KR101513254B1 - 트랜스펙션 및 면역자극을 위한 ｒｎａ 및 양이온성 펩타이드의 복합체 - Google Patents

트랜스펙션 및 면역자극을 위한 ｒｎａ 및 양이온성 펩타이드의 복합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 올리고펩타이드와 복합체화된 적어도 하나의 RNA를 포함하는 복합체화된 RNA에 관한 것이며, 여기에서 상기 올리고펩타이드는 그 길이가 8 내지 15개 아미노산이고 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가진다. 본 발명은 또한 세포 또는 생체를 트랜스펙션 시키는 방법에 관한 것이고, 그것에 의해 본 발명 복합체화된 RNA를 적용한다. 부가적으로, 본 발명 복합체화된 RNA를 포함하는 약학 조성물 및 키트 뿐만 아니라, 세포, 조직 또는 생체를 트랜스펙션 시키기 위한 본 발명 복합체화된 RNA의 용도 및/또는 면역 반응을 조절, 바람직하게는 유도 또는 촉진하기 위한 본 발명 복합체화된 RNA의 용도가 본 명세서에서 제공된다.

Description

트랜스펙션 및 면역자극을 위한 ＲＮＡ 및 양이온성 펩타이드의 복합체{COMPLEXES OF RNA AND CATIONIC PEPTIDES FOR TRANSFECTION AND FOR IMMUNOSTIMULATION}
본 발명은 하나 이상의 올리고펩타이드와 복합체화된 적어도 하나의 RNA (분자)를 포함하는 RNA 복합체(complexed RNA)에 관한 것으로서, 여기에서 상기 올리고펩타이드는 8 내지 15개 아미노산의 길이를 가지고, (Arg)l(Lys)m(His)n(Orn)o(Xaa)x의 식을 가진다. 본 발명은 또한 세포 또는 생체를 트랜스펙션하는 방법에 관한 것이고, 이것은 본 발명의 RNA 복합체를 적용하는 것이다. 덧붙여, 세포, 조직 또는 생체를 트랜스펙션 및/또는 면역 반응을 조절, 바람직하게는 유도 또는 촉진하기 위한 본 발명의 RNA 복합체의 용도뿐만 아니라, 본 발명의 RNA 복합체를 포함하는 약학 조성물 및 키트 또한 본 발명에서 제공된다.
유전자 전달의 방법에 의한 핵산의 세포 또는 조직으로의 트랜스펙션은 분자 의학에서 중심적인 방법이며, 많은 질병의 치료 또는 예방에 있어 중요한 역할을 한다. 핵산의 트랜스펙션 방법은 조직 또는 생체의 면역 자극을 유도할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 핵산의 트랜스펙션은 도입된 핵산에 의해 코딩된 정보의 프로세싱, 즉, 바람직한 폴리펩타이드 또는 단백질의 번역(translation)을 야기할 수 있다. 핵산으로서의 DNA 또는 RNA는 유전자 치료의 대안적인 접근법이다. 핵산의 트랜스펙션은 또한 트랜스펙션된 핵산의 종류에 따라 유전자 발현의 조절, 예를 들어, 억제 또는 촉진을 유도할 수 있다. 이러한 핵산의 트랜스펙션은 일반적으로 유전자 전달(gene transfer)의 방법에 의해 수행된다.
세포 또는 조직 내로의 유전자 전달의 방법은 과거 수십 년 동안 집중적으로 연구되어 왔지만, 부분적으로 제한된 성공을 거두었다. 잘 알려진 방법은 순수한(naked) 핵산의 (직접) 주사 또는 유전조절(biolistic) 유전자 전달과 같은 물리적 또는 물리-화학적 방법을 포함한다. 바이오리스틱 유전자 전달(바이오리스틱 입자 충격(biolistic particle bombardment)으로도 알려짐)은 Cornell 대학에서 개발된 방법으로, 유전 물질을 조직 또는 배양 세포 내로 도입할 수 있도록 한다. 바이오리스틱 유전자 전달은 일반적으로 금 또는 은 입자와 같은 표면 코팅 금속 입자에 의해 수행되며, 유전자 건을 사용하여 흡착된 DNA를 포함하는 이러한 금속 입자를 세포 내로 슈팅(shooting)함에 의해 수행된다. 그러나, 바이오리스틱 유전자 전달 방법은 RNA를 이용한 경우에 효과적이지 않았으며, 이것은 아마 그것의 빠른 분해 때문이다. 게다가, 이러한 방법은 in vivo 적용에는 적당하지 않으며, 이것은 실용적 측면에서 매우 심각한 제한이다.
대안적인 물리적 또는 물리-화학적 방법은 in vitro 전기천공법(electroporation)의 방법이다. In vitro 전기천공법은 고-전압 전류로 세포 막을 투과성 있게 하여서 새로운 DNA 또는 RNA를 세포 내로 도입할 수 있도록 하는 것에 기초한다. 그러므로, 세포 벽은 화학물질을 사용하거나, 또는 동결의 세심한 과정을 통하여 그들이 "전기적격(electrocompetent)"이 있도록 만듬으로써 트랜스펙션 전에 일반적으로 약해진다. 전기적격 박테리아 또는 세포 (예를 들어, 진핵 세포) 및 DNA (또는 RNA)가 함께 혼합된다면, 플라스미드는 반응 챔버를 가로지르는 스파크의 경로 내에서 상기 DNA (또는 RNA)가 세포 내로 전달되도록 하는 전기 방전을 사용함으로써 세포 내로 트랜스펙션될 수 있다.
다른 대안적인 물리적 또는 물리-화학적 방법은 나노플렉스(nanoplex)(나노입자 시스템), 리포플렉스(리포좀 시스템(liposomal system)), 또는 폴리플렉스 또는 양이온 폴리머의 사용이다. 그러한 나노플렉스(나노입자 시스템)는 핵산의 세포 또는 조직 내로의 전달을 위한 운반 시스템으로서 폴리아크릴레이트, 폴리아마이드, 폴리스티렌, 시아노아크릴레이트, 폴릴아크타트(polylactat)(PLA), 폴리(락틱-코-글리콜릭산)(PLGA), 폴리에틸 등의 사용을 포함한다. 리포플렉스 또는 리포좀 시스템은 일반적으로 양이온 리피드의 사용을 포함하고, 이것은 세포 막과 유사한 기능을 할 수 있다. 이것에 의해, 리피드의 양으로 하전된 부분은 핵산의 음으로 하전된 부분과 상호작용하고, 그래서 세포 막과 융합할 수 있다. 리포플렉스 또는 리포좀 시스템은 예를 들어, DOTMA, DOPE, DOSPA, DOTAP, DC-Chol, EDMPC 등을 포함한다. 폴리플렉스(양이온 폴리머)는 일반적으로 음으로 하전된 핵산과 복합체를 형성하여 핵산의 응축(condensation)을 야기하고, 이러한 핵산이 분해되는 것을 방지한다. 폴리플렉스(양이온 폴리머)를 사용하는 세포 내로의 이송은 일반적으로 수용체 매개 엔도사이토시스에 의해 일어난다. 이것에 의해, DNA는 트랜스페린과 같은 독특한 분자와 예를 들어, 폴리플렉스 폴리-L-라이신(PLL)에 의해 커플링되고, 이것은 표면 수용체에 결합하여 엔도사이토시스를 촉발한다. 폴리플렉스(양이온 폴리머)는 예를 들어, 폴리-L-라이신(PLL), 키토산, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)(PEI), 폴리디메틸아미노에틸메타크릴레이트(PD-MAEMA), 폴리아미도아민(PAMAM)을 포함한다.
세포 또는 생체 내로 유전자 전달의 다른 잘 알려진 물리적 또는 물리-화학적 방법은 바이러스 기반 트랜스펙션 방법과 같은 방법이다. 특정 예로, DNA 바이러스가 DNA 비히클(vehicle)로 사용될 수 있다. 그들의 감염 성질 때문에, 그러한 바이러스는 매우 높은 트랜스펙션 율(rate)을 가질 수 있다. 일반적으로 사용되는 바이러스는 유전적으로 조작되어, 트랜스펙션된 세포 내에서 감염이 가능한 입자는 형성되지 않는다. 안전성 관련 주의에도 불구하고, 예를 들어, 가능한 재조합 이벤트 때문에, 도입된 치료적으로 활성인 유전자 및 바이러스 유전자의 조절되지 않은 증식 위험성이 배제될 수 없다.
본 발명에서 세포 또는 조직 내로의 거대분자의 전달을 위한 소위 전위(translocatory) 단백질 또는 단백질 트랜스덕션 도메인(PTD)의 사용은 매우 유리하다. 전위 단백질들은 HIV tat(HIV), 안텐나페디아(antennapedia)(Drosophila antennapedia), HSV VP22(Herpes simplex), FGF 또는 락토페린 등과 같이 세포 사이(전위 단백질들 사이)에서 거대분자의 이송에 영향을 미칠 수 있는 펩타이드의 일 그룹으로 생각된다. 대조적으로, 단백질 트랜스덕션 도메인(PTD)은 이러한 서열들에 공유적으로 결합된 단백질 및 펩타이드를 세포 막에 의해 세포 내로 안내할 수 있는 펩타이드들의 일 그룹으로 생각된다(Leifert and Whitton: Translocatory proteins and protein transduction domains: a critical analysis of their biological effects and the underlying mechanisms. Molecular Therapy Vol. 8 No.1 2003). PTD 뿐만 아니라 전위 단백질들에 일반적 영역이 있는데, 이것은 핵산과 같은 다음이온에 결합할 수 있기 때문에 융합 펩타이드의 이송에 주된 역할을 하는 것으로 여겨진다. 어떠한 이론에 한정됨 없이, PTD는 수용체 의존성 비-포화(non-saturatable) 흡착 엔도사이토시스를 이용하는 양이온 트랜스펙션 성분과 유사하게 작용할 수 있다. PTD는 일반적으로 단백질 또는 펩타이드에 커플링되어 펩타이드 기반 백신을 투여할 때 CTL 반응을 촉진하거나 영향을 미친다(review: Melikov and Chernomordik, Arginine-rich cell penetrating peptides: from endosomal uptake to nuclear delivery, Cell. Mol. Life Sci. 2005 참조).
단백질 트랜스턱션 도메인(PTD)은 때때로 "세포 침투 펩타이드(cell penetrating peptide)"로 명명되는데, 이는 세포 막을 침투하여 세포 내로 (거대)분자의 이송에 영향을 미치는 그들의 능력 때문이다. CPP는 작은 펩타이드이며, 일반적으로 고 함량의 염기성 아미노산을 포함하고, 길이가 7 내지 30개의 아미노산 길이이다. CPP에 의해 세포 내로 이송되는 것으로 보여지는 거대분자는 DNA, siRNA 또는 PNA(peptide nucleic acid) 뿐만 아니라 펩타이드들을 포함하며, 여기에서 CPP는 일반적으로 공유 결합에 의해 이러한 거대분자에 결합되고, 세포 내로 트랜스펙션된다. 비록 세포 침투 펩타이드(CPP)는 in vitro 및 in vivo에서 약리학적으로 흥미있는 다양한 분자의 세포 내 전달을 매개하기 위하여 성공적으로 사용되어 왔지만, 세포 업테이크가 일어나는 기전은 아직 명확하지 않다. CPP 그룹은 매우 다양하고, 트랜스포탄(transportan), 페네트라틴(penetratin)과 같은 양친매성, 나선형 펩타이드, MTS, VP22, MAP, KALA, PpTG20, 프롤린-풍부 펩타이드, MPG-펩타이드, Pep-1, L-올리고머, 칼시토닌-펩타이드와 같은 소수성 펩타이드, 또는 아르기닌-풍부 CPP와 같은 양이온성, 친수성 아르기닌-풍부 펩타이드로 구성되며, 이것은 HIV-1 Tat 단백질의 트랜스덕션 도메인과 같은 세포의 프로테오글리칸에 결합함으로써 (공유적으로) 결합된 분자의 세포 업테이크를 매개한다(Review: Deshayes et al . Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cell. Mol. Life Sci. 2005). 특히, 아르기닌-풍부 CPP는 단백질 또는 DNA, 예를 들어, 플라스미드 DNA의 세포 내로의 비히클로 묘사된다. 폴리-아르기닌은 또한 세포 내로의 (거대-)분자의 이송을 위해 사용될 수 있으며, 이것은 일반적으로 적어도 60 내지 80개 아미노산(특히, 아르기닌) 길이를 포함하고, 더 일반적으로는 1000 내지 15000 아미노산 길이이며, 따라서 고 분자량 화합물이다. 비록 CPP에 대한 세포 업테이크 기전은 일반적으로 불명확하지만, 엔도사이토시스가 폴리-아르기닌의 업테이크 기전으로 제안된다. 엔도사이토시스는 세포 막을 통과함없이 거대분자가 세포로 들어가는 세포 프로세스이며, 여기에서 세 가지 다른 엔도사이토시스 기전이 제안된다(클라쓰린(chlathrin)-의존성 엔도사이토시스, 카베올린(caveolin)-의존성 엔도사이토시스 및/또는 F 액틴-의존성 엔도사이토시스, 예를 들어, review: Melikov and Chernomordik, Arginine-rich cell penetrating peptides: from endosomal uptake to nuclear delivery, Cell. Mol. Life Sci. 2005 참조). 어떠한 이론에 한정됨 없이, 엔도사이토시스 동안 CPP-복합체화된 거대분자는 처음에 음으로 하전된 세포 표면 헤파란(heparan(HS))을 포함하는 글리코스아미노글리칸(GAG)에 결합한다. 그 후, CPP-결합 거대분자는 클라쓰린(chlathrin)-의존성 엔도사이토시스, 카베올린(caveolin)-의존성 엔도사이토시스 및/또는 F 액틴-의존성 엔도사이토시스에 의해 세포 내로 들어가는데, 예를 들어, 세포 바깥의 CPP-결합 거대분자 주위의 막을 접힘에 의해 들어간다. 이것은 CPP-결합 거대분자가 봉입된 주머니모양 비히클을 형성한다. 죽은(late) 엔도솜 및/또는 골지 및/또는 세포질 망상구조(ER)를 통한 CPP-결합 거대분자의 트래픽킹(trafficking)은 CPP-bound 거대분자를 세포질 내로 운반하고, 여기에서 이러한 단계는 CPP-유도된 지질 이중막 내 일시적인 구멍의 개방을 포함할 수 있다. 대안적으로, CPP-복합체화된 거대분자는 특정 목적에 요구되는 활성 모드에 따라, 예를 들어, 엔도솜(endosom) 내와 같은, 세포 내 다른 위치들로 이송될 수 있다. 예로써, TLR-7 및 TLR-8 수용체들은 엔도솜 내에 위치한다. 따라서, 예를 들어, TLR1 TLR13 리간드 (Toll-유사 수용체들: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 또는 TLR13)로부터 선택된 Toll-유사 수용체(TLR)의 리간드일 수 있는 면역자극 RNA의 세포 트랜스펙션은, 엔도솜으로 이송될 수 있고, (특정 상호작용 및 상호작용 파트너에 따라), 예를 들어, RNA 리간드에 의한 면역자극을 일으킬 수 있다.
위에서 설명된 세포 침투 펩타이드(CPP)는 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있고, 넓게 토의되고 있다. 그러나, 이러한 CPP의 펩타이드, 단백질 및 DNA의 화물 이송을 위한 (운반체로서의) 용도는 확립되어 있고, 여기에서 CPP는 일반적으로 공유 방식으로 화물 분자와 연결되어 있다. 대조적으로, CPP를 사용하는 RNA의 세포 이송은 단지 매우 제한된 수의 경우에만 나타났고, 특히 예를 들어, 이중 나선 siRNA 서열과 같은 짧은 RNA 서열의 경우에만 나타난다.
예로, Futaki 등(The Journal of Biological Chemistry, Vol 276, No. 8, pp. 5836-5840, 2001)은 화물 펩타이드의 생체 외 전달을 위한 4-16개 아미노산 길이를 가진 운반체 올리고펩타이드 (Arg)n의 사용을 개시하고 있으며, 여기에서 상기 운반체 펩타이드는 화물 펩타이드에 공유적으로 연결되어 있다. 상대적으로 6 또는 8개 아르기닌 길이를 가진 (Arg)n에서 최적의 이동이 일어났다.
CPP에 의한 막-통과 이송 펩타이드 또는 펩타이드유사물(peptidomimetic)은 또한 Deshayes 등(2005, supra)에 의해 개시된다. Deshayes 등(2005, supra)은 화물 펩타이드의 생체 외 이송 및 사이클로스포린 또는 카탈라제와 같은 화물 단백질의 생체 내 이송을 위한 올리고펩타이드 Arg7 및 Arg9 사용을 개시한다.
DNA, 펩타이드 또는 단백질과 같은 거대분자의 세포 트랜스펙션을 위하여, PEI (polyethyleneimin) (예를 들어, 일반적으로 약 25 kDa의 분자량을 가짐)뿐만 아니라, 폴리-L-아르기닌 (예를 들어, 일반적으로 약 5000 Da 내지 15 kDa의 분자량을 가짐) 또는 폴리-L-라이신 (예를 들어, 일반적으로 약 54 kDa의 분자량을 가짐)과 같은 고 분자량 폴리펩타이드가 본 발명이 속한 분야에서 사용된다(또한 Bettinger et al., Nucleic Acids Research, Vol. 29 No. 18 (2001) 참조). 그러나, 고 분자량 폴리-L-라이신 및 PEI는 운반체 분자로는 비효율적인 것처럼 나타났다. 게다가, 고 농도로 고 분자량 폴리-L-아르기닌을 사용하는 경우, 독성 부작용이 관찰되어 보체 시스템의 활성화를 야기한다. 따라서, 예를 들어, 저 분자량 폴리-아르기닌과 같은 저 분자량 트랜스펙션 성분을 개발하기 위한 노력이 수행되었다. 그러나, 그러한 저 분자량 폴리-아르기닌은 일반적으로 운반체-화물-복합체, 즉, 예를 들어, 운반체로서 폴리-아르기닌 및 화물로서 DNA 분자로 형성된 복합체의 안정성이 낮다. 따라서 McKenzie 등(McKenzie et al . A potent new class of reductively activated peptide gene delivery agents; The Journal of Biological Chemistry Vol. 274 No. 14, 2000)은 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 이러한 펩타이드를 DNA에 교차결합함으로써 펩타이드-DNA-복합체의 안정성을 증가시키기 위해 시도하였고, 이것에 의해 Schiff's base를 형성하였다. 그러나, 그러한 교차결합은 세포 내에서 상기 복합체의 극도의 낮은 해리(dissociation)를 야기하였고, 결과적으로 코딩된 단백질의 발현이 시간의 경우에 따라 매우 낮았다. 이러한 문제를 극복하기 위하여, McKenzie 등(2000, supra)은 CPP 운반체 내에 시스테인 잔기를 도입하였고, 이것은 CPP 및 DNA 사이의 디설파이드 결합을 형성함으로써 상기 복합체를 안정화한다. 트랜스펙션 시, 이러한 디설파이드 결합은 세포 내에서 세포 내 환원 조건으로 인해 분리되고, 코딩된 펩타이드의 증가된 발현을 가져온다. 그러나, 그러한 교차결합은 정교한 작업이고 DNA의 원치않는 변경을 추가로 야기할 수 있다.
덧붙여, 저-분자량 PEI (예를 들어, 일반적으로 약 2000 Da의 분자량을 가짐) 및 저-분자량 폴리-L-라이신 (예를 들어, 일반적으로 약 3400 Da의 분자량을 가짐)은 위에서 언급된 그러한 거대분자의 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 비록 이러한 실험들에서 저 분자량 PEI 또는 폴리-L-라이신은 개선된 트랜스펙션을 나타내었지만, 이러한 운반체 분자와 DNA의 극도의 안정한 복합체의 형성으로 인하여 발현이 관찰되지 않았다. 결과로, 이러한 운반체 분자는 코딩된 단백질의 번역 및 발현을 위한 필수적인 단계인 그들의 복합체화된 DNA의 해리가 발생하지 않는 것으로 보인다(Bettinger et al ., (2001), supra 참조).
CPP에 의한 DNA의 이송은 또한 Niidome 등(The Journal of Biological Chemistry, Vol 272., No. 24, pp. 15307-15312, 1997)에 의해 연구되었다. Niidome 등(1997, supra)은 CPP의 사용, 특히, 화물 부분으로 플라스미드 DNA의 이송을 위한, 각각, 한정된 아르기닌 함량이 25%이고, 길이가 12 또는 24개 아미노산인 양이온 알파-나선형 펩타이드의 사용을 개시한다. 결과로, 길거나; 소수성이거나; 또는 길고 소수성인 펩타이드는 DNA에 강하게 결합하고 세포 내로의 DNA 이송에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 게다가, Niidome 등(Bioconjugate Chem. 1999, 10, 773-780)은 16 내지 17개 아미노산 길이를 가지는 펩타이드가 플라스미드 DNA의 이송에 최적임을 보여주었다. 그러나, CPP로 작은 펩타이드(예를 들어, 약 12개 아미노산)를 사용할 때, 세포 내로의 DNA 트랜스펙션 효율은 심각하게 감소하는 것으로 밝혀졌다.
짧은 아르기닌 분자의 세포 내 트랜스펙션 효율을 촉진하기 위하여, Futaki 등(Bioconjugate Chem. 2001, 12, 1005-1011)은 4-16개 아미노산 길이를 가진 스테아릴화된(stearylated) 올리고펩타이드 (Arg)n을 사용하였다. 이러한 올리고펩타이드는 루시페라제를 코딩하는 플라스미드 DNA의 생체 외 이송을 위한 트랜스펙션 실험에서 4-16개 아미노산 길이의 스테아릴화되지 않은 올리고펩타이드 (Arg)n 및 폴리-아르기닌(MW 5000-15000)과 비교평가되었다. 따라서, 트랜스펙션을 위해 사용된 운반체 펩타이드는 플라스미드 DNA와 혼합되었고, 운반체/화물 복합체를 형성하였다. 8개 아르기닌 길이의 스테아릴화된 (Arg)n에서 최적의 이송이 발생한 반면, 6-7 및 9-15개 아르기닌 길이의 아르기닌들은 매우 감소된 세포 내 이송 활성을 나타내었다. 게다가, 비-스테아릴화된 아르기닌 및 폴리-아르기닌의 이송 활성은 나쁜 결과를 나타내었고, 이러한 운반체 펩타이드를 사용할 때 이송 활성의 손실을 표시하였다. Futaki 등(2001, supra)에 의해 나타난 스테아릴화된 및 비-스테아릴화된 운반체 펩타이드에 있어서의 트랜스펙션 효율의 관측된 차이는 따라서 리피드 부분의 존재에 기인하는 것이며, 이것은 이러한 실험에서 사용된 CPP의 화학적 성질을 매우 많이 변화시킨다.
Kim 등(Kim et al ., Basic peptide system for efficient delivery of foreign genes, Biochimica et Biophysica Acta 1640 (2003) 129-136)에 따르면, (Arg)9 내지 (Arg)15와 같은 짧은 아르기닌 운반체 펩타이드가 녹색 형광성 단백질 PEGFP-N3을 코딩하는 DNA의 복합체와 및 세포 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있다. 아르기닌 (Arg)9 내지 (Arg)15를 사용할 때, 최적 결과는 (Arg)15에서 나타났으며, (Arg)9에서 (Arg)15까지 세포 트랜스펙션 효율이 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 DNA로 세포를 트랜스펙션하는 최적의 이송 성질은 n이 15를 훨씬 넘은 (Arg)n 운반체 펩타이드로 달성될 수 있음을 나타낸다. 그러나, Kim 등(2003, supra)은 트랜스펙션 목적의 짧은 아르기닌 펩타이드의 적용성은 화물 부분으로 DNA 분자를 사용하는 경우에만 국한하였다.
세포는 또한 RNA와 조합하여 CPP를 사용함으로써 트랜스펙션될 수 있다. 그러나, 단지 적은 수의 실제 예만이 RNA의 세포 이송을 위해 수행되었는데, 이는 아마 그것의 빠른 분해 및 복합체 내에서의 낮은 안정성 때문이다. 따라서, CPP를 사용하는 RNA의 트랜스펙션은 siRNA와 같은 더 안정한 이중 나선 RNA에 국한되는 것으로 보인다. 예로, Tonges 등(RNA (2006), 12:1431-1438)은 신경 히포캠퍼스 세포 내로의 이중 나선 짧은 siRNA의 생체 외 전달을 위해 스테아릴화된 옥타-아르기닌 (Arg)8을 사용하였고, 여기에서 상기 스테아릴화된 옥타-아르기닌 (Arg)8은 siRNA와 복합체를 형성한다. Tonges 등(2006, supra)의 결과에 기초할 때, 운반체 펩타이드의 스테아릴 성분은 siRNA의 이송 또는 다른 RNA 분자의 이송에 있어 필수적인 것으로 보인다.
Veldhoen 등(2006)은 또한 이중 나선 짧은 siRNA 서열의 세포 내 트랜스펙션을 위한 비-공유 복합체 내의 특이 CPP의 사용을 개시하였다(Veldhoen et al ., Cellular delivery of small interfering RNA by a non-covalently attached cell penetrating peptide: quantitative analysis of uptake and biological effect. Nucleic Acids Research 2006). Veldhoen 등(2006)에 의해 사용된 펩타이드는 MPGalpha (Ac-GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKKKRKV-Cya) 및 MPGalpha-mNLS (Ac-GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKSKRKV-Cya)이다. 이러한 특이 펩타이드는 부가적으로 N-말단에서 아세틸 모이어티(Ac)로, C-말단에서 시스테아미드(cysteamide) 모이어티로 변형된다. Veldhoen 등(2006)은 위에서 언급된 운반체 펩타이드를 사용하여 약 18 내지 40개 뉴클레오타이드를 가진 이중-나선 siRNA를 세포 내로 전달할 수 있었다.
상기 내용을 요약하면, 거대분자의 세포 내 이송을 위한 CPP 또는 다른 운반체 펩타이드의 사용은 기본적으로 펩타이드 및 DNA 분자를 위한 것으로 보여진다. 아주 적은 수의 매우 특이적인 문헌이 이중 나선 siRNA의 세포 침투 성질을 개시한다.
RNA 전달은 현대 분자 의학에 있어 중요한 수단이며, DNA 세포 트랜스펙션보다 우월한 성질은 보이는데, 이는 DNA 분자가 심각한 문제를 야기할 수 있기 때문이다. 예를 들어, DNA 분자의 적용은 DNA가 숙주 게놈 내로 통합될 위험성이 있다. 외부 DNA의 숙주 게놈 내로의 통합은 숙주 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있고, 종양유전자의 발현 또는 종양 억제 유전자의 파괴를 촉발할 수 있다. 숙주에게 필수적인 유전자 - 및 그러므로 유전자 산물 -는 또한 이러한 유전자의 코딩 영역 내로 외래 DNA의 통합으로 비활성화될 수 있다. DNA의 통합이 세포 성장의 조절에 참여하는 유전자에서 발생한다면 심각한 위험성이 생길 수 있다. 이 경우, 숙주 세포는 퇴행성(degenerated) 상태로 들어설 수 있고, 암 또는 종양 형성을 유도할 수 있다. 그러한 바람직하지 않은 DNA의 통합은 세포 내로 트랜스펙션된 DNA가 바이러스성 CMV 프로모터와 같은 능력있는 프로모터를 포함할 경우 더욱 문제될 수 있다. 그러한 프로모터의 치료받은 세포 게놈으로의 통합은 세포 내 유전자 발현의 조절에 있어 원치 않은 변화를 야기할 수 있다. 추가적인 단점은 해당 DNA 분자가 오랫동안 에피솜으로서 또는 언급된 바와 같이 숙주 게놈 내에 통합되어 세포 핵 내에 남아 있다는 것이다. 이러한 현상은 시간상으로 제한되지 않는 제한될 수 없는 이식유전자 단백질의 생성 및 이러한 이식유전자 단백질에 대한 관련된 내성의 위험성을 야기할 수 있다. 더욱이, 항-DNA 항체의 생성(Gilkeson et al ., J Clin Invest 95, 1398-1402 (1995)) 및 자가면역 질환의 발생이 DNA의 주사에 의해 촉발될 수 있다. 언급된 이러한 모든 위험성은 DNA의 적용과 관련된다. 대조적으로, RNA, 특히 mRNA가 DNA 대신 사용된다면 이러한 문제들은 발생하지 않는다. 예를 들어, mRNA는 숙주 게놈 내로 통합하지 않고, 프로모터 등과 같은 바이러스성 서열이 효율적인 전사 등을 위하여 요구되지 않는다. RNA 사용으로부터 발생하는 단점은 DNA와 비교하여 그것의 불안정성이다(RNA-분해 효소, 소위 RNase들 (리보뉴클레아제), 특히, RNA를 불안정화하는 수많은 다른 프로세스들이 이러한 RNA 불안정성에 관여한다). 그러나, RNA를 안정화하는 방법들이 본 발명이 속한 분야에서 개시되어오고 있는데, 예를 들어, WO 03/051401, WO 02/098443, WO 99/14346, EP-A-1083232, US 5,580,859 및 US 6,214,804에서 개시된다. 리포좀(Martinon et al ., Eur J Immunol 23, 1719-1722 (1993)) 또는 발리스틱(ballistic) 장치(유전자 건)를 이용한 핵산의 세포질-내(intra-cytosolic) in vivo 투여(Vassilev et al ., Vaccine 19, 2012-2019 (2001))를 사용하여 리보뉴클레아제에 의한 분해에 대항하여 RNA를 보호하기 위한 방법들 또한 개발되어오고 있다.
RNA 분자는 위에서 설명한 바와 같이 DNA에 비하여 이로운 성질을 제공하기 때문에, 본 발명의 목적은 세포 내로 RNA 전달을 위한 적합하고 효율적인 운반체를 제공하는 것이다. 따라서 본 발명은 RNA가 세포 내로 효율적으로 트랜스펙션 되도록 하는 해결책을 제공한다.
본 발명의 목적은 청구항들에 의해 특징져지는 본 발명의 구현들에 의해 달성된다. 특히, 상기 목적은 하나 이상의 올리고펩타이드와 복합체화된 적어도 하나의 RNA (분자), 바람직하게는 mRNA를 포함하는 RNA (분자) 복합체에 의해 달성되는데, 여기에서 상기 적어도 하나의 올리고펩타이드는 8 내지 15개 아미노산 길이이며, 상기 적어도 하나의 올리고펩타이드는 다음의 실험식을 가지는 적어도 하나의 올리고펩타이드 이내에 어떠한 순서로 위치할 수 있는 잔기들인 1 Arg 잔기, m Lys 잔기, n His 잔기, o Orn 잔기 및 x Xaa 잔기를 포함한다:
(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (실험식 I)
여기에서,
· l + m + n +o + x = 8-15, 및
만약 Arg, Lys, His 및 Orn의 총 함량이 상기 올리고펩타이드의 모든 아미노산의 적어도 약 50%, 예를 들어, 적어도 60% 또는 70%라면, l, m, n 또는 o는 서로 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택되는 어떠한 수일 수 있고; 및
· Xaa는 Arg, Lys, His 또는 Orn을 제외한 자연적인 (=자연적으로 발생하는) 또는 비-자연적인 아미노산으로부터 선택되는 아미노산일 수 있으며; 및
· x는 Xaa의 총 함량이 상기 올리고펩타이드의 총 아미노산의 50%를 초과하지 않는다면, 예를 들어, 40% 또는 30% 이하라면, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8로부터 선택되는 어떠한 수일 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 복합체화된 RNA는 RNA와 올리고펩타이드(들) 사이에 비-공유 복합체를 형성함에 의해, 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x에 따른 하나 이상의 올리고펩타이드와 복합체화된 본 발명에서 정의된 바와 같은 RNA (분자), 바람직하게는 mRNA라고 이해되어야 한다. 여기에서 "비-공유"는 RNA와 올리고펩타이드의 가역적 결합이 이러한 분자들의 비-공유 상호작용에 의해 형성되었음을 의미하고, 여기에서 상기 분자들은 예를 들어, van der Waals-bond와 같은, 즉, 복합체화된 분자들의 비특이적 인력으로부터 형성되는 약학 정전기적 인력과 같은, 공유 결합 이외의 전자들의 상호작용의 어떠한 타입에 의해 결합한다. RNA와 적어도 하나의 올리고펩타이드의 결합(association)은 해당 복합체의 해리(dissociation)와 평형 상태에 있다. 세포 내에서, 어떠한 이론에 한정됨 없이, 상기 평형은 해리된 RNA 및 올리고펩타이드(들) 쪽으로 이동할 것으로 보인다.
본 발명에 따른 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 올리고펩타이드는 길이가 8 내지 15 아미노산이고, 바람직하게는 길이가 8 내지 14, 8 내지 13, 8 내지 12, 또는 9 내지 12 또는 9 내지 11 아미노산이며, 더욱 바람직하게는 길이가 8 내지 10, 9 내지 11, 10 내지 12, 11 내지 13, 12 내지 14 또는 13 내지 15 아미노산이고, 더욱더 바람직하게는 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 아미노산인 상기 화학식의 펩타이드로부터 선택된다.
본 발명에 따른 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드는 위에서 정의된 바와 같이 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x을 가지며, 여기에서 l + m + n + o + x = 8-15이고, l, m, n 또는 o는 서로 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 어떠한 수이거나, 또는 이러한 값들의 두 개로 형성된 어떠한 범위일 수 있으며, 이 경우 (기본 아미노산들) Arg, Lys, His 및/또는 Orn의 총 함량은 본 발명에 따른 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드의 총 아미노산의 적어도 50% (예를 들어, 적어도 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 또는 59%), 적어도 60% (예를 들어, 적어도 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 또는 69%), 적어도 70% (예를 들어, 적어도 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 또는 79%), 적어도 80% (예를 들어, 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 또는 89%), 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%), 또는 100%일 수 있다. 아미노산들 Arg, Lys, His 및 Orn (3문자 코드)은 각각 아미노산들인 아르기닌, 라이신, 히스티딘 및 오르니틴을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 문맥에서, 오르니틴(ornithine)은 그 구조가 NH2-CH2-CH2-CH2-CHNH2-COOH인 아미노산이다. 오르니틴은 21번째 아미노산으로 인공적으로 포함되었고, 오르니틴은 DNA에 의해 코딩되는 아미노산이 아니며, 따라서 일차적인 단백질 합성에 관여하지 않는다는 점에서 "자연적으로 발생하는" 20개의 아미노산들에 포함되지 않는다. 그러나, 오르니틴은 L-아르기닌으로부터 시작하는 효소 반응에 의해 제공된다. 보호되지 않은 오르니틴을 포함하는 폴리펩타이드는 자발적인 lactamization이 되기 때문에 유전 코드의 일부가 아니라고 생각된다. 오르니틴은 우레아를 생성하는, L-아르기닌에 대한 효소 아르기나제의 반응 산물들 중 하나이기 때문에 기본 아미노산으로 생각된다.
추가적 바람직한 구현에 따르면, 위에서 보여진 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (식 I)의 실험식을 가지는 본 발명의 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드의 (단일) 아미노산들은 실험식에 대해 위에서 설명된 바와 같이 어떠한 빈도로도 발생할 수 있는데, 즉, (Xaa 뿐만 아니라) 각 기본 아미노산은 상기 정의된 값 또는 범위 내에서 위에서 정의된 실험식에서 나타날 수 있고, 여기에서 상기 범위는 위에서 정의된 값들의 두 개로부터 형성될 수 있다. 그러나, 상기 실험식에서 기본 아미노산 Arg의 함량이 전체 실험식 대비 적어도 10%, 더욱 바림직하게는 적어도 20%, 더욱더 바람직하게는 적어도 30%, 40% 또는 50%, 더욱더 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%조차 라면, 그것은 특히 바람직하다. 다른 특히 바람직한 구현에 따르면, 상기 실험식 내 기본 아미노산 Lys의 함량은 전체 실험식 대비 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 20%, 더욱더 바람직하게는 적어도 30%, 40% 또는 50%라도, 더욱더 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%이다. 다른 특히 바람직한 구현에 따르면, 상기 실험식 내 기본 아미노산 His의 함량은 전체 실험식 대비 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 20%, 더욱더 바람직하게는 적어도 30%, 40% 또는 50%라도, 더욱더 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%이다. 다른 특히 바람직한 구현에 따르면, 상기 실험식 내 기본 아미노산 Orn의 함량은 전체 실험식 대비 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 20%, 더욱더 바람직하게는 적어도 30%, 40% 또는 50%라도, 더욱더 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%이다. 상기 정의된 함량들 중 어느 것에 있어, 위에서 정의된 기본 아미노산들인 Arg, Lys, His 및/또는 Orn의 값 또는 범위들은 또한 서로 결합할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드의 모든 기본 아미노산들의 총 함량이 처음에 정의된 바와 같이 적어도 50% (적어도 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 또는 59%) 적어도 60% (적어도 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 또는 69%), 적어도 70% (적어도 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 또는 79%), 적어도 80% (적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 또는 89%), 적어도 90% (적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%), 또는 100%이다.
상기 식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x의 아미노산들, 즉, Arg, Lys, His 및/또는 Orn은 더욱이 자연적(= 자연적으로 발생하는) 아미노산들 Arg, Lys, His 및 Orn 또는 이러한 아미노산들로부터 유래한 비-자연적(= 자연적으로 발생하지 않는) 아미노산들로부터 선택될 수 있다. 아미노산들 Arg, Lys, His 및 Orn으로부터 유래한 비-자연적(= 자연적으로 발생하지 않은) 아미노산으로, 이러한 아미노산들의 알려진 유도체가 만약 이러한 유도체들이 상기 올리고펩타이드와 제공될 때 세포 또는 생체에 대해 비독성이라면 사용될 수 있으며, 이것은 화학적으로 변형된 것이다. (아미노산들의 그러한 유도체들은 다양한 회사들에 의해 제공된다; 예를 들어, Sigma Aldrich (see http://www.sigmaaldrich.com) 참조).
게다가, 본 발명에 따른 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드는 상기 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x에서 아미노산 Xaa를 포함할 수 있으며, 이것은 Arg, Lys, His 또는 Orn을 제외한 자생적(= 자연적으로 발생하는) 또는 비-자생적(= 자연적으로 발생하지 않는) 아미노산들로부터 선택된 어떠한 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, Xaa는 알라닌 (Ala), 발린 (Val), 루신 (Leu), 이소루신 (Ile), 프롤린 (Pro), 트립토판 (Trp), 페닐알라닌 (Phe), 또는 메티오닌 (Met)과 같은 중성 (및 소수상) 사이드 체인을 가진 아미노산들인 자생적으로 발생하는 중성 (및 소수성) 아미노산들로부터 선택되거나, 및/또는 글리신 (Gly), 세린 (ser), 트레오닌 (Thr), 타이로신 (Tyr), 시스테인 (Cys), 아스파라긴 (Asn), 또는 글루타민 (Glu)과 같은 중성 (및 극성) 사이드 체인을 가진 아미노산들인 자생적으로 발생하는 중성 (및 극성) 아미노산들로부터 선택되거나, 및/또는 아스파틱산 (Asp) 또는 글루타믹산 (Glu)과 같은 산성 사이드 체인을 가진 아미노산들인 자생적으로 발생하는 산성 아미노산드로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드는 상기 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x에서 아미노산 Xaa를 포함할 수 있으며, 이것은 산성 사이드 체인을 가지지 않은 아미노산들로부터 선택된다. 더욱더 바람직하게는, 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x의 아미노산 Xaa는 위에서 정의된 바와 같은 중성 (및 소수성) 사이드 체인을 가진 아미노산들 및/또는 중성 (및 극성) 사이드 체인을 가진 아미노산들인 중성 사이드 체인을 가진 아미노산들로부터 선택된다. 덧붙여, 아미노산의 어떠한 알려진 유도체도 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x의 아미노산 Xaa로 사용될 수 있는데, 즉, 해당 유도체가 상기 올리고펩타이드와 함께 제공될 때 세포 또는 생체에 독성을 나타내지 않는다면 화학적으로 변형된 유도체인 아미노산들이 사용될 수 있다. (아미노산의 그러한 유도체들은 여러 회사에 의해 공급되며, 예를 들어, Sigma Aldrich 참조 (http://www.sigmaaldrich.com 참조)). Xaa는 일반적으로 상기 식에서 총 올리고펩타이드 서열의 모든 아미노산들의 0-30%, 0-40% 또는 0-50%로 존재한다. 즉, Xaa의 총 함량은 총 올리고펩타이드 서열의 모든 아미노산들의 30%, 40% 또는 50%를 초과하지 않으며, 바람직하게는 20%를 초과하지 않고, 더욱 바람직하게는 10%를 초과하지 않고, 및 가장 바람직하게는 5%를 초과하지 않는다. 따라서 상기 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x의 x는 Xaa의 함량이 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드의 모든 총 아미노산들의 30% (또는 이 미만), 40% 또는 50%의 표시된 값을 초과하지 않는다면 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8로부터 선택된 어떠한 수일 수 있다.
일반적으로, 위에서 표시된 바와 같은 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가지는, 본 발명에 따른 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드의 아미노산들인 Arg, Lys, His, Orn 및 Xaa는 상기 올리고펩타이드 서열의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다. 따라서, 실험식 (I)는 아미노산들의 특정 순서를 표시하는 것은 아니고, 펩타이드 내 아미노산들의 종류 및 그들의 빈도를 반영하기 위한 것일 뿐이며, 상기 펩타이드 체인이 얼마간의 l개 Arg 잔기들, m개 Lys 잔기들, n개 His 잔기들, o개 Orn 잔기들 및 x개 Xaa 잔기들을 함유하고 있음을 나타내는 것으로, 펩타이드 체인 내에 이러한 잔기들의 어떠한 순서를 특정하는 것은 아니다.
그러나, 상기 올리고펩타이드는 한쪽, 바람직하게는, 양쪽 말단에 산성 사이드 체인을 포함하지 않는 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 상기 올리고펩타이드 서열은 한쪽, 또는 바람직하게는 양쪽 말단에 중성 또는 염기성 아미노산을 포함하고, 더욱더 바람직하게는 한쪽 또는 양쪽 말단에 염기성(basic) 아미노산을 포함한다. 더 바람직한 구현에서, 상기 일반식에 따른 올기고펩타이드는 적어도 두 개, 더 바람직하게는 적어도 세 개, 적어도 네 개 또는 더욱더 바람직하게는 적어도 다섯 개의 말단 염기 잔기, 특히 Arg, Orn 또는 Lys을 한쪽 말단에 포함한다. 또 다른 바람직한 구현에서, 상기 식에 따른 올리고펩타이드는 바람직하게는 한쪽, 또는 바람직하게는 양쪽 말단에 양이온성 아미노산을 포함하지 않고 (즉, Arg, Orn 또는 Lys 포함 안 함), 더욱더 바람직하게는 양쪽 말단에 양이온성 아미노산을 포함하지 않는다 (즉, Arg, Orn 또는 Lys 포함하지 않음). 즉, 그러한 비-양이온성 아미노산이 Arg, Orn 또는 Lys 또는 이러한 양이온성 아미노산들의 어떠한 변이체 또는 유도체를 제외한 아미노산으로부터 선택된다면, 상기 일반 식에 따른 올리고펩타이드의 한쪽, 또는 더 바람직하게는 양쪽 말단은 위에서 정의된 바와 같은 비-양이온성 아미노산을 포함할 수 있다. 말단은 예를 들어, 상기 특정 서열의 N-말단 및/또는 C-말단으로부터 시작하여 위에서 정의된 염기성 비-양이온성 잔기들을 한 개, 적어도 두 개, 적어도 세 개, 적어도 네 개, 적어도 다섯 개 또는 더 많이 포함할 수 있다.
더 바람직한 구현에서, 본 발명에 따른 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드의 한쪽 또는 양쪽 말단은 그것의 한쪽 또는 양쪽 말단에 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 본 발명에 따른 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드는, 위에서 정의된 바와 같이 올리고펩타이드의 총 길이가 8 내지 15개 아미노산이라면, 한쪽 또는 양쪽 말단에 연속하여 한 개, 두 개, 세 개 또는 더 많은 히스티딘 잔기를 포함할 수 있다.
덧붙여, 본 발명에 따른 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드의 Xaa 잔기는 일반적으로 적어도 하나의 Arg, Lys, His 또는 Orn에 의해 각각이 분리되어 있다. Xaa 잔기들의 그러한 분리는, 바람직하게는, 올리고펩타이드 내 비-염기성 아미노산들의 군집(cluster)을 피할 수 있게 하며, 그러한 비-염기성 군집은 본 발명에 따른 복합체화된 RNA의 운반체 펩타이드로서의 올리고펩타이드의 이로운 성질을 감소시킬 수 있다.
그러나, 상기 식에 따른 복합체화된 올리고펩타이드의 염기성 아미노산 잔기들은 위에서 정의된 바와 같이 Arg, Lys, His 또는 Orn으로부터 선택될 수 있으며, 일반적으로 본 발명에서 정의된 바와 같이, 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3, 4, 5, 또는 심지어 6 또는 더 많은 염기성 아미노산들의 군집으로 존재한다. 특지 바람직한 구현에서, 그러한 군집(cluster)은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 심지어 15개 아미노산을 포함할 수 있다. 염기성 아미노산의 그러한 군집은, 바람직하게는 적어도 3, 4, 5, 또는 심지어 6 또는 더 많은 염기성 아미노산의 군집은, 바람직하게는, 올리고펩타이드 내에서 염기성 표면 또는 결합 영역(region)을 생성하고, 이것은 본 발명에 따른 복합체화된 RNA의 운반체 펩타이드로서의 올리고펩타이드에 유리한 성질을 제공한다.
바람직한 구현에 따른, 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (실험식 I)를 가지는 본 발명의 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드는 다음의 실험식의 서브그룹일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Arg8, Arg9, Arg10, Arg11, Arg12, Arg13, Arg14, Arg15, (서열정보 번호: 1-8);
Lys8, Lys9, Lys10, Lys11, Lys12, Lys13, Lys14, Lys15, (서열정보 번호: 9-16);
His8, His9, His10, His11, His12, His13, His14, His15, (서열정보 번호: 17-24);
Orn8, Orn9, Orn10, Orn11, Orn12, Orn13, Orn14, Orn15, (서열정보 번호: 25-32);
더 바람직한 구현에 따른, 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (실험식 I)를 가지는 본 발명의 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드는 다음의 서브그룹으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 서브그룹은 예시적으로 특정 독창적인 올리고펩타이드를 정의하고, 이것은 위에서 정의된 실험식 I의 범주에 소가며, 여기에서 다음의 식들 (실험식 (I)와 마찬가지로)은 아미노산의 특정 순서를 특정하는 것은 아니며, 각 펩타이드의 조성으로서 아미노산들 (아미노산들의 숫자)를 배타적으로 특정함으로써 실험식을 반영하도록 의도된 것이다. 따라서 실험식 Arg(7-14)Lys1는 그 순서가 어떠하든지 간에 7 내지 14 Arg 잔기 및 1개 Lys 잔기를 포함하는 펩타이드를 의미하도록 의도된 것이다. 펩타이드가 7 Arg 잔기 및 1 Lys 잔기를 포함한다면, 7 Arg 잔기 및 1 Lys 잔기를 포함하는 모든 변이체(variant)는 해당 범주에 포함된다. 상기 Lys 잔기는 그러므로 예를 들어, 7 Arg 잔기 및 1 Lys 잔기로 이루어진 8개 아미노산 길이 서열 내에서 어떠한 위치에도 위치할 수 있다. 이러한 서브그룹은, 바람직하게는, 다음을 포함한다:
Arg(7-14)Lys1, Arg(7-14)His1, Arg(7-14)Orn1, Lys(7-14)His1, Lys(7-14)Orn1, His(7-14)Orn1,;
Arg(6-13)Lys2, Arg(6-13)His2, Arg(6-13)Orn2, Lys(6-13)His2, Lys(6-13)Orn2, His(6-13)Orn2,;
Arg(5-12)Lys3, Arg(5-12)His3, Arg(5-12)Orn3, Lys(5-12)His3, Lys(5-12)Orn3, His(5-12)Orn3,;
Arg(4-11)Lys4, Arg(4-11)His4, Arg(4-11)Orn4, Lys(4-11)His4, Lys(4-11)Orn4, His(4-11)Orn4,;
Arg(3-10)Lys5, Arg(3-10)His5, Arg(3-10)Orn5, Lys(3-10)His5, Lys(3-10)Orn5, His(3-10)Orn5,;
Arg(2-9)Lys6, Arg(2-9)His6, Arg(2-9)Orn6, Lys(2-9)His6, Lys(2-9)Orn6, His(2-9)Orn6,;
Arg(1-8)Lys7, Arg(1-8)His7, Arg(1-8)Orn7, Lys(1-8)His7, Lys(1-8)Orn7, His(1-8)Orn7,;
Arg(6-13)Lys1His1, Arg(6-13)Lys1Orn1, Arg(6-13)His1Orn1, Arg1Lys(6-13)His1, Arg1Lys(6-13)Orn1, Lys(6-13)His1Orn1, Arg1Lys1His(6-13), Arg1His(6-13)Orn1, Lys1His(6-13)Orn1;
Arg(5-12)Lys2His1, Arg(5-12)Lys1His2, Arg(5-12)Lys2Orn1, Arg(5-12)Lys1Orn2, Arg(5-12)His2Orn1, Arg(5-12)His1Orn2, Arg2Lys(5-12)His1, Arg1Lys(5-12)His2, Arg2Lys(5-12)Orn1, Arg1Lys(5-12)Orn2, Lys(5-12)His2Orn1, Lys(5-12)His1Orn2, Arg2Lys1His(5-12), Arg1Lys2His(5-12), Arg2His(5-12)Orn1, Arg1His(5-12)Orn2, Lys2His(5-12)Orn1, Lys1His(5-12)Orn2;
Arg(4-11)Lys3His1, Arg(4-11)Lys2His2, Arg(4-11)Lys1His3, Arg(4-11)Lys3Orn1, Arg(4-11)Lys2Orn2, Arg(4-11)Lys1Orn3, Arg(4-11)His3Orn1, Arg(4-11)His2Orn2, Arg(4-11)His1Orn3, Arg3Lys(4-11)His1, Arg2Lys(4-11)His2, Arg1Lys(4-11)His3, Arg3Lys(4-11)Orn1, Arg2Lys(4-11)Orn2, Arg1Lys(4-11)Orn3, Lys(4-11)His3Orn1, Lys(4-11)His2Orn2, Lys(4-11)His1Orn3, Arg3Lys1His(4-11), Arg2Lys2His(4-11), Arg1Lys3His(4-11), Arg3His(4-11)Orn1, Arg2His(4-11)Orn2, Arg1His(4-11)Orn3, Lys3His(4-11)Orn1, Lys2His(4-11)Orn2, Lys1His(4-11)Orn3;
Arg(3-10)Lys4His1, Arg(3-10)Lys3His2, Arg(3-10)Lys2His3, Arg(3-10)Lys1His4, Arg(3-10)Lys4Orn1, Arg(3-10)Lys3Orn2, Arg(3-10)Lys2Orn3, Arg(3-10)Lys1Orn4, Arg(3-10)His4Orn1, Arg(3-10)His3Orn2, Arg(3-10)His2Orn3, Arg(3-10)His1Orn4, Arg4Lys(3-10)His1, Arg3Lys(3-10)His2, Arg2Lys(3-10)His3, Arg1Lys(3-10)His4, Arg4Lys(3-10)Orn1, Arg3Lys(3-10)Orn2, Arg2Lys(3-10)Orn3, Arg1Lys(3-10)Orn4, Lys(3-10)His4Orn1, Lys(3-10)His3Orn2, Lys(3-10)His2Orn3, Lys(3-10)His1Orn4, Arg4Lys1His(3-10), Arg3Lys2His(3-10), Arg2Lys3His(3-10), Arg1Lys4His(3-10), Arg4His(3-10)Orn1, Arg3His(3-10)Orn2, Arg2His(3-10)Orn3, Arg1His(3-10)Orn4, Lys4His(3-10)Orn1, Lys3His(3-10)Orn2, Lys2His(3-10)Orn3, Lys1His(3-10)Orn4;
Arg(2-9)Lys5His1, Arg(2-9)Lys4His2, Arg(2-9)Lys3His3, Arg(2-9)Lys2His4, Arg(2-9)Lys1His5, Arg(2-9)Lys5Orn1, Arg(2-9)Lys4Orn2, Arg(2-9)Lys3Orn3, Arg(2-9)Lys2Orn4, Arg(2-9)Lys1Orn5, Arg(2-9)His5Orn1, Arg(2-9)His4Orn2, Arg(2-9)His3Orn3, Arg(2-9)His2Orn4, Arg(2-9)His1Orn5, Arg5Lys(2-9)His1, Arg4Lys(2-9)His2, Arg3Lys(2-9)His3, Arg2Lys(2-9)His4, Arg1Lys(2-9)His5, Arg5Lys(2-9)Orn1, Arg4Lys(2-9)Orn2, Arg3Lys(2-9)Orn3, Arg2Lys(2-9)Orn4, Arg1Lys(2-9)Orn5, Lys(2-9)His5Orn1, Lys(2-9)His4Orn2, Lys(2-9)His3Orn3, Lys(2-9)His2Orn4, Lys(2-9)His1Orn5, Arg5Lys1His(2-9), Arg4Lys2His(2-9), Arg3Lys3His(2-9), Arg2Lys4His(2-9), Arg1Lys5His(2-9), Arg5His(2-9)Orn1, Arg4His(2-9)Orn2, Arg3His(2-9)Orn3, Arg2His(2-9)Orn4, Arg1His(2-9)Orn5, Lys5His(2-9)Orn1, Lys4His(2-9)Orn2, Lys3His(2-9)Orn3, Lys2His(2-9)Orn4, Lys1His(2-9)Orn5;
Arg(1-8)Lys6His1, Arg(1-8)Lys5His2, Arg(1-8)Lys4His3, Arg(1-8)Lys3His4, Arg(1-8)Lys2His5, Arg(1-8)Lys1His6, Arg(1-8)Lys6Orn1, Arg(1-8)Lys5Orn2, Arg(1-8)Lys4Orn3, Arg(1-8)Lys3Orn4, Arg(1-8)Lys2Orn5, Arg(1-8)Lys1Orn6, Arg(1-8)His6Orn1, Arg(1-8)His5Orn2, Arg(1-8)His4Orn3, Arg(1-8)His3Orn4, Arg(1-8)His2Orn5, Arg(1-8)His1Orn6, Arg6Lys(1-8)His1, Arg5Lys(1-8)His2, Arg4Lys(1-8)His3, Arg3Lys(1-8)His4, Arg2Lys(1-8)His5, Arg1Lys(1-8)His6, Arg6Lys(1-8)Orn1, Arg5Lys(1-8)Orn2, Arg4Lys(1-8)Orn3, Arg3Lys(1-8)Orn4, Arg2Lys(1-8)Orn5, Arg1Lys(1-8)Orn6, Lys(1-8)His6Orn1, Lys(1-8)His5Orn2, Lys(1-8)His4Orn3, Lys(1-8)His3Orn4, Lys(1-8)His2Orn5, Lys(1-8)His1Orn6, Arg6Lys1His(1-8), Arg5Lys2His(1-8), Arg4Lys3His(1-8), Arg3Lys4His(1-8), Arg2Lys5His(1-8), Arg1Lys6His(1-8), Arg6His(1-8)Orn1, Arg5His(1-8)Orn2, Arg4His(1-8)Orn3, Arg3His(1-8)Orn4, Arg2His(1-8)Orn5, Arg1His(1-8)Orn6, Lys6His(1-8)Orn1, Lys5His(1-8)Orn2, Lys4His(1-8)Orn3, Lys3His(1-8)Orn4, Lys2His(1-8)Orn5, Lys1His(1-8)Orn6;
Arg(5-12)Lys1His1Orn1, Arg1Lys(5-12)His1Orn1, Arg1Lys1His(5-12)Orn1, Arg1Lys1His1Orn(5-12);
Arg(4-11)Lys2His1Orn1, Arg(4-11)Lys1His2Orn1, Arg(4-11)Lys1His1Orn2, Arg2Lys(4-11)His1Orn1, Arg1Lys(4-11)His2Orn1, Arg1Lys(4-11)His1Orn2, Arg2Lys1His(4-11)Orn1, Arg1Lys2His(4-11)Orn1, Arg1Lys1His(4-11)Orn2, Arg2Lys1His1Orn(4-11), Arg1Lys2His1Orn(4-11), Arg1Lys1His2Orn(4-11);
Arg(3-10)Lys3His1Orn1, Arg(3-10)Lys2His2Orn1, Arg(3-10)Lys2His1Orn2, Arg(3-10)Lys1His2Orn2, Arg(3-10)Lys1His1Orn3, Arg3Lys(3-10)His1Orn1, Arg2Lys(3-10)His2Orn1, Arg2Lys(3-10)His1Orn2, Arg1Lys(3-10)His2Orn2, Arg1Lys(3-10)His1Orn3, Arg3Lys1His(3-10)Orn1, Arg2Lys2His(3-10)Orn1, Arg2Lys1His(3-10)Orn2, Arg1Lys2His(3-10)Orn2, Arg1Lys1His(3-10)Orn3, Arg3Lys1His1Orn(3-10), Arg2Lys2His1Orn(3-10), Arg2Lys1His2Orn(3-10), Arg1Lys2His2Orn(3-10), Arg1Lys1His3Orn(3-10);
Arg(2-9)Lys4His1Orn1, Arg(2-9)Lys1His4Orn1, Arg(2-9)Lys1His1Orn4, Arg(2-9)Lys3His2Orn1, Arg(2-9)Lys3His1Orn2, Arg(2-9)Lys2His3Orn1, Arg(2-9)Lys2His1Orn3, Arg(2-9)Lys1His2Orn3, Arg(2-9)Lys1His3Orn2, Arg(2-9)Lys2His2Orn2, Arg4Lys(2-9)His1Orn1, Arg1Lys(2-9)His4Orn1, Arg1Lys(2-9)His1Orn4, Arg3Lys(2-9)His2Orn1, Arg3Lys(2-9)His1Orn2, Arg2Lys(2-9)His3Orn1, Arg2Lys(2-9)His1Orn3, Arg1Lys(2-9)His2Orn3, Arg1Lys(2-9)His3Orn2, Arg2Lys(2-9)His2Orn2, Arg4Lys1His(2-9)Orn1, Arg1Lys4His(2-9)Orn1, Arg1Lys1His(2-9)Orn4, Arg3Lys2His(2-9)Orn1, Arg3Lys1His(2-9)Orn2, Arg2Lys3His(2-9)Orn1, Arg2Lys1His(2-9)Orn3, Arg1Lys2His(2-9)Orn3, Arg1Lys3His(2-9)Orn2, Arg2Lys2His(2-9)Orn2, Arg4Lys1His1Orn(2-9), Arg1Lys4His1Orn(2-9), Arg1Lys1His4Orn(2-9), Arg3Lys2His1Orn(2-9), Arg3Lys1His2Orn(2-9), Arg2Lys3His1Orn(2-9), Arg2Lys1His3Orn(2-9), Arg1Lys2His3Orn(2-9), Arg1Lys3His2Orn(2-9), Arg2Lys2His2Orn(2-9);
Arg(1-8)Lys5His1Orn1, Arg(1-8)Lys1His5Orn1, Arg(1-8)Lys1His1Orn5, Arg(1-8)Lys4His2Orn1, Arg(1-8)Lys2His4Orn1, Arg(1-8)Lys2His1Orn4, Arg(1-8)Lys1His2Orn4, Arg(1-8)Lys1His4Orn2, Arg(1-8)Lys4His1Orn2, Arg(1-8)Lys3His3Orn1, Arg(1-8)Lys3His1Orn3, Arg(1-8)Lys1His3Orn3, Arg5Lys(1-8)His1Orn1, Arg1Lys(1-8)His5Orn1, Arg1Lys(1-8)His1Orn5, Arg4Lys(1-8)His2Orn1, Arg2Lys(1-8)His4Orn1, Arg2Lys(1-8)His1Orn4, Arg1Lys(1-8)His2Orn4, Arg1Lys(1-8)His4Orn2, Arg4Lys(1-8)His1Orn2, Arg3Lys(1-8)His3Orn1, Arg3Lys(1-8)His1Orn3, Arg1Lys(1-8)His3Orn3, Arg5Lys1His(1-8)Orn1, Arg1Lys5His(1-8)Orn1, Arg1Lys1His(1-8)Orn5, Arg4Lys2His(1-8)Orn1, Arg2Lys4His(1-8)Orn1, Arg2Lys1His(1-8)Orn4, Arg1Lys2His(1-8)Orn4, Arg1Lys4His(1-8)Orn2, Arg4Lys1His(1-8)Orn2, Arg3Lys3His(1-8)Orn1, Arg3Lys1His(1-8)Orn3, Arg1Lys3His(1-8)Orn3, Arg5Lys1His1Orn(1-8), Arg1Lys5His1Orn(1-8), Arg1Lys1His5Orn(1-8), Arg4Lys2His1Orn(1-8), Arg2Lys4His1Orn(1-8), Arg2Lys1His4Orn(1-8), Arg1Lys2His4Orn(1-8), Arg1Lys4His2Orn(1-8), Arg4Lys1His2Orn(1-8), Arg3Lys3His1Orn(1-8), Arg3Lys1His3Orn(1-8), Arg1Lys3His3Orn(1-8);
바람직한 일 구현에서, 위에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가지는 본 발명의 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드는 Arg8, Arg9, Arg10, Arg11, Arg12, Arg13, Arg14, Arg15, (서열정보 번호: 1-8); Lys8, Lys9, Lys10, Lys11, Lys12, Lys13, Lys14, Lys15, (서열정보 번호: 9-16); His8, His9, His10, His11, His12, His13, His14, His15, (서열정보 번호: 17-24); 또는 Orn8, Orn9, Orn10, Orn11, Orn12, Orn13, Orn14, Orn15, (서열정보 번호: 25-32)로 이루어진 서브그룹으로부터 선택된다.
다른 바람직한 구현에 따른, 위에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가지는 본 발명의 복합체화된 RNA의 올리고펩타이드는 일반식 Arg9 (또한 R9로 명명됨), Arg9His3 (또한 R9H3로 명명됨), His3Arg9His3 (또한 H3R9H3로 명명됨), TyrSerSerArg9SerSerTyr (또한 YSSR9SSY로 명명됨), His3Arg9SerSerTyr (또한 H3R9SSY로 명명됨), (ArgLysHis)4 (또한 (RKH)4로 명명됨), Tyr(ArgLysHis)2Arg (또한 Y(RKH)2R로 명명됨)로 이루어진 서브그룹으로부터 선택된다. 더욱더 바람직하게는, 이러한 일반 식들은 다음과 같이 정의된다:
Arg9:
Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg (서열정보 번호: 2)
Arg9His3:
Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-His-His-His (서열정보 번호: 39)
His3Arg9His3:
His-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-His-His-His (서열정보 번호: 40)
TyrSerSerArg9SerSerTyr:
Tyr-Ser-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Tyr (서열정보 번호: 41)
His3Arg9SerSerTyr:
His-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Tyr (서열정보 번호: 42)
(ArgLysHis)4:
Arg-Lys-His-Arg-Lys-His-Arg-Lys-His-Arg-Lys-His (서열정보 번호: 43)
Tyr(ArgLysHis)2Arg:
Tyr-Arg-Lys-His-Arg-Lys-His-Arg (서열정보 번호: 44)
위에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x을 가지는 본 발명의 복합체화된 RNA (분자)의 적어도 하나의 올리고펩타이드는 추가적으로 변형될 수 있다. 본 발명의 명세서에서 변형들은, 이러한 변형들이 생성되는 복합체화된 RNA의 트랜스펙션 능력에 영향을 미치지 않는다면, 일반적으로 펩타이드들에 적합한 어떠한 변형일 수도 있다.
이러한 변형들은, 그러므로, 예를 들어, 위에서 정의된 변형된 아미노산들의 사용을 포함한다. 게다가, 위에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가지는, 카복시 (C-말단) 및 아미노 (N-말단) 그룹을 가지는 (또한 위와 같은 카르복시 또는 아마이드 아미노산 사이드 체인 그룹을 가지는) 올리고펩타이드의 말단 아미노산 잔기들은 적절한 아미노 또는 카르복실 보호 그룹을 사용하여 보호된 (예를 들어, 아마이드 그룹에 의해 보호된 C-말단) 및/또는 보호되지 않은 형태로 존재할 수 있다. 또한 위에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가지는 올리고펩타이드의 산-부가 염들이 사용될 수 있다. 일반적인 산 부가 염들은 하이드로할릭 산 염, 즉, HBr, HI, 또는 더욱 바람직하게는, HCl이다.
위에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x을 가지는 올리고펩타이드 내 존재하는 말단 또는 사이드 체인 카르복실 그룹의 페길레이션(PEGylation) 또는 라이신의 엡실론(epsilon)-아미노 그룹은 응집 및 혈청 분해에 저항성을 부여하며, 이것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
위에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가지는 본 발명의 복합체화된 RNA (분자)의 적어도 하나의 올리고펩타이드는 게다가 적어도 하나의 특정 리간드에 결합 또는 커플링되도록 변형될 수 있으며, 여기에서 상기 적어도 하나의 특정 리간드는 상기 적어도 하나의 올리고펩타이드의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합 또는 커플링되어 있을 수 있다. 상기 올리고펩타이드의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합 또는 커플링된 상기 적어도 하나의 특정 리간드는 동일하거나 다를 수 있으며, 수용체 또는 단백질 또는 단백질/수용체 복합체와 상호작용하거나 결합할 수 있는 어떠한 화합물로부터 선택될 수 있고, 예를 들어, 세포 표면, 예를 들어, RGD-펩타이드, 트랜스페린 또는 만노스 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
위에서 보여진 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가지는 올리고펩타이드의 유도체를 형성하는 다른 바람직한 변형들은 올리고펩타이드에 공유적으로 커플링될 수 있는 탄수화물 및/또는 지질에 기초한다. 탄수화물 및/또는 지질은 반응성 사이드 체인 부분을 통하여 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민 또는 타이로신 또는 글루타메이트 또는 아스파테이트와 커플링되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 탄수화물 및/또는 지질은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 올리고펩타이드의 말단 부분과 연결될 수 있다. 게다가, 올리고펩타이드는 기능적을 다른 펩타이드 또는 단백질 부분과 커플링될 수 있으며, 이것은 또한 올리고펩타이드를 안정화하거나, 및/또는 체액, 특히 혈액에서 올리고펩타이드의 이송 성질을 개선할 수 있다. 적당한 펩타이드 또는 단백질은 예를 들어, 알부민, 트랜스페린 등으로부터 선택될 수 있으며, 이것은 위에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x을 가지는 올리고펩타이드와 직접적으로, 또는 펩타이드 또는 유기 링커 서열을 통하여 커플링될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 펩타이드 또는 단백질은 올리고펩타이드의 말단들 중 한쪽과 연결된다.
본 문맥에서, 위에서 정의된 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x을 가지는 올리고펩타이드의 지질을 통한 변형은 일반적으로 (포화 또는 불포화) 지방산의 사용을 포함하지 않으며, 특히 긴 체인 (포화 또는 불포화) 지방산 (특히, > C12, > C14 또는 > C16의 체인 길이를 가진 지방산)의 사용을 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 문맥에서, 위에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가지는 올리고펩타이드의 지방산 이용 변형은 본 발명의 필요불가결한 부분을 형성하는 것은 아니다. 그러나, 지방산이 운반체 펩타이드를 변형하기 위하여 사용된다면, 그들은 예를 들어, 부타노익 지방산 (부티릭 지방산), 펜타노익 지방산 (발레릭 지방산), 헥사노익 지방산 (카프로익 지방산), 옥타노익 지방산 (카프릴릭 지방산), 노나노익 지방산 (펠라르고닉(pelargonic) 지방산), 데카노익 지방산 (카프릭 지방산), 도데카노익 지방산 (라우릭 지방산), 테트라데카노익 지방산 (미리스틱 지방산), 헥사데카노익 지방산 (팔미틱 지방산), 헵타데카노익 지방산 (마르가릭(margaric) (다투릭(daturic)) 지방산), 옥타데카노익 지방산 (스테아릭 지방산), 에이코사노익 지방산 (아라키딕(arachidic) 지방산), 도코사노익 지방산 (베헤닉(behenic) 지방산), 테트라코사노익 지방산 (리그노세릭(lignoceric) 지방산), 헥사코사노익 지방산 (세로틱(cerotic) 지방산), 헵타코사노익 지방산 (카르보세릭(carboceric) 지방산), 옥타코사노익 지방산 (몬타닉 지방산), 트리아콘타노익(triacontanoic) 지방산 (멜리식(melissic) 지방산), 도트리아콘타노익(dotriacontanoic) 지방산 (라세로익(lacceroic) 지방산), 트리트리아콘타노익(tritriacontanoic) 지방산 (세로멜리식(ceromelissic) (프실릭(psyllic)) 지방산), 테트라트리아콘타노익 지방산 (게딕(geddic) 지방산), 펜타트리아콘타노익 지방산 (세로플라스틱(ceroplastic) 지방산) 등, 또는 이들의 불포화 유사체(analog)를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 예로, 본 발명은 일반적으로 실험식 I의 운반체 펩타이드의 변형을 위하여 옥타데카노익 지방산 (스테아릭 지방산) 또는 그것의 불포화 유사체를 사용하는 것을 포함하지 않는다, 즉, 일반적으로 본 명세서에서 식 I의 스테아릴화된 올리고펩타이드는 본 발명 복합체의 RNA 조성의 복합체화를 위하여 사용되지 않는다.
본 발명의 다른 구현에 따른, 위에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가지는 올리고펩타이드의 분해 문제를 피하기 위하여, D 아미노산들로 이루어진 또는 부분적으로 D 아미노산들로 이루어진 상기 올리고펩타이드의 레트로-인버소 이성질체가 사용될 수 있다. 용어 "레트로-인버소(retro-inverso) 이성질체"는 선형 펩타이드의 이성질체로, 서열의 방향이 뒤집히고, 각 아미노산 잔기의 키랄성이 뒤집힌 이성질체이다(예를 들어, Jameson et al ., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al ., Nature, 368, 692-693 (1994) 참조). 본 펩타이드와 관련하여, 레트로-인버소 펩타이드는 아미노산의 역순으로 집합되어 있고, 일반적으로 F-moc 아미노산 유도체를 가진다. 일반적으로, 조(crude) 펩타이드는 역상 HPLC에 의해 정제될 수 있다.
위에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가지는 올리고펩타이드 내로 도입될 수 있는 다른 변형은 펩타이드 백본(backbone)의 변형에 관한 것이다. 바람직하게는, 변형된 올리고펩타이드는 스캐폴드 모방체(mimetics)이다. 그들의 백본은 자연 발생적인 백본과 다른 반면, 그들의 사이드-체인 구조는 올리고펩타이드 또는 그들의 절편, 변이체 또는 유도체와 동일하다. 일반적으로, 스캐폴드 모방체는 백본 체인 멤버들 (NH, CH, CO)의 하나 이상의 변형, 치환 (바람직하게는) 또는 삽입(insertion)을 나타낸다. 치환은 예를 들어, (I) -NH- 대신에 -O-, -S-, 또는 -CH2-; (II) -CHR- 대신에 -N-, C-알킬-, 또는 -BH- 및 (III) -CO- 대신에 -CS-, -CH2-, -SOn-, -P=O(OH)-, 또는 -B(OH)-이다. 본 명세서에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가지는 올리고펩타이드의 펩타이드 모방체(mimetic)는 이러한 변형 각각의 조합일 수 있다. 특히, 각 그룹 I, II 및 III의 변형들이 조합될 수 있다. 하나의 펩타이드 모방체에서, 각 백본 체인 멤버는 변형될 수 있거나, 대안적으로 체인 멤버들 중 일정 수가 자연적으로 발생하지 않는 부분으로 교환될 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가지는 올리고펩타이드의 모든 백본 체인 멤버들의 -NH-, -CHR- 또는 CO는 자연적으로 발생하지 않는 그룹으로 치환될 수 있다. 올리고펩타이드 백본의 아마이드 결합(-NH-CO-)이 치환되는 경우(모든 분자에서 또는 적어도 하나의 단일 위치에서), 바람직한 치환 부분은 바이오등전자(bioisosteric)인데, 예를 들어, 레트로-인버스 아마이드 결합 (-CO-NH-), 하이드록실 에틸렌 (-CH(OH)-CH2-), 알켄 (CH2=CH-), 카바 (CH2-CH2-) 및/또는 -P=O(OH)-CH2-이다. 대안적으로, 삽입에 의한 백본 체인 연장은 본 명세서에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가진 올리고펩타이드의 스캐폴드 모방체에서 발생할 수 있는데, 예를 들어, C-알파 원자의 측면에 위치한 부분에 발생한다. C-알파 원자의 한쪽 사이드에, 예를 들어, -O-, -S-, -CH-, -NH-가 삽입될 수 있다.
특히 본 명세서에서 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가진 올리고펩타이드의 올리고카바메이트(oligocarbamate) 펩타이드 백본 구조가 바람직하다. 여기에서 아마이드 결합은 카바메이트 부분에 의해 대체된다. 모노메릭(monomeric) N-보호된 아미노 알킬 카보네이트는 대응하는 아미노산 또는 아미노 알코올에 의해 영향받기 쉽다. 그들은 활성 에스테르로 전환되는데, 예를 들어, F-moc 모이어티를 사용하여 p-니트로 페닐 에스테르 또는 고상 합성(solid phase synthesis)에 의한 빛(photo) 민감 니트로아트릴옥시카르보닐(nitroatryloxycarbonyl) 그룹이다.
본 발명의 복합체화된 RNA는 트랜스펙션 목적에 적합한 적어도 하나의 RNA (분자)를 추가로 포함하고, 여기에서 이러한 적어도 하나의 RNA (분자)는 위에서 개시된 것과 같은 실험식 I ((Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x)를 가지는 하나 이상의 올리고펩타이드와 복합체화된다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 어떠한 길이 일 수 있다 (바람직하게는 본 발명에 따른 복합체화된 RNA로서 적용되는 RNA의 타입에 의존함). 적어도 하나의 RNA (분자)는 (아래의 개시 참조) 트랜스펙션되는 RNA의 타입에 따라 그 길이가 5 내지 20000 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 5 내지 10000 또는 300 내지 10000 뉴클레오타이드, 더욱더 바람직하게는 길이가 5 내지 5000 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 20 내지 5000, 50 내지 5000, 100 내지 5000 또는 300 내지 10000 뉴클레오타이드일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 짧은 RNA 올리고뉴클레오타이드 (바람직하게는 길이가 5 내지 80 또는, 더 바람직하게는 20 내지 80 뉴클레오타이드), 코딩 RNA, 면역자극성(immunostimulatory) RNA, siRNA, 안티센스 RNA, 또는 리보스위치(riboswitch), 리보자임(ribozyme) 또는 아프타머(aptamer) 등 어떠한 RNA일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 게다가, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 단일- 또는 (두 개의 단일-가닥 RNA (분자)의 비-공유적 회합 때문인 RNA (분자)로 취급될 수 있는) 이중-가닥 RNA, 또는 부분적 이중-가닥 RNA (이것은 일반적으로 하나의 긴 단일-가닥 RNA 분자와 짧은 단일-가닥 RNA에 의해 형성되거나 또는 거의 동일한 길이의 두 개의 단일-가닥 RNA-분자들에 의해 형성되며, 여기에서 하나의 단일-가닥 RNA 분자는 부분적으로 다른 하나의 단일-가닥 RNA 분자에 상보적이고, 따라서 이 둘은 이러한 영역에서 이중-가닥 RNA 분자를 형성함)이다. 바람직하게는, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 단일-가닥 RNA이다. 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 또한 원형(circular) 또는 선형 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 선형 RNA이다. 더 바람직하게는, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 (선형) 단일-가닥 RNA일 수 있다. 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 리보솜 RNA (rRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 메신저 RNA (mRNA), 또는 바이러스성 RNA (vRNA)일 수 있고, 바람직하게는 mRNA이다. 본 발명은 이러한 RNA들 모두가 세포 내로 트랜스펙션되도록 할 수 있다. 본 특허에서, mRNA는 일반적으로 몇 개의 구조 엘리먼트, 예를 들어, 선택적인 5'-UTR 영역, 업스트림 위치 리보솜 결합 부위, 그 옆의 코딩 영역, 선택적인 3'-UTR 영역, 그 옆의 폴리-A 꼬리 (및/또는 폴리-C 꼬리)로 이루어진 RNA이다. mRNA는 모노-, 디-, 또는 멀티시스트로닉(multicistronic) RNA일 수 있는데, 즉, 하나, 둘 또는 더 많은 단백질의 코딩 서열을 포함하는 RNA일 수 있다. 디- 또는 멀티시스트로닉 mRNA 내 그러한 코딩 서열들은 적어도 하나의 IRES 서열, 예를 들어, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 서열에 의해 분리될 수 있다.
짧은 RNA 올리고뉴클레오타이드
첫째 구현에서, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 짧은 RNA 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명에서 짧은 RNA 올리고뉴클레오타이드는 위에서 설명된 어떠한 RNA를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 짧은 RNA 올리고뉴클레오타이드는 단일- 또는 이중-가닥 RNA 올리고뉴클레오타이드이고, 더 바람직하게는 단일-가닥 RNA 올리고뉴클레오타이드이다. 더욱더 바람직하게는 짧은 RNA 올리고뉴클레오타이드는 선형 단일-가닥 RNA 올리고뉴클레오타이드이다.
바람직하게는, 본 명세서에서 사용된 짧은 RNA 올리고뉴클레오타이드는 RNA 분자에 대해 일반적으로 위에서 정의된 길이를 포함하고, 더 바람직하게는 그 길이가 5 내지 100, 5 내지 50, 또는 5 내지 30이며, 또는 대안적으로, 그 길이가 20 내지 100, 20 내지 80, 또는 더욱더 바람직하게는, 20 내지 60의 뉴클레오타이드이다. 짧은 RNA 올리고뉴클레오타이드는 다양한 목적으로 사용될 수 있는데, 예를 들어, (비특정) 면역 자극, 또는 유전자의 전자/번역의 감소/억제를 위하여 사용된다.
코딩( coding ) RNA
두 번째 구현에서, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)은 코딩 RNA이다. 본 발명의 복합체화된 코딩 RNA는 위에서 정의된 것과 같은 RNA일 수 있다. 바람직하게는, 코딩 RNA는 단일- 또는 이중-가닥 RNA일 수 있으며, 더 바람직하게는 단일-가닥 RNA이고, 또 코딩 RNA는 원형 또는 선형 RNA, 더 바람직하게는 선형 RNA이다. 더욱더 바람직하게는, 코딩 RNA는 (선형) 단일-가닥 RNA이다. 가장 바람직하게는, 코딩 RNA는 ((선형) 단일-가닥) 메신저 RNA (mRNA)이다.
코딩 RNA는 추가로 단백질 또는 펩타이드를 코딩할 수 있으며, 이것은 예를 들어, 치료적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드, 종양 항원, 항체, 면역억제 단백질 또는 펩타이드 등, 또는 특정 (치료) 적용을 위해 적합한 어떠한 다른 단백질 또는 펩타이드로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 여기에서 상기 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 RNA (분자)는 세포, 조직 또는 생체 내로 이송되며, 상기 단백질은 이러한 세포, 조직 또는 생체 내에서 차후에 발현된다.
본 명세서에서, 치료적으로 활성인 단백질들은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 어떠한 재조합 또는 분리 단백질로부터 선택될 수 있다. 본 명세서에서 정의된 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩되는 치료적으로 활성인 단백질은 AIF, Apaf 예를 들어, Apaf-1, Apaf-2, Apaf-3, oder APO-2 (L), APO-3 (L), Apopain, Bad, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-xS, bik, CAD, 칼페인(Calpain), 카스파제(Caspase), 예를 들어, 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-3, 카스파제-4, 카스파제-5, 카스파제-6, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-10, 카스파제-11, ced-3, ced-9, c-Jun, c-Myc, crm A, 사이토크롬 C, CdR1, DcR1, DD, DED, DISC, DNA-PKCS, DR3, DR4, DR5, FADD/MORT-1, FAK, Fas (Fas-리간드 CD95/fas (수용체)), FLICE/MACH, FLIP, 포드린(fodrin), fos, G-액틴, Gas-2, 겔솔린(gelsolin), 그랜자임(granzyme) A/B, ICAD, ICE, JNK, 라민(lamin) A/B, MAP, MCL-1, Mdm-2, MEKK-1, MORT-1, NEDD, NF-kappaB, NuMa, p53, PAK-2, PARP, 퍼포린(perforin), PITSLRE, PKCdelta, pRb, 프레세닐린(presenilin), prICE, RAIDD, Ras, RIP, 스핀고마이엘리나제(sphingomyelinase), 헤르퍼스 심플렉스 유래 티미딘키나제, TRADD, TRAF2, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, 트랜스글루타미나제, 등을 포함하는, 아폽토시스(apoptosis) 인자 또는 아폽토시스 관련 단백질로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 정의된 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩되는 치료적으로 활성인 단백질들은 또한 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질들을 포함하는 재조합 단백질들로부터 선택될 수 있다: 0ATL3, 0FC3, 0PA3, 0PD2, 4-1BBL, 5T4, 6Ckine, 707-AP, 9D7, A2M, AA, AAAS, AACT, AASS, ABAT, ABCA1, ABCA4, ABCB1, ABCB11, ABCB2, ABCB4, ABCB7, ABCC2, ABCC6, ABCC8, ABCD1, ABCD3, ABCG5, ABCG8, ABL1, ABO, ABR ACAA1, ACACA, ACADL, ACADM, ACADS, ACADVL, ACAT1, ACCPN, ACE, ACHE, ACHM3, ACHM1, ACLS, ACPI, ACTA1, ACTC, ACTN4, ACVRL1, AD2, ADA, ADAMTS13, ADAMTS2, ADFN, ADH1B, ADH1C, ADLDH3A2, ADRB2, ADRB3, ADSL, AEZ, AFA, AFD1, AFP, AGA, AGL, AGMX2, AGPS, AGS1, AGT, AGTR1, AGXT, AH02, AHCY, AHDS, AHHR, AHSG, AIC, AIED, AIH2, AIH3, AIM-2, AIPL1, AIRE, AK1, ALAD, ALAS2, ALB, HPG1, ALDH2, ALDH3A2, ALDH4A1, ALDH5A1, ALDH1A1, ALDOA, ALDOB, ALMS1, ALPL, ALPP, ALS2, ALX4, AMACR, AMBP, AMCD, AMCD1, AMCN, AMELX, AMELY, AMGL, AMH, AMHR2, AMPD3, AMPD1, AMT, ANC, ANCR, ANK1, ANOP1, AOM, AP0A4, AP0C2, AP0C3, AP3B1, APC, aPKC, APOA2, APOA1, APOB, APOC3, APOC2, APOE, APOH, APP, APRT, APS1, AQP2, AR, ARAF1, ARG1, ARHGEF12, ARMET, ARSA, ARSB, ARSC2, ARSE, ART-4, ARTC1/m, ARTS, ARVD1, ARX, AS, ASAH, ASAT, ASD1, ASL, ASMD, ASMT, ASNS, ASPA, ASS, ASSP2, ASSP5, ASSP6, AT3, ATD, ATHS, ATM, ATP2A1, ATP2A2, ATP2C1, ATP6B1, ATP7A, ATP7B, ATP8B1, ATPSK2, ATRX, ATXN1, ATXN2, ATXN3, AUTS1, AVMD, AVP, AVPR2, AVSD1, AXIN1, AXIN2, AZF2, B2M, B4GALT7, B7H4, BAGE, BAGE-1, BAX, BBS2, BBS3, BBS4, BCA225, BCAA, BCH, BCHE, BCKDHA, BCKDHB, BCL10, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BCPM, BCR, BCR/ABL, BDC, BDE, BDMF, BDMR, BEST1, 베타-카테닌(Catenin)/m, BF, BFHD, BFIC, BFLS, BFSP2, BGLAP,BGN, BHD, BHR1, BING-4, BIRC5, BJS, BLM, BLMH, BLNK, BMPR2, BPGM, BRAF, BRCA1, BRCA1/m, BRCA2, BRCA2/m, BRCD2, BRCD1, BRDT, BSCL, BSCL2, BTAA, BTD, BTK, BUB1, BWS, BZX, C0L2A1, C0L6A1, C1NH, C1QA, C1QB, C1QG, C1S, C2, C3, C4A, C4B, C5, C6, C7, C7orf2, C8A, C8B, C9, CA125, CA15-3/CA 27-29, CA195, CA19-9, CA72-4, CA2, CA242, CA50, CABYR, CACD, CACNA2D1, CACNA1A, CACNA1F, CACNA1S, CACNB2, CACNB4, CAGE, CA1, CALB3, CALCA, CALCR, CALM, CALR, CAM43, CAMEL, CAP-1, CAPN3, CARD15, CASP-5/m, CASP-8, CASP-8/m, CASR, CAT, CATM, CAV3, CB1, CBBM, CBS, CCA1, CCAL2, CCAL1, CCAT, CCL-1, CCL-11, CCL-12, CCL-13, CCL-14, CCL-15, CCL-16, CCL-17, CCL-18, CCL-19, CCL-2, CCL-20, CCL-21, CCL-22, CCL-23, CCL-24, CCL-25, CCL-27, CCL-3, CCL-4, CCL-5, CCL-7, CCL-8, CCM1, CCNB1, CCND1, CCO, CCR2, CCR5, CCT, CCV, CCZS, CD1, CD19, CD20, CD22, CD25, CD27, CD27L, cD3, CD30, CD30, CD30L, CD33, CD36, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD44v, CD44v6, CD52, CD55, CD56, CD59, CD80, CD86, CDAN1, CDAN2, CDAN3, CDC27, CDC27/m, CDC2L1, CDH1, CDK4, CDK4/m, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2A/m, CDKN1A, CDKN1C, CDL1, CDPD1, CDR1, CEA, CEACAM1, CEACAM5, CECR, CECR9, CEPA, CETP, CFNS, CFTR, CGF1, CHAC, CHED2, CHED1, CHEK2, CHM, CHML, CHR39C, CHRNA4, CHRNA1, CHRNB1, CHRNE, CHS, CHS1, CHST6, CHX10, CIAS1, CIDX, CKN1, CLA2, CLA3, CLA1, CLCA2, CLCN1, CLCN5, CLCNKB, CLDN16, CLP, CLN2, CLN3, CLN4, CLN5, CLN6, CLN8, C1QA, C1QB, C1QG, C1R, CLS, CMCWTD, CMDJ, CMD1A, CMD1B, CMH2, MH3, CMH6, CMKBR2, CMKBR5, CML28, CML66, CMM, CMT2B, CMT2D, CMT4A, CMT1A, CMTX2, CMTX3, C-MYC, CNA1, CND, CNGA3, CNGA1, CNGB3, CNSN, CNTF, COA-1/m, COCH, COD2, COD1, COH1, COL10A, COL2A2, COL11A2, COL17A1, COL1A1, COL1A2, COL2A1, COL3A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL4A6, COL5A1, COL5A2, COL6A1, COL6A2, COL6A3, COL7A1, COL8A2, COL9A2, COL9A3, COL11A1, COL1A2, COL23A1, COL1A1, COLQ, COMP, COMT, CORD5, CORD1, COX10, COX-2, CP, CPB2, CPO, CPP, CPS1, CPT2, CPT1A, CPX, CRAT, CRB1, CRBM, CREBBP, CRH, CRHBP, CRS, CRV, CRX, CRYAB, CRYBA1, CRYBB2, CRYGA, CRYGC, CRYGD, CSA, CSE, CSF1R, CSF2RA, CSF2RB, CSF3R, CSF1R, CST3, CSTB, CT, CT7, CT-9/BRD6, CTAA1, CTACK, CTEN, CTH, CTHM, CTLA4, CTM, CTNNB1, CTNS, CTPA, CTSB, CTSC, CTSK, CTSL, CTS1, CUBN, CVD1, CX3CL1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CYB5, CYBA, CYBB, CYBB5, , CYFRA 21-1, CYLD, CYLD1, CYMD, CYP11B1, CYP11B2, CYP17, CYP17A1, CYP19, CYP19A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP21A2, CYP27A1, CYP27B1, CYP2A6, CYP2C, CYP2C19, CYP2C9, CYP2D, CYP2D6, CYP2D7P1, CYP3A4, CYP7B1, CYPB1, CYP11B1, CYP1A1, CYP1B1, CYRAA, D40,DADl, DAM, DAM-10/MAGE-B1, DAM-6/MAGE-B2, DAX1, DAZ, DBA, DBH, DBI, DBT, DCC, DC-CK1, DCK, DCR, DCX, DDB 1, DDB2, DDIT3, DDU, DECR1, DEK-CAN, DEM, DES, DF,DFN2, DFN4, DFN6, DFNA4, DFNA5, DFNB5, DGCR, DHCR7, DHFR, DHOF, DHS, DIA1, DIAPH2, DIAPH1, DIH1, DIO1, DISCI, DKC1, DLAT, DLD, DLL3, DLX3, DMBT1, DMD, DM1, DMPK, DMWD, DNAI1, DNASE1, DNMT3B, DPEP1, DPYD, DPYS, DRD2, DRD4, DRPLA, DSCR1, DSG1, DSP, DSPP, DSS, DTDP2, DTR, DURS1, DWS, DYS, DYSF, DYT2, DYT3, DYT4, DYT2, DYT1, DYX1, EBAF, EBM, EBNA, EBP, EBR3, EBS1, ECA1, ECB2, ECE1, ECGF1, ECT, ED2, ED4, EDA, EDAR, ECA1, EDN3, EDNRB, EEC1, EEF1A1L14, EEGV1, EFEMP1, EFTUD2/m, EGFR, EGFR/Her1, EGI, EGR2, EIF2AK3, eIF4G, EKV, El IS, ELA2, ELF2, ELF2M, ELK1, ELN, ELONG, EMD, EML1, EMMPRIN, EMX2, ENA-78, ENAM, END3, ENG, ENO1, ENPP1, ENUR2, ENUR1, EOS, EP300, EPB41, EPB42, EPCAM, EPD, EphA1, EphA2, EphA3, 에프린A2(EphrinA2), 에프린A3, EPHX1, EPM2A, EPO, EPOR, EPX, ERBB2, ERCC2 ERCC3,ERCC4, ERCC5, ERCC6, ERVR, ESR1, ETFA, ETFB, ETFDH, ETM1, ETV6-AML1, ETV1, EVC, EVR2, EVR1, EWSR1, EXT2, EXT3, EXT1, EYA1, EYCL2, EYCL3, EYCL1, EZH2, F10, F11, F12, F13A1, F13B, F2, F5, F5F8D, F7, F8, F8C, F9, FABP2, FACL6, FAH, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD2, FANCF, FasL,FBN2, FBN1, FBP1, FCG3RA, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCHL, FCMD, FCP1, FDPSL5, FECH, FEO, FEOM1, FES, FGA, FGB, FGD1, FGF2, FGF23, FGF5, FGFR2, FGFR3, FGFR1, FGG, FGS1, FH, FIC1, FIH, F2, FKBP6, FLNA, FLT4, FMO3,FMO4, FMR2, FMR1, FN, FN1/m, FOXC1, FOXE1, FOXL2, FOXO1A, FPDMM, FPF, Fra-1, FRAXF, FRDA, FSHB, FSHMD1A, FSHR, FTH1, FTHL17, FTL, FTZF1, FUCA1, FUT2, FUT6, FUT1, FY, G250, G250/CAIX, G6PC, G6PD, G6PT1, G6PT2, GAA, GABRA3, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GALC, GALE, GALK1, GALNS, GALT, GAMT, GAN, GAST, GASTRIN17, GATA3, GATA, GBA, GBE, GC, GCDH, GCGR, GCH1, GCK, GCP-2, GCS1, G-CSF, GCSH, GCSL, GCY, GDEP,GDF5, GDI1, GDNF, GDXY, GFAP, GFND, GGCX, GGT1, GH2, GH1, GHR, GHRHR, GHS, GIF, GINGF, GIP, GJA3, GJA8, GJB2, GJB3, GJB6, GJB1, GK, GLA, GLB, GLB1, GLC3B, GLC1B, GLC1C, GLDC, GLI3, GLP1, GLRA1, GLUD1, GM1 (fuc-GM1), GM2A, GM-CSF, GMPR, GNAI2, GNAS, GNAT1, GNB3, GNE, GNPTA, GNRH, GNRH1, GNRHR, GNS, GnT-V, gp100, GP1BA, GP1BB, GP9, GPC3, GPD2, GPDS1, GPI, GP1BA, GPN1LW, GPNMB/m, GPSC, GPX1, GRHPR, GRK1, GROα, GROβ, GROγ, GRPR, GSE, GSM1, GSN, GSR, GSS, GTD, GTS, GUCA1A, GUCY2D, GULOP, GUSB, GUSM, GUST, GYPA, GYPC, GYS1, GYS2, H0KPP2, H0MG2, HADHA, HADHB, HAGE, HAGH, HAL, HAST-2, HB 1, HBA2, HBA1, HBB, HBBP1, HBD, HBE1, HBG2, HBG1, HBHR, HBP1, HBQ1, HBZ, HBZP, HCA, HCC-1, HCC-4, HCF2, HCG, HCL2, HCL1, HCR, HCVS, HD, HPN, HER2, HER2/NEU, HER3, HERV-K-MEL, HESX1, HEXA, HEXB, HF1, HFE, HF1, HGD, HHC2, HHC3, HHG, HK1 HLA-A, HLA-A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HLA-DPB1 HLA-DRA, HLCS, HLXB9, HMBS, HMGA2, HMGCL, HMI, HMN2, HMOX1, HMS1 HMW-MAA, HND, HNE, HNF4A, HOAC, HOMEOBOX NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HOXA1 HOXD13, HP, HPC1, HPD, HPE2, HPE1, HPFH, HPFH2, HPRT1, HPS1, HPT, HPV-E6, HPV-E7, HR, HRAS, HRD, HRG, HRPT2, HRPT1, HRX, HSD11B2, HSD17B3, HSD17B4, HSD3B2, HSD3B3, HSN1, HSP70-2M, HSPG2, HST-2, HTC2, HTC1, hTERT, HTN3, HTR2C, HVBS6, HVBS1, HVEC, HV1S, HYAL1, HYR, I-309, IAB, IBGC1, IBM2, ICAM1, ICAM3, iCE, ICHQ, ICR5, ICR1, ICS 1, IDDM2, IDDM1, IDS, IDUA, IF, IFNa/b, IFNGR1, IGAD1, IGER, IGF-1R, IGF2R, IGF1, IGH, IGHC, IGHG2, IGHG1, IGHM, IGHR, IGKC, IHG1, IHH, IKBKG, IL1, IL-1 RA, IL10, IL-11, IL12, IL12RB1, IL13, IL-13Rα2, IL-15, IL-16, IL-17, IL18, IL-1a, IL-1α, IL-1b, IL-1β, IL1RAPL1, IL2, IL24, IL-2R, IL2RA, IL2RG, IL3, IL3RA,IL4, IL4R,IL4R, IL-5, IL6, IL-7, IL7R, IL-8, IL-9, 미성숙(Immature) 라미닌 수용체, IMMP2L, INDX, INFGR1, INFGR2, INFα, IFNβ, INFγ, INS, INSR, INVS, IP-10, IP2, IPF1, IP1, IRF6, IRS1, ISCW, ITGA2, ITGA2B, ITGA6, ITGA7, ITGB2, ITGB3, ITGB4, ITIH1, ITM2B, IV, IVD, JAG1, JAK3, JBS, JBTS1, JMS, JPD, KAL1, KAL2, KALI, KLK2, KLK4, KCNA1, KCNE2, KCNE1, KCNH2, KCNJ1, KCNJ2, KCNJ1, KCNQ2, KCNQ3, KCNQ4, KCNQ1, KCS, KERA, KFM, KFS, KFSD, KHK, ki-67, KIAA0020, KIAA0205, KIAA0205/m, KIF1B, KIT, KK-LC-1, KLK3, KLKB1, KM-HN-1, KMS, KNG, KNO, K-RAS/m, KRAS2, KREV1, KRT1, KRT10, KRT12, KRT13, KRT14, KRT14L1, KRT14L2, KRT14L3,KRT16, KRT16L1, KRT16L2, KRT17, KRT18, KRT2A, KRT3, KRT4, KRT5, KRT6 A, KRT6B, KRT9, KRTHB1, KRTHB6, KRT1, KSA, KSS, KWE, KYNU, L0H19CR1, L1CAM, LAGE, LAGE-1, LALL, LAMA2, LAMA3, LAMB3, LAMB1, LAMC2, LAMP2, LAP, LCA5, LCAT, LCCS, LCCS 1, LCFS2, LCS1, LCT, LDHA, LDHB, LDHC, LDLR, LDLR/FUT, LEP, LEWISY, LGCR, LGGF-PBP, LGI1, LGMD2H, LGMD1A, LGMD1B, LHB, LHCGR, LHON, LHRH, LHX3, LIF, LIG1, LIMM, LIMP2, LIPA, LIPA, LIPB, LIPC, LIVIN, L1CAM, LMAN1, LMNA, LMX1B, LOLR, LOR, LOX, LPA, LPL, LPP, LQT4, LRP5, LRS 1, LSFC, LT-β, LTBP2, LTC4S, LYL1, XCL1, LYZ, M344, MA50, MAA, MADH4, MAFD2, MAFD1, MAGE, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGEB1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1,MAGE-H1, MAGEL2, MGB1, MGB2, MAN2A1, MAN2B1, MANBA, MANBB, MAOA, MAOB, MAPK8IP1, MAPT, MART-1, MART-2, MART2/m, MAT1A, MBL2, MBP, MBS1, MC1R, MC2R, MC4R, MCC, MCCC2, MCCC1, MCDR1, MCF2, MCKD, MCL1, MC1R, MCOLN1, MCOP, MCOR, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCPH2, MCPH1, MCS, M-CSF, MDB, MDCR, MDM2, MDRV, MDS 1, ME1, ME1/m, ME2, ME20, ME3, MEAX, MEB, MEC CCL-28, MECP2, MEFV, MELANA, MELAS, MEN1 MSLN, MET, MF4, MG50, MG50/PXDN, MGAT2, MGAT5, MGC1 MGCR, MGCT, MGI, MGP, MHC2TA, MHS2, MHS4, MIC2, MIC5, MIDI, MIF, MIP, MIP-5/HCC-2, MITF, MJD, MKI67, MKKS, MKS1, MLH1, MLL, MLLT2, MLLT3, MLLT7, MLLT1, MLS, MLYCD, MMA1a, MMP 11, MMVP1, MN/CA IX-항원, MNG1, MN1, MOC31, MOCS2, MOCS1, MOG, MORC, MOS, MOV18, MPD1, MPE, MPFD, MPI, MPIF-1, MPL, MPO, MPS3C, MPZ, MRE11A, MROS, MRP1, MRP2, MRP3, MRSD, MRX14, MRX2, MRX20, MRX3, MRX40, MRXA, MRX1, MS, MS4A2, MSD, MSH2, MSH3, MSH6, MSS, MSSE, MSX2, MSX1, MTATP6, MTC03, MTCO1, MTCYB, MTHFR, MTM1, MTMR2, MTND2, MTND4, MTND5, MTND6, MTND1, MTP, MTR, MTRNR2, MTRNR1, MTRR,MTTE, MTTG, MTTI, MTTK, MTTL2, MTTL1, MTTN, MTTP, MTTS1, MUC1,MUC2, MUC4, MUC5AC, MUM-1, MUM-1/m, MUM-2, MUM-2/m, MUM-3, MUM-3/m, MUT, 돌연변이 p21 ras, MUTYH, MVK, MX2, MXI1, MY05A, MYB, MYBPC3, MYC, MYCL2, MYH6, MYH7, MYL2, MYL3, MYMY, MYO15A, MYO1G, MYO5A, MYO7A, MYOC, 마이오신(Myosin)/m, MYP2, MYP1, NA88-A, N-아세틸글루코사민일트랜스퍼라제-V, NAGA, NAGLU, NAMSD, NAPB, NAT2, NAT, NBIA1, NBS1, NCAM, NCF2, NCF1, NDN , NDP, NDUFS4, NDUFS7, NDUFS8, NDUFV1, NDUFV2, NEB, NEFH, NEM1, Neo-PAP, neo-PAP/m, NEU1, NEUROD1, NF2, NF1, NFYC/m, NGEP, NHS, NKS1, NKX2E, NM, NME1, NMP22, NMTC, NODAL, NOG, NOS3, NOTCH3, NOTCH1, NP, NPC2, NPC1, NPHL2, NPHP1, NPHS2, NPHS1, NPM/ALK, NPPA, NQO1, NR2E3, NR3C1, NR3C2, NRAS, NRAS/m, NRL, NROB1, NRTN, NSE, NSX, NTRK1, NUMA1, NXF2, NY-CO1, NY-ESO1, NY-ESO-B, NY-LU-12, ALDOA, NYS2, NYS4, NY-SAR-35, NYS1, NYX, OA3, OA1, OAP, OASD, OAT, OCA1, OCA2, OCD1, OCRL, OCRL1, OCT, ODDD, ODT1, OFC1, OFD1, OGDH, OGT, OGT/m, OPA2, OPA1, OPD1, OPEM, OPG, OPN, OPN1LW, OPN1MW, OPN1SW, OPPG, OPTB1, TTD, ORM1, ORP1, OS-9, OS-9/m, OSM LIF, OTC, OTOF, OTSC1, OXCT1, OYTES1, P15, P190 MINOR BCR-ABL, P2RY12, P3, P16, P40, P4HB, P-501, P53, P53/m, P97, PABPN1, PAFAH1B1, PAFAH1P1, PAGE-4, PAGE-5, PAH, PAI-1, PAI-2, PAK3, PAP, PAPPA, PARK2, PART-1, PATE, PAX2, PAX3, PAX6, PAX7, PAX8, PAX9, PBCA, PBCRA1, PBT, PBX1, PBXP1, PC, PCBD, PCCA, PCCB, PCK2, PCK1, PCLD, PCOS1, PCSK1, PDB1, PDCN, PDE6A, PDE6B, PDEF, PDGFB, PDGFR, PDGFRL, PDHA1, PDR, PDX1, PECAM1, PEE1, PEO1, PEPD, PEX10, PEX12, PEX13, PEX3, PEX5, PEX6, PEX7, PEX1, PF4, PFBI, PFC, PFKFB1, PFKM, PGAM2, PGD, PGK1, PGK1P1, PGL2, PGR, PGS, PHA2A, PHB, PHEX, PHGDH, PHKA2, PHKA1, PHKB, PHKG2, PHP, PHYH, PI, PI3, PIGA, PIM1-KINASE, PIN1, PIP5K1B, PITX2, PITX3, PKD2, PKD3, PKD1, PKDTS, PKHD1, PKLR, PKP1, PKU1, PLA2G2A, PLA2G7, PLAT, PLEC1, PLG, PLI, PLOD, PLP1, PMEL17, PML, PML/RARα, PMM2, PMP22, PMS2, PMS1, PNKD, PNLIP, POF1, POLA, POLH, POMC, PON2, PON1, PORC, POTE, POU1F1, POU3F4, POU4F3, POU1F1, PPAC, PPARG, PPCD, PPGB, PPH1, PPKB, PPMX, PPOX, PPP1R3A, PPP2R2B, PPT1, PRAME, PRB, PRB3, PRCA1, PRCC, PRD, PRDX5/m, PRF1, PRG4, PRKAR1A, PRKCA, PRKDC, PRKWNK4, PRNP, PROC, PRODH, PROM1, PROP1, PROS1, PRST, PRP8, PRPF31, PRPF8, PRPH2, PRPS2, PRPS1, PRS, PRSS7, PRSS1, PRTN3, PRX, PSA, PSAP, PSCA, PSEN2, PSEN1, PSG1, PSGR, PSM, PSMA, PSORS1, PTC, PTCH, PTCH1, PTCH2, PTEN, PTGS1, PTH, PTHR1, PTLAH, PTOS1, PTPN12, PTPNI l, PTPRK, PTPRK/m, PTS, PUJO, PVR, PVRL1, PWCR, PXE, PXMP3, PXR1, PYGL, PYGM, QDPR, RAB27A, RAD54B, RAD54L, RAG2, RAGE, RAGE-1, RAG1, RAP1, RARA, RASA1, RBAF600/m, RB1, RBP4, RBP4, RBS, RCA1, RCAS1, RCCP2, RCD1, RCV1, RDH5, RDPA, RDS, RECQL2, RECQL3, RECQL4, REG1A, REHOBE, REN, RENBP, RENS1, RET, RFX5, RFXANK, RFXAP, RGR, RHAG, RHAMM/CD168, RHD, RHO, Rip-1, RLBP1, RLN2, RLN1, RLS, RMD1, RMRP, ROM1, ROR2, RP, RP1, RP14, RP17, RP2, RP6, RP9, RPD1, RPE65, RPGR, RPGRIP1, RP1, RP10, RPS19, RPS2, RPS4X, RPS4Y, RPS6KA3, RRAS2, RS1, RSN, RSS, RU1, RU2, RUNX2,RUNXl, RWS, RYR1, S-100, SAA1, SACS, SAG, SAGE, SALL1, SARDH, SART1, SART2 , SART3, SAS, SAX1, SCA2, SCA4, SCA5, SCA7, SCA8, SCA1, SCC, SCCD, SCF, SCLC1, SCN1A, SCN1B, SCN4A, SCN5A, SCNN1A, SCNN1B, SCNN1G, SCO2, SCP1, SCZD2, SCZD3, SCZD4, SCZD6, SCZD1, SDF-1α/β SDHA, SDHD, SDYS, SEDL, SERPENA7, SERPINA3, SERPINA6, SERPINA1, SERPINC1, SERPIND1, SERPINE1, SERPINF2, SERPING1, SERPINI1, SFTPA1, SFTPB, SFTPC, SFTPD, SGCA, SGCB, SGCD, SGCE, SGM1, SGSH, SGY-1, SH2D1A, SHBG, SHFM2, SHFM3, SHFM1, SHH, SHOX, SI, SIAL, SIALYL LEWISX , SIASD, S11, SIM1, SIRT2/m, SIX3, SJS1, SKP2, SLC10A2, SLC12A1, SLC12A3, SLC17A5, SLC19A2, SLC22A1L, SLC22A5, SLC25A13, SLC25A15, SLC25A20, SLC25A4, SLC25A5, SLC25A6, SLC26A2, SLC26A3, SLC26A4, SLC2A1, SLC2A2, SLC2A4, SLC3A1, SLC4A1, SLC4A4, SLC5A1, SLC5A5, SLC6A2, SLC6A3, SLC6A4, SLC7A7, SLC7A9, SLC11A1, SLOS, SMA, SMAD1, SMAL, SMARCB1, SMAX2, SMCR, SMCY, SM1, SMN2, SMN1, SMPD1, SNCA, SNRPN, SOD2, SOD3, SOD1, SOS1, SOST, SOX9, SOX10, Sp17, SPANXC, SPG23, SPG3A, SPG4, SPG5A, SPG5B, SPG6, SPG7, SPINK1, SPINK5, SPPK, SPPM, SPSMA, SPTA1, SPTB, SPTLC1, SRC, SRD5A2, SRPX, SRS, SRY, βhCG, SSTR2, SSX1, SSX2 (HOM-MEL-40/SSX2), SSX4, ST8, STAMP-1, STAR, STARP1, STATH, STEAP, STK2, STK11, STn/ KLH, STO, STOM, STS, SUOX, SURF1, SURVIVIN-2B, SYCP1, SYM1, SYN1, SYNS1, SYP, SYT/SSX, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAAL6, TACSTD1, TACSTD2, TAG72, TAF7L, TAF1, TAGE, TAG-72, TALI, TAM, TAP2, TAP1, TAPVR1, TARC, TARP, TAT, TAZ, TBP, TBX22, TBX3, TBX5, TBXA2R, TBXAS1, TCAP, TCF2, TCF1, TCIRG1, TCL2, TCL4, TCL1A, TCN2, TCOF1, TCR, TCRA, TDD, TDFA, TDRD1, TECK, TECTA, TEK, TEL/AML1, TELAB1, TEX15, TF, TFAP2B, TFE3, TFR2, TG, TGFα, TGFβ, TGFβI, TGFβ1, TGFβR2, TGFβRE, TGFγ, TGFβRII, TGIF, TGM-4, TGM1, TH, THAS, THBD, THC, THC2, THM, THPO, THRA, THRB, TIMM8A, TIMP2, TIMP3, TIMP1, TITF1, TKCR, TKT, TLP, TLR1, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLX1, TM4SF1, TM4SF2, TMC1, TMD, TMIP, TNDM, TNF, TNFRSF11A, TNFRSF1A, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, TNFα, TNFβ, TNNI3, TNNT2, TOC, TOP2A, TOP1, TP53, TP63, TPA, TPBG, TPI, TPI/m, TPI1, TPM3, TPM1, TPMT, TPO, TPS, TPTA, TRA, TRAG3, TRAPPC2, TRC8, TREH, TRG, TRH, TRIM32, TRIM37, TRP1, TRP2, TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, TRPS1, TS, TSC2, TSC3, TSC1, TSG101, TSHB, TSHR, TSP-180, TST, TTGA2B, TTN, TTPA, TTR, TU M2-PK, TULP1, TWIST, TYH, TYR, TYROBP, TYROBP, TYRP1, TYS, UBE2A, UBE3A, UBE1, UCHL1, UFS, UGT1A, ULR, UMPK, UMPS, UOX, UPA, UQCRC1, URO5, UROD, UPK1B, UROS, USH2A, USH3A, USH1A, USH1C, USP9Y, UV24, VBCH, VCF, VDI, VDR, VEGF, VEGFR-2, VEGFR-1, VEGFR-2/FLK-1, VHL, VIM, VMD2, VMD1, VMGLOM, VNEZ, VNF, VP, VRNI, VWF, VWS, WAS, WBS2, WFS2, WFS1, WHCR, WHN, WISP3, WMS, WRN, WS2A, WS2B, WSN, WSS, WT2, WT3, WT1, WTS, WWS, XAGE, XDH, XIC, XIST, XK, XM, XPA, XPC, XRCC9, XS, ZAP70, ZFHX1B, ZFX, ZFY, ZIC2, ZIC3, ZNF145, ZNF261, ZNF35, ZNF41, ZNF6, ZNF198, 및 ZWS1.
부가적으로, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩되는 치료적으로 활성인 단백질은 또한 예를 들어, 예를 들어, TGFα 및 IGFs (인슐린-유사 성장 인자)와 같은 (트랜스제닉) 생명체의 성장을 촉진할 수 있는 성장 호르몬 또는 성장 인자, 예를 들어, 안티-트립신, LDL 수용체, 에라이쓰로포이에틴 (EPO), 인슐린, GATA-1, 등과 같은 대시 및/또는 혈액세포생성(haematopoiesis)에 영향을 주는 단백질들, 또는 예를 들어, 혈액 응고 시스템의 팩터(factor) VIII 및 XI과 같은 단백질 등으로부터 선택될 수 있다. 그러한 단백질은 예를 들어, β-갈락토시다제 (lacZ), DNA 제한 효소 (예를 들어, EcoRI, HindIII 등), 라이소자임 등과 같은 효소들, 또는 예를 들어, 파파인, 브로멜라인, 케라티나제, 트립신, 키모트립신, 펩신, 레닌 (키모신), 수이자임(suizyme), 노르타제(nortase) 등과 같은 프로테아제를 추가로 포함한다. 이러한 단백질들은 본 명세서에서 정의된 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩된다. 따라서, 본 발명은 치료받을 생체 (예를 들어, 돌연변이 때문에, 결손 또는 존재하지 않는 발현 때문에) 내에 결손인 단백질들을 대체하는 기술을 제공하고, 이것에 의해 치료받을 생체 내에서 (예를 들어, 단생 장애(monogenetic disorder), 바람직하게는 선천적 면역 반응이 일어나지 않는) 기능하지 않는 단백질들의 효과적이고 증가된 발현을 제공한다.
대안적으로, 본 명세서에서 정의된 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩되는 치료적으로 활성인 단백질들은 또한 프로테아제 등으로부터 선택될 수 있으며, 이것은 예를 들어, 장애 또는 질병을 야기하는 기능장애 또는 외래 단백질의 (과)발현 때문인 특정 질병을 치료한다. 따라서, 본 발명은 복합체화된 RNA를 생체 내로 치료적으로 도입하기 위하여 사용될 수 있으며, 이것은 병원성 유기체 (바이러스, 박테리아 등)를 공격한다. 예를 들어, RNA 코딩 치료활성 프로테아제는 바이러스 어셈블리 또는 바이러스 생성의 다른 필수적 단계에 필수적인 바이러스 단백질을 절단하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 정의된 바와 같은 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩되는 치료적으로 활성인 단백질은 또한 다양한 세포 내 경로를 조절하는 단백질들로부터 선택될 수 있으며, 예를 들어, 상기 경로는 특히 생체의 면역 시스템과 관련된, 아폽토시스, 세포 성장 등과 같은 중심적인 세포 내 프로세스에 영향을 미칠 수 있는 시그널 전달 조절 경로이다. 따라서, 사이토카인, 림포카인, 모노카인, 인터페론 등과 같은 면역 조절자(immune modulator)는 본 발명에서 정의된 복합체화된 RNA에 의해 효율적으로 발현될 수 있다. 바람직하게는, 그러므로 이러한 단백질들은 또한 예를 들어, 4 위치-특이 보존(conserved) 시스테인 잔기 (CCCC)를 포함하는 사이토카인 패밀리의 클래스 I의 사이토카인들 및 보존(conserved) 서열 모티프 Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS)를 포함하며, 여기에서 X는 비보존 아미노산이다. 사이토카인 패밀리의 클래스 I의 사이토카인들은 예를 들어, IL-3, IL-5, GM-CSF인 GM-CSF 서브-패밀리, 예를 들어, IL-6, IL-11, IL-12인 IL-6 서브-패밀미, 또는 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 등인 IL-2 서브-패밀리, 또는 IL-1α, IL-1β, IL-10 등과 같은 사이토카인들을 포함한다. 비유(analogy)적으로, 그러한 단백질들은 또한 사이토카인 패밀리(인터페론 수용체 패밀리)의 클래스 II의 사이토카인들을 포함하고, 이것은 앞선 사이토카인들과 달리 4 위치-특이 보존 시스테인 잔기들 (CCCC)을 포함하지만, 보존 서열 모티프 Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS)를 포함하지는 않는다. 사이토카인 패밀리의 클래스 II의 사이토카인들은 예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 등을 포함한다. 본 발명에 따른, (본 발명 면역억제 조성물의) 적어도 하나의 변형된 (m)RNA에 의해 코딩되는 단백질들은 예를 들어, TNF-α, TNF-β, TNF-RI, TNF-RII, CD40, Fas 등과 같은 종양 괴사 패밀리의 사이토카인들, 또는 예를 들어, IL-8, MIP-1, RANTES, CCR5, CXR4 등과 같은, 7 트랜스멤브레인 헬릭스를 포함하고 G-단백질과 상호작용을 하는 케모카인 패밀리의 사이토카인들을 추가로 포함한다. 그러한 단백질들은 또한 아폽토시스 인자 또는 아폽토시스-관련 또는 연관 단백질들로부터 선택될 수 있으며, 그러한 단백질들은 AIF, Apaf, 예를 들어, Apaf-1, Apaf-2, Apaf-3, 또는 APO-2 (L), APO-3 (L), 아포파인(apopain), Bad, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-xS, bik, CAD, 칼파인(calpain), 카스파제, 예를 들어, 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-3, 카스파제-4, 카스파제-5, 카스파제-6, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-10, 카스파제-11, ced-3, ced-9, c-Jun, c-Myc, crm A, 사이토크롬 C, CdR1, DcR1, DD, DED, DISC, DNA-PKCS, DR3, DR4, DR5, FADD/MORT-1, FAK, Fas (Fas 리간드 CD95/fas (수용체)), FLICE/MACH, FLIP, 포드린(fodrin), fos, G-액틴, Gas-2, 겔솔린(gelsolin), 그랜자임(granzyme) A/B, ICAD, ICE, JNK, 라민(lamin) A/B, MAP, MCL-1, Mdm-2, MEKK-1, MORT-1, NEDD, NF-kB, NuMa, p53, PAK-2, PARP, 페르포린(perforin), PITSLRE, PKCd, pRb, 프레세닐린(presenilin), prICE, RAIDD, Ras, RIP, 스핀고마이엘리나제(sphingomyelinase), Herpes simplex 유래 티미딘 키나제, TRADD, TRAF2, TRAIL, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, 트랜스글루타미나제 등을 포함한다.
부가적으로, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩되는 치료적으로 활성인 단백질들은 또한 항원 특이 T 세포 수용체를 코딩할 수 있다. T 세포 수용체 즉 TCR은 주 조직적합 복합체(major histocompatibility complex)(MHC) 분자에 결합하는 항원을 인식하는 역할을 담당하는 T 임파구 (또는 T 세포)의 표면에서 발견되는 분자이다. 이것은 T 세포의 95%에서 알파 및 베타 체인으로 이루어진 이질이합체(heterodimer)이고, T 세포의 나머지 5%는 감마 및 델타 체인으로 이루어진 TCR을 가지고 있다. 항원 및 MHC와 TCR의 관여(engagement)는 관련된 효소, 공-수용체 및 전문적 부속 분자들에 의해 중재되는 일련의 생화학적 이벤트를 통하여 그것의 T 림프구의 활성화를 초래한다. 따라서, 이러한 단백질들은 전문적으로 특정 항원을 타깃할 수 있으며, 그들의 타깃 성질 때문에 면역 시스템의 기능(functionality)을 보충할 수 있다. 따라서, 이러한 수용체들을 코딩하는 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)를 투여함에 의한 생체 내의 세포 트랜스펙션, 또는 바람직하게는, ex vivo 세포 트랜스펙션 접근법 (예를 들어, 특이적으로 일정 면역 세포를 트랜스펙션함으로써)이 추구될 수 있다. 도입된 T 세포 수용체 분자는 MHC 분자 상의 특정 항원을 인식하고, 그것에 의해 면역 시스템이 공격될 항원을 인식하는 것을 도울 수 있다.
본 발명의 복합체화된 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는, 치료적으로 활성인 단백질들은 보조(adjuvant) 단백질을 더 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 보조 단백질은 본 명세서에 정의된 선천적 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질로 이해되는 것이 바람직하다. 바람직하게, 그러한 선천적 면역 반응은 형태 인식 수용체(pattern recognition receptor), 예컨대 인간의 TLR1 내지 TLR10으로부터 선택된 Toll-유사 수용체나 쥐의 TLR1 내지 TLR13으로부터 선택된 Toll-유사 수용체를 포함한 Toll-유사 수용체 패밀리로부터 선택된 수용체의 활성화를 포함한다. 바람직하게, 선천적 면역 반응은 포유류, 더욱 바람직하게는 인간에 발생한다. 바람직하게, 보조 단백질은 인간의 보조 단백질 또는 병원성 보조 단백질, 특히 박테리아 보조 단백질로부터 선택된다. 덧붙여, 보조적 효과와 관련된 인간의 단백질을 코딩하는 mRNA도 마찬가지로 사용될 수 있다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 인간의 보조(애주번트) 단백질들은 일반적으로, (포유류의) 선천적 면역 반응, 예컨대 외래 TLR 리간드와 TLR을 결합시키는 반응을 유도할 수 있으면 어떤 인간의 단백질도 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 복합체화된 RNA에 의해 코딩될 수 있는 인간의 보조 단백질들은, 이에 한정되지 않지만, 선천적 면역 반응을 유도 또는 촉진시키는 사이토카인, 예를 들어 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21CCL21, GM-CSF 및 TNF-알파; 대식세포로부터 분비된 사이토카인, 예를 들어 IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, 및 TNF-알파; C1q, MBL, C1r, C1s, C2b, Bb, D, MASP-1, MASP-2, C4b, C3b, C5a, C3a, C4a, C5b, C6, C7, C8, C9, CR1, CR2, CR3, CR4, C1qR, C1INH, C4bp, MCP, DAF, H, I, P 및 CD59를 포함하는 보완 체계의 화합물로부터 선택될 수 있고; TLR 및 IL-1R1을 포함하는 형태(패턴) 인식 수용체들의 신호 네트워크들의 화합물들인 단백질로부터 선택될 수 있고, 여기에서 상기 요소(component)들은 IL-1 알파, IL-1 베타, 베타-데펜신(defensin), HSP10, HSP60, HSP65, HSP70, HSP75 및 HSP90와 같은 열 충격 단백질들, gp96, 피브리노겐, 피브리노겐의 TypIII 반복 엑스트라 도메인 A; IL-1RI, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11을 포함하는 수용체들; 작은-GTPase 시그널링 구성요소 (RhoA, Ras, Rac1, Cdc42 등), PIP 시그널링 구성요서 (PI3K, Src-Kinase 등), MyD88-의존성 시그널링 구성요소 (MyD88, IRAK1, IRAK2, 등), MyD88-비의존성 시그널링 구성요소(TICAM1, TICAM2 등)을 포함하는 시그널 트랜스듀서; 예를 들어, NF-kB, c-Fos, c-Jun, c-Myc를 포함하는 활성화된 전사 인자; 및 예를 들어, IL-1 알파, IL-1 베타, 베타-데펜신, IL-6, IFN 감마, IFN 알파 및 IFN 베타를 포함하는 유도된 타깃 유전자; CD28 또는 CD40-리간드 또는 PD1를 포함하는 공자극 분자(costimulatory molecule)로부터; LAMP를 포함하는 단백질 도메인들; 세포 표면 단백질들; 또는 CD80, CD81, CD86, trif, flt-3 리간드, 티모펜틴, Gp96 또는 피브로넥틴 등을 포함하는 인간 애주번트 단백질, 또는 상기 인간 애주번트 단백질 중 어떠한 것의 어떠한 종 유사체(any species homolog)를 포함하는 패턴 인식 수용체들의 리간드들이다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 병원성 보조(애주번트) 단백질들은 일반적으로, (포유류의) 선천적 면역 반응을 유도할 수 있으면 어떤 병원성 (보조) 단백질도 포함하며. 바람직하게는 박테리아, 원생동물, 바이러스, 또는, 곰팡이, 동물 등으로부터 유래된 병원성 (보조) 단백질, 더욱 바람직하게는 이에 한정되지 않지만, 박테리아 단백질, 원생동물 단백질(예를 들어, 프로필린(profilin)- Toxoplasma gondii 단백질 같은), 바이러스 단백질 또는 곰팡이 단백질, 동물 단백질 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 병원성 보조 단백질을 포함한다.
이와 관련해서, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 박테리아 (보조) 단백질은 (바람직하게, 포유류의) 선천적 면역 반응을 유도할 수 있으면 어떤 박테리아 단백질도 포함할 수 있다. 바람직하게, 복합체화된 RNA에 의해 코딩될 수 있는 박테리아 (보조) 단백질은, 이에 한정되지 않지만, 박테리아 플라젤린(flagellin), 예를 들면 Agrobacterium, Aquifex , Azospirillum , Bacillus, Bartonella , Bordetella , Borrelia, Burkholderia, Campylobacter , Caulobacte , Clostridium , Escherichia, Helicobacter , Lachnospiraceae , Legionella , Listeria , Proteus , Pseudomonas , Rhizobium , Rhodobacter , Roseburia, Salmonella , Serpulina , Serratia , Shigella , Treponema , Vibrio, Wolinella , Yersiniaf를 포함한 미생물들로부터의 플라젤린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아 (보조) 단백질들을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 이에 한정되지 않지만, Agrobacterium tumefaciens, Aquifex pyrophilus, Azospirillum brasilense, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bartonella bacilliformis, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Caulobacter crescentus, Clostridium botulinum strain Bennett clone 1, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Lachnospiraceae bacterium, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeroguinosa, Pseudomonas syringae, Rhizobium meliloti, Rhodobacter sphaeroides, Roseburia cecicola, Roseburis hominis, Salmonella typhimurium, Salmonella bongori, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Serpulina hyodysenteriae, Serratia marcescens, Shigella boydii, Treponema phagedenis, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Wolinella succinogenes 및 Yersinia enterocolitica를 포함한 종(species)으로부터의 플라젤린으로 이루어진 그룹에서 선택된 박테리아 보조 단백질을 포함할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 박테리아 플라젤린(flagellin)은 특히 보조(애주번트) 형질을 나타내는 어떠한 박테리아 플라젤린으로부터 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100를 포함하는 박테리아성 열 충격 단백질 또는 샤페론(chaperon); 그람-음성 박테리아 유래 OmpA (Outer membrane protein); OmpF 포함 박테리아성 포린; Bordetella pertussis 유래 퍼튜시스 톡신(pertussis toxin (PT)), Bordetella pertussis 유래 퍼튜시스 아데닐레이트 사이클라제 톡신 CyaA 및 CyaC, 퍼튜시스 톡신 유래 PT-9K/129G 돌연변이, Bordetella pertussis 유래 퍼튜시스 아데닐레이트 사이클라제 CyaA 및 CyaC, 테타누스 톡신, 콜레라 톡신 (CT), 콜레라 톡신 B-서브유닛, 콜레라 톡신 유래 CTK63 돌연변이, CT 유래 CTE112K 돌연변이, Escherichia coli 열-불안정성 장독소 (LT), 열-불안정성 장독소 유래 B 서브유닛 (LTB) LTK63, LTR72를 포함하는 감소된 독성을 가지는 Escherichia coli 열-불안정성 장독박테리아성 독소를 포함하는 박테리아성 톡신; Helicobacter pylori 유래 페놀-용해성 모듈린; 뉴트로필-활성화 단백질 (HP-NAP); Borrelia burgdorferi 유래 계면활성제 단백질 D; 외부 표면(Outer surface) 단백질 A 리포단백질, Mycobacterium tuberculosis 유래 Ag38 (38 kDa 항원); 박테리아성 핌브리아(bacterial fimbriae) 유래 단백질; 비브리오 콜레라의 장독소 CT, 그람 음성 박테리아 유래 섬모 유래 필린(Pilin), 및 계면활성제 단백질 A; 등, 또는 상기 박테리아성 (애주번트) 단백질의 어느 것의 일정 종 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아성 플라젤린으로부터 선택된다.
더욱 바람직하게, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 박테리아 플라젤린은 수납번호(accession number)로 표시되는 하기 서열들 중 어느 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.
Figure 112010021098252-pct00001
Figure 112010021098252-pct00002
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 원생동물 단백질은 보조 형질을 나타내는 어떠한 원생동물 단백질로부터 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 이에 한정되지 않지만, Trypanosoma cruzi로부터의 Tc52, Trypanosoma gondii로부터의 PFTG, 원생동물 열충격 단백질, Leishmania spp.로부터의 LeIF, Toxoplasma gondii로부터의 프로필린-유사 단백질 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 바이러스 단백질은 보조 형질을 나타내는 어떠한 원생동물 단백질로부터 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 이에 한정되지 않지만, 호흡기 세포융합 바이러스 융합 당단백질 (F-단백질), MMT 바이러스로부터의 외피 단백질, 쥐의 백혈병 바이러스 단백질, 야생형 홍역 바이러스의 헤마글루티닌(Hemagglutinin) 단백질 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 곰팡이 단백질은 보조 형질을 나타내는 어떠한 원생동물 단백질로부터 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 이에 한정되지 않지만, 곰팡이 면역조절 단백질(FIP; LZ-8) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
마지막으로, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 병원성 보조 단백질은 보조 형질을 나타내는 어떤 추가적인 병원성 단백질로부터 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 이에 한정되지 않지만, 구멍삿갓조개 헤모시아닌(Keyhole limpet hemocyanin)(KLH), OspA 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 대안적으로 항원을 코딩할 수 있다. 본 발명에 따르면, "항원"이라는 용어는 면역 체계에 의해 인식되고, 예를 들면, 항체의 형성에 의한 항원-특이 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질을 말한다. 항원은 유래에 따라 분류될 수 있다. 따라서, 두 개의 주요한 항원 종류로 외인성 항원과 내인성 항원이 있다. 외인성 항원은, 예를 들면, 흡입, 음식물 섭취 또는 주입 등에 의하여 (세포나 신체) 외부로부터 세포 또는 신체 안으로 들어가는 항원이다. 이 항원은 항원-제시 세포(수지상 세포 또는 대식 세포 같은 "APCs")에 의해 내화되고 절편들로 처리된다. 그런 후, APCs는 표면 상의 MHC II 분자들을 사용하여 절편들을 조력 T세포들(예를 들어, CD4+)에 제시한다. T세포들에 의한 이러한 항원 절편들의 인식은 T세포들의 활성화와 사이토카인의 분리로 이어진다. 사이토카인은 세포독성 T세포, B세포 또는 대식세포 같은 면역 세포들의 증식을 활성화시킬 수 있는 물질이다. 반대로, 내인성 항원은, 예를 들어, 정상 세포의 물질대사의 결과로 세포 내에서 발생된 항원이다. 이러한 항원의 절편들은 항원-제시 세포의 표면 상의 MHC I 분자들에 제시된다. 이러한 항원은 활성화된 항원-특이 세포독성 CD8+ T 세포들에 의해 인식된다. 인식 후, 이러한 T 세포들은 항원-제시 세포의 용해 또는 아포토시스(apoptosis)로 인한 서로 다른 독소들의 분비에 반응한다. 내인성 항원은, 예를 들면, 세포 자체의 유전정보에 의해 코딩되는 단백질 또는 펩타이드 뿐만 아니라 세포 내 외래 핵산에 의해 코딩되는 단백질 또는 펩타이드 같은 항원, 또는 세포내 발생 바이러스(intracellularly occurring virus)로부터의 항원을 포함한다. 내인성 항원의 한 종류는 종양 항원의 종류이다. 이러한 항원은 종양 세포의 표면 상의 MHC I 분자들에 제시된다. 이 종류는 종양-특이 항원(TSAs)과 종양-관련 항원(TAAs)으로 더 세분될 수 있다. 종양-특이 항원은 종양 세포들에 의해서만 제시되고 정상의 건강한 세포에 의해서는 제시될 수 없다. 종양-특이 항원은 일반적으로 종양 특이 돌연변이로부터 기인한다. 더 흔한 종양-관련 항원은 대개 종양 세포와 건강한 세포 모두에 의해 제시된다. 이 항원은 인식되고, 항원-제시 세포는 세포독성 T세포들에 의해 파괴될 수 있다. 덧붙여, 예를 들면, 종양 항원은 돌연변이형 수용체의 형태로 종양의 표면에 발생할 수 있다. 이러한 경우, 종양 항원은 항체에 의해 인식될 수 있다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 항원은, 예를 들어, 단백질, 펩타이드 또는 그의 절편을 포함할 수 있다. 바람직하게, 항원은 단백질, 펩타이드 또는 그의 절편, 예를 들어, 단백질이나 펩타이드의 에피토프일 수 있다. 일반적으로, 에피토프("항원결정소"로도 칭함)는 5 내지 15, 바람직하게는 9 내지 15의 아미노산(B-세포 에피토프 및 T-세포 에피토프는 일반적으로 MHC 분자들 상에 제시되고, 여기서, 예를 들어, MHC-I는 일반적으로 약 9 aa의 길이를 가진 에피토프를 제시하고 MHC-II는 일반적으로 약 12 내지 15의 길이 를 가진 에피토프를 제시함)을 가진 그러한 항원 단백질 또는 펩타이드 구조의 외표면 상에 위치한 절편이다. 또한, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 항원은 다른 생체분자, 예를 들어, RNA (분자)에 공유 또는 비공유 식으로 부착될 수 있는 지질, 탄수화물 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 항원은 외인성 항원 또는 내인성 항원일 수 있다. 내인성 항원은 세포, 특히 종양 세포 같은 퇴화 세포 내에 발생된 항원을 포함한다. 이러한 항원은 "종양 세포"로도 지칭된다. 바람직하게, 이에 한정되지 않지만, 그들은 세포의 표면 상에 위치한다. 또한, "종양 항원"은 스스로 퇴화된 (또는 원래부터 스스로 퇴화된) 것이 아니라 추정 종양과 관련된 세포에서 발현된 항원을 의미하기도 한다. 종양-제공 정맥 또는 그의 (재)형성과 관계된 항원, 특히 신혈관 형성과 관련된 항원, 예를 들어 VEGF, bFGF 등의 성장 요인도 포함된다. 종양과 관계된 항원은, 일반적으로 종양을 포매하는 세포 또는 조직으로부터의 항원을 더 포함한다. 더욱이, 몇몇의 물질들은 (인식하든 못하든) 암으로 고통받는 환자에게 발현되고, 환자의 체액, 예를 들어 단백질의 증가된 농도로 발생하며, 이는 종양 세포의 침투 및 전이와 연관이 있다. 이러한 물질은 "종양 항원"으로도 지칭되지만, 면역 반응 유도 물질의 엄격한 의미에서는 항원이 아니다. 이의 사용 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 항원은 예시적으로, 예를 들어, 특정 목적에 적합한 어떠한 항원으로부터, 예를 들어, 본 발명에서 정의된 바와 같은 특정 감염 질병과 관련된 (또는 원인인) 항원으로부터, 종양 표면 항원과 같은 암 항원으로부터, 암 질병에서 발현되는 항원으로부터, 암 질병에서 발현되는 돌연변이 항원으로부터, 또는 예를 들어, 자가면역 질병, 알러지 등과 같은 다른 질병의 병인학에 관여하는 단백질 항원 등으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 이러한 항원들은 환자의 알러지 또는 자가면역 상태를 야기하는 항원을 투여함으로써 환자를 탈감작하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩되는 바람직한 예시적인 항원성 (폴리)펩타이드는 공지된 모든 항원성 펩타이드, 예를 들어, 종양 항원 등을 포함한다. 종양 항원의 특정한 예로는 inter alia 종양-특이 표면 항원(TSSAs), 예를 들어, 5T4, 알파5베타1-인테그린, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, Bcr-abl, MN/C IX 항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, 베타-카테닌/m, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27/m, CD 30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MART-2/Ski, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, PAP, proteinase-3, p190 마이너 bcr-abl, Pml/RAR알파, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, 서비빈(survivin), TEL/AML1, TGF베타, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF 및 WT1이거나, 또는 예를 들어, NY-Eso-1 또는 NY-Eso-B 같이 서열로부터 유래한다. 어떤 종류의 종양 항원이라도 본 발명의 목적에 적합하며, 예를 들어, 세포 밖의 매트릭스 구조 등에 영향을 미치며 신혈관 형성과 관련 있는 것으로 알려진 종양 항원이 적합하다. 상기 항원의 절편들 및 유사체들도 포함된다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 종양 항원의 예들은 하기 표 1과 표 2에 나타난다. 이들 표는 암 질환에 대하여 그와 관련있는 특정 (단백질) 항원(즉, "종양 항원")을 보여준다. 본 발명에 따르면, "암 질환"과 "종양 질환"이라는 용어는 본 명세서에서 동의어로 사용된다.
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Figure 112010021098252-pct00005
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Figure 112010021098252-pct00010
본 발명에 따른 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 종양 항원의 예들은 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, 5 1-인테그린, 5 6-인테그린, -액티닌-4/m, 메틸아실-조효소 A 라세마아제(racemase), ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, 카테닌/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, 칼레티큘린(calreticulin), CAMEL, CASP-8/m, 카텝신(cathepsin) B, 카텝신 L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, coactosin-유사 단백질, 콜라지(collage) XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, 사이클린 B1, 사이클린 D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, 헵신, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, 호메오박스(homeobox) NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, 미숙한 라미닌 수용체, 칼리크레인(kallikrein)-2, 칼리크레인-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, 마마글로빈(mammaglobin) A, MART-1/멜란-A, MART-2, MART-2/m, 기질 단백질(matrix protein) 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, 메소텔린(mesothelin), MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-antigen, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, 미오신 클래스(class) I/m, NA88-A, N-아세틸글루코사미닐 전이효소(acetylglucosaminyltransferase)-V, Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오폰틴(osteopontin), p15, p190 마이너 bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-Kinase, Pin-1, Pml/PARa, POTE, PRAME, PRDX5/m, 프로스타인(prostein), 프로테이나아제(proteinase)-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP, 서비빈, 서비빈-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGFb, TGFbRII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, 타이로시나아제(tyrosinase), UPA, VEGF, VEGFR-2/FLK-1, 및 WT1으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 종양 항원의 예들은 MAGE-A1 [기탁번호 M77481], MAGE-A6 [기탁번호 NM_005363], 멜란-A [기탁번호 NM_005511], GP100 [기탁번호 M77348], tyrosinase [기탁번호 NM_000372], 서비빈 [기탁번호 AF077350], CEA [기탁번호 NM_004363], Her-2/neu [기탁번호 M11730], WT1 [기탁번호 NM_000378], PRAME [기탁번호 NM_006115], EGFRI (상피 성장 요인 수용체 1) [기탁번호 AF288738], 뮤신-1 [기탁번호 NM_002456], 및 SEC61G [기탁번호 NM_014302]로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가 대안으로, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 항체를 코딩할 수 있다. 본 발명에 따르면, 그러한 항체는 어떤 항체에서든지 선택될 수 있지만, 예를 들면, 종래 기술에 알려진, 재조합하여 생성되거나 자연적으로 발생하는 항체, 특히 치료용, 진단용 또는 과학적 목적에 적합한 항체, 또는 특정 암 질환과 관련하여 확인된 항체로부터 선택될 수 있다. 여기서, "항체"라는 용어는 넓은 의미에서 사용되고, 구체적으로 단일클론 항체와 다클론 항체(주동근(agonist), 길항근(antagonist), 및 차단(blocking) 또는 중화(neutralizing) 항체 포함), 폴리에피토픽 특이성(polyepitopic specificity)을 가진 항체 종을 포함한다. 본 발명에 따르면, "항체"는 일반적으로 종래 기술에 알려진 항체(예를 들어, IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE 항체), 예를 들어, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 이중특이성(bispecific) 항체, 세포내항체, 즉 세포 내에서 발현되고 선택적으로 특정 세포 격실(compartment)에 위치되는 항체뿐만 아니라, 자연적으로 발생하는 항체, 숙주 미생물 내 면역화에 의해 생성된 항체, 자연적으로 발생하는 항체로부터 분리되어 확인된 항체, 또는 숙주 미생물 내 면역화에 의해 생성되거나 종래 기술에 공지된 생체분자 방법에 의해 재조합으로 생성된 항체로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 항체는 경쇄와 중연쇄로 구성되고, 두 개 모두 가변 및 불변 도메인을 갖는다. 경쇄는 N-말단 가변 도메인, VL, 및 C-말단 불변 도메인, CL으로 구성된다. 반대로, IgG 항체의 중연쇄는, 예를 들어, is comprised of an N-말단 가변 도메인, VH, 및 세 개의 불변 도메인들, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 하나의 사슬 항체는 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는데, 바람직하게는, 단일-가닥 RNA에 의해, 더욱 바람직하게는 mRNA에 의해 코딩될 수 있다.
제1 대안에 따르면, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 다클론 항체를 코딩할 수 있다. 이와 관련해서, "다클론 항체"라는 용어는 일반적으로, 숙주 미생물, 예를 들어, 염소, 소, 백조, 개, 고양이, 당나귀, 원숭이, 유인원 같은 포유류, 쥐, 햄스터와 토끼 같은 설치류의 면역화에 의해 발생된 단백질의 특이성 항원, 또는 면역원, 또는 에피토프에 대한 항체의 혼합물을 의미한다. 다클론 항체는 일반적으로 동일하지 않으므로, 대개 동일한 항원으로부터 상이한 에피토프 또는 영역을 인식한다. 따라서, 그러한 경우에, 단백질의 특이성 항원, 또는 면역원, 또는 에피토프에 대해 특이성(단일클론) 항체를 코딩하는 RNA 분자에 있어서, 본 발명에 의해 청구된 바와 같이 복합체화된 상이한 RNA 분자들의 혼합물(조성물)이 적용될 것이다.
추가적인 대안에 따르면, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 단일클론 항체를 코딩할 수 있다. 여기서, 일반적으로 "단일클론 항체"라는 용어는 실질적으로 동종의 항체들, 즉 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적인 돌연변이를 제외하고 모집단을 이루는 개별 항체들의 모집단에서 얻어진 항체를 말한다. 단일클론 항체는 하나의 항원성 부위에 대해 꽤 특이적이다. 더구나, 일반적으로 상이한 결정소(에피토프)에 대해 상이한 항체들을 포함하는 종래의(다클론) 항체 조제와 달리, 각각의 단일클론 항체는 항원에 대한 하나의 결정소에 대한 것이다. 예를 들어, 상기에 정의된 단일클론 항체는 Kohler 및 Milstein, Nature, 256:495 (1975)에 최초로 개시된 히브리도마(hybridoma) 법에 의해, 또는 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567호에 개시된 바와 같이 재조합 DNA 방법에 의해 생성될 수 있다. "단일클론 항체"는, 예를 들어 McCafferty et al ., Nature, 348:552-554 (1990)에 개시된 기술을 이용하여 생성된 파아지 라이브러리(phage libraries)로부터 분리될 수도 있다. Kohler 및 Milstein에 따르면, 대상이 되는 면역원(항원)은 쥐 같은 숙주로 주입되고, 면역원에 반응하여 생성된 B-세포 림프구는 일정 시간 후 수확된다. B-세포는 쥐로부터 얻어진 골수종 세포와 조합되고, B-세포와 골수종 세포가 융합하여 하이브리도마를 생성하도록 하는 매개체로 도입된다. 그런 후, 이러한 융합된 세포(하이브리도마)를 마이크로타이터 플레이트의 별도의 웰에 놓은 다음 성장시켜 단일클론 항체들을 생성시킨다. 대상이 되는 항원을 검출하기에 적합한 것이 어느 것인지 결정하기 위해 단일 항체들을 테스트한다. 선택된 후, 단일 항체들은 하이브리도마의 생쥐 주입 또는 세포 배양에서 성장될 수 있다. 그러나 본 발명의 목적을 위해, 이러한 항체들의 펩타이드 서열은 차례로 나열되어야 하고, 이러한 항체들을 코딩하는 RNA 서열들은 종래 기술에 잘 알려진 공정에 따라 준비될 수 있다.
인간의 치료 목적을 위해, 인간 이외의 단일클론 또는 다클론 항체들, 예를 들어 쥐의 항체들도 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있다. 그러나, 그러한 항체들은 일반적으로 인간 이외의 항체에 대한 인간 항체를 생성함으로써 면역 반응을 유도하므로, 인간의 신체에 제한적으로만 사용된다. 따라서, 인간 이외의 특정한 항체는 인간에 한번만 투여될 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 이외 및 인간 항체들은 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 "키메라 항체"는 바람직하게 상기 항체의 불변 도메인들이 다른 미생물들로부터의 항체들의 서열, 바람직하게, 인간의 서열로 대체된 항체이다. 또한, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩될 수 있는 "인간화" (인간 이외의) 항체는 상기한 항체의 불변 및 가변 도메인들(고도 가변 도메인 제외)이 인간의 서열로 대체된 항체이다. 다른 대안에 따르면, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 인간 항체, 즉 인간 서열만을 가진 항체를 코딩할 수 있다. 그러한 인간 항체는 인간 조직, 또는 인간 IgG 유전자 자리에 대한 이식 유전자인, 면역화된 인간이 아닌 숙주 미생물로부터 분리될 수 있고, 차례로 나열된 RNA 서열은 종래 기술에 잘 알려진 공정에 따라 준비될 수 있다. 덧붙여, 인간 항체는 파아지 디스플레이(phage display)의 사용으로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 이중 특이성 항체를 코딩할 수 있다. 본 발명의 명세서에 있어서, "이중 특이성(bispecific)" 항체는, 바람직하게, 효과기와 개별 표적 사이의 적응기 역할을 하는 항체로, 여기서 표적은, 예를 들어, 독성, 약물, 사이토카인 등 같은 효과기 분자들을 회복시킬 목적의 CTL, NK 세포, 대식세포, 과립성 백혈구 등이 있다 (참조: Kontermann R.E., Acta Pharmacol. Sin, 2005, 26(1): 1-9). 본 명세서에 설명된 이중 특이성 항체는, 일반적으로, 예를 들어, 상기한 두 개의 상이한 항체, 면역원, 에피토프, 약물, 세포 (또는 세포의 수용체), 또는 기타 분자(또는 구조)를 인식하는 구성이다. 이중 특이성은 항체의 항원-결합 영역이 두 개의 상이한 에피토프에 대해 특이하다는 것을 의미한다. 따라서, 상이한 항원, 면역원 또는 에피토프 등은 서로 밀접해 수 있으며, 이는 선택적으로 두 요소들의 직접적인 상호작용을 가능하게 한다. 예를 들어, 효과기 세포와 표적 세포 같은 상이한 세포들은 이중 특이성 항체를 통해 연결될 수 있다. 이에 한정되지 않지만, 본 발명에 의하면, 한편으로는 본 명세서에 설명한 바와 같이 수용성 항원과 결합하고 다른 한편으로는 종양 세포의 표면에 있는 항체 또는 수용체와 결합하는 항체 또는 절편일 수 있다.
요약하면, 본 발명에 따르면, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 또한 상기한 바와 같이 항체를 코딩할 수 있다. 이러한 항체는 세포내 발현된 항체, 즉 세포의 특정 격실에 위치한 핵산에 의해 코딩되고 거기서 발현된 항체이므로, 그러한 항체는 세포내 항체로 명명될 수 있다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 코딩된 항체는 바람직하게 전길이(full-length) 항체, 즉 상기한 바와 같이, 모든 중쇄와 경쇄로 이루어진 항체를 포함할 수 있다. 그러나, 항체 절편, 변이체 또는 대사체(adduct) 같은 항체의 유도체는 본 발명에 따라 복합체화된 RNA의 상기한 적어도 하나의 RNA에 의해 코딩될 수 있다.
또한, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 전술한 항체의 Fab, Fab', F(ab')2, Fc, Facb, pFc', Fd 및 Fv 절편으로부터 선택된 항체 절편을 코딩할 수 있다. 일반적으로, 항체 절편은 종래 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, Fab ("절편, 항원 결합") 절편은 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 불변 도메인과 하나의 가변 도메인으로 구성된다. 두 개의 가변 도메인은 특정 항원의 에피토프를 결합한다. 두 개의 고리는 이황화물 결합을 통해 연결된다. 단쇄가변절편(scFv; "single chain variable fragment")은, 예를 들어, 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인으로 이루어진다. 도메인들은 인위적인 결합, 일반적으로는 예를 들어 15-25 글리신(glycine), 프롤린(proline) 및/또는 세린(serine) 잔기(residue)로 이루어진 펩타이드 같은 폴리펩타이드 결합으로 링크된다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 전술한 치료적으로 활성인 단백질, 항원 또는 항체의 절편 및/또는 변이체를 코딩할 수 있고, 여기에서 절편 및/또는 변이체는 전술한 치료적으로 활성인 단백질, 항원 또는 항체 중 하나와 이러한 치료적으로 활성인 단백질, 항원 또는 항체를 코딩하는 코딩 핵산 또는 아미노산 서열의 전 길이에 걸쳐 적어도 70%, 80% 또는 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성(sequence identity)을 가질 수 있다. 바람직하게, 절편 및/또는 변이체는 동일한 전길이의 본래의 치료적으로 활성인 단백질, 항원 또는 항체와 비교하여 생물학적 기능 또는 특이 활성화, 예를 들어 특이 결합력(예를 들어, 특정 항원의), 촉매 활성화(예를 들어, 치료적으로 활성인 단백질의) 등을 갖는다. 이와 관련해서, 본 명세서에 설명된 항체의 "생물학적 기능"은 항원의 중성화, 보체 활성화(complement activation), 옵소닌화(opsonization)도 포함한다. 이에 따라, 항체는 일반적으로 세포 표면 상의 본래의 에피토프 또는 자유 항원을 인식한다. 상기한 항체는 세포-제시 항원과 상호작용하고 상이한 방어 매커니즘을 개시할 수 있다. 한편, 항체는 표적이된 세포에서 시그널링 매커니즘을 개시하여 세포의 자기파괴(아포토시스)에 이르게 할 수 있다. 다른 한편으로, 신체의 면역 체계의 기타 요소들이나 작용기 세포들이 인식하고 공격할 수 있도록 세포를 표지(mark)할 수 있다. 공격 매커니즘은 항체의존형 보체-매개 세포독성(CMC) 및 항체의존형 세포독성(ADCC)으로 지칭될 수 있다. 항체의존형 세포독성(ADCC)은 항체표지된 세포와 결합하고, 그들의 직접적인 작용 또는 다른 세포 형태의 회복을 통해 꼬리표가 붙은 세포의 죽음에 이르게 하는 면역 세포에 의한 항체의 인식을 수반한다. 항체의존형 보체-매개 세포독성(CMC)은 대개 몇 개의 항체들이 서로 밀접할 때 상이한 보체 단백질의 캐스케이드(cascade)가 활성화되어 세포 용해가 발생하거나 기타 면역 세포들을 적용기 세포 기능을 위한 이 위치로 끌어 당기는 공정이다. 항원의 중성화에 있어서, 항체는 항원과 결합하고 그를 중성화할 수 있다. 그러한 중성화 반응은 일반적으로 항체의 차단에 이르게 된다. 따라서, 항체는 하나의 항원하고만 결합할 수 있고, 또는 이중 특이성 항체의 경우, 두 개의 항원과 결합할 수 있다. 특히, scFv 항체 절편은 항체의 불변 도메인의 기능성을 포함하지 않으므로, 중성화 반응에 유용하다. 보체 활성화에 있어서, 보체 단백질의 복합 시스템은 항체의 Fc 부분으로부터 독립적인 항체의 결합을 통해 활성화될 수 있다. 보체 캐스케이드의 최종 생성물로 인해 세포의 융해 및 염증을 일으키는 환경의 생성이 일어난다. 옵소닌화에 있어서, 병원균 또는 세포를 포함하지 않은 기타 파티클(particle)은 항체의 불변 도메인과 결합을 통해 식세포(phagocyte)에 접근할 수 있다. 대안으로써, 외래로 인식된 세포는 항체의존형 세포-매개 세포독성(ADCC)을 통해 융해될 수 있다. 특히, NK-세포는 Fc 수용체를 활성화시킴으로써 융해를 표시할 수 있다.
RNA 서열(핵산 또는 아미노산)이 동일한 백분율을 결정하기 위해, 순차적으로 상호 비교를 하기 위하여 서열은 배열될 수 있다. 따라서, 제1 서열의 순서에 간극(gap)이 삽입되고, 제2 서열의 대응하는 위치의 요소는 비교될 수 있다. 제1 서열의 한 위치가 제2 서열의 한 위치에서 그러하듯이 동일한 요소에 의해 점유되고 있다면, 두 서열은 이 위치에서 동일하다. 두 서열이 동일한 백분율은 위치의 총 갯수를 동일 위치의 갯수로 나눈 함수이다.
두 서열이 동일한 백분율은 수학적 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 이에 한정되지 않으나, 사용될 수 있는 수학적 알고리즘의 바람직한 예는 Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877 또는 Altschul et al . (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402의 알고리즘이다. 그러한 알고리즘은 BLAST 프로그램에서 적분된다. 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA와 어느 정도 동일한 서열은 이 프로그램에 의해 확인될 수 있다.
생리학적 서열과 비교하여 보존적 치환(conservative substitution)을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 (본 발명의 복합체화된 RNA의) 적어도 하나의 RNA 분자는 특히 변이체라는 용어에 해당한다. 동일한 클래스로부터 유래하는 코딩된 아미노산이 서로 교환되는 치환을 보존적 치환이라고 부른다. 특히, 이러한 것들은 코딩된 아미노산 코딩된 지방족 사이드 체인, 양성 또는 음성으로 하전된 사이드 체인, 사이드 체인의 방향족 그룹 또는 사이드 체인이 수소 브릿지를 형성할 수 있는 코딩된 아미노산, 예를 들어, 하이드록실 기능을 가진 사이드 체인이다. 이것은, 예를 들어, 극성 측쇄를 가진 아미노산이 유사한 극성 측쇄를 가진 다른 아미노산으로 대체되는 것을 의미하거나, 또는 예를 들어 소수성 측쇄로 특징지어진 아미노산이 유사한 소수성 측쇄를 가진 다른 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다 (예를 들어, 세린이 트레오닌(threonine)으로 대체 또는 그 반대, 또는 류신이 이소류신으로 대체 또는 그 반대). 3차원 구조에 변형을 일으키지 않거나 결합 영역에 영향을 끼치지 않는 서열 위치에서 삽입과 치환은 가능하다. 삽입 또는 삭제에 의한 3차원 구조의 변형은, 예를 들어, CD 스펙트라(원형 2색성 스펙트라) (Urry, 1985, 흡수, 폴리펩타이드의 원형 2색성 및 ORD, 생화학에서 현대의 물리적 방법, Neuberger et al . (ed.), 암스테르담 엘스비어) 용이하게 결정될 수 있다.
면역촉진 RNA
제3 실시예에 따르면, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 면역촉진 RNA이다. 이에 따라, 면역촉진 RNA는 상기한 바와 같은 화학식(I)에 따른 신규한 올리고펩타이드와 RNA의 복합체화 이전에 이미 면역촉진 효과를 나타낼 수 있거나, 더 바람직하게는, 여기에 사용된 RNA의 면역촉진 효과는 개선되거나 상기한 바와 같은 화학식(I)에 따른 신규한 올리고펩타이드와 RNA의 복합체화에 의해 유도될 수 있다. 본 발명의 복합체화된 RNA의 면역촉진 RNA는 상기한 바와 같이 어떤 RNA든 가능하지만, 예를 들어, 코딩 RNA일 수 있다. 바람직하게, 면역촉진 RNA는 단일-가닥, 이중가닥 또는 부분 이중가닥 RNA, 더욱 바람직하게는 단일-가닥 RNA 및/또는 원형 또는 선형 RNA, 더욱 바람직하게는, 선형 RNA일 수 있다. 더더욱 바람직하게, 면역촉진 RNA는 (선형) 단일가닥 메신저 RNA (mRNA)일 수 있다. 또한, 면역촉진 RNA는 상기한 바와 같이 짧은 올리고뉴클레오타이드로 발생할 수 있다.
또한, 여기에 사용된 면역촉진 RNA는, 면역반응을 유도할 수 있는, 자연에서 발견되거나 합성하여 제조된, RNA 분자들의 어느 클래스로부터 선택될 수 있다. 이와 관련해서, 면역반응은 다양한 방식으로 발생할 수 있다. 적합한 면역 반응을 위한 실질적인 요인은 상이한 T-세포 소집단의 촉진이다. T-림프구는 일반적으로 두 개의 소집단, 즉 T-1 조력세포(Th1)와 T-2 조력세포(Th2)로 나뉘고, 이들 덕분에 면역체계는 세포내(Th1) 및 세포외(Th2) 병원균(예를 들어, 항원)을 파괴할 수 있다. 두개의 Th 세포집단은 그들에 의해 생성된 효과기 단백질(사이토카인)의 형태 면에서 상이하다. 따라서, Th1 세포는 대식세포와 독성 T-세포의 활성화에 의해 세포의 면역 반응을 돕는다. 한편, Th2 세포는 플라즈마 세포로의 변환을 위해 B-세포의 촉진 및 항체(예를 들어, 항원에 대한)의 형성에 의해 체액 면역 반응을 촉진시킨다. 따라서, Th1/Th2 비율은 면역 반응에서 매우 중요하다. 본 발명과 관련하여, 면역 반응의 Th1/Th2 비율은 바람직하게 세포 반응(Th1 반응)을 향하는 방향으로 이동되고 이에 따라 세포의 면역 반응은 유도된다. 하나의 예에 따르면, 면역 체계는 Toll-유사 수용체(TLRs)의 리간드에 의해 활성화될 수 있다. Toll-유사 수용체(TLRs)는 병원체-관련 분자 형태(PAMPs)를 인식하고 포유류의 선천적 면역에서 결정적인 역할을 하는 고도로 보존된 형태 인식 수용체 (PRR) 폴리펩타이드의 패밀리이다. 현재, TLR1 - TLR13 (Toll-유사 수용체: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 또는 TLR13)로 지정된 적어도 13개의 패밀리 구성원들이 확인되었다. 특정 TLR 리간드의 갯수도 확인되었다. 예를 들어, 메틸화되지 않은 박테리아 DNA 및 그의 합성 유사체(CpG DNA)는 TLR9용 리간드인 것으로 밝혀졌다 (Hemmi H et al . (2000) Nature 408:740-5; Bauer S et al . (2001) Proc NatlAcadSci USA 98, 9237-42). 또한, 어떤 Toll-유사 수용체용 리간드는 어떤 핵산 분자들을 포함하고 어떤 RNA 종류는 서열-독립적 또는 서열-의존적인 방식으로 면역 촉진적인 반면, 이러한 다양한 면역촉진 RNA는, 예를 들어, TLR3, TLR7, 또는 TLR8, 또는 RIG-I, MDA-5 등 같은 세포내 수용체를 촉진할 수 있다. 예를 들어, Lipford et al .는 TLR7 및 TLR8을 통해(참조 WO 03/086280) 활성화시킴으로써 어떤 G, U-함유 올리고리보뉴클레오티드를 면역촉진적으로 결정하였다. Lipford et al .에 의해 설명된 면역촉진 G, U-함유 올리고리보뉴클레오티드는 리보솜 RNA, 전이 RNA, 메신저 RNA, 및 바이러스성 RNA를 포함한 RNA 소스(source)로부터 유래되는 것으로 여겨졌다.
본 발명에 따르면, (특정 길이, 쇄의 수, 변형 및/또는 뉴클레오티드 서열 에 상관없이) 예를 들어, 상기한 바와 같이 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (화학식 I)에 따른 캐리어 펩타이드와 복합체화된 RNA (분자)는 면역촉진적인 특성을 가질 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기한 바와 같이 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (화학식 I)에 따른 캐리어 펩타이드와 복합체화된 RNA는 특정 치료에 적합하고 바람직하다면 (비특이) 면역촉진을 개선시키는데 사용될 수 있다. 따라서, RNA와 화학식 (I)에 따른 펩타이드의 복합체화에 의한 면역촉진 효과를 제공하는 것은 본 발명의 복합체화된 RNA의 본질적인 특성일 수 있다.
따라서, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 (면역촉진) RNA (분자)는 따라서 면역촉진하는 것으로 알려진 어떠한 RNA 서열을 포함할 수 있으며, 이것은 TLR의 리간드, 바람직하게는 TLR1 - TLR13 패밀리 멤버들, 더 바람직하게는 TLR7 및 TLR8로부터 선택되는 TLR 리간드를 대표 및/또는 코딩하는 RNA 서열들, (RIG-I 또는 MAD-5 등과 같은) RNA에 대한 세포 내 수용체를 위한 리간드들(예를 들어, Meylan, E., Tschopp, J. (2006). Toll-like receptors and RNA helicases: two parallel ways to trigger antiviral responses. Mol. Cell 22, 561-569 참조), 또는 어떠한 다른 면역촉진 RNA 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 게다가, 면역촉진 RNA로 사용될 수 있는 (클래스의) RNA 분자는 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 어떠한 다른 RNA를 포함할 수 있다. 그러한 면역촉진 RNA는 리보솜 RNA (rRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 메신저 RNA (mRNA), 및 바이러스성 RNA (vRNA)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 (면역촉진) RNA (분자)로 사용될 수 있는 그러한 RNA 분자들(의 추가 클래스)은, 이에 한정되지 않지만, 예를 들어 화학식 (IIa)의 RNA 분자를 포함할 수 있다:
G l X m G n ,
여기에서,
G는 구아노신, 우라실, 또는 구아노신 또는 우라실의 유사체;
X는 구아노신, 우라실, 아데노신, 티미딘, 사이토신, 또는 상기 뉴클레오티드의 유사체;
l는 1 내지 40의 정수,
여기에서, l = 1일 때, G는 구아노신 또는 그의 유사체,
l > 1일 때, 상기 뉴클레오티드의 적어도 50%는 구아노신 또는 그의 유사체;
m은 정수이고 적어도 3;
여기에서, m = 3일 때, X는 우라실 또는 그의 유사체,
m > 3 일때, 적어도 3개의 연속하는 우라실 또는 우라실의 유사체가 발생하고;
n은 1 내지 40의 정수,
여기에서, n = 1일 때, G는 구아노신 또는 그의 유사체,
n > 1일 때, 상기 뉴클레오티드의 적어도 50%는 구아노신 또는 그의 유사체이다.
덧붙여, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 (면역촉진) RNA (분자)로 사용될 수 있는 그러한 RNA 분자들(의 추가 클래스)은, 이에 한정되지 않지만, 예를 들어 화학식 (IIb)의 RNA 분자를 포함할 수 있다:
C l X m C n ,
여기에서,
C는 사이토신, 우라실, 또는 사이토신 또는 우라실의 유사체;
X는 구아노신, 우라실, 아데노신, 티미딘, 사이토신, 또는 상기 뉴클레오티드의 유사체;
l는 1 내지 40의 정수,
여기에서, l = 1일 때, C는 사이토신 또는 그의 유사체,
l > 1일 때, 상기 뉴클레오티드의 적어도 50%는 사이토신 또는 그의 유사체;
m은 정수이고 적어도 3;
여기에서, m = 3일 때, X는 우라실 또는 그의 유사체,
m > 3일 때, 적어도 3개의 연속하는 우라실 또는 우라실의 유사체가 발생하고;
n은 1 내지 40의 정수,
여기에서, n = 1일 때, C는 사이토신 또는 그의 유사체,
n > 1일 때, 상기 뉴클레오티드의 적어도 50%는 사이토신 또는 그의 유사체이다.
바람직하게, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 (면역촉진) RNA (분자)로 여기서 사용된 면역촉진 RNA 분자는, 일반적으로, 상기한 바와 같이, 본 발명의 복합체화된 RNA의 RNA 분자에 대한 길이를 포함할 수 있는데, 바람직하게는 5 내지 5000 뉴클레오티드의 길이, 또는 500 내지 5000, 더욱 바람직하게는 1000 내지 5000, 대안적으로, 5 내지 1000, 또는 5 내지 500, 또는 5 내지 250, 또는 5 내지 100, 또는 5 내지 50, 더욱 바람직하게는 5 내지 30 뉴클레오티드의 길이를 포함한다.
상기 DNA의 면역촉진 특성을 개선하기 위해, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기서 사용된 적어도 하나의 면역촉진 RNA는 더 변형될 수 있는데, 바람직하게는 화학적으로 변형될 수 있다. "화학적 변형"이라는 용어는 본 발명에 따른 면역촉진 RNA로 사용된 RNA가 자연발생적 RNA 종과 비교하여 개별 또는 몇 개의 원자 또는 원자 그룹의 대체, 삽입 또는 제거에 의해 변형되는 것을 의미한다.
바람직하게, RNA의 화학적 변형은 적어도 자연발생적인 뉴클레오티드의 하나의 유사체를 포함한다. 한정적이지 않은 목록에서, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 뉴클레오티드 유사체로 언급될 수 있는 예로는 구아노신, 우라실, 아데노신, 티미딘, 사이토신의 유사체가 있다. 변형은 염기, 리보오스 모이어티 및/또는 포스페이트 백본 모이어티의 변형을 말할 수 있다. 이와 관련해서, 구아노신, 우라실, 아데노신, 및 사이토신의 유사체는, 제한없이, 화학적으로 변화된, 예를 들어 아세틸화, 메틸화, 하이드록실화 등에 의해 변화된 어떤 자연발생적 또는 비자연발생적 구아노신, 우라실, 아데노신, 티미딘 또는 사이토신을 포함하며, 예를 들어, 1-메틸-아데노신, 1-메틸-구아노신, 1-메틸-이노신, 2,2-디메틸-구아노신, 2,6-디아미노퓨린, 2'-아미노-2'-디옥시아데노신, 2'-아미노-2'-디옥시시티딘, 2'-아미노-2'-디옥시구아노신, 2'-아미노-2'-디옥시우리딘, 2-아미노-6-클로로퓨린리보시드, 2-아미노퓨린-리보시드, 2'-아라아데노신, 2'-아라시티딘, 2'-아라우리딘, 2'-아지도-2'-디옥시아데노신, 2'-아지도-2'-디옥시시티딘, 2'-아지도-2'-디옥시구아노신, 2'-아지도-2'-디옥시우리딘, 2-클로로아데노신, 2'-플루오로-2'-디옥시아데노신, 2'-플루오로-2'-디옥시시티딘, 2'-플루오로-2'-디옥시구아노신, 2'-플루오로-2'-디옥시우리딘, 2'-플루오로티미딘, 2-메틸-아데노신, 2-메틸-구아노신, 2-메틸-티오-N6-이소페네닌-아데노신, 2'-O-메틸-2-아미노아데노신, 2'-O-메틸-2'-디옥시아데노신, 2'-O-메틸-2'-디옥시시티딘, 2'-O-메틸-2'-디옥시구아노신, 2'-O-메틸-2'-디옥시우리딘, 2'-O-메틸-5-메틸우리딘, 2'-O-메틸이노신, 2'-O-메틸슈도우리딘, 2-티오시티딘, 2-티오-사이토신, 3-메틸-사이토신, 4-아세틸-사이토신, 4-티오우리딘, 5-(카르복시하이드록시메틸)-우라실, 5,6-디하이드로우리딘, 5-아미노알릴시티딘, 5-아미노알릴-디옥시-우리딘, 5-브로모우리딘, 5-카르복시메틸아모노메틸-우라실, 5-클로로-아라-사이토신, 5-플루오로-우리딘, 5-요도우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸-우리딘, 5-메톡시-우리딘, 5-메틸-2-thio-우리딘, 6-아자시티딘, 6-아자우리딘, 6-클로로-7-데아자-구아노신, 6-클로로퓨린리보시드, 6-메르캅토-구아노신, 6-메틸-메르캅토퓨린-리보시드, 7-데아자-2'-디옥시-구아노신, 7-데아자아데노신, 7-메틸-구아노신, 8-아자아데노신, 8-브로모-아데노신, 8-브로모-구아노신, 8-메르캅토-구아노신, 8-옥소구아노신, 벤즈이미다졸-리보시드, 베타-D-마노실-퀘오신, 디하이드로-우라실, 이노신, N1-메틸아데노신, N6-([6-아미노헥실]카바모일메틸)-아데노신, N6-이소펜테닐-아데노신, N6-메틸-아데노신, N7-메틸-잔토신, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 퓨로마이신, 퀘오신, 우라실-5-옥시아세트산, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 와이부톡소신(Wybutoxosine), 잔토신, 및 자일로-아데노신을 포함한다. 그러한 유사체들의 제조는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 US 4,373,071, US 4,401,796, US 4,415,732, US 4,458,066, US 4,500,707, US 4,668,777, US 4,973,679, US 5,047,524, US 5,132,418, US 5,153,319, US 5,262,530 및 US 5,700,642에 개시되어 있다. 상기한 바와 같은 유사체의 경우, 본 발명에 따라, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기서 사용된 면역촉진 RNA 서열의 면역성을 증가 및/또는 상기 면역촉진 RNA로 도입된 추가 변형과 간섭하지 않는 상기한 유사체들을 참조한다.
siRNA
제4 실시예에 있어서, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 siRNA 형태일 수 있다. siRNA는 RNA 간섭 현상과 관련하여 매우 중요하다. 면역 연구 과정에서 RNA 간섭 현상에 주목하였다. 최근, 곰팡이, 식물 및 동물계에서 모두 발생하고 "게놈의 면역 체계" 역할을 하는 RNA-방어 매커니즘을 발견하였다. 공정의 기저 매커니즘이 동일한 것으로 확인할 수 있기 전까지, 그러한 체계는 최초로 C. elegans에서 원래 서로 독립적인 다양한 종에서 설명되었다. 따라서, 식물에서 RNA-매개 바이러스 저항, 식물에서 PTGS (전사후의 유전자 침묵(silencing)), 및 진핵생물에서 RNA 간섭은 공통의 공정에 기초한다. RNA 간섭(RNAi)의 체외 기술은 유전자 발현의 서열-특이 억제를 유발하는 이중 가닥 RNA 분자(dsRNA)에 기초한다 (Zamore (2001) Nat. Struct. Biol. 9: 746-750; Sharp (2001) Genes Dev. 5:485-490: Hannon (2002) Nature 41: 244-251). 긴 dsRNA를 가진 포유류 세포의 트랜스펙션에서, 단백질 키나아제 R 및 RnaseL의 활성화는 비특이적 효과, 예를 들어, 인터페론 반응(Stark et al . (1998) Annu. Rev. Biochem. 67: 227-264; He and Katze (2002) Viral Immunol. 15: 95-119)을 일으킨다. 이러한 비특이적 효과는 30 bp (Elbashir et al . (2001) Nature 411: 494-498)보다 더 짧은 siRNA에 의해 유발되지 않으므로, 더 짧은, 에를 들어, 21- to 23-mer, 소위 siRNA (작은 간섭 RNA(small interfering RNA))가 사용될 때 그 비특이적 효과는 회피된다. 최근, dsRNA 분자도 생체조건에서 사용되었다 (McCaffrey et al . (2002), Nature 418: 38-39; Xia et al . (2002), Nature Biotech. 20: 1006-1010; Brummelkamp et al . (2002), Cancer Cell 2: 243-247). 따라서, 본 발명에 따라 복합체화된 RNA용으로 사용된 siRNA는 일반적으로 (단일- 또는) 이중 가닥 RNA 서열을 포함하는데, 바람직하게는 약 8 내지 30 뉴클레오티드를 가진 이중 가닥의 RNA 서열, 바람직하게는 17 내지 25, 더 바람직하게는 20 내지 25, 가장 바람직하게는 21 내지 23 뉴클레오티드를 가진 이중 가닥의 RNA 서열을 포함한다. 특히, 상기한 RNA 서열, 예를 들어, (m)RNA 서열의 코딩 영역에서 발생하는 17 내지 29 염기쌍의 길이를 가진 모든 분절들, 바람직하게 19 내지 25, 가장 바람직하게 21 내지 23 염기쌍의 길이를 가진 모든 분절들은 siRNA를 위한 표적 서열의 역할을 할 수 있다. 동일하게, siRNA도 코딩 영역, 특히 RNA의 5' 비-코딩 영역에 없는 상기한 (치료적으로 관련있는) 단백질 또는 항원의 뉴클레오티드 서열을 표적으로 하므로, 따라서 조절 기능을 가진 RNA의 비-코딩 영역을 표적으로 할 수 있다. 따라서, siRNA의 표적 서열은 RNA의 번역된 및/또는 번역되지 않은 영역, 및/또는 제어 요소의 영역에 있을 수 있다. 또한, siRNA의 표적 서열은 번역되지 않은 서열과 번역된 서열의 중복된 영역에 있을 수 있다. 특히, 표적 서열은 RNA의 코딩 영역의 시작 트리플렛(triplet)의 적어도 하나의 뉴클레오티드 하류(upstream)를 포함할 수 있다.
안티센스 RNA
제5 실시예에 따르면, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 안티센스 RNA일 수 있다. 본 발명의 명세서에서, 안티센스 RNA는 바람직하게 주형(template), DNA의 가닥보다는 코딩에 기초하여 전사된 (단일 가닥) RNA 분자이므로, 센스 (메신저) RNA와 상보적이다. 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기서 사용된 안티센스 RNA는 일반적으로 센스 및 안티센스 RNA 분자들 사이에 2쇄 DNA분자를 형성하여 mRNA의 번역(translation)을 방해할 수 있다. 이에 따라, 코딩된 단백질의 번역이 감소/억제되면, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기서 사용된 안티센스 RNA는 (치료적으로 관련있는) 단백질 또는 항원(예를 들어, 상기한 바와 같은 항원)을 코딩할 수 있는 mRNA 서열의 일부를 표적으로 할 수 있다(mRNA 서열의 일부에 상보적일 수 있다). 따라서, 표적 mRNA에 대한 안티센스 RNA의 표적 서열은 mRNA의 번역된 영역 및/또는 번역되지 않은 영역, 예를 들어, mRNA 제어 요소의 영역, 특히 조절 기능을 행하는 RNA의 5' 비-코딩 영역에 위치될 수 있다. 또한, 표적 mRNA에 대한 안티센스 RNA의 표적 서열은 안티센스 RNA가 표적 mRNA의 번역되지 않은 서열 및 번역된 (코딩) 서열과 부분적으로 상보적인 영역을 그의 서열로 커버함으로써 mRNA와 결합하도록 구성될 수 있다. 특히, 안티센스 RNA는 표적 mRNA의 코딩 영역의 시작 트리플렛의 적어도 하나의 뉴클레오티드 상류에 의해 표적 mRNA 서열과 상보적일 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기서 사용된 안티센스 RNA는 (본 발명의 복합체화된 RNA의) RNA 분자를 위해 일반적으로 상기한 바와 같은 길이를 포함한다. 일반적으로 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기서 사용된 안티센스 RNA는 표적 mRNA의 절편일 것이다. 더욱 상세하게, 안티센스 RNA는 바람직하게 5 내지 5000, 또는 500 내지 5000의 길이, 더욱 바람직하게는, 1000 내지 5000, 또는 대안적으로, 5 내지 1000, 5 내지 500, 5 내지 250, 5 내지 100, 5 내지 50, 또는 5 내지 30 뉴클레오티드, 또는 대안적으로, 더더욱 바람직하게 20 내지 100, 또는 20 내지 80, 또는 20 내지 60 뉴클레오티드의 길이를 포함할 수 있다.
RNA 의 변형
하나의 실시예에 따르면, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기에 사용된 RNA(예를 들어, 특이 치료 가능성, 길이, 및/또는 서열에 상관없이), 특히 짧은 RNA 올리고뉴클레오티드, 코딩 RNA, 면역촉진 RNA, siRNA, 안티센스 RNA, 리보스위치(riboswitch), 리보자임(ribozyme) 또는 압타머(aptamer) 는 변형된 RNA로 제공될 수 있다. 여기에서, 변형(특히, 하기에 개시되는 변형)은 (조합하여 또는 그대로) 상기한 RNA (분자)로 도입될 수 있다. 그러나, 특정 형태의 변형은 특정 RNA 형태(예를 들어, 코딩 RNA)에 더 적합할 수 있는 반면, 그외의 변형은 어떤 RNA 분자에든 적용될 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되지 않지만, 특정 RNA 형태에 제한되지 않는다. 따라서, RNA의 변형은 본 발명의 주제의 사용으로 원하는 특정 또는 복합 효과를 달성하기 위해 도입될 수 있다. 따라서, 변형은, 예를 들어, 붕괴에 대비한 RNA의 안정화, 트랜스펙션 효능 개선, 면역 가능성 증가 및/또는 치료 가능성 향상(예를 들어, 침묵 또는 안티센스 특성 향상)을 위한 것일 수 있다. 특히, 신규한 복합체화된 RNA의 요소로서의 변형된 RNA가 적어도 하나, 바람직하게 적어도 두 개의 기능성의 향상을 조합시킨다면, 예를 들어, RNA를 안정화시키고 치료 또는 면역 가능성을 향상시킨다면, 바람직하다.
일반적으로, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기에 사용된 RNA를 안정화시켜 생체조건에서 반감기를 연장시키는 것이 제1 목적이다. 바람직하게, 생체조건하에서 변형된 RNA의 반감기는 (변형되지 않은 RNA와 비교하여) 적어도 20, 바람직하게는 적어도 40, 더 바람직하게는 적어도 50, 더욱 바람직하게는 적어도 70, 80, 90, 100, 150 또는 200% 연장된다. 변형에 의해 달성된 안정화는, 변형되지 않은 RNA와 비교하여, 변형된 RNA의 반감기를 적어도 5분, 10분, 15분, 30분 또는 바람직하게는 적어도 60분 연장할 수 있다.
하나의 실시예에 따르면, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자), 바람직하게는 코딩 RNA, 예를 들어, mRNA는, 예를 들어, RNA의 코딩 영역의 G/C 함량을 변경함으로써 안정화될 수 있다. 특히, 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 대응하는 야생형 RNA, 즉 변형되지 않은 RNA의 코딩 영역의 G/C 함량과 비교하여, (본 발명의 복합체화된 RNA의) RNA의 코딩 영역의 G/C 함량은 변경, 특히 증가된다. 대응하는 야생형 RNA에 의해 코딩된 아미노산 서열과 비교하여, 변형된 RNA의 코딩된 아미노산 서열은 변경되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기에 사용된 RNA의 이러한 변형은 번역되어야 하는 RNA의 코딩 서열이 그 RNA의 효과적인 번역을 위해 중요하다는 사실에 기초한다. 특히, G(구아노신)/C(사이토신) 함량이 증가된 서열은 A(아데노신)/U(우라실) 함량이 증가된 서열보다 더 안정적이다. 따라서, 본 발명에 따르면, 야생형 RNA와 비교하여, RNA의 코돈(codon)은 변형되는 반면, 번역된 아미노산 염기는 G/C 뉴클레오티드량의 증가를 포함하도록 보존된다. 몇몇의 코돈이 하나의 동일한 아미노산(소위 유전암호의 퇴화)의 유전암호를 지정한다는 사실에 관하여, 안정성에 가장 유리한 코돈이 결정될 수 있다 (소위 선택적 코돈 사용).
본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기에 사용된 RNA에 의해 코딩되는 아미노산에 따라, 야생형 서열과 비교하여 RNA 서열의 변형에 대한 다양한 가능성이 있다. G 또는 C 뉴클레오티드만을 포함한 코돈에 의해 코딩되는 아미노산의 경우, 코돈의 변형이 필요하지 않다. 따라서, Pro (CCC 또는 CCG), Arg (CGC 또는 CGG), Ala (GCC 또는 GCG) 및 Gly (GGC 또는 GGG)에 대한 코돈은 A 또는 U가 존재하지 않으므로 변형이 필요하지 않다.
반대로, A 및/또는 U 뉴클레오티드를 포함한 코돈은 A 및/또는 U를 포함하지 않으나 동일한 아미노산의 유전암호를 지정하는 기타 코돈의 치환에 의해 변형될 수 있다. 이에 대한 예는 다음과 같다:
Pro에 대한 코돈은 CCU 또는 CCA에서 CCC 또는 CCG로 변형될 수 있다.
Arg에 대한 코돈은 CGU 또는 CGA 또는 AGA 또는 AGG에서 CGC 또는 CGG로 변형될 수 있다.
Ala에 대한 코돈은 GCU 또는 GCA에서 GCC 또는 GCG로 변형될 수 있다.
Gly에 대한 코돈은 GGU 또는 GGA에서 GGC 또는 GGG로 변형될 수 있다.
다른 경우, 코돈으로부터 A 또는 U 뉴클레오티드를 제거할 수 없더라도, A 및/또는 U 뉴클레오티드의 함량이 더 낮은 코돈을 사용함으로써 A 및 U 함량을 줄일 수 있다. 이에 대한 예는 다음과 같다:
Phe에 대한 코돈은 UUU에서 UUC로 변형될 수 있다.
Leu에 대한 코돈은 UUA, UUG, CUU 또는 CUA에서 CUC 또는 CUG로 변형될 수 있다.
Ser에 대한 코돈은 UCU 또는 UCA 또는 AGU에서 UCC, UCG 또는 AGC로 변형될 수 있다.
Tyr에 대한 코돈은 UAU에서 UAC로 변형될 수 있다.
Cys에 대한 코돈은 UGU에서 UGC로 변형될 수 있다.
His에 대한 코돈은 CAU에서 CAC로 변형될 수 있다.
Gln에 대한 코돈은 CAA에서 CAG로 변형될 수 있다.
Ile에 대한 코돈은 AUU 또는 AUA에서 AUC로 변형될 수 있다.
Thr에 대한 코돈은 ACU 또는 ACA에서 ACC 또는 ACG로 변형될 수 있다.
Asn에 대한 코돈은 AAU에서 AAC로 변형될 수 있다.
Lys에 대한 코돈은 AAA에서 AAG로 변형될 수 있다.
Val에 대한 코돈은 GUU 또는 GUA에서 GUC 또는 GUG로 변형될 수 있다.
Asp에 대한 코돈은 GAU에서 GAC로 변형될 수 있다.
Glu에 대한 코돈은 GAA에서 GAG로 변형될 수 있다.
종결코돈 UAA는 UAG 또는 UGA로 변형될 수 있다.
다른 한편, Met (AUG) 및 Trp (UGG)에 대한 코돈의 경우, 서열 변형 가능성이 없다.
야생형 RNA(즉, 원래의 서열)과 비교하여, 상기 나열한 치환은 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기에 사용된 RNA의 G/C 함량을 증가시키기 위하여, 개별적으로 또는 가능한 모든 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 야생형 서열에 발생하는 Thr에 대한 모든 코돈은 ACC (또는 ACG)로 변형될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 상기 치환의 조합이 사용되는 것이 바람직하다:
원래 서열(야생형 RNA)에서 Thr에 대한 모든 코돈을 ACC (또는 ACG)로 치환,
Ser의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 UCC (또는 UCG 또는 AGC)로 치환;
원래 서열에서 Ile의 유전암호를 지정하는 모든 코돈을 AUC로 치환,
Lys의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 AAG로 치환,
Tyr의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 UAC로 치환,
원래 서열에서 Val의 유전암호를 지정하는 모든 코돈을 GUC (또는 GUG)로 치환,
Glu의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 GAG로 치환,
Ala의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 GCC (또는 GCG)로 치환,
Arg의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 CGC (또는 CGG)로 치환,
원래 서열에서 Val의 유전암호를 지정하는 모든 코돈을 GUC (또는 GUG)로 치환,
Glu의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 GAG로 치환,
Ala의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 GCC (또는 GCG)로 치환,
Gly의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 GGC (또는 GGG)로 치환,
Asn의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 AAC로 치환;
원래 서열에서 Val의 유전암호를 지정하는 모든 코돈을 GUC (또는 GUG)로 치환,
Phe의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 UUC로 치환,
Cys의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 UGC로 치환
Leu의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 CUG (또는 CUC)로 치환,
Gln의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 CAG로 치환,
Pro의 유전암호를 원래 지정하는 모든 코돈을 CCC (또는 CCG)로 치환 등.
바람직하게는, 단백질의 유전암호를 지정하는 야생형 RNA의 코딩된 영역의 G/C 함량과 비교하여, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기에 사용된 RNA의 코딩 영역의 G/C 함량은 적어도 7%, 바람직하게는 적어도 15%, 특히 바람직하게는 적어도 20% 증가한다. 특정 실시예에 따르면, 단백질 또는 야생형 RNA의 서열 전체의 유전암호를 지정하는 영역에서 치환가능한 코돈은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70 %, 더 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90%, 95% 또는 100%까지이므로, 상기 서열의 G/C 함량을 증가 또는 최대화할 수 있다. 이와 관련해서, 특히 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기에 사용된 RNA의 G/C 함량을, 특히 단백질의 유전암호를 지정하는 영역에서 최대로(즉, 치환가능한 코돈의 100%) 증가시키는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기에 사용된 RNA의 더 바람직한 변형은 세포 내 tRNA의 상이한 발생 빈도에 의해서도 번역 효율이 결정된다는 발견에 기초한다. 따라서, 소위 "희소 암호(rare code)"가 RNA 서열에 증가된 정도로 존재하면, 대응하는 변형된 RNA 서열은 상대적으로 "빈번한" tRNA의 유전암호를 지정하는 코돈이 존재하는 경우보다 더 빈약한 정도로 번역된다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 복합체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기에 사용된 RNA에 있어서, 야생형 RNA의 대응 영역과 비교하여, 세포 내에서 비교적 희귀한 tRNA의 유전암호를 지정하는 야생형 서열의 적어도 하나의 콘돈이 비교적 희귀한 tRNA와 동일한 아미노산을 운반하고 세포 내에서 비교적 빈번한 tRNA의 유전암호를 지정하는 콘돈과 교환되도록 단백질의 유전암호를 지정하는 영역은 변형된다. 이러한 변형으로, RNA 서열은 빈번히 발생하는 tRNA가 유용한 콘돈이 삽입되도록 변형된다. 즉, 본 발명에 따르면, 이러한 변형으로, 세포 내에서 비교적 희귀한 tRNA의 유전암호를 지정하는 야생형 서열의 모든 콘돈은 각각의 경우에 비교적 희귀한 tRNA와 동일한 아미노산을 운반하고 세포 내에서 비교적 빈번한 tRNA의 유전암호를 지정하는 콘돈과 각각의 경우에 교환될 수 있다. tRNA가 세포내에서 비교적 빈번히 발생하고 반대로 비교적 희귀하게 발생하는 것은 당업자에게 공지된 기술로, 예를 들어, Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666에 개시되어 있다. The codons which use for the particular amino acid the 가장 빈번히 발생하는 tRNA를 특정 아미노산을 위해 사용하는 콘돈, 예를 들어, (인간) 세포에서 가장 빈번히 발생하는 tRNA를 사용하는 Gly 콘돈이 특히 바람직하다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따라 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기에 사용된 RNA 내에서 증가된, 특히 최대화된 순차 G/C 함량을 RNA의 코딩 영역에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변형하지 않은 "빈번한" 콘돈과 링크하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 바람직한 실시예는 본 발명에 따라 복체화된 RNA의 특별히 효과적으로 번역 및 안정화된(변형된) RNA의 제공을 가능하게 한다. 본 발명에 따라 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로 여기에 사용된 RNA의 G/C 함량(증가된 G/C 함량; tRNA의 교환)은 WO 02/098443에 설명된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 이 국제특허공개의 내용은 본 발명의 전범위에 포함된다. 이 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 세포 내에서 가능한 한 빈번하게 발생하는 tRNA의 유전암호를 지정하는 콘돈의 사용과 조합하여 최대 G/C 함량이 결과로 발생하도록 원하는 RNA의 뉴클레오티드 서열은 유전암호 또는 그의 퇴화성 성질의 도움으로 변형될 수 있고, RNA (분자)에 의해 코딩된 아미노산 염기는 변형되지 않은 염기와 비교하여 변형되지 않는 것이 바람직하다. 또는, 원래 서열과 비교하여, G/C 함량 또는 콘돈 사용만을 변경하는 것도 가능하다. 비주얼 베이직(Visual Basic) 6.0의 원시코드 (사용된 개발 환경: 서비스팩 3 포함 마이크로소프트 비주얼 스튜디오 엔터프라이즈 6.0) 또한 WO 02/098443에 설명된다.
본 발명의 더 바람직한 실시예에 있어서, 특히 야생형 RNA의 리보솜 결합 부위의 환경에서 A/U 함량과 비교하여, 본 발명에 따라 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)의 리보솜 결합 부위의 환경에서 A/U 함량은 증가한다. 이러한 변형(리보솜 결합 부위 주위의 증가된 A/U 함량)은 변형된 RNA와 리보솜의 결합 효율을 증가시킨다. 리보솜 결합 부위와 리보솜의 효과적인 결합(코작(Kozak) 서열: GCCGCCACCAUGG (서열정보 번호: 33), AUG는 시작 콘돈을 형성한다)은 변형된 RNA의 효율적인 번역 효과를 가져온다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)는 잠재적으로 불안정하게 하는 서열 요소들에 대해 변형될 수 있다. 특히, 특정 야생형 RNA와 비교하여, 이 RNA의 코딩 영역 및/또는 5' 및/또는 3' 번역되지 않은 영역은 불안정 서열 요소를 포함하지 않도록 변형될 수 있고, 특정 야생형 RNA와 비교하여 RNA (분자)의 코딩된 아미노산 염기는 변형되지 않는 것이 바람직하다. 예를 들어, 진핵생물 RNA의 서열에서, 신호 단백질과 결합하고 생체조건에서 RNA의 효소의 퇴화를 조절하는 불안정 서열 요소(DSE)가 발생하는 것은 공지된 기술이다. RNA (분자)의 안정화를 더욱 기하기 위해, 선택적으로 단백질의 유전정보를 지정하는 영역에서, 야생형 RNA의 대응하는 영역과 비교하여 하나 또는 그 이상의 이러한 변형이 이루어져 그 곳에 불안정 서열 요소가 전혀 또는 실질적으로 포함되지 않는다. 또한, 본 발명에 따르면, 번역되지 않은 (3'- 및/또는 5'-UTR) 영역에 존재하는 DSE는 그러한 변형에 의해 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)로부터 제거될 수 있다.
그러한 불안정 서열은, 예를 들어, 다양한 불안정한 RNA(Caput et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 to 1674)의 3'-UTR 분절에서 발생하는 AU-풍부 서열(AURES)이다. 따라서, 야생형 RNA와 비교하여, 본 발명에 따라 복체화된 RNA의 RNA는 그러한 불안정 서열을 포함하지 않도록 변형되는 것이 바람직하다. 이는 가능한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 트랜스페린(transferrin) 수용체의 유전정보를 지정하는 유전자의 3'-UTR 분절에 포함된 서열 GAACAAG에 의해 인식된 서열 모티프에도 적용된다 (Binder et al ., EMBO J. 1994, 13: 1969 to 1980). 이러한 서열 모티프는 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)에서 본 발명에 따라 제거되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)는 5' 캡 구조(cap structure)를 가질 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 캡 구조의 예로는 m7G(5')ppp, (5'(A,G(5')ppp(5')A and G(5')ppp(5')G이 있다.
본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)의 안정성을 개선하는 다른 변형은 Another modification enhancing the stability of the 적어도 one RNA (molecule) of the complexed RNA of the present invention is based on RNA의 5'- 또는 3' 신장, 일반적으로 10 내지 200 뉴클레오티드의 길이를 가진 호모뉴클레오티드 신장에 기초한다, 이러한 신장은, 특히 RNA가 mRNA로 제공되면, 일반적으로 약 10 내지 200 아데노신 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 10 내지 100 아데노신 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 약 20 내지 70 아데노신 뉴클레오티드 또는 더욱 바람직하게는 약 20 내지 60 아데노신 뉴클레오티드의3' 단말에서 폴리-A 꼬리를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)는, 특히 RNA가 mRNA로 제공되면, 일반적으로 약 10 내지 200 사이토신 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 10 내지 100 사이토신 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 약 20 내지 70 사이토신 뉴클레오티드 또는 더욱 바람직하게는 약 20 내지 60 사이토신 또는 10 내지 40까지의 사이토신 뉴클레오티드의 3' 단말에서 폴리-C 꼬리를 포함할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)에 발생할 수 있는 또 다른 변형은, 특히 RNA가 mRNA로 제공되면, 적어도 하나의 IRES 및/또는 적어도 하나의 5' 및/또는 3' 안정화 서열을 말한다. 본 발명에 따르면, 하나 또는 그 이상의 소위 IRES (내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site))는 RNA에 삽입될 수 있다. 따라서, IRES는 유일한 리보솜 결합 부위로 기능할 수 있지만, 서로 독립적인 리보솜에 의해 번역되어야 하는 몇몇의 단백질의 유전암호를 지정하는 RNA(다중시스트론 RNA(multicistronic RNA))를 제공할 수도 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 IRES 서열의 예로는 피코르나바이러스(picornavirus)로부터의 그것들, 예를 들어, 페스티바이러스(pestivirus)(CFFV), 폴리오바이러스(poliovirus)(PV), 바이러스(encephalomyocarditis virus)(ECMV), 발과 입 질병 바이러스(FMDV), C형 간염 바이러스(HCV), 전통적인 돼지 콜레라 바이러스(CSFV), 쥐 각막백반 바이러스(MLV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV) 또는 귀뚜라미 마비 바이러스(CrPV)가 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)는 종래 기술에 공지된 적어도 하나의 5' 및/또는 3' 안정화 서열을 나타낼 수 있다. 5 및/또는 3 번역되지 않은 영역에서 이러한 안정화 서열은 시토졸에서 RNA의 반감기를 증가시키는 효과를 갖는다. 이러한 안정화 서열은 바이러스, 박테리아 및 진핵생물에서 발생할 뿐만 아니라 부분적 또는 완전히 합성될 수 있는 자연발생적인 서열과 100% 서열 상동관계를 가질 수 있다. 예를 들어, 호모 사피엔스 또는 아프리카 발톱 개구리( Xenopus laevis )로부터의 글로빈 유전자의 번역되지 않은 서열(UTR)은 안정화된 RNA를 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 안정화 서열의 하나의 예로 언급될 수 있다. 안정화 서열의 다른 예는 일반 화학식 (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC (서열정보 번호: 34)을 갖고, 이는 글로빈, (I)-콜라겐, 15-리폭시제나아제(lipoxygenase)의 유전정보를 지정하거나 타이로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase)의 유전정보를 지정하는 매우 안정적인 RNA의 3'UTR에 포함된다 (참조. Holcik et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 내지 2414). 물론, 그러한 안정화 서열은 개별적으로 또는 서로 조합하여 사용될 수 있고, 당업자에게 공지된 기타 안정화 서열과도 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)는 글로빈 UTR (번역되지 않은 영역)-안정화된 RNA, 특히 글로빈 UTR-안정화된 RNA로 존재하는 것이 바람직하다.
원할 경우, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)는 백본 변형을 포함할 수 있다. 본 발명과 관련된 백본 변형은 RNA에 포함된 뉴클레오티드의 백본의 포스페이트가 화학적으로 변형된 변형이다. 그러한 백본 변형은 일반적으로, 이에 한정되지 않지만, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트(예를 들어, 시티딘-5'-O-(1-티오포스페이트))로 이루어진 그룹으로부터 선택된 변형을 포함한다.
또한, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)는 추가적으로 또는 대안적으로 당 변형을 포함할 수 있다. 본 발명과 관련된 당 변형은 존재하는 뉴클레오티드의 당의 화학적 변형이고, 이에 한정되지 않지만, 일반적으로 2'-디옥시-2'-플루오로-올리고리보뉴클레오티드 (2'-fluoro-2'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-플루오로-2'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트), 2'-디옥시-2'-디아민 올리고리보뉴클레오티드 (2'-아미노-2'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트), 2'-O-알킬 올리고리보뉴클레오티드, 2'-디옥시-2'-C-알킬 올리고리보뉴클레오티드 (2'-O-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-메틸우리딘-5'-트리포스페이트), 2'-C-알킬 올리고리보뉴클레오티드, 및 그의 이성질체, (2'-아라시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-아라우리딘-5'-트리포스페이트), 또는 아지도트리포스페이트 (2'-아지도-2'-디옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-아지도-2'-디옥시우리딘-5'-트리포스페이트)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 변형을 포함한다.
또한, 바람직하게 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)는, 추가적으로 또는 대안적으로, 변경되지 않은, 즉 자연(= 천연) RNA 서열과 비교하여, 적어도 하나의 RNA (분자)에 의해 유전암호가 지정된 단백질의 발현을 상당히 증가시키기에 적합한 적어도 하나의 염기 변형을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상당한 정도는 천연 RNA 서열의 발현과 비교하여, 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 40%, 50% 또는 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90% 또는 100%까지, 가장 바람직하게는 적어도 150%, 200% 또는 300%까지 단백질 발현의 증가를 의미한다. 본 발명과 관련해서, 염기 변형을 가진 뉴클레오티드는 바람직하게 2-아미노-6-클로로퓨린리보시드-5'-트리포스페이트, 2-아미노아데노신-5'-트리포스페이트, 2-티오시티딘-5'-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 4-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴시티딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모우리딘-5'-트리포스페이트, 5-요도시티딘-5'-트리포스페이트, 5-요도우리딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 6-아자시티딘-5'-트리포스페이트, 6-아자우리딘-5'-트리포스페이트, 6-클로로퓨린리보시드-5'-트리포스페이트, 7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 8-아자아데노신-5'-트리포스페이트, 8-아지도아데노신-5'-트리포스페이트, 벤즈이미다졸-리보시드-5'-트리포스페이트, N1-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N1-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, O6-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, 슈도우리딘-5'-트리포스페이트, 또는 퓨로마이신-5'-트리포스페이트, 잔토신-5'-트리포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특히, 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 및 슈도우리딘-5'-트리포스페이트로 이루어진 염기-변형된 뉴클레오티드의 그룹으로부터 선택된 염기 변형을 위한 뉴클레오티드가 바람직하다.
또한, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)는, 추가적으로 또는 대안적으로, 적어도 하나의 RNA(분자)에 포함된 뉴클레오티드 중 뉴클레오시드의 적어도 하나의 변형을 포함하고, 이는 필요한 환자에 투여될 때 면역억제 역할을 하는데, 즉 바람직하게 면역 반응을 방지 또는 감소시키기에 적합하다. 그러한 적어도 하나의 변형은 바람직하게 하기로부터 선택된 뉴클레오시드 변형으로부터 선택된다:
a) 시티딘 및/또는 우리딘의 뉴클레오시드의 피리미딘 염기의 4-, 5-또는 6-위치에서의 화학적 변형;
b) 아데노신, 이노신 및/또는 구아노신의 뉴클레오시드의 퓨린 염기의 2-, 6-, 7- 또는 8-위치에서의 화학적 변형; 및/또는
c) 아데노신, 이노신, 구아노신, 시티딘 및/또는 우리딘의 뉴클레오시드의 당의 2'-위치에서의 화학적 변형.
이와 관련해서, (m)RNA는 아데노신-5'-모노포스페이트, 구아노신-5'-모노포스페이트, 이노신-5'-모노포스페이트, 시티딘-5'-모노포스페이트 및/또는 우리딘- 5'-모노포스페이트로부터 일반적으로 선택된 수많은 뉴클레오티드에 의해 형성된 핵산 사슬이다. 이러한 뉴클레오티드는 그의 1인산염을 통해 서로 링크된다. 뉴클레오티드는 구조 성분으로 뉴클레오시드 및 5'-모노포스페이트를 포함하고, 여기에서 뉴클레오시드는 일반적으로 뉴클레오베이스, 즉 피리미딘(우라실 또는 사이토신) 또는 퓨린(아데닌 또는 구아닌) 염기, 및 당에 의해 형성된다. 따라서, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)의 뉴클레오시드의 변형은 언제나 상기 적어도 하나의 RNA(분자)의 각각의 뉴클레오티드의 뉴클레오시드 구조에서의 변형을 의미하는 것으로 의도된다.
제1 변형 a)에 따르면, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)의 적어도 하나의 뉴클레오시드는 시티딘 및/또는 우리딘의 피리미딘 염기의 5- 또는 6-위치에서의 화학적 변형으로 변형될 수 있다. 이에 한정되지 않지만, 뉴클레오티드, 시티딘 및/또는 우리딘의 피리미딘 염기의 4-, 5- 또는 6-위치에서의 그러한 화학적 변형은 4-티오, 5-요도- / (5-I-), 5-브로모- / (5-Br-), 5-아미노알릴-, 5-플루오로- / (5-F-), 5-하이드록시-, 5-하이드로- / (5-H-), 5-니트로-, 5-프로피닐- / (5-(C≡C-CH3)-), 5-메틸-, 5-메틸-2-티오-, 5-포르밀-, 5-하이드록시메틸-, 5-메톡시-, 5-옥시아세트산 메틸 에스테르-, 5-옥시아세트산-, 5-카르복시하이드록시메틸-, 5-(카르복시하이드록시메틸)피리미딘 메틸 에스테르-, 5-메톡시카르보닐메틸-, 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오, 5-아미노메틸-, 5-아미노메틸-2-티오-, 5-아미노메틸-2-셀레노-, 5-메틸아미노메틸-, 5-카르바모일메틸-, 5-카르복시메틸아미노메틸-, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-thio-, 5-카르복시메틸-, 5-메틸디하이드로-, 5-타우리노메틸-, 5-타우리노메틸-2-티오우리딘, 5-이소펜테닐아미노메틸-, 5-이소펜테닐아미노메틸-2-티오-, 5-아미노프로필- / (5-(C3H6NH3)-), 5-메톡시-에톡시-메틸- / (5-(CH2-O-C2H4-O-CH3)-), 또는 6-아자-로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다..
제2 변형 b)에 따르면, 대응하는 변형되지 않은 적어도 하나의 RNA (분자) 투여시 일반적으로 나타나는 포유류의 (선천적) 면역촉진 반응 억제 및/또는 피하기에 적합한 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)의 적어도 하나의 뉴클레오시드는 선택적으로 아데노신, 이노신 및/또는 구아노신 뉴클레오시드의 퓨린 염기의 2-, 6-, 7- 또는 8-위치에서의 화학적 변형으로 변형될 수 있다. 이에 한정되지 않지만, 아데노신, 이노신 및/또는 구아노신 뉴클레오시드의 퓨린 염기의 2-, 6-, 7- 또는 8-위치에서의 그러한 화학적 변형은 2-아미노-, 7-데아자-, 8-아자-, 또는 8-아지도-로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
제3 변형 c)에 따르면, 대응하는 변형되지 않은 적어도 하나의 RNA (분자) 투여시 일반적으로 나타나는 포유류의 (선천적) 면역촉진 반응 억제 및/또는 피하기에 적합한 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)의 적어도 하나의 뉴클레오시드는, RNA 서열에 통합될 때, 아데노신, 이노신, 구아노신시티딘 및/또는 우리딘 뉴클레오시드의 당의 2'-위치에서의 적어도 하나의 화학적 변형으로 변형될 수 있다. 이에 한정되지 않지만, 아데노신, 이노신, 구아노신시티딘 및/또는 우리딘 뉴클레오시드의 당의 2'-위치에서의 그러한 화학적 변형은 2'-디옥시-, 2'-아미노-2'-디옥시-, 2'-아미노-, 2'-플루오로-2'-디옥시-, 2'-플루오로-, 2'-O-메틸-2'-디옥시-, 2'-플루오로-, 2'-O-메틸-2'-디옥시- 또는 2'-O-메틸-로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
특별히 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)의 적어도 하나의 뉴클레오시드는 시티딘 및/또는 우리딘 뉴클레오시드의 피리미딘 염기의 4,- 5- 또는 6-위치에서 변형되었고 또한 상기한 a) 및 c) 변형에 따라 리보스 당의 2'-위치에서 변형되었다.
특별히 바람직한 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)의 적어도 하나의 뉴클레오시드는 아데노신, 이노신 및/또는 구아노신 뉴클레오시드의 퓨린 염기의 2-, 6-, 7- 또는 8-위치에서 변형되었고 또한 상기한 b) 및 c) 변형에 따라, 더욱 바람직하게는 상기한 바와 같이 리보스 당의 2'-위치에서 변형되었다.
더 특별히 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)의 적어도 하나의 뉴클레오시드는 변형되어, 하기 그룹으로부터 선택된 ((m)RNA의) 화학적으로 변형된 뉴클레오티드가 되었다: 4-티오-우리딘-5'-(모노)포스페이트, 2-아미노퓨린-리보시드-5'-(모노)포스페이트, 5-아미노알릴시티딘-5'-(모노)포스페이트, 5-아미노알릴우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-(모노)포스페이트, 5-브로모-2'-디옥시시티딘-5'-(모노)포스페이트, 5-브로모우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-브로모-2'-디옥시우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-요도시티딘-5'-(모노)포스페이트, 5-요도-2'-디옥시시티딘-5'-(모노)포스페이트, 5-요도우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-요도-2'-디옥시우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-프로피닐-2'-디옥시시티딘-5'-(모노)포스페이트, 5-프로피닐-2'-디옥시우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-포르밀시티딘-5'-(모노)포스페이트, 5,2'-O-디메틸시티딘-5'-(모노)포스페이트, 5-하이드록시메틸시티딘-5'-(모노)포스페이트, 5-포르밀-2'-O-메틸시티딘-5'-(모노)포스페이트, 5,2'-O-디메틸우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-메틸-2-티오우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-하이드록시우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-메톡시우리딘-5'-(모노)포스페이트, 우리딘 5-옥시아세트산-5'-(모노)포스페이트, 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르-5'-(모노)포스페이트, 5-(카르복시하이드록시메틸)우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-(카르복시하이드록시메틸)우리딘 메틸 에스테르-5'-(모노)포스페이트, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-아미노메틸-2-티오우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-메틸아미노메틸우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-카르바모일메틸우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-카르바모일메틸-2'-O-메틸우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-카르복시메틸우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-메틸디하이드로우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-타우리노메틸우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-타우리노메틸-2-티오우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오우리딘-5'-(모노)포스페이트, 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸우리딘-5'-(모노)포스페이트, 6-아자시티딘-5'-(모노)포스페이트, 7-데아자아데노신-5'-(모노)포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-(ㅍ)포스페이트, 8-아자아데노신-5'-(모노)포스페이트, 8-아지도아데노신-5'-(모노)포스페이트, 슈도우리딘-5'-(모노)포스페이트, 2'-아미노-2'-디옥시시티딘-(모노)포스페이트, 2'-플루오로티미딘-5'-(모노)포스페이트, 이노신-5'-(모노)포스페이트, 2'-O-메틸-이노신-5'-(모노)포스페이트.
원할 경우, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)는 뉴클레오티드의 치환, 부가 또는 삭제를 포함할 수 있고, 바람직하게 이의 도입은 기능적 효과를 달성한다. RNA, 예를 들어, mRNA가 WT 서열로부터 유래된다면, 이러한 다양한 형태의 뉴클레오티드 변형은 도입될 수 있다. 이로써, DNA 매트릭스는 종래 기술에 잘 알려진 부위 지향적 돌연변이 생성(site directed mutagenesis) 기술(참조, 예를 들어, Maniatis et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001)에 의해 본 발명에 따른 복체화된 RNA의 제조를 위해 사용된다. 그러한 공정에 있어서, RNA의 제조를 위하여, 대응하는 DNA 분자는 생체조건에서 전사될 수 있다. 이 DNA 매트릭스는 생체조건의 전사에 적합한 촉진제(promoter), 예를 들어, T7 또는 SP6 촉진제로, 제조되어야 하는 RNA의 원하는 뉴클레오티드 서열 및 생체조건의 전사를 위한 종결 신호가 뒤따른다. 본 발명에 따르면, 대상이 되는 RNA의 매트릭스를 형성하는 DNA 분자는 발효 증식 및, 이후 박테리아에서 복제될 수 있는 플라스미드(plasmid)의 일부로 분리에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 적합한 것으로 언급될 수 있는 플라스미드는, 예를 들어, 플라스미드 pT7Ts (유전자 은행 수탁 번호(GenBank accession number) U26404; Lai et al ., Development 1995, 121: 2349 to 2360), pGEM® 시리즈, 예를 들어, pGEM®1 (유전자 은행 수탁 번호 X65300; 프로메가사(Promega)) 및 pSP64 (유전자 은행 수탁 번호 X65327); 참조. Mezei and Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001)이다.
하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드에 대한 RNA (단일 가닥 또는 이중 가닥)의 질량비 또는 몰비를 의미하는, 본 발명에 따른 RNA 복합체의 요소들의 질량비 또는 몰비는, 이에 제한되지 않지만, 일반적으로 특정 적용에 적합한 것으로 선택된다. 그러나, 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드와 RNA 사이의 질량비 또는 몰비는 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 또는 1:20 보다 적지 않다. 대안적으로, 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드와 RNA 사이의 질량비 또는 몰비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1보다 높을 수 있다. 바람직하게, 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드와 RNA 사이의 질량비 또는 몰비는 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드의 함량 대비 1:5보다 적지 않을 수 있다. 더 바람직하게, 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드와 RNA 사이의 질량비 또는 몰비는 1:5 내지 20:1, 더욱 바람직하게는 1:3 내지 15:1이다.
특정한 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 RNA 복합체의 요소들의 질량비, 특히 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드에 대한 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)의 질량비는 바람직하게 약 1:100 내지 약 1:0.5이고, 더 바람직하게는 복합체 내 RNA:펩타이드 비율에 대해 약 1:50 내지 약 1:1, 또는 더욱 바람직하게는 약 1:100, 약 1:90, 약 1:80, 약 1:70, 약 1:60, 약 1:50, 약 1: 45, 약 1:40, 약 1:35, 약 1:30, 약 1:25, 약 1:20, 약 1:15, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:4, 약 1:3, 약 1:2, 약 1:1 또는 약 1:0.5까지의 값을 가지며, 여기에서 어떤 범위든 상기에 특정하게 표시된 값들의 조합에 의해 형성될 수 있다. 가장 바람직하게, 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드에 대한 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)의 질량비는약 1:50 내지 약 1:1 범위 내에 있을 수 있다.
마찬가지로, 본 발명에 따른 RNA 복합체의 요소들의 몰비, 특히 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드에 대한 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)의 몰비는, 바람직하게, 특정한 바람직한 실시예에 따라, 약 1:20000 내지 약 1:500 또는 1:250까지, 더 바람직하게는 약 1:10000 내지 약 1:1000, 또는 더욱 바람직하게는 복합체 내 RNA:펩타이드 비율에 대해 약 1:9500, 약 1:9000, 약 1:8500, 약 1:8000, 약 1:7500, 약 1:7000, 약 1:6500, 약 1:6000, 약 1:5500, 약 1:5000, 약 1:4500, 약 1:4000, 약 1:3500, 약 1:3000, 약 1:2500, 약 1:2000, 약 1:1500, 약 1:1000, 약 1:500, 약 1:450, 약 1: 400, 약 1:350, 약 1:300, 또는 약 1:250의 값을 가지며, 여기에서 어떤 범위든 상기에 특정하게 표시된 값들의 조합에 의해 형성될 수 있다. 가장 바람직하게, 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드에 대한 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)의 몰비는 약 1:10000 내지 약 1:1000의 범위 내에 있을 수 있다. 면역촉진 목적을 위해, 본 발명에 따른 RNA 복합체의 요소들의 몰비는 약 1:10000 내지 약 1:100, 또는 약 1:10000 내지 약 1:500의 범위 내에 있을 수 있다.
본 발명의 상황에서, 몰비와 질량비는 일반적으로 상호 의존적이고, 여기에서 이 비율은 각각 RNA 길이 또는 펩타이드 길이 같은 요인들에 의해 영향을 받을 수 있다. 그러나, 결정을 하기 위한 목적으로, 질량비와 몰비는 복합체 평균 크기 별로 계산할 수 있고, 여기에서 약 1:50 - 1:1의 질량비는 약 1:10000 - 1:1000의 몰비에 해당한다. 몰비와 질량비의 예시적인 표는 실시예에 나타나며, 추가적으로 계산을 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 RNA 복합체 요소들의 비율, 특히 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드에 대한 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA (분자)의 비율은 RNA 복합체 전체의 질소/인산염 비(N/P비)를 기초로 계산할 수 있다. 예를 들어, RNA가 통계적 염기 분포를 나타낸다면, 1 μg RNA는 일반적으로 약 3 nmol 인산염 잔기를 포함한다. 덧붙여, 1 μg 펩타이드는 분자량과 염기성 아미노산의 갯수에 따라 일반적으로 약 x nmol 질소 잔기를 포함한다. (Arg)9 (분자량 1424 g/mol, 9 질소 원자)에 대해 예시적으로 계산할 경우, 1 μg (Arg)9는 약 700 pmol (Arg)9를 포함하므로, 700 x 9=6300 pmol 염기성 아미노산 = 6.3 nmol 질소 원자이다. 약 1:1 RNA/(Arg)9의 질량비에 대해서는, 약 2의 N/P비를 계산할 수 있다. 2 μg RNA에 대해 약 2:1의 질량비를 가진 프로타민(연어의 프로타민이 사용될 때, 분자량 약 4250 g/mol, 21 질소 원자)에 대해 예시적으로 계산할 때, RNA에 대해 6 nmol 인산염이 계산될 것이다; 1 μg 프로타민이 약 235 pmol 프로타민 분자를 포함하므로, 235 x 21 = 4935 pmol 염기성 질소 원자 = 4.9 nmol 질소 원자이다. 약 2:1 RNA/프로타민의 질량비에 대해서는, 약 0.2의 N/P비를 계산할 수 있다. 약 8:1 RNA/프로타민의 질량비에 대해서는, 약 0.2의 N/P비를 계산할 수 있다. 본 발명의 상황에서, 바람직하게 N/P비는 복합체 내 RNA:펩타이드의 비율에 관하여 약 0,2-50의 범위 내에 있고, 더 바람직하게는 약 0.5-50, 가장 바람직하게는 약 0.75-25 또는 1-25의 범위 내에 있고. 더욱 바람직하게는 약 10-50, 가장 바람직하게는 약 25-50의 범위 내에 있다.
본 발명의 다른 실시예는 조성물, 바람직하게는 의약 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 복체화된 RNA와, 선택적으로 (의약적으로) 적합한 캐리어 및/또는 보조 물질 및 첨가제를 포함한다. 본 발명에 따라 사용된 (의약) 조성물은 일반적으로 안전하고 효과적인 양의 본 발명에 따른 복체화된 RNA를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "안전하고 효과적인 양"은 시험관 내 또는 생체조건에서 세포 또는 조직 내에 효과를 제공, 예를 들어, 상기한 치료적으로 활성인 단백질, 항체 또는 항원 또는 기타 단백질이나 펩타이드 같은 상기한 코딩된 단백질의 (시험관 내 또는 생체조건에서) 발현을 의미있게 유도, 세포, 조직 또는 미생물, 예를 상기한 종양 질환 또는 암 질환, 심혈관 질환, 감염 질환, 자가면역 질환, (단일)유전자 질환 등의 (생체조건에서) 치료되어야 하는 상태의 긍정적인 변화를 유도 및/또는 면역 반응을 유도 또는 개선시킬 정도의 본 발명에 따른 복체화된 RNA의 수량을 의미한다. 그러나, 동시에, "안전하고 효과적인 양"은, 특히 상기한 질병의 치료에서 심각한 부작용을 피하기에 충분히 낮다. 즉, 이점과 위험 사이의 적당한 비율을 가능하게 하기에 충분히 낮다. 이러한 한계의 결정은 일반적으로 합당한 의학적 판단의 범위 안에 있다. 따라서, 그러한 (의약) 조성물의 본 발명에 따른 복체화된 RNA의 농도는, 이에 한정되지 않지만, 예를 들어 0.1 ng 내지 1,000 mg/ml 또는 그 이상의 넓은 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 발명에 따른 복체화된 RNA의 그러한 "안전하고 효과적인 양"은 치료되어야 특정 상태, 치료받아야 하는 환자의 나이 및 신체 상태, 상태 의 심각성 정도, 치료 기간, 치료하는 의사의 지식과 경험 내에서 수반되는 치료의 성질, 사용된 (의약적으로) 적합한 특정 캐리어 및 유사 요인들의 성질과 관련하여 다양할 수 있다. 여기에 설명된 (의약) 조성물은 인간에 사용될 수 있고, 수의학적 목적을 위해서도 사용될 수 있다.
여기에 설명된, 본 발명에 따른 (의약) 조성물은 적합한 캐리어, 바람직하게는 의약적으로 적합한 캐리어를 선택적으로 포함할 수 있다. 여기에 사용된 "적합한 캐리어"라는 용어는, 바람직하게 하나 또는 그 이상의 양립가능한 고체 또는 액체 필러(filler), 또는 희석액 또는 사람에게 투여하기에 적합한 캡슐화 화합물을 포함한다. 여기에 사용된 "양립가능(compatible)"이라는 용어는, 통상적인 사용 조건에서 조성물의 (의약적) 효과를 실질적으로 경감시킬 수 있는, 예를 들어, 코딩된 단백질의 (의약적) 활성화를 경감시키거나 코딩된 단백질의 발현을 억제 또는 상실시킬 수 있는, 또는 예를 들어, 복체화된 RNA의 면역 잠재력을 억제시킬 수 있는 상호작용이 일어나지 않도록 조성물의 구성 성분들이 서로 그리고 본 발명에 따른 복체화된 RNA 및 조성물에 선택적으로 포함된 보조 물질과 함께 혼합될 수 있음을 의미한다. 물론, 적합한 캐리어는 치료받아야 하는 사람에게 투여하기에 적합하도록 충분히 높은 순도와 충분히 낮은 독성을 가져야 한다.
캐리어는 투여 방법, 즉 고체 또는 액체 형태에 따라 선택된다. 따라서, 상기한 (의약적으로) 적합한 캐리어의 선택은, 특히본 발명에 따른 (의약) 조성물이 투여되는 방식에 의해 결정된다. 본 발명에 따른 (의약) 조성물은, 예를 들어, 전신에 투여될 수 있다. 투여 경로는, 예를 들어, 피내 또는 경피투여, 구강투여, 피하, 근육내, 정맥내 같은 비경구투여, 국소투여 및/또는 비강내투여 경로를 포함한다. 본 발명에 따른 (의약) 조성물의 사용되어야 하는 적절한 양은 동물 모델을 이용한 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 그러한 모델은, 이에 한정되지 않지만, 토끼, 양, 쥐 개 및 인간이외의 영장류 모델들을 포함한다.
액상으로, 예를 들어, 주사 투여된다면, 캐리어는 파이로젠(pyrogen)이 없는 물; 등장성 식염수액 및 완충액, 예를 들어, 인산염 완충액으로부터 선택될 수 있다. 주사를 위한 바람직한 단위 투여량 형태는 물의 무균액, 생리학적 식염수액 또는 그의 혼합물, 예를 들어, Ringer-Lactat 용액을 포함한다. 그러한 용액의 pH는 약 7. 0 내지 약 7.6, 바람직하게는 약 7.4로 조절되어야 한다.
바람직하게, (의약) 조성물은 물 속에 신규한 복체화된 RNA를 함유한다. 대안적으로, 본 발명에 따른 (의약) 조성물은 액상 제조를 위한 캐리어로 주사 완충액을 포함할 수 있으며, 이는 바람직하게 트랜스펙션을 향상시키고, 본 발명의 복체화된 RNA의 RNA가 단백질의 유전정보를 지정할 경우, 세포, 조직 또는 미생물 안의 코딩된 단백질의 번역도 향상시킨다. 본 발명에 따른 (의약) 조성물은, 예를 들어, 수계 주사 완충액과, 액상일 경우, 나트륨염, 바람직하게는 (의약) 조성물 전체 대비 적어도 50 mM 나트륨염, 칼슘염, 바람직하게는 적어도 0.01 mM 칼슘 및/또는 마그네슘염을 포함할 수 있고, 선택적으로 칼륨염, 바람직하게는 적어도 3 mM 칼륨염을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에 따라, 이러한 주사 완충액에 함유된 나트륨염, 칼륨 및/또는 마그네슘염 및 선택적으로 칼륨염은 할로젠화물(halide), 예를 들어, 염화물, 요오도화물 또는 브로민화물의 형태, 또는 그의 수산화물, 탄산염, 중탄산염 또는 황산염의 형태일 수 있다. 여기에 언급될 예들로는, 나트륨염으로 NaCl, NaI, NaBr, Na2CO3, NaHCO3, 및/또는 Na2SO4, 선택적으로 존재하는 칼륨염으로 KCl, KI, KBr, K2CO3, KHCO3, 및/또는 K2SO4, 칼슘 및/또는 마그네슘염으로 CaCl2, CaI2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca(OH)2, MgCl2, MgI2, MgBr2, MgCO3, MgSO4, 및/또는 Mg(OH)2이 있다. 또한, 주사 완충액은 상기한 양이온들의 유기 음이온을 함유한다. 특별히 바람직한 실시예에 있어서, 그러한 주사 완충액은 염으로 염화나트륨(NaCl), 염화칼슘(CaCl2) 및 선택적으로 염화칼륨(KCl)을 포함하고, 염화물뿐만 아니라 다른 음이온들도 존재할 수 있다.
이러한 염들은 일반적으로 본 발명에 따른 (의약) 조성물에 선택적으로 사용된 주사 완충액에 존재하는데, (액상인 경우) (의약) 조성물 전체 대비 적어도 50 mM 염화나트륨(NaCl), 적어도 3 mM 염화칼륨(KCl), 및 적어도 0.01 mM 염화칼슘 및/또는 염화마그네슘(CaCl2)의 농도로 존재한다. 주사 완충액은 고장성, 등장성 또는 저장성 주사 완충액의 형태일 수 있다. 본 발명과 관련하여, 이와 관련해서, 주사 완충액은 각각의 경우에 특정 기준 매개물에 대해 고장성, 등장성 또는 저장성이다. 즉, 주사 완충액은 특정 기준 매개물보다 더 높거나, 동일하거나 더 낮은 염 함량을 가지며, 삼투 또는 기타 농도 효과에 의해 세포 손상을 일으키지 않을 정도의 상기한 염의 농도가 사용되는 것이 바람직하다. 여기에서 기준 매개물은, 예를 들어, 체내에서 발생하는 림프체액, 시토졸(cytosol) 체액 또는 기타 체액, 또는 "시험관내" 방법에서 전통적으로 사용된 액체 또는 완충액이다. 그러한 액체와 완충액은 당업자에게 공지된 기술이다.
또한, 본 발명에 따른 (의약) 조성물에 선택적으로 포함된 주사 완충액은 추가 성분들, 예를 들어 당류(단당류, 이당류, 삼당류, 다당류), 특히 글루코오스(glucose) 또는 마니톨(mannitol)을 포함할 수 있다. 그러나, 바람직한 실시예에서, 사용된 주사 완충액에는 당류가 존재하지 않는다. 또한, 주사 완충액은, 전하를 띠지 않는 성분, 예를 들어 당류를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 주사 완충액은 일반적으로 금속 양이온, 특히, 알칼리 또는 알카라인 토류 금속(earth metal)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 금속 양이온, 및 음이온, 특히 상기한 음이온만을 함유한다. 사용된 주사 완충액의 pH는, 액상일 경우, 바람직하게는 (의약) 조성물 전체 대비 1 내지 8.5, 더 바람직하게는 3 내지 5, 더욱 바람직하게는 5.5 내지 7.5, 특히 5.5 내지 6.5 사이이다. 적당하다면, 주사 완충액은, 완충된 pH로 주사 완충액을 고정시키는 완충작용(buffer system)도 포함할 수 있다. 이는, 예를 들어, 인산염 완충작용, HEPES 또는 Na2HPO4/NaH2PO4일 수 있다. 그러나, 사용된 주사 완충액은 상기한 완충작용 중 어느 것도 포함하지 않거나 어떤 완충작용도 포함하지 않는 것이 매우 바람직하다.
본 발명에 따른 (의약) 조성물에 선택적으로 포함된 주사 완충액은 상기한 1가 및 2가 양이온에 부가적으로 또는 그에 대안적으로 2가 양이온 및 1가 양이온을 포함할 수 있는데, 특히 마그네슘 (Mg2 +), 또는 철 (Fe2 +) 같은 알카라인 토류 금속으로 이루어진 그룹으로부터의 2가 양이온과, 리튬 (Li+) 같은 알칼리 금속으로 이루어진 그룹으로부터의 1가 양이온은 포함할 수 있다. 바람직하게, 이러한 1가 양이온은 그의 염의 형태, 예를 들어, 할로젠화물의 형태, 예를 들어, 염화물, 요오드화물 또는 브로민화물의 형태, 또는 그의 수산화물, 탄산염, 중탄산염 또는 황산염의 형태이다.
여기에 언급되어야 하는 예로는, 리튬염으로 LiCl, LiI, LiBr, Li2CO3, LiHCO3, Li2SO4, 마그네슘염으로 MgCl2, MgI2, MgBr2, MgCO3, MgSO4, 및 Mg(OH)2, 철염으로 FeCl2, FeBr2, FeI2, FeF2, Fe2O3, FeCO3, FeSO4, Fe(OH)2이 있다. 상기한 2가 및/또는 1가 양이온의 모든 조합도 마찬가지로 포함된다. 따라서, 2가 양이온만, 1가 양이온만, 또는 2가 및 1가 양이온을 포함한 그러한 주사 완충액은 본 발명에 따른 (의약) 조성물에 사용될 수 있다. 2가 또는 1가 양이온 중 어느 하나, 특히 바람직하게, 예를 들어 Ca2 + 양이온 또는 그의 염, 예를 들어 CaCl2만을 함유한 그러한 주사 완충액은 마찬가지로 사용될 수 있다.
Ca2 + 일부 또는 전체, 또는 Na1 + 대신, 다른 2가 또는 1가 양이온, 특히 알카라인 토류 금속과 알칼리 금속으로 이루어진 그룹으로부터의 다른 양이온이 각각 주사 용액의 제조를 위해 본 발명에 따라 사용된 주사 완충액에 사용될 경우, 주사 완충액에서 Ca2 + (2가 양이온으로) 및 Na1 + (1가 양이온으로)에 대해 상기에 주어진 몰농도(즉, 일반적으로 적어도 50 mM Na+, 적어도 0.01 mM Ca2 + 및 선택적으로 적어도 3 mM K+의 농도)는 고려될 수도 있다. 사실, 상기한 모든 Ca2 + 또는 Na1 +는, 각각의 경우에, 사용된 주사 완충액에서 다른 2가 또는 1가 양이온으로 각각 대체될 수 있고, 또한 예를 들어, 다른 2가 양이온들(Ca2 + 대신)의 조합 및/또는 다른 1가 양이온들(Na1 + 대신)의 조합(특히, 알카라인 토류 금속으로 이루어진 그룹으로부터의 기타 2가 양이온들의 조합 또는 알칼리 금속으로 이루어진 그룹으로부터의 기타 1가 양이온들의 조합 각각)에 의해서도 대체될 수 있지만, 그러나 Ca2 + 및 Na1 +이 포함된 주사 완충액에서 1가 및 2가 양이온의 특정 몰농도 전체 대비 적어도 20 %, 바람직하게는 적어도 40 %, 더 바람직하게는 적어도 60　%, 더더욱 바람직하게는 적어도 80 %의 Ca2 + 또는 Na1 +를 대체하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명에 따른 의약 조성물에 선택적으로 포함된 주사 완충액이 의약 조성물 전체에 대해 2가 양이온으로 Ca2 +만, 1가 양이온으로 Na1 +만 포함한다면, Na1 +가 1가 양이온의 전체 몰농도의 100 %를 나타내듯이, Ca2 +는 2가 양이온의 전체 몰농도의 100 %를 나타내는 것이 특히 바람직하다. 주사 완충액의 수계 용액은 용액 안에 포함된 염을 의약 조성물 전체 대비 30　mol%까지 포함할 수 있는데, 바람직하게는 25 mol%까지, 더 바람직하게는 20 mol%까지, 더욱 바람직하게는 15 mol%까지, 더욱 바람직하게는 10 mol%까지, ㄷ더더욱 바람직하게는 5　mol%까지, 더더욱 바람직하게는 2 mol%까지의 불용해성 또는 약한 용해성 염을 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 상황에서, 약한 용해성 염은 용해도 평형이 < 10-4이다. 용이하게 용해가능한 염은 용해도 평형이 > 10-4이다. 바람직하게, 본 발명에 따른 의약 조성물에 선택적으로 포함된 주사 완충액은, 염화나트륨(NaCl)에서 50 mM 내지 800 mM, 바람직하게는 60 mM 내지 500 mM, 더 바람직하게는 70 mM 내지 250 mM, 특히 바람직하게는 60 mM 내지 110 mM, 염화칼슘(CaCl2)에서 0.01 mM 내지 100 mM, 바람직하게는 0.5　mM 내지 80 mM, 더 바람직하게는 1.5 mM 내지 40 mM 및 선택적으로 염화칼륨(KCl)에서 3 mM 내지 500 mM, 바람직하게는 4 mM 내지 300 mM, 더 바람직하게는 5 mM 내지 200 mM이다. 유기 양이온은 상기한 무기 양이온, 예를 들어 할로젠화물, 황산염 또는 탄산염에 부가하여 추가 양이온으로 발생할 수 있다. 이들 중에는 숙신산(succinate), 락토비온산(lactobionate), 젖산, 말산(malate), 말레인산 등이 언급될 수 있고, 이들은 조합하여서도 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 (의약) 조성물에 선택적으로 포함된 주사 완충액은 바람직하게 젖산을 포함한다. 유기 양이온을 포함할 경우, 특히 바람직하게, 그러한 주사 완충액은 유기 양이온으로 젖산만을 포함한다. 본 발명의 상황에서 젖산은 어떤 젖산이든 무방하지만, 예를 들어, L-젖산 및 D-젖산일 수 있다. 본 발명과 관련하여 발생하는 젖산염은, 특히 주사 완충액이 1가 양이온으로 Na+만, 2가 양이온으로 Ca2 +만을 포함할 경우, 일반적으로 젖산나트륨 및/또는 젖산칼슘이다. 본 발명에 따라 상기한 바와 같이 (의약) 조성물에 선택적으로 사용된 주사 완충액은 바람직하게 의약 조성물 전체 대비 15 mM 내지 500 mM, 더 바람직하게는 15 mM 내지 200 mM, 가장 바람직하게는 15 mM 내지 100 mM 젖산을 포함한다.
비수 형태(예를 들어, 고상 또는 반고상)로 제형된다면, 본 발명의 의약 조성물은 적합한 캐리어 역할을 할 수 있는 특정 화합물, 또는 그의 구성요소들일 수 있는데, 예를 들어, 당류, 예를 들어, 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스(sucrose); 녹말, 예를 들어, 옥수수 녹말 또는 감자 녹말; 셀룰로오스 및 그의 유도체들, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트; 분쇄된 트래거캔스 고무(tragacanth); 맥아; 젤라틴; 태로(tallow); 고체 윤활제, 예를 들어, 스테아르산, 스테아린산마그네슘; 황산칼슘; 식물성 오일, 예를 들어, 땅콩 오일, 면실유, 참기름, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 테오브로마(Theobroma) 오일; 폴리올, 예를 들어, 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤, 소비톨(sorbitol), 마니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 알기닌산일 수 있다. 그러나, 상기 화합물들은 또한 액상 조성물의 제공을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에 포함할 수 있는 기타 성분들로는, 예를 들어, 유화제, 예를 들어, Tween®; 습윤제, 예를 들어, 로릴황산나트륨(sodium lauryl sulfate); 착색제(colouring agent); 향미제(flavouring agent); 약제 캐리어(medicament carrier); 정제형성제(tablet-forming agent); 안정제; 산화방지제; 방부제가 있다.
주사를 위한 적합한 다른 캐리어는 하이드로겔, 제어 또는 연기된 방출을 위한 장치, 폴리유산(polylactic acid) 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 여기에 사용될 수 있는 적합한 캐리어는 로션, 크림, 젤 등에 사용하기 적합한 것을 포함한다. 화합물이 경구, 정제, 캡슐 등으로 투여되어야 한다면, 단위 투여량 형태가 바람직하다. 구강 투여용으로 사용될 수 있는, 단위 투여량 형태의 제조를 위한 적합한 캐리어는 종래 기술에 잘 알려져 있다. 그들의 선택은 향, 가격 및 저장 안정성 같은 부차적인 고려에 따를 것이며, 본 발명의 목적을 위해 결정적이지 않고 당업자에 의해 어려움없이 실행될 수 있다.
또한, 본 발명은 세포 또는 조직을 상기한 본 발명의 복체화된 RNA로 감염시키는 (시험관내 또는 생체조건) 트랜스펙션법을 제공한다. 신규한 (시험관내 또는 생체조건) 트랜스펙션법은 바람직하게 하기 단계들을 포함한다:
a) 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x을 가진 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드로 복체화된 적어도 하나의 RNA를 포함한 본 발명에 따른 복체화된 RNA를 선택적으로 제조 및/또는 제공하는 단계;
b) 상기 a) 단계에 따라 제조 및/또는 제공된 복체화된 RNA를 이용하여 (시험관내 또는 생체조건에서) 세포, (살아있는) 조직 또는 미생물을 트랜스펙트시키는 단계.
세포 또는 조직을 본 발명의 복체화된 RNA로 트랜스펙트시키는 신규한 시험관내 또는 생체조건 트랜스펙션법의 a) 단계에 따라 상기와 같이 복체화된 RNA를 제조 및/또는 제공하는 것은 종래 기술에 알려진 어떤 방법으로든 실행될 수 있다. 본 명세서에 사용된 복체화된 RNA는 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x을 가진 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드로 복체화된 적어도 하나의 RNA를 포함한다. 따라서, a) 단계에 따라 상기와 같이 복체화된 RNA를 제조 및/또는 제공하는 것은 적어도 하나의 RNA, 및 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x을 가진 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드의 제조 및/또는 제공을 포함할 수 있다.
(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x 같은 짧은 펩타이드 서열을 제조하는 방법은 종래 기술에 널리 알려져 있고, 예를 들어, Fmoc 고상 합성 같은 고상 합성 또는 기타 적합한 방법들을 사용할 수 있다. (참조, 예를 들어, R. Martin, Ed., Protein Synthesis : Methods and Protocols . Methods in Molecular Biology , Vol . 77 Humana Press (1998)).
상기한 신규한 복합체의 성분으로 적어도 하나의 RNA(분자)를 제조 및/또는 제공하는 단계는, a) 단계에 따으면, 제1 하부단계 a1), 즉 핵산 주형의 제공 및/또는 제조를 포함할 수 있고, 핵산 주형은 일반적으로 원하는 RNA에 대응하는 서열을 포함한다. 핵산 주형의 서열은 어떤 핵산이어도 무방하지만, 예를 들어, 상기한 치료적으로 활성인 단백질, 항체 또는 항원 또는 기타 단백질 또는 펩타이드의 유전정보를 지정할 수 있는 단일 또는 이중가닥 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 그의 절편 등일 수 있다. 일반적으로, DNA 서열, 예를 들어, DNA 플라스미드, 바람직하게 선형화된 형태는 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게, 핵산 주형의 서열은 (발현) 벡터일 수 있는데, 더 바람직하게는 RNA 폴리메라아제 결합 부위를 가진 발현) 벡터일 수 있다. 이를 위해서, 종래 기술에 알려진 어떤 (발현) 벡터든 사용될 수 있는데, 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 (발현) 벡터가 사용될 수 있다. 바람직한 (발현) 벡터는, 예를 들어, SP6 또는 클로닝 부위의 T7 또는 T3 결합 부위 상류 및/또는 하류를 가진 것일 수 있다. 벡터는 상기한 치료적으로 활성인 단백질, 항체 또는 항원 또는 기타 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 일반적으로, 예를 들어 사용된 벡터의 다중 클로닝 부위를 통해 (발현) 벡터로 복제된다.
전사 전, (발현) 벡터는 일반적으로 제한 효소로 분리되는데, RNA의 미래의 3' 말단이 발견될 부위에서 적합한 제한 효소를 이용하여 분리되고, 절편은 정제된다. 이로써, 전사된 RNA가 벡터 서열을 포함하는 것이 방지되고, 한정된 길이의 RNA 전사를 얻을 수 있다. 이와 관련해서, 돌출 말단(overhanging end)(예를 들어, AatII, ApaI, BanII, BglI, Bsp1286, BstXI, CfoI, HaeII, HgiAI, HhaI, KpnI, PstI, PvuI, SacI, SacII, SfiI, SphI, 등)을 생성하는 제한 효소를 사용하지 않는 것이 바람직하다. 그럼에도, 그러한 제한효소가 사용될 경우, 돌출된 3' 말단은, 예를 들어, Klenow 또는 T4 DNA 폴리메라아제로 채워지는 것이 바람직하다.
상기의 대안으로, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)를 제조 및/또는 제공하는 단계를 위해 사용된 핵산 주형은 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR)을 이용함으로써 제조될 수 있다. 바람직하게, 핵산 주형, 및 사용된 프라이머 중 하나는 일반적으로 RNA 결합 부위의 서열을 포함한다. 또한, 사용된 프라이머의 5' 말단은 바람직하게 약 10 - 50 추가 뉴클레오티드의 신장, 더 바람직하게는 15 내지 30 추가 뉴클레오티드의 신장, 가장 바람직하게는 약 20 뉴클레오티드의 신장을 포함한다.
높은 수득률을 위해, 일반적으로 시험관내 전사 전에, 전사 주형으로 사용된 핵산, 예를 들어, DNA 또는 cDNA 주형을 정제하여 RNase가 없게 한다. 이와 관련해서, 그러한 주형의 정제는 종래 기술에 알려진 방법의 도움으로 실행될 수 있는데, 예를 들면, 세슘염화물 구배(caesium chloride gradient), 이온교환법(ion exchange method)을 이용하거나 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 통한 정제에 의해 실행될 수 있다.
핵산 주형의 제조 및/또는 제공 다음, 상기한 제1 하부단계 a1)에 따라 제조된 핵산 주형을 이용하여 본 발명에 따른 복체화된 RNA의 적어도 하나의 원하는 RNA(분자)를 제조하기 위하여 제2 하부단계 a2)에 따른 시험관내 전사 반응을 실행할 수 있다.
제2 하부단계 a2)에 따른 시험관내 전사 반응은 일반적으로 시험관내 전사 반응에서 실행된다. 적합한 시험관내 전사 매개체는 초기에 상기한 핵산 주형을 포함하는데, 예를 들어, 약 0.1 - 10 ㎍, 바람직하게는 약 1 - 5 ㎍, 더 바람직하게는 2,5 ㎍, 가장 바람직하게는 약 1 ㎍의 핵산을 포함한다. 적합한 시험관내 전사 매개체는 선택적으로 환원제를 더 포함하는데, 예를 들어, DTT, 더 바람직하게는 약 1-20 ㎕ 50 mM DTT, 더욱 바람직하게는 약 5 ㎕ 50 mM DTT를 포함한다. 시험관내 전사 매개체는 일반적으로 뉴클레오티드, 예를 들어, 뉴클레오티드 믹스(mix)를 포함하는데, 본 발명의 경우, 뉴클레오티드 믹스는 일반적으로 뉴클레오티드당 약 0.1-10 mM, 바람직하게는 뉴클레오티드당 0.1 to 1 mM, 바람직하게는 전체적으로 약 4 mM의 A, G, C 또는 U의 뉴클레오티드의 혼합물을 포함한다. 마찬가지로, 적합한 시험관내 전사 매개체는 RNA 폴리메라아제를 포함하는데, 예를 들어, T7 RNA 폴리메라아제 (예를 들어, T7-Opti mRNA 키트, CureVac, 독일 튀빙겐), T3 RNA 폴리메라아제 또는 SP6, 일반적으로 약 10 내지 500 U, 바람직하게는 약 25 내지 250 U, 더 바람직하게는 약 50 내지 150 U, 가장 바람직하게는 약 100 U의 RNA 폴리메라아제를 포함한다. 본 발명의 복체화된 RNA의 전사된 적어도 하나의 RNA(분자)의 퇴화를 막기 위해, 시험관내 전사 매개체는 RNase가 없는 것이 더욱 바람직하다. 따라서, 적합한 시험관내 전사 매개체는 선택적으로 RNase 억제제를 추가적으로 포함한다.
그런 후, 핵산 주형은 시험관내 전사 매개체에서 배양될 수 있고, 상기한 치료적으로 활성인 단백질, 항체 또는 항원 또는 기타 단백질 또는 펩타이드를 코딩할 수 있는 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)로 전사된다. 배양 시간은 일반적으로 약 30 내지 240분, 바람직하게는 약 40 내지 120분, 가장 바람직하게는 약 90분이다. 배양 온도는 일반적으로 약 30-45 ℃, 바람직하게는 37-42 ℃이다. 배양 온도는사용된 RNA 폴리메라아제에 좌우되는데, 예를 들어, T7 RNA 폴리메라아제에 대해서는, 약 37 ℃이다. 전사에 의해 얻어진, 본 발명의 복체화된 RNA의 적어도 하나의 RNA(분자)는 바람직하게 mRNA이다. 시험관내 전사에서 얻어진 산출물은, 상기에 사용된 개시 규정량에 대해서, 사용된 주형 DNA의 ㎍ 당 약 30 ㎍의 RNA의 영역에 있다. 본 발명의 상황에서, 시험관내 전사에서 얻어진 산출물은 선형적 스케일 확대(linear up scaling)에 의해 증가될 수 있다. 이를 위하여, 상기에 사용된 개시 규정량은 요구되는 수득률에 따라, 예를 들어, 5, 10, 50, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000 등의 증배율로 증가되는 것이 바람직하다.
배양 후, 본 발명의 복체화된 RNA의 전사된 적어도 하나의 RNA(분자)의 정제는 선택적으로 발생할 수 있다. 이를 위해서, 종래 기술에 알려진 적합한 방법, 예를 들어, 크로마토그래피 정제 방법, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 겔여과 등이 사용될 수 있다. 정제에 의해서, 통합되지 않은, 즉, 초과 뉴클레오티드 및 주형 DNA를 시험관내 전사 매개체로부터 제거하여 순수한 RNA를 얻을 수 있다. 예를 들어, 전사된 RNA와의 반응 혼합물에 여전히 포함된 DNA 주형을 제거하기 위하여, 전사 후에는 일반적으로 반응 혼합물을 DNase로 침지시킬 수 있다.
본 발명의 복체화된 RNA의 전사된 적어도 하나의 RNA(분자)는 연속적으로 또는 대안적으로 LiCl로 침지될 수 있다. 그런 후, 전사된 RNA의 정제는 IP RP-HPLC를 통해 발생할 수 있다. 특히, 이것은 더 긴 절편과 더 짧은 절편의 효과적인 분리를 가능하게 한다.
바람직하게, 이와 관련해서, RNA의 정제는 RNA의 정제 방법을 통해 분취 스케일(preparative scale)로 일어날 수 있으며, RNA는 고정상(stationary phase)(PURE Messenger)으로 다공성 역상(porous reverse phase)을 이용하는 HPLC에 의해 정제된다는 점에서 구별된다. 예를 들어, 정제를 위하여, HPLC 정제를 위한 고정상으로 역상을 이용할 수 있다. 역상 크로마토그래피를 위하여, 고정상으로는 일반적으로 비극성 화합물을 사용하고, 용출을 위한 이동상으로는 대개 완충액의 형태로 사용되는 극성 용매, 예를 들어, 물의 혼합물을 아세토니트릴 및/또는 메탄올과 함께 사용한다. 바람직하게, 다공성 역상은 8.0 ± 2 ㎛, 바람직하게는 ±1, 더 바람직하게는 ± 0.5 ㎛의 입자 크기를 갖는다. 역상 물질은 비드(beads)의 형태일 수 있다. 정제는 이러한 입자 크기, 선택적으로 비드의 형태를 가진 다공성 역상으로 특별히 바람직한 방식으로 실행될 수 있어 매우 양호한 분리 결과를 얻을 수 있다. 다공성이 아닌 고정상 역상의 경우, Azarani A. and Hecker K.H.에 설명된 바와 같이, 과도한 압력이 조성되어 RNA의 분취 정체가 가능한 경우 매우 어렵게 이루어지므로, 사용된 역상은 바람직하게 다공성이다. 바람직하게, 역상은 200 내지 5,000의 기공 크기, 특히 300 내지 4,000의 기공 크기를 갖는다. 역상의 특히 바람직한 기공 크기는 200 - 400, 800 - 1,200 및 3,500 - 4,500이다. 이러한 기공 크기를 가진 역상 덕분에, 전사된 RNA의 정제에 관하여 특히 양호한 결과가 달성된다. 역상을 위한 물질은 바람직하게 폴리스티렌-디비닐벤젠이고, 비알킬화된 폴리스티렌-디비닐벤젠은 특히 사용될 수 있다. 폴리스티렌-디비닐벤젠을 가진 고정상은 그 자체로 잘 알려져 있다. 정제를 위하여, 그 자체가 공지되어 있고 HPLC법을 위해 이미 사용되고 있으며 상업적으로 얻을 수 있는 폴리스티렌-디비닐벤젠이 사용될 수 있다. 8.0 ± 0.5 ㎛의 입자 크기와 250 - 300, 900 - 1,100 또는 3,500 - 4,500의 기공 크기를 가진 비알킬화된 다공성 폴리스티렌-디비닐벤젠이 정제를 위해 특히 바람직하게 사용된다. 상기한 이점들은 역상을 위한 물질로 특히 유리한 방식으로 달성될 수 있다.
HPLC 정제는 이온쌍 결합법에 의해 실행될 수 있고, 양전하를 띤 이온은 음전기로 충전된 RNA의 반대 이온으로 이동상에 부가된다. 역상 시스템의 비극성 고정상에 의해 늦춰진, 친유성을 가진 이온쌍은 이러한 식으로 형성된다. 특히, 이온쌍 결합법을 위한 정밀한 조건은 각각의 특정 분리 문제에 대해 실증적으로 실시되어야 한다. 반대 이온의 크기, 그의 농도 및 용액의 pH는 분리의 결과에 크게 기여한다. 유리한 방식으로, 트리에틸암모늄 아세테이트 같은 알킬암모늄 염 및/또는 테트라부틸암모늄 같은 테트라알킬암모늄 화합물이 이동상에 부가된다. 바람직하게는, 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트가 부가되고, pH는 약 7로 조절된다. 이동상의 선택은 원하는 분리에 좌우된다. 이것이 의미하는 바는, 잘 알려진, 예를 들어, 종래 기술에 공지된, 특정 분리를 위해 발견된 이동상은 성공이 충분히 예견된 다른 분리 문제로 쉽게 이동될 수 있다. 이상적인 용출 조건, 특히 사용된 이동상은 각각의 분리 문제에 대해 실증적 실험에 의해 결정되어야 한다. 수계 용매와 유기 용매의 혼합물은 HPLC법에 의한 RNA의 용출을 위한 이동상으로 사용될 수 있다. 이와 관련해서, pH가 특히 약 7, 예를 들어 6.5 - 7.5, 예를 들어, 7.0인 완충액이 수계 용매로 사용되면 유리하다; 바람직하게는, 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액이 사용되고, 상기한 바와 같이 이온쌍 결합법에서 RNA의 반대 이온 역할을 하는 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액이 특히 바람직하다. 이동상에 사용된 유기 용매는 아세토니트릴, 메탄올 또는 이 두 가지의 혼합물일 수 있고, 아세토니트릴이 특히 바람직하다. 상기한 HPLC법을 이용한 RNA의 정제는 이러한 유기 용매로 특히 유리한 방식으로 실행된다. 이동상은 특히 바람직하게 pH 7의 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트와 아세토니트릴의 혼합물이다. 또한, 이동상이 5.0 vol.% 내지 20.0 vol.%(이동상 대비)의 유기 용매를 포함하고, 100 vol.%을 채우는 나머지가 수계 용매인 경우, 유리한 것으로 알려져 있다. 특히, 이동상이 9.5 vol.% 내지 14.5 vol.%(이동상 대비)의 유기 용매를 포함하고, 100 vol.%을 채우는 나머지가 수계 용매인 경우, 매우 유리한 것으로 알려져 있다. 연속으로 RNA의 용출은 일정하게 또는 구배 분리에 의해 실행될 수 있다. 일정 분리의 경우, RNA의 용출은 단일한 용출제 또는 불변인 몇 개의 용출제의 혼합물로 실행되어, 상기에 상세히 설명된 E용매를 용출제로 사용하는 것이 가능하다.
대안적으로, 트랜스펙션의 신규한 방법의 a) 단계에 따른 적어도 하나의 RNA (분자)는 화학적 합성에 의해서도 제조될 수 있다. 이에, 종래 기술에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, RNA 절편 (Nucleic Acid Research, 17:7059-7071, 1989)을 합성하는데 포스포로아미디트(phosphoroamidite)법이 가장 널리 사용된다. 일반적으로, 이 포스포로아미디트법은 뉴클레오시드 포스포로아미디트와 뉴클레오시드 사이의 응축(condensation) 반응을 가속제로 테트라졸을 사용하는 키(key) 반응으로 활용한다. 이러한 반응은 대개 당 모이어티에서 하이드록실 그룹과 뉴클레오시드 염기 모이어티에서 아암아미노그룹 모두에 경쟁적으로 발생하기 때문에, 원하는 뉴클레오티드를 합성하기 위해서 당 모이어티에서 하이드록실 그룹에만 선택적인 반응이 요구된다. 따라서, 아미노 그룹에서의 부반응은 아미노 그룹을 보호함으로써 대개 방지된다. 합성이 완료되면, 보호적 그룹은 제거된다. RNA분자를 합성하는 방법에 대한 더 상세한 정보는 "7th Symposium Chem. Nucleic Acid Components," Nucleic Acids Symposium Series, 18, 181-184 (Aug. 30, 1987)에 보고된 Arnold et al ., "Chloridite and Amidite Automated Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides Using Amidine Protected Nucleosides,"; Chemical Abstracts, 108(19), p. 692, Abstr. No. 167875z (May 9, 1988); Hayakawa et al ., "Benzimidazolium Triflate as an Efficient Promoter for Nucleotide Synthesis via the Phosphoramidite Method," J. Organic Chemistry, 61(23), 7996-7997 (Nov. 15, 1996); Pirrung et al ., "Proofing of Photolithographic DNA Synthesis with 3',5'-Dimethoxybenzoinyloxycarbonyl-Protected Deoxynucleoside Phosphoramidites," J. Organic Chemistry, 63(2), 241-246 (Jan. 23, 1998); Effenberger et al ., Trifluoromethanesulfonic Imidazolide--A Convenient Reagent for Introducing the Triflate Group, Tetrahedron Letters, 1980 (45), 3947-3948 (Sep. 1980)에서 찾을 수 있으며, 이들 모두는 인용으로써 본 명세서에 병합된다.
본 발명의 a) 단계에 따른 복체화된 RNA의 제조는 일반적으로 하위단계 a3)에 따라 특정 양의 적어도 하나의 RNA (분자)를 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x. 을 가진 특정 양의 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드에 부가함으로써 발생한다. 이에 따라, 적어도 하나의 RNA (분자) 및 본 명세서에 정의된 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x을 가진 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드의 상기 표시된 몰비 또는 질량비는 일반적으로 고려된다. 복합체 형성은 일반적으로 두 성분을 혼합하면 발생한다. 이에 따라, 텝타이드 성분은 일반적으로 rna 성분에 부가되고, 경우에 따라서는 그 반대도 가능하다.
그러나, 방법의 a) 단계에 따른 이러한 제조 단계는 선택적이고, 본 발명에 따른 복체화된 RNA가 이미 이용가능하면 발생하지 않을 수 있다. 따라서, 상기한 하위단계들 a1), a2) 및 a3)도 선택적이고, 복체화된 RNA를 위해 사용된 RNA가 이미 이용가능하면, 실행될 필요가 없다. 유사하게, 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x을 가진 하나 또는 그 이상의 올리고펩티드는 직접 사용될 수 있고, 예를 들어 공급원으로부터 이미 이용가능하다면 제조될 필요가 없다.
시험관내 또는 생체조건에서 세포 또는 조직을 트랜스펙션하는 신규한 방법의 b) 단계에 따르면, 세포 또는 조직은 a) 단계에 따라 공급 및/또는 제조된 복체화된 RNA를 이용하여 트랜스펙트될 수 있다. 시험관내 또는 생체조건에서 세포 또는 조직의 트랜스펙션은 일반적으로 a) 단계에 따라 공급 및/또는 제조된 복체화된 RNA를 세포 또는 조직에 부가함으로써 실행된다. 그런 후, 바람직하게, 복체화된 RNA는 세포 매커니즘, 예를 들어, 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 세포 속으로 들어간다. 그러한 세포 또는 조직으로 복체화된 RNA의 부가는 본 발명의 복체화된 RNA (분자)의 트랜스펙션 잠재력 때문에 추가 성분의 부가없이 본 발명에 따라 발생할 수 있다. 대안적으로, a) 단계에 따라 공급 및/또는 제조된 복체화된 RNA의 세포 또는 조직으로의 부가는 조성물의 형태로 발생할 수 있는데, 예를 들어, 수계 용액의 성분, 바람직하게는 트랜스펙션 활성화를 더 개선시키기 위해 추가 성분을 선택적으로 포함할 수 있는 상기한 의약 조성물의 형태로 발생할 수 있다.
시험관내에서 a) 단계에 따라 공급 및/또는 제조된) 복체화된 RNA의 트랜스펙션을 위한 이러한 상황에서 세포 (또는 숙주 세포)는 어느 세포를 포함하든 무방하나. 이에 한정되지 않지만, 신규한 복체화된 RNA를 이용하여 (상기한) RNA 분자에 의해 트랜스펙트되는 세포가 바람직하다. 특히, RNA 트랜스펙션은 본 발명에 따른 복체화된 RNA의 RNA에 의해 코딩된 단백질의 세포내 발현을 가능하게 하거나 또는 신규한 복합체의 RNA (예를 들어, siRNA, 안티센스 RNA)가 세포 유전자의 발현을 상쇄 또는 억제하게 할 수 있다. 이와 관련해서, 바람직하게, 세포는 배양된 진핵생물 세포(예를 들어, 효모 세포, 식물 세포, 동물 세포 및 인간 세포) 또는 원핵생물 세포(예를 들어, 박테리아 세포 등)를 포함하고, 또는 면역 반응을 유도한다. 다세포 미생물의 세포는 번역후의 변형, 예를 들어, 코딩된 단백질의 글리코실화가 필요한 경우 (N- 및/또는 O-결합) 선택되는 것이 바람직하다. 원핵생물 세포에 반대로, 그러한 (고등) 진핵생물 세포는 합성된 단백질의 번역후의 변형을 가능하게 한다. 다량의 그러한 고등 진핵생물 세포 또는 세포계, 예를 들어, 293T (진핵생물 신장 세포계), HeLa (인간 자궁경관 암종세포), CHO (중국 햄스터의 난소의 세포) 및 실험 목적을 위해 개발된 그러한 세포와 세포계를 포함한 그외 세포계, 예를 들어, hTERT-MSC, HEK293, Sf9 또는 COS 세포는 당업자에게 알려져 있다. 적합한 진핵 세포는 질병 또는 감염, 예를 들어, 암 세포, 특히 본 명세서에 언급된 종류의 암의 암세포에 의해 손상된 세포, HIV에 의해 손상된 세포, 및/또는 면역 체계 또는 중앙 신경계(CNS)의 세포 또는 세포계를 더 포함한다. 또한, 적합한 세포는 진핵 미생물, 예를 들어, 효모, 예를 들어, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)(Stinchcomb et al ., Nature, 282:39, (1997)), 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 칸디다(Candida), 피키아(Pichia), 및 아스페르길루스(Aspergillus)속, 페니실륨(Penicillium)속의 섬사상 곰팡이(filamentous fungi) 등으로부터 유래된다. 또한, 적합한 셀은 원핵생물 세포, 예를 들어, 박테리아 세포, 예를 들어, 대장균(Escherichia coli) 또는 일반적인 바실루스(Bacillus), 락토코커스(Lactococcus), 락토바실루스(Lactobacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces), 스트렙토코커스(Streptococcus), 포도상구균(Staphylococcus)의 박테리아, 바람직하게는 E. coli, 등을 포함한다. 특히, 인간 세포 또는 동물 세포, 예를 들어, 본 명세서에 언급된 동물들의 동물 세포는 진핵세포로 바람직하다. 또한, 항원제시세포(APCs)는 본 발명에 따른 복체화된 RNA의 체외 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 복체화된 RNA의 체외 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있는 수상세포가 특히 바람직하다.
특히 바람직한 실시예에 따르면, 혈구 및/또는 헤모포이에틴성(haemopoietic) 세포, 또는 그의 부분 모집단, 즉 (전체) 혈액으로부터 분리될 수 있거나 및/또는 상기 세포로부터 유래된 배양된 세포로부터 유래될 수 있는 어떤 종류의 세포, 예를 들어, 적혈구(erythrocytes), 과립구(granulocytes), 단핵 세포 (말초혈단핵세포, PBMCs) 및/또는혈소판 (혈전구(thrombocytes)), APSs, DCs, 등은 상기 트랜스펙션 방법을 이용하여 상기한 바와 같이 복체화된 RNA로 트랜스펙트될 수 있다. 바람직하게, 혈구, 특히 DC 같이 잘 분화된 전문적인 APC를 작은 비율로 포함한다는 점이 특징인 그의 부분 모집단이 사용된다. 트랜스펙션을 위해 사용될 때, 트랜스펙트된 세포는 바람직하게 5% 미만, 특히 바람직하게는 2% 미만의 DC를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 상황에서 "혈구"는 전체 혈액, 혈청 또는 다른 원천, 예를 들어, 비장 또는 림프절로부터의 적혈구, 과립구, 단핵세포(PBMCs) 및/또는 혈소판의 실질적으로 순수한 모집단의 혼합물 또는 농축물로 이해되는 것이 바람직하고, 작은 비율의 전문적인 APC만이 존재한다. 본 발명에 따라 사용된 혈구는 바람직하게 신선한 혈구로, 즉 혈구의 모집(특히 혈액 회수)과 트랜스펙션 사이의 기간이 매우 짧은데, 예를 들어, 12 h 미만, 바람직하게는 6 h 미만, 특히 바람직하게는 2 h a미만, 더욱 특히 바람직하게는 1 미만이다. 또한, 본 발명에 따른 복체화된 RNA를 트랜스펙트하는 상기 방법을 이용하여 트랜스펙트되어야 하는 혈구는 바람직하게 본 발명의 의약 조성물로 치료받을 실제 환자의 것이다. 상기한 혈구, 헤모포이에틴성 세포 또는 그의 일부 모집단의 사용은 본 명세서에 정의된 mRNA에 의해 코딩된 특정 항원에 대해 치료받아야 하는 환자의 종두를 위해서, 개인, 특히 치료받아야 하는 환자의 혈액으로부터 얻은 혈구, 예를 들어, PBMC를 힘들고, 비싸고 오랜 시간이 걸리는 배양 기술을 이용하여 전문적인 항원 제시 세포(APCs), 특히 수상 세포의 높은 비율로 세포의 모집단에 분포시킬 필요가 없지만, 성공적인 면역촉진을 위해, 혈구, 특히 그의 상기한 부분 모집단을 얻은 실제 환자에게 적합한 면역 촉진을 일으키는 의약 조성물을 얻기 위해 하나 또는 그 이상의 항원의 유전암호를 지정하는 mRNA로 혈구를 직접 트랜스펙트하는 것으로도 충분하다는 놀라운 발견에 기초하고, 상기 면역촉진은 종양으로부터의 하나 또는 그이상의 항원 또는 병원성 세균 또는 병원체로부터의 하나 또는 그 이상의 항원을 표적으로 하는 것이 바람직하다. 본 명세서에 정의된 복체화된 RNA의 혈구 또는 그로부터 유래된 세포(글부터 분리된 세포 또는 각각의 배양된 세포계로부터의 세포)로의 트랜스펙션은 항원에 한정되지 않으며, 복체화된 RNA를 위해 사용된 상기한 RNA, 예를 들어, 본 명세서에 정의된 면역촉진 RNA, 코딩 RNA, 등에 관한 것도 아니다.
배양된 세포를 시험관내에서(예를 들어, 인간 또는 동물 세포) 트랜스펙트하거나 외식된 세포를 시험관내에서(예를 들어, 인간 또는 동물 세포) 트랜스펙트할 필요가 있지만, 생체내 트랜스펙션을 위해 본 발명의 복체화된 RNA를 환자에게 직접적으로 투여하는 것도 고려된다. 따라서, a)단계에 따라 공급 및/또는 제조된) 복체화된 RNA의 트랜스펙션은 b) 단계에 따라 생체내에서도 발생할 수 있다. 즉, 살아 있는 조직 및/또는 미생물에 투여될 수 있다. 따라서, 신규한 트랜스펙션 방법의 a)단계에 따라 공급된 복체화된 RNA는 그대로 살아있는 조직 또는 미생물에 투여되거나 예를 들어, (액체) 조성물, 특히 수계 조성물, 예를 들어, 상기한 의약 조성물의 성분으로 투여될 수 있다. 이와 관련해서, 미생물 (또는 존재)은 일반적으로 포유류를 의미하며, 예를 들어, 이에 한정되지 않지만, 인간, 동물, 예를 들어 돼지, 염소, 소, 멧돼지, 개, 고양이, 당나귀, 원숭이, 영장류 또는 귀, 햄스터, 토끼를 포함하는 설치류 그룹으로부터 선택된 포유류를 말한다. 또한, 상기한살아있는 조직은 바람직하게 이러한 미생물로부터 유래된다. 복체화된 RNA의 이러한 살아있는 조직 및/또는 미생물로의 투여는 적합한 투여 경로를 통해 전신에 발생할 수 있고, 예를 들어, 투여 경로는 상기한 피내 또는 경피투여, 구강투여, 피하, 근육내, 정맥내 같은 비경구투여, 국소투여 및/또는 비강내투여 경로를 포함한다.
게다가, 시험관내 또는 체외에서 사용될 수 있는 트랜스펙션 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 언급된 다양한 질병의 치료 방법 같이 체내에서 사용되기에도 적합할 수 있다. 본 발명에 따른 치료 방법의 바람직한 형태에 있어서, 의약적으로 효과적인 다른 물질, 예를 들어, 항체, 항원(특히, 상기한 병원성 또는 종양 항원)의 투여 또는 적어도 하나의 사이토카인의 투여를 포함할 수 있는 추가 단계가 포함될 수 있다. 양자는 복합체화된 RNA로부터 예를 들어, 사이토카인 또는 항원을 코딩하는 DNA 또는 RNA로 분리되어 투여될 수 있으며, 또는 해당 사이토카인 또는 항원이 그렇게 투여될 수 있다. 치료 방법은 또한, 면역 체계를 더 활성화시킬 수 있는 (본 명세서에 상기한) 추가 보조제의 투여를 포함할 수 있다 .
본 발명의 추가 실시예에 따르면, 8 내지 15의 아미노산 길이를 나타내고 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x을 가진 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드로 복체화된 적어도 하나의 RNA를 포함한 상기 복체화된 RNA는 본 명세서에 언급된 특정 질병의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 특정 질병의 질병 및/또는 예방은 일반적으로 본 발명의 복체화된 RNA의 RNA에 의해 코딩된 적합한 단백질의 선택에 좌우된다. 이와 관련해서, (이러한 단백질을 코딩하는) 본 발명에 따른 복체화된 RNA를 그대로 투여 또는 본 발명에 따른 상기한 (의약) 조성물을 투여함으로써 치료는 발생할 수 있다.
이와 관련해서, 질병 또는 상태는, 이에 한정되지 않지만, 예를 들어, 악성 흑색종(melanomas), 결장암(colon carcinomas), 림프종(lymphomas), 육종(sarcomas), 모세포종(blastomas), 신장암종(kidney carcinomas), 위장종양(gastrointestinal tumours), 신경교종(gliomas), 전립선종양(prostate tumours), 방광암(bladder cancer), 직장종양(rectal tumours), 위선암(stomach cancer), 식도암(oesophageal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간암(liver cancer), 유방암(mammary carcinomas)(= breast cancer), 자궁암(uterine cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 급성골수백혈병(acute myeloid leukaemia) (AML), 급성림프백혈병(acute lymphoid leukaemia)(ALL), 만성골수백혈병(chronic myeloid leukaemia)(CML), 만성림프백혈병(chronic lymphocytic leukaemia)(CLL), 간암(hepatomas), 각종 바이러스-유도성 종양(diverse virus-induced tumours), 예를 들어, 유두종 바이러스-유도성암(papilloma virus-induced carcinomas)(예를 들어, 자궁경관 암종(cervix carcinoma = cervical cancer), 선암(adenocarcinomas), 헤르페스 바이러스-유도성 종양(herpes virus-induced tumours)(예를 들어, 버킷(Burkitt) 림프종, EBV-유도성 B 세포 림프종), B형 간염-유도성 종양 (간세포 암종), HTLV-1- 및 HTLV-2-유도성 림프종, 청신경초종(acusticus neurinoma), 폐암 (= lung cancer = bronchial carcinoma), 작은 세포 폐암, 인후암, 항문암, 교모세포종(glioblastoma), 곧은창자 암, 성상세포종(astrocytoma), 뇌종양, 망막모세포종(retinoblastoma), 기저세포암(basalioma), 뇌전이, 수질아세포종(medulloblastomas), 질암, 고환암, 갑상선암, Hodgkin 증후군, meningeomas, Schneeberger병, 뇌하수체 종양, 진균성 사상균병(mycosis fungoides), 암양종(carcinoids), 신경초종(neurinoma), spinalioma, Burkitt 림프종, 후두암, 신장암, 흉선종(thymoma), 자궁체부암(corpus carcinoma), 뼈암(bone cancer), 비-Hodgkin 림프종, 요도암, CUP 증후군, 머리/목 종양, 핍지교종(oligodendroglioma), 외음부암, 장암, 결장암, 식도암 (oesophageal carcinoma =　oesophageal cancer), wart conditions, 소장 종양, craniopharyngeomas, 난소암종(ovarian carