WO2011158852A1 - 誘導型多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2011158852A1
WO2011158852A1 PCT/JP2011/063650 JP2011063650W WO2011158852A1 WO 2011158852 A1 WO2011158852 A1 WO 2011158852A1 JP 2011063650 W JP2011063650 W JP 2011063650W WO 2011158852 A1 WO2011158852 A1 WO 2011158852A1
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cell
cells
protein
reprogramming factor
pluripotent stem
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啓光 中内
真 大津
直也 高山
東赫 安
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国立大学法人東京大学
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    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing induced pluripotent stem cells, a kit used for the method, and an induced pluripotent stem cell obtained by the method.
  • iPS cells are also referred to as inducible pluripotent stem cells or induced pluripotent stem cells.
  • somatic cells such as fibroblasts, ES cells (Embryonic) stem cells) -like cells that have acquired pluripotency.
  • ES cells with differentiation pluripotency retain the ability to differentiate into all the organs and tissues that make up the living body, and are expected to be an extremely effective means for regenerating organs damaged by some disease. Yes.
  • ES cells are obtained from embryos that are the origin of life, and thus face ethical problems in their use. become.
  • tissues prepared from ES cells may cause rejection at the stage of transplantation, and it is necessary to overcome such immunological problems.
  • iPS cells are highly expected as differentiated pluripotent cells that can solve ethical problems and immunological problems that can occur when ES cells are used.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 2
  • Non-patent Documents 3 and 4 the establishment of mouse iPS cells by the same method has been reported.
  • iPS cells can be established with only three genes other than the c-Myc gene (Oct3 / 4, Sox2, Klf4).
  • a factor (Oct3 / 4, Sox2, etc., hereinafter also referred to as a cell reprogramming factor) that imparts pluripotency to a somatic cell
  • a gene introduction method using a retroviral vector or the like is used. It has been pointed out that cell reprogramming factors are randomly inserted into the genome of somatic cells, and as a result, mutations caused by gene insertion (particularly activation of endogenous oncogenes, etc.) have been pointed out.
  • the c-Myc gene which is an oncogene, is introduced, the canceration of the produced iPS cells has been confirmed with a significantly high probability.
  • Non-patent Document 5 Non-patent Document 6
  • the establishment (creation) efficiency is extremely low. It is thought that it will be difficult to use for clinical application in the future.
  • Non-patent Document 10 a method has been reported in which an adenovirus vector is used to produce iPS cells by transiently producing a large amount of cell reprogramming factor in somatic cells.
  • iPS cells produced by this method are injected into mouse blastocysts, differentiated cells derived from injected iPS cells are confirmed in the tissues of the born mice, and at least 4 to 12 weeks old mice No canceration was observed in.
  • this method there is a possibility that the problem of canceration of iPS cells associated with gene transfer of a cell reprogramming factor may be solved.
  • the method of producing iPS cells by introducing a cell reprogramming factor as a gene requires many complicated steps, and a long time is required for screening and the like, and thus a problem of efficiency has been pointed out.
  • the protein itself in addition to introducing the gene and expressing it in the target cell, the protein itself can be directly introduced into the cell.
  • Many methods have been reported so far for directly introducing a protein itself into a cell.
  • a fusion protein with a protein transduction domain also referred to as PTD, membrane-permeable peptide, or cell-membrane-permeable peptide
  • PTD protein transduction domain
  • Many methods are used that are introduced into cells by contacting them (for example, Patent Documents 1 to 9).
  • cell reprogramming factors are introduced into somatic cells as proteins.
  • Oct4 protein and Sox2 protein are introduced, Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc protein and arginine.
  • Patent Documents 10 to 13 Non-patent Documents 10 to 13
  • these methods require the production of proteins using Escherichia coli, etc., and the subsequent extraction, purification and use of each protein, which is costly and time consuming, and iPS cell establishment efficiency is low.
  • iPS cell establishment efficiency is low.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and a cell reprogramming factor is easily and efficiently induced without being inserted into the genome of an induced pluripotent stem cell (iPS cell).
  • An object is to provide a method capable of producing type pluripotent stem cells.
  • the present inventors have introduced DNA encoding a fusion protein comprising an extracellular secretion signal, a protease recognition sequence, a protein transduction domain, and a cell reprogramming factor.
  • the cell reprogramming factor is introduced into the genome of the induced pluripotent stem cell by preparing a cell and allowing the fusion protein secreted from the cell to act on the target cell for inducing the induced pluripotent stem cell. It has been found that inducible pluripotent stem cells can be produced simply and efficiently without being inserted, and the present invention has been completed (see FIG. 1). More specifically, the present invention provides the following inventions.
  • a method for producing induced pluripotent stem cells (A) a step of preparing a cell into which DNA encoding a fusion protein containing an extracellular secretion signal, a protease recognition sequence, a protein transduction domain and a cell reprogramming factor is introduced, and (b) induction into an induced pluripotent stem cell. Or the cells prepared in step (a) or the cells prepared in step (a) against cells for inducing into induced pluripotent stem cells Contacting the supernatant; Including methods.
  • Cell reprogramming factors are Oct3 / 4, c-Myc, Sox2, Klf4, Klf5, LIN28, Nanog, ECAT1, ESG1, Fbx15, Eras, ECAT7, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, ECAT15-2
  • cell reprogramming factor is at least one protein selected from the group consisting of the proteins described in SEQ ID NOs: 1 to 5.
  • the protein introduction domain is at least one protein selected from the group consisting of the proteins described in SEQ ID NOs: 6 to 7.
  • kits for use in the method according to any one of (1) to (8) comprising at least one of the following (a) to (c): (a) an extracellular secretion signal, a protease recognition sequence A vector capable of expressing DNA encoding a fusion protein comprising a protein transduction domain and a cell reprogramming factor (b) encoding a fusion protein comprising an extracellular secretion signal, a protease recognition sequence, a protein transduction domain and a cell reprogramming factor Culture supernatant of cells of cells (c) and (b) that retain DNA in an expressible manner.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a transducible recombinant protein secretion system.
  • FIG. The structure of an expression cassette for stable gene transfer used for preparing feeder cell lines is shown in the upper part of the figure.
  • the mouse immunoglobulin (Ig) k chain leader sequence (Igk Leader) is used in the process of secreting the recombinant protein from the feeder cells (indicated by “1” in the figure). Indicates.
  • this leader sequence is cleaved from the early protein product at the downstream 4 peptide sequence (RARR) in the secretion process, resulting in a protein transduction domain (PTD) and one protein of the cell reprogramming factor.
  • RARR downstream 4 peptide sequence
  • furin is an enzyme that is abundant in the Golgi apparatus and specifically cleaves various proteins at the target sequence.
  • Furin is a member of the proprotein convertase family known to process potential precursor proteins into their biologically active products, recognizes downstream of the target sequence, and cleaves rapidly. It is the schematic which shows this. It is the schematic which shows the problem resulting from furin in a secretory type recombinant protein introduction system.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing TAT sequences and iPS-4 (5) -factor variants used to compensate for defects in the secretory recombinant protein introduction system.
  • FIG. 1 shows a schematic of a construct for a recombinant protein secretion system designed to avoid cleavage by furin, as well as feeder cells into which they have been introduced. That is, in order to correspond to the generation of inducible pluripotent stem (iPS) cells (iPSC), by transfecting the SNL parent cell with a construct corresponding to each recombinant protein, and selecting in the presence of zeocin, Feeder cells capable of secreting transducible cell reprogramming factors were made.
  • iPS inducible pluripotent stem
  • Kubira Orange is a schematic diagram showing that it was used as a marker protein for establishing and optimizing a protein secretion system.
  • SP indicates a secreted form of protein (secreted form of protein).
  • It is a microscope picture which shows the result verified about the transduction property of the secretory type recombinant protein by the modified SNL cell line by furin resistant PTD. That is, a fluorescence micrograph showing the results of verifying the transduction properties of TAT4 fusion protein, TATk fusion protein (furin resistant PTD) and nonaarginine (R9) fusion protein using combavira orange (KO) as a fusion partner. Shown in the upper three panels in the figure.
  • FIG. 6 is a dot plot diagram showing the results of flow cytometry analysis of transduction efficiency of TAT4-KO recombinant protein and TATk-KO recombinant protein secreted from a modified SNL cell line.
  • “Jurkat” indicates the result of co-culture of SNL parent cells and Jurkat cells
  • “SP-TAT4-huKO” indicates the co-culture of SNL cells secreting TAT4-KO recombinant protein and Jurkat cells.
  • SP-TATk-huKO shows the results of co-culture of SNL cells secreting TATk-KO recombinant protein and Jurkat cells. It is a photograph which shows the result of having detected the TAT4 fusion cell reprogramming factor and the TATk fusion cell reprogramming factor in the culture medium containing a modified SNL cell line by Western blotting. It is a photograph which shows the result of having detected the recombinant protein secreted from the modified SNL cell line by Western blotting.
  • TAT4- indicates a recombinant protein in which the TAT4 sequence is fused to each cell reprogramming factor
  • (TAT4-) does not fuse the TAT4 sequence to each cell reprogramming factor.
  • DMEM (FBS ⁇ ) shows a result of analyzing a medium in which cells are not cultured
  • DMEM (FBS ⁇ ) + SNLs shows a result of analyzing a culture medium of SNL parent cells.
  • results of testing the functionality of secreted transducible TAT4-hOCT4 or TATk-hOCT4 protein in iPSC production using human dermal fibroblasts (HDF) into which hc-MYC, hSOX2 and hKLF4 have been introduced by retrovirus FIG.
  • the upper 4 panels are photomicrographs showing the morphological changes of the cells
  • the lower 2 panels are photomicrographs showing the results of alkaline phosphatase (AP) staining.
  • AP alkaline phosphatase
  • “Retro-4 Factors” shows the results of HDF in which four factors (hc-MYC, hSOX2, hOCT4 and hKLF4) were introduced by retrovirus, and “Retro-M, S, K” shows hc-MYC, hSOX2 and hKLF4. Shows the results of HDF introduced by retrovirus. Furthermore, “SP-TAT4-hOCT4” shows the result of culturing HDF into which hc-MYC, hSOX2 and hKLF4 were introduced by retrovirus on an SNL cell line secreting TAT4-hOCT4.
  • SP-TATk-hOCT4 Shows the results of culturing HDF introduced with hc-MYC, hSOX2 and hKLF4 by retrovirus on an SNL cell line secreting TATk-hOCT4. It is the schematic which shows the scheme for mouse
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing the results of evaluating the characteristics of mouse iPS cells (SP4-miPSWT # 1-10) prepared using an SNL cell line that secretes a transducible cell reprogramming factor (wild type).
  • Phase Contrast indicates the result of observation with a phase contrast microscope
  • AP Staining indicates the result of AP staining
  • SSEA-1 Staining indicates the result of SSEA-1 staining.
  • the left side shows the result observed at 40 times magnification and the right side at 100 times magnification.
  • the left shows the result of observation in a bright field at a magnification of 200 times
  • the right shows the result of fluorescence observation (observation magnification: 200 times).
  • the middle two panels (“pOCT4-EGFP (10 ⁇ )”) are photomicrographs showing mouse iPS cells prepared from mouse MEFs incorporating a transgene in which EGFP is linked to the mouse Oct4 promoter, and the right panel is The observation result by the fluorescence microscope is shown, and the left panel shows the result of superimposing the observation result in the bright field and the observation result by the fluorescence microscope.
  • the left panel shows the results of observation of SSEA-1-stained mouse iPS cells with a fluorescence microscope
  • the middle panel shows the results of observation of an EGFP signal indicating activation of the OCT4 promoter with a fluorescence microscope.
  • Panel shows the observation result of mouse iPS cells in bright field.
  • FIG. 7 shows the results of analysis of miPSC production efficiency under various conditions using an SNL cell line secreting transducible cell reprogramming factor (modified SNL cell line) by array scan on a Post4-EGFP (+) colony
  • SNL cell line secreting transducible cell reprogramming factor modified SNL cell line
  • Post4-EGFP (+) colony It is a graph. It is the schematic which shows the scheme for human iPS cell preparation using the SNL cell line which secretes the cell reprogramming factor (wild type) which can be transduced. It is a microscope picture which shows the result of having evaluated the characteristic of the human iPS cell (SP4-hiPSWT cell) produced using the SNL cell strain which secretes the cell reprogramming factor (wild type) which can be transduced.
  • the top two panels are photomicrographs showing the observation results in the bright field of the colonies of the prepared human iPS cells.
  • the second two panels from the top are micrographs showing the results of AP staining of the prepared human iPS cells.
  • the left shows the results of observation at 40 times magnification and the right at 100 times magnification.
  • Each of the third to fifth panels from the top is a micrograph (observation magnification: 100 times) showing the results of SSEA-4 staining, TRA-1-60 staining, and TRA-1-81 staining of each prepared human iPS cell.
  • the right panel shows each observation result in the bright field of the prepared human iPS cells
  • the middle panel shows each observation result of the prepared human iPS cells by a fluorescence microscope
  • the left panel shows the right panel.
  • the result of superimposing the middle panel and the middle panel is shown. It is the schematic which shows the scheme for human iPS cell preparation using the SNL cell line which secretes the cell reprogramming factor (mutant which shows furin resistance) which can be transduced.
  • SP-SNL (mut) that secretes a transducible cell reprogramming factor (a mutant that exhibits furin resistance)
  • colonies of human iPS cells SP-hiPSmut cells
  • HDF high-density human iPS cells
  • the top left panel shows the results of AP staining of the prepared human iPS cells (derived from SP-hiPSmut cells)
  • the top middle panel (EB (day6) -SP-hiPSWT) is The results of observing the embryoid bodies derived from SP-hiPSWT cells are shown
  • the upper right panel (EB (day6) -SP-hiPSmut) shows the results of observing the embryoid bodies derived from SP-hiPSmut cells.
  • the second 6 panels from the top are the SPES-hiPSmut cell-derived iPS cells from the left side, respectively, fluorescence staining images of SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, OCT4, NANOG and SSEA-1.
  • FIG. 3 is an electrophoresis photograph showing the results of analyzing the expression level of a human ES cell marker gene in SP-hiPSWT cells and SP-hiPSmut cells by semi-quantitative RT-PCR.
  • KhES-3 indicates the result of ES cell analysis (positive control)
  • HDF (neonate) indicates the HDF derived from human neonatal tissue that is the basis of SP-hiPSWT cells and SP-hiPSmut cells.
  • the analysis results are shown.
  • the expression of GAPDH gene was analyzed as an internal standard. It is a microscope picture which shows the result of having analyzed the karyotype of SP-hiPSWT cell and SP-hiPSmut cell by standard G band chromosomal examination.
  • the upper left panel shows the observation results of colony of iPS cells derived from human umbilical cord blood CD34 + progenitor cells
  • the upper right panel shows the results of AP staining
  • the lower left panel shows the results of SSEA-4 staining and DAPI staining
  • the lower middle panel shows the results of overlaying SSEA-4 staining and DAPI staining
  • the lower right panel “Contrast” indicates the observation result by a phase contrast microscope.
  • the method for producing the induced pluripotent stem cell of the present invention comprises: (A) a step of preparing a cell into which DNA encoding a fusion protein containing an extracellular secretion signal, a protease recognition sequence, a protein transduction domain and a cell reprogramming factor is introduced, and (b) induction into an induced pluripotent stem cell. Or the cells prepared in step (a) or the cells prepared in step (a) against cells for inducing into induced pluripotent stem cells Contacting the supernatant; It is the method characterized by including.
  • step (a) in the method for producing induced pluripotent stem cells of the present invention will be described.
  • an “inducible pluripotent stem cell” is a cell also called an iPS cell or an induced pluripotent stem cell.
  • an ES cell Embronic stem cells.
  • the “cell reprogramming factor” used in the present invention when introduced into a somatic cell, imparts pluripotency to the somatic cell alone or in cooperation with other pluripotent factors. It can be any factor that can be used, and is not particularly limited. However, Oct3 / 4, c-Myc, Sox2, Klf4, Klf5, LIN28, Nanog, ECAT1, ESG1, Fbx15, Eras, ECAT7, ECAT8, Gdf3, Sox15, It is preferably at least one protein selected from the group consisting of ECAT15-1, ECAT15-2, Fthl17, Sal14, Rex1, Utf1, Tcl1, Stella, ⁇ -catenin, Stat3 and Grb2. A typical example of such a protein is a protein encoded by a gene identified by a GenBank accession number shown in Table 1.
  • Oct3 / 4, c-Myc, Sox2 and Klf4 are described below as inducible pluripotent stem cells from the viewpoint that efficient induction pluripotent stem cells can be established with few factors. More preferably, it is introduced into a cell for inducing into the cell (hereinafter also referred to as “target cell”). Further, from the viewpoint of reducing the risk of canceration of the resulting induced pluripotent stem cells, it is more preferable to introduce Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 (3 factors) excluding c-Myc into somatic cells.
  • the present invention can be achieved using homologs of the above-described cell reprogramming factors present in human and non-human animal cells (eg, mouse, rat, cow, horse, pig, sheep, monkey, dog, cat, bird, etc.).
  • a homolog has 70% or more (preferably 80% or more, for example, 85% or more, 90% or more, 95% or more) of homology with the amino acid sequence of the cell reprogramming factor described above. Sequence homology can be determined using the BLASTX (amino acid level) program (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990).
  • the pluripotent factor used in the present invention does not necessarily need to be a wild type, and confers pluripotency to the somatic cell alone or in cooperation with other pluripotent factors. It may be a mutant protein as long as it has the ability to do so.
  • the number of amino acids to be inserted, substituted or deleted in such a mutant protein is usually 1 to 30, preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 5.
  • Such a mutant can be prepared using a method similar to “Method for preparing cell reprogramming factor in which furin recognition sequence is eliminated” described later.
  • the “cell reprogramming factor” used in the present invention is preferably one in which the furin recognition sequence has been lost or the furin recognition sequence does not exist, and the group consisting of the proteins described in SEQ ID NOs: 1 to 5 More preferably, the protein is at least one protein selected from the group consisting of:
  • Furin is a protease also called PACE (Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme), and is known to be abundant in the Golgi apparatus in the cell. Furin is also known to cleave immediately after a specific sequence (furin recognition sequence) in the target protein, and such specific sequence is “RXRR” or “RXKR” (see FIG. 2). Therefore, it is preferable that the cell reprogramming factor used in the present invention is one in which such a sequence has been lost or does not exist. In the recognition sequence, “R” represents arginine, “K” represents lysine, and “X” represents any amino acid.
  • PACE Panaired basic Amino acid Cleaving Enzyme
  • a known method can be used as a method for preparing a cell reprogramming factor in which such a furin recognition sequence is eliminated.
  • a known method can be used.
  • the Gapped duplex method, the Coupled primary cyclic selection method, the Kunkel method, phosphoroate (Eckstein) method, or a method based on these methods can be mentioned.
  • a mutagenesis kit using site-directed mutagenesis for example, Mutan-K ( TAKARA) or Mutan-G (TAKARA)
  • TAKARA LA PCR TAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis series kits, the cells encoded by the gene identified by the above GenBank Accession Number.
  • Create a cell reprogramming factor that eliminates the furin recognition sequence by introducing mutations into the furin recognition sequence of the reprogramming factor (wild type) can do.
  • extracellular secretion signal used in the present invention may be an amino acid sequence capable of secreting the fusion protein described later to the outside of the cell, and may be used for the characteristics of the fusion protein, the cells expressing the fusion protein, etc.
  • a known amino terminal signal peptide sequence is appropriately selected.
  • antibody molecules, receptors and extracellular matrix molecules, cytokines, hormones, growth and differentiation factors, neuropeptides, vasomediators, phosphokinases, phosphatases, phospholipases, phosphodiesterases, G proteins, Ras related Examples include signal sequences contained in proteins, ion channels, transporters / pumps, proteases, or transcription factors.
  • a preferred signal peptide includes, for example, an Ig ⁇ chain VJ2-C signal peptide which is an amino terminal signal peptide sequence contained in an antibody molecule.
  • the sequence can be appropriately selected from sequences recognized by known site-specific endoproteases. Examples thereof include sequences recognized by furin, thrombin, enterokinase, and factor Xa.
  • a preferable protease recognition sequence includes, for example, a furin recognition sequence.
  • the “protein transduction domain” used in the present invention is a cell (hereinafter also referred to as “target cell”) for inducing a fusion protein described later cleaved by the protease recognition into an inducible pluripotent stem cell.
  • target cell a cell for inducing a fusion protein described later cleaved by the protease recognition into an inducible pluripotent stem cell.
  • a peptide sequence having the ability to be introduced into For example, VP22, Kaposi FGF, TAT, Drosophila Antitinapedia, Penetratin, M918, Transportan-10, Poly-Arginine, and derivatives of these peptides.
  • a preferred protein transduction domain is, for example, TAT.
  • the “protein transduction domain” used in the present invention is preferably one in which the furin recognition sequence has been lost or the furin recognition sequence does not exist, and is more preferably the protein described in SEQ ID NO: 6 or 7. preferable.
  • Such a “protein transduction domain” can be appropriately prepared by the above-described method of introducing a mutation into the furin recognition sequence.
  • the “fusion protein” used in the present invention is a fusion protein comprising the “extracellular secretion signal”, the “protease recognition sequence”, the “protein transduction domain”, and the “cell reprogramming factor”.
  • a fusion protein comprising, in order, from the N-terminal side, an “extracellular secretion signal”, the “protease recognition sequence”, the “protein transduction domain”, and the “cell reprogramming factor”; “, A fusion protein comprising the“ cell reprogramming factor ”and the“ protein transduction domain ”in this order from the N-terminal side.
  • the “fusion protein” used in the present invention may further contain a functional peptide or protein.
  • functional peptides or proteins include intracellular localization signal peptides such as nuclear translocation signal peptides, epitopic tags such as fluorescent proteins and FLAG peptides, and drug resistance factors.
  • the number and type of amino acids between each peptide in the “extracellular secretion signal”, the “protease recognition sequence”, the “cell reprogramming factor”, the “protein transduction domain” and the like inhibit the function of the fusion protein. Unless otherwise specified, there is no particular limitation.
  • Examples of the “cell” into which DNA encoding the fusion protein used in the present invention is introduced include, for example, pluripotency of pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells.
  • Feeder cells for example, mouse embryonic fibroblasts (MEF), STO cells, SNL cells, CHO / CHO-K1 cells (derived as a subclone from the parent CHO cell line initiated) from a biopsy of an ovary of an adult Chinese hamster, Saos-2 cells (human bone osteosarcoma), H357 cells (human head and n) ck squamous cell carcinoma cell line), 293T cells (HEK293T: human kidney) include, but are not limited thereto.
  • feeder cells are preferable from the viewpoint that secretion of substances to be maintained as stem cells is possible, and further, from the viewpoint that LIF (Leukemia Inhibitory Factor, leukocyte migration inhibitory factor) can also be secreted.
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor, leukocyte migration inhibitory factor
  • SNL cells are more preferred.
  • these cells are preferably used after being subjected to irradiation or antibiotic treatment (for example, mitomycin C treatment).
  • the “cell reprogramming factor” of the target cell is inhibited while inhibiting the uptake of the “cell reprogramming factor” into the cell and suppressing the reprogramming of the cell.
  • the cell recognizes the receptor that recognizes the “protein transduction domain” (for example, heparin for TAT).
  • Cells inactivated with a receptor recognizing such “protein transduction domain” are appropriately known in the art, for example, production of an animal knocking out or knocking in the receptor recognizing the “protein transduction domain” and cultured cells from the animal.
  • preparation of siRNA for a receptor recognizing the “protein transduction domain” and introduction into a cell, etc. can be selected as appropriate.
  • a vector holding the DNA encoding the fusion protein so that it can be expressed may be introduced into the secretory cell.
  • the “vector” used is not particularly limited as long as it can be introduced into the cell for secretion and the fusion protein can be expressed in the cell.
  • plasmid DNA, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, retrovirus vector, lentivirus vector, herpes virus vector, Sendai virus vector, or the like can be used.
  • the plasmid DNA or the like preferably has a sequence of a selection marker such as a promoter, an enhancer, a terminator, a poly A signal, and a drug resistance gene in order to express a gene encoding the fusion protein. .
  • a known gene introduction method can be appropriately employed.
  • a method for introducing the plasmid DNA a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a lipofection method, an electroporation method, or a microinjection method can be employed.
  • a method for introducing the viral vector for example, a culture supernatant containing virus particles obtained by introducing the viral vector into a packaging cell by a method of introducing plasmid DNA such as a calcium phosphate method is used.
  • a method of contacting a reprogramming factor-secreting cell can be used. Expression of the fusion protein in the secretory cell prepared by such a method may be either transient or constant.
  • step (b) in the method for producing induced pluripotent stem cells of the present invention in order to introduce the fusion protein secreted from the cell prepared in the step (a) into a cell for inducing into an induced pluripotent stem cell, the induced pluripotency
  • the cell for inducing into a sex stem cell and the cell prepared in the step (a) are co-cultured or the cell for inducing into the induced pluripotent stem cell in the step (a)
  • the “cell for inducing into induced pluripotent stem cells” (target cell) used in the present invention is not particularly limited as long as it is an animal-derived somatic cell.
  • human and non-human animal cells mae
  • somatic cell eg, fibroblast, epithelial cell, blood cell, any cell derived from animal specimen
  • the method of “co-culture” used in the present invention is not particularly limited.
  • a cell culture container examples thereof include a method of seeding and culturing target cells thereon, and a method of simultaneously seeding and culturing the cells prepared in (a) and target cells in a cell culture container.
  • the conditions for such co-culture are not particularly limited, and known conditions suitable for each cell can be used.
  • the method of “contacting the culture supernatant” used in the present invention is not particularly limited.
  • the culture supernatant in the culture of the cell prepared in step (a) is directly added to the target cell.
  • a method in which the culture supernatant of the cell prepared in step (a) is once refrigerated or frozen and then returned to a temperature suitable for cell culture (for example, 37 ° C.) and then added to the target cell.
  • the basal medium of the medium used for preparing such “culture supernatant” is not particularly limited as long as it can produce and maintain inducible pluripotent stem cells by the method of the present invention.
  • additives include serum, serum substitute additives (for example, Knockout Serum Replacement (KSR) (manufactured by Invitrogen)), growth factors, LIF, iron such as transferrin, polyamines, minerals, saccharides (for example, glucose, etc.) ), Amino acids such as organic acids, serum proteins, L-glutamine, reducing agents, vitamins, steroids, buffers (eg, HEPES), and nutritional additives.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • the method for producing induced pluripotent stem cells of the present invention may be used in combination with an existing method (for example, a method for introducing a cell reprogramming factor using a retrovirus).
  • an existing method for example, a method for introducing a cell reprogramming factor using a retrovirus.
  • a DNA encoding c-Myc, Sox2 and Klf4 is introduced into a target cell by a retrovirus, and then Oct3 / 4 is introduced as a protein by the method of the present invention. It is also possible to establish competent stem cells.
  • the preferred embodiment of the method for producing induced pluripotent stem cells of the present invention has been described above.
  • a method for confirming whether induced pluripotent stem cells can be established by such a production method a known method is appropriately used. Can be adopted. For example, it is obtained by a method for analyzing the expression or methylation state of an ES cell marker (eg, SSEA-1, SSEA-4, Nanog, Oct3 / 4), an alkaline phosphatase staining method, or the production method of the present invention.
  • an ES cell marker eg, SSEA-1, SSEA-4, Nanog, Oct3 / 4
  • an alkaline phosphatase staining method eg, an alkaline phosphatase staining method
  • a method of transferring teratoma cells to immunodeficient mice such as nude mice (or immunotolerant mice) and analyzing teratoma-forming ability.
  • the production method of the present invention can be used even when an induced pluripotent stem cell is established using Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 (three factors) without using c-Myc. Compared with the method for producing induced pluripotent stem cells by retroviruses, the establishment efficiency is inferior. Therefore, the production method of the present invention is excellent in that iPS cells having high safety (low risk of canceration) can be obtained while exhibiting high establishment efficiency.
  • the production method of the present invention is a known method for introducing a cell reprogramming factor into a somatic cell as a protein (Non-patent Documents 10 to 13, Patent Document 10). Compared with -14), the period until the establishment of induced pluripotent stem cells is short. Therefore, the production method of the present invention is superior to the known method of introducing a cell reprogramming factor as a protein in that it does not require labor, time and cost.
  • the kit of the present invention is a kit used in the above-described method for producing induced pluripotent stem cells of the present invention, and includes at least one of the following (a) to (c).
  • Vector “cell (secretory cell)” and “culture supernatant”
  • reagents for introducing "vector” into cells and confirming whether induced pluripotent stem cells could be established by this kit Reagents (primer set for amplifying ES cell marker gene, antibody recognizing ES cell marker protein, alkaline Phosphatase staining reagent, etc.).
  • the induced pluripotent stem cell of the present invention is a cell produced by the aforementioned method for producing an induced pluripotent stem cell of the present invention, and the cell reprogramming factor is not inserted exogenously into the genome. It is a featured inducible pluripotent stem cell. Inducible pluripotent stem cells produced by the production method of the present invention are targeted to other cell reprogramming factors other than c-Myc by the method of the present invention from the viewpoint of low risk of canceration and high safety. Inducible pluripotent stem cells obtained by introduction by cells are preferred.
  • HDF Human dermal fibroblasts
  • a human inducible pluripotent stem cell (hiPSC) clone established by the method of the present invention described later is prepared by using human embryonic stem cell (hESC) medium on irradiated mouse embryonic fibroblasts (MEF) or SNL cells. Used and maintained.
  • hESC human embryonic stem cell
  • MEF mouse embryonic fibroblasts
  • the hESC medium consists of 20% knockout serum replacement additive (KSR), 0.1 mM 6-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids (all of which are manufactured by Invitrogen) and 5 ng / ml human basic. It consists of Dulbecco's modified Eagle medium / nutrient mixture F-12 Ham (DMEM-F12, SIGMA) supplemented with fibroblast growth factor (bFGF, manufactured by Wako).
  • KSR knockout serum replacement additive
  • 0.1 mM 6-mercaptoethanol 2 mM L-glutamine
  • 0.1 mM non-essential amino acids all of which are manufactured by Invitrogen
  • 5 ng / ml human basic 5 ng / ml human basic. It consists of Dulbecco's modified Eagle medium / nutrient mixture F-12 Ham (DMEM-F12, SIGMA) supplemented with fibroblast growth factor (bFGF, manufactured
  • HiPSC and hESC were subcultured using PBS containing 20% KSR, 0.25% trypsin and 1 mM CaCl 2 .
  • MEF was established from isolated C57BL / 6 and ICR mouse fetuses (gestation day 12.5).
  • MEFs containing EGFP genes whose expression is controlled by the Oct4 promoter were obtained from transgenic C57BL / 6 and ICR mouse embryos.
  • MEF and SNL cells were cultured under the same conditions as MEF. That is, MEF and SNL cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • mouse inducible pluripotent stem cell (miPSC) clone was maintained on MMC-treated MEF or SNL cells using mouse embryonic stem cell (mESC) medium.
  • the mESC medium was 15% KSR, 0.1 mM 6-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid, 20 mM HEPES (manufactured by Invitroge), 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 10 3 U / ml LIF (ESGRO (registered trademark), manufactured by Millipore).
  • miPSCs were subcultured as a single cell suspension using 0.25% trypsin / EDTA (GIBCO).
  • All these cells (HDF, SNL, iPSC and ESC) were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • ⁇ Transduction with retrovirus> First, a retroviral vector was constructed so that each cell reprogramming factor could be expressed using a GCsam bicistronic backbone vector. Each retroviral vector was then introduced into packaging cells to prepare a viral supernatant.
  • a cell reprogramming factor was transduced into MEF containing an EGFP gene whose expression was controlled by the Oct4 promoter using the virus supernatant in the presence of 20 ⁇ g / ml protamine.
  • the virus-infected MEF was then cultured in fresh medium (DMEM containing 10% FBS and 1% PSG (penicillin, streptomycin and L-glutamine)) with daily medium changes.
  • DMEM containing 10% FBS and 1% PSG (penicillin, streptomycin and L-glutamine)
  • the culture medium was replaced with mESC medium, and the virus-infected MEF was re-plated on MMC-treated MEFs. From the next day, the medium was continuously changed every other day until an EGFP + (expression) colony was observed.
  • a cell reprogramming factor was transduced into HDF using the virus supernatant in the presence of 20 ⁇ g / ml protamine.
  • HDF cells were reseeded in irradiated MEFs.
  • the culture medium was replaced with hESC medium and continued to be replenished with fresh medium every other day until human iPSC colonies were observed.
  • Example 1 ⁇ Production of SNL cells that secrete transducible cell reprogramming factors> An IgK leader sequence is selected as an extracellular secretion signal, a furin recognition sequence (RARR) is selected as a protease recognition sequence, a TAT sequence (wild type) is selected as a protein transduction domain, and these functional peptide sequences, cell reprogramming factors and the like are included.
  • Cells into which DNA encoding a fusion protein (such as a transducible cell reprogramming factor) was introduced were prepared by the following method.
  • the cell reprogramming factors hc-MYC, hSOX2 and hKLF4, and the wild-type amino acid sequence of the TAT sequence have a furin recognition site, so these polypeptides are secreted from feeder cells. It is expected to be cut off during the process. Therefore, in order to avoid this digestion by furin and enhance the efficiency of the transducible recombinant protein secretion system, amino acid variants showing furin resistance of hc-MYC, hSOX2, hKLF4 and TAT sequences were also prepared (FIG. 4 and 5).
  • a pTAT-HA vector series including DNAs encoding fusion proteins in which various proteins and TAT sequences (wild type) were fused was constructed. That is, a fusion protein in which c-MYC, c-MYC, R367K, R424Q, OCT4, SOX2, SOX2, R43Q, R114Q, KLF5, or wedge orange (Kusterrorism Orange) is fused to the TAT sequence can be expressed in animal cells.
  • a vector series was constructed.
  • the pTAT-HA vector is Dr. The one provided by Steven F Dowdy was used.
  • the DNA sequence encoding the TAT sequence (wild type) in the pTAT-HA vector was replaced with a DNA sequence corresponding to the TAT4 sequence or the TATk sequence.
  • a cassette encoding a sequence corresponding to the TAT4-HA-fusion partner or the TATk-HA-fusion partner is constructed using the pSecTag2B vector. Cloned into.
  • the pSecTag2B vector is a vector developed by Invitrogen, particularly for the secretion of recombinant proteins.
  • cDNA of each cell reprogramming factor was prepared by PCR amplification and directly cloned into pSecTag2B.
  • SNL cells SNL parent cells
  • SNL cell line (hereinafter also referred to as “modified SNL cells”) was established.
  • each modified SNL cell was treated with MMC and prepared as feeder cells. And according to the combination of the cell reprogramming factor introduce
  • CM conducted medium
  • DMEM fetal calf serum
  • CM was prepared using mESC medium instead of DMEM, and freshly collected CM (fresh mESC medium was given to the mixture of modified SNL feeder cells and the medium was kept for one day) Cell cultures were maintained daily with or without replacement.
  • a cell reprogramming factor wild type
  • a cell fraction expressing E-cadherin and SSEA-1 is sorted in order to produce mouse iPSC.
  • the cells were reseeded on the MMC-treated MEF feeder cells with mESC medium (see FIG. 11).
  • the number of EGFP + colonies was calculated using an array scan VT1 high content screening (HCS) leader (ArrayScan VTI High Content Screening (HCS) Reader, Cellomics). The selected colonies were picked up and reseeded onto MMC-treated MEF feeder cells with standard mESC medium (see FIG. 13).
  • HCS high content screening
  • HCS ArrayScan VTI High Content Screening
  • Example 3 ⁇ Preparation of human iPS cells from HDF>
  • the method was the same as that described in ⁇ Preparation of mouse iPS cells> except that HDF was used as a cell source and hESC medium was used instead of mESC medium.
  • Transduced HDFs were supplemented daily with new CM.
  • the cell fraction expressing SSEA-4 is then sorted and re-seeded onto the irradiated MEF feeder cells with standard hESC medium supplemented with 10 ⁇ M ROCK inhibitor (Y27632, Wako), and hiPSC colonies Continued daily replacement with fresh hESC medium until observed.
  • the process up to transducing a cell reprogramming factor (wild type) into HDF and obtaining hiPSC (SP-hiPSWT cells) is shown in FIG. 16, where the cell reprogramming factor (mutant) is transduced into HDF, and hiPSC
  • the process up to obtaining (SP-hiPSmut cells) is shown in FIG.
  • Example 4 Preparation of human iPS cells from human cord blood CD34 + progenitor cells> Further, in order to prepare hiPSC using human umbilical cord blood CD34 + progenitor cells instead of HDF as a cell source, 50 ng / ml human stem cell factor (SCF, manufactured by R & D Systems), human thrombopoietin (TPO, R & D Systems) And a human FMS-like tyrosine kinase 3 ligand (FLT3-L, manufactured by PeproTech) using a suitable medium and culturing human umbilical cord blood CD34 + progenitor cells for 5 days in CM prepared as described above. And processed.
  • SCF human stem cell factor
  • TPO human thrombopoietin
  • FLT3-L human FMS-like tyrosine kinase 3 ligand
  • the cells were re-plated onto the mixture of modified SNL feeder cells together with the same CM, and from the next day, prepared in the same manner as described above using hESC medium supplemented with a cocktail of 50 ng / ml SCF, human TPO and human FLT3-L. Cultured in the CM.
  • cells expressing SSEA-4 were sorted and cultured in a hESC medium supplemented with 10 ⁇ M ROCK inhibitor. In addition, after the hiPS colonies were observed, the cells were cultured only in hESC medium.
  • the characteristics of the cells thus prepared were evaluated as follows.
  • TAT4 TAT4-KO
  • TATk TATk-KO
  • R9-KO nonaarginine fused with wedge orange (KO) in order to evaluate the transduction of secretory recombinant protein by the protein transduction domain
  • a vector derived from pSecTag2B encoding the gene was introduced into SNL cells.
  • Nonaarginine (R9) is known to be degraded by furin.
  • the recombinant protein secreted from each SNL cell is efficiently transduced into a cell (Jurkat cell) different from each SNL cell, and similarly to the result shown in FIG.
  • the TAT4 and TATk shown have been demonstrated to have high transduction properties even for target cells.
  • c-MYC Antibodies to c-MYC: manufactured by Cell Signaling, code number 5605 or Santa Cruz, catalog number sc-764
  • OCT4 antibodies to OCT4: manufactured by Cell Signaling, code number 2840
  • SOX2 SOX2 Antibody: Cell Signaling, code number 3579
  • KLF5 KLF5 antibody: R & D Systems, catalog number AF3758
  • Each protein was then probed with the corresponding primary antibody, and then incubated with horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse / rabbit IgG antibody (GE Healthcare). Each band was visualized using an ECL plus western blotting detection system (GE Healthcare).
  • TAT4-SOX2 was decomposed.
  • TAT4-SOX2 R43Q R114Q was not disassembled.
  • SOX2 (TAT4-) was decomposed, but SOX2 R43Q R114Q (TAT4-) was not decomposed.
  • TAT4 / TATk-hOCT4 The functionality of secreted TAT4-hOCT4 or TATk-hOCT4 protein without a furin recognition site was evaluated in hiPSC production using HDF. Specifically, a modified SNL cell line (SP-TAT4-hOCT4 or SP-TATK-hOCT4) that secretes TAT4-hOCT4 or TATk-hOCT4 protein by HDF transduced with hc-MYC, hSOX2 and hKLF4 by a retrovirus And the morphological changes and alkaline phosphatase (AP) staining were observed. The obtained result is shown in FIG.
  • the AP staining was performed using an alkaline phosphatase staining kit (Vector, SK-5100, SK-5200) according to the manufacturer's instructions.
  • mouse iPS cells by secretory cell reprogramming factor (wild type)> Whether or not mouse iPS cells could be produced was examined using only a transducible secretory cell reprogramming factor (wild type). That is, as shown in FIG. 11, the MEF is cultured in a CM containing a mixture of four types of SNL feeder cells secreting cell reprogramming factors fused to TAT4 and a mixture of TAT4 fusion cell reprogramming factors. did. Furthermore, as a result of sorting and culturing E-cadherin and SSEA-1-expressing cells, miPSC colonies could be obtained.
  • the characteristics of the miPSC thus obtained were analyzed by AP staining and immunocytochemical staining (SSEA-1 staining). The obtained result is shown in FIG. Immunocytochemical staining was performed as follows.
  • the cells were fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 15 minutes. Then, it was washed with 4% normal goat serum-containing phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS normal goat serum-containing phosphate buffered saline
  • Contains ES cell characterization kit Millipore, SCR001
  • mice iPS cells by secretory cell reprogramming factor (mutant) Whether or not mouse iPS cells could be produced was examined using only a transducible secretory cell reprogramming factor (a mutant that exhibits resistance to furin). That is, as shown in FIG. 13, a mixture of TAT4 fusion cell reprogramming factor (mutant type) together with a mixture of four SNL feeder cells secreting TAT4 fused cell reprogramming factor (mutant type).
  • the MEF containing the EGFP gene whose expression was controlled by the Oct4 promoter was cultured.
  • the expression of OCT4-EGFP + colonies was confirmed for the first time on the 9th day.
  • miPSC The characteristics of miPSC thus obtained were analyzed by pOCT4-EGFP signal observation, AP staining, and immunocytochemical staining (SSEA-1 staining). Immunocytochemical staining was performed as described above. The obtained result is shown in FIG.
  • the bar graph in FIG. 15 shows the average number of OCT4-EGFP + ES-like colonies prepared from 1 ⁇ 10 5 MEF (average value measured in triplicate ⁇ standard deviation (s.d)). The average value is shown in the lower part of the graph. Further, the abbreviations in the X-axis display indicate the conditions for producing miPSC, respectively.
  • CM transducible cell reprogramming factor is cultured in CM
  • Retro Cell reprogramming factor introduced into MEF by retrovirus
  • WT Wild type cell reprogramming factor introduced into MEF
  • Mut Mutant of cell reprogramming factor exhibiting furin resistance introduced into MEF.
  • the SNL is more efficient than the retrovirus-introducing method (“4, Retro, WT”) in terms of the efficiency when introducing 4 factors into iPS cells.
  • the method of introduction using a mixture of feeder cells and / or CM is inferior, the efficiency in producing iPS cells by introducing three factors is compared with the method using retrovirus ("3, Retro, WT”).
  • the methods using SNL feeder cells and CM (“3, F + CM, WT” and “3, F + CM, Mut”) showed inferior establishment efficiency. Therefore, it has been clarified that the production method of the present invention is excellent in that it can produce iPS cells having high safety with low risk of canceration while exhibiting high production efficiency.
  • iPS cells ⁇ Construction of human iPS cells by secretory cell reprogramming factor (wild type)> Whether or not human iPS cells can be produced using only transducible secretory cell reprogramming factor (wild type) was examined. That is, as shown in FIG. 16, a CM containing a mixture of four types of SNL feeder cells each secreting a cell reprogramming factor fused to TAT4 and a mixture of TAT4 cell reprogramming factors derived from neonatal tissue. HDF was cultured. Furthermore, as a result of sorting and culturing SSEA-4 expressing cells, hiPSC colonies could be obtained. The iPS cells thus obtained are also referred to as SP-hiPSWT cells.
  • hiPSCs obtained by transducing HDF with four types of cell reprogramming factors (wild type) fused to TAT4 and secreted from the modified SNL cell line.
  • SP-hiPSWT cells the expression of alkaline phosphatase, SSEA-4, TRA-1-60 and TRA-1-81, which are markers of pluripotent stem cells, was confirmed.
  • the SP-hiPSWT cells and SP-hiPSmut cells obtained as described above were further evaluated for the following characteristics.
  • SP-hiPSWT cells and SP-hiPSmut cells AP staining and immunocytochemical staining were performed by the above-described methods.
  • these human iPS cells were differentiated in vitro, and the presence or absence of embryoid body formation was observed. That is, in order to perform embryoid body formation, SP-hiPSWT cells or SP-hiPSmut cells are dissociated from the mixture of SNL feeder cells, transferred to a low-adhesion culture dish (manufactured by Sterlin), and contain bFGF. The cells were cultured in a non-hESC medium. The obtained result is shown in FIG.
  • human iPS cells prepared by the production method of the present invention showed typical human ES-like morphology, and were also positive for alkaline phosphatase staining.
  • formation of embryoid bodies was observed after 3 days from the transfer to a low-adhesion culture dish in suspension culture.
  • expression of pluripotency markers SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, OCT4 and NANOG was also observed.
  • SSEA-1 which is a pluripotency marker in mice, was not observed and the modified SNL cell line was irradiated, miPSC formation by autotransduction from the modified SNL cell line The possibility is very low.
  • the human iPS cells obtained by the production method of the present invention have high pluripotency both in expression analysis at the gene or protein level and in morphological observation.
  • the production method of the present invention confirmed the formation of a hiPSC-like colony derived from human umbilical cord blood CD34 + progenitor cells, and in the obtained hiPSC, alkaline phosphatase and The expression of SSEA-4 was also confirmed.
  • a cell reprogramming factor is not inserted into the genome of an inducible pluripotent stem cell, the establishment efficiency is high, and it does not require labor, time and cost. It becomes possible to provide a method for producing a potent stem cell.
  • the method, kit, and induced pluripotent stem cells of the present invention for producing induced pluripotent stem cells are extremely useful for clinical use of induced pluripotent stem cells, particularly for use in regenerative medicine. It is.

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Abstract

　細胞初期化因子が誘導型多能性幹細胞のゲノム中に挿入されることなく、簡便かつ効率的に、誘導型多能性幹細胞を製造しうる方法を提供することを目的とし、細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を調製し、該細胞から分泌される融合蛋白質を、体細胞に導入することにより、安全、簡便、かつ効率的に、誘導型多能性幹細胞を製造しうることを見出した。

Description

誘導型多能性幹細胞の製造方法
　本発明は、誘導型多能性幹細胞の製造方法、その方法に用いられるキット、並びにその方法によって得られる誘導型多能性幹細胞に関する。
　ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）は、誘導型多能性幹細胞又は人工多能性幹細胞とも称され、数種類の転写因子の遺伝子を線維芽細胞等の体細胞に導入することにより、ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）様の分化多能性を獲得した細胞である。
　分化多能性を有する細胞は、生体を構成する全ての臓器や組織へ分化する能力を保持していることから、何らかの疾患で損傷した臓器等を再生する上で極めて有効な手段として期待されている。従来は、ＥＳ細胞を利用する再生医療研究が中心に行われていたが、ＥＳ細胞は生命の起源となる胚から取得されるものであるため、その使用上、倫理的な問題に直面することになる。また、ＥＳ細胞から調製した組織などは、移植の段階で拒絶反応を引き起こすおそれがあり、このような免疫的な問題を克服する必要もある。
　そこで、ＥＳ細胞を用いた場合に生じ得る倫理上の問題と免疫学上の問題とを解決することができる分化多能性細胞として、ｉＰＳ細胞に多くの期待が寄せられている。
　マウスのｉＰＳ細胞は、山中らによって、分化多能性の維持に重要なＮａｎｏｇ遺伝子の発現を指標にし、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの４つの遺伝子を導入することにより、初めて樹立された（非特許文献１、非特許文献２）。その後も同様の方法によるマウスｉＰＳ細胞の樹立が報告されている（非特許文献３、非特許文献４）。そして、ｉＰＳ細胞の癌化の問題を克服するために、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子以外の３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）のみでも、ｉＰＳ細胞の樹立が可能であることも報告されている（非特許文献５～７）。
　一方、ヒトのｉＰＳ細胞に関しては、Ｔｈｏｍｓｏｎらが、ヒトの線維芽細胞に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８を導入してヒトｉＰＳ細胞を樹立し（非特許文献８）、また、山中らは、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ－ＭＹＣをヒトの線維芽細胞に導入することにより、同じくｉＰＳ細胞を樹立することが可能であることが報告されている（非特許文献９）。
　このように、ｉＰＳ細胞の今後の利用可能性が注目され、その樹立（製造）方法の開発が進む中、いくつかの問題点が指摘されている。
　まず、分化多能性を体細胞に付与する因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２等、以下、細胞初期化因子とも称する）を体細胞へ導入するために、レトロウィルスベクター等による遺伝子導入法を用いると、体細胞のゲノム中に細胞初期化因子がランダムに挿入され、その結果、遺伝子の挿入による突然変異（特に、内在性発癌遺伝子の活性化等）が引き起こされる可能性が指摘されている。特に、癌遺伝子であるｃ－Ｍｙｃ遺伝子を導入すると、作製したｉＰＳ細胞の癌化が有意に高い確率で確認されている。ｃ－Ｍｙｃ遺伝子を用いずにｉＰＳ細胞の作出に成功したことは報告されてはいるが（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）、樹立（作出）効率が極めて低いため、今後、臨床的な応用に利用することは難しいのではないかと考えられている。
　最近、アデノウィルスベクター用いて、細胞初期化因子の体細胞における発現を、一過的に大量に行うことでｉＰＳ細胞を作製する方法が報告された（非特許文献１０）。この方法で作製されたｉＰＳ細胞をマウスの胚盤胞にインジェクトすると、生まれたマウスの組織中にインジェクトしたｉＰＳ細胞由来の分化した細胞が確認され、また、少なくとも４～１２週齢のマウスにおいて癌化は認められなかった。この方法によれば、細胞初期化因子の遺伝子導入に伴うｉＰＳ細胞の癌化の問題が解決される可能性がある。しかしながら、細胞初期化因子を遺伝子として導入してｉＰＳ細胞を作製する方法は、多くの煩雑な工程を必要とし、スクリーニング等に長い時間を要することから、効率性の問題が指摘されている。
　また、タンパク質を細胞内で機能させるためには、その遺伝子を導入して目的の細胞内で発現させる他、タンパク質自体を細胞内に直接導入することも可能である。タンパク質自体を直接細胞に導入する方法は、これまでに多くの方法が報告されているが、中でも蛋白質導入ドメイン（ＰＴＤ、膜透過ペプチド、細胞膜透過性ペプチドとも称する）との融合タンパク質を目的の細胞に接触させて、細胞内に導入する方法が多く利用されている（例えば、特許文献１～９）。またｉＰＳ細胞を樹立するために、細胞初期化因子をタンパク質として体細胞に導入する方法については、例えば、Ｏｃｔ４タンパク質とＳｏｘ２タンパク質とを導入した例、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃタンパク質とアルギニンとを結合させて導入した例がある（非特許文献１０～１３，特許文献１０～１４）。しかしながらこれらの方法は、タンパク質を大腸菌等を用いて生産せしめ、しかる後にそれぞれのタンパク質を抽出、精製し用いることを必要とするため、コストと時間がかかり、またｉＰＳ細胞の樹立効率も低いという多くの問題点を有する。
米国特許第５，８０４，６０４号明細書 米国特許第５，７４７，６４１号明細書 米国特許第５，６７４，９８０号明細書 米国特許第５，６７０，６１７号明細書 米国特許第５，６５２，１２２号明細書 国際公開第２００２／０１８５７２号 特開２００５－５２０８３号公報 特開２００５－２５３４０８号公報 特開２００１－１９９９９７号公報 国際公開第２００９／０３２４５６号 国際公開第２００９／０６７７５６号 国際公開第２００９／０６７７５７号 国際公開第２００９／１４９９５６号 特開２０１０－１１０２８９号公報
Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、２００６年、１２６巻、６６３～６７６ページ Ｏｋｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４４８巻、３１３～３１７ページ Ｗｅｒｎｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４４８巻、３１８～３２４ページ Ｍａｈｅｒａｌｉら、Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ、２００７年、１巻、５５～７０ページ Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４５１巻、１４１～１４６ページ Ｎａｋａｇａｗａら、Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００８年、２６巻、１０１～１０６ページ Ｗｅｒｎｉｇら、Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ、２００８年、１０巻、１０～１２ページ Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年、３１８巻、１９１７～１９２０ページ Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、２００７年、１３１巻、８６１～８７２ページ Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８年、３２２巻、９４５～９４９ページ Ｂｏｎｓｎａｌｉ及びＥｄｅｎｈｏｆｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００８年、３８９巻、８５１～８６１ページ Ｈｏｎｇｙａｎら、Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ、２００９年、４巻、５号、３８１～３８４ページ Ｄｏｈｏｏｎら、Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ、２００９、４巻、６号、４７２～４７６ページ
　本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、細胞初期化因子が誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）のゲノム中に挿入されることなく、簡便かつ効率的に誘導型多能性幹細胞を製造しうる方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメイン及び細胞初期化因子を構成要素とする融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を調製し、該細胞より分泌される融合蛋白質を、誘導型多能性幹細胞へ誘導するための標的細胞に作用させることにより、前記細胞初期化因子が誘導型多能性幹細胞のゲノム中に挿入されることなく、簡便かつ効率的に、誘導型多能性幹細胞を製造しうることを見出し、本発明を完成するに至った（図１　参照）。本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
　（１）　誘導型多能性幹細胞の製造方法であって、
（ａ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を調製する工程、ならびに
（ｂ）誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞と、工程（ａ）において調製された細胞とを共培養するか、または、誘導型多能性幹細胞に誘導するための細胞に対して、工程（ａ）において調製された細胞の培養上清を接触させる工程、
を含む方法。
　（２）　細胞初期化因子が、フューリン認識配列を消失させた、若しくは、フューリン認識配列が存在しないものである、（１）に記載の方法。
　（３）　細胞初期化因子が、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５－１、ＥＣＡＴ１５－２、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、β－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｓｔａｔ３及びＧｒｂ２からなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質である、（１）または（２）に記載の方法。
　（４）　細胞初期化因子が、配列番号：１から５に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質である、（３）に記載の方法。
　（５）　蛋白質導入ドメインが、フューリン認識配列を消失させた、若しくは、フューリン認識配列が存在しないものである、（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
　（６）　蛋白質導入ドメインがＴＡＴである、（１）から（５）のいずれかに記載の方法。
　（７）　蛋白質導入ドメインが、配列番号：６から７に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質である、（６）に記載の方法。
　（８）　融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞がフィーダ細胞である、（１）から（７）のいずれかに記載の方法。
　（９）　（１）から（８）のいずれかに記載の方法に用いられるキットであって、下記（ａ）から（ｃ）の少なくとも一つを含むキット
（ａ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持するベクター
（ｂ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持する細胞
（ｃ）（ｂ）の細胞の培養上清。
　（１０）　（１）から（８）のいずれかに記載の方法によって製造され、細胞初期化因子がゲノム中に外来的に挿入されていない、誘導型多能性幹細胞。
　本発明によれば、細胞初期化因子が誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）のゲノム中に挿入されることなく、簡便かつ効率的に、誘導型多能性幹細胞の製造しうる方法を提供することが可能となる。
形質導入可能な組換えタンパク質分泌システムの概略図である。フィーダ細胞株を作製するために用いる、安定的遺伝子導入（ｓｔａｂｌｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）用発現カセットの構造を図の上部に示す。また、図の下部にて、マウスイムノグロブリン（Ｉｇ）ｋ鎖リーダー配列（Ｉｇｋ　Ｌｅａｄｅｒ）は、フィーダ細胞から組換えタンパク質が分泌される過程（図中「１」で示す過程）にて用いられることを示す。さらに、このリーダー配列は、分泌過程において、下流の４ペプチド配列（ＲＡＲＲ）にて、初期のタンパク質生成物から切り離され、結果として、蛋白質導入ドメイン（ＰＴＤ）及び細胞初期化因子のうちの１タンパク質（Ｃａｒｇｏ）からなる融合タンパク質が分泌され、標的細胞に形質導入（図中「２」で示す過程）されることを示す。 フューリンの特性を示す概略図である。すなわち、フューリンはゴルジ装置に豊富に存在する酵素であり、標的配列にて様々なタンパク質を特異的に切断する。また、フューリンは、潜在的前駆体タンパク質をそれらの生物学的活性産物に処理することで知られているプロタンパク質転換酵素ファミリーの１酵素であり、標的配列の下流を認識し、速やかに切断することを示す概略図である。 分泌型組換えタンパク質導入システムにおける、フューリンに起因する問題点を示す概略図である。すなわち、細胞初期化因子　ｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４、並びに蛋白質導入ドメインとして用いるＴＡＴ配列は、全てフューリン認識部位（標的配列）を有しており、フィーダ細胞からの分泌の過程において切断されることが予想される。それゆえ、このフューリンを介する消化は、形質導入可能な組換えタンパク質分泌システムの効率を低下させるかもしれず、フューリンは形質導入可能な組換えタンパク質分泌システムに制限をかける可能性があることを示す概略図である。 分泌型組換えタンパク質導入システムにおける欠陥を補うために用いられる、ＴＡＴ配列及びｉＰＳ－４（５）－因子の変異体を示す概略図である。すなわち、フューリンを介するｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２、ｈＫＬＦ４及びＴＡＴペプチドの切断を回避するため、フューリン認識部位をノックダウンしたアミノ酸置換体（変異体）を分泌型組換えタンパク質導入システムに導入したことを示す概略図である。具体的には、野生型のＴＡＴペプチドの代わりに、ＴＡＴ４及びＴＡＴｋペプチド（以前にフューリン耐性を示す組換え体として報告されているペプチド配列）を使用し、ｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４の代替形態として、ｈｃ－ＭＹＣ　Ｒ３６７Ｋ　Ｒ４２４Ｑ、ｈＳＯＸ２　Ｒ４３Ｑ　Ｒ１１４Ｑ及びｈＫＬＦ４　Ｒ３７７Ｓを各々使用した。また、ｈＫＬＦ５はフューリン認識部位を欠損しているため、ｈＫＬＦ４の置換体として使用した。 フューリンによる切断を回避するために設計した、組換えタンパク質分泌システムのためのコンストラクト、並びにそれらが導入されたフィーダ細胞の概略を示す図である。すなわち、誘導型多能性幹（ｉＰＳ）細胞（ｉＰＳＣ）の作製に対応するため、各組換えタンパク質に対応するコンストラクトをＳＮＬ親細胞にトランスフェクションし、ゼオシンの存在下にて選択することにより、形質導入可能な細胞初期化因子を分泌することができるフィーダ細胞を作製した。また、クサビラオレンジ（Ｋｕｓａｂｉｒａ　Ｏｒａｎｇｅ）はタンパク質分泌システムの確立及び最適化のためのマーカータンパク質として用いたことを示す概略図である。なお、図中「ＳＰ」は、タンパク質の分泌型（ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｆｏｒｍ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ）であることを示す。 改変ＳＮＬ細胞株における、フューリン耐性ＰＴＤのによる分泌型組換えタンパク質の形質導入性について検証した結果を示す顕微鏡写真である。すなわち、ＴＡＴ４融合タンパク質及びＴＡＴｋ融合タンパク質（フューリン耐性ＰＴＤ）並びにノナアルギニン（Ｒ９)融合タンパク質の形質導入性を、融合パートナーとしてクサビラオレンジ（ＫＯ）を使用して検証した結果を示す蛍光顕微鏡写真を図中上部３パネルにて各々示す。また、該蛍光顕微鏡写真に対応する明視野での顕微鏡写真を図中下部３パネルにて各々示す。 改変ＳＮＬ細胞株から分泌されるＴＡＴ４－ＫＯ組換えタンパク質及びＴＡＴｋ－ＫＯ組換えタンパク質の形質導入効率をフローサイトメトリーによって分析した結果を示すドットプロット図である。なお図中「Ｊｕｒｋａｔ」はＳＮＬ親細胞とＪｕｒｋａｔ細胞との共培養の結果を示し、「ＳＰ－ＴＡＴ４－ｈｕＫＯ」は、ＴＡＴ４－ＫＯ組換えタンパク質を分泌するＳＮＬ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞との共培養の結果を示し、「ＳＰ－ＴＡＴｋ－ｈｕＫＯ」は、ＴＡＴｋ－ＫＯ組換えタンパク質を分泌するＳＮＬ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞との共培養の結果を示す。 改変ＳＮＬ細胞株を含む培養培地中のＴＡＴ４融合細胞初期化因子及びＴＡＴｋ融合細胞初期化因子をウェスタンブロッティングによって検出した結果を示す写真である。 改変ＳＮＬ細胞株から分泌された組換えタンパク質をウェスタンブロッティングによって検出した結果を示す写真である。なお図中「ＴＡＴ４－」は各細胞初期化因子にＴＡＴ４配列が融合している組換えタンパク質であることを示し、「（ＴＡＴ４－）」は各細胞初期化因子にＴＡＴ４配列が融合していない組換えタンパク質であることを示す。また、陰性対照として、「ＤＭＥＭ（ＦＢＳ－）」に細胞を培養していない培地を分析した結果を、「ＤＭＥＭ（ＦＢＳ－）＋ＳＮＬs」にＳＮＬ親細胞の培養培地を分析した結果を示す。 分泌された形質導入可能なＴＡＴ４－ｈＯＣＴ４又はＴＡＴｋ－ｈＯＣＴ４タンパク質の機能性を、ｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４をレトロウィルスにより導入したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を用いたｉＰＳＣ作製において試験した結果を示す顕微鏡写真である。なお図中、上部４パネルは細胞の形態学的変化を示す顕微鏡写真であり、下部２パネルはアルカリフォスファタ―ゼ（ＡＰ）染色の結果を示す顕微鏡写真である。また「Ｒｅｔｒｏ－４　Ｆａｃｔｏｒｓ」は４因子（ｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２、ｈＯＣＴ４及びｈＫＬＦ４）をレトロウィルスにより導入したＨＤＦの結果を示し、「Ｒｅｔｒｏ－Ｍ，Ｓ，Ｋ」はｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４をレトロウィルスにより導入したＨＤＦの結果を示す。さらに「ＳＰ－ＴＡＴ４－ｈＯＣＴ４」はｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４をレトロウィルスにより導入したＨＤＦを、ＴＡＴ４－ｈＯＣＴ４を分泌するＳＮＬ細胞株上にて培養した結果を示し、「ＳＰ－ＴＡＴｋ－ｈＯＣＴ４」はｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４をレトロウィルスにより導入したＨＤＦを、ＴＡＴｋ－ｈＯＣＴ４を分泌するＳＮＬ細胞株上にて培養した結果を示す。 形質導入可能な細胞初期化因子（ヒト野生型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いたマウスｉＰＳ細胞作製のためのスキームを示す概略図である。 形質導入可能な細胞初期化因子（野生型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いて作製したマウスｉＰＳ細胞（ＳＰ４－ｍｉＰＳＷＴ♯１～１０）の特性を評価した結果を示す顕微鏡写真である。なお図中、「Ｐｈａｓｅ　Ｃｏｎｔｒａｓｔ」は位相差顕微鏡による観察結果を示し、「ＡＰ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ」はＡＰ染色の結果を示し、「ＳＳＥＡ－１　Ｓｔａｉｎｉｎｇ」はＳＳＥＡ－１染色の結果を示す。また、上二段のパネルにおいては左が４０倍、右が１００倍の倍率で観察した結果を示す。さらに、最下段は左が明視野において２００倍の倍率で観察した結果を、右が蛍光観察（観察倍率：２００倍）の結果を示す。 形質導入可能な細胞初期化因子（フューリン耐性を示す変異型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いたマウスｉＰＳ細胞作製のためのスキームを示す概略図である。 形質導入可能な細胞初期化因子（フューリン耐性を示す変異型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いて作製したマウスｉＰＳ細胞（ＳＰ４－ｍｉＰＳＭｕｔａｎｔ）の特性を評価した結果を示す顕微鏡写真である。なお図中、上部３パネル（「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　Ｃｌｏｎｅ」）は作製したマウスｉＰＳ細胞のコロニーを示す顕微鏡写真であり、右のパネルは明視野における観察結果を示し、真ん中のパネルは蛍光顕微鏡による観察結果を示し、左のパネルは右のパネルと真ん中のパネルとを重ね合わせた結果を示す。また真ん中の２パネル（「ｐＯＣＴ４－ＥＧＦＰ（１０×）」）はマウスＯｃｔ４プロモーターにＥＧＦＰを繋いだトランスジーンを組み込んだマウスのＭＥＦより作製したマウスｉＰＳ細胞を示す顕微鏡写真であり、右のパネルは蛍光顕微鏡による観察結果を示し、左のパネルは明視野における観察結果と蛍光顕微鏡による観察結果とを重ね合わせた結果を示す。さらに下部３パネルにおいて、左のパネルはＳＳＥＡ－１染色したマウスｉＰＳ細胞の蛍光顕微鏡による観察結果を示し、真ん中のパネルはＯＣＴ４プロモーターの活性化を表わすＥＧＦＰシグナルの蛍光顕微鏡による観察結果を示し、右のパネルは明視野におけるマウスｉＰＳ細胞の観察結果を示す。 形質導入可能な細胞初期化因子を分泌するＳＮＬ細胞株（改変ＳＮＬ細胞株）を用いた様々な条件下でのｍｉＰＳＣ作製効率を、Ｐｏｃｔ４－ＥＧＦＰ（＋）コロニーに対するアレイスキャンにより分析した結果を示すグラフである。 形質導入可能な細胞初期化因子（野生型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いたヒトｉＰＳ細胞作製のためのスキームを示す概略図である。 形質導入可能な細胞初期化因子（野生型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いて作製したヒトｉＰＳ細胞（ＳＰ４－ｈｉＰＳＷＴ細胞）の特性を評価した結果を示す顕微鏡写真である。なお図中、一番上の２パネルは作製したヒトｉＰＳ細胞のコロニーの明視野における観察結果を示す顕微鏡写真である。また、上から２番目の２パネルは作製したヒトｉＰＳ細胞のＡＰ染色の結果を示す顕微鏡写真である。さらに、上２段のパネルにおいて、左は４０倍、右は１００倍の倍率で各々観察した結果を示す。また上から３～５番目の各３パネルは、各々作製したヒトｉＰＳ細胞のＳＳＥＡ－４染色、ＴＲＡ－１－６０染色及びＴＲＡ－１－８１染色の結果を示す顕微鏡写真（観察倍率；１００倍）であり、さらに右のパネルは作製したヒトｉＰＳ細胞の明視野における各観察結果を示し、真ん中のパネルは作製したヒトｉＰＳ細胞の蛍光顕微鏡による各観察結果を示し、左のパネルは右のパネルと真ん中のパネルとを重ね合わせた結果を示す。 形質導入可能な細胞初期化因子（フューリン耐性を示す変異型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いたヒトｉＰＳ細胞作製のためのスキームを示す概略図である。 形質導入可能な細胞初期化因子（フューリン耐性を示す変異型）を分泌するＳＮＬ細胞株（ＳＰ－ＳＮＬ（ｍｕｔ））を用いて、ＨＤＦから樹立したヒトｉＰＳ細胞（ＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞）のコロニーの観察結果を示す顕微鏡写真（観察倍率：４０倍（左側）及び１００倍（右側））である。なお、顕微鏡観察は得られたヒトｉＰＳ細胞のコロニ―の中から２つをランダムに選んで行った。 形質導入可能な細胞初期化因子を分泌するＳＮＬ細胞株を用いて作製したヒトｉＰＳ細胞（ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞）の特性を評価した結果を示す顕微鏡写真である。なお図中、一番上の左のパネルは作製したヒトｉＰＳ細胞（ＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞由来）のＡＰ染色の結果を示し、一番上の真ん中のパネル（ＥＢ（ｄａｙ６）－ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ）はＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞由来の胚葉体を観察した結果を示し、一番上の右のパネル（ＥＢ（ｄａｙ６）－ＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ）はＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞由来の胚葉体を観察した結果を示す。また上から２番目の６パネルはＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞由来のｉＰＳ細胞につき、左側から各々、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＳＳＥＡ－１の蛍光染色像を示し、上から３番目の６パネルは各々、ＳＳＥＡ－４染色等とＤＡＰＩ染色との重ね合わせの結果を示す。さらに、一番下の６パネルは作製したヒトｉＰＳ細胞の明視野における各観察結果を示す。なお、ＳＳＥＡ－１はヒト由来の細胞においては発現していないので、陰性対照として観察した。 ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞における、ヒトＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現レベルを半定量的ＲＴ－ＰＣＲにて分析した結果を示す電気泳動の写真である。なお図中「ＫｈＥＳ－３」はＥＳ細胞を分析した結果（陽性対照）を示し、「ＨＤＦ（ｎｅｏｎａｔｅ）」はＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞の基になったヒト新生児組織由来のＨＤＦを分析した結果を示す。またＧＡＰＤＨ遺伝子については、内部標準としてその発現を分析した。 ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞の核型を標準的なＧバンド染色体検査によって分析した結果を示す顕微鏡写真である。 ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞又はＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞由来のテラトーマを、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって観察した結果を示す顕微鏡写真である。なお図中「Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ」は腸上皮を示し、「Ｃａｒｔｉｌａｇｅ」は軟骨を示し、「Ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ　ｎｅｕｒａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ」は色素神経上皮を示し、「Ｒｅｔｉｎｏｃｙｔｅ」は網膜芽細胞を示す。 形質導入可能な細胞初期化因子を分泌するＳＮＬ細胞株を用いて作製した、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞由来のｉＰＳ細胞の特性を評価した結果を示す顕微鏡写真である。上部左のパネル（ＳＰ－ｈｉＰＳＣＢ）はヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞由来のｉＰＳ細胞のコロニーの観察結果を示し、上部右のパネル（ＡＰ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ）はＡＰ染色の結果を示し、下部左のパネル（ＳＳＥＡ－４／ＤＡＰＩ）はＳＳＥＡ－４染色とＤＡＰＩ染色との結果を示し、下部真ん中のパネル（Ｍｅｒｇｅ）はＳＳＥＡ－４染色とＤＡＰＩ染色との重ね合わせの結果を示し、下部右のパネル（Ｐｈａｓｅ　Ｃｏｎｔｒａｓｔ）は位相差顕微鏡による観察結果を示す。
　本発明の誘導型多能性幹細胞の製造方法は、
（ａ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を調製する工程、ならびに
（ｂ）誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞と、工程（ａ）において調製された細胞とを共培養するか、または、誘導型多能性幹細胞に誘導するための細胞に対して、工程（ａ）において調製された細胞の培養上清を接触させる工程、
を含むことを特徴とする方法である。
　先ず、本発明の誘導型多能性幹細胞の製造方法における工程（ａ）について説明する。
　本発明において、「誘導型多能性幹細胞」とは、ｉＰＳ細胞又は人工多能性幹細胞とも称される細胞であり、体細胞に細胞初期化因子を導入することにより、ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）様の分化多能性を獲得した細胞である。
　また、本発明に用いられる「細胞初期化因子」は、体細胞に導入されることにより、単独で、又は他の分化多能性因子と協働して該体細胞に分化多能性を付与できる因子であればよく、特に制限されることはないが、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５－１、ＥＣＡＴ１５－２、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、β－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｓｔａｔ３及びＧｒｂ２からなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質であることが好ましい。なお、かかるタンパク質の典型的な例としては、表１において示されるＧｅnＢａｎｋアクセッション番号で特定される遺伝子がコードする蛋白質が挙げられる。
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　さらに、これらタンパク質の中では、少ない因子で効率良く誘導型多能性幹細胞を樹立できるという観点から、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（４因子）を後述の誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞（以下「標的細胞」とも称する）に導入することがより好ましい。また、得られる誘導型多能性幹細胞の癌化のリスクを低くするという観点から、ｃ－Ｍｙｃを除く、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（３因子）を体細胞に導入することがより好ましい。
　また、ヒト及び非ヒト動物細胞（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）に存在する上掲の細胞初期化因子のホモログを用いて本発明を実施することにより、所望の動物由来のｉＰＳ細胞を容易に作製することができる。このようなホモログは、上掲の細胞初期化因子のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは、８０％以上、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上）の相同性を有する。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＸ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ。、　２１５：　４０３－４１０，　１９９０）を利用して決定することができる。さらに、本発明において使用される分化多能性因子は、必ずしも野生型である必要はなく、単独で、又は他の分化多能性因子と協働して該体細胞に分化多能性を付与できる能力を有する限り、変異タンパク質であってもよい。かかる変異タンパク質における挿入、置換又は欠失されるアミノ酸数は、通常、１～３０であり、好ましくは１～１０であり、より好ましくは１～５である。なお、かかる変異体は後述の「フューリン認識配列を消失させた細胞初期化因子を作製する方法」と同様の方法を用いて、作製することができる。
　さらに、本発明に用いられる「細胞初期化因子」は、フューリン認識配列を消失させた、若しくは、フューリン認識配列が存在しないものであることが好ましく、配列番号１～５に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質であることがより好ましい。
　フューリン（Ｆｕｒｉｎ）とは、ＰＡＣＥ（Ｐａｉｒｅｄ　ｂａｓｉｃ　Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　Ｃｌｅａｖｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅ）とも称されるプロテアーゼであり、細胞内のゴルジ体に豊富に存在することが知られている。また、フューリンは標的蛋白質中の特定の配列（フューリン認識配列）の直後を切断することも知られており、かかる特定の配列は「ＲＸＲＲ」又は「ＲＸＫＲ」である（図２　参照）。そのため、本発明に用いられる細胞初期化因子はかかる配列を消失させた、若しくは、かかる配列が存在しないものであることが好ましい。なお、前記認識配列において、「Ｒ］はアルギニンを、「Ｋ」はリシンを、「Ｘ」は任意のアミノ酸を示す。かかるフューリン認識配列を消失させた細胞初期化因子を作製する方法としては、公知の手法を用いることができる。例えば、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法、Ｃｏｕｐｌｅｄ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｙｃｌｉｃ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法、Ｋｕｎｋｅｌ法、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）法、又はこれらに準ずる方法が挙げられ、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ－Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ－Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））を用いて、又はＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　シリーズキットを用いて、前記ＧｅnＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒで特定される遺伝子がコードしているような細胞初期化因子（野性型）のフューリン認識配列中に変異を導入することにより、フューリン認識配列を消失させた細胞初期化因子を作製することができる。
　また、本発明に用いられる「細胞外分泌シグナル」としては、後述の融合タンパク質を細胞外に分泌させることができるアミノ酸配列であればよく、該融合タンパク質の特性や該融合タンパク質を発現させる細胞等に合わせて、適宜公知のアミノ末端シグナルペプチド配列から選択される。例えば、抗体分子、受容体及び細胞外基質分子（ｍａｔｒｉｘ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、サイトカイン、ホルモン、成長及び分化因子、神経ペプチド、血管介在物質（ｖａｓｏｍｅｄｉａｔｏｒ）、ホスホキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホジエステラーゼ、Ｇタンパク質、Ｒａｓ関連タンパク質、イオンチャンネル、輸送体／ポンプ、プロテアーゼ、あるいは転写因子が含有するシグナル配列が挙げられる。好ましいシグナルペプチドとしては、例えば、抗体分子が含有するアミノ末端シグナルペプチド配列である、Ｉｇκ鎖Ｖ－Ｊ２－Ｃシグナルペプチドを挙げることができる。
　さらに、本発明に用いられる「プロテアーゼ認識配列」としては、後述の融合タンパク質が細胞外に分泌される際または分泌された後に、部位特異的エンドプロテアーゼによって認識されて切断される配列であればよく、公知の部位特異的エンドプロテアーゼによって認識される配列の中から適宜選択することができる。例えば、フューリン、トロンビン、エンテロキナーゼ、ファクターＸａが認識する配列が挙げられる。好ましいプロテアーゼ認識配列としては、例えば、フューリン認識配列が挙げられる。
　また、本発明に用いられる「蛋白質導入ドメイン」は、前記プロテアーゼ認識において切断された後述の融合タンパク質を、誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞（以下「標的細胞」とも称する。）内に導入する能力を有するペプチド配列であれば特に制限はない。例えば、ＶＰ２２、Ｋａｐｏｓｉ　ＦＧＦ、ＴＡＴ、ショウジョウバエ　アンテチィナペディア、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｍ９１８、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ－１０、Ｐｏｌｙ－Ａｒｇｉｎｉｎｅ、及びこれらペプチドの派生物が挙げられる。好ましい蛋白質導入ドメインとしては、例えば、ＴＡＴが挙げられる。また、本発明に用いられる「蛋白質導入ドメイン」は、フューリン認識配列を消失させた、若しくはフューリン認識配列が存在しないものであることが好ましく、配列番号６又は７に記載のタンパク質であることがより好ましい。なお、かかる「蛋白質導入ドメイン」は、フューリン認識配列に変異を導入するといった前述の方法により適宜調製することができる。
　また、本発明に用いられる「融合タンパク質」は、前記「細胞外分泌シグナル」、前記「プロテアーゼ認識配列」、前記「蛋白質導入ドメイン」および前記「細胞初期化因子」を含む融合タンパク質であり、前記「細胞外分泌シグナル」、前記「プロテアーゼ認識配列」、前記「蛋白質導入ドメイン」および前記「細胞初期化因子」をＮ末端側より順に含む融合タンパク質、または、前記「細胞外分泌シグナル」、前記「プロテアーゼ認識配列」、前記「細胞初期化因子」および前記「蛋白質導入ドメイン」をＮ末端側より順に含む融合タンパク質が好ましい。
　本発明に用いられる「融合タンパク質」としては、更に機能性ペプチド又はタンパク質を含んでいてもよい。機能性ペプチド又はタンパク質としては、例えば、核移行シグナルペプチド等の細胞内局在化シグナルペプチド、蛍光タンパク質、ＦＬＡＧペプチド等のエピト―プタグ、薬剤耐性因子が挙げられる。
　また、前記「細胞外分泌シグナル」、前記「プロテアーゼ認識配列」、前記「細胞初期化因子」、前記「蛋白質導入ドメイン」等における各々のペプチド間のアミノ酸の数および種類は、融合タンパク質の機能を阻害しない限り、特に制限されない。
　本発明に用いられる、融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入される「細胞」（以下、「分泌用細胞」とも称する）としては、例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の多能性を維持しながら培養する際に用いられるフィーダー細胞（例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞）、ＣＨＯ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ｄｅｒｉｖｅｄ　ａｓ　ａ　ｓｕｂｃｌｏｎｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ＣＨＯ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｂｉｏｐｓｙ　ｏｆ　ａｎ　ｏｖａｒｙ　ｏｆ　ａｎ　ａｄｕｌｔ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ）、Ｓａｏｓ－２細胞（ｈｕｍａｎ　ｂｏｎｅ　ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、Ｈ３５７細胞（ｈｕｍａｎ　ｈｅａｄ　ａｎｄ　ｎｅｃｋ　ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）、２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ：ｈｕｍａｎ　ｋｉｄｎｅｙ）が挙げられるが、これらに制限されない。かかる細胞の中では、幹細胞として維持するための物質の分泌が可能であるという観点から、フィーダー細胞が好ましく、さらに、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ、白血球遊走阻止因子）の分泌も可能であるという観点から、ＳＮＬ細胞がより好ましい。
　また、細胞分裂を停止させるという観点から、これらの細胞は放射線照射や抗生物質処理（例えば、マイトマイシンＣ処理）を施して用いることが好ましい。
　さらに、本発明に用いられる分泌用細胞としては、該細胞への前記「細胞初期化因子」の取り込みを阻害し、該細胞の初期化を抑制しつつ、標的細胞の前記「細胞初期化因子」の取り込み効率を亢進させるという観点から、前記「蛋白質導入ドメイン」を認識する受容体（例えば、ＴＡＴに対するヘパリン）が不活化されている細胞であることが好ましい。かかる「蛋白質導入ドメイン」を認識する受容体を不活化した細胞は適宜公知の技術、例えば、前記「蛋白質導入ドメイン」を認識する受容体をノックアウト若しくはノックインした動物の作製及び該動物からの培養細胞の樹立、又は前記「蛋白質導入ドメイン」を認識する受容体に対するｓｉＲＮＡの作製及び細胞への導入等の方法を適宜選択して調製することができる。
　なお、かかる「分泌用細胞」の培養条件としては、各細胞の増殖等に適するよう確立された公知の条件を適宜採用することができる。
　また、融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を調製するためには、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持するベクターを前記分泌用細胞に導入すればよい。用いられる「ベクター」としては、前記分泌用細胞に導入することができ、前記融合タンパク質を該細胞において発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、プラスミドＤＮＡ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等に、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を挿入したＤＮＡを用いることができる。また、かかるプラスミドＤＮＡ等としては、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を発現させるために、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡシグナル、薬剤耐性遺伝子等の選択マーカー等の配列を有していることが望ましい。
　さらに、前記分泌用細胞に前記ベクターを導入する方法としては、公知の遺伝子導入方法を適宜採用することができる。例えば、前記プラスミドＤＮＡを導入する方法として、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法を採用することができる。また、前記ウィルスベクターを導入する方法として、例えば、リン酸カルシウム法等のプラスミドＤＮＡを導入する方法により前記ウィルスベクターをパッケージング細胞に導入して得られたウィルス粒子を含有する培地上清を、前記細胞初期化因子分泌細胞に接触させる方法を用いることができる。かかる方法により調製された前記分泌用細胞における、前記融合タンパク質の発現は一過性なものであっても恒常的なものであってもよい。
　次に、本発明の誘導型多能性幹細胞の製造方法における工程（ｂ）について説明する。本発明に係る工程（ｂ）は、工程（ａ）において調製された細胞から分泌される融合蛋白質を、誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞に導入するために、当該誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞と、工程（ａ）において調製された細胞とを共培養するか、または、当該誘導型多能性幹細胞に誘導するための細胞に対して、工程（ａ）において調製された細胞の培養上清を接触させる工程である。
　本発明において用いられる「誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞」（標的細胞）としては動物由来の体細胞であれば特に制限されることなく、例えば、ヒト及び非ヒト動物細胞（マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリ等）由来の体細胞（例えば、線維芽細胞、上皮細胞、血球系細胞、動物検体由来の任意の細胞）を用いることができる。
　また、本発明において用いられる「共培養」の方法としては特に制限されることはなく、例えば、細胞培養容器に本発明の工程（ａ）において調製された細胞を播種して付着させた後、その上に標的細胞を播種して培養する方法、（ａ）において調製された細胞と標的細胞とを同時に細胞培養容器に播種して培養する方法が挙げられる。なお、かかる共培養の条件としては特に制限されることなく、各細胞に適した公知の条件を用いることができる。
　また、本発明において用いられる「培養上清を接触させる」方法としては特に制限されることはなく、例えば、工程（ａ）において調製された細胞の培養中の培養上清をそのまま標的細胞に添加する方法、工程（ａ）において調製された細胞の培養上清を一旦冷蔵又は凍結保存し、再度細胞培養に適した温度（例えば３７℃）に戻した後に標的細胞に添加する方法が挙げられる。
　また、かかる「培養上清」を調製するのに用いられる培地の基礎培地としては、本発明の方法により誘導型多能性幹細胞を製造し維持できるものであれば特に制限はない。例えば、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９、ＨＡＭ、ＡＴＣＣ－ＣＲＣＭ３０、ＤＭ－１６０、ＤＭ－２０１、ＢＭＥ、ＳＦＭ－１０１、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ
５Ａ、Ｌｅ ｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５、ＲＩＴＣ８０－７、ＨＦ－Ｃ１、ＭＣＤＢ１０７、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ７５２／１、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４
ＳＦＭが挙げられる。また、ＥＳ細胞培養用等に改変された培地を用いてもよく、前記基礎培地の混合物を用いてもよい。かかる培地は、必要に応じて、添加物を含んでいてもよい。添加物としては、例えば、血清、血清の代替添加物（例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））、成長因子、ＬＩＦ、トランスフェリン等の鉄、ポリアミン類、ミネラル、糖類（例えばグルコース等）、有機酸、血清蛋白質、Ｌ－グルタミン等のアミノ酸、還元剤、ビタミン類、ステロイド、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）、栄養添加物が挙げられる。
　さらに、本発明の誘導多能性幹細胞の製造方法においては、既存の方法（例えばレトロウィルスによる細胞初期化因子の導入方法）と組み合わせて用いてもよい。例えば、後述の図１０で示すように、レトロウィルスにより、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４をコードするＤＮＡを標的細胞に導入した後、Ｏｃｔ３／４を蛋白質として本発明の方法により導入し、誘導多能性幹細胞を樹立するということも可能である。
　以上、本発明の誘導多能性幹細胞の製造方法の好適な実施形態について説明したが、かかる製造方法によって誘導多能性幹細胞を樹立することができたかを確認する方法としては公知の方法を適宜採用することができる。例えば、ＥＳ細胞のマーカー（例えば、ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－４、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４）の発現やメチル化状態を解析する方法、アルカリフォスファタ―ゼ染色方法、本発明の製造方法で得られた細胞をヌードマウス等の免疫不全マウス（又は免疫寛容マウス）に移入し、テラトーマ形成能を解析する方法が挙げられる。
　また、本発明の製造方法は、後述の図１５で示すように、ｃ－Ｍｙｃを用いずに、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（３因子）を用いて誘導多能性幹細胞を樹立する場合でも、レトロウィルスによる誘導多能性幹細胞の製造方法と比較して、遜色ない樹立効率を示している。したがって、本発明の製造方法は、高い樹立効率を示しつつ、高い安全性を有する（癌化の危険が少ない）ｉＰＳ細胞が得られるという点においても優れている。
　さらに、本発明の製造方法は、後述の図１１、１３、１６及び１８で示すように、細胞初期化因子をタンパク質として体細胞に導入する公知の方法（非特許文献１０～１３、特許文献１０～１４）と比較して、誘導多能性幹細胞を樹立するまでの期間が短い。したがって、本発明の製造方法は、タンパク質として細胞初期化因子を導入する公知の方法と比較して、手間と時間とコストがかからないという点においても優れている。
　次に、本発明のキットについて説明する。本発明のキットは、前述の本発明の誘導多能性幹細胞の製造方法に用いられるキットであって、下記（ａ）から（ｃ）の少なくとも一つを含むキットである。
（ａ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持するベクター
（ｂ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持する細胞
（ｃ）（ｂ）の細胞の培養上清
　「ベクター」、「細胞（分泌用細胞）」、「培養上清」は前述の通りであり、これらの他に、本キットを使用する際の説明書、「ベクター」を細胞に導入するための試薬、本キットにより誘導多能性幹細胞が樹立できたかどうかを確認するための試薬（ＥＳ細胞のマーカー遺伝子を増幅するためのプライマーセット、ＥＳ細胞のマーカータンパク質を認識する抗体、アルカリフォスファタ―ゼ染色用試薬等）が含まれていてもよい。
　次に、本発明の誘導型多能性幹細胞について説明する。本発明の誘導型多能性幹細胞は、前述の本発明の誘導多能性幹細胞の製造方法によって製造される細胞であって、細胞初期化因子がゲノム中に外来的に挿入されていないことを特徴とする誘導型多能性幹細胞である。本発明の製造方法により製造された誘導型多能性幹細胞は、癌化のリスクが少なく安全性が高いという観点から、ｃ－Ｍｙｃを除いた他の細胞初期化因子を本発明の方法により標的細胞によって導入して得られる誘導型多能性幹細胞であることが好ましい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例において用いた各細胞の培養、並びにレトロウィルスによる各細胞への形質導入は下記方法に沿って行った。
　＜細胞培養＞
　ヒト皮膚線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦ）はＣｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＳＩＧＭＡ社製）にて、ゼラチンコートディッシュ上で培養した。
　後述の本発明の方法によって樹立したヒト誘導型多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）クローンは、放射線照射したマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）又はＳＮＬ細胞上にて、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培地を用いて維持した。
　なお、ｈＥＳＣ培地は、２０％ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ）、０．１ｍＭ　６－メルカプトエタノール、２ｍＭ　Ｌ‐グルタミン、０．１ｍＭ　非必須アミノ酸（これら全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及び５ｎｇ／ｍｌ　ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｗａｋｏ社製）を添加した、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ－１２ハム（ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＳＩＧＭＡ社製）からなる。
　さらに、前記の通り、ＳＮＬ細胞及びＭＥＦは、フィーダ細胞として利用するため、ヒトｉＰＳ細胞を樹立する際には、放射線照射（５０Ｇｙ）によってこれらの分裂を不活性化して用いた。また、マウスｉＰＳ細胞を樹立する際には、これらの細胞を、マイトマイシンＣ処理（ＭＭＣ処理：最高濃度１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンにて、３７度で２時間、細胞を処理）することによって、これら細胞の分裂を不活性化して用いた。
　また、ｈｉＰＳＣ及びｈＥＳＣは２０％ＫＳＲ、０．２５％トリプシン及び１ｍＭＣａＣｌ２添加ＰＢＳを用いて継代した。
　ＭＥＦは、分離したＣ５７ＢＬ／６及びＩＣＲマウス胎児（妊娠１２．５日目）から樹立した。さらに、Ｏｃｔ４プロモーターによって発現が制御されているＥＧＦＰ遺伝子を含むＭＥＦはトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６及びＩＣＲマウス胎児から得た。
　ＳＮＬ細胞はＭＥＦと同様の条件にて培養した。すなわち、ＭＥＦ及びＳＮＬ細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ　ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭにて培養した。
　樹立したマウス誘導型多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）クローンは、ＭＭＣ処理したＭＥＦ又はＳＮＬ細胞上にて、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）培地を用いて維持した。
　なお、ｍＥＳＣ培地は、１５％ＫＳＲ、０．１ｍＭ　６－メルカプトエタノール、０．１ｍＭ　非必須アミノ酸、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ社製）、２ｍＭ　Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン及び１０３Ｕ／ｍｌ　ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ（登録商標）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）からなる。
　また、ｍｉＰＳＣｓは０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、単一細胞懸濁液にして継代した。
　なお、これら全ての細胞（ＨＤＦ、ＳＮＬ、ｉＰＳＣ及びＥＳＣ）は、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。
　＜レトロウィルスによる形質導入＞
　先ず、ＧＣｓａｍバイシストロニックバックボーンベクターを用いて、各細胞初期化因子を発現できるようにレトロウィルスベクターを構築した。次いで、各レトロウィルスベクターをパッケージング細胞に導入し、ウィルス上清を調製した。
　そして、ｍｉＰＳＣｓを作製するために、２０μｇ／ｍｌ　プロタミン存在下にて前記ウィルス上清を用いて、Ｏｃｔ４プロモーターによって発現が制御されているＥＧＦＰ遺伝子を含むＭＥＦに細胞初期化因子を形質導入した。次いで、ウィルス感染したＭＥＦを、新鮮な培地（１０％ＦＢＳ及び１％ＰＳＧ（ペニシリン、ストレプトマイシン及びＬ‐グルタミン）含有ＤＭＥＭ）にて毎日培地交換しながら培養した。形質導入してから３日目に、培養培地をｍＥＳＣ培地に置き換えると共に、ＭＭＣ処理ＭＥＦｓの上に前記ウィルス感染したＭＥＦをリプレート（ｒｅｐｌａｔｅ）した。その翌日より、ＥＧＦＰ＋（発現）コロニーが観察されるまで、一日おきに培地を新しいものに交換し続けた。
　そして、リプログラミング（初期化）効率を推測するためにＥＧＦＰ＋コロニーを数え、安定したｉＰＳＣクローン樹立のためにピックアップした。
　また、ｈｉＰＳＣｓを作製するために、２０μｇ／ｍｌ　プロタミン存在下にて前記ウィルス上清を用いて、ＨＤＦに細胞初期化因子を形質導入した。形質導入後５日目に、ＨＤＦ細胞を放射線照射ＭＥＦｓに播き直した。その翌日、培養培地をｈＥＳＣ培地に交換し、ヒトｉＰＳＣコロニーが観察されるまで一日おきに新たな培地を補充し続けた。
　（実施例１）
　＜形質導入可能な細胞初期化因子を分泌するＳＮＬ細胞の作製＞
　細胞外分泌シグナルとしてＩｇＫリーダー配列を、プロテアーゼ認識配列としてフューリン認識配列（ＲＡＲＲ）を、蛋白質導入ドメインとしてＴＡＴ配列（野生型）を選択し、これら機能的ペプチド配列と、細胞初期化因子等とを含む融合タンパク質（形質導入可能な細胞初期化因子等）をコードするＤＮＡが導入された細胞を下記方法にて調製した。
　また、図３に示す通り、細胞初期化因子　ｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４、並びにＴＡＴ配列の野生型のアミノ酸配列は、フューリン認識部位を有しているため、これらポリペプチドはフィーダ細胞からの分泌の過程において切断されることが予想される。そこで、このフューリンによる消化を回避し、形質導入可能な組換えタンパク質分泌システムの効率を亢進させるために、ｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２、ｈＫＬＦ４及びＴＡＴ配列のフューリン耐性を示すアミノ酸変異体も調製した（図４及び５　参照）。すなわち、ｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ及びｈＫＬＦ４については、フューリン認識部位をノックダウンしたアミノ酸変異体　ｈｃ－ＭＹＣ　Ｒ３６７Ｋ　Ｒ４２４Ｑ、ｈＳＯＸ２　Ｒ４３Ｑ　Ｒ１１４Ｑ及びｈＫＬＦ４　Ｒ３７７Ｓを各々作製し、さらにｈＫＬＦ５はフューリン認識部位を欠損しているため、ｈＫＬＦ４の変異体として調製した。また、ＴＡＴ配列については、フューリン耐性を示す組換え体として報告されているＴＡＴ４及びＴＡＴｋ配列を調製した（ＴＡＴ４配列については、Ａｌａｎ　Ｈｏら、ＣＡＮＣＥＲ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ、２００１年１月１５日、６１巻、２号、４７４～４７７ページ　参照。ＴＡＴｋ配列については、Ｍａｒｃｅｌｌａ　Ｆ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｈｅｒａｐｙ、２００９年２月、１７巻、２号、３３４～３４２ページ　参照）。
　具体的には、先ず、種々のタンパク質とＴＡＴ配列（野生型）とが融合している融合タンパク質をコードするＤＮＡが含まれているｐＴＡＴ－ＨＡベクターシリーズを構築した。すなわち、ＴＡＴ配列に、ｃ－ＭＹＣ、ｃ－ＭＹＣ　Ｒ３６７Ｋ　Ｒ４２４Ｑ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＯＸ２　Ｒ４３Ｑ　Ｒ１１４Ｑ、ＫＬＦ５又はクサビラオレンジ（Ｋｕｓａｂｉｒａ　Ｏｒａｎｇｅ）が融合している融合タンパク質を動物細胞にて発現させることができるベクターシリーズを構築した。また、ｐＴＡＴ－ＨＡベクターはＤｒ．Ｓｔｅｖｅｎ　Ｆ　Ｄｏｗｄｙから提供して頂いたものを使用した。
　次に、ｐＴＡＴ－ＨＡベクター中のＴＡＴ配列（野生型）をコードするＤＮＡ配列を、ＴＡＴ４配列又はＴＡＴｋ配列に対応するＤＮＡ配列に置換した。そして、ＴＡＴ４配列又はＴＡＴｋ配列を含む組換えタンパク質を分泌させるためのプラスミドベクターを構築するために、ＴＡＴ４‐ＨＡ‐融合パートナー又はＴＡＴｋ‐ＨＡ‐融合パートナーに対応する配列をコードするカセットを、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクターにクローニングした。なお、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクターは、特に組換えタンパク質の分泌用として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって開発されたベクターである。
　また、ＴＡＴ４／ＴＡＴｋ配列をコードするＤＮＡを含有しないプラスミドベクターを構築するために、細胞初期化因子各々のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅にて作製し、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂにダイレクトクローニングした。
　そして、このように構築した前記ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ由来ベクターをＳＮＬ細胞（ＳＮＬ親細胞）にトランスフェクションし、続いて最長２１日間、前記ベクターが耐性を示す薬剤　２００μｇ／ｍｌ　ゼオシンによる選択を行い、各組換えタンパク質を安定して発現することができるＳＮＬ細胞株（以下、「改変ＳＮＬ細胞」とも称する）を樹立した。
　（実施例２）
　＜マウスｉＰＳ細胞の作製＞
　先ず、本発明の方法によって、ＭＥＦからｍｉＰＳＣを作製するために、各改変ＳＮＬ細胞にＭＭＣ処理を施し、フィーダ細胞として調製した。そして、標的細胞に導入する細胞初期化因子の組み合わせに合わせて、適宜これらフィーダ細胞をリプレートし、改変ＳＮＬフィーダ細胞の混合物を調製した。
　また、形質導入可能な細胞初期化因子等を含有する馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ（ＣＭ））を調製するために、改変ＳＮＬフィーダ細胞の混合物をもう１セット別に用意し、４ｘ１０６個を培地（ＤＭＥＭ又はｍＥＳＣ培地）とともにＴ‐７５フラスコに播き、一晩インキュベーションした。その翌日、得られた培地を回収しつつ、新たな培地を補充した。次いで、回収した一晩培養後の培養培地はフィルトレーション（孔径：０．４５μｍ）し、後述の培養に直ぐに用いるか、－３０℃にて保存した。また、このように調製したＣＭには、使用する直前に５ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加した。
　次に、このようにして調製した改変ＳＮＬフィーダ細胞の混合物及び／又はＣＭを用いて、標的細胞であるＭＥＦに細胞初期化因子等を形質導入するために、ＤＭＥＭを用いて調製したＣＭにてＭＥＦをインキュベーションし、その翌日もＤＭＥＭを用いて調製した新鮮なＣＭをＭＥＦに与えた。
　次いで、形質導入後３日目に、改変ＳＮＬフィーダ細胞の混合物又はＳＮＬ親細胞の上にＭＥＦを播き直した。なお、この日以降、ＣＭはＤＭＥＭの代わりにｍＥＳＣ培地を用いて調製したものを使用し、回収したてのＣＭ（改変ＳＮＬフィーダ細胞の混合物に新鮮なｍＥＳＣ培地を与え、１日おいた培地）に毎日交換し、又は交換することなく、細胞培養を維持した。
　そして、細胞初期化因子（野生型）をＭＥＦに形質導入した場合には、マウスｉＰＳＣを作製するために、Ｅ－カドヘリン及びＳＳＥＡ－１を発現している細胞画分をソーティングし、標準的なｍＥＳＣ培地と共にＭＭＣ処理ＭＥＦフィーダ細胞の上に播き直した（図１１参照）。
　一方、細胞初期化因子（変異型）をＭＥＦに形質導入した場合には、ＥＧＦＰ＋コロニー数をアレイスキャンＶＴ１ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）リーダー（ＡｒｒａｙＳｃａｎ　ＶＴＩ　Ｈｉｇｈ　Ｃｏｎｔｅｎｔ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　（ＨＣＳ）　Ｒｅａｄｅｒ、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社製）を用いて数え、選択したコロニーをピックアップし、標準的なｍＥＳＣ培地と共にＭＭＣ処理ＭＥＦフィーダ細胞の上に播き直した（図１３参照）。
　（実施例３）
　＜ＨＤＦからヒトｉＰＳ細胞の作製＞
　本発明の方法によってｈｉＰＳＣを作製するために、細胞源としてＨＤＦを用い、ｍＥＳＣ培地の代わりにｈＥＳＣ培地を用いた以外は、前記＜マウスｉＰＳ細胞の作製＞に記載の方法と同様にして行った。また、形質導入したＨＤＦには新たなＣＭを毎日補充した。
　そして、ＳＳＥＡ－４を発現している細胞画分をソーティングし、１０μＭ　ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２、Ｗａｋｏ社製）を添加した標準的なｈＥＳＣ培地と共に放射線照射ＭＥＦフィーダ細胞の上に播き直し、ｈｉＰＳＣコロニーが観察されるまで、新鮮なｈＥＳＣ培地に毎日交換し続けた。細胞初期化因子（野生型）をＨＤＦに形質導入し、ｈｉＰＳＣ（ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞）を得るまでの過程については図１６に示し、細胞初期化因子（変異型）をＨＤＦに形質導入し、ｈｉＰＳＣ（ＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞）を得るまでの過程については図１８に示す。
　（実施例４）
　＜ヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞からヒトｉＰＳ細胞の作製＞
　また、細胞源としてＨＤＦの代わりにヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞を用いて、ｈｉＰＳＣを作製するために、５０ｎｇ／ｍｌ　ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びヒトＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３－Ｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）のカクテルを添加した適切な培地を用いて、前記同様に調製したＣＭにてヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞を５日間培養し、処理した。
　その後、細胞を同ＣＭと共に改変ＳＮＬフィーダ細胞の混合物上にリプレートし、その翌日から、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、ヒトＴＰＯ及びヒトＦＬＴ３－Ｌのカクテルを添加したｈＥＳＣ培地を用いて、前記同様に調製したＣＭにて培養した。
　そして、ＳＳＥＡ－４を発現している細胞をソーティングし、１０μＭ　ＲＯＣＫ阻害剤を添加したｈＥＳＣ培地にて培養した。また、ｈｉＰＳコロニーが観察された後、細胞はｈＥＳＣ培地のみにて培養した。
　このようにして調製した各細胞（実施例１に記載の改変ＳＮＬ細胞、実施例２～４に記載のｉＰＳ細胞）については、その特性等を以下のようにして評価した。
　＜蛋白質導入ドメインによる形質導入性の評価１＞
　蛋白質導入ドメインによる分泌型組換えタンパク質の形質導入性を評価するために、クサビラオレンジ（ＫＯ）を融合させたＴＡＴ４（ＴＡＴ４－ＫＯ）、ＴＡＴｋ（ＴＡＴｋ－ＫＯ）及びノナアルギニン（Ｒ９－ＫＯ）をコードするｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ由来のベクターをＳＮＬ細胞に導入した。なお、ノナアルギニン（Ｒ９）はフューリンによって分解されることが知られている。そして、２００μｇ／ｍｌ　ゼオシンによる選択の後、３種類のＳＮＬ細胞（ＴＡＴ４－ＫＯ－ＳＮＬ細胞、ＴＡＴｋ－ＫＯ－ＳＮＬ細胞、Ｒ９－ＫＯ－ＳＮＬ細胞）を観察し、各ＳＮＬ細胞から分泌された組換えタンパク質の各ＳＮＬ細胞自体への形質導入（自己形質導入（ｓｅｌｆ－ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ））の程度を評価した。得られた結果を図６に示す。
　図６に示した結果から明らかなように、組換えＫＯの発現はＴＡＴ４－ＫＯ－ＳＮＬ細胞及びＴＡＴｋ－ＫＯ－ＳＮＬ細胞の細胞内全体（細胞質）にて観察された（図６　左側及び真ん中のパネル　参照）。一方、Ｒ９－ＫＯ－ＳＮＬ細胞に関しては、特定の細胞小器官（小胞体及びゴルジ装置）においてＫＯの発現が観察され、細胞質におけるＫＯシグナルは示されなかった（図６　右側のパネル　参照）。なお、この要因は、Ｒ９が小胞体等においてフューリンによって消化されてしまっため、ＫＯ組換えタンパク質の分泌が困難になってしまったことにあると推測される。
　従って、これらの結果から、ＳＮＬ細胞株はフューリンを含有しており、ＴＡＴ４組換えタンパク質又はＴＡＴk組換えタンパク質を用いることによって、ＰＴＤ－タンパク質分泌システムにおいて、標的細胞への全体的な形質導入性を増強できることが示された。
　＜蛋白質導入ドメインによる形質導入性の評価２＞
　蛋白質導入ドメインによる分泌型組換えタンパク質の形質導入性を評価するために、ＴＡＴ４－ＫＯ又はＴＡＴｋ－ＫＯを分泌するＳＮＬ細胞をＪｕｒｋａｔ細胞と一晩共培養した。そして、その翌日、Ｊｕｒｋａｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析した。得られた結果を図７に示す。
　図７に示した結果から明らかなように、ＴＡＴ４－ＫＯ又はＴＡＴｋ－ＫＯを分泌するＳＮＬ細胞と共培養したＪｕｒｋａｔ細胞においては、明確にＫＯ由来の蛍光強度が確認された（図７　真ん中及び右側のドットプロット図　参照）。
　従って、各ＳＮＬ細胞から分泌された組換えタンパク質は、各ＳＮＬ細胞とは異なる細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）にも効率良く形質導入されており、図６に示した結果同様に、フューリンに対して耐性を示すＴＡＴ４及びＴＡＴｋは標的細胞に対しても高い形質導入性を有していることが実証された。
　＜フューリン耐性を示すアミノ酸変異体の評価＞
　前述の通り、細胞初期化因子　ｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４の野生型のアミノ酸配列は、フューリン認識部位を有しているため、これらポリペプチドはフィーダ細胞からの分泌の過程において切断されることが予想される（図３　参照）。そこで、実際に野生型のアミノ酸配列からなるタンパク質がフューリンによって切断されるかどうかをウェスタンブロッテイングによって確認した。得られた結果を図８に示す。
　また予想されるフューリンによる消化を回避し、形質導入可能な組換えタンパク質分泌システムの効率を亢進させるために、フューリン認識部位を不活化したｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２ｈＫＬＦ４のアミノ酸変異体（図４及び５　参照）を調製し、これら変異体のフューリンに対する耐性をウェスタンブロッテイングによって評価した。得られた結果を図９に示す。
　なお、ウェスタンブロッティングは以下の通りに行った。すなわち先ず、改変ＳＮＬ細胞を２４ウェル（穴）プレートに播種した。そして、その翌日、培養培地を血清非含有ＤＭＥＭ培地に置き換えた。次いで、その２４時間後に培地を回収し、ビバスピン２カラム（Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２　ｃｏｌｕｍｎ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製、ＶＳ０２９１）によって濃縮した。得られた各濃縮培地１０μｌを、下記分子に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。
ｃ－ＭＹＣ（ｃ－ＭＹＣに対する抗体：Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、コード番号　５６０５又はＳａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社製、カタログ番号　ｓｃ－７６４）、ＯＣＴ４（ＯＣＴ４に対する抗体：Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、コード番号　２８４０）、ＳＯＸ２（ＳＯＸ２に対する抗体：Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、コード番号　３５７９）、ＫＬＦ５（ＫＬＦ５に対する抗体：Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号　ＡＦ３７５８）。
　そして、各々のタンパク質を対応する一次抗体でプローブし、次いで西洋ワサビぺルオキシダーゼ結合抗マウス／ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）と共にインキュベーションした。また、各々のバンドは、ＥＣＬプラスウェスタンブロッティング検出システム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて可視化した。
　図８に示した結果から明らかなように、ＴＡＴ４又はＴＡＴｋと融合させて分泌させたｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４においては、各々予想されるフューリンによる分解産物の分子量のバンドが確認された。従って、ＳＮＬ細胞によって分泌された野生型のｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦはフューリンによって切断されていることが実証された。
　図９のaに示した結果から明らかなように、フューリン感受性のＴＡＴ４－ｃ－ＭＹＣにおいては、図８に示した結果同様に分解された画分が確認された。一方、フューリン耐性のＴＡＴ４－ｃ－ＭＹＣ　Ｒ３６７Ｋ　Ｒ４２４Ｑにおいては分解された画分が確認されなかった。また、ＴＡＴ４を融合していない形質導入不可能な形態（ｃ－ＭＹＣ（ＴＡＴ４－）、ｃ－ＭＹＣ　Ｒ３６７Ｋ　Ｒ４２４Ｑ（ＴＡＴ４－））においても同様のパターンが確認された。
　さらに図９のｂに示した結果から明らかなように、野生型のアミノ酸配列においてもフューリン認識配列が認められないＯＣＴ４においては、ＴＡＴ４－ＯＣＴ４及びＯＣＴ４（ＴＡＴ４－）において、分解された画分は確認されなかった。
　また図９のcに示した結果から明らかなように、ＴＡＴ４－ＳＯＸ２は分解されていた。しかし、ＴＡＴ４－ＳＯＸ２　Ｒ４３Ｑ　Ｒ１１４Ｑは分解されていなかった。同様に、ＳＯＸ２（ＴＡＴ４－）は分解されていたが、ＳＯＸ２　Ｒ４３Ｑ　Ｒ１１４Ｑ（ＴＡＴ４－）は分解されていなかった。
　また図９のｄに示した結果から明らかなように、ＴＡＴ４－ＫＬＦ５及びＫＬＦ５（ＴＡＴ４－）において、分解された画分は確認されなかった。
　＜ＴＡＴ４／ＴＡＴｋ－ｈＯＣＴ４についての機能試験＞
　フューリン認識部位を有さない、分泌されたＴＡＴ４－ｈＯＣＴ４又はＴＡＴｋ－ｈＯＣＴ４タンパク質の機能性を、ＨＤＦを用いたｈｉＰＳＣ作製において評価した。具体的には、ｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４をレトロウィルスによって形質導入したＨＤＦを、ＴＡＴ４－ｈＯＣＴ４又はＴＡＴｋ－ｈＯＣＴ４タンパク質を分泌する改変ＳＮＬ細胞株（ＳＰ－ＴＡＴ４－ｈＯＣＴ４又はＳＰ－ＴＡＴｋ－ｈＯＣＴ４）と共培養し、その形態学的変化、アルカリホスファタ―ゼ（ＡＰ）染色を観察した。得られた結果を図１０に示す。
　なお、ＡＰ染色はアルカリホスファタ―ゼ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ社製、ＳＫ－５１００、ＳＫ－５２００）を用い、そのメーカーの使用説明書に従って行った。
　図１０に示した結果から明らかなように、ＳＰ－ＴＡＴ４－ｈＯＣＴ４又はＳＰ－ＴＡＴｋ－ｈＯＣＴ４上にて培養し、ｈＯＣＴ４を除く細胞初期化因子（ｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４）をレトロウィルスによって形質導入したＨＤＦにおいては、いくつかの形態学的変化、例えば細胞膜の薄膜化、細長状から円形状への変化が確認された。また、注目すべきことに、ＡＰ染色によって、ＡＬＰ活性を示すいくつかの細胞も確認された。従って、ＳＮＬ細胞株から分泌されたＴＡＴ４／ＴＡＴｋ－ｈＯＣＴ４は標的細胞にリプログラミング効果をもたらすことが明らかになった。
　なお、ｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４をレトロウィルスによってＨＤＦに形質導入したが、ｉＰＳＣ様コロニーの形成は確認されなかった（図１０　Ｒｅｔｒｏ－Ｍ，Ｓ，Ｋ　参照）。一方、ＳＮＬ親細胞株と共に培養し、ｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４に加え、ｈＯＣＴ４をレトロウィルスによって形質導入した場合、従前の報告（非特許文献９）通り、典型的なｉＰＳＣコロニーが出現が確認された（図１０　Ｒｅｔｒｏ－４　Ｆａｃｔｏｒｓ　参照）。
　＜分泌型細胞初期化因子（野生型）によるマウスｉＰＳ細胞の構築＞
　形質導入可能な分泌型細胞初期化因子（野生型）のみを用いて、マウスｉＰＳ細胞ができるかどうかを調べた。すなわち、図１１に示す通り、ＴＡＴ４に融合している細胞初期化因子を各々分泌している４種のＳＮＬフィーダ細胞の混合物と共に、ＴＡＴ４融合細胞初期化因子の混合物を含むＣＭにてＭＥＦを培養した。さらに、Ｅ－カドヘリン及びＳＳＥＡ－１発現細胞をソーティングして培養した結果、ｍｉＰＳＣのコロニーを得ることができた。
　そして、このようにして得られたｍｉＰＳＣの特性について、ＡＰ染色及び免疫細胞化学的染色（ＳＳＥＡ－１染色）にて分析した。得られた結果を図１２に示す。なお免疫細胞化学染色は以下の通り行った。
　先ず、細胞を、室温下１５分間、４％パラホルムアルデヒドにて固定した。そして４％正常ヤギ血清含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて洗浄した。
　次いで、以下の抗体と固定化した細胞とを反応させた。
抗ＳＳＥＡ－１抗体（ａｂｃａｍ社製、ａｂ１６２８５、希釈率＝１：１００）、
フィコエリスリン結合　抗ＳＳＥＡ－４抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＦＡＢ１４３５Ｐ、希釈率＝１：１００）、
ＥＳ細胞キャラクタリゼーションキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＳＣＲ００１）含有；抗ＴＲＡ－１－６０抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＭＡＢ４３６０、希釈率＝１：１００）及び抗ＴＲＡ－１－８１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＭＡＢ４３８１、希釈率＝１：１００）。
　また、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５４６結合　抗マウスＩｇＭ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ａ２１０４５、希釈率＝１：２５０）を、抗ＳＳＥＡ－１抗体、抗ＴＲＡ－１－６０抗体及び抗ＴＲＡ－１－８１抗体を検出するための二次抗体として用い、免疫細胞化学染色を行った。
　図１２に示した結果から明らかなように、改変ＳＮＬ細胞株から分泌された、ＴＡＴ４に融合している細胞初期化因子４種（野生型）をＭＥＦに形質導入することによって得られたｍｉＰＳＣにおいて、典型的なｉＰＳ細胞様コロニーが観察された。また、多能性幹細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼ及びＳＳＥＡ－１の発現が確認された。
　＜分泌型細胞初期化因子（変異型）によるマウスｉＰＳ細胞の構築＞
　形質導入可能な分泌型細胞初期化因子（フューリンに対して耐性を示す変異型）のみを用いて、マウスｉＰＳ細胞ができるかどうかを調べた。すなわち、図１３に示す通り、ＴＡＴ４融合している細胞初期化因子（変異型）を各々分泌している４種のＳＮＬフィーダ細胞の混合物と共に、ＴＡＴ４融合細胞初期化因子（変異型）の混合物を含むＣＭにて、Ｏｃｔ４プロモーターによって発現が制御されているＥＧＦＰ遺伝子（ｐＯＣＴ４－ＥＧＦＰ）を含むＭＥＦを培養した。その結果、約９日目にＯＣＴ4－ＥＧＦＰ＋コロニーの発現が初めて確認された。
　そして、このようにして得られたｍｉＰＳＣの特性について、ｐＯＣＴ４－ＥＧＦＰのシグナル観察、ＡＰ染色及び免疫細胞化学染色（ＳＳＥＡ－１染色）にて分析した。なお免疫細胞化学染色は前記の通り行った。得られた結果を図１４に示す。
　図１４に示した結果から明らかなように、改変ＳＮＬ細胞株から分泌された、ＴＡＴ４に融合している細胞初期化因子４種（変異型）をＭＥＦに形質導入することによって得られたｍｉＰＳＣにおいて、多能性幹細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼ及びＳＳＥＡ－１の発現が確認された。また、ｐＯＣＴ４－ＥＧＦＰの持続的な発現も観察され、このｍｉＰＳＣの多分化能は安定しており、強いものであることが明らかになった。
　＜改変ＳＮＬ細胞株を用いた様々な条件下でのｍｉＰＳＣ作製の効率比較＞
　下記に示す様々な条件にて改変ＳＮＬ細胞株によるｍｉＰＳＣ作製の効率を、アレイスキャンＶＴ１　ＨＣＳリーダー（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社製）を用いて調べた。なお、細胞源としてはｐＯＣＴ４－ＥＧＦＰを含むＭＥＦを用い、ＴＡＴ４配列を蛋白質導入ドメインとして用い、図１１及び１３に示した方法に準じてｍｉＰＳＣを作製した。得られた結果を図１５に示す。
　なお、図１５中の棒グラフは、１×１０５ＭＥＦから作製されたＯＣＴ４－ＥＧＦＰ＋ＥＳ様コロニーの平均数（三重に測定した平均値±標準偏差（ｓ．ｄ））を示す。また平均値についてはグラフの下部にその具体的な数値を示す。さらに、Ｘ軸の表示における略語は各々ｍｉＰＳＣの作製の際の条件を示す。
４：細胞初期化因子として４因子（ｈＯＣＴ４、ｈｃ－ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４）をＭＥＦに導入
３：細胞初期化因子として３因子（ｃ－Ｍｙｃ以外の４因子、すなわち、ｈＯＣＴ４、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４）をＭＥＦに導入
Ｆ：形質導入可能な細胞初期化因子を、ＳＮＬフィーダ細胞の混合物から分泌させることにより、ＭＥＦに導入
ＣＭ：形質導入可能な細胞初期化因子を、ＣＭにて培養することにより、ＭＥＦに導入
Ｒｅｔｒｏ：細胞初期化因子をレトロウィルスによりＭＥＦに導入
ＷＴ：野生型細胞初期化因子をＭＥＦに導入
Ｍｕｔ：フューリン耐性を示す細胞初期化因子の変異体をＭＥＦに導入。
　図１５に示した結果から明らかなように、４因子を導入してｉＰＳ細胞を作製する際の効率において、レトロウィルスを用いて導入する方法（「４，Ｒｅｔｒｏ，ＷＴ」）に比べて、ＳＮＬフィーダ細胞の混合物及び/又はＣＭを用いて導入する方法は劣るものの、３因子を導入してｉＰＳ細胞を作製する際の効率においては、レトロウィルスによる方法（「３，Ｒｅｔｒｏ，ＷＴ」）と比較して、ＳＮＬフィーダ細胞及びＣＭを用いる方法（「３，Ｆ＋ＣＭ，ＷＴ」及び「３，Ｆ＋ＣＭ，Ｍｕｔ」）は遜色ない樹立効率を示した。したがって、本発明の製造方法は高い作製効率を示しつつ、癌化の危険が少ない高い安全性を有するｉＰＳ細胞を作製できる点において優れていることが明らかになった。
　＜分泌型細胞初期化因子（野生型）によるヒトｉＰＳ細胞の構築＞
　形質導入可能な分泌型細胞初期化因子（野生型）のみを用いて、ヒトｉＰＳ細胞ができるかどうかを調べた。すなわち、図１６に示す通り、ＴＡＴ４に融合している細胞初期化因子を各々分泌している４種のＳＮＬフィーダ細胞の混合物と共に、ＴＡＴ４細胞初期化因子の混合物を含むＣＭにて新生児組織由来のＨＤＦを培養した。さらに、ＳＳＥＡ－４発現細胞をソーティングして培養した結果、ｈｉＰＳＣのコロニーを得ることができた。なお、このようにして得られたｉＰＳ細胞をＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞とも称する。
　そして、ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞の特性について、ＡＰ染色及び免疫細胞化学的染色にて分析した。なお免疫細胞化学染色は前記の通り行った。得られた結果を図１７に示す。
　図１７に示した結果から明らかなように、改変ＳＮＬ細胞株から分泌された、ＴＡＴ４に融合している細胞初期化因子４種（野生型）をＨＤＦに形質導入することによって得られたｈｉＰＳＣ（ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞）において、多能性幹細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０及びＴＲＡ－１－８１の発現が確認された。
　＜分泌型細胞初期化因子（変異型）によるヒトｉＰＳ細胞の構築＞
　形質導入可能な分泌型細胞初期化因子（フューリンに対して耐性を示す変異型）のみを用いて、ヒトｉＰＳ細胞ができるかどうかを調べた。すなわち、図１８に示す通り、ＴＡＴ４融合している細胞初期化因子（変異型）を各々分泌している４種のＳＮＬフィーダ細胞の混合物と共に、ＴＡＴ４融合細胞初期化因子（変異型）の混合物を含むＣＭにて、新生児組織由来のＨＤＦを培養した。さらに、ＳＳＥＡ－４発現細胞をソーティングして培養した結果、ｈｉＰＳＣのコロニーを得ることができた。また、このようにして得られたｈｉＰＳＣは図１９に示す通り、典型的なヒトＥＳ／ｉＰＳ様の形態を示した。なお、このようにして得られたｉＰＳ細胞をＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞とも称する。
　そして、前記のようにして得られたＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞については、さらに以下の特性評価を行った。
　＜ＡＰ染色及び免疫細胞化学的染色＞
　ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞について、前記の方法により、ＡＰ染色及び免疫細胞化学的染色を行った。また、これらヒトｉＰＳ細胞のインビトロ分化を行い、胚葉体形成の有無を観察した。すなわち、胚葉体形成を行うために、ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞又はＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞をＳＮＬフィーダ細胞の混合物から解離し、低付着性培養ディッシュ（ｌｏｗ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｄｉｓｈ、Ｓｔｅｒｉｌｉｎ社製）に移し、ｂＦＧＦを含有しないｈＥＳＣ培地にて培養した。得られた結果を図２０に示す。
　図２０に示した結果から明らかなように、本発明の製造方法によって作製したヒトｉＰＳ細胞は典型的なヒトＥＳ様形態を示し、アルカリフォスファターゼ染色も陽性であった。また、ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞は懸濁培養にて、低付着性培養ディッシュに移してから３日後に共に胚葉体の形成が観察された。さらに、多分化能マーカーの発現（ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ）も観察された。なお、マウスの多分化能マーカーであるＳＳＥＡ－１の発現は観察されず、改変ＳＮＬ細胞株に対しては放射線照射を行なっているので、改変ＳＮＬ細胞株からの自己形質導入によるｍｉＰＳＣの形成の可能性は極めて低い。
　＜半定量的ＲＴ－ＰＣＲによるヒトＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現分析＞
　ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞における、ヒトＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現分析を半定量的ＲＴ－ＰＣＲによって行った。すなわち、各細胞から、トータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙ　マイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）により調製し、ハイキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、そのメーカーの使用説明書に従って、逆転写を行った。そして、Ｔａｑ　ＨＳ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）及び表２に示すプライマーを用いて、半定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＲＴ－ＰＣＲ）を行った。得られた結果を図２１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図２１に示した結果から明らかなように、ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞の全てのクローンにおいて、全ての多分化能（ＥＳ細胞）マーカー遺伝子及び内在性ｃ－ＭＹＣ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ５の発現が確認された。
　＜核型分析＞
　ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞の核型を分析するため、標準的なＧバンド染色体検査（Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｇ－ｂａｎｄ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。得られた結果を図２２に示す。
　図２２に示した結果から明らかなように、ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞において、標準的なＧバンド染色体検査によって正常な核型が確認された。
　＜テラトーマ形成＞
　ＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞の多分化能を確認するため、これらの細胞のテラトーマ形成能を調べた。すなわち、先ず麻酔したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ＣＬＥＡ　Ｊａｐａｎ，　Ｉｎｃ．製）の精巣内にＳＰ－ｈｉＰＳＷＴ細胞又はＳＰ－ｈｉＰＳｍｕｔ細胞を注入した。次に注入してから６～８週間後に前記マウスを安楽死させ、腫瘍を解剖した。そして、得られた腫瘍を４％パラホルムアルデヒドにて固定してスライスし、次いで、得られた切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）にて染色し、顕微鏡にて観察した。得られた結果を図２３に示す。
　図２３に示した結果から明らかなように、いずれのヒトｉＰＳ細胞クローン由来のテラトーマにおいて、内胚葉、中胚葉、外胚葉の組織全ての形成が確認された。
　従って、本発明の製造方法によって得られるヒトｉＰＳ細胞についても、高い多分化能を有していることが、遺伝子又はタンパク質レベルでの発現解析においても、形態学的観察においても明らかになった。
　＜ヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞からのｈｉＰＳＣの作製＞
　一般的にＨＤＦやＭＥＦ等の線維芽細胞に比べ、ウイルスを用いずに造血系細胞からｉＰＳ細胞を作製することは困難だと言われている。例えば、Ｈｏｎｇ　Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４６０巻、７２５９号、１１３２～１１３５ページや、Ｔａｋｅｎａｋａ　Ｃ．ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２０１０年、３８巻、１５４～１６２ページに記載されているように、レトロウィルスによってＭＥＦに細胞初期化因子を導入するとｉＰＳ細胞は樹立できるが、同方法によってＴリンパ球等に細胞初期化因子を導入してもｉＰＳ細胞（コロニー）を得ることができなかったことが知られている。そこで、実施例４に記載の方法にて、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞からのｈｉＰＳＣ作製を試み、さらに得られた細胞におけるアルカリフォスファタ―ゼ及びＳＳＥＡ－４の発現を前記方法にて調べた。得られた結果を図２４に示す。
　図２４に示した結果から明らかなように、本発明の製造方法によって、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞由来のｈｉＰＳＣ様コロニーの形成が確認され、さらに得られたｈｉＰＳＣにおいて、アルカリフォスファタ―ゼ及びＳＳＥＡ－４の発現も確認された。
　従って、線維芽細胞のみならず、ウイルスを用いずにｉＰＳ細胞を樹立することが困難である造血系細胞を用いても、本発明の製造方法によって、ｉＰＳ細胞の作製が可能であることが明らかになった。
　以上説明したように、本発明によれば、細胞初期化因子が誘導型多能性幹細胞のゲノム中に挿入されることなく、樹立効率が高く、しかも手間と時間とコストのかからない、誘導型多能性幹細胞の製造方法を提供することが可能となる。
　したがって、本発明の誘導型多能性幹細胞の製造方法、キット、誘導型多能性幹細胞は、誘導型多能性幹細胞を臨床上利用する上で、特に再生医療に利用する上で、極めて有用である。
配列番号１、３、４、６及び７
＜２２３＞　人工的に合成されたポリペプチドの配列
配列番号８～４３
＜２２３＞　人工的に合成されたプライマーの配列

Claims (10)

  1. 　誘導型多能性幹細胞の製造方法であって、
    （ａ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を調製する工程、ならびに
    （ｂ）誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞と、工程（ａ）において調製された細胞とを共培養するか、または、誘導型多能性幹細胞に誘導するための細胞に対して、工程（ａ）において調製された細胞の培養上清を接触させる工程、
    を含む方法。
  2. 　細胞初期化因子が、フューリン認識配列を消失させた、若しくは、フューリン認識配列が存在しないものである、請求項１に記載の方法。
  3. 　細胞初期化因子が、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５－１、ＥＣＡＴ１５－２、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、β－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｓｔａｔ３及びＧｒｂ２からなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　細胞初期化因子が、配列番号：１から５に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質である、請求項３に記載の方法。
  5. 　蛋白質導入ドメインが、フューリン認識配列を消失させた、若しくは、フューリン認識配列が存在しないものである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 　蛋白質導入ドメインがＴＡＴである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 　蛋白質導入ドメインが、配列番号：６から７に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質である、請求項６に記載の方法。
  8. 　融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞がフィーダ細胞である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
  9. 　請求項１から８のいずれかに記載の方法に用いられるキットであって、下記（ａ）から（ｃ）の少なくとも一つを含むキット
    （ａ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持するベクター
    （ｂ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持する細胞
    （ｃ）（ｂ）の細胞の培養上清。
  10. 　請求項１から８のいずれかに記載の方法によって製造され、細胞初期化因子がゲノム中に外来的に挿入されていない、誘導型多能性幹細胞。
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