において、1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。
追加的実施形態において、1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。
ある特定の実施形態において、1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。
ある特定の実施形態において、1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、NANOG、ECAT1、UTF1、及びESRRBからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。
ある特定の実施形態において、1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、ECAT1、及びUTF1からなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。
具体的実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターである。
いくつかの実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームベクターである。
関連した具体的実施形態において、細胞培養培地は、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含む。
さらなる具体的実施形態において、1つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることは、1つ以上の非多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWntアゴニスト;MEK阻害剤;及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択で
ROCK阻害剤と接触させることを含む。
ROCK阻害剤と接触させることを含む。
追加的実施形態において、iPSCは、iPSCの集団を含む。
具体的実施形態において、iPSCの集団は、iPSCの均質集団である。
具体的実施形態において、iPSCの集団の少なくとも95%は、SSEA4及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する。
ある特定の実施形態において、多能性細胞の集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する。
ある特定の実施形態において、多能性細胞を細胞培養培地中で培養することは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する。
追加的実施形態において、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、iPSCにおいて、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養されたiPSCにおける1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。
具体的実施形態において、1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、自発的分化の低減は、少なくとも5継代の間維持される。
他の実施形態において、自発的分化の低減は、少なくとも10継代の間維持される。
具体的実施形態において、自発的分化の低減は、少なくとも50継代の間維持される。
追加的実施形態において、自発的分化の低減は、少なくとも100継代の間維持される。
さらなる実施形態において、上記方法は、継代の間、iPSCを解離させることを含む。
追加的実施形態において、iPSCの生存能力は、継代の間維持される。
ある特定の実施形態において、iPSCは、正常核型を含む。
他の実施形態において、iPSCは、フィーダーを含まない環境内で培養される。
具体的実施形態において、iPSCのゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される。
追加的実施形態において、iPSCのゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される。
具体的な追加的実施形態において、iPSCのゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される。
様々な実施形態において、本発明は、部分的に、上記実施形態のいずれか1つに従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)を提供する。
様々なある特定の実施形態において、本発明は、部分的に、基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まないiPSCを提供する。
様々な具体的実施形態において、本発明は、部分的に、人工多能性幹細胞(iPSC)を製造する方法であって、(a)1つ以上の多能性幹細胞を得ることと;(b)TGFβR阻害剤を含まない細胞培養培地中で1つ以上の多能性幹細胞を培養し、それにより基底状態iPSCを生成することとを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態において、1つ以上のiPSCは、再プログラムされた体細胞を含む。
追加的実施形態において、1つ以上のiPSCは、再プログラムされた成体幹細胞を含む。
他の実施形態において、1つ以上のiPSCは、1つ以上のiPSC内の内在性OCT4の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされている。
具体的実施形態において、1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている。
ある特定の具体的実施形態において、1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入することにより再プログラムされている。
追加的実施形態において、1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている。
追加的実施形態において、1つ以上のiPSCは、OCT4、NANOG、ECAT1、UTF1、及びESRRBからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている。
別の実施形態において、1つ以上のiPSCは、OCT4、ECAT1、及びUTF1からなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている。
様々な実施形態において、レンチウイルスベクターは、1つ以上のポリヌクレオチドを含む。
具体的実施形態において、エピソームベクターは、1つ以上のポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態において、細胞培養培地は、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含む。
ある特定の実施形態において、1つ以上のiPSCを得ることは、1つ以上の非多能性細胞または部分多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWntアゴニスト;MEK阻害剤;及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤と接触させ、1つ以上のiPSCを生成することを含む。
追加的実施形態において、iPSCは、iPSCの集団を含む。
追加的実施形態において、iPSCの集団は、iPSCの均質集団である。
具体的実施形態において、iPSCの集団の少なくとも95%は、SSEA4及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する。
具体的実施形態において、1つ以上のiPSCは、多能性細胞の集団を再プログラムすることにより得られ、多能性細胞の集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する。
さらなる実施形態において、上記方法は、1つ以上のiPSCを細胞培養培地中で培養することを含み、これは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する。
ある特定の実施形態において、自発的分化が低減されたiPSCは、遺伝子発現を含み、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養されたiPSCにおける1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。
追加的実施形態において、1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される。
他の実施形態において、低減された自発的分化は、少なくとも5継代の間維持される。
ある特定の実施形態において、低減された自発的分化は、少なくとも10継代の間維持される。
追加的実施形態において、低減された自発的分化は、少なくとも50継代の間維持される。
具体的実施形態において、低減された自発的分化は、少なくとも100継代の間維持される。
さらなる実施形態において、上記方法は、継代の間、1つ以上のiPSCを解離させることを含む。
具体的実施形態において、継代の間、1つ以上のiPSCの生存能力が維持される。
他の実施形態において、1つ以上のiPSCは、正常核型を含む。
追加的実施形態において、1つ以上のiPSCは、フィーダーを含まない環境内で培養される。
ある特定の実施形態において、1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される。
追加的実施形態において、1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される。
具体的実施形態において、1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される。
様々な具体的実施形態において、本発明は、部分的に、上記実施形態のいずれか1つに従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)を提供する。
様々な実施形態において、本発明は、部分的に、基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まないiPSCを提供する。
いくつかの実施形態において、非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするための方法であって、非多能性細胞に、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオ
チド、または、(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドを導入し、それにより非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムすることを含む方法が提供される。
チド、または、(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドを導入し、それにより非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムすることを含む方法が提供される。
具体的実施形態において、導入することは、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドを導入することを含む。
別の実施形態において、導入することは、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または(ii)OCT−4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドを導入することを含む。
いくつかの実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにより導入される。
具体的実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
別の実施形態において、多能性細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない。
別の実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、CRE媒介切断により切断される。
いくつかの実施形態において、方法は、非多能性細胞に、(i)SV40LTポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または(ii)SV40LTポリペプチドを導入することをさらに含む。
一実施形態において、方法は、非多能性細胞を、TGFβR阻害剤、Wnt経路アゴニスト、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つと接触させることを含み、Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤である。
別の実施形態において、非多能性細胞は、TGFβR阻害剤、Wnt経路アゴニスト、MEK阻害剤、及びROCK阻害剤と接触させられ、Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤である。
具体的実施形態において、方法は、Wnt経路アゴニストと、MEK阻害剤と、ROCK阻害剤とを含む培養培地中で多能性細胞を培養することをさらに含み、Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤であり、培養培地は、TGFβR阻害剤を含有しない。
いくつかの実施形態において、Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または、MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である。
別の実施形態において、多能性細胞の多能性は、少なくとも5回の細胞分裂または少な
くとも10回の細胞分裂の間維持される。
くとも10回の細胞分裂の間維持される。
具体的実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される。
一実施形態において、多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、多能性細胞内のOCT4発現のために選択することにより、多能性細胞を同定することを含む。
一実施形態において、OCT4発現のために選択することは、異所性Oct−4発現のために選択することを含む。
別の実施形態において、培養することは、多能性幹細胞の集団を生成する。
別の実施形態において、多能性幹細胞の集団は、少なくとも70%均質、少なくとも80%均質、または少なくとも90%均質である。
さらに別の実施形態において、多能性細胞の集団の少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%は、SSEA及びTra−181を発現する。
ある実施形態において、多能性細胞または多能性細胞の集団は、単一細胞継代が可能である。
一実施形態において、単一細胞継代により生成された細胞は、正常核型を有する。
一実施形態において、本発明は、上記方法のいずれか1つに従って生成される多能性細胞を提供する。
別の実施形態において、本発明は、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも1つの外因性ポリペプチドを含む、単離された非多能性細胞を含む組成物を提供する。
一実施形態において、細胞は、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドの少なくとも2つをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも2つの外因性ポリペプチドを含む。
別の実施形態において、細胞は、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドの少なくとも3つをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも3つの外因性ポリペプチドを含む。
1つの具体的実施形態において、細胞は、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性OCT4ポリペプチド、外因性ECAT1ポリペプチド、外因性UTF1ポリペプチド、外因性NANOGポリペプチド、及び外因性ESRRBポリペプチドを含む。
別の実施形態において、細胞は、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または外因性OCT4ポリペプチド、外因性ECAT1ポリペプチド、及び外因性UTF1ポリペプチドを含む。
一実施形態において、細胞は、TGFβR阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つと接触させられている。
別の実施形態において、細胞は、TGFβR阻害剤、Wnt経路活性化因子、MEK阻害剤、及びROCK阻害剤と接触させられており、Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である。
具体的実施形態において、Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または、MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である。
別の実施形態において、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにより非多能性細胞に導入される。
別の実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
具体的実施形態において、細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない。
ある実施形態において、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、CRE媒介切断により除去される。
別の実施形態において、細胞は、SV40LT抗原ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、または外因性SV40LT抗原ポリペプチドを含む。
一実施形態において、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される。
別の実施形態において、多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、OCT4ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している。
1つの具体的実施形態において、本発明は、(i)OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、(ii)ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、(iii)UTF1ポリペプチドをコードするcDNA、(iv)NANOGポリペプチドをコードするcDNA、及び(v)ESRRBポリペプチドをコードするcDNAの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つからなる組成物を提供する。
ある実施形態において、組成物は、OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、UTF1ポリペプチドをコードするcDNA、NANOGポリペプチドをコードするcDNA、及びESRRBポリペプチドをコードするcDNAからなる。
別の実施形態において、組成物は、OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、及びUTF1ポリペプチドをコードするcDNAからなる。
具体的実施形態において、各cDNAは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにコードされる。
一実施形態において、本発明は、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つの再プログラミング因子ポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
ある実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、OCTポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする。
別の実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、OCTポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする。
別の具体的実施形態において、ベクターは、SV40LT抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
一実施形態において、ベクターは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAである。
一実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
1つの具体的実施形態において、本発明は、非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするためのキットであって、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、もしくはESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチド;またはOCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、もしくはESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチド;ならびにTGFβR阻害剤、Wnt経路活性化因子、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つを備え、Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤であるキットを提供する。
ある実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする、または、少なくとも1つのポリペプチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドを含む。
別の実施形態において、1つ以上の1つ以上のポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする、または、少なくとも1つのポリペプチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドを含む。
一実施形態において、キットは、SV40LT抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはSV40LT抗原ポリペプチドを備える。
別の実施形態において、キットは、TGFβR阻害剤と、Wnt経路活性化因子と、MEK阻害剤と、ROCK阻害剤とを備え、Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である。
一実施形態において、Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または、MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である。
別の実施形態において、少なくとも1つのポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにコードされる。
別の実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
一実施形態において、少なくとも1つのポリヌクレオチドは、多シストロン性ベクターにコードされ、各ポリヌクレオチドは、2Aペプチドにより隔てられている。
さらに別の実施形態において、多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする2つ以上のポリヌクレオチドを含む。
具体的実施形態において、OCT4ポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している。
別の具体的実施形態において、本発明は、多能性幹細胞の集団を生成するための方法であって、非多能性細胞の集団を提供することと;非多能性細胞の集団に、選択可能マーカーに連結したOCT4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することと;非多能性細胞の集団の少なくとも一部を多能性細胞に再プログラムするのに十分な条件下で、非多能性細胞の集団をポリヌクレオチドと共にインキュベートすることと;選択可能マーカーを発現する細胞を選択し、それにより多能性幹細胞の集団を提供することとを含む方法を提供する。
別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される。
一実施形態において、複数のポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられる。
さらに別の実施形態において、細胞の集団内の細胞の少なくとも10%は、SSEA及びTRA−181を発現する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
(a)Wnt経路アゴニストと;
(b)MEK阻害剤と;
(c)ROCK阻害剤とを含み、
TGFβR阻害剤を含まない組成物。
(項目2)
前記Wnt経路アゴニストは、GSK3阻害剤である、項目1に記載の前記組成物。
(項目3)
前記GSK3阻害剤は、CHIR99021またはBIOである、項目2に記載の前記組成物。
(項目4)
前記MEK阻害剤は、PD98059またはPD032901である、項目1に記載の前記組成物。
(項目5)
前記ROCK阻害剤は、チアゾビビンまたはY27632である、項目1に記載の前記組成物。
(項目6)
前記GSK3阻害剤は、CHIR99021であり、前記MEK阻害剤は、PD032901であり、前記ROCK阻害剤は、チアゾビビンである、項目1に記載の前記組成物。
(項目7)
bFGFまたはLIFをさらに備える、項目1から6のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目8)
bFGF及びLIFをさらに含む、項目1から6のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目9)
項目1に記載の前記組成物を含み、
TGFβR阻害剤を含まない培養培地。
(項目10)
1つ以上の多能性細胞を培養する方法であって、前記1つ以上の多能性細胞を、項目9に記載の細胞培養培地中で培養することを含む前記方法。
(項目11)
前記1つ以上の多能性細胞は、胚幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)である、項目10に記載の前記方法。
(項目12)
前記1つ以上の多能性細胞は、iPSCである、項目10に記載の前記方法。
(項目13)
前記組成物は、多能性細胞の集団を含む、項目10に記載の前記方法。
(項目14)
多能性細胞の前記集団は、多能性細胞の均質集団である、項目13に記載の前記方法。
(項目15)
多能性細胞の前記集団の少なくとも95%は、SSEA4−FITC及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する、項目13に記載の前記方法。
(項目16)
多能性細胞の前記集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する、項目13に記載の前記方法。
(項目17)
前記多能性細胞は、TGFβR阻害剤を含む細胞培養培地中で事前に培養されている、項目10に記載の前記方法。
(項目18)
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、前記培養された細胞の自発的分化を低減する、項目13に記載の前記方法。
(項目19)
前記培養された細胞における1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目20)
前記1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目19に記載の前記方法。
(項目21)
前記培養された細胞において、2つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における2つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目22)
前記2つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目21に記載の前記方法。
(項目23)
前記培養された細胞において、3つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における3つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目24)
前記3つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目23に記載の前記方法。
(項目25)
前記培養された細胞において、5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目26)
前記5つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目25に記載の前記方法。
(項目27)
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、多能性の基底状態を維持または誘引する、項目18に記載の前記方法。
(項目28)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも5継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目29)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも10継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目30)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも50継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目31)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも100継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目32)
継代の間、前記1つ以上の多能性細胞を解離させることをさらに含む、項目10から31のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目33)
継代の間、前記1つ以上の多能性細胞の生存率が維持される、項目32に記載の前記方法。
(項目34)
前記1つ以上の多能性細胞は、正常核型を含む、項目10から33のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目35)
前記1つ以上の多能性細胞は、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目10から34のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目36)
前記1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される、項目10から35のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目37)
前記1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される、項目10から35のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目38)
前記1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される、項目10から35のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目39)
多能性細胞をフィーダーを含まない培養に適合させる方法であって、
(a)フィーダー細胞の存在下で培養される1つ以上の多能性細胞を単離することと、
(b)前記1つ以上の多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で培養することとを含む前記方法。
(項目40)
単一細胞として酵素的に継代された多能性細胞を培養する方法であって、
(a)1つ以上の多能性細胞を酵素的に処理して、単一多能性細胞を継代することと;
(b)フィーダーを含まない環境内で前記単一多能性細胞を培養することと;
(c)Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、前記単一多能性細胞を培養することとを含む前記方法。
(項目41)
1つ以上の多能性細胞の自発的分化を低減する方法であって、
(a)フィーダーを含まない環境内で前記1つ以上の多能性細胞を培養することと;
(b)Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、前記1つ以上の多能性細胞を培養することとを含む前記方法。
(項目42)
人工多能性幹細胞(iPSC)を製造する方法であって、
(a)1つ以上の非多能性細胞を得ることと;
(b)前記1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることと;
(c)TGFβR阻害剤を含まない細胞培養培地中で前記多能性細胞を培養し、それによりiPSCを生成することとを含む前記方法。
(項目43)
前記1つ以上の非多能性細胞は、体細胞を含む、項目42に記載の前記方法。
(項目44)
前記1つ以上の非多能性細胞は、成体幹細胞を含む、項目42に記載の前記方法。
(項目45)
前記1つ以上の非多能性細胞は、前記細胞内の内在性OCT4の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされる、項目42に記載の前記方法。
(項目46)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目47)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目48)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目49)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、NANOG、ECAT1、UTF1、及びESRRBからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目50)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、ECAT1、及びUTF1からなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目51)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターである、項目46から50のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目52)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームベクターである、項目46から50のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目53)
前記細胞培養培地は、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含む、項目42から52のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目54)
前記1つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることは、前記1つ以上の非多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wntアゴニスト;MEK阻害剤;及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤と接触させることを含む、項目42から53のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目55)
前記iPSCは、iPSCの集団を含む、項目42に記載の前記方法。
(項目56)
iPSCの前記集団は、iPSCの均質集団である、項目55に記載の前記方法。
(項目57)
iPSCの前記集団の少なくとも95%は、SSEA4及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する、項目55に記載の前記方法。
(項目58)
多能性細胞の前記集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、また
はFoxA2を発現する、項目55に記載の前記方法。
(項目59)
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する、項目42から58のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目60)
1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、前記iPSCにおいて、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養されたiPSCにおける1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目59に記載の前記方法。
(項目61)
前記1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目60に記載の前記方法。
(項目62)
自発的分化の前記低減は、少なくとも5継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目63)
自発的分化の前記低減は、少なくとも10継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目64)
自発的分化の前記低減は、少なくとも50継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目65)
自発的分化の前記低減は、少なくとも100継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目66)
継代の間、前記iPSCを解離させることを含む、項目42から65のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目67)
前記iPSCの前記生存率は、継代の間維持される、項目66に記載の前記方法。
(項目68)
前記iPSCは、正常核型を含む、項目42から67のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目69)
前記iPSCは、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目42から68のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目70)
前記iPSCのゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される、項目42から69のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目71)
前記iPSCのゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される、項目42から69のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目72)
前記iPSCのゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される、項目42から69のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目73)
項目42から72のいずれか一項に従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)。
(項目74)
基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まない前記iPSC。
(項目75)
人工多能性幹細胞(iPSC)を製造する方法であって、
(a)1つ以上の多能性幹細胞を得ることと;
(b)TGFβR阻害剤を含まない細胞培養培地中で前記1つ以上の多能性幹細胞を培養し、それにより基底状態iPSCを生成することとを含む前記方法。
(項目76)
前記1つ以上のiPSCは、再プログラムされた体細胞を含む、項目75に記載の前記方法。
(項目77)
前記1つ以上のiPSCは、再プログラムされた成体幹細胞を含む、項目75に記載の前記方法。
(項目78)
前記1つ以上のiPSCは、前記1つ以上のiPSC内の内在性OCT4の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目79)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目80)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目81)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目82)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、NANOG、ECAT1、UTF1、及びESRRBからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目83)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、ECAT1、及びUTF1からなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目84)
レンチウイルスベクターは、前記1つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目79から83のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目85)
エピソームベクターは、前記1つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目79から83のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目86)
前記細胞培養培地は、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含む、項目75に記載の前記方法。
(項目87)
前記1つ以上のiPSC得ることは、前記1つ以上の非多能性細胞または部分多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wntアゴニスト;MEK阻害剤;及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤と接触させ、前記1つ以上のiPSCを生成することを含む、項目75から86のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目88)
前記iPSCは、iPSCの集団を含む、項目75に記載の前記方法。
(項目89)
iPSCの前記集団は、iPSCの均質集団である、項目88に記載の前記方法。
(項目90)
iPSCの前記集団の少なくとも95%は、SSEA4及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する、項目88に記載の前記方法。
(項目91)
前記1つ以上のiPSCは、多能性細胞の集団を再プログラムすることにより得られ、多能性細胞の前記集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する、項目88に記載の前記方法。
(項目92)
前記1つ以上のiPSCを前記細胞培養培地中で培養することは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する、項目75に記載の前記方法。
(項目93)
自発的分化が低減された前記iPSCは、遺伝子発現を含み、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養されたiPSCにおける1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目92に記載の前記方法。
(項目94)
前記1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目93に記載の前記方法。
(項目95)
前記低減された自発的分化は、少なくとも5継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目96)
前記低減された自発的分化は、少なくとも10継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目97)
前記低減された自発的分化は、少なくとも50継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目98)
前記低減された自発的分化は、少なくとも100継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目99)
継代の間、前記1つ以上のiPSCを解離させることを含む、項目75から98のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目100)
継代の間、前記1つ以上のiPSCの生存率が維持される、項目90に記載の前記方法。
(項目101)
前記1つ以上のiPSCは、正常核型を含む、項目75から100のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目102)
前記1つ以上のiPSCは、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目75から101のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目103)
前記1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される、項目75から102のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目104)
前記1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される、項目75から102のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目105)
前記1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される、項目75から102のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目106)
項目75から105のいずれか一項に従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)。
(項目107)
基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まない前記iPSC。
(項目108)
非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするための方法であって、前記非多能性細胞に、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチド、または、(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドを導入し、それにより前記非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムすることを含む前記方法。
(項目109)
導入することは、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドを導入することを含む、項目108に記載の前記方法。
(項目110)
導入することは、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または(ii)OCT−4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドを導入することを含む、項目108に記載の前記方法。
(項目111)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにより導入される、項目108から110のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目112)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目111に記載の前記方法。
(項目113)
前記多能性細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない、項目111に記載の前記方法。
(項目114)
前記1つ以上のポリヌクレオチドが、CRE媒介切断により切断される、項目113に記載の前記方法。
(項目115)
前記非多能性細胞に、(i)SV40LTポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または(ii)SV40LTポリペプチドを導入することをさらに含む、項目108から114のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目116)
前記非多能性細胞を、TGFβR阻害剤、Wnt経路アゴニスト、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つと接触させることをさらに含み、前記Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤である、項目108から115のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目117)
前記非多能性細胞は、TGFβR阻害剤、Wnt経路アゴニスト、MEK阻害剤、及びROCK阻害剤と接触させられ、前記Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤である、項目116に記載の前記方法。
(項目118)
Wnt経路アゴニストと、MEK阻害剤と、ROCK阻害剤とを含む培養培地中で前記多能性細胞を培養することをさらに含み、前記Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤であり、前記培養培地は、TGFβR阻害剤を含有しない、項目108から117のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目119)
(a)前記Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、(b)前記TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、(c)前記GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または(d)前記MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である、項目116から118のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目120)
前記多能性細胞の多能性は、少なくとも5回の細胞分裂または少なくとも10回の細胞分裂の間維持される、項目118または119に記載の前記方法。
(項目121)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目108から120のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目122)
前記多シストロン性ベクターは、Oct4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む、項目121に記載の前記方法。
(項目123)
前記多能性細胞内のOct34発現のために選択することにより、前記多能性細胞を同定することをさらに含む、項目108から122のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目124)
Oct4発現のために選択することは、異所性Oct4発現のために選択することを含む、項目123に記載の前記方法。
(項目125)
培養することは、多能性幹細胞の集団を生成する、項目118から124のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目126)
多能性幹細胞の前記集団は、少なくとも70%均質、少なくとも80%均質、または少なくとも90%均質である、項目125に記載の前記方法。
(項目127)
多能性細胞の前記集団の少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%は、SSEA及びTra−181を発現する、項目125または126に記載の前記方法。
(項目128)
前記多能性細胞または多能性細胞の集団は、単一細胞継代が可能である、項目108から127のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目129)
単一細胞継代により生成された前記細胞は、正常核型を有する、項目128に記載の前記方法。
(項目130)
項目108から129のいずれか一項に記載の前記方法に従って生成される多能性細胞。
(項目131)
(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも1つの外因性ポリペプチドを含む、単離された非多能性細胞を含む組成物。
(項目132)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドの少なくとも2つをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも2つの外因性ポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目133)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドの少なくとも3つをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも3つの外因性ポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目134)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性OCT4ポリペプチド、外因性ECAT1ポリペプチド、外因性UTF1ポリペプチド、外因性NANOGポリペプチド、及び外因性ESRRBポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目135)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性OCT4ポリペプチド、外因性ECAT1ポリペプチド、及び外因性UTF1ポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目136)
前記細胞は、TGFβR阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つと接触させられている、項目121から135のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目137)
前記細胞は、TGFβR阻害剤、Wnt経路活性化因子、MEK阻害剤及びROCK阻害剤と接触せられており、前記Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である、項目136に記載の前記組成物。
(項目138)
(a)前記Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、(b)前記TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、(c)前記GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または(d)前記MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である、項目136または137に記載の前記組成物。
(項目139)
前記1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにより前記非多能性細胞に導入される、項目131から138のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目140)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目139に記載の前記方法。
(項目141)
前記細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない、項目139に記載の前記組成物。
(項目142)
前記1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、CRE媒介切断により除去される、項目141に記載の前記方法。
(項目143)
前記細胞は、(i)SV40LT抗原ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性SV40LT抗原ポリペプチドをさらに含む、項目131から142のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目144)
前記1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目
131から143のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目145)
前記多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む、項目144に記載の前記組成物。
(項目146)
OCT4ポリペプチドをコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している、項目131から145のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目147)
(i)OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、(ii)ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、(iii)UTF1ポリペプチドをコードするcDNA、(iv)NANOGポリペプチドをコードするcDNA、及び(v)ESRRBポリペプチドをコードするcDNAの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つからなる組成物。
(項目148)
OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、UTF1ポリペプチドをコードするcDNA、NANOGポリペプチドをコードするcDNA、及びESRRBポリペプチドをコードするcDNAからなる、項目147に記載の前記組成物。
(項目149)
OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、及びUTF1ポリペプチドをコードするcDNAからなる、項目148に記載の前記組成物。
(項目150)
各cDNAは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにコードされる、項目147から149のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目151)
OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つの再プログラミング因子ポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目152)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、OCTポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする、項目151に記載の前記ベクター。
(項目153)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、OCTポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする、項目152に記載の前記ベクター。
(項目154)
前記ベクターは、SV40LT抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目151から153のいずれか一項に記載の前記ベクター。
(項目155)
レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAである、項目151から154のいずれか一項に記載の前記ベクター。
(項目156)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目155に記載の前記ベクター。
(項目157)
非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするためのキットであって、
(a)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NA
NOGポリペプチド、もしくはESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチド;または
(b)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、もしくはESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチド;ならびに
(c)TGFβR阻害剤、Wnt経路活性化因子、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つを備え、前記Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である、前記キット。
(項目158)
(i)前記1つ以上のポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードし、または、(ii)前記少なくとも1つのポリペプチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドを含む、項目157に記載の前記キット。
(項目159)
(i)前記1つ以上の1つ以上のポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする、または、(ii)前記少なくとも1つのポリペプチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドを含む、項目157に記載の前記キット。
(項目160)
(i)SV40LT抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または(ii)SV40LT抗原ポリペプチドをさらに備える、項目157から159のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目161)
前記キットは、TGFβR阻害剤と、Wnt経路活性化因子と、MEK阻害剤と、ROCK阻害剤とを備え、前記Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である、項目157から160のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目162)
(a)前記Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、(b)前記TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、(c)前記GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または(d)前記MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である、項目157から161のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目163)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドは、レンチウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにコードされる、項目157から162のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目164)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目163に記載の前記キット。
(項目165)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドは、多シストロン性ベクターにコードされ、各ポリヌクレオチドは、2Aペプチドにより隔てられている、項目157から164のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目166)
前記多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする2つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目165に記載の前記キット。
(項目167)
OCT4ポリペプチドをコードする前記少なくとも1つのポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している、項目157から166のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目168)
多能性幹細胞の集団を生成するための方法であって、
a)非多能性細胞の集団を提供することと;
b)非多能性細胞の前記集団に、選択可能マーカーに連結したOCT4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することと;
c)非多能性細胞の前記集団の少なくとも一部を多能性細胞に再プログラムするのに十分な条件下で、非多能性細胞の前記集団を前記ポリヌクレオチドと共にインキュベートすることと;
d)前記選択可能マーカーを発現する細胞を選択し、それにより多能性幹細胞の集団を提供することとを含む前記方法。
(項目169)
前記ポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目168に記載の前記方法。
(項目170)
前記複数のポリヌクレオチドは、2Aペプチドにより隔てられている、項目169に記載の前記方法。
(項目171)
細胞の前記集団内の細胞の少なくとも10%は、SSEA及びTRA−181を発現する、項目169に記載の前記方法。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
(a)Wnt経路アゴニストと;
(b)MEK阻害剤と;
(c)ROCK阻害剤とを含み、
TGFβR阻害剤を含まない組成物。
(項目2)
前記Wnt経路アゴニストは、GSK3阻害剤である、項目1に記載の前記組成物。
(項目3)
前記GSK3阻害剤は、CHIR99021またはBIOである、項目2に記載の前記組成物。
(項目4)
前記MEK阻害剤は、PD98059またはPD032901である、項目1に記載の前記組成物。
(項目5)
前記ROCK阻害剤は、チアゾビビンまたはY27632である、項目1に記載の前記組成物。
(項目6)
前記GSK3阻害剤は、CHIR99021であり、前記MEK阻害剤は、PD032901であり、前記ROCK阻害剤は、チアゾビビンである、項目1に記載の前記組成物。
(項目7)
bFGFまたはLIFをさらに備える、項目1から6のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目8)
bFGF及びLIFをさらに含む、項目1から6のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目9)
項目1に記載の前記組成物を含み、
TGFβR阻害剤を含まない培養培地。
(項目10)
1つ以上の多能性細胞を培養する方法であって、前記1つ以上の多能性細胞を、項目9に記載の細胞培養培地中で培養することを含む前記方法。
(項目11)
前記1つ以上の多能性細胞は、胚幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)である、項目10に記載の前記方法。
(項目12)
前記1つ以上の多能性細胞は、iPSCである、項目10に記載の前記方法。
(項目13)
前記組成物は、多能性細胞の集団を含む、項目10に記載の前記方法。
(項目14)
多能性細胞の前記集団は、多能性細胞の均質集団である、項目13に記載の前記方法。
(項目15)
多能性細胞の前記集団の少なくとも95%は、SSEA4−FITC及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する、項目13に記載の前記方法。
(項目16)
多能性細胞の前記集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する、項目13に記載の前記方法。
(項目17)
前記多能性細胞は、TGFβR阻害剤を含む細胞培養培地中で事前に培養されている、項目10に記載の前記方法。
(項目18)
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、前記培養された細胞の自発的分化を低減する、項目13に記載の前記方法。
(項目19)
前記培養された細胞における1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目20)
前記1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目19に記載の前記方法。
(項目21)
前記培養された細胞において、2つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における2つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目22)
前記2つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目21に記載の前記方法。
(項目23)
前記培養された細胞において、3つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における3つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目24)
前記3つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目23に記載の前記方法。
(項目25)
前記培養された細胞において、5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目26)
前記5つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目25に記載の前記方法。
(項目27)
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、多能性の基底状態を維持または誘引する、項目18に記載の前記方法。
(項目28)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも5継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目29)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも10継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目30)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも50継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目31)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも100継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目32)
継代の間、前記1つ以上の多能性細胞を解離させることをさらに含む、項目10から31のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目33)
継代の間、前記1つ以上の多能性細胞の生存率が維持される、項目32に記載の前記方法。
(項目34)
前記1つ以上の多能性細胞は、正常核型を含む、項目10から33のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目35)
前記1つ以上の多能性細胞は、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目10から34のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目36)
前記1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される、項目10から35のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目37)
前記1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される、項目10から35のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目38)
前記1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される、項目10から35のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目39)
多能性細胞をフィーダーを含まない培養に適合させる方法であって、
(a)フィーダー細胞の存在下で培養される1つ以上の多能性細胞を単離することと、
(b)前記1つ以上の多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で培養することとを含む前記方法。
(項目40)
単一細胞として酵素的に継代された多能性細胞を培養する方法であって、
(a)1つ以上の多能性細胞を酵素的に処理して、単一多能性細胞を継代することと;
(b)フィーダーを含まない環境内で前記単一多能性細胞を培養することと;
(c)Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、前記単一多能性細胞を培養することとを含む前記方法。
(項目41)
1つ以上の多能性細胞の自発的分化を低減する方法であって、
(a)フィーダーを含まない環境内で前記1つ以上の多能性細胞を培養することと;
(b)Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、前記1つ以上の多能性細胞を培養することとを含む前記方法。
(項目42)
人工多能性幹細胞(iPSC)を製造する方法であって、
(a)1つ以上の非多能性細胞を得ることと;
(b)前記1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることと;
(c)TGFβR阻害剤を含まない細胞培養培地中で前記多能性細胞を培養し、それによりiPSCを生成することとを含む前記方法。
(項目43)
前記1つ以上の非多能性細胞は、体細胞を含む、項目42に記載の前記方法。
(項目44)
前記1つ以上の非多能性細胞は、成体幹細胞を含む、項目42に記載の前記方法。
(項目45)
前記1つ以上の非多能性細胞は、前記細胞内の内在性OCT4の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされる、項目42に記載の前記方法。
(項目46)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目47)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目48)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目49)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、NANOG、ECAT1、UTF1、及びESRRBからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目50)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、ECAT1、及びUTF1からなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目51)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターである、項目46から50のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目52)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームベクターである、項目46から50のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目53)
前記細胞培養培地は、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含む、項目42から52のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目54)
前記1つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることは、前記1つ以上の非多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wntアゴニスト;MEK阻害剤;及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤と接触させることを含む、項目42から53のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目55)
前記iPSCは、iPSCの集団を含む、項目42に記載の前記方法。
(項目56)
iPSCの前記集団は、iPSCの均質集団である、項目55に記載の前記方法。
(項目57)
iPSCの前記集団の少なくとも95%は、SSEA4及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する、項目55に記載の前記方法。
(項目58)
多能性細胞の前記集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、また
はFoxA2を発現する、項目55に記載の前記方法。
(項目59)
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する、項目42から58のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目60)
1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、前記iPSCにおいて、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養されたiPSCにおける1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目59に記載の前記方法。
(項目61)
前記1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目60に記載の前記方法。
(項目62)
自発的分化の前記低減は、少なくとも5継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目63)
自発的分化の前記低減は、少なくとも10継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目64)
自発的分化の前記低減は、少なくとも50継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目65)
自発的分化の前記低減は、少なくとも100継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目66)
継代の間、前記iPSCを解離させることを含む、項目42から65のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目67)
前記iPSCの前記生存率は、継代の間維持される、項目66に記載の前記方法。
(項目68)
前記iPSCは、正常核型を含む、項目42から67のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目69)
前記iPSCは、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目42から68のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目70)
前記iPSCのゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される、項目42から69のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目71)
前記iPSCのゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される、項目42から69のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目72)
前記iPSCのゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される、項目42から69のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目73)
項目42から72のいずれか一項に従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)。
(項目74)
基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まない前記iPSC。
(項目75)
人工多能性幹細胞(iPSC)を製造する方法であって、
(a)1つ以上の多能性幹細胞を得ることと;
(b)TGFβR阻害剤を含まない細胞培養培地中で前記1つ以上の多能性幹細胞を培養し、それにより基底状態iPSCを生成することとを含む前記方法。
(項目76)
前記1つ以上のiPSCは、再プログラムされた体細胞を含む、項目75に記載の前記方法。
(項目77)
前記1つ以上のiPSCは、再プログラムされた成体幹細胞を含む、項目75に記載の前記方法。
(項目78)
前記1つ以上のiPSCは、前記1つ以上のiPSC内の内在性OCT4の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目79)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目80)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目81)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目82)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、NANOG、ECAT1、UTF1、及びESRRBからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目83)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、ECAT1、及びUTF1からなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目84)
レンチウイルスベクターは、前記1つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目79から83のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目85)
エピソームベクターは、前記1つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目79から83のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目86)
前記細胞培養培地は、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含む、項目75に記載の前記方法。
(項目87)
前記1つ以上のiPSC得ることは、前記1つ以上の非多能性細胞または部分多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wntアゴニスト;MEK阻害剤;及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤と接触させ、前記1つ以上のiPSCを生成することを含む、項目75から86のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目88)
前記iPSCは、iPSCの集団を含む、項目75に記載の前記方法。
(項目89)
iPSCの前記集団は、iPSCの均質集団である、項目88に記載の前記方法。
(項目90)
iPSCの前記集団の少なくとも95%は、SSEA4及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する、項目88に記載の前記方法。
(項目91)
前記1つ以上のiPSCは、多能性細胞の集団を再プログラムすることにより得られ、多能性細胞の前記集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する、項目88に記載の前記方法。
(項目92)
前記1つ以上のiPSCを前記細胞培養培地中で培養することは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する、項目75に記載の前記方法。
(項目93)
自発的分化が低減された前記iPSCは、遺伝子発現を含み、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養されたiPSCにおける1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目92に記載の前記方法。
(項目94)
前記1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目93に記載の前記方法。
(項目95)
前記低減された自発的分化は、少なくとも5継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目96)
前記低減された自発的分化は、少なくとも10継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目97)
前記低減された自発的分化は、少なくとも50継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目98)
前記低減された自発的分化は、少なくとも100継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目99)
継代の間、前記1つ以上のiPSCを解離させることを含む、項目75から98のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目100)
継代の間、前記1つ以上のiPSCの生存率が維持される、項目90に記載の前記方法。
(項目101)
前記1つ以上のiPSCは、正常核型を含む、項目75から100のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目102)
前記1つ以上のiPSCは、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目75から101のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目103)
前記1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される、項目75から102のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目104)
前記1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される、項目75から102のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目105)
前記1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される、項目75から102のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目106)
項目75から105のいずれか一項に従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)。
(項目107)
基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まない前記iPSC。
(項目108)
非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするための方法であって、前記非多能性細胞に、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチド、または、(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドを導入し、それにより前記非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムすることを含む前記方法。
(項目109)
導入することは、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドを導入することを含む、項目108に記載の前記方法。
(項目110)
導入することは、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または(ii)OCT−4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドを導入することを含む、項目108に記載の前記方法。
(項目111)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにより導入される、項目108から110のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目112)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目111に記載の前記方法。
(項目113)
前記多能性細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない、項目111に記載の前記方法。
(項目114)
前記1つ以上のポリヌクレオチドが、CRE媒介切断により切断される、項目113に記載の前記方法。
(項目115)
前記非多能性細胞に、(i)SV40LTポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または(ii)SV40LTポリペプチドを導入することをさらに含む、項目108から114のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目116)
前記非多能性細胞を、TGFβR阻害剤、Wnt経路アゴニスト、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つと接触させることをさらに含み、前記Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤である、項目108から115のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目117)
前記非多能性細胞は、TGFβR阻害剤、Wnt経路アゴニスト、MEK阻害剤、及びROCK阻害剤と接触させられ、前記Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤である、項目116に記載の前記方法。
(項目118)
Wnt経路アゴニストと、MEK阻害剤と、ROCK阻害剤とを含む培養培地中で前記多能性細胞を培養することをさらに含み、前記Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤であり、前記培養培地は、TGFβR阻害剤を含有しない、項目108から117のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目119)
(a)前記Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、(b)前記TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、(c)前記GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または(d)前記MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である、項目116から118のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目120)
前記多能性細胞の多能性は、少なくとも5回の細胞分裂または少なくとも10回の細胞分裂の間維持される、項目118または119に記載の前記方法。
(項目121)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目108から120のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目122)
前記多シストロン性ベクターは、Oct4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む、項目121に記載の前記方法。
(項目123)
前記多能性細胞内のOct34発現のために選択することにより、前記多能性細胞を同定することをさらに含む、項目108から122のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目124)
Oct4発現のために選択することは、異所性Oct4発現のために選択することを含む、項目123に記載の前記方法。
(項目125)
培養することは、多能性幹細胞の集団を生成する、項目118から124のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目126)
多能性幹細胞の前記集団は、少なくとも70%均質、少なくとも80%均質、または少なくとも90%均質である、項目125に記載の前記方法。
(項目127)
多能性細胞の前記集団の少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%は、SSEA及びTra−181を発現する、項目125または126に記載の前記方法。
(項目128)
前記多能性細胞または多能性細胞の集団は、単一細胞継代が可能である、項目108から127のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目129)
単一細胞継代により生成された前記細胞は、正常核型を有する、項目128に記載の前記方法。
(項目130)
項目108から129のいずれか一項に記載の前記方法に従って生成される多能性細胞。
(項目131)
(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも1つの外因性ポリペプチドを含む、単離された非多能性細胞を含む組成物。
(項目132)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドの少なくとも2つをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも2つの外因性ポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目133)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドの少なくとも3つをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも3つの外因性ポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目134)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性OCT4ポリペプチド、外因性ECAT1ポリペプチド、外因性UTF1ポリペプチド、外因性NANOGポリペプチド、及び外因性ESRRBポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目135)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性OCT4ポリペプチド、外因性ECAT1ポリペプチド、及び外因性UTF1ポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目136)
前記細胞は、TGFβR阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つと接触させられている、項目121から135のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目137)
前記細胞は、TGFβR阻害剤、Wnt経路活性化因子、MEK阻害剤及びROCK阻害剤と接触せられており、前記Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である、項目136に記載の前記組成物。
(項目138)
(a)前記Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、(b)前記TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、(c)前記GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または(d)前記MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である、項目136または137に記載の前記組成物。
(項目139)
前記1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにより前記非多能性細胞に導入される、項目131から138のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目140)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目139に記載の前記方法。
(項目141)
前記細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない、項目139に記載の前記組成物。
(項目142)
前記1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、CRE媒介切断により除去される、項目141に記載の前記方法。
(項目143)
前記細胞は、(i)SV40LT抗原ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性SV40LT抗原ポリペプチドをさらに含む、項目131から142のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目144)
前記1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目
131から143のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目145)
前記多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む、項目144に記載の前記組成物。
(項目146)
OCT4ポリペプチドをコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している、項目131から145のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目147)
(i)OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、(ii)ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、(iii)UTF1ポリペプチドをコードするcDNA、(iv)NANOGポリペプチドをコードするcDNA、及び(v)ESRRBポリペプチドをコードするcDNAの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つからなる組成物。
(項目148)
OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、UTF1ポリペプチドをコードするcDNA、NANOGポリペプチドをコードするcDNA、及びESRRBポリペプチドをコードするcDNAからなる、項目147に記載の前記組成物。
(項目149)
OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、及びUTF1ポリペプチドをコードするcDNAからなる、項目148に記載の前記組成物。
(項目150)
各cDNAは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにコードされる、項目147から149のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目151)
OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つの再プログラミング因子ポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目152)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、OCTポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする、項目151に記載の前記ベクター。
(項目153)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、OCTポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする、項目152に記載の前記ベクター。
(項目154)
前記ベクターは、SV40LT抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目151から153のいずれか一項に記載の前記ベクター。
(項目155)
レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAである、項目151から154のいずれか一項に記載の前記ベクター。
(項目156)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目155に記載の前記ベクター。
(項目157)
非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするためのキットであって、
(a)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NA
NOGポリペプチド、もしくはESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチド;または
(b)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、もしくはESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチド;ならびに
(c)TGFβR阻害剤、Wnt経路活性化因子、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つを備え、前記Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である、前記キット。
(項目158)
(i)前記1つ以上のポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードし、または、(ii)前記少なくとも1つのポリペプチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドを含む、項目157に記載の前記キット。
(項目159)
(i)前記1つ以上の1つ以上のポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする、または、(ii)前記少なくとも1つのポリペプチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドを含む、項目157に記載の前記キット。
(項目160)
(i)SV40LT抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または(ii)SV40LT抗原ポリペプチドをさらに備える、項目157から159のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目161)
前記キットは、TGFβR阻害剤と、Wnt経路活性化因子と、MEK阻害剤と、ROCK阻害剤とを備え、前記Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である、項目157から160のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目162)
(a)前記Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、(b)前記TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、(c)前記GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または(d)前記MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である、項目157から161のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目163)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドは、レンチウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにコードされる、項目157から162のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目164)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目163に記載の前記キット。
(項目165)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドは、多シストロン性ベクターにコードされ、各ポリヌクレオチドは、2Aペプチドにより隔てられている、項目157から164のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目166)
前記多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする2つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目165に記載の前記キット。
(項目167)
OCT4ポリペプチドをコードする前記少なくとも1つのポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している、項目157から166のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目168)
多能性幹細胞の集団を生成するための方法であって、
a)非多能性細胞の集団を提供することと;
b)非多能性細胞の前記集団に、選択可能マーカーに連結したOCT4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することと;
c)非多能性細胞の前記集団の少なくとも一部を多能性細胞に再プログラムするのに十分な条件下で、非多能性細胞の前記集団を前記ポリヌクレオチドと共にインキュベートすることと;
d)前記選択可能マーカーを発現する細胞を選択し、それにより多能性幹細胞の集団を提供することとを含む前記方法。
(項目169)
前記ポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目168に記載の前記方法。
(項目170)
前記複数のポリヌクレオチドは、2Aペプチドにより隔てられている、項目169に記載の前記方法。
(項目171)
細胞の前記集団内の細胞の少なくとも10%は、SSEA及びTRA−181を発現する、項目169に記載の前記方法。
A.概要
多能性細胞の生成及び維持のための現行の方法は、自発的分化がなく、高分解能/高クローン性単一細胞継代及び大規模拡大が容易なフットプリントを含まない多能性細胞の均質培養を、依然として実現していない。基底状態多能性細胞は、これらの課題を克服する品質及び特性をもたらし得る。しかしながら、現在まで、フィーダーを含まない条件下での基底状態多能性細胞のハイスループット生成のための、信頼性のある堅牢な方法は存在しない。したがって、現行の方法は、産業または臨床グレードの多能性細胞の生成には好適となり得ない。本明細書において企図される発明は、基底状態多能性の、またはその特性を有する安定した多能性細胞の堅牢な生成の必要性に対処し、産業及び臨床用途に好適な安定した多能性細胞の製造における問題を解決する。
多能性細胞の生成及び維持のための現行の方法は、自発的分化がなく、高分解能/高クローン性単一細胞継代及び大規模拡大が容易なフットプリントを含まない多能性細胞の均質培養を、依然として実現していない。基底状態多能性細胞は、これらの課題を克服する品質及び特性をもたらし得る。しかしながら、現在まで、フィーダーを含まない条件下での基底状態多能性細胞のハイスループット生成のための、信頼性のある堅牢な方法は存在しない。したがって、現行の方法は、産業または臨床グレードの多能性細胞の生成には好適となり得ない。本明細書において企図される発明は、基底状態多能性の、またはその特性を有する安定した多能性細胞の堅牢な生成の必要性に対処し、産業及び臨床用途に好適な安定した多能性細胞の製造における問題を解決する。
概して、本発明は、多能性細胞、特に、基底状態多能性細胞を含む自発的分化が低減された細胞の改善された製造のための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、段階特異的に細胞シグナル伝達経路の小分子モジュレータを利用し、培養方法及び多能性細胞の誘導方法が下流における使用の変動性及び/またはゲート活性の原因とならない点まで多能性細胞の誘導及び維持を可能にする、複数段階培養基盤に関する。さらに、本明細書において企図される培養基盤は、改善されたゲノム安定性、改善された未分化状態、低減された自発的分化、改善された培養物均質性、培養における改善された生残性、解離、及び単一多能性細胞の継代、ならびに、導入遺伝子またはフットプリントを使用しない基底状態多能性までの細胞の再プログラムを伴う、フィーダーを含まない条件下での多能性細胞の誘導及び維持を可能にする。したがって、本明細書において企図される組成物及び方法は、産業及び臨床用途に適切な多能性細胞、ならびに/または基底状態多能性細胞の製造を可能にする。
現在まで、小分子駆動基盤は、再プログラムを向上させ、ヒト細胞から誘導されたフットプリントを含まない人工多能性幹細胞(iPSC)の単一細胞及びFF培養を補助することは示されていない(Nichols and Smith,2012)。本明細書において企図される培養基盤は、部分的に、段階特異的な小分子阻害剤の特定の組み合わせの適用を提供し、多能性幹細胞の迅速及び堅牢な再プログラムならびに安定な長期培養を可能にする。様々な実施形態において、基底状態多能性を含む改善された未分化多能性状態を誘引または維持するための培養基盤が提供される。本明細書において企図される基盤はまた、ヒトiPSC(hiPSC)における基底状態多能性の生成及び維持のための堅牢な培養系を提供する。一実施形態において、培養基盤は、導入遺伝子またはフットプリントを使用しない再プログラム方法を可能にする。具体的実施形態において、本明細書において企図される基盤は、導入遺伝子を含まないhiPSCの多重誘導及び維持における主要な課題を克服するhiPSCの製造のための改善された方法を示す。
本発明の実践は、具体的に異なるように指定されない限り、当該技術分野の技術の範囲内である、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術、遺伝学、免疫学、細胞生物学、幹細胞プロトコル、細胞培養及び遺伝子導入生物学の従来の方法を使用し、その多くは例示のめに以下に記載される。そのような技術は、文献中に十分説明されている。例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001);Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989);Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,updated July 2008);Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985);Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992);Guthrie and Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press,New York,1991);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,Ed.,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1985);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984);Animal Cell Culture(R.Freshney,Ed.,1986);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);Fire et al.,RNA Interference Technology:From Basic Science to Drug Development(Cambridge University Press,Cambridge,2005);Schepers,RNA Interference in Practice(Wiley−VCH,2005);Engelke,RNA Interference(RNAi):The Nuts&Bolts of siRNA Technology(DNA Press,2003);Gott,RNA Interference,Editing,and Modification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology; Human Press,Totowa,NJ,2004);Sohail,Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application(CRC,2004);Clarke and Sanseau,microRNA:Biology,Function&Expression(Nuts&Bolts series; DNA Press,2006);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986);論文、Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory);Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998);Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987);Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I−IV(D.M.Weir and C.Blackwell,eds.,1986);Riott,Essential Immunology,6th Edition,(Blackwell Scientific Publications,Oxford,1988);Embryonic Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kurstad Turksen,Ed.,2002);Embryonic Stem Cell Protocols:Volume I:Isolation and Characterization(Methods in Molecular Biology)(Kurstad Turksen,Ed.,2006);Embryonic Stem Cell Protocols:Volume II:Differentiation Models(Methods in Molecular Biology)(Kurstad Turksen,Ed.,2006);Human Embryonic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kursad Turksen Ed.,2006);Mesenchymal Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Darwin J.Prockop,Donald G.Phinney,and Bruce A.Bunnell Eds.,2008);Hematopoietic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Medicine)(Christopher A.Klug,and Craig T.Jordan Eds.,2001);Hematopoietic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kevin D.Bunting Ed.,2008) Neural Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Leslie P.Weiner Ed.,2008);Hogan et al.,Methods of Manipulating the Mouse Embyro(2nd Edition,1994);Nagy et al.,Methods of Manipulating the Mouse Embryo(3rd Edition,2002)、及びThe Zebrafish book.A guide for the laboratory use of zebrafish(Danio rerio),4th Ed.,(Univ.of Oregon Press,Eugene,OR,2000)を参照されたい。
本明細書において引用される全ての出版物、特許及び特許出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
B.定義
別段に定義されていない限り、本明細書において使用される技術的及び科学的用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の目的において、以下の用語は、以下のように定義される。
別段に定義されていない限り、本明細書において使用される技術的及び科学的用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の目的において、以下の用語は、以下のように定義される。
冠詞「a」、「an」及び「the」は、本明細書において、冠詞の文法的な目的語の1つまたは2つ以上(すなわち少なくとも1つ)を指すように使用される。例として、「要素(an element)」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
選択肢(例えば「または」)の使用は、選択肢のいずれか一方、両方、またはその任意の組み合わせを意味するように理解されるべきである。
「及び/または」という用語は、選択肢のいずれか一方、または両方を意味するように理解されるべきである。
本明細書において使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さと比較して、最大15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%だけ異なる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに関して、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さ±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、または±1%の範囲を指す。
本明細書において使用される場合、「実質的に」または「本質的に」という用語は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さと比較して、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%以上の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、「本質的に同じ」または「実質的に同じ」という用語は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さとほぼ同じ数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。
本明細書において使用される場合、「〜を実質的に含まない」及び「〜を本質的に含まない」という用語は、交換可能に使用され、細胞集団または培養培地等の組成物を説明するために使用される場合、指定された物質を含まない、例えば指定された物質を95%含まない、96%含まない、97%含まない、98%含まない、99%含まない、または従来の手段により測定した場合検出不可能である組成物を指す。組成物の特定の物質または構成成分の非存在を指す場合、「〜が存在しない」という用語にも同様の意味が適用され得る。
本明細書において使用される場合、「認め得る」という用語は、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量もしくは長さの範囲、または1つ以上の標準的方法により容易に検出可能であるイベントを指す。「認め得ない(not−appreciable)」及び「認め得ない(not appreciable)」という用語は、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量もしくは長さの範囲、または標準的方法により容易に検出可能でない、もしくは検出不可能であるイベントを指す。一実施形態において、イベントは、5%、4%、3%、2%、1%、0.1%、0.01%、0.001%またはそれ未満の確率で生じる場合、認め得ない。
本出願全体を通して、文脈により別の意味が求められない限り、「備える(comprise)」、「備える(comprises)」及び「備える(comprising)」は、示されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含むことを暗示するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外を暗示しないものとして理解される。具体的実施形態において、「含む」、「有する」、「含有する」、及び「備える」という用語は、同義的に使用される。
「〜からなる」とは、「〜からなる」とうい語句に付随するものを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という語句は、列挙された要素が必要または必須であり、他の要素は存在し得ないことを示す。
「本質的に〜からなる」とは、その語句に付随して列挙された任意の要素を含み、列挙された要素に関して本開示において特定された活動または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「本質的に〜からなる」という語句は、列挙された要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択ではなく、列挙された要素の活動または作用に影響するか否かに依存して、存在してもしなくてもよいことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「具体的実施形態」、「関連した実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加的実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせは、実施形態に関連して説明される具体的な特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して、上記の語句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を指すわけではない。さらに、具体的な特徴、構造、または特性は、1つ以上の実施形態に
おいて任意の好適な様式で組み合わされてもよい。
おいて任意の好適な様式で組み合わされてもよい。
「ex vivo」という用語は、概して、生物の外で生じる活動、例えば、好ましくは自然条件を最小限に改変した生物の外の人工的環境において、生体組織内または生体組織上で行われる実験または測定を指す。具体的実施形態において、「ex vivo」手順は、生物から取り出され、通常は無菌条件下で、また典型的には数時間から約24時間までであるが、状況によっては48時間または72時間までの間実験室装置内で培養された生体細胞または組織を含む。ある特定の実施形態において、そのような組織または細胞は、回収及び凍結されてもよく、またその後ex vivo処理のために解凍されてもよい。生体細胞または組織を使用した数日を超える期間続く組織培養実験または手順は、典型的には「in vitro」とみなされるが、ある特定の実施形態において、この用語はex vivoと交換可能に使用され得る。
「in vivo」は、概して、生物内で生じる活動を指す。
本明細書において使用される場合、「再プログラム」または「脱分化」または「細胞能力の増加」または「発生能の増加」という用語は、細胞の能力を増加させる、または細胞をより分化していない状態に脱分化する方法を指す。例えば、増加した細胞能力を有する細胞は、非再プログラム状態における同じ細胞と比較して、発生上の可塑性を有する(すなわち、より多くの細胞型に分化し得る)。換言すれば、再プログラムされた細胞は、非再プログラム状態の同じ細胞よりも分化していない状態にある細胞である。
本明細書において使用される場合、「能力」という用語は、細胞が利用し得る全ての発生上の選択肢の合計(すなわち、発生能)を指す。細胞能力は、最も高い発生能を有する最も可塑性の細胞である全能幹細胞から、最も低い発生能を有する最も非可塑性の細胞である最終分化細胞までの範囲の連続であることが、当業者に認識される。細胞能力の連続は、全能細胞、多能性細胞、多分化能細胞、少分化能細胞、単分化能細胞、及び最終分化細胞を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「多能性」という用語は、体または身体(すなわち胚本体)の全ての系統を形成する細胞の能力を指す。例えば、胚幹細胞は、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の3つの胚葉のそれぞれから細胞を形成することができる多能性幹細胞の種類である。
多能性は、部分的に、細胞の多能性特性を評価することにより決定され得る。多能性特性は、(i)多能性幹細胞形態;(ii)無制限自己再生の可能性;(iii)SSEA1(マウスのみ)、SSEA3/4;SSEA5、TRA1−60/81;TRA1−85、TRA2−54、GCTM−2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30及び/またはCD50を含むがこれらに限定されない多能性幹細胞マーカーの発現;(iv)3つ全ての体細胞系統(外胚葉、中胚葉及び内胚葉)への分化能力;(v)3つの体細胞系統からなる奇形腫形成;ならびに(vi)3つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成を含むが、これらに限定されない。
後期胚盤胞の胚盤葉上層幹細胞(EpiSC)に類似した「プライム」または「準安定」状態の多能性、及び初期/着床前胚盤胞の内部細胞塊に類似した「ナイーブ」または「基底」状態の多能性の、2種類の多能性が以前に説明されている。両方の多能性状態が上述のような特性を示すが、ナイーブまたは基底状態は、さらに、(i)雌性細胞におけるX染色体の事前不活性化または再活性化、(ii)単細胞培養中の改善されたクローン性及び生残性、(iii)DNAメチル化の全体的低減、(iv)発生制御遺伝子プロモーターへのH3K27me3抑制クロマチンマーク堆積の低減、ならびに(v)プライム状態多能性細胞に対する分化マーカーの発現の低減を示す。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、次いでサイレンシングまたは得られた多能性細胞から除去される細胞再プログラムの標準的方法は、概して、プライム状態の多能性の特性を有すると見られる。標準的多能性細胞培養条件下において、そのような細胞は、外因性導入遺伝子発現が維持されない限りプライム状態のままであり、基底状態の特性が観察される。
本明細書において使用される場合、「多能性幹細胞形態」という用語は、胚幹細胞の古典的な形態の特徴を指す。正常な胚幹細胞形態は、丸く小さい形状を特徴とし、高い核対細胞質比、顕著な核小体の存在、及び典型的な細胞間間隔を有する。
本明細書において使用される場合、「遺伝子発現プロファイル」、「遺伝子発現シグニチャー」、「遺伝子発現パネル」、「遺伝子パネル」、または「遺伝子シグニチャー」という用語は、細胞または細胞の集団を別の細胞または細胞の集団から区別するのに役立つ、複数の遺伝子の発現または発現のレベルを指す。例えば、自発的分化を防止するために培地中に維持された多能性細胞の集団は、同じ培地中に維持されていない同じ起源の多能性細胞の対照集団と比較して、分化遺伝子の発現の低下を含む遺伝子発現プロファイルを示し得る。
本明細書において使用される場合、「分化マーカー遺伝子」または「分化遺伝子」という用語は、その発現が、多能性細胞等の細胞内で生じる細胞分化を示す遺伝子を指す。分化マーカー遺伝子は、次の遺伝子:FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「分化マーカー遺伝子プロファイル」もしくは「分化遺伝子プロファイル」、「分化遺伝子発現プロファイル」、「分化遺伝子発現シグニチャー」、「分化遺伝子発現パネル」、「分化遺伝子パネル」、または「分化遺伝子シグニチャー」という用語は、複数の分化マーカー遺伝子の発現または発現のレベルを指す。
具体的実施形態において、自発的分化の減少を示す多能性細胞の集団は、分化マーカー遺伝子の発現の減少または分化マーカー遺伝子プロファイルにより特徴付けられ得る。例えば、多能性細胞または多能性細胞の集団における自発的分化の減少は、所与の培養条件のセットが、同じ培養条件を有さない対照多能性細胞または多能性細胞の集団の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現の少なくとも10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上の減少をもたらした場合に示され得る。
「遺伝子発現」は、本明細書において使用される場合、多能性細胞、または多能性細胞を含む細胞の集団等の生体試料における遺伝子の発現の相対的レベル及び/または発現のパターンを指す。具体的実施形態において、多能性細胞は、iPSCである。
本発明の細胞を特徴付ける遺伝子の発現を検出するための、当該技術分野において利用可能な任意の方法が、本明細書において包含される。本明細書において使用される場合、「発現を検出する」という用語は、遺伝子のRNA転写産物またはその発現産物の数量または存在を決定することを意味する。遺伝子の発現を検出するための、すなわち遺伝子発現プロファイリングのための方法は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、免疫組織化学的方法、及びプロテオミクスに基づく方法を含む。方法は、一般に、関心のある遺伝子の発現産物(例えばmRNA)を検出する。いくつかの実施形態において、PCRに基づく方法、例えば逆転写PCR(RT−PCR)(Weis et al.,TIG 8:263−64,1992)、及びアレイに基づく方法、例えばマイクロアレイ(Schena et al.,Science 270:467−70,1995)が使用される。
「接着」は、槽に付着する細胞、例えば、適切な培養培地の存在下で無菌プラスチック(またはコーティングプラスチック)細胞培養皿またはフラスコに付着する細胞を指す。細胞のある特定のクラスは、それらが細胞培養槽に接着しない限り、培養物中で保持されない、または成長しない。細胞のある特定のクラス(「非接着細胞」)は、接着せずに培養物中で維持及び/または増殖される。
「培養」または「細胞培養」は、in vitro環境における細胞の維持、成長及び/または分化を指す。「細胞培養培地(Cell culture media)」、「培養培地(Cell culture media)」(それぞれの場合において単数形は「medium」)、「補充物」及び「培地補充物」は、細胞培養物を育成する栄養組成物を指す。
「育成する」は、組織または体の外での、例えば無菌プラスチック(またはコーティングプラスチック)細胞培養皿またはフラスコ内での細胞の保持、繁殖(成長)及び/または分化を指す。「育成」は、栄養物、ホルモンならびに/または細胞の繁殖及び/もしくは保持に役立つ他の因子の源として、培養培地を利用してもよい。
本明細書において使用される場合、「解離した」細胞は、他の細胞または表面(例えば培養プレート表面)から実質的に分離または精製された細胞を指す。例えば、細胞は、機械的または酵素的方法により、動物または組織から解離され得る。代替として、in vitroで凝集する細胞は、例えば、クラスタ、単一細胞または単一細胞及びクラスタの混合物の懸濁液中に解離させることにより、互いから酵素的または機械的に解離され得る。さらに別の代替の実施形態において、接着細胞は、培養プレートまたは他の表面から解離される。したがって、解離は、細胞外基質(ECM)及び基板(例えば培養表面)との細胞相互作用の破壊、または細胞間のECMの破壊を含み得る。
本明細書において使用される場合、「濃縮する」及び「濃縮すること」という用語は、細胞の組成物等の組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「濃縮された」は、細胞集団等の細胞の組成物を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量的割合が、濃縮される前の細胞の集団におけるそのような構成成分の割合と比較して増加した細胞の集団を指す。例えば、細胞の集団等の組成物は、標的細胞型(すなわち特定の特性を有する細胞)に関して濃縮されてもよく、したがって、濃縮される前の細胞の集団内に存在する標的細胞の割合と比較して、標的細胞型の割合またはパーセントが増加していてもよい。細胞の集団は、当該技術分野において知られている細胞選択及びソーティング方法により、標的細胞型に関して濃縮されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、本明細書の実施例において説明されるようなソーティングまたは選択プロセスにより濃縮される。具体的実施形態において、標的細胞集団に関して濃縮する方法は、標的細胞集団に関して少なくとも約20%細胞集団を濃縮し、すなわち、濃縮された細胞集団は、比例して、集団が濃縮される前の集団内よりも約20%多い標的細胞型を含む。
一実施形態において、標的細胞集団に関して濃縮する方法は、標的細胞集団に関して、比例して少なくとも約30+%、40+%、50+%、60+%、70+%、80%、85%、90%、95%、97%、98%もしくは99%、または少なくとも約98%、または具体的実施形態において約99%細胞集団を濃縮する。
一実施形態において、標的細胞集団に関して濃縮する方法は、標的細胞集団に関して、比例して少なくとも約30+%、40+%、50+%、60+%、70+%、80%、85%、90%、95%、97%、98%もしくは99%、または少なくとも約98%、または具体的実施形態において約99%細胞集団を濃縮する。
ある特定の実施形態において、細胞の集団は、多能性細胞、または多能性特性を示す細胞の量に関して濃縮される。本発明の具体的実施形態において、再プログラムを受ける細胞の集団は、多能性の特性、例えば、SSEA3、SSEA4、TRA 1−60、TRA−1−81、CD30またはCD50を含むがこれらに限定されない多能性マーカーの発現を有する標的細胞に関して濃縮される。
具体的実施形態において、細胞の集団、例えば再プログラムを受ける細胞の集団は、例えばCD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、またはCD7を含み得る、分化細胞系統または非多能性細胞に特異的な表面マーカーを使用して、非多能性細胞が枯渇している。したがって、得られる細胞集団は、多能性細胞が濃縮された細胞の集団であると説明され得る。
具体的実施形態において、濃縮された細胞は、異なる遺伝子またはタンパク質発現プロファイル、例えば、SSEA3、SSEA4、TRA 1−60、TRA−1−81、CD30及びCD50等の少なくとも2つの多能性マーカーの細胞表面発現を有する。いくつかの実施形態において、濃縮された細胞は、2つ以上の多能性マーカーを含む。具体的実施形態において、濃縮された細胞は、TRA−181またはTRA−160と組み合わせてSSEA4を発現する。より具体的な実施形態において、濃縮された細胞は、SSEA4、TRA181、及びCD30を発現する。一実施形態において、細胞の集団は、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、70%、75%、80%、90%、95%、97%、98%、または99%の濃縮された細胞、例えば多能性細胞を含む。
したがって、いくつかの実施形態において、多能性細胞に関して細胞の集団を濃縮する方法は、細胞集団を、SSEA3、SSEA4、TRA 1−60、TRA−1−81、CD30及びCD50等の多能性マーカーの細胞表面発現に基づいてソーティングすることと、そのようなマーカーを発現する細胞の分画を回収して、多能性細胞が濃縮された細胞の集団を得ることを含む。他の実施形態において、細胞の集団は、細胞集団を、CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、及びCD7等の、分化している、または分化した細胞のマーカーの細胞表面発現に基づいてソーティングすること、ならびに、そのような細胞の細胞集団を枯渇させて、多能性細胞が濃縮された細胞の集団を得ることにより、多能性細胞に関して濃縮される。具体的実施形態において、細胞集団は、CD13の発現に基づいてソーティングされ、細胞集団からCD13+細胞が除去されて、多能性細胞が濃縮された細胞の集団が得られる。
本明細書において使用される場合、「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、第2の種類の細胞と共培養されて第2の種類の細胞が成長し得る環境を提供する(フィーダー細胞が第2の細胞型を補助するための成長因子及び栄養物を提供するため)1つの種類の細胞を説明するために使用される用語である。フィーダー細胞は、任意選択で、それらが補助している細胞とは異なる種からのものである。例えば、幹細胞を含むある特定の種類のヒト細胞は、マウス胎児線維芽細胞及び不死化マウス胎児線維芽細胞の初代培養物により補助され得る。フィーダー細胞は、典型的には、他の細胞と共培養される場合、それらが補助している細胞の過剰成長を防止するために、放射線照射またはマイトマイシンC等の抗分裂剤による処理によって不活性化され得る。上記に限定されず、1つの特定のフィーダー細胞の種類は、ヒトフィーダー、例えばヒト皮膚線維芽細胞であってもよい。別の
フィーダー細胞の種類は、マウス胎児線維芽細胞(MEF)であってもよい。
フィーダー細胞の種類は、マウス胎児線維芽細胞(MEF)であってもよい。
本明細書において使用される場合、「フィーダーを含まない」(FF)環境は、例えば、フィーダー細胞を本質的に含まない、及び/またはフィーダー細胞の育成により事前に調整されていない細胞培養物または培養培地等の環境を指す。「事前に調整された」培地は、培地中で所定期間、例えば少なくとも1日フィーダー細胞が育成された後に採取された培地を指す。事前調整された培地は、培地中で育成されたフィーダー細胞により分泌された成長因子及びサイトカインを含む、多くのメディエーター物質を含有する。
ゲノム安定性は、DNAを忠実に複製し、DNA複製プロセスの完全性を維持する細胞の能力を指す。本明細書において使用される場合、「ゲノム安定細胞」及び「ゲノム安定性を有する細胞」という用語は、正常ヒト体細胞に対する突然変異及び染色体異常の頻度に実質的に類似した突然変異及び染色体異常(例えば転座、異数性、複製数の多様性及び重複)の頻度を示す細胞を指す。
「成分」は、細胞の成長及び/または分化を維持及び/または促進するために細胞培養培地中に使用され得る、元来化学的または生物学的な任意の化合物または他の材料を指す。「構成成分」、「栄養物」及び「成分」という用語は、交換可能に使用され得る。細胞培養培地に使用される従来の成分は、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質等を含み得るが、これらに限定されない。ex vivoで細胞の育成を促進及び/または維持する他の成分は、所望の効果のために必要に応じて当業者により選択され得る。
「単離する」または「単離すること」は、その自然環境から組成物または材料を分離及び回収すること、例えば組織または体からの個々の細胞または細胞培養物の分離を指す。一態様において、細胞の集団または組成物は、細胞、及び細胞が自然において関連し得る材料を実質的に含まない。細胞の標的集団に関連して、「単離された」または「精製された」または「実質的に純粋な」は、全細胞集団を構成する標的細胞に関して、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、及び具体的実施形態において少なくとも約95%純粋である細胞の集団を指す。細胞の集団または組成物の純度は、当該技術分野において周知の適切な方法により評価され得る。例えば、多能性細胞の実質的に純粋な集団は、全細胞集団を構成する多能性細胞に関して、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、及び具体的実施形態において少なくとも約95%、及びある特定の実施形態において約98%純粋である細胞の集団を指す。「本質的に純粋な」という用語は、本明細書において、「実質的に純粋な」と交換可能に使用される。
「継代」または「継代すること」は、細胞が所望の程度まで増殖した際に、複数の細胞培養表面または槽に細胞を小分け及び播種する行為を指す。いくつかの実施形態において、「継代」または「継代すること」は、細胞を小分け、希釈及び播種することを指す。細胞が初代培養表面または槽から表面または槽の後続のセットに継代されると、後続の培養は、本明細書において「二次培養」または「第1継代」等と呼ぶことができる。新たな培養槽への小分け及び播種の各行為は、1つの継代とみなされる。
「播種」は、細胞が細胞培養槽に接着する、またはそれに展着するように、細胞(複数を含む)を培養槽内に入れることを指す。
「多能性因子」は、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、細胞の発生能を増加させることができる薬剤をさす。多能性因子は、限定されることなく、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び細胞の発生能を増加させることができる小分子を含む。例示的な多能性
因子は、例えば、転写因子及び小分子再プログラム剤を含む。
因子は、例えば、転写因子及び小分子再プログラム剤を含む。
「増殖する」は、2つの本質的に同一の細胞に、または数が増加する(例えば再生する)細胞の集団に分裂する1つの細胞の性質を指す。
「繁殖」は、組織または体の外で、例えばプラスチック(またはコーティングプラスチック)細胞培養皿またはフラスコ等の無菌容器内で細胞を成長させる(例えば細胞増殖により再生する)ことを指す。
「初期培養物」は、単離された細胞が培養培地を有する第1の培養槽内に入れられる場合の細胞、組織及び/または培養物を指す。細胞、組織及び/または培養物は、保持されてもよく、及び/または増殖されてもよいが、細胞、組織及び/または培養物が第1の槽内に維持される限り、細胞、組織及び/または培養物は初期培養物と呼ばれる。
「小分子再プログラム剤」または「小分子再プログラム化合物」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、単独で、または他の多能性因子と組み合わせて細胞の発生能を増加させることができる小分子を指す。「小分子」は、約5kD未満、約4kD未満、約3kD未満、約2kD未満、約1kD未満、または約0.5kD未満の分子量を有する薬剤を指す。小分子は、核酸、ペプチド模倣体、ペプトイド、炭水化物、脂質、または他の有機もしくは無機分子を含むが、これらに限定されない。真菌、細菌、または藻類抽出物等の化学的及び/または生物学的混合物のライブラリが当該技術分野において知られており、ある特定の実施形態において小分子の源として使用され得る。具体的実施形態において、本明細書において使用される小分子再プログラム剤は、10,000ダルトン未満、例えば8000、6000、4000、2000ダルトン未満、例えば50〜1500、500〜1500、200〜2000、500〜5000ダルトンの間の分子量を有する。
C.細胞
C.細胞
具体的実施形態において、本明細書において企図される組成物及び方法を使用して、1つ以上の細胞が培養、解離、及び継代されてもよい。一実施形態において、本明細書において企図される組成物及び方法を使用して、単一細胞が培養、解離、及び継代される。別の実施形態において、本明細書において企図される組成物及び方法を使用して、細胞の集団または複数の細胞が培養、解離、及び継代される。
具体的実施形態における使用に好適な出発細胞集団は、本質的に任意の好適な源から誘導され得、細胞型または多能性の状態に関して不均質または均質であってもよい。好適な細胞は、胎児細胞及び成体細胞を含む。さらに、好適な細胞は、元来哺乳動物細胞であってもよく、例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、または霊長類からのものであってもよい。一実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。
細胞は、体細胞、非多能性細胞、不完全もしくは部分多能性幹細胞、多分化能細胞、少分化能細胞、単分化能細胞、最終分化細胞、または上記の任意の組み合わせを含む混合細胞集団であってもよい。具体的実施形態における使用に好適な多能性細胞は、自然発生的幹細胞、胚幹細胞、またはiPSCを含むが、これらに限定されない。「混合」細胞集団は、様々な程度の発生能を有する細胞の集団である。例えば、混合細胞集団は、再プログラムを受けている細胞を含んでもよく、したがって混合集団は多能性細胞、部分多能性細胞、及び非多能性細胞、例えば完全分化細胞を含む。
一実施形態において、出発細胞集団は、成体または新生児幹/前駆細胞から選択される。具体的実施形態において、出発幹/前駆体細胞集団は、中胚葉幹/前駆細胞、内胚葉幹
/前駆細胞、及び外胚葉幹/前駆細胞からなる群から選択される。
/前駆細胞、及び外胚葉幹/前駆細胞からなる群から選択される。
中胚葉幹/前駆細胞の実例は、中胚葉幹/前駆細胞、内皮幹/前駆細胞、骨髄幹/前駆細胞、臍帯幹/前駆細胞、脂肪組織誘導幹/前駆細胞、造血幹/前駆細胞(HSC)、間充織幹/前駆細胞、筋幹/前駆細胞、腎臓幹/前駆細胞、骨芽幹/前駆細胞、軟骨幹/前駆細胞等を含むが、これらに限定されない。
外胚葉幹/前駆細胞の実例は、神経幹/前駆細胞、網膜幹/前駆細胞、皮膚幹/前駆細胞等を含むが、これらに限定されない。
内胚葉幹/前駆細胞の実例は、肝臓幹/前駆細胞、膵臓幹/前駆細胞、上皮幹/前駆細胞等を含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、出発細胞集団は、膵島細胞、CNS細胞、PNS細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、造血細胞、骨細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、肺細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、瀘胞細胞、血管細胞、上皮細胞、免疫細胞、内皮細胞等からなる群から選択される、不均質または均質細胞集団であってもよい。
D.自発的分化を低減するため、及び基底状態多能性を誘引するための培養基盤
細胞バンキング、疾患モデリング及び細胞治療用途は、高品質多能性細胞の製造に対して益々多くの要求を課している。例えば、ハイスループットのフットプリントを含まないiPSCの誘導、及び大規模生産を可能にするシステムにおけるその拡大は、技術的に実現しにくい状態が続いている。具体的実施形態において、段階特異的培地組成物中での小分子経路阻害剤を使用した多能性細胞の迅速な並列生成、選択及び拡大を可能にする培養基盤が企図される。本明細書において企図される基盤は、完全にフィーダーを含まない環境において、最小限の再プログラミング因子を使用して効率的及び迅速化された再プログラムを補助し、多能性細胞の単一細胞培養及び拡大を可能にしながら、均質及びゲノム安定性多能性集団を維持する。さらに、本明細書において企図される培養基盤は、遺伝的背景とは無関係に、及び導入遺伝子発現とは独立して、hESC及びhiPSCを含む多能性細胞を、自発的分化の低減された状態、及び一般的な多能性の基底状態まで培養することを提供する。
細胞バンキング、疾患モデリング及び細胞治療用途は、高品質多能性細胞の製造に対して益々多くの要求を課している。例えば、ハイスループットのフットプリントを含まないiPSCの誘導、及び大規模生産を可能にするシステムにおけるその拡大は、技術的に実現しにくい状態が続いている。具体的実施形態において、段階特異的培地組成物中での小分子経路阻害剤を使用した多能性細胞の迅速な並列生成、選択及び拡大を可能にする培養基盤が企図される。本明細書において企図される基盤は、完全にフィーダーを含まない環境において、最小限の再プログラミング因子を使用して効率的及び迅速化された再プログラムを補助し、多能性細胞の単一細胞培養及び拡大を可能にしながら、均質及びゲノム安定性多能性集団を維持する。さらに、本明細書において企図される培養基盤は、遺伝的背景とは無関係に、及び導入遺伝子発現とは独立して、hESC及びhiPSCを含む多能性細胞を、自発的分化の低減された状態、及び一般的な多能性の基底状態まで培養することを提供する。
本明細書において企図される培養基盤は、部分的に、培養における自発的分化が低減された産業または臨床グレード多能性細胞の生成に有用である。一実施形態において、非多能性細胞が、多能性細胞となるように誘引され、多能性を維持するように培養される。別の実施形態において、非多能性細胞が、多能性細胞となるように誘引され、培養における低減された自発的分化を達成及び/または維持するように培養される。別の実施形態において、非多能性細胞が、多能性細胞となるように誘引され、基底状態多能性を達成及び/または維持するように培養される。
様々な実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、1つ以上の多能性細胞の基底状態多能性、正常核型、及びゲノム安定性を、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100またはそれ以上の継代(任意の介在する継代数を含む)の間維持する。
他の実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、1つ以上の多能性細胞における低減された自発的分化を、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100またはそれ以上の継代(任意の介在する継代数を含む)の間維持する。
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100またはそれ以上の継代(任意の介在する継代数を含む)の間維持する。
一実施形態において、培養基盤は、細胞培養培地、ならびにGSK−3阻害剤、MEK阻害剤及びRho Kinase(ROCK)阻害剤を含む細胞培養培地を含む。様々な実施形態において、本明細書において企図される細胞培養培地は、TGFβ受容体(TGFβR)阻害剤及びALK5阻害剤を含む、TGFβ/アクチビンシグナル伝達経路の阻害剤を含まない、またはそれを有さない。任意の具体的理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、驚くべきことに、TGFβR/ALK5阻害剤が再プログラムの効率を増加させる一方で、これらの阻害剤は多能性細胞集団の長期維持、品質及び均質性に反作用することを発見し、すなわち、TGFβ経路シグナル伝達の阻害は、細胞再プログラムの効率を改善したが、自発的分化が低減された均質多能性集団が好ましい場合、より具体的には導入遺伝子発現が存在しない場合、in vitro培養系、特にフィーダー細胞を含まない単一細胞酵素的継代を使用した系における、多能性細胞集団のその後の維持には、この阻害からの解放が必要である。さらに、GSK−3阻害剤及びMEK阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤を含むが、TGFβR/ALK5阻害剤を有さない培地中での準安定多能性細胞の培養は、本明細書において開示されるように、多能性細胞を移行させ、自発的分化の低減を達成、及び/または基底状態多能性を達成する。本明細書において企図される培養培地基盤はまた、フィーダーを含まない環境内での多能性細胞の効率的な再プログラム及び長期培養を可能にする。さらに、「ALK5阻害剤」は、非特異的キナーゼ阻害剤を包含することを意図しないが、「ALK5阻害剤」は、ALK5に加えてALK4及び/またはALK7を阻害する阻害剤、例えばSB−431542等を包含するものとして理解されるべきである(例えば、Inman,et al.,J Mol.Pharmacol.62(1):65−74(2002)を参照されたい)。
好ましい実施形態において、培養基盤は、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、Rho Kinase(ROCK)阻害剤、ならびに任意選択でLIF及び/またはbFGFを含む細胞培養培地を含み、TGFβRまたはALK5阻害剤を含むがこれらに限定されないTGFβ/アクチビンシグナル伝達経路の小分子阻害剤を含まない。
追加的実施形態において、細胞培養培地は、サイトカイン及び/または成長因子を実質的に含まず、任意選択でフィーダーを含まない環境である。他の実施形態において、細胞培養培地は、血清、抽出物、成長因子、ホルモン、サイトカイン等の補充物を含有する。
1つの好ましい実施形態において、培養基盤は、フィーダーを含まない培養物を含む。
本明細書において企図される培養基盤はまた、自発的発現が低減され、及び/または基底状態多能性を達成する産業または臨床グレード多能性細胞の均質集団の製造等の、多くの利点を提供する。本明細書において使用される場合、「均質」という用語は、各細胞が集団内の他の細胞と同じ、または実質的に同じである細胞の集団を指す。一実施形態において、細胞は、各細胞が、本明細書において企図されるような同じ多能性マーカーの1つ以上、例えばSSEA4及びTRA1−81を発現する場合、集団内の他の細胞と同じである。一実施形態において、細胞の少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上が、集団内の他の細胞と同じまたは実質的に同じである場合、集団は均質である。
1.TGFB受容体/ALK5阻害剤
TGFβ受容体(例えばALK5)阻害剤は、TGFβ受容体(例えばALK5)に対する抗体、そのドミナントネガティブ変異体、及びその発現を抑制するアンチセンス核酸を含み得る。例示的なTGFβ受容体/ALK5阻害剤は、SB431542(例えば、Inman,et al.,Molecular Pharmacology 62(1):65−74(2002)を参照されたい)、3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミドとしても知られるA−83−01(例えば、Tojo,et al.,Cancer Science 96(11):791−800(2005)を参照されたく、例えばToicris Bioscienceから市販されている);2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジン、Wnt3a/BIO(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Dalton,et al.,WO2008/094597を参照されたい)、BMP4(Dalton、上記参照を参照されたい)、GW788388(−{4−[3−(ピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル]ピリジン−2−イル}−N−(テトラヒドロ−2H−ピラン−4−イル)ベンズアミド)(例えば、Gellibert,et al.,Journal of Medicinal Chemistry 49(7):2210−2221(2006)を参照されたい)、SM16(例えば、Suzuki,et al.,Cancer Research 67(5):2351−2359(2007)を参照されたい)、IN−1130(3−((5−(6−メチルピリジン−2−イル)−4−(キノキサリン−6−イル)−1H−イミダゾール−2−イル)メチル)ベンズアミド)(例えば、Kim,et al.,Xenobiotica 38(3):325−339(2008)を参照されたい)、GW6604(2−フェニル−4−(3−ピリジン−2−イル−1H−ピラゾール−4−イル)ピリジン)(例えば、de Gouville,et al.,Drug News Perspective 19(2):85−90(2006)を参照されたい)、SB−505124(2−(5−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−2−tert−ブチル−3H−イミダゾール−4−イル)−6−メチルピリジン塩酸塩)(例えば、DaCosta,et al.,Molecular Pharmacology 65(3):744−752(2004)を参照されたい)及びピリミジン誘導体(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Stiefl,et al.,WO2008/006583において列挙されているものを参照されたい)を含むが、これらに限定されない。さらに、「ALK5阻害剤」は、非特異的キナーゼ阻害剤を包含することを意図しないが、「ALK5阻害剤」は、ALK5に加えてALK4及び/またはALK7を阻害する阻害剤、例えばSB−431542等を包含するものとして理解されるべきである(例えば、Inman,et al.,J Mol.Pharmacol.62(1):65−74(2002)を参照されたい)。本発明の範囲を限定することを意図しないが、ALK5阻害剤は、上皮間葉転換/移行(MET)プロセスに影響すると考えられる。TGFβ/アクチビン経路は、間葉上皮移行(EMT)の駆動機構である。したがって、TGFβ/アクチビン経路の阻害は、MET(すなわち再プログラム)プロセスを促進し得る。
TGFβ受容体(例えばALK5)阻害剤は、TGFβ受容体(例えばALK5)に対する抗体、そのドミナントネガティブ変異体、及びその発現を抑制するアンチセンス核酸を含み得る。例示的なTGFβ受容体/ALK5阻害剤は、SB431542(例えば、Inman,et al.,Molecular Pharmacology 62(1):65−74(2002)を参照されたい)、3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミドとしても知られるA−83−01(例えば、Tojo,et al.,Cancer Science 96(11):791−800(2005)を参照されたく、例えばToicris Bioscienceから市販されている);2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジン、Wnt3a/BIO(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Dalton,et al.,WO2008/094597を参照されたい)、BMP4(Dalton、上記参照を参照されたい)、GW788388(−{4−[3−(ピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル]ピリジン−2−イル}−N−(テトラヒドロ−2H−ピラン−4−イル)ベンズアミド)(例えば、Gellibert,et al.,Journal of Medicinal Chemistry 49(7):2210−2221(2006)を参照されたい)、SM16(例えば、Suzuki,et al.,Cancer Research 67(5):2351−2359(2007)を参照されたい)、IN−1130(3−((5−(6−メチルピリジン−2−イル)−4−(キノキサリン−6−イル)−1H−イミダゾール−2−イル)メチル)ベンズアミド)(例えば、Kim,et al.,Xenobiotica 38(3):325−339(2008)を参照されたい)、GW6604(2−フェニル−4−(3−ピリジン−2−イル−1H−ピラゾール−4−イル)ピリジン)(例えば、de Gouville,et al.,Drug News Perspective 19(2):85−90(2006)を参照されたい)、SB−505124(2−(5−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−2−tert−ブチル−3H−イミダゾール−4−イル)−6−メチルピリジン塩酸塩)(例えば、DaCosta,et al.,Molecular Pharmacology 65(3):744−752(2004)を参照されたい)及びピリミジン誘導体(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Stiefl,et al.,WO2008/006583において列挙されているものを参照されたい)を含むが、これらに限定されない。さらに、「ALK5阻害剤」は、非特異的キナーゼ阻害剤を包含することを意図しないが、「ALK5阻害剤」は、ALK5に加えてALK4及び/またはALK7を阻害する阻害剤、例えばSB−431542等を包含するものとして理解されるべきである(例えば、Inman,et al.,J Mol.Pharmacol.62(1):65−74(2002)を参照されたい)。本発明の範囲を限定することを意図しないが、ALK5阻害剤は、上皮間葉転換/移行(MET)プロセスに影響すると考えられる。TGFβ/アクチビン経路は、間葉上皮移行(EMT)の駆動機構である。したがって、TGFβ/アクチビン経路の阻害は、MET(すなわち再プログラム)プロセスを促進し得る。
ALK5を阻害する効果を示す本明細書におけるデータを考慮して、TGFβ/アクチビン経路の阻害は、ALK5の阻害の同様の効果を有すると考えられる。したがって、TGFβ/アクチビン経路の任意の阻害剤(例えば上流または下流)は、本明細書における各段落で説明されるようなALK5阻害剤と組み合わせて、またはその代わりとして使用され得る。例示的なTGFβ/アクチビン経路阻害剤は、TGFβ受容体阻害剤、SMAD2/3リン酸化の阻害剤、SMAD2/3及びSMAD4の相互作用の阻害剤、ならびにSMAD6及びSMAD7の活性化因子/アゴニストを含むが、これらに限定されない。さらに、以下で説明されるカテゴリー化は、単に体系化を目的としたものであり、化合物は経路内の1つ以上の点に影響し得ること、したがって化合物は定義されたカテゴリーの2つ以上において機能し得ることが、当業者に知られている。
TGFβ受容体(TGFβR)阻害剤は、TGFβ受容体に対する抗体、そのドミナントネガティブ変異体、及びそれを標的化するsiRNAまたはアンチセンス核酸を含み得る。TGFβ受容体阻害剤の具体例は、SU5416;2−(5−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−2−tert−ブチル−3H−イミダゾール−4−イル)−6−メチルピリジン塩酸塩(SB−505124);レルデリムマブ(CAT−152);メテリムマブ(CAT−192);GC−1008;ID11;AP−12009;AP−11014;LY550410;LY580276;LY364947;LY2109761;SB−505124;SB−431542;SD−208;SM16;NPC−30345;Ki26894;SB−203580;SD−093;グリベック;3,5,7,2’,4’−ペンタヒドロキシフラボン(モリン);アクチビン−M108A;P144;可溶性TBR2−Fc;及びTGFβ受容体を標的化するアンチセンストランスフェクト腫瘍細胞を含むが、これらに限定されない(例えば、Wrzesinski,et al.,Clinical Cancer Research 13(18):5262−5270(2007);Kaminska,et al.,Acta Biochimica Polonica 52(2):329−337(2005);及びChang,et al.,Frontiers in Bioscience 12:4393−4401(2007)を参照されたい)。
SMAD2/3リン酸化の阻害剤は、SMAD2またはSMAD3に対する抗体、そのドミナントネガティブ変異体、及びそれらを標的化するアンチセンス核酸を含み得る。阻害剤の具体例は、PD169316;SB203580;SB−431542;LY364947;A77−01;及び3,5,7,2’,4’−ペンタヒドロキシフラボン(モリン)を含む(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Wrzesinski,上記参照;Kaminska,上記参照;Shimanuki,et al.,Oncogene 26:3311−3320(2007);及びKataoka,et al.,EP1992360を参照されたい)。
SMAD2/3及びsmad4の相互作用の阻害剤は、SMAD2、SMAD3及び/またはsmad4に対する抗体、そのドミナントネガティブ変異体、及びそれらを標的化するアンチセンス核酸を含み得る。SMAD2/3及びSMAD4の相互作用の阻害剤の具体例は、Trx−SARA、Trx−xFoxH1b及びTrx−Lef1を含むが、これらに限定されない(例えば、Cui,et al.,Oncogene 24:3864−3874(2005)及びZhao,et al.,Molecular Biology of the Cell,17:3819−3831(2006)を参照されたい)。
SMAD6及びSMAD7の活性化因子/アゴニストは、SMAD6またはSMAD7に対する抗体、そのドミナントネガティブ変異体、及びそれらを標的化するアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。阻害剤の具体例は、smad7−as PTO−オリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない.(例えば、共に参照により本明細書に組み込まれる、Miyazono,et al.,US6534476、及びSteinbrecher,et al.,US2005119203を参照されたい)。
2.WNT経路アゴニスト
本明細書において使用される場合、「Wntシグナル促進剤」、「Wnt経路活性化剤」、または「Wnt経路アゴニスト」は、Wntl、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、Wnt10a、Wntl0b、Wnt11、Wnt14、Wnt15、またはWnt16の1つ以上のアゴニストを含むがこれらに限定されない、Wntシグナル伝達経路のアゴニストを指す。Wnt経路アゴニストは、以下のポリペプチド:Dkkポリペプチド、三日月型ポリペプチド(crescent polypeptide)、ケルベロスポリペプチド(cerberus polypeptide)、アキシンポリペプチド(axin polypeptide)、Frzbポリペプチド、T細胞因子ポリペプチド、もしくはドミナントネガティブ無秩序ポリペプチド(disheveled polypeptide)またはその断片の1つ以上を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「Wntシグナル促進剤」、「Wnt経路活性化剤」、または「Wnt経路アゴニスト」は、Wntl、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、Wnt10a、Wntl0b、Wnt11、Wnt14、Wnt15、またはWnt16の1つ以上のアゴニストを含むがこれらに限定されない、Wntシグナル伝達経路のアゴニストを指す。Wnt経路アゴニストは、以下のポリペプチド:Dkkポリペプチド、三日月型ポリペプチド(crescent polypeptide)、ケルベロスポリペプチド(cerberus polypeptide)、アキシンポリペプチド(axin polypeptide)、Frzbポリペプチド、T細胞因子ポリペプチド、もしくはドミナントネガティブ無秩序ポリペプチド(disheveled polypeptide)またはその断片の1つ以上を含むが、これらに限定されない。
Wnt経路アゴニストの限定されない例は、Wntポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Wntポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、活性化Wnt受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、活性化Wnt受容体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、Wnt/β−カテニンシグナル伝達を促進する小有機分子、Wnt拮抗剤の発現または活性を阻害する小有機分子、Wnt拮抗剤の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、Wnt拮抗剤の発現を阻害するリボザイム、Wnt拮抗剤の発現を阻害するRNAiコンストラクト、siRNA、またはshRNA、Wnt拮抗剤に結合してその活性を阻害する抗体、β−カテニンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、β−カテニンポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、Lef−1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Lef−1ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドの1つ以上をさらに含む。
Wnt経路アゴニストは、GSK3阻害剤、例えばドミナントネガティブGSK−3、GSK3αまたはGSK3βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ドミナントネガティブGSK−3、GSK3αまたはGSK3βポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、GSK−3、GSK3αまたはGSK3βに結合してその発現または活性を阻害する小有機分子、GSK−3、GSK3αまたはGSK3βに結合してその発現及び/または活性を阻害するRNAiコンストラクト、siRNAまたはshRNA、GSK−3、GSK3αまたはGSK3βに結合してその発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、GSK−3、GSK3αまたはGSK3βに結合してその発現及び/または活性を阻害する抗体、GSK−3、GSK3αまたはGSK3βに結合してその発現を阻害するリボザイム、ならびに、効果がGSK−3阻害に類似した、β−カテニン標的遺伝子を活性化する任意のGSK−3非依存性試薬等をさらに含む。
3.GSK−3B阻害剤
GSK−3β阻害剤は、本明細書において企図される組成物における使用に好適な、特定の例示的Wnt経路アゴニストであり、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子を含み得るが、これらに限定されない。本明細書において企図されるGSK−3β阻害剤は、GSK−3β発現及び/またはGSK−3β活性を減少させ得る。本明細書において企図されるGSK−3β阻害剤の実例は、GSK−3βを標的化する抗GSK−3β抗体、ドミナントネガティブGSK−3β変異体、siRNA、shRNA、miRNA及びアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。
GSK−3β阻害剤は、本明細書において企図される組成物における使用に好適な、特定の例示的Wnt経路アゴニストであり、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子を含み得るが、これらに限定されない。本明細書において企図されるGSK−3β阻害剤は、GSK−3β発現及び/またはGSK−3β活性を減少させ得る。本明細書において企図されるGSK−3β阻害剤の実例は、GSK−3βを標的化する抗GSK−3β抗体、ドミナントネガティブGSK−3β変異体、siRNA、shRNA、miRNA及びアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。
他の例示的GSK−3β阻害剤は、ケンパウロン、l−アザケンパウロン、CHIR99021、CHIR98014、AR−A014418、CT99021、CT20026、SB216763、AR−A014418、リチウム、SB 415286、TDZD−8、BIO、BIO−アセトキシム、(5−メチル−1H−ピラゾール−3−イル)−(2−フェニルキナゾリン−4−イル)アミン、ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニルルテニウム錯体、TDZD−8 4−ベンジル−2−メチル−1,2,4−チアジアゾリジン−3,5−ジオン、2−チオ(3−ヨードベンジル)−5−(1−ピリジル)−[1,3,4]−オキサゾール、OTDZT、アルファ−4−ジブロモアセトフェノン、AR−AO 144−18、3−(1−(3−ヒドロキシプロピル)−1H−ピロロ[
2,3−b]ピリジン−3−イル]−4−ピラジン−2−イル−ピロール−2,5−ジオン;TWSl19ピロロピリミジン化合物、L803 H−KEAPPAPPQSpP−NH2またはそのミリストイル化形態;2−クロロ−1−(4,5−ジブロモ−チオフェン−2−イル)−エタノン;GF109203X;RO318220;TDZD−8;TIBPO;及びOTDZTを含むが、これらに限定されない。
2,3−b]ピリジン−3−イル]−4−ピラジン−2−イル−ピロール−2,5−ジオン;TWSl19ピロロピリミジン化合物、L803 H−KEAPPAPPQSpP−NH2またはそのミリストイル化形態;2−クロロ−1−(4,5−ジブロモ−チオフェン−2−イル)−エタノン;GF109203X;RO318220;TDZD−8;TIBPO;及びOTDZTを含むが、これらに限定されない。
具体的な例示的実施形態において、GSK−3β阻害剤は、CHIR99021、BIO、またはケンパウロンである。
好ましい実施形態において、GSK−3β阻害剤は、CHIR99021である。
4.ERK/MEK阻害剤
本明細書において企図される組成物における使用に好適なERK/MEK阻害剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子を含むが、これらに限定されない。本明細書において企図されるERK/MEK阻害剤は、MEKもしくはERK発現及び/またはMEKもしくはERK活性を減少させ得る。本明細書において企図されるMEK/ERK阻害剤の実例は、MEKまたはERKを標的化する抗MEKまたは抗ERK抗体、ドミナントネガティブMEKまたはERK変異体、siRNA、shRNA、miRNA及びアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。
本明細書において企図される組成物における使用に好適なERK/MEK阻害剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子を含むが、これらに限定されない。本明細書において企図されるERK/MEK阻害剤は、MEKもしくはERK発現及び/またはMEKもしくはERK活性を減少させ得る。本明細書において企図されるMEK/ERK阻害剤の実例は、MEKまたはERKを標的化する抗MEKまたは抗ERK抗体、ドミナントネガティブMEKまたはERK変異体、siRNA、shRNA、miRNA及びアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。
他の例示的ERK/MEK阻害剤は、PD0325901、PD98059、UO126、SL327、ARRY−162、PD184161、PD184352、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、GSKl 120212、ARRY−438162、RO5126766、XL518、AZD8330、RDEAl19、AZD6244、FR180204及びPTK787を含むが、これらに限定されない。
追加の例示的MEK/ERK阻害剤は、国際特許出願公開第WO99/01426号、同第WO02/06213号、同第WO03/077914号、同第WO05/051301号及び同第WO2007/044084号において開示される化合物を含む。
MEK/ERK阻害剤のさらなる実例は、以下の化合物:6−(4−ブロモ−2−クロロ−フェニルアミノ)−7−フルオロ−3−メチル−3H−ベンゾイミダゾール−5−カルボン酸(2,3−ジヒドロキシ−プロポキシ)−アミド;6−(4−ブロモ−2−クロロ−フェニルアミノ)−7−フルオロ−3−(テトラヒドロ−ピラン−2−イルメチル)−3H−ベンゾイミダゾール−5−カルボン酸(2−ヒドロキシ−エトキシ)−アミド、1−[6−(4−ブロモ−2−クロロ−フェニルアミノ)−7−フルオロ−3−メチル−3H−ベンゾイミダゾール−5−イル]−2−ヒドロキシ−エタノン、6−(4−ブロモ−2−クロロ−フェニルアミノ)−7−フルオロ−3−メチル−3H−ベンゾイミダゾール−5−カルボン酸(2−ヒドロキシ−1,1−ジメチル−エトキシ)−アミド、6−(4−ブロモ−2−クロロ−フェニルアミノ)−7−フルオロ−3−(テトラヒドロ−フラン−2−イルメチル)−3H−ベンゾイミダゾール−5−カルボン酸(2−ヒドロキシ−エトキシ)−アミド、6−(4−ブロモ−2−フルオロ−フェニルアミノ)−7−フルオロ−3−メチル−3H−ベンゾイミダゾール−5−カルボン酸(2−ヒドロキシ−エトキシ)−アミド、6−(2,4−ジクロロ−フェニルアミノ)−7−フルオロ−3−メチル−3H−ベンゾイミダゾール−5−カルボン酸(2−ヒドロキシ−エトキシ)−アミド、6−(4−ブロモ−2−クロロ−フェニルアミノ)−7−フルオロ−3−メチル−3H−ベンゾイミダゾール−5−カルボン酸(2−ヒドロキシ−エトキシ)−アミド(以降でMEK阻害剤1と呼ばれる);2−[(2−フルオロ−4−ヨードフェニル)アミノ]−N−(2−ヒドロキシエトキシ)−1,5−ジメチル−6−オキソ−1,6−ジヒドロピリ
ジン−3−カルボキサミド(以降でMEK阻害剤2と呼ばれる);及び4−(4−ブロモ−2−フルオロフェニルアミノ)−N−(2−ヒドロキシエトキシ)−1,5−ジメチル−6−オキソ−1,6−ジヒドロピリダジン−3−カルボキサミド、またはそれらの薬学的に許容される塩を含む。
ジン−3−カルボキサミド(以降でMEK阻害剤2と呼ばれる);及び4−(4−ブロモ−2−フルオロフェニルアミノ)−N−(2−ヒドロキシエトキシ)−1,5−ジメチル−6−オキソ−1,6−ジヒドロピリダジン−3−カルボキサミド、またはそれらの薬学的に許容される塩を含む。
好ましい実施形態において、MEK/ERK阻害剤は、PD98059である。
5.ROCK阻害剤
Rho関連キナーゼ(ROCK)は、Rhoキナーゼ(そのうち、3つのアイソフォーム−RhoA、RhoB及びRhoCが存在する)の下流エフェクターに作用するセリン/トレオニンキナーゼである。本明細書において企図される組成物における使用に好適なROCK阻害剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子を含むが、これらに限定されない。本明細書において企図されるROCK阻害剤は、ROCK発現及び/またはROCK活性を減少させ得る。本明細書において企図されるROCK阻害剤の実例は、ROCKを標的化する抗ROCK抗体、ドミナントネガティブROCK変異体、siRNA、shRNA、miRNA及びアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。
Rho関連キナーゼ(ROCK)は、Rhoキナーゼ(そのうち、3つのアイソフォーム−RhoA、RhoB及びRhoCが存在する)の下流エフェクターに作用するセリン/トレオニンキナーゼである。本明細書において企図される組成物における使用に好適なROCK阻害剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子を含むが、これらに限定されない。本明細書において企図されるROCK阻害剤は、ROCK発現及び/またはROCK活性を減少させ得る。本明細書において企図されるROCK阻害剤の実例は、ROCKを標的化する抗ROCK抗体、ドミナントネガティブROCK変異体、siRNA、shRNA、miRNA及びアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。
本明細書において企図される例示的なROCK阻害剤は、チアゾビビン、Y27632、ファスジル、AR122−86、Y27632 H−1152、Y−30141、Wf−536、HA−1077、ヒドロキシル−HA−1077、GSK269962A、SB−772077−B、N−(4−ピリジル)−N’−(2,4,6−トリクロロフェニル)尿素、3−(4−ピリジル)−1H−インドール、及び(R)−(+)−trans−N−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド、及び、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,044,201号において開示されるROCK阻害剤を含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、ROCK阻害剤は、チアゾビビン、Y27632、またはピリンテグリンである。
好ましい実施形態において、ROCK阻害剤は、チアゾビビンである。
本明細書において企図される組成物及び細胞培養培地中の小分子の量は変動し得、使用される特定の分子及び組み合わせ、培地中で培養されている細胞型、ならびに特定用途を含む、特定の培養条件に従って最適化され得る。一実施形態において、小分子は、多能性を誘引する、再プログラムの効率を改善する、細胞の能力を増加もしくは維持する、または基底状態多能性を誘引もしくは維持するのに十分な濃度で組成物中に存在する。
具体的実施形態において、本発明の細胞培養培地における小分子の好ましい濃度及び組み合わせは、表1において運命維持培地(Fate Maintenance Medium(FMM))として示されている。培地の構成成分は、表1に示される最適濃度付近の最適範囲内の量で培地中に存在し得る。運命再プログラム培地(Fate Reprogramming Medium(FRM))は、細胞の再プログラムを含む本明細書において企図される培養基盤において有用であるが、基底状態多能性細胞の樹立及び長期維持に好適ではない。
6.サイトカイン及び成長因子
具体的実施形態において、本発明の細胞培養培地は、サイトカイン及び/または成長因子を実質的に含まない。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、血清、抽出物、成長因子、ホルモン、サイトカイン等を含むがこれらに限定されない1つ以上の補充物を
含有する。
具体的実施形態において、本発明の細胞培養培地は、サイトカイン及び/または成長因子を実質的に含まない。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、血清、抽出物、成長因子、ホルモン、サイトカイン等を含むがこれらに限定されない1つ以上の補充物を
含有する。
1つの例示的実施形態において、培養培地は、ECMタンパク質、ラミニン1、フィブロネクチン、コラーゲンIVアイソタイプ、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、細胞表面接着タンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、カドヘリン、塩化物細胞内チャネル1、膜貫通受容体PTK7、インスリン様成長因子、またはインヒビンベータAの1つ以上を含んでもよいが、TGFβ/アクチビン/nodalシグナル伝達経路の誘引物質、及びアクチビンAを含まない。他の実施形態において、培地は、TGFβ/アクチビン/nodalシグナル伝達経路の誘引物質を含んでもよい。
別の例示的実施形態において、培養培地は、以下のサイトカインまたは成長因子:上皮細胞成長因子(EGF)、酸性線維芽細胞成長因子(aFGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、白血病阻止因子(LIF)、肝細胞成長因子(HGF)、インスリン様成長因子1(IGF−1)、インスリン様成長因子2(IGF−2)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、神経成長因子(NGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、形質転換成長因子ベータ(TGF−β)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)トランスフェリン、各種インターロイキン(例えばIL−1からIL−18)、各種コロニー刺激因子(例えば顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF))、各種インターフェロン(例えばIFN−γ)、ならびに幹細胞に影響する他のサイトカイン、例えば幹細胞因子(SCF)及びエリスロポエチン(Epo)の1つ以上を含む。これらのサイトカインは、例えばR&D Systems,Minneapolis,Minn.から商業的に入手可能であり、天然または組換えであってもよい。具体的実施形態において、成長因子及びサイトカインは、本明細書において企図される濃度で添加され得る。ある特定の実施形態において、成長因子及びサイトカインは、実験的に、または確立されたサイトカイン技術により導かれるように決定される濃度で添加され得る。
7.培養基材
任意の好適な槽または細胞培養容器が、基本培地及び/または細胞培養補充物中の細胞培養物の担体として使用され得る。担体上には基材コーティングは必要ない。しかしながら、接着促進物質(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、RGD含有ポリペプチド、ゼラチン等)で培養槽の表面をコーティングすることにより、細胞の付着が促進され、具体的実施形態において、本明細書において開示される細胞培養培地及び補充物の効果が向上され得る。細胞の培養及び継代に好適な基材は、当該技術分野において知られており、限定されることなく、ビトロネクチン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチン、オステオポンチン、自然発生的細胞株生成マトリックスの混合物、例えばMatrigel(商標)、ならびに合成または人工表面、例えばポリアミン単一層及びカルボキシ末端単一層を含む。
任意の好適な槽または細胞培養容器が、基本培地及び/または細胞培養補充物中の細胞培養物の担体として使用され得る。担体上には基材コーティングは必要ない。しかしながら、接着促進物質(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、RGD含有ポリペプチド、ゼラチン等)で培養槽の表面をコーティングすることにより、細胞の付着が促進され、具体的実施形態において、本明細書において開示される細胞培養培地及び補充物の効果が向上され得る。細胞の培養及び継代に好適な基材は、当該技術分野において知られており、限定されることなく、ビトロネクチン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチン、オステオポンチン、自然発生的細胞株生成マトリックスの混合物、例えばMatrigel(商標)、ならびに合成または人工表面、例えばポリアミン単一層及びカルボキシ末端単一層を含む。
一実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、Matrigel(商標)またはビトロネクチンを含む基材を含む。
8.フィーダーを含まない環境
多能性細胞を培養するための現行の方法は、フィーダー細胞、またはフィーダー細胞で事前に調整され、ウシ胎仔血清を含有する培地に大きく依存するが、そのような環境は、臨床及び治療用途の細胞を生成するには不適切となり得る。例えば、そのような外的に汚染された環境において繁殖された細胞は、動物構成成分への曝露が、免疫拒絶、及び未確認の病原体の治療患者への伝染の重大なリスクを呈する可能性があり、潜在的に動物レトロウイルスを再活性化し得るため、一般に、ヒト細胞移植には不適切であるとみなされる。本明細書において企図される、フィーダーを含まない環境等の動物成分を含まない細胞培地を使用した培養系は、臨床グレード細胞株、具体的にはhESC及びhiPSC細胞
株の製造を容易化する。
多能性細胞を培養するための現行の方法は、フィーダー細胞、またはフィーダー細胞で事前に調整され、ウシ胎仔血清を含有する培地に大きく依存するが、そのような環境は、臨床及び治療用途の細胞を生成するには不適切となり得る。例えば、そのような外的に汚染された環境において繁殖された細胞は、動物構成成分への曝露が、免疫拒絶、及び未確認の病原体の治療患者への伝染の重大なリスクを呈する可能性があり、潜在的に動物レトロウイルスを再活性化し得るため、一般に、ヒト細胞移植には不適切であるとみなされる。本明細書において企図される、フィーダーを含まない環境等の動物成分を含まない細胞培地を使用した培養系は、臨床グレード細胞株、具体的にはhESC及びhiPSC細胞
株の製造を容易化する。
具体的実施形態において、フィーダーを含まない環境は、限定されることなく、マウス胎児線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、ケラチノサイト、及び胚幹細胞を含むヒトフィーダー細胞を本質的に含まず、フィーダー細胞により事前に調整されない。フィーダーを含まない細胞培養培地は、多能性細胞の培養、細胞の再プログラム、単一細胞培養、解離、及び多能性細胞の継代、多能性細胞の細胞ソーティング、基底状態多能性細胞の生成、ならびに基底状態多能性の維持における使用に好適である。具体的実施形態において、フィーダーを含まない環境は、多能性を誘引するため、再プログラムの効率を改善するため、及び/または細胞の能力を維持するために使用される。ある特定の実施形態において、フィーダーを含まない環境は、サイトカイン及びbFGFを含む成長因子を実質的に含まない。
9.解離
本明細書において企図される培養基盤により提供される利点の1つは、培養、継代、及び解離する単一基底状態多能性細胞の向上した生存能力及び生残性である。単一細胞への、例えば単一細胞懸濁液への細胞の解離は、酵素的または機械的手段により達成され得る。単一細胞への細胞の解離を可能にするための当該技術分野において知られている任意の酵素剤が、本発明の方法において使用され得る。一実施形態において、解離剤は、Trypsin/EDTA、TrypLE−Select、コラゲナーゼIV及びディスパーゼから選択される。
本明細書において企図される培養基盤により提供される利点の1つは、培養、継代、及び解離する単一基底状態多能性細胞の向上した生存能力及び生残性である。単一細胞への、例えば単一細胞懸濁液への細胞の解離は、酵素的または機械的手段により達成され得る。単一細胞への細胞の解離を可能にするための当該技術分野において知られている任意の酵素剤が、本発明の方法において使用され得る。一実施形態において、解離剤は、Trypsin/EDTA、TrypLE−Select、コラゲナーゼIV及びディスパーゼから選択される。
また、本明細書において企図される方法による細胞の解離において、EDTA、Accutase、またはAccuMax等のキレート剤が、単独で、または酵素剤と組み合わせて使用されてもよい。解離剤は、カルシウム及びマグネシウムを含まないPBS中に溶解されて、単一細胞への解離が促進されてもよい。
解離中または解離後の細胞の生残性を高めるために、生存促進物質、例えばチアゾビビン等のROCK阻害剤が添加されてもよい(例えば、成長因子、細胞死及びアポトーシスに関与する細胞経路の阻害剤、または調整培地)。
細胞培養物及び培地回収における技術は、Hu et al.,Curr.Opin.Biotechnol.8:148,1997;K.Kitano,Biotechnology 17:73,1991;Curr.Opin.Biotechnol.2:375,1991;Birch et al.,Bioprocess Technol.19:251,1990;「Teratocarcinomas and embryonic stem cells:A practical approach」(E.J.Robertson,ed.,IRL Press Ltd.1987);「Guide to Techniques in Mouse Development」(P.M.Wasserman et al.eds.,Academic Press 1993);「Embryonic Stem Cell Differentiation
in vitro」(M.V.Wiles,Meth.Enzymol.225:900,1993);「Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy」(P.D.Rathjen et al.,al.,1993)において概説されている。
in vitro」(M.V.Wiles,Meth.Enzymol.225:900,1993);「Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy」(P.D.Rathjen et al.,al.,1993)において概説されている。
幹細胞の分化については、Robertson,Meth.Cell Biol.75:173,1997;及びPedersen,Reprod.Fertil.Dev.10:31,1998において考察されている。
10.濃縮及び枯渇戦略
10.濃縮及び枯渇戦略
具体的実施形態において、多能性細胞、例えばiPSCに関して細胞の集団を濃縮するための戦略が提供される。一実施形態において、濃縮は、クローンiPSCコロニーを比較的短時間で誘導し、それによりiPSC生成の効率を改善するための方法を提供する。濃縮は、多能性のマーカーを発現する細胞を再プログラムする、同定する、及び得るように誘引された細胞の集団をソーティングし、それにより多能性細胞に関して濃縮された細胞の集団を得ることを含み得る。追加的な濃縮方法は、分化のマーカーを発現する細胞または非多能性細胞を枯渇させて、濃縮された多能性細胞の集団を得ることを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、再プログラムが約4〜30日間、約4〜24日間、約6〜22日間、または約8〜約12日間誘引された後に培養される。
一実施形態において、多能性細胞に関して細胞の集団を濃縮することは、集団内の細胞を解離し、細胞を再懸濁させることにより、単一細胞懸濁液を作製することを含む。解離した細胞は、細胞を維持する、または細胞ソーティングを行うための任意の好適な溶液または培地中に再懸濁され得る。具体的実施形態において、単一細胞懸濁液は、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、及びRock阻害剤を含有し、TFGβ阻害剤を有さない。ある特定の実施形態において、GSK3阻害剤は、CHIR99021であり、MEK阻害剤は、PD0325901であり、ROCK阻害剤は、チアゾビビンである。
具体的実施形態において、細胞の集団は、多能性細胞を積極的に選択するようにソーティングされ、及び/または、集団は、非再プログラムもしくは非多能性細胞が枯渇され、それにより多能性細胞に関して濃縮された細胞の集団が得られる。一実施形態において、単一細胞懸濁液が調製され、次いで、例えば適切な抗体等を使用して多能性のマーカーを染色すること等により、単一細胞がソーティングのために調製される。細胞は、任意の好適な方法により、例えば磁性ビーズまたはフローサイトメトリー(FACS)ソーティングによりソーティングされ得る。
細胞は、SSEA3/4、TRA1−60/81、TRA1−85、TRA2−54、GCTM−2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、KLF4、SSEA1(マウス)、CD30、SSEA5、CD90及びCD50の発現を含む、多能性の様々なマーカーに基づいてソーティングされ得る。様々な実施形態において、細胞は、多能性の少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つのマーカーに基づいてソーティングされる。ある特定の実施形態において、細胞は、SSEA4の発現に基づいてソーティングされ、ある特定の具体的実施形態において、TRA1−81またはTRA1−60と組み合わせてSSEA4の発現に基づいてソーティングされる。ある特定の実施形態において、細胞は、SSEA4、TRA1−81またはTRA1−60及びCD30発現に基づいてソーティングされる。ある特定の実施形態において、細胞は、CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、またはCD7を含むがこれらに限定されない分化している細胞の表面マーカーを使用して、最初に非再プログラム細胞に関して枯渇され、次いでSSEA4、TRA1−81及びCD30等の多能性マーカーに関して濃縮される。
多能性細胞に関して濃縮された集団は、従来のhESC培地または本発明の細胞培養培地等の細胞培養系内に入れられてもよい。細胞培養系は、フィーダー細胞が補充されてもよく、または任意選択でフィーダーを含まない環境であってもよい。いくつかの実施形態において、多能性のマーカーを発現するソーティングされた細胞は、フィーダー細胞が補充された培養系中に入れられ、次いでフィーダーを含まない環境に移される。一実施形態において、細胞培養培地は、フィーダーを含まない環境であり、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、及びRock阻害剤を含み、TGFβ阻害剤を有さない。具体的実施形態におい
て、GSK3阻害剤は、CHIR99021であり、MEK阻害剤は、PD0325901であり、ROCK阻害剤は、チアゾビビンである。本発明の他の具体的実施形態において、細胞培養系は、Matrigel(登録商標)コーティング組織プレートを含む、フィーダーを含まない環境である。一実施形態において、細胞培養系は、表1に示されるFMM培地を含む。
て、GSK3阻害剤は、CHIR99021であり、MEK阻害剤は、PD0325901であり、ROCK阻害剤は、チアゾビビンである。本発明の他の具体的実施形態において、細胞培養系は、Matrigel(登録商標)コーティング組織プレートを含む、フィーダーを含まない環境である。一実施形態において、細胞培養系は、表1に示されるFMM培地を含む。
濃縮された細胞集団は、本明細書に記載の細胞培養系中で培養して、典型的にはソーティング後約3〜約25日後、ソーティング後約5〜9日後、またはソーティング後約5〜7日後に出現する基底状態iPSCコロニーを得ることができる。iPSCコロニーは、クローン拡大のために採取またはソーティングされ得る。本明細書において企図される濃縮戦略を使用して、細胞集団は、少なくとも約3倍、5倍、または10倍以上、多能性細胞に関して濃縮される。
いくつかの実施形態において、再プログラムを受ける細胞の集団、または多能性細胞の集団は、分化細胞が枯渇される。一実施形態において、多能性細胞、または再プログラムするように誘引された細胞の集団は、分化細胞の細胞表面マーカーを有する細胞が枯渇され得る。分化している細胞の細胞表面マーカーの実例は、CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、またはCD7を含むが、これらに限定されない。具体的実施形態において、CD13が分化している細胞の表面マーカーとして使用される。
他の実施形態において、分化している、または分化した細胞の濃縮集団を得るために、細胞の集団は、所望の系統に分化するように誘引され、多能性細胞が枯渇される。いくつかの実施形態において、分化細胞の集団は、特定の系統に分化するように誘引されたESCまたはiPSC等の細胞の集団を含む。細胞の集団は、上述のネガティブ細胞ソーティング技術(「パニング」)、例えば多能性のマーカーに基づく磁性ビーズまたはFACに従う集団内の細胞のソーティングを使用して、多能性細胞が枯渇されてもよい。いくつかの実施形態において、分化細胞を含む細胞の集団は、多能性マーカーを使用してFACによりソーティングされ、多能性マーカーを発現する細胞が枯渇した分画が得られる。他の実施形態において、細胞の集団は、分化のマーカー、例えばCD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、またはCD7等の系統特異的マーカーに基づくFACによりソーティングされ、多能性のマーカーが枯渇した分画が得られる。CD13は、本発明の具体的実施形態において、分化している細胞の表面マーカーとして使用される。D.細胞を再プログラムするための培養基盤
細胞において多能性を誘引するため、または能力を増加させるために(Takahashi,K.,and Yamanaka,S.,Cell 126,663−676(2006);Takahashi et al.,Cell 131,861−872(2007);Yu et al.,Science 318,1917−1920(2007);Zhou et al.,Cell Stem Cell 4,381−384(2009);Kim et al.,Cell Stem Cell 4,472−476(2009);Yamanaka et al.,2009;Saha,K.,Jaenisch,R.,Cell Stem Cell 5,584−595(2009))、及び再プログラムの効率を改善するために(Shi et al.,Cell Stem Cell 2,525−528(2008a);Shi et al.,Cell Stem Cell 3,568−574(2008b);Huangfu et al.,Nat Biotechnol 26,795−797(2008a);Huangfu et al.,Nat Biotechnol 26,1269−1275(2008b);Silva et al.,Plos Bio 6,e253.doi:10.1371/journal.pbio.0060253(2008);Lyssiotis et al.,PNAS 106,8912−8917(2009);Ichid
a et al.,Cell Stem Cell 5,491−503(2009);Maherali,N.,Hochedlinger,K.,Curr Biol 19,1718−1723(2009b);Esteban et al.,Cell Stem Cell 6,71−79(2010);Feng et al.,Cell Stem Cell 4,301−312(2009))、様々な戦略が追求されている。しかしながら、現行の方法は依然として、産業または臨床グレードの多能性細胞、すなわち均質な多能性を有し、顕著な自発的分化を有さず、規定外的不含フィーダー細胞培養系における単一細胞の酵素的継代を使用して細胞集団を培養及び拡大する能力を有するクローン導入遺伝子不含多能性細胞集団の製造のための、ハイスループットの解決策を実現する余地がある。
a et al.,Cell Stem Cell 5,491−503(2009);Maherali,N.,Hochedlinger,K.,Curr Biol 19,1718−1723(2009b);Esteban et al.,Cell Stem Cell 6,71−79(2010);Feng et al.,Cell Stem Cell 4,301−312(2009))、様々な戦略が追求されている。しかしながら、現行の方法は依然として、産業または臨床グレードの多能性細胞、すなわち均質な多能性を有し、顕著な自発的分化を有さず、規定外的不含フィーダー細胞培養系における単一細胞の酵素的継代を使用して細胞集団を培養及び拡大する能力を有するクローン導入遺伝子不含多能性細胞集団の製造のための、ハイスループットの解決策を実現する余地がある。
本明細書において企図される培養基盤は、部分的に、ハイグレードの人工多能性幹細胞(iPSC)の生成に有用である。一実施形態において、非多能性細胞が、多能性となるように再プログラムされ、多能性を維持するように培養される。別の実施形態において、iPSCは、基底状態多能性となるように培養される。
様々な実施形態において、培養基盤は、導入遺伝子及び/またはフットプリントを使用しない再プログラム方法を可能にする。本明細書において企図される培養基盤は、hiPSC生成に必要とされる時間及び労力が大幅に低減された、極めて効率的なエピソーム再プログラムを提供する。任意の具体的理論に束縛されることを望まないが、再プログラムプロセスの早期において分化の合図をブロックすること、ならびに特定経路(MEK、ERK、TGFβ及びROCK)の小分子阻害を通して間葉上皮移行(MET)を促進することの両方によって、hiPSC生成の効率は、FF及び単一細胞培養系において、エピソームベクターを使用して大幅に改善される。
一実施形態において、培養基盤は、細胞内の内因性OCT4の発現を増加させることを含む、1つ以上の非多能性細胞を多能性状態に再プログラムすることを含む。細胞内の内在性OCT4の発現は、1つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはOCT4発現の小分子誘引物質を導入することにより増加され得る。一実施形態において、OCT4をコードするポリヌクレオチドまたはOCT4ポリペプチドの細胞内への導入は、細胞内のOCT4の内因性発現を誘引するのに十分である。
一実施形態において、培養基盤は、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、及びSV40LTからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、1つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることを含む。別の実施形態において、培養基盤は、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、SV40LT、hTERT、SALL4、GLIS、ESRRB、DPPA2、ECAT1、SOX1、SOX3、KLF2、KLF5、L−MYC、N−MYC、LRH1及びUTF1からなる群から選択される1つ以上のポリペプチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、1つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることを含む。
一実施形態において、培養基盤は、OCT4、NANOG、ESRRB、ECAT1及びUTF1からなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、1つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることを含む。別の実施形態において、培養基盤は、OCT4、NANOG、ESRRB、ECAT1及びUTF1からなる群から選択される1つ以上のポリペプチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、1つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることを含む。
本明細書において使用される場合、具体的実施形態において、「導入する」という用語は、細胞をポリヌクレオチド、ポリペプチド、または小分子に接触させることを含むプロセスを指す。導入するステップはまた、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの細胞内へのマイクロインジェクション、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを細胞内に送達するためのリポソームの使用、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを細胞内に導入するためのそれらの細胞透過性部分への誘導を含み得る。
具体的実施形態において、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、SV40LT、hTERT、SALL4、GLIS、ESRRB、DPPA2、ECAT1、SOX1、SOX3、KLF2、KLF5、L−MYC、N−MYC、LRH1及びUTF1からなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の、1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが、細胞を再プログラムするために非多能性細胞内に導入されてもよい。細胞内に導入される各再プログラミング因子の複製数は、本明細書において企図されるような基底状態多能性を達成するのに好適な任意の組み合わせにおいて、同じまたは異なってもよい。
一実施形態において、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の、1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入される。
一実施形態において、OCT4、SOX2、及びNANOGのそれぞれの1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入される。
一実施形態において、OCT4及びSOX2のそれぞれの1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入される。
一実施形態において、OCT4の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入される。
一実施形態において、OCT4の2つの複製、SOX2の2つの複製、及びNANOGの2つの複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入され、SV40LTは、任意選択で非多能性細胞内に導入される。
別の実施形態において、OCT4の3つの複製、SOX2の2つの複製、NANOGの1つの複製、及びUTF1の1つの複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入される。
様々な例示的実施形態において、多能性細胞を再プログラムすることを含む培養基盤は、OCT4をコードするポリヌクレオチドの1〜5つの複製と、SOX2をコードするポリヌクレオチドの1〜3つの複製と、任意選択でNANOGをコードするポリヌクレオチドの1〜2つの複製とを導入することを含む。ポリヌクレオチドは、1つ以上のより大きなポリヌクレオチドの任意の組み合わせとして細胞内に導入されてもよい。1つの限定されない例において、OCT4の1〜4つの複製、SOX2の1つまたは2つの複製、及びNANOGの1つの複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入される。別の限定されない例において、非多能性細胞を多能性状態に再プログラムすることは、OCT4の2つの複製をコードする第1のポリヌクレオチドと、OCT4の1つの複製及びSOX2の1つの複製をコードする第2のポリヌクレオチドと、OCT4の
1つの複製、SOX2の1つの複製、及びNANOGの1つの複製をコードする第3のポリヌクレオチドとを、非多能性細胞内に導入することを含む。さらなる限定されない例において、1つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることは、OCT4の2つの複製をコードする第1のポリヌクレオチドと、OCT4の1つの複製、SOX2の1つの複製、及びNANOGの1つの複製をコードする第2のポリヌクレオチドとを、1つ以上の非多能性細胞内に導入することを含む。さらなる限定されない例において、OCT4の2つの複製をコードする第1のポリヌクレオチドと、OCT4の1つの複製及びSOX2の1つの複製をコードする第2のポリヌクレオチドが、1つ以上の非多能性細胞内に導入されて、多能性細胞が生成される。
1つの複製、SOX2の1つの複製、及びNANOGの1つの複製をコードする第3のポリヌクレオチドとを、非多能性細胞内に導入することを含む。さらなる限定されない例において、1つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることは、OCT4の2つの複製をコードする第1のポリヌクレオチドと、OCT4の1つの複製、SOX2の1つの複製、及びNANOGの1つの複製をコードする第2のポリヌクレオチドとを、1つ以上の非多能性細胞内に導入することを含む。さらなる限定されない例において、OCT4の2つの複製をコードする第1のポリヌクレオチドと、OCT4の1つの複製及びSOX2の1つの複製をコードする第2のポリヌクレオチドが、1つ以上の非多能性細胞内に導入されて、多能性細胞が生成される。
一実施形態において、本明細書において企図される再プログラミング因子の任意の数及び組み合わせを含むポリヌクレオチドを含む単一ベクターが、非多能性細胞内に導入され、細胞を多能性状態に再プログラムするのに十分である。
一実施形態において、本明細書において企図される再プログラミング因子の任意の数及び組み合わせを含む1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む1つ以上のベクターが、非多能性細胞内に導入され、細胞を多能性状態に再プログラムするのに十分である。
好ましい実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドを細胞内に導入するために、非体細胞を再プログラムするための本明細書において企図される1つ以上のポリヌクレオチドを含む1つ以上のベクターが使用され、細胞を再プログラムするのに十分である。
最も好ましい実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドを細胞内に導入するために、非体細胞を再プログラムするための本明細書において企図される1つ以上のポリヌクレオチドを含む1つ以上のエピソームベクターが使用され、細胞を再プログラムするのに十分である。低減された自発的分化及び/または基底状態を示す多能性細胞は、本明細書において企図されるようなエピソームベクターを用いて製造され得、次いで、再プログラミング因子をコードする外因性核酸を含まない、低減された自発的分化及び/または基底状態を示す多能性細胞を得るために、ベクターがなくなるまで培養される。
さらに、ポリヌクレオチドまたはそれを含むベクターが、少なくとも2つの再プログラミング因子、または再プログラミング因子の少なくとも2つの複製をコードするポリヌクレオチドを含む場合、ポリヌクレオチドは、本明細書において企図されるような再プログラミング因子のそれぞれの間にIRES配列、または自己切断型ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含むことが企図される。
いくつかの態様において、非多能性細胞の再プログラムの効率は、再プログラミング因子ポリヌクレオチドが非多能性細胞内に導入された後に、1つ以上の再プログラミング因子ポリヌクレオチドの異所性発現のために選択することにより増加される。そのような選択は、例えば、再プログラミング因子ポリヌクレオチドの1つ以上を、選択可能マーカーに連結し、再プログラミング因子ポリヌクレオチド及び選択可能マーカーを、非多能性細胞内に導入し、選択可能マーカーを発現するそれらの細胞を選択することにより生じ得るが、選択は、マーカー及びその関連した再プログラミング因子ポリヌクレオチドの発現を有さない細胞に比べて増加した再プログラム効率を有する細胞を特定する。具体的実施形態において、非多能性細胞による導入された再プログラムポリヌクレオチドの発現を特定する任意の選択可能マーカーが使用され得ることが、当業者に認識される。
そのような選択可能マーカーの1つの限定されない例は、ピューロマイシン耐性等の抗生物質耐性遺伝子を含むが、これに限定されない。選択可能マーカーは、以下の再プログ
ラミング因子ポリヌクレオチド:OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、SV40LT、hTERT、SALL4、GLIS、ESRRB、DPPA2、ECAT1、SOX1、SOX3、KLF2、KLF5、L−MYC、N−MYC、LRH1及びUTF1の1つ以上に連結されてもよい。いくつかの実施形態において、再プログラミング因子ポリヌクレオチドの特定の組み合わせが、多シストロン性ベクターとして導入され、選択可能マーカーは、再プログラミング因子ポリヌクレオチドの特定の組み合わせに連結している。再プログラミング因子ポリヌクレオチドの特定の組み合わせは、本明細書において開示される再プログラミング因子ポリヌクレオチドの2つ以上の複製をコードし得る。
ラミング因子ポリヌクレオチド:OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、SV40LT、hTERT、SALL4、GLIS、ESRRB、DPPA2、ECAT1、SOX1、SOX3、KLF2、KLF5、L−MYC、N−MYC、LRH1及びUTF1の1つ以上に連結されてもよい。いくつかの実施形態において、再プログラミング因子ポリヌクレオチドの特定の組み合わせが、多シストロン性ベクターとして導入され、選択可能マーカーは、再プログラミング因子ポリヌクレオチドの特定の組み合わせに連結している。再プログラミング因子ポリヌクレオチドの特定の組み合わせは、本明細書において開示される再プログラミング因子ポリヌクレオチドの2つ以上の複製をコードし得る。
1つの限定されない実施形態において、多シストロン性ベクターは、ピューロマイシン耐性をコードする遺伝子等の選択可能マーカーに連結したOCT4ポリヌクレオチドの2つ以上の複製をコードする。
いくつかの態様において、1つ以上の再プログラミング因子ポリヌクレオチドをコードする多シストロン性ベクター及び選択可能マーカーは、1つ以上の別個の再プログラミング因子ポリヌクレオチドに加えて非多能性細胞に導入され、選択可能マーカーを発現する細胞のための選択は、選択可能マーカーの発現を有さない細胞よりも高い再プログラム効率を有する細胞の集団を生成する。
この選択プロセスの1つの限定されない例において、OCT4、NANOG及びSOX2ポリヌクレオチドが、ピューロマイシン耐性遺伝子に連結したOCT4の2つ以上の複製をコードする多シストロン性ベクターに加えて非多能性細胞に導入される。選択可能マーカーを発現する非多能性マーカーのその後の選択は、選択可能マーカーを発現しない非多能性細胞に比べてより高い再プログラム効率を有する非多能性細胞を特定する。選択された細胞は、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、または少なくとも40%の再プログラム効率を有し得る。
具体的な好ましい実施形態の再プログラムステップにおいて、小分子がしばしば含まれる。任意の具体的理論に束縛されることを望まないが、様々な分化経路の小分子阻害剤の含有は、再プログラムの効率及び反応速度を上昇させることが企図される。したがって、具体的実施形態において、非多能性細胞を再プログラムすることを含む培養基盤は、1つ以上の再プログラミング因子を、本明細書において企図されるような細胞内に導入することと、細胞を、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、TGFβR阻害剤、及びROCK阻害剤と接触させることとを含む。
再プログラムの効率の改善は、(1)再プログラム及び多能性細胞の生成に必要な時間の減少(例えば、小分子を用いない同様もしくは同じプロセスと比較して、多能性細胞を生成するための時間を少なくとも1日短縮することによる)、または代替としてもしくは組み合わせて、(2)特定のプロセスにより生成される多能性細胞の数の増加(例えば、小分子を用いない同様もしくは同じプロセスと比較して、所与の期間で例えば少なくとも10%、30%、50%、100%、200%、500%だけ再プログラムされる細胞の数を増加させること)により測定され得る。いくつかの実施形態において、再プログラム効率の2倍から20倍の改善が観察される。いくつかの実施形態において、再プログラム効率は、20倍超改善される。いくつかの実施形態において、小分子再プログラム剤を用いない方法の100倍を超える効率の改善(例えば、生成される多能性細胞の数の100倍を超える増加)が観察される。
一実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、1つ以上の再プログラミング因子を、本明細書において企図されるような細胞内に導入し、細胞を、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤と接触させることにより、非多能性細胞を再プログラムすることを含む。
1つの好ましい実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、1つ以上の再プログラミング因子を、本明細書において企図されるような細胞内に導入し、細胞を、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、TGFβR阻害剤、及びROCK阻害剤と接触させることにより、非多能性細胞を再プログラムすることを含む。
より好ましい実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、1つ以上の再プログラミング因子を、本明細書において企図されるような細胞内に導入し、細胞を、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、TGFβR阻害剤、及びROCK阻害剤と接触させることにより、非多能性細胞を再プログラムすることを含み、ROCK阻害剤は、チアゾビビンである。
しかしながら、自発的分化が低減された、もしくは著しくない、フィーダー細胞を含まない酵素的継代培養系における多能性細胞の長期培養を可能とするため、または、基底状態多能性を誘引及び/もしくは維持するためには、iPSCは、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、及び任意選択でRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤を含む細胞培養培地中でのその後の培養を必要とし、細胞培養培地は、本明細書において企図されるように、TGFβ受容体(TGFβR)阻害剤及びALK5阻害剤を含む、TGFβ/アクチビンシグナル伝達経路の阻害剤を含まない、または有さない。任意の具体的理論に束縛されることを望まないが、TGFβR/ALK5阻害剤との多能性細胞の長期培養は、培養された導入遺伝子を含まないiPSCの自発的分化、そして最終的には基底状態多能性の喪失をもたらすことが企図される。
様々な実施形態において、体細胞を安定して再プログラムし、基底状態多能性を含む培地中での低減された自発的分化を達成するように、2ステップ培養基盤が使用される。ある特定の実施形態において、非多能性細胞は、当該技術分野において開示されている任意の好適な方法により再プログラムされ、再プログラムされた体細胞は、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、及びRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより、培養物中での低減された自発的分化を達成するように培養され、培地は、TGFβR/ALK5阻害剤を有さない。いくつかの実施形態において、再プログラムされた体細胞は、基底状態多能性細胞を提供するように培養される。
具体的実施形態において、非多能性細胞は、本明細書において開示される方法により再プログラムされ、再プログラムされた体細胞は、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、及びRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより、多能性の安定な基底状態まで培養され、培地は、TGFβR/ALK5阻害剤を有さない。
いくつかの実施形態において、非多能性細胞は、1つ以上の再プログラミング因子を導入し、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、Rhoキナーゼ(ROCK)阻害剤、及びTGFβR/ALK5阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより再プログラムされ、その後、再プログラムされた体細胞は、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、及びRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより、自発的分化が低減された細胞を提供するように培養され、培地は、TGFβR/ALK5阻害剤を有さない。
いくつかの実施形態において、非多能性細胞は、1つ以上の再プログラミング因子を導入し、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、Rhoキナーゼ(ROCK)阻害剤、及びTGFβR/ALK5阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより再プログラムされ、その後、再プログラムされた体細胞は、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、及びRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより、多能性の安定な基底状態まで培養され、培地は、TGFβR/ALK5阻害剤を有さない。
好ましい実施形態において、非多能性細胞は、1つ以上の再プログラミング因子を導入し、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、Rhoキナーゼ(ROCK)阻害剤、及びTGFβR/ALK5阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより再プログラムされ、その後、再プログラムされた体細胞は、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、及びRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより、多能性の安定な基底状態まで培養され、培地は、TGFβR/ALK5阻害剤を有さず、再プログラム導入遺伝子の残留する著しい発現は存在しない。
一実施形態において、非多能性細胞は、本明細書の別の箇所で開示されるようなOCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、SV40LT、hTERT、SALL4、GLIS、ESRRB、DPPA2、ECAT1、SOX1、SOX3、KLF2、KLF5、L−MYC、N−MYC、LRH1及びUTF1からなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子を導入し、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、Rhoキナーゼ(ROCK)阻害剤、及びTGFβR/ALK5阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより再プログラムされ、その後、再プログラムされた体細胞は、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、及びRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤を含む培地中で培養され、培地は、TGFβR/ALK5阻害剤を有さない。
好ましい実施形態において、非多能性細胞は、本明細書の別の箇所で開示されるようなOCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、SV40LT、hTERT、SALL4、GLIS、ESRRB、DPPA2、ECAT1、SOX1、SOX3、KLF2、KLF5、L−MYC、N−MYC、LRH1及びUTF1からなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子を導入し、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、Rhoキナーゼ(ROCK)阻害剤、及びTGFβR/ALK5阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより再プログラムされ、その後、再プログラムされた体細胞は、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、及びRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤を含む培地中で培養され、Rock阻害剤は、チアゾビビンであり、培地は、TGFβR/ALK5阻害剤を有さない。
様々な実施形態において、本明細書において企図される培養基盤を使用して、自発的分化が低減された多能性細胞、及び/または基底状態人工多能性幹細胞(iPSC)を製造する方法が提供される。
具体的実施形態において、1つ以上の非多能性または部分多能性幹細胞を含む出発材料を使用し、TGFβR阻害剤を含まない培養培地中で、1つ以上の多能性または部分多能性幹細胞を培養して、自発的分化が低減された多能性細胞、及び/または基底状態人工多能性幹細胞(iPSC)が製造される。出発材料は、入手されてもよく、または形成されてもよい。例えば、非多能性または部分多能性幹細胞は、商業的供給者もしくは他の供給元から提供されてもよく、または新たに得られてもよく、非多能性細胞はまた、組織または器官から単離されてもよく、部分多能性細胞はまた、体細胞または成体幹細胞を再プログラムすることにより生成されてもよい。いくつかの実施形態において、多能性胚幹細胞、または体細胞核移植により得られた多能性細胞が、本明細書に記載の培養培地及び基盤を使用して基底状態多能性を達成するように誘引され得る。
具体的実施形態において、1つ以上のIPSCの集団は、再プログラムされた体細胞または再プログラムされた成体幹細胞を含んでもよい。具体的実施形態において、IPSCは、方法を実行することによって、または方法により生成されたIPSCを得ることによ
って、任意の既知の方法により生成され得る。
って、任意の既知の方法により生成され得る。
IPSCを生成する例示的方法は、非多能性細胞内の内因性OCT4の発現を増加させること;OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、SV40LT、hTERT、SALL4、GLIS、ESRRB、DPPA2、ECAT1、SOX1、SOX3、KLF2、KLF5、L−MYC、N−MYC、LRH1及びUTF1からなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする、任意選択で1つ以上の複製としての1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞内に導入すること;または、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする、任意選択で1つ以上の複製としての1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞内に導入することを含むが、これらに限定されない。IPSCを生成する方法は、1つ以上の非多能性細胞または部分多能性細胞を、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤と接触させ、1つ以上のiPSCを生成することをさらに含んでもよい。
ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、及びROCK阻害剤を含む。
好ましい実施形態において、細胞培養培地は、GSK3阻害剤、MEK阻害剤、及びROCK阻害剤を含み、ROCK阻害剤は、チアゾビビンである。
具体的実施形態において、1つ以上の多能性細胞、例えばIPSCを細胞培養培地中で培養することは、多能性の基底状態、生存能力、正常核型、ゲノム安定性、及び自発的分化の低減された速度を維持または誘引し、これらは、少なくとも5継代、少なくとも10継代、少なくとも50継代、少なくとも100継代、またはそれ以上(任意の介在する継代数を含む)の間維持され得る。
E.多能性細胞の特性決定
本明細書において企図される培養基盤を使用して製造される多能性細胞は、例えば、基底状態多能性細胞または自発的分化が低減された多能性細胞を含む多能性細胞生成物の選択または検証をさらに含んでもよい。多能性細胞は、再プログラム、ならびに本明細書において企図される組成物及び方法を用いたその後の培養の後、または、多能性細胞が再プログラムされなかった場合、多能性細胞が本明細書において企図される培養方法に移行した後に、選択及び/または検証されてもよい。細胞の多能性は、多能性に関連した、関係のある、及び検出可能な形態的、分子的及び/または生化学的変化に基づいて、特性決定及び/または選択されてもよい。
本明細書において企図される培養基盤を使用して製造される多能性細胞は、例えば、基底状態多能性細胞または自発的分化が低減された多能性細胞を含む多能性細胞生成物の選択または検証をさらに含んでもよい。多能性細胞は、再プログラム、ならびに本明細書において企図される組成物及び方法を用いたその後の培養の後、または、多能性細胞が再プログラムされなかった場合、多能性細胞が本明細書において企図される培養方法に移行した後に、選択及び/または検証されてもよい。細胞の多能性は、多能性に関連した、関係のある、及び検出可能な形態的、分子的及び/または生化学的変化に基づいて、特性決定及び/または選択されてもよい。
細胞の能力の評価において、別個に、または組み合わせて監視され得る細胞多能性の特定の特性は、遺伝子発現、メチル化、ならびにin vivo及びin vitro特性、例えば、i)円形の多能性幹細胞形態;ii)SSEA3/4(ヒト多能性幹細胞)、TRA1−60/81、TRA1−85、TRA2−54、GCTM−2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30、SSEA5、CD90及び/またはCD50、ならびに上記の組み合わせを含む、多能性幹細胞マーカーの発現;iii)多能性幹細胞の奇形腫形成;iv)胚様体の形成及びin vitro三胚葉分化;ならびにv)不活性X染色体再活性化を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、上記特性のいずれかのサブセットが、細胞能力の監視に使用される。一実施形態において、多能性細胞は、円形のコロニー形態を有すること、SSEA4、TRA1−81、及びOCT4の発現、ならびに胚様体及び奇形腫を形成する能力により特徴付けられる。
別の実施形態において、in vitro培養において低減された自発的分化を有する多能性細胞は、TGFβR阻害剤の存在下で培養された多能性細胞と比較して、以下の分化マーカー遺伝子の1つ以上の発現における少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%の減少を含む遺伝子発現シグニチャーにより特定され得る:FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1。
一実施形態において、低減された自発的分化を有する多能性細胞は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1を含むがこれらに限定されない、1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現の減少により特徴付けられる。具体的実施形態において、低減された自発的分化を有する多能性細胞は、TGFβR阻害剤の存在下で培養された多能性細胞と比較して、1つ以上の分化マーカー遺伝子(例えば、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、TUJ1)の発現における少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%の減少を含む遺伝子発現シグニチャーにより特定され得る。別の実施形態において、低減された自発的分化を有する多能性細胞は、1つ以上の分化マーカー遺伝子(例えば、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、TUJ1)の発現における少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%の減少を含む遺伝子発現シグニチャーにより特定され得る。
具体的実施形態において、基底状態多能性細胞は、大幅に抑制されたXist発現、ならびに分化細胞の初期マーカー、例えばFoxa2、Sox17、及びBrachyuryの発現を有し、一方従来の培養された多能性細胞は、Xist発現の中程度の抑制のみ、及び初期分化マーカーの顕著な発現を示す。
具体的実施形態において、基底状態多能性細胞は、複数の細胞継代の間、例えば少なくとも1、3、5、7、10、15、20またはそれ以上の継代の間、基底状態多能性の特性を維持する。
F.ポリヌクレオチド
様々な例示的実施形態において、本発明は、部分的に、ポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び本明細書において企図される融合ポリペプチド、ならびにそれらを含む組成物を企図する。様々な他の例示的実施形態において、本発明は、部分的に、少なくとも1つの再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードするポリヌクレオチドで非多能性細胞を再プログラムすることを企図する。本明細書に記載の培養基盤との使用のための再プログラミング因子は、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、SV40LT、hTERT、SALL4、GLIS、ESRRB、DPPA2、ECAT1、SOX1、SOX3、KLF2、KLF5、L−MYC、N−MYC、LRH1及びUTF1を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のような再プログラミング因子の
配列を含む。
様々な例示的実施形態において、本発明は、部分的に、ポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び本明細書において企図される融合ポリペプチド、ならびにそれらを含む組成物を企図する。様々な他の例示的実施形態において、本発明は、部分的に、少なくとも1つの再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードするポリヌクレオチドで非多能性細胞を再プログラムすることを企図する。本明細書に記載の培養基盤との使用のための再プログラミング因子は、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、SV40LT、hTERT、SALL4、GLIS、ESRRB、DPPA2、ECAT1、SOX1、SOX3、KLF2、KLF5、L−MYC、N−MYC、LRH1及びUTF1を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のような再プログラミング因子の
配列を含む。
本明細書において使用される場合、「遺伝子」は、エンハンサー、プロモーター、イントロン、エクソン等を含むポリヌクレオチド配列を指してもよい。具体的実施形態において、「遺伝子」という用語は、ポリヌクレオチド配列がポリペプチドをコードするゲノム配列に同一であるかとは無関係に、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指す。
「単離されたポリヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、自然発生状態でそれに隣接する配列、例えば、通常断片の隣にある配列から除去されたDNA断片から精製されたポリヌクレオチドを指す。具体的実施形態において、「単離されたポリヌクレオチド」は、自然には存在せず、人間の手により作製された相補的DNA(cDNA)、組換えDNA、または他のポリヌクレオチドを指す。
具体的実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、ベクター等のより大きなポリヌクレオチド内で、任意の好適な順序で配列していてもよい。好ましい実施形態において、ベクターは、エピソームベクターである。
本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、それ自体のコード配列の長さとは無関係に、他のDNA配列、例えば、本明細書の別の箇所で開示されているような、または当該技術分野において知られているような発現制御配列、プロモーター及び/またはエンハンサー、非翻訳領域(UTR)、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位(IRES)、リコンビナーゼ認識部位(例えば、LoxP、FRT、及びAtt部位)、終止コドン、転写終止シグナル、及び自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグと組み合わされてもよく、したがってそれらの全体的長さは大きく変動し得る。ゆえに、ほぼいかなる長さのポリヌクレオチド断片も使用することができ、全長は、好ましくは、意図される組換えDNAプロトコルにおける調製及び使用の容易性により制限されることが企図される。
ポリヌクレオチドは、当該技術分野において知られ利用可能である様々な十分に確立された技術のいずれかを使用して、調製、操作、及び/または発現され得る。所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切なベクター内に挿入され得る。ベクターの例は、プラスミド、自己複製配列、及び転位因子である。追加的な例示的ベクターは、限定されることなく、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、またはP1誘導人工染色体(PAC)、ラムダファージまたはM13ファージ等のバクテリオファージ、及び動物ウイルスを含む。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例は、限定されることなく、レトロウイルス(レンチウイルスを含む)、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス)、ポックスウイルス、バキュロウイルス、乳頭腫ウイルス、及びパポバウイルス(例えばSV40)を含む。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのpClneoベクター(Promega);レンチウイルス媒介遺伝子移入及び哺乳動物細胞における発現のためのpLenti4/V5−DEST(商標)、pLenti6/V5−DEST(商標)、及びpLenti6.2/V5−GW/lacZ(Invitrogen)である。具体的実施形態において、本明細書において開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のために、そのような発現ベクター内にライゲーションされ得る。
具体的実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外で維持されるベクターである。本明細書において使用される場合、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体DNAへの統合なしで、また、分裂する宿主細胞からの段階的な喪失なしで複製することができるベクターを指し、これはまた、前記ベクターが染色体外で、またはエピソームとして複製することを意味する。ベクターは、リンパ球指向性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、SV40、ウシ乳頭腫ウイルス、または酵母からのDNA複製の源または「ori」、具体的にはEBVのoriPに対応するリンパ球指向性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルスの複製源をコードする配列を有するように操作される。具体的態様において、リンパ球指向性ヘルペスウイルスは、エプスタイン・バーウィルス(EBV)、カポジ肉腫ヘルペスウイルス(KSHV)、ヘルペスウイルスサイミリ(HS)、またはマレック病ウイルス(MDV)であってもよい。エプスタイン・バーウィルス(EBV)及びカポジ肉腫ヘルペスウイルス(KSHV)はまた、ガンマヘルペスウイルスの例である。典型的には、宿主細胞は、複製を活性化するウイルス複製転写活性化タンパク質を含む。
発現ベクター内に存在する「発現制御配列」、「制御要素」、または「調節配列」は、ベクターの非翻訳領域、すなわち複製源、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル(シャイン・ダルガノ配列またはコザック配列)イントロン、ポリアデニル化配列、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写及び翻訳を実行する5’及び3’非翻訳領域である。そのような要素は、その長さ及び特異性において様々となり得る。使用されるベクター系及び宿主に依存して、普遍的プロモーター及び誘引性プロモーターを含む、任意の数の好適な転写及び翻訳要素が使用され得る。
「作用可能に連結した」という用語は、説明される構成成分が、その意図される様式で機能することができる関係にある並列位置を指す。一実施形態において、この用語は、発現制御配列(例えばプロモーター及び/またはエンハンサー)と、第2のポリヌクレオチド配列との間の機能的連結を指し、発現制御配列は、第2の配列に対応する核酸の転写を方向付ける。
本発明の具体的実施形態における使用のための例示的な普遍的発現制御配列は、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター、ウイルス性シミアンウイルス40(SV40)(例えば初期もしくは後期)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)LTRプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTR、単純ヘルペスウイルス(HSV)(チミジンキナーゼ)プロモーター、ワクチニアウイルスからのH5、P7.5、及びP11プロモーター、伸長因子1−アルファ(EF1a)プロモーター、初期成長応答1(EGR1)、フェリチンH(FerH)、フェリチンL(FerL)、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、真核生物翻訳開始因子4A1(EIF4A1)、熱ショック70kDaタンパク質5(HSPA5)、熱ショックタンパク質90kDaベータ、メンバー1(HSP90B1)、熱ショックタンパク質70kDa(HSP70)、β−キネシン(β−KIN)、ヒトROSA26遺伝子座(Irions et al.,Nature Biotechnology 25,1477−1482(2007))、ユビキチンCプロモーター(UBC)、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/トリβ−アクチン(CAG)プロモーター、ならびにβ−アクチンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
誘引性プロモーター/系の実例は、ステロイド誘引性プロモーター、例えばグルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター(対応するホルモンでの処理により誘引可能)、メタロチオニンプロモーター(様々な重金属での処理により誘引可能)、MX−1プロモーター(インターフェロンにより誘引可能)、「GeneSwitch」ミフェプリストン調節可能系(Sirin et al.,2003,Gene,323:67)、クメート誘引性遺伝子スイッチ(WO2002/088346)、テトラサイクリン依存性調節系等を含むが、これらに限定されない。
条件付き発現もまた、部位特異的DNAリコンビナーゼを使用して達成され得る。本発明のある特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼにより媒介される組換えのための少なくとも1つの(典型的には2つの)部位を含む。本明細書において使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、1つ以上の組換え部位(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個、またはそれ以上)が関与する組換え反応に関与する、切断または統合可能なタンパク質、酵素、共同因子または関連タンパク質を含み、これらは、野生型タンパク質(Landy,Current Opinion in Biotechnology 3:699−707(1993)を参照されたい)、または突然変異、誘導体(例えば、組換えタンパク質配列もしくはその断片を含有する融合タンパク質)、断片、及びその変異体であってもよい。本発明の具体的実施形態における使用に好適なリコンビナーゼの実例は、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3レゾルバーゼ、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1、及びParAを含むが、これらに限定されない。
具体的実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。具体的実施形態において、複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、1つ以上のIRES配列、または自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列により隔てられてもよい。本明細書において使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「IRES」は、シストロン(タンパク質コード領域)のATG等の開始コドンへの直接的な内部リボソーム侵入を促進し、それにより遺伝子のキャップ非依存的翻訳をもたらす要素を指す。例えば、Jackson et al.,1990.Trends Biochem Sci 15(12):477−83及びJackson and Kaminski.1995.RNA 1(10):985−1000を参照されたい。当業者により一般的に使用されるIRESの例は、米国特許第6,692,736号に記載のものを含む。当該技術分野において知られている「IRES」のさらなる例は、ピコルナウイルスから得ることができるIRESを含むが、これに限定されない(Jackson et al.,1990)。
H.ポリペプチド
本発明は、部分的に、ポリペプチド、融合ポリペプチド、及びポリペプチドを発現するベクターを含む組成物を企図する。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、異なるように指定されない限り、交換可能に、及び従来の意味に従って、すなわちアミノ酸の配列として使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチド及び他の変異体を含む。ポリペプチドは、様々な周知の組換え及び/または合成技術のいずれかを使用して調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、全長タンパク質配列、全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含んでもよく、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等、ならびに、自然発生的及び非自然発生的の両方の当該技術分野において知られている他の修飾を含んでもよい。
本発明は、部分的に、ポリペプチド、融合ポリペプチド、及びポリペプチドを発現するベクターを含む組成物を企図する。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、異なるように指定されない限り、交換可能に、及び従来の意味に従って、すなわちアミノ酸の配列として使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチド及び他の変異体を含む。ポリペプチドは、様々な周知の組換え及び/または合成技術のいずれかを使用して調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、全長タンパク質配列、全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含んでもよく、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等、ならびに、自然発生的及び非自然発生的の両方の当該技術分野において知られている他の修飾を含んでもよい。
「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」等は、本明細書において使用される場合、細胞環境からの、及び細胞の他の構成成分との関連からのペプチドまたはポリペプチド分子のin vitro単離及び/または精製を指し、すなわち、それは、in vivo物質と大きく関連してない。
2つ以上のポリペプチドの発現が望ましい一実施形態において、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の別の箇所で議論されるようにIRES配列により隔てられてもよい。別の実施形態において、2つ以上のポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインのそれぞれの間にポリペプチド切断シグナルを含む融合タンパク質として発現され得る。さらに、ポリペプチド部位は、任意のリンカーペプチド配列内に挿入され得る。例示的なポリペプチド切断シグナルは、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位(例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位)、及び自己切断型ウイルスオリゴペプチド等のポリペプチド切断認識部位を含む(deFelipe
and Ryan,2004.Traffic,5(8);616−26を参照されたい)。
and Ryan,2004.Traffic,5(8);616−26を参照されたい)。
好適なプロテアーゼ切断部位及び自己切断型ペプチドは、当業者に知られている(例えば、Ryan et al.,1997.J.Gener.Virol.78,699−722;Scymczak et al.(2004)Nature Biotech.5,589−594を参照されたい)。例示的プロテアーゼ切断部位は、ポチウイルスNIaプロテアーゼ(例えばタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ)、ポチウイルスHCプロテアーゼ、ポチウイルスP1(P35)プロテアーゼ、ビオウイルス(byovirus)NIaプロテアーゼ、ビオウイルスRNA−2コードプロテアーゼ、アフトウイルスLプロテアーゼ、エンテロウイルス2Aプロテアーゼ、ライノウイルス2Aプロテアーゼ、ピコルナ3Cプロテアーゼ、コモウイルス24Kプロテアーゼ、ネポウイルス24Kプロテアーゼ、RTSV(イネツングロ球形ウイルス)3C様プロテアーゼ、PYVF(パースニップ黄斑ウイルス)3C様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、Xa因子及びエンテロキナーゼの切断部位を含むが、これらに限定されない。その高い切断厳密性により、一実施形態においてTEV(タバコエッチ病ウイルス)プロテアーゼ切断部位、例えば、EXXYXQ(G/S)(配列番号:29)、例えばENLYFQG(配列番号:30)及びENLYFQS(配列番号:31)(Xは、任意のアミノ酸を表す)が好ましい(TEVによる切断は、QとGとの間、またはQとSとの間で生じる)。
ある特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、2Aまたは2A様部位、配列またはドメインを含む(Donnelly et al.,2001.J.Gen.Virol.82:1027−1041)。具体的実施形態において、ウイルス2Aペプチドは、アフトウイルス2Aペプチド、ポチウイルス2Aペプチド、またはカルジオウイルス2Aペプチドである。
一実施形態において、ウイルス2Aペプチドは、口蹄疫ウイルス(FMDV)2Aペプチド、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)2Aペプチド、ゾセア・アシグナ(Thosea
asigna)ウイルス(TaV)2Aペプチド、ブタテッショウウイルス−1(PTV−1)2Aペプチド、タイロウイルス2Aペプチド、ならびに脳心筋炎ウイルス2Aペプチドからなる群から選択される。
asigna)ウイルス(TaV)2Aペプチド、ブタテッショウウイルス−1(PTV−1)2Aペプチド、タイロウイルス2Aペプチド、ならびに脳心筋炎ウイルス2Aペプチドからなる群から選択される。
好ましい実施形態において、1つ以上の再プログラミング因子ポリペプチドをコードするベクターは、再プログラミング因子のそれぞれの間に、同じまたは異なるプロテアーゼ切断部位の1つ以上を含む。
本明細書において引用される全ての出版物、特許出願及び発行された特許は、個々の出版物、特許出願または発行された特許がそれぞれ参照により援用されることが具体的及び個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に援用される。
上記の発明は、明確な理解のために図及び例を用いてある程度詳細に説明されているが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱せずに、ある特定の変更及び修正が本発明になされてもよいことが容易に明らかとなる。以下の例は、例示のみを目的として提供されるものであり、限定を目的としない。当業者には、本質的に同様の結果を得るために変更または修正され得る、様々な重要ではないパラメータが容易に認識される。
本明細書において開示される実施例は、段階特異的培地組成物中での小分子経路阻害剤を使用したhiPSCの迅速な並列生成、選択及び拡大のための基盤を特定した。基盤は、完全にフィーダーを含まない環境において、最小限の再プログラミング因子を使用して効率的及び迅速化されたエピソーム再プログラムを補助した。得られたhiPSCは、導入遺伝子を含まず、容易に培養され、単一細胞として拡大されながら、均質及びゲノム安定性多能性集団を維持した。実施例において企図された培地組成物中で生成または維持されたhiPSCは、多能性の基底状態に関連した特性を示し、均一な産業または臨床グレードhiPSCの製造のための、堅牢なハイスループットシステムを表す。
実施例1
iPSCの長期維持及び拡大のための培地基盤の特定
概要
SMC4補充培養物中のレンチウイルス誘導hiPSC株の大多数は、未分化細胞の均
質集団を維持するが、株のサブセットにおける導入遺伝子再プログラミング因子のサイレンシングは、長期培養において様々な程度の自発的分化を示した(図1A及びB)。したがって、残留導入遺伝子発現とは無関係の継続的FF培養及び単一細胞の酵素的継代中の多能性の維持のための条件を特定するために、様々な細胞培養構成成分を評価した。再プログラム及び維持プロセスの異なる段階における固有の経路を標的化する複数段階培養系が、hiPSC生成の効率的及び堅牢な手法として特定された。
iPSCの長期維持及び拡大のための培地基盤の特定
概要
SMC4補充培養物中のレンチウイルス誘導hiPSC株の大多数は、未分化細胞の均
質集団を維持するが、株のサブセットにおける導入遺伝子再プログラミング因子のサイレンシングは、長期培養において様々な程度の自発的分化を示した(図1A及びB)。したがって、残留導入遺伝子発現とは無関係の継続的FF培養及び単一細胞の酵素的継代中の多能性の維持のための条件を特定するために、様々な細胞培養構成成分を評価した。再プログラム及び維持プロセスの異なる段階における固有の経路を標的化する複数段階培養系が、hiPSC生成の効率的及び堅牢な手法として特定された。
結果
長期維持の間のTGFβ経路の阻害は、サイレンシングされた導入遺伝子発現を有するhiPSC株の自発的分化における重要な因子として特定された(図1C)。自発的発現を生じることが判明したiPSC細胞株の1つを、新たな培地配合物、運命維持培地(Fate Maintenance Medium(FMM))中での培養に移行した(表1)。自発的分化が排除され、SSEA4/TRA1−81陽性細胞の均質集団が2〜3継代以内に樹立された(図1A)。
長期維持の間のTGFβ経路の阻害は、サイレンシングされた導入遺伝子発現を有するhiPSC株の自発的分化における重要な因子として特定された(図1C)。自発的発現を生じることが判明したiPSC細胞株の1つを、新たな培地配合物、運命維持培地(Fate Maintenance Medium(FMM))中での培養に移行した(表1)。自発的分化が排除され、SSEA4/TRA1−81陽性細胞の均質集団が2〜3継代以内に樹立された(図1A)。
従来の培養物(MEFフィーダー細胞に対するhESC培地)、FF培養におけるSMC4補充培地、またはFF培養における新たに配合したFMMにおける、OCT4/KLF4/SOX2(OKS)レンチウイルス再プログラム(図1D)もまた比較した。レンチウイルス再プログラムの誘引から17日後、SSEA4/TRA1−81陽性細胞をFACにより選択し、比較のためにSMC4またはFMM中に再播種した(図1D)。SMC4は、再プログラムの反応速度を改善し、誘引から17日後に、FMMによる再プログラムよりも大幅に多くのSSEA4/TRA1−81陽性細胞をもたらした(FMMの0.76%及び従来の培養の0.10%に対して2.72%;図1D)。
最初のソーティング後、細胞をそれぞれの条件下で10日間維持し、続いて第2のSSEA4/TRA1−81陽性フローサイトメトリー選択を行った(図1D)。培養物をさらに9日間維持し(感染から合計36日後)、OCT4及びNANOG同時発現に基づいて未分化コロニーに関してスコア化した(図1D及び1E)。SMC4における最初の再プログラムに続くFMMへの移行の組み合わせは、最終的により多くのOCT4/NANOG陽性コロニー、及びSMC4における継続的維持に対して大幅に低減された数のOCT4/NANOG陰性コロニーをもたらした(図1D及び1E)。OCT4/NANOG陽性コロニーは、FMMにおいてのみ維持された培養物中において検出されたが、コロニーの数及びサイズは、段階特異的培地手法よりも低いようであった。
これらの結果は、再プログラム及び維持プロセスの異なる段階における固有の経路を標的化する新規の複数段階培養系が、高品質hiPSCの効率的製造をもたらしたことを示している。
実施例2
単一細胞継代及びFF形式における導入遺伝子を含まないhiPSCの製造のための基盤概要
エピソームベクター系を使用した非組み込み型再プログラム方法の効率は、特にFF環境において極めて低い(<0.001%)(Narsinh et al.,2011;O’Doherty et al.,2013)。SMC4及び再プログラムを改善することが示されている培地添加剤を含有する運命再プログラム培地(Fate Reprogramming Medium(FRM))、ならびにFMMの2つの培地を含む複数段階培養系において、エピソーム誘引を試験した(図2A及び表1)。
単一細胞継代及びFF形式における導入遺伝子を含まないhiPSCの製造のための基盤概要
エピソームベクター系を使用した非組み込み型再プログラム方法の効率は、特にFF環境において極めて低い(<0.001%)(Narsinh et al.,2011;O’Doherty et al.,2013)。SMC4及び再プログラムを改善することが示されている培地添加剤を含有する運命再プログラム培地(Fate Reprogramming Medium(FRM))、ならびにFMMの2つの培地を含む複数段階培養系において、エピソーム誘引を試験した(図2A及び表1)。
結果
OCT4/SOX2/NANOG/KLF4/LIN28/MYC/SV40LT(OSNKLMT)の遺伝子の組み合わせからなるエピソーム発現系を使用して、様々な線維芽細胞をトランスフェクトした。エピソーム発現の誘引から24時間後、再プログラム培養物をERMに移行し、再プログラム反応速度を向上させる。最初の週以内に初期コロニー形成が観察され、10日目までに、SSEA4/TRA1−81陽性細胞の大規模な集団が検出された(>1%)(図8A及び8B)。14日目に、FRMにより補助された再プログラム培養物を、FRMまたはFMM培地中に分割した。21日目に、FACSを使用して、培養物中のSSEA4/TRA1−81/CD30陽性細胞を特定した(図8C)。FRM維持培養物は、分化及び未分化細胞の両方を含有し、一方FMM培養物は、ほぼ未分化細胞を含有していた(図8D)。
OCT4/SOX2/NANOG/KLF4/LIN28/MYC/SV40LT(OSNKLMT)の遺伝子の組み合わせからなるエピソーム発現系を使用して、様々な線維芽細胞をトランスフェクトした。エピソーム発現の誘引から24時間後、再プログラム培養物をERMに移行し、再プログラム反応速度を向上させる。最初の週以内に初期コロニー形成が観察され、10日目までに、SSEA4/TRA1−81陽性細胞の大規模な集団が検出された(>1%)(図8A及び8B)。14日目に、FRMにより補助された再プログラム培養物を、FRMまたはFMM培地中に分割した。21日目に、FACSを使用して、培養物中のSSEA4/TRA1−81/CD30陽性細胞を特定した(図8C)。FRM維持培養物は、分化及び未分化細胞の両方を含有し、一方FMM培養物は、ほぼ未分化細胞を含有していた(図8D)。
この手法のスループット及び堅牢性を、異なる年齢、性別及び民族のドナーからの最少量の臍帯血から拡大された線維芽細胞及びCD34+細胞で試験した(図9A及び9B)。エピソーム遺伝子組み合わせセットOSNKLMTにより、図2Aにおいて概説されるように体細胞再プログラムを誘引し、16日目と21日目との間の個々のhiPSCに対して、96ウェルプレートフローサイトメトリーソーティングを行った(図2B)。試験された株の大部分に対して、SSEA4/TRA1−81/CD30陽性細胞の大規模集団が観察された。従来の培地及びフィーダー細胞を使用した並行再プログラム実験と比較して、FRM及びFMM培地系は、hiPSCクローンの数の大幅な増加をもたらした(FTC007線維芽細胞株では、従来の培養の0.02%に対してFRM/FMMにおいて8.55%(図2A及び2B))。平均して96ウェルプレート当たり22のクローンhiPSCが、SMC4培地を用いたレンチウイルス再プログラムに不応性であることが以前に観察されている線維芽細胞FTC008を含む各体細胞株に対して観察された(図2B、10A及び10B)。コロニーは、その後、細胞内及び表面マーカー発現の分析、ならびにNANOGに対する直接qRTPCRにより、真正hiPSCクローンとして確認された(図2D、2E及び10C)。96ウェルソーティング及び選択プロセスを使用した再プログラムの効率もまた増加した(図2E)。規定の表面コーティングビトロネクチンでも同様の再プログラム効率が観察された(図10D)。
これらのデータは、基盤が、エピソーム再プログラムに適用された場合に堅牢で再現性があること、ならびに、最小限の労力で、及びiPSC最終生成物の品質を低下させることなく、ハイスループットの様式で複数の再プログラム実験が並行して実行されることを可能にすることを示していた。
実施例3
FMM中での導入遺伝子を含まないhiPSC株の長期継代及び拡大
概要
FF培養において単一細胞として拡大された実施例2からのhiPSCクローンを使用して、FRM及びFMMの複数段階培地基盤を使用したhiPSCの長期継代及び拡大を試験した(図3A及び3B)。
FMM中での導入遺伝子を含まないhiPSC株の長期継代及び拡大
概要
FF培養において単一細胞として拡大された実施例2からのhiPSCクローンを使用して、FRM及びFMMの複数段階培地基盤を使用したhiPSCの長期継代及び拡大を試験した(図3A及び3B)。
結果
実施例2に従い再プログラムされたhiPSC株は、4〜7継代までにエピソームDNAを喪失し、したがって、導入遺伝子に基づく再プログラミング因子とは独立して多能性であった(図3C)。hiPSC株は、SSEA4、TRA1−81、OCT4及びNANOGに対して陽性である未分化細胞の均質集団を維持した。さらに、これらの株は、多能性培養において一般的に利用される任意の洗浄戦略なしに、多能性特性(図3F)を維持した(図3D及び3E)。慣例的な単一細胞継代培養中に、マトリゲルが規定表面コーティングビトロネクチンで置き換えられた場合、均一hiPSC培養物の同様の拡大が観察された(図S10E〜10G)。
実施例2に従い再プログラムされたhiPSC株は、4〜7継代までにエピソームDNAを喪失し、したがって、導入遺伝子に基づく再プログラミング因子とは独立して多能性であった(図3C)。hiPSC株は、SSEA4、TRA1−81、OCT4及びNANOGに対して陽性である未分化細胞の均質集団を維持した。さらに、これらの株は、多能性培養において一般的に利用される任意の洗浄戦略なしに、多能性特性(図3F)を維持した(図3D及び3E)。慣例的な単一細胞継代培養中に、マトリゲルが規定表面コーティングビトロネクチンで置き換えられた場合、均一hiPSC培養物の同様の拡大が観察された(図S10E〜10G)。
FF環境において単一細胞として培養されたhESC及びhiPSC株では、ゲノム異常がしばしば検出される(Laurent et al.,2011;Taapken et al.,2011)。全ての分析されたhiPSC株の核型分析は、FMM培養におけるゲノム安定性を示した(図4A)。さらに、FMMにおいて長期間(25〜30継代)維持された単一細胞及びFF培養hiPSCクローンは、培養物洗浄または選択を必要とせずに、その未分化プロファイル及びゲノム安定性を維持し続けた(図4B)。
FMMにおいて維持されたエピソーム誘導hiPSCクローンはまた、3つ全ての体細胞系統、胚様体を介したin vitro分化、及び奇形腫形成によるin vivo分化を容易に生じた(図4C〜E)。
これらのデータは、FRM及びFMM複数段階培地基盤によって、導入遺伝子を含まないhiPSCクローンがFF及び単一細胞の酵素的継代形式において容易に生成及び拡大されるのが可能となり、一方多能性及びゲノム安定性細胞の均質集団が維持されることを示していた。
実施例4
複数段階培地基盤は、最小限の遺伝子でエピソーム再プログラムを可能にする
概要
KLF4、MYC及びLIN28等のがん遺伝子に対する依存性、または再プログラムプロセスにおいてP53をノックダウンする必要性が低減された効率的なフットプリントを含まない発現系は、多能性幹細胞治療にとって極めて有価値となるだろう(Lee et al.,2013;Okita et al.,2011;Yu et al.,2009)。複数段階培地基盤は、OSNKLMT再プログラミング因子を使用した導入遺伝子を含まないhiPSC細胞の生成及び拡大のための極めて効率的及び堅牢な基盤を示したため、基盤の堅牢性を、再プログラミング因子の必要性に対して測定した。
複数段階培地基盤は、最小限の遺伝子でエピソーム再プログラムを可能にする
概要
KLF4、MYC及びLIN28等のがん遺伝子に対する依存性、または再プログラムプロセスにおいてP53をノックダウンする必要性が低減された効率的なフットプリントを含まない発現系は、多能性幹細胞治療にとって極めて有価値となるだろう(Lee et al.,2013;Okita et al.,2011;Yu et al.,2009)。複数段階培地基盤は、OSNKLMT再プログラミング因子を使用した導入遺伝子を含まないhiPSC細胞の生成及び拡大のための極めて効率的及び堅牢な基盤を示したため、基盤の堅牢性を、再プログラミング因子の必要性に対して測定した。
結果
遺伝子発現の組み合わせ及び用量を変更するために、OCT4/NANOG/SOX2(ONS)、OCT4/SOX2(OS)またはOCT4/OCT4(2xO)を含む最小限の遺伝子セットを含有するいくつかのエピソーム発現カセットを構築した(図5A)。線維芽細胞株をOCT4、NANOG、SOX2、及びSV40LTの組み合わせでトランスフェクトし、FRM/FMM基盤を使用して培養した。SV40LT単独では、再プログラムの13日目にいかなる真のSSEA4/TRA1−81陽性細胞も生成されなかったが、トランスフェクト後の細胞生残性が改善された(図5B及び11A)。様々な再プログラミング因子の組み合わせは、再プログラムプロセスの初期において、SSEA4/TRA1−81陽性集団の発生により示されるように効率的な再プログラムをもたらした(13日目までに、OCT4/SOX2/SV40LTの場合>0.5%、OCT4/NANOG/SOX2/SV40LTの場合>3.5%;図5B)。さらなる日数再プログラムされた培養物は、SSEA4/TRA1−81陽性集団を大幅に増加させた(16日目までに、OCT4/SOX2/SV40LTの場合>4.0%;図11B)。驚くべきことに、観察された再プログラムされた細胞のパーセンテージは、がん遺伝子KLF4及びMYCを含有するレンチウイルス及びエピソーム誘引系に匹敵した(図2B、5B及び11B)。
遺伝子発現の組み合わせ及び用量を変更するために、OCT4/NANOG/SOX2(ONS)、OCT4/SOX2(OS)またはOCT4/OCT4(2xO)を含む最小限の遺伝子セットを含有するいくつかのエピソーム発現カセットを構築した(図5A)。線維芽細胞株をOCT4、NANOG、SOX2、及びSV40LTの組み合わせでトランスフェクトし、FRM/FMM基盤を使用して培養した。SV40LT単独では、再プログラムの13日目にいかなる真のSSEA4/TRA1−81陽性細胞も生成されなかったが、トランスフェクト後の細胞生残性が改善された(図5B及び11A)。様々な再プログラミング因子の組み合わせは、再プログラムプロセスの初期において、SSEA4/TRA1−81陽性集団の発生により示されるように効率的な再プログラムをもたらした(13日目までに、OCT4/SOX2/SV40LTの場合>0.5%、OCT4/NANOG/SOX2/SV40LTの場合>3.5%;図5B)。さらなる日数再プログラムされた培養物は、SSEA4/TRA1−81陽性集団を大幅に増加させた(16日目までに、OCT4/SOX2/SV40LTの場合>4.0%;図11B)。驚くべきことに、観察された再プログラムされた細胞のパーセンテージは、がん遺伝子KLF4及びMYCを含有するレンチウイルス及びエピソーム誘引系に匹敵した(図2B、5B及び11B)。
いくつかの再プログラミング因子の組み合わせを繰り越し、FMM培地に移行してから、個々のhiPSCクローンのフローサイトメトリーソーティング及び選択を行った。OSNKLMTエピソーム再プログラムと同様に、クローンhiPSC株が、最小限の遺伝子OCT4、SOX2及びSV40LT(2xO+OS+T)を含有する組み合わせ、ならびに他の組み合わせ(図5C)から容易に誘導された。5〜7継代までに導入遺伝子及
びエピソームベクターマーカーを喪失したhiPSCクローンを、さらなる分析に繰り越した(図5D)。選択されたクローンをFF環境において単一細胞として継続的に継代したが、ゲノム安定性未分化細胞の均質集団を維持し、3つの体細胞系統に効率的に分化する能力を示した(図5E〜J)。
びエピソームベクターマーカーを喪失したhiPSCクローンを、さらなる分析に繰り越した(図5D)。選択されたクローンをFF環境において単一細胞として継続的に継代したが、ゲノム安定性未分化細胞の均質集団を維持し、3つの体細胞系統に効率的に分化する能力を示した(図5E〜J)。
総合的に、これらのデータは、FRM/FMM、フローサイトメトリーに基づく再プログラム基盤における最小限の再プログラミング遺伝子の一時的発現により、hiPSCが容易に生成されることを示していた。
実施例5
FMM基盤は基底状態多能性を補助する
概要
FMM基盤をさらに評価するために、現行の方法により再プログラムされた体細胞の遺伝子発現特性を、本明細書において企図されるFMM基盤を使用して再プログラムされた体細胞の遺伝子発現特性と比較した。小分子による培養物と従来通り維持されたhiPSC培養物(Hanna et al.,2010b;Saha and Jaenisch,2009)との間の遺伝子発現の差を評価した。
FMM基盤は基底状態多能性を補助する
概要
FMM基盤をさらに評価するために、現行の方法により再プログラムされた体細胞の遺伝子発現特性を、本明細書において企図されるFMM基盤を使用して再プログラムされた体細胞の遺伝子発現特性と比較した。小分子による培養物と従来通り維持されたhiPSC培養物(Hanna et al.,2010b;Saha and Jaenisch,2009)との間の遺伝子発現の差を評価した。
結果
1組の実験において、小分子媒介培養と従来の培養との間で遺伝子発現パターンを評価した。小分子培養においてレンチウイルス誘引hiPSCクローンFTi111を生成及び維持したが、多能性であることが示された。i)フィーダー細胞を有する従来の培地、及びii)フィーダー細胞を有する、またはFF表面上の小分子阻害剤含有培地(図12A及び12B)を含む様々な培養環境内に、クローンを直接解凍した。従来の培養におけるhiPSCコロニーは、ROCK阻害剤であるチアゾビビンの存在下でのみ回収され、その後、回収された細胞を塊での培養に変換した(図12B及び12C)。培養条件の各セットは、固有のコロニー形態(図12D)、及び多能性マーカーの遺伝子発現の異なるパターン(図12E)を示した。フィーダー細胞上の従来通り支持された培養は、小分子において維持された対応する培養物よりも、従来の培養において維持されたhESC対照H1及びHUES9によく類似していた(図12E)。これらのデータは、小分子媒介培養と従来の培養との間に異なる遺伝子発現パターンが存在することを示していた。
1組の実験において、小分子媒介培養と従来の培養との間で遺伝子発現パターンを評価した。小分子培養においてレンチウイルス誘引hiPSCクローンFTi111を生成及び維持したが、多能性であることが示された。i)フィーダー細胞を有する従来の培地、及びii)フィーダー細胞を有する、またはFF表面上の小分子阻害剤含有培地(図12A及び12B)を含む様々な培養環境内に、クローンを直接解凍した。従来の培養におけるhiPSCコロニーは、ROCK阻害剤であるチアゾビビンの存在下でのみ回収され、その後、回収された細胞を塊での培養に変換した(図12B及び12C)。培養条件の各セットは、固有のコロニー形態(図12D)、及び多能性マーカーの遺伝子発現の異なるパターン(図12E)を示した。フィーダー細胞上の従来通り支持された培養は、小分子において維持された対応する培養物よりも、従来の培養において維持されたhESC対照H1及びHUES9によく類似していた(図12E)。これらのデータは、小分子媒介培養と従来の培養との間に異なる遺伝子発現パターンが存在することを示していた。
また、レンチウイルス誘引及び従来のESC/フィーダー培養を使用したhiPSC誘導株と、エピソーム誘導系統との間、さらに、FRM/FMM基盤において維持された再プログラミング因子の異なる組み合わせで誘導されたエピソーム株との間で、遺伝子発現の差を評価した。高含量qRT−PCR分析を使用して、多能性及び分化に関連した遺伝子発現を定量した。調査された多能性遺伝子の大部分は、FMM培養物またはフィーダー細胞を含有する従来の培養物において維持されたhiPSCの間で、同等の発現パターンを示した(図6A)。しかしながら、分化に関連した遺伝子の評価において、細胞株の間の差が観察された(図6B)。FMM維持hiPSCは、従来の培地中及びフィーダー細胞上で維持されたhiPSC及びH1 hESCの両方と比較して、3つの体細胞系統に関連したほとんどの遺伝子のより低い発現を示した。エピソーム遺伝子セットOSNKLMTにより誘引された株のサブセットは、外胚葉系統、OTX2及びTUJ1の発現を示すようであったが、この発現は、Lin28、KLF4及びc−MYCの使用なしでエピソーム誘導されたhiPSCにおいては無視できた(図6B)。驚くべきことに、試験された全ての分化遺伝子の発現は、エピソーム最小限遺伝子セットから誘導されFMMにおいて維持された全てのhiPSCにおいては完全に抑制された(図6B)。総合して、これらのデータは、FRM/FMM基盤が僅かなエピソームに基づく再プログラミング因子で堅牢に細胞を再プログラムすることができること、及び、hiPSCを安定な基底多能性状態に維持することができることを示していた。
以下の方法から誘導されたhiPSCに対して、全体的な遺伝子発現パターンを決定した:i)FMMにおいて維持されるエピソーム誘引、ii)FMMにおいて維持されるが3継代の間従来の培地に切り替えられるエピソーム誘引、iii)SMC4において維持されるレンチウイルス誘引;及びiv)従来の培養において維持されるレンチウイルス誘引(図13A、13B)。遺伝子発現プロファイルを評価する前に、全ての系統は多能性であり、ゲノム安定性であり、及び3つの体細胞系統全てに分化し得ることが決定された。小分子培養と従来の培養との間の差別的に発現した遺伝子のクラスタ分析では、hiPSC株が、現在の培養条件に基づいてグループ化され、元の誘導法及び培養によってグループ化されないことが明らかとなった(図13B)。2.5倍の発現差を示す300の遺伝子の遺伝子オントロジー分類は、分化及び発生を従来の培養群において極めて濃縮された主要カテゴリーとして特定し、一方小分子培養群において上方調節された遺伝子は、ほとんど細胞増殖及び性分化の調節に関連していた(図13C及び13D)。
遺伝子発現分析を繰り返し、FMM、従来型、または移行培養系を直接比較した(FMM、Conv、FMM→Conv、Conv→FMM;図13A)。クラスタ分析は、生成の方法または以前の培養系とは無関係に、現在の培養系に基づいて2つの群を生成した(図7A)。例えば、hiPSCクローンFTC016−c28が生成され、従来の培養への移行の前に、FRM/FMM基盤の下で維持された。このクローンは、従来の培養においてのみ維持された培養物とグループ化され、FMM中に維持されたその親株とグループ化されず;従来の培養において生成され、FMMへの移行まで従来セット内でグループ化され、その後FMMクラスタ内にグループ化されたOKSレンチウイルス誘引hiPSCクローン等の株でも同等の結果が見られた(図7A)。遺伝子オントロジーは、分化及び発生に関連した遺伝子で濃縮されるべき従来の培養物をカテゴリー化した(すなわち、p値=2.2E−10、パターン指定プロセス;図7B及び13E)。総合的に、これらのデータは、分化傾向に関連した遺伝子が、FMM培養において大幅に低減され、hiPSCは、自発的分化能を低減するためにFMM培養基盤に適合され得ることを示していた。
ヒト多能性幹細胞の基底状態及び準安定状態を表す遺伝子リストをコンパイルした(De Los Angeles et al.,2012;Han et al.,2011;Hanna et al.,2010a;Hirata et al.,2012;Nichols and Smith,2012;Valamehr et al.,2012;Zhou et al.,2010)(図7C)。これらの遺伝子リストに基づく遺伝子クラスタ分析を、FMMまたは従来の培養におけるhiPSC株に対して行った(図7D)。全体的遺伝子発現比較と同様に、集中遺伝子クラスタ分析は、相互交換可能と思われるプロファイルを有するその現在の培養条件に基づく細胞株の分離を示した。例えば、hiPSCクローンFTC016−c28は、FMMから、H1 hESCとグループ化され、FMMにおいて維持されたその親hiPSC株とはグループ化されていない従来の培養に移行した(図7D)。同様に、従来の培養において維持された線維芽細胞株から誘導されたレンチウイルスhiPSCクローンは、従来の培養におけるHUES9 hESC及び他のhiPSCクローンとグループ化されたが、FMMに切り替えられると、それは、臍帯血から誘導されたエピソームhiPSC及び他のFMM培養株とグループ化された(図7D)。2つのクラスタ内の基底及び準安定状態を表す遺伝子の分布は、小分子(SMC4/FMM)対従来の培養に関して、各プローブセットに対する平均強度をプロットすることにより決定された(図7E)。驚くべきことに、基底状態に関連した遺伝子のほとんどは、小分子培養クラスタにおける増加した発現を示し、準安定状態に関連した遺伝子の増加した発現は、従来の培養クラスタにおいて検出された(図7E)。
従来の培養において培養及び維持されたhiPSCのX不活性化状態を、小分子培養に
適合され、10継代の間維持されたその対応物と比較した(図7F)。小分子培養において維持されたhiPSCは、従来の培養と比較して、X染色体遺伝子発現において増加を示し、これは、サイレンシングされたX染色体の再活性化を示唆していた(図7F)。認め得る例外は、小分子培養への切り替えにおいて下方調節されたX不活性特異的転写(XIST)であった(図7F)。X活性化のさらなる証拠は、従来の培地に適合されたその対応する培養に対する、FMM中で培養されたhiPSCのH3K27me3の分染により提供された(図7G)。FMM中のhiPSCの大部分は、H3K27me3染色を有さず、一方、従来の培養におけるhiPSCの大部分は、核サイズの低減と共にH3K27me3核内フォーカスを示し、これはX不活性化を示唆していた(従来の培地における>90%のH3K27me3染色と比較して、FMMにおける<10%のH3K27me3染色;図7G)。
適合され、10継代の間維持されたその対応物と比較した(図7F)。小分子培養において維持されたhiPSCは、従来の培養と比較して、X染色体遺伝子発現において増加を示し、これは、サイレンシングされたX染色体の再活性化を示唆していた(図7F)。認め得る例外は、小分子培養への切り替えにおいて下方調節されたX不活性特異的転写(XIST)であった(図7F)。X活性化のさらなる証拠は、従来の培地に適合されたその対応する培養に対する、FMM中で培養されたhiPSCのH3K27me3の分染により提供された(図7G)。FMM中のhiPSCの大部分は、H3K27me3染色を有さず、一方、従来の培養におけるhiPSCの大部分は、核サイズの低減と共にH3K27me3核内フォーカスを示し、これはX不活性化を示唆していた(従来の培地における>90%のH3K27me3染色と比較して、FMMにおける<10%のH3K27me3染色;図7G)。
実施例6
小分子培養におけるhiPSC維持
誘導hiPSC(OCT4/NANOG/SOX2、OCT4/ECAT1/UTF1、またはOCT4/ECAT1/UTF1/ESRRB/NANOGを含む再プログラミング因子の様々な組み合わせで誘引された線維芽細胞または血球)を、培養物のコンフルエンスが75〜90%に達したら、単一細胞として慣例的に継代した。単一細胞解離のために、hiPSCをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Mediatech)で1回洗浄し、Accutase(Millipore)で37℃で3〜5分間処理し、続いて滴下して、単一細胞解離を確実とした。次いで、単一細胞懸濁液を従来の培地と同体積で混合し、225gで4分間遠心分離し、運命維持培地(Fate Maintenance Medium(FMM))中に再懸濁させ、hESC定性マトリゲル(Corning)コーティング表面上に播種した。マトリゲルは、製造者の指示に従って調製及び表面のコーティングに使用した。継代は典型的に1:3〜1:6であり、組織培養プレートは事前にマトリゲルで37℃で1〜4時間コーティングし、2日から3日毎にFMMを供給した。細胞培養物を、37℃及び5%CO2に設定された加湿インキュベータ内に維持した。従来の培地は、DMEM/F12(Mediatech)、20%ノックアウト血清代替物(Life Technologies)、1×Glutagro(Mediatech)、1×非必須アミノ酸(NEAA)(Mediatech)、1×Pen/Strep(Mediatech)、及び100μMのβ−メルカプトエタノールからなる。FMMは、5μMのチアゾビビン(施設内で合成)、0.4μMのPD0325901(Biovision)、1μMのCHIR99021(Biovision)、100ng/mLのbFGF(Life Technologies)、及び10ng/mLのhLIF(Millipore)が補充された従来の培地からなる。FMMにおいて拡大された培養物のフロー分析及び形態を、図18A〜D及び19A〜Bに示す。FMMにおいて拡大された細胞はまた、図20A〜Dに示されるように、複数の継代にわたって正常核型を示した。
小分子培養におけるhiPSC維持
誘導hiPSC(OCT4/NANOG/SOX2、OCT4/ECAT1/UTF1、またはOCT4/ECAT1/UTF1/ESRRB/NANOGを含む再プログラミング因子の様々な組み合わせで誘引された線維芽細胞または血球)を、培養物のコンフルエンスが75〜90%に達したら、単一細胞として慣例的に継代した。単一細胞解離のために、hiPSCをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Mediatech)で1回洗浄し、Accutase(Millipore)で37℃で3〜5分間処理し、続いて滴下して、単一細胞解離を確実とした。次いで、単一細胞懸濁液を従来の培地と同体積で混合し、225gで4分間遠心分離し、運命維持培地(Fate Maintenance Medium(FMM))中に再懸濁させ、hESC定性マトリゲル(Corning)コーティング表面上に播種した。マトリゲルは、製造者の指示に従って調製及び表面のコーティングに使用した。継代は典型的に1:3〜1:6であり、組織培養プレートは事前にマトリゲルで37℃で1〜4時間コーティングし、2日から3日毎にFMMを供給した。細胞培養物を、37℃及び5%CO2に設定された加湿インキュベータ内に維持した。従来の培地は、DMEM/F12(Mediatech)、20%ノックアウト血清代替物(Life Technologies)、1×Glutagro(Mediatech)、1×非必須アミノ酸(NEAA)(Mediatech)、1×Pen/Strep(Mediatech)、及び100μMのβ−メルカプトエタノールからなる。FMMは、5μMのチアゾビビン(施設内で合成)、0.4μMのPD0325901(Biovision)、1μMのCHIR99021(Biovision)、100ng/mLのbFGF(Life Technologies)、及び10ng/mLのhLIF(Millipore)が補充された従来の培地からなる。FMMにおいて拡大された培養物のフロー分析及び形態を、図18A〜D及び19A〜Bに示す。FMMにおいて拡大された細胞はまた、図20A〜Dに示されるように、複数の継代にわたって正常核型を示した。
実施例7
小分子培養における最小限の遺伝子を用いた再プログラム
再プログラムを開始させるために、伝統的な組み込みレンチウイルスであるNILを使用したレンチウイルス形質導入により、またはエピソームベクターによるエレクトロポレーションにより、再プログラミング因子の異所性発現を誘引した。図14A〜Bに示されるように、レンチウイルス発現系は、EF1αプロモーター、特異的遺伝子の組み合わせ(表3)、及び組み込まれた導入遺伝子のCRE媒介切断を可能とする3’末端におけるLOXP部位を含む、いくつかの特徴からなっていた。CRE切断後、誘導されたhiPSCゲノムはもはや導入遺伝子を含有せず、本質的にフットプリントを含んでいなかった。図14C〜Fに示されるように、エピソームコンストラクトは、EF1αプロモーター及び固有の再プログラミング因子を含む、固有の特徴を有していた。トランスフェクト後
、エピソームコンストラクトは核内に位置し、ゲノム内に組み込まれないトランス媒介様式で作用した。
小分子培養における最小限の遺伝子を用いた再プログラム
再プログラムを開始させるために、伝統的な組み込みレンチウイルスであるNILを使用したレンチウイルス形質導入により、またはエピソームベクターによるエレクトロポレーションにより、再プログラミング因子の異所性発現を誘引した。図14A〜Bに示されるように、レンチウイルス発現系は、EF1αプロモーター、特異的遺伝子の組み合わせ(表3)、及び組み込まれた導入遺伝子のCRE媒介切断を可能とする3’末端におけるLOXP部位を含む、いくつかの特徴からなっていた。CRE切断後、誘導されたhiPSCゲノムはもはや導入遺伝子を含有せず、本質的にフットプリントを含んでいなかった。図14C〜Fに示されるように、エピソームコンストラクトは、EF1αプロモーター及び固有の再プログラミング因子を含む、固有の特徴を有していた。トランスフェクト後
、エピソームコンストラクトは核内に位置し、ゲノム内に組み込まれないトランス媒介様式で作用した。
レンチウイルス感染のために、出発ヒト線維芽細胞を、製造者の指示に従い、マトリゲル(Corning)でコーティングされた6ウェルプレートのウェル当たり7×104〜1×105細胞で播種した。293T細胞からの新鮮なレンチウイルス上清を、出発細胞に、1:2(1部のレンチウイルス上清:1部の線維芽細胞培地)の希釈率で添加した。NILウイルス上清は、1×濃度で使用し、希釈しなかった。以前に凍結されていたウイルスを使用する場合、希釈せずに1×濃度で使用した。様々な因子のウイルス上清を、6ウェル当たり全部で2mLの培地まで合わせた(表3)。これに、5μg/mLのポリブレン(Millipore)及び10mMのHepes(Meditech)を補充し、続いて遠心感染(spin infection)を行った。6ウェルプレートをパラフィルムで封止し、600gで90分間、32℃で遠心分離した。次いでプレートを37℃及び5% CO2のインキュベータに12〜16時間移した。レンチウイルスでのインキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、培養培地を、1部の運命再プログラム培地(Fate Reprogramming Medium(FRM))及び1部の線維芽細胞培地を含有する50/50培地に切り替えた。培地は、感染から4〜6日後の間で完全にFRMに切り替えられた。FRMは、5μMのチアゾビビン(施設内で合成)、0.4μMのPD0325901(Biovision)、1μMのCHIR99021(Biovision)、2μMのSB431542(Biovision)、100ng/mLのbFGF(Life Technologies)、1×N2補充物質(Life Technologies)、及び1×B27補充物質(Life Technologies)が補充された従来の培地(上述)からなる。ウェルがコンフルエントとなったら、事前にマトリゲルでコーティングされた10cmの皿の上に細胞を継代する。継代は、マトリゲルコーティング表面上へのAccutase(Millipore)による解離からなっていた(上述の通り)。14日目から18日目の間、またはiPSCコロニーが存在するようになったら、培養培地をFRMからFMMに切り替えた。単一細胞解離細胞を、FMMを有するマトリゲルコーティングプレート上に拡大し、フローサイトメトリーソーティングまで維持した。hiPSC表現型の発現の結果を、表3、図15A〜C(8〜15日目)、及び図16A〜D、図17A〜B(4週目のOct−4/Ecat1/UTF1/Esrrb/Nanog)に示す。
エピソームベクター再プログラムのために、図13に示されるプラスミドを使用した線維芽細胞または臍帯血細胞のトランスフェクションを、NEON Transfection System(Life Technologies)を使用して行った。製品マニュアルにより説明されているように適切な緩衝液中で1650v/10ms/3パルスの設定を使用して、5×105線維芽細胞または2.5×105臍帯血細胞に、再プログラミング因子を含有する全部で約3μgのエピソームプラスミドを、EBNA(mRNAの形態で、またはクローニングプラスミドpCDNA内のカセットとして)と共トランスフェクトした。抗生物質を含まない4ng/mLのbFGF及び5μg/mLのフィブロネクチン(BD Biosciences)が補充された線維芽細胞培地または臍帯血培養培地を含有する(細胞型に依存して)マトリゲルでコーティングされた6ウェルプレートのウェル上に、トランスフェクトされた細胞を直接播種した。臍帯血培養培地は、SFMII+CC110(Stem Cell Technologies)からなる。トランスフェクションから24時間後、FRMを培養物に同体積で添加する。線維芽細胞培養に対しては、トランスフェクションから48時間後に、50μg/mLのハイグロマイシン(Corning)を培養物に添加した。5日目に培養培地を完全にFRMに切り替え、ハイグロマイシンはトランスフェクションから7日後に除去した。全ての再プログラム培養物は、トランスフェクションから14日後にFMMに切り替えた。臍帯血培養物に対しては、トランスフェクションから24時間後に、FRMを同体積で添加し、トランスフェクション後14日目まで数日毎に継続的に添加し、そこで培養物を吸引して完全にFMMで置き換えた。両方の場合において、トランスフェクションから5〜7日後に、接着性の円形細胞のクラスタが観察された。FMM中となったら、全ての再プログラムクラスタを維持し、マトリゲルコーティング表面(上述)上でAccutaseを使用して単一細胞継代を行った。単一細胞解離細胞を、FMMを有するマトリゲルコーティングプレート上に拡大し、フローサイトメトリーソーティングまで維持した。
実施例8
再プログラミング因子の影響及びそれらの化学量論
ヒト線維芽細胞を、いくつかの再プログラミング因子を含有するレンチウイルスに遠心感染させた。抗生物質選択因子を含有しないレンチウイルスプラスミドを使用して、全ての試料をOCT4、SOX2、NANOG、及びSV40LTに感染させた。細胞を、ピューロマイシン選択カセット及び様々な再プログラミング因子を含有する単一レンチウイルスプラスミドに同時感染させた。これらの因子は、OCT4−P2A−SOX2、OCT4−P2A−NANOG−T2A−SOX2、またはOCT4−P2A−OCT4のいずれかを含んでいた。感染から2日後、50/50培地中の500ng/mLのピューロマイシン(Life Technologies)を各ウェルに添加した。5日目、ピューロマイシン選択から3日後に、ピューロマイシンを含まないFRMに培地を変更した。14日目に、培地をFMMに切り替えた。24日目と27日目との間に、SSEA4+/TRA181+集団に対してフロー分析を行った。増加したOCT4発現が、再プログラム効率を大幅に改善することが観察された(図23A)。
再プログラミング因子の影響及びそれらの化学量論
ヒト線維芽細胞を、いくつかの再プログラミング因子を含有するレンチウイルスに遠心感染させた。抗生物質選択因子を含有しないレンチウイルスプラスミドを使用して、全ての試料をOCT4、SOX2、NANOG、及びSV40LTに感染させた。細胞を、ピューロマイシン選択カセット及び様々な再プログラミング因子を含有する単一レンチウイルスプラスミドに同時感染させた。これらの因子は、OCT4−P2A−SOX2、OCT4−P2A−NANOG−T2A−SOX2、またはOCT4−P2A−OCT4のいずれかを含んでいた。感染から2日後、50/50培地中の500ng/mLのピューロマイシン(Life Technologies)を各ウェルに添加した。5日目、ピューロマイシン選択から3日後に、ピューロマイシンを含まないFRMに培地を変更した。14日目に、培地をFMMに切り替えた。24日目と27日目との間に、SSEA4+/TRA181+集団に対してフロー分析を行った。増加したOCT4発現が、再プログラム効率を大幅に改善することが観察された(図23A)。
実施例9
実験手順
従来の培養系におけるhiPSCの維持
従来通り培養されたhiPSCを、マイトマイシンC処理MEF(Millipore)フィーダー細胞上で維持し、DMEM/F12(Mediatech)、20%v/vのノックアウト血清代替物(Life Technologies)、1%v/vの非必須アミノ酸(Mediatech)、2mMのL−グルタミン(Mediatech)、100μMのβ−メルカプトエタノール(Life Technologies)及び10ng/mLのbFGF(Life Technologies)を含有する従来の培地(文章内では従来の培地と呼ばれる)で培養した。コンフルエントとなったら、従来通り培養されたhiPSCを、1mg/mLのコラゲナーゼIV(Life Technologies)を使用して37℃で7分間酵素的に解離させ、続いて小片まで機械的解離を行い(集塊継代(clump passaging)と呼ばれる)、回収して、従来の培地を毎日添加しながら、5〜7日毎に、新しく播種されたフィーダー細胞上に1:3〜1:4で希釈継代した。過度の自発的分化が見られる場合、コロニーを手作業で採取し、Insulin Syringe(Becton Dickinson)のチップを使用して小片に切断し、新しく播種されたフィーダー細胞に移した。細胞培養物を、37℃及び5% CO2に設定された加湿インキュベータ内に維持した。
実験手順
従来の培養系におけるhiPSCの維持
従来通り培養されたhiPSCを、マイトマイシンC処理MEF(Millipore)フィーダー細胞上で維持し、DMEM/F12(Mediatech)、20%v/vのノックアウト血清代替物(Life Technologies)、1%v/vの非必須アミノ酸(Mediatech)、2mMのL−グルタミン(Mediatech)、100μMのβ−メルカプトエタノール(Life Technologies)及び10ng/mLのbFGF(Life Technologies)を含有する従来の培地(文章内では従来の培地と呼ばれる)で培養した。コンフルエントとなったら、従来通り培養されたhiPSCを、1mg/mLのコラゲナーゼIV(Life Technologies)を使用して37℃で7分間酵素的に解離させ、続いて小片まで機械的解離を行い(集塊継代(clump passaging)と呼ばれる)、回収して、従来の培地を毎日添加しながら、5〜7日毎に、新しく播種されたフィーダー細胞上に1:3〜1:4で希釈継代した。過度の自発的分化が見られる場合、コロニーを手作業で採取し、Insulin Syringe(Becton Dickinson)のチップを使用して小片に切断し、新しく播種されたフィーダー細胞に移した。細胞培養物を、37℃及び5% CO2に設定された加湿インキュベータ内に維持した。
体細胞の再プログラム
再プログラムを開始させるために、レンチウイルス形質導入またはエピソームベクタートランスフェクションにより、再プログラミング因子の異所性発現を誘引した。続いて、レンチウイルストランスフェクションを、以前に説明された通りに行った(Valamehr et al.,2012)。簡潔に説明すると、出発細胞を、マトリゲル(BD Biosciences)コーティング表面上で、6ウェルプレートのウェル当たり1×105細胞で播種した。指定されない限り、全てのマトリゲルコーティングは、マトリゲル溶液(25mLのDMEM/F12中に再懸濁された1アリコートのマトリゲル)を組織培養表面に添加し、37℃で2〜4時間のインキュベーションを行うことからなる。レンチウイルス発現導入遺伝子OCT4/SOX2/KLF4を生成する293T細胞からの上清を、1:2(1部のレンチウイルス上清:1部の線維芽細胞培地)の希釈率で出発細胞に添加し、4μg/mLポリブレン(Millipore)を補充し、37℃及び5% CO2に12〜16時間移した。線維芽細胞培地:DMEM(Mediatech)、10%のFBS(Life Technologies)、1×glutamax(Life Technologies)、1×非必須アミノ酸(Mediatech)。レンチウイルスによるインキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、線維芽細胞培地を供給した。トランスフェクションから48時間後、1部のFRM(またはSMC4)及び1部の線維芽細胞培地を含有する50/50培地に培養培地を切り替えた。通常は感染後4日目から6日目の間に、培養物がより大きな槽に継代されると、培地は完全にFRM(またはSMC4)に切り替えられた。継代は、マトリゲルコーティング表面上へのAccutaseによる解離からなる(後述の通り)。培養物は、次の適用までFRM(またはSMC4)中で維持した。
再プログラムを開始させるために、レンチウイルス形質導入またはエピソームベクタートランスフェクションにより、再プログラミング因子の異所性発現を誘引した。続いて、レンチウイルストランスフェクションを、以前に説明された通りに行った(Valamehr et al.,2012)。簡潔に説明すると、出発細胞を、マトリゲル(BD Biosciences)コーティング表面上で、6ウェルプレートのウェル当たり1×105細胞で播種した。指定されない限り、全てのマトリゲルコーティングは、マトリゲル溶液(25mLのDMEM/F12中に再懸濁された1アリコートのマトリゲル)を組織培養表面に添加し、37℃で2〜4時間のインキュベーションを行うことからなる。レンチウイルス発現導入遺伝子OCT4/SOX2/KLF4を生成する293T細胞からの上清を、1:2(1部のレンチウイルス上清:1部の線維芽細胞培地)の希釈率で出発細胞に添加し、4μg/mLポリブレン(Millipore)を補充し、37℃及び5% CO2に12〜16時間移した。線維芽細胞培地:DMEM(Mediatech)、10%のFBS(Life Technologies)、1×glutamax(Life Technologies)、1×非必須アミノ酸(Mediatech)。レンチウイルスによるインキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、線維芽細胞培地を供給した。トランスフェクションから48時間後、1部のFRM(またはSMC4)及び1部の線維芽細胞培地を含有する50/50培地に培養培地を切り替えた。通常は感染後4日目から6日目の間に、培養物がより大きな槽に継代されると、培地は完全にFRM(またはSMC4)に切り替えられた。継代は、マトリゲルコーティング表面上へのAccutaseによる解離からなる(後述の通り)。培養物は、次の適用までFRM(またはSMC4)中で維持した。
エピソームベクター再プログラムのために、遺伝子セットOCT4/SOX2/NANOG/KLF4/LIN28/MYC/SV40LT(A14703、Life Technologies)を使用した線維芽細胞または臍帯血細胞のトランスフェクションを、NEON Transfection System(Life Technologies)を使用して行った。製品マニュアルにより説明されているように適切な緩衝液中で1650v/10ms/3パルスの設定を使用して、約4μgのベクターセットを5×105線維芽細胞または2.5×105臍帯血細胞内にトランスフェクトした。マトリゲルでコーティングされ、10ng/mLのbFGF及び5μg/mLのフィブロネクチン(BD Biosciences)が補充された線維芽細胞培地または臍帯血培養培地を含有する(細胞型に依存して)、10cmの皿(線維芽細胞)または6ウェルプレートのウェル(臍帯血)内に、トランスフェクトされた細胞を直接播種した。臍帯血培養培地:SFMII+CC110(Stem Cell Technologies)。トランスフェクションから24時間後、FRMを培養物に同体積で添加する。線維芽細胞培養に対しては、トランスフェクションから48時間後に、50μg/mLのハイグロマイシン(Mediatech)を培養物に添加した。5日目に培養培地を完全にFRMに切り替え、ハイグロマイシンはトランスフェクション後7日目に除去した。全ての再プログラム培養物は、トランスフェクション後14日目にFMMに切り替えた。臍帯血培養物に対しては、トランスフェクションから24時間後に、FRMを同体積で添加し、トランスフェクション後14日目まで数日毎に継続的に添加し、そこで培養物を吸引して完全にFMMで置き換えた。両方の場合において、トランスフェクション後5〜7日目に、接着性の円形細胞のクラスタが観察された。FMM中となったら、全ての再プログラムクラスタを維持し、Accutaseを使用して単一細胞継代を行った。単一細胞解離細胞を、FMMを有するマトリゲルコーティングプレート上に拡大し、フローサイトメトリーソーティングまで維持した。ビトロネクチン(Life Technologies)表面コーティング試験においては、マトリゲルのビトロネクチンへの置換を除く全ての点が同じに保たれた。低減因子エピソーム再プログラムのために、EF1αプロモーターの調節下で、OCT4−P2A−OCT4、OCT4−P2A−SOX2またはOCT4−P2A−NANOG−T2A−SOX2を含有するようにpCEP4(Life Technologies)ベクター骨格を構築した。低減因子エピソームベクターのトランスフェクションに続き、わずかな変更を除いて上述と同じプロトコルを行った。EBNAを、EBNA mRNA(20μg)またはベクターカセット(2μg)として共トランスフェクトした(Howden et al.,2006)。ハイグロマイシン選択を10日間維持し、16日目にFMMを導入した。
レンチウイルスの生成
293T(ATCC)を、抗生物質を含まない線維芽細胞培地中に維持し、80%超のコンフルエンスに到達させなかった。線維芽細胞培地は、DMEM(Mediatech)、10%のウシ胎仔血清(FBS)(Life Technologies)、1×Glutagro(Mediatech)、及び1×NEAA(Mediatech)からなっていた。まずPBSで洗浄し、続いて0.05%トリプシン(Mediatech)と共に37℃で4分間インキュベーションすることにより、細胞を継代した。解離した細胞を線維芽細胞培地中に再懸濁させ、225gで4分間遠心分離し、所望のプレート上に播種した。組み込みレンチウイルスを生成するために、293Tを、1日目に各ウイルス調製用の10cmの皿当たり3.5×106細胞で継代した。2日目に、トランスフェクションの1時間前に培地を10mLの新鮮な線維芽細胞培地に変更した。CalPhos
Kit(Clontech)を使用してDNAをトランスフェクトした。トランスフェクションのために、関心のある遺伝子(複数を含む)を含有する5μgのレンチウイルスクローニングプラスミド、3.2μgのパッケージングプラスミドpPAX、630ngのパッケージングプラスミドpMDG、87μLのカルシウム溶液、及び700μLまでの水を合わせた。1mLの血清用ピペットを使用して気泡を形成しながら、700μLのHBS溶液を添加した。これを室温で15分間インキュベートし、次いで293Tの10cmプレートに滴下により添加した。3日目に、ウイルス上清を除去し、廃棄し、15mLの新鮮な線維芽細胞培地をプレートに添加した。4日目、トランスフェクションから48時間後に、ウイルス上清を回収し、4℃で保存した。15mLの線維芽細胞培地をプレートに添加した。5日目、トランスフェクションから72時間後に、ウイルス上清を回収し、4日目の上清に添加した。0.45μmのフィルタを使用してこのウイルスプールを濾過し、Lenti−X GoStix(Clontech)を使用して力価を確認した。ウイルスを、感染に使用するか、またはアリコートとして−80℃で凍結した。非組み込みレンチウイルス(NIL)(Invivogen)を生成するために、各ウイルス調製用のT75フラスコを使用して、製造者の指示に従いプロトコルを行った。ウイルス上清を、トランスフェクションから48、72、及び96時間後に回収し、プールし、濾過し、上述のように力価を測定した。NILウイルスを、感染に使用するか、またはアリコートとして−80℃で凍結した。
293T(ATCC)を、抗生物質を含まない線維芽細胞培地中に維持し、80%超のコンフルエンスに到達させなかった。線維芽細胞培地は、DMEM(Mediatech)、10%のウシ胎仔血清(FBS)(Life Technologies)、1×Glutagro(Mediatech)、及び1×NEAA(Mediatech)からなっていた。まずPBSで洗浄し、続いて0.05%トリプシン(Mediatech)と共に37℃で4分間インキュベーションすることにより、細胞を継代した。解離した細胞を線維芽細胞培地中に再懸濁させ、225gで4分間遠心分離し、所望のプレート上に播種した。組み込みレンチウイルスを生成するために、293Tを、1日目に各ウイルス調製用の10cmの皿当たり3.5×106細胞で継代した。2日目に、トランスフェクションの1時間前に培地を10mLの新鮮な線維芽細胞培地に変更した。CalPhos
Kit(Clontech)を使用してDNAをトランスフェクトした。トランスフェクションのために、関心のある遺伝子(複数を含む)を含有する5μgのレンチウイルスクローニングプラスミド、3.2μgのパッケージングプラスミドpPAX、630ngのパッケージングプラスミドpMDG、87μLのカルシウム溶液、及び700μLまでの水を合わせた。1mLの血清用ピペットを使用して気泡を形成しながら、700μLのHBS溶液を添加した。これを室温で15分間インキュベートし、次いで293Tの10cmプレートに滴下により添加した。3日目に、ウイルス上清を除去し、廃棄し、15mLの新鮮な線維芽細胞培地をプレートに添加した。4日目、トランスフェクションから48時間後に、ウイルス上清を回収し、4℃で保存した。15mLの線維芽細胞培地をプレートに添加した。5日目、トランスフェクションから72時間後に、ウイルス上清を回収し、4日目の上清に添加した。0.45μmのフィルタを使用してこのウイルスプールを濾過し、Lenti−X GoStix(Clontech)を使用して力価を確認した。ウイルスを、感染に使用するか、またはアリコートとして−80℃で凍結した。非組み込みレンチウイルス(NIL)(Invivogen)を生成するために、各ウイルス調製用のT75フラスコを使用して、製造者の指示に従いプロトコルを行った。ウイルス上清を、トランスフェクションから48、72、及び96時間後に回収し、プールし、濾過し、上述のように力価を測定した。NILウイルスを、感染に使用するか、またはアリコートとして−80℃で凍結した。
小分子培養におけるhiPSC維持
誘導hiPSCを、培養物のコンフルエンスが75〜90%に達したら、単一細胞として慣例的に継代した。過度のコンフルエンスは、分化をもたらし得ることに留意されたい。単一細胞解離のために、hiPSCをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Mediatech)で1回洗浄し、Accutaseで37℃で3〜5分間処理し、続いて滴下して、単一細胞解離を確実とした。次いで、単一細胞懸濁液を従来の培地と同体積で混合し、225gで4分間遠心分離し、FMM中に再懸濁させ、マトリゲルコーティング表面上に播種した。継代は典型的に1:4〜1:8であり、移された組織培養プレートは事前にマトリゲルで37℃で2〜4時間コーティングし、1日おきにFMMを供給した。細胞培養物を、37℃及び5% CO2に設定された加湿インキュベータ内に維持した。FMM及びFRM用の培地配合物を、表1に記載する。SMC4培養は、以前に議論されている(Valamehr et al.,2012)。簡潔に説明すると、小分子0.4mMのPD0325901(Biovision)、1mMのCHIR99021(Biovision)、5mMのチアゾビビン及び2mMのSB431542(Biovision)を、従来の培養培地に添加し、プロトコルに従って継代する。
誘導hiPSCを、培養物のコンフルエンスが75〜90%に達したら、単一細胞として慣例的に継代した。過度のコンフルエンスは、分化をもたらし得ることに留意されたい。単一細胞解離のために、hiPSCをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Mediatech)で1回洗浄し、Accutaseで37℃で3〜5分間処理し、続いて滴下して、単一細胞解離を確実とした。次いで、単一細胞懸濁液を従来の培地と同体積で混合し、225gで4分間遠心分離し、FMM中に再懸濁させ、マトリゲルコーティング表面上に播種した。継代は典型的に1:4〜1:8であり、移された組織培養プレートは事前にマトリゲルで37℃で2〜4時間コーティングし、1日おきにFMMを供給した。細胞培養物を、37℃及び5% CO2に設定された加湿インキュベータ内に維持した。FMM及びFRM用の培地配合物を、表1に記載する。SMC4培養は、以前に議論されている(Valamehr et al.,2012)。簡潔に説明すると、小分子0.4mMのPD0325901(Biovision)、1mMのCHIR99021(Biovision)、5mMのチアゾビビン及び2mMのSB431542(Biovision)を、従来の培養培地に添加し、プロトコルに従って継代する。
フローサイトメトリー分析及びソーティング
単一細胞解離(上述)再プログラムプールを、ハンク平衡塩溶液(MediaTech)、4%のウシ胎仔血清(Invitrogen)、1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech)及び10mMのHepes(Mediatech)を含有する冷却された染色緩衝液中に再懸濁させた。SSEA4−FITC、TRA1−81−Alexa Fluor−647及びCD30−PE(BD Biosciences)を含む複合化した一次抗体を、細胞溶液に添加し、氷上で15分間インキュベートした。全ての抗体は、100万細胞当たり100μLの染色緩衝液中7〜10μLで使用した。溶液を染色緩衝液中で1回洗浄し、225gで4分間遠心分離し、10μM のチアゾビビンを含有する染色緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメトリーソーティングのために氷上で維持した。上記のゲーティング戦略を使用して、FACS Aria II(BD Biosciences)でフローサイトメトリーソーティングを行った。ソーティングされた細胞は、ウェル当たり3及び9イベントの濃度で、100μMノズルを使用して96ウェルプレート内に直接排出された。我々は、ソーティングされたイベントが必ずしもソーティング後の各ウェルにおいて観察される実際の細胞の数と相関するわけではないこと、及び、ウェル当たり3細胞が、個々のコロニーを含有する好ましい数のウェルの提供したことに気付いたため、ウェル当たり3細胞のソーティングが、我々にとって好ましい濃度であった。各ウェルを、5μg/mLのフィブロネクチン及び1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech)が補充された200μLのFMMで事前に充填し、5×マトリゲルで一晩事前にコーティングした。5×マトリゲル事前コーティングは、1アリコートのマトリゲルを5mLのDMEM/F12に添加し、次いで一晩4℃でインキュベートして適切に再懸濁させ、最後にウェル当たり50μLで96ウェルプレートに添加し、続いて37℃で一晩インキュベートすることを含む。各ウェルに培地を添加する直前に、5×マトリゲルを吸引する。ソーティングの完了後、インキュベーションの前に、96ウェルプレートを225gで1〜2分間遠心分離する。プレートを、撹乱されない状態で7日間静置した。7日目に、150μLの培地を各ウェルから除去し、100μLのFMMで置き換えた。ソーティング後10日目に、さらなる100μLのFMMをウェルに再供給した。コロニー形成は、早くも2日目に検出され、ソーティングから7〜10日の間にほとんどのコロニーが拡大された。第1の継代において、ウェルをPBSで洗浄し、30μLのAccutaseで37℃で約10分間解離させた。Accutase処理の延長の必要性は、長期間培養物中で待機状態であったコロニーの緊密度を反映している。細胞が解離していることが観察された後、200μLのFMMを各ウェルに添加し、数回滴下してコロニーを分解する。解離したコロニーを、5×マトリゲルで事前にコーティングされた96ウェルプレートの別のウェルに移し、次いで、インキュベーションの前に225gで2分間遠心分離する。この1:1の継代は、初期コロニーを広げるために行う。3〜5分間のAccutase処理、及びFMM中の1×マトリゲルで事前にコーティングされたより大きなウェル内への1:4の拡大により、その後の継代を慣例的に行う。Guava EasyCyte 8 HT(Millipore)でフローサイトメトリー分析を行い、FCS Express 4(De Novo Software)を使用して分析した。
単一細胞解離(上述)再プログラムプールを、ハンク平衡塩溶液(MediaTech)、4%のウシ胎仔血清(Invitrogen)、1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech)及び10mMのHepes(Mediatech)を含有する冷却された染色緩衝液中に再懸濁させた。SSEA4−FITC、TRA1−81−Alexa Fluor−647及びCD30−PE(BD Biosciences)を含む複合化した一次抗体を、細胞溶液に添加し、氷上で15分間インキュベートした。全ての抗体は、100万細胞当たり100μLの染色緩衝液中7〜10μLで使用した。溶液を染色緩衝液中で1回洗浄し、225gで4分間遠心分離し、10μM のチアゾビビンを含有する染色緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメトリーソーティングのために氷上で維持した。上記のゲーティング戦略を使用して、FACS Aria II(BD Biosciences)でフローサイトメトリーソーティングを行った。ソーティングされた細胞は、ウェル当たり3及び9イベントの濃度で、100μMノズルを使用して96ウェルプレート内に直接排出された。我々は、ソーティングされたイベントが必ずしもソーティング後の各ウェルにおいて観察される実際の細胞の数と相関するわけではないこと、及び、ウェル当たり3細胞が、個々のコロニーを含有する好ましい数のウェルの提供したことに気付いたため、ウェル当たり3細胞のソーティングが、我々にとって好ましい濃度であった。各ウェルを、5μg/mLのフィブロネクチン及び1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech)が補充された200μLのFMMで事前に充填し、5×マトリゲルで一晩事前にコーティングした。5×マトリゲル事前コーティングは、1アリコートのマトリゲルを5mLのDMEM/F12に添加し、次いで一晩4℃でインキュベートして適切に再懸濁させ、最後にウェル当たり50μLで96ウェルプレートに添加し、続いて37℃で一晩インキュベートすることを含む。各ウェルに培地を添加する直前に、5×マトリゲルを吸引する。ソーティングの完了後、インキュベーションの前に、96ウェルプレートを225gで1〜2分間遠心分離する。プレートを、撹乱されない状態で7日間静置した。7日目に、150μLの培地を各ウェルから除去し、100μLのFMMで置き換えた。ソーティング後10日目に、さらなる100μLのFMMをウェルに再供給した。コロニー形成は、早くも2日目に検出され、ソーティングから7〜10日の間にほとんどのコロニーが拡大された。第1の継代において、ウェルをPBSで洗浄し、30μLのAccutaseで37℃で約10分間解離させた。Accutase処理の延長の必要性は、長期間培養物中で待機状態であったコロニーの緊密度を反映している。細胞が解離していることが観察された後、200μLのFMMを各ウェルに添加し、数回滴下してコロニーを分解する。解離したコロニーを、5×マトリゲルで事前にコーティングされた96ウェルプレートの別のウェルに移し、次いで、インキュベーションの前に225gで2分間遠心分離する。この1:1の継代は、初期コロニーを広げるために行う。3〜5分間のAccutase処理、及びFMM中の1×マトリゲルで事前にコーティングされたより大きなウェル内への1:4の拡大により、その後の継代を慣例的に行う。Guava EasyCyte 8 HT(Millipore)でフローサイトメトリー分析を行い、FCS Express 4(De Novo Software)を使用して分析した。
リアルタイムRT−PCR及びFluidigm分析
Pico Pure RNA Isolation Kit(Life Technologies)を使用して、全RNAを単離した。iScript cDNA Synthesis Kit(Bio−Rad)を使用して、相補的DNA(cDNA)を100ngの単離された全RNAから逆転写した。次いで、cDNAを、TaqMan PreAmp Master Mix Kit(Life Technologies)及び0.2×濃度のプールされたTaqManアッセイを使用した、22の特異的標的遺伝子及び2つの参照対照遺伝子の事前増幅に使用した。製造者のプロトコルに記載の標準サイクリング条件による14サイクルの増幅を使用して、cDNAからの特異的標的増幅(STA)を行った。事前増幅されたcDNA反応(n=48)を1:5で希釈し(無菌水中)、リアルタイム定量PCR反応用のテンプレートとして使用した。48.48動的アレイ(Fluidigm)をNanoFlex IFC Controller MX(Fluidigm)を使用して投入し、TaqManアッセイを2回投入し、BioMark Real−Time PCR System(Fluidigm)を使用してリアルタイム反応を行った。BioMark Real−Time PCR Analysisソフトウェア(Fluidigm)を使用して結果を分析した。32を超えるサイクル閾値(Ct)を有する試料は、計算から除外した。2回のアッセイから平均Ctを計算し、6つの対照MEF細胞株(MEF上のOSK hiPSC及びH1 ESC)の中央値に対する2つの参照遺伝子(GAPDH及びHPRT1)の平均を使用して、デルタ−デルタCts(ΔΔCt)を計算した。相対的遺伝子発現(RQ)の結果は、ヒートマップ形式でExcel(Microsoft)で表示される。
Pico Pure RNA Isolation Kit(Life Technologies)を使用して、全RNAを単離した。iScript cDNA Synthesis Kit(Bio−Rad)を使用して、相補的DNA(cDNA)を100ngの単離された全RNAから逆転写した。次いで、cDNAを、TaqMan PreAmp Master Mix Kit(Life Technologies)及び0.2×濃度のプールされたTaqManアッセイを使用した、22の特異的標的遺伝子及び2つの参照対照遺伝子の事前増幅に使用した。製造者のプロトコルに記載の標準サイクリング条件による14サイクルの増幅を使用して、cDNAからの特異的標的増幅(STA)を行った。事前増幅されたcDNA反応(n=48)を1:5で希釈し(無菌水中)、リアルタイム定量PCR反応用のテンプレートとして使用した。48.48動的アレイ(Fluidigm)をNanoFlex IFC Controller MX(Fluidigm)を使用して投入し、TaqManアッセイを2回投入し、BioMark Real−Time PCR System(Fluidigm)を使用してリアルタイム反応を行った。BioMark Real−Time PCR Analysisソフトウェア(Fluidigm)を使用して結果を分析した。32を超えるサイクル閾値(Ct)を有する試料は、計算から除外した。2回のアッセイから平均Ctを計算し、6つの対照MEF細胞株(MEF上のOSK hiPSC及びH1 ESC)の中央値に対する2つの参照遺伝子(GAPDH及びHPRT1)の平均を使用して、デルタ−デルタCts(ΔΔCt)を計算した。相対的遺伝子発現(RQ)の結果は、ヒートマップ形式でExcel(Microsoft)で表示される。
導入遺伝子の存在の試験
QIAamp(登録商標)DNA Mini Kit及びProteinase K digestion(Qiagen)を使用して、ゲノムDNAを単離した。Taq PCR Master Mix Kit(Qiagen)を使用し、導入遺伝子特異的プライマーセット(以下の表5)(Yu et al.,2007)を用いて100ngのゲノムDNAを増幅した。PCR反応は、以下のように35サイクルの間行った:94℃で30秒間(変性)、60〜64℃で30秒間(アニール)及び72℃で1分間(伸長)。レンチウイルス法を用いて生成された線維芽細胞及びhiPSCからのゲノムDNAを、陰性対照として使用した。エピソームコンストラクトのDNAを、陽性対照として使用した。
QIAamp(登録商標)DNA Mini Kit及びProteinase K digestion(Qiagen)を使用して、ゲノムDNAを単離した。Taq PCR Master Mix Kit(Qiagen)を使用し、導入遺伝子特異的プライマーセット(以下の表5)(Yu et al.,2007)を用いて100ngのゲノムDNAを増幅した。PCR反応は、以下のように35サイクルの間行った:94℃で30秒間(変性)、60〜64℃で30秒間(アニール)及び72℃で1分間(伸長)。レンチウイルス法を用いて生成された線維芽細胞及びhiPSCからのゲノムDNAを、陰性対照として使用した。エピソームコンストラクトのDNAを、陽性対照として使用した。
免疫細胞化学分析
4%v/vのパラホルムアルデヒド(Alfa Aesar)を使用して細胞を固定し、0.2%v/vのTween(PBST)(Fisher Scientific)を含有するPBSで3回洗浄し、PBS中0.15%v/vのTritonX−100(Sigma−Aldrich)を使用して25℃で1時間透過処理した。透過処理後、細胞をPBST(Fisher Scientific)中1%v/vのBSA(Invitrogen)(PBSTB)で25℃で30分間ブロックした。PBSTBを穏やかに除去した後、細胞を、PBSTB中の一次抗体と共に、4℃で一晩インキュベートした。この試験において使用された一次抗体は、OCT4(Santa Cruz)、NANOG(Santa Cruz)、TRA160(Millipore)、TRA1−81(Millipore)、SSEA4(Millipore)、β−IIIチューブリン(TUJ1、R&D Systems)、α−平滑筋アクチン(Sigma)、FoxA2(R&D Systems)、Sox17(R&D Systems)、ネスチン(Abcam)及びα−1−フェトプロテイン(Dako)を含む。一晩のインキュベーション後、細胞をPBSTで3回洗浄し、PBSTB中に1:250で希釈された二次抗体(Alexa Fluor 488または555;Life Technologies)で、37℃で1時間染色した。細胞をPBST中で3回洗浄し、Hoechst染料(Invitrogen)で染色した。H3K27me3染色分析のために、hiPSCをカバースリップ上で72〜96時間成長させ、PBS中4%のパラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Science、EMS)で25℃で15分間固定した。PBS中0.1%のTriton X−100で25℃で1時間細胞透過処理を行い、次いで細胞をブロック溶液(PBS中1%のBSA)と共に、25℃で30分間インキュベートした。ブロック後、カバースリップを、ブロック溶液中の抗トリメチルヒストンH3(Lys27)抗体(Millipore 07−449、H3K27me3)の1:1600希釈物と共に、4℃で一晩インキュベートした。二次抗体は、Alexa Fluor 555ヤギ抗ウサギIgG(Life Technologies、A21429)であった。核をDAPIで対比染色し、Axio Observer Inverted Microscope(Carl Zeiss)で観察した。画像をAxioVS40 v4.8.1.0(Carl Zeiss Imaging Solutions Gmbh)で記録した。
4%v/vのパラホルムアルデヒド(Alfa Aesar)を使用して細胞を固定し、0.2%v/vのTween(PBST)(Fisher Scientific)を含有するPBSで3回洗浄し、PBS中0.15%v/vのTritonX−100(Sigma−Aldrich)を使用して25℃で1時間透過処理した。透過処理後、細胞をPBST(Fisher Scientific)中1%v/vのBSA(Invitrogen)(PBSTB)で25℃で30分間ブロックした。PBSTBを穏やかに除去した後、細胞を、PBSTB中の一次抗体と共に、4℃で一晩インキュベートした。この試験において使用された一次抗体は、OCT4(Santa Cruz)、NANOG(Santa Cruz)、TRA160(Millipore)、TRA1−81(Millipore)、SSEA4(Millipore)、β−IIIチューブリン(TUJ1、R&D Systems)、α−平滑筋アクチン(Sigma)、FoxA2(R&D Systems)、Sox17(R&D Systems)、ネスチン(Abcam)及びα−1−フェトプロテイン(Dako)を含む。一晩のインキュベーション後、細胞をPBSTで3回洗浄し、PBSTB中に1:250で希釈された二次抗体(Alexa Fluor 488または555;Life Technologies)で、37℃で1時間染色した。細胞をPBST中で3回洗浄し、Hoechst染料(Invitrogen)で染色した。H3K27me3染色分析のために、hiPSCをカバースリップ上で72〜96時間成長させ、PBS中4%のパラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Science、EMS)で25℃で15分間固定した。PBS中0.1%のTriton X−100で25℃で1時間細胞透過処理を行い、次いで細胞をブロック溶液(PBS中1%のBSA)と共に、25℃で30分間インキュベートした。ブロック後、カバースリップを、ブロック溶液中の抗トリメチルヒストンH3(Lys27)抗体(Millipore 07−449、H3K27me3)の1:1600希釈物と共に、4℃で一晩インキュベートした。二次抗体は、Alexa Fluor 555ヤギ抗ウサギIgG(Life Technologies、A21429)であった。核をDAPIで対比染色し、Axio Observer Inverted Microscope(Carl Zeiss)で観察した。画像をAxioVS40 v4.8.1.0(Carl Zeiss Imaging Solutions Gmbh)で記録した。
実施例7に従って再プログラムされた細胞を、4%v/vのパラホルムアルデヒド(Alfa Aesar)で固定し、PBS(Mediatech)で洗浄し、PBS中0.15%v/vのTritonX−100(Sigma−Aldrich)を使用して、25℃で1時間透過処理した。透過処理後、細胞をPBS中1%v/vのBSA(Sigma)(PBSB)で25℃で30分間ブロックした。PBSBを穏やかに除去した後、細胞を、PBSB中の一次抗体と共に、4℃で一晩インキュベートした。この試験において使用された一次抗体は、OCT4(Santa Cruz)及びTRA181(Millipore)を含む。一晩のインキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、PBSB中に1:250で希釈された二次抗体(Alexa Fluor 488または555;Life Technologies)で、37℃で1時間染色した。細胞をPBS中で3回洗浄し、Hoechst染料(Invitrogen)で染色した。染色された細胞を、Axio Observer Inverted Microscope(Carl Zeiss)で観察した。画像をAxioVS40 v4.8.1.0(Carl Zeiss Imaging Solutions Gmbh)で記録した。
分化分析(EB及び一定方向)
DMEM/F12(Mediatech)、20%のウシ胎仔血清(Invitrogen)、1%の非必須アミノ酸(Mediatech)、2mMのL−グルタミン(Mediatech)及び100μMのβ−メルカプトエタノールを含有する分化培地中で、hiPSCをEBとして分化させた。簡潔に説明すると、EB形成のために、hiPSCを、FMM中に播種し、翌日従来の培地に切り替え、細胞をプライミングした。従来の培地中で3〜4日後、培養物を、Accutase(Millipore)で単一細胞解離し、10μMのY27632を含む分化培地中に100,000細胞/mLの最終濃度まで再懸濁させた。EB形成にはチアゾビビンの代わりにROCK阻害剤Y27632が使用されることに留意されたい。V底96ウェル非組織培養プレート(Nunc)内で100μL/ウェルで細胞を播種し、950gで5分間遠心分離した。翌日、P1000を使用して、緊密な「ボール状集塊」を、分化培地中約30〜40EB/ウェルで超低結合性6ウェルプレート(Corning)に移した。7日後、EBを1:1でマトリゲルコーティング6ウェルプレートに移し、3日毎に分化培地を供給した。培養物中で3週間後、細胞を固定及び染色した。一定方向単層分化のために、hiPSCをFMM中のマトリゲルコーティングウェル上に播種し、翌日50%及び90%のコンフルエンスとした。両方の密度を、分化するように誘引した。神経誘引のために、FMM培地を、10μMのSB431542及び100nMのLDN−193189(共にSMAD阻害剤、Biovision)が補充されたhESC培地で置き換えた。2日後、分化培地に2つのSMAD阻害剤に加えて3μMのCHIR99021(Biovision)を補充した。2日後、細胞を固定し、ネスチン(Abcam)用に染色した。中胚葉分化のために、培地を、1×B27培地添加剤(Life Technologies)、3μMのCHIR99021、4ng/mlのbFGF及び10ng/mlのBMP4が補充されたRPMI(Mediatech)で置き換えた。培地を1日おきに交換し、4日目に細胞を固定し、αSMA(Sigma)用に染色した。Human Pluripotent Stem Cell Functional Identification Kit(R&D Systems)を使用して、内胚葉分化を行った。hiPSCを内胚葉分化培地で3日間インキュベートし、固定し、SOX17(R&D Systems)用に染色した。
DMEM/F12(Mediatech)、20%のウシ胎仔血清(Invitrogen)、1%の非必須アミノ酸(Mediatech)、2mMのL−グルタミン(Mediatech)及び100μMのβ−メルカプトエタノールを含有する分化培地中で、hiPSCをEBとして分化させた。簡潔に説明すると、EB形成のために、hiPSCを、FMM中に播種し、翌日従来の培地に切り替え、細胞をプライミングした。従来の培地中で3〜4日後、培養物を、Accutase(Millipore)で単一細胞解離し、10μMのY27632を含む分化培地中に100,000細胞/mLの最終濃度まで再懸濁させた。EB形成にはチアゾビビンの代わりにROCK阻害剤Y27632が使用されることに留意されたい。V底96ウェル非組織培養プレート(Nunc)内で100μL/ウェルで細胞を播種し、950gで5分間遠心分離した。翌日、P1000を使用して、緊密な「ボール状集塊」を、分化培地中約30〜40EB/ウェルで超低結合性6ウェルプレート(Corning)に移した。7日後、EBを1:1でマトリゲルコーティング6ウェルプレートに移し、3日毎に分化培地を供給した。培養物中で3週間後、細胞を固定及び染色した。一定方向単層分化のために、hiPSCをFMM中のマトリゲルコーティングウェル上に播種し、翌日50%及び90%のコンフルエンスとした。両方の密度を、分化するように誘引した。神経誘引のために、FMM培地を、10μMのSB431542及び100nMのLDN−193189(共にSMAD阻害剤、Biovision)が補充されたhESC培地で置き換えた。2日後、分化培地に2つのSMAD阻害剤に加えて3μMのCHIR99021(Biovision)を補充した。2日後、細胞を固定し、ネスチン(Abcam)用に染色した。中胚葉分化のために、培地を、1×B27培地添加剤(Life Technologies)、3μMのCHIR99021、4ng/mlのbFGF及び10ng/mlのBMP4が補充されたRPMI(Mediatech)で置き換えた。培地を1日おきに交換し、4日目に細胞を固定し、αSMA(Sigma)用に染色した。Human Pluripotent Stem Cell Functional Identification Kit(R&D Systems)を使用して、内胚葉分化を行った。hiPSCを内胚葉分化培地で3日間インキュベートし、固定し、SOX17(R&D Systems)用に染色した。
遺伝子発現分析
PicoPure RNA Isolation kit(Life Technologies)を使用して、製造者の推奨プロトコルを用い、RNAを抽出した。Nanodrop 2000 Spectrophotometer(Thermo Scientific)を使用して、全RNAを定量した。簡潔に説明すると、MessageAmp II aRNA Amplification Kit(Applied Biosystems/Ambion、Austin、TX)用の標準プロトコルを使用し、任意
選択の第2ラウンド増幅を利用して、およそ100ngの全RNAからビオチニル化aRNAを調製し、次いでMessageAmp II Biotin Enhanced Kit(Applied Biosystems/Ambion、Austin、TX)を使用して、ビオチン標識化aRNA内に転写した。Affymetrix推奨に従って、ビオチン標識化aRNAを精製及び断片化した。20μgの断片化aRNAを使用して、Human Genome U133−plus−2.0チップ(Affymetrix Inc.Santa Clara、CA)に45℃で16時間ハイブリダイズした。Affymetrix Fluidics Station 450でアレイを洗浄及び染色し、Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7Gを使用して走査した。生の発現データファイルは、Gene Expression Omnibus(GSE50868)上で利用可能である。Affymetrix Expression Consoleソフトウェアを使用して、初期分析設定を用いて画像データを分析した。対数スケールのロバストマルチアレイ分析(RMA、Affymetrix)によりアレイを正規化し、Spotfire for Genomics 4.5(Tibco Spotfire、Palo Alto、CA)で可視化した。Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID v6.7)を使用して、差別的に発現したプローブの生物学的経路濃縮分析を、遺伝子オントロジー(GO)データベース(GO生物学的プロセスに対する単一濃縮及びp値<0.01)に対して行った。ユークリッド距離測定による完全連結クラスタリング法を使用して、Log2発現レベルに基づいて試料間の遺伝子発現プロファイルを比較するために階層的クラスタ分析を行った(Spotfire for Genomics 4.5)。クラスタ分析用のプローブセットは、発現レベルにおける全体的差異(><2.5倍)または基底もしくは準安定を定義する標的化遺伝子リスト上の存在により選択した。X染色体遺伝子発現比較のために、RMA正規化Affymetrix遺伝子チップ強度を、2^[RMA log2強度]を考慮することにより一次式値に変換した。一次式比を、ナイーブ発現セットをプライミングした発現セットで除した値として計算した。X染色体にマッピングされた全てのプローブセットに対する発現比を、強調表示された2倍超または未満の濃縮比のプローブセットにより、Spotfire 4.5で可視化した。
PicoPure RNA Isolation kit(Life Technologies)を使用して、製造者の推奨プロトコルを用い、RNAを抽出した。Nanodrop 2000 Spectrophotometer(Thermo Scientific)を使用して、全RNAを定量した。簡潔に説明すると、MessageAmp II aRNA Amplification Kit(Applied Biosystems/Ambion、Austin、TX)用の標準プロトコルを使用し、任意
選択の第2ラウンド増幅を利用して、およそ100ngの全RNAからビオチニル化aRNAを調製し、次いでMessageAmp II Biotin Enhanced Kit(Applied Biosystems/Ambion、Austin、TX)を使用して、ビオチン標識化aRNA内に転写した。Affymetrix推奨に従って、ビオチン標識化aRNAを精製及び断片化した。20μgの断片化aRNAを使用して、Human Genome U133−plus−2.0チップ(Affymetrix Inc.Santa Clara、CA)に45℃で16時間ハイブリダイズした。Affymetrix Fluidics Station 450でアレイを洗浄及び染色し、Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7Gを使用して走査した。生の発現データファイルは、Gene Expression Omnibus(GSE50868)上で利用可能である。Affymetrix Expression Consoleソフトウェアを使用して、初期分析設定を用いて画像データを分析した。対数スケールのロバストマルチアレイ分析(RMA、Affymetrix)によりアレイを正規化し、Spotfire for Genomics 4.5(Tibco Spotfire、Palo Alto、CA)で可視化した。Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID v6.7)を使用して、差別的に発現したプローブの生物学的経路濃縮分析を、遺伝子オントロジー(GO)データベース(GO生物学的プロセスに対する単一濃縮及びp値<0.01)に対して行った。ユークリッド距離測定による完全連結クラスタリング法を使用して、Log2発現レベルに基づいて試料間の遺伝子発現プロファイルを比較するために階層的クラスタ分析を行った(Spotfire for Genomics 4.5)。クラスタ分析用のプローブセットは、発現レベルにおける全体的差異(><2.5倍)または基底もしくは準安定を定義する標的化遺伝子リスト上の存在により選択した。X染色体遺伝子発現比較のために、RMA正規化Affymetrix遺伝子チップ強度を、2^[RMA log2強度]を考慮することにより一次式値に変換した。一次式比を、ナイーブ発現セットをプライミングした発現セットで除した値として計算した。X染色体にマッピングされた全てのプローブセットに対する発現比を、強調表示された2倍超または未満の濃縮比のプローブセットにより、Spotfire 4.5で可視化した。
核型分析
WiCell Research Institute(Madison、WI)により、20から40のGバンド中期細胞に対して細胞遺伝学的分析が行われた。
WiCell Research Institute(Madison、WI)により、20から40のGバンド中期細胞に対して細胞遺伝学的分析が行われた。
奇形腫形成
200μLの溶液(100μLのFMM及び100μLのマトリゲル)当たり50万及び300万細胞の濃度の単一細胞解離hiPSCを、NOD/SCID/γヌルマウスに皮下注射した。5〜6週間後(300万細胞注射)及び7〜8週間後(50万細胞注射)、奇形腫をPBS中に採取し、4%パラホルムアルデヒド中で室温で一晩固定し、その後処理のために70%エタノール中で室温で維持した。切片化ならびにヘマトキシリン及びエオシン染色のために、試料をUCSD Histology Core Facilityに提出した。Nikon DS−Fi1カメラを装備したNikon Eclipse TS100顕微鏡を使用して、切片の検査、解釈、及び撮像を行った。
200μLの溶液(100μLのFMM及び100μLのマトリゲル)当たり50万及び300万細胞の濃度の単一細胞解離hiPSCを、NOD/SCID/γヌルマウスに皮下注射した。5〜6週間後(300万細胞注射)及び7〜8週間後(50万細胞注射)、奇形腫をPBS中に採取し、4%パラホルムアルデヒド中で室温で一晩固定し、その後処理のために70%エタノール中で室温で維持した。切片化ならびにヘマトキシリン及びエオシン染色のために、試料をUCSD Histology Core Facilityに提出した。Nikon DS−Fi1カメラを装備したNikon Eclipse TS100顕微鏡を使用して、切片の検査、解釈、及び撮像を行った。
統計分析:
標準偏差に関する統計評価にはスチューデントt検定を使用した。StepOne Software v2.2(Life Technologies)を使用して、qRTPCRデータに関するRQ最小及び最大値(エラーバー)を決定した。
標準偏差に関する統計評価にはスチューデントt検定を使用した。StepOne Software v2.2(Life Technologies)を使用して、qRTPCRデータに関するRQ最小及び最大値(エラーバー)を決定した。
一般に、以下の特許請求の範囲において、用語は、本明細書及び特許請求の範囲において開示される具体的実施形態に特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲の対象となる均等物の全範囲と共に、全ての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されない。
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- 本明細書に記載の発明。
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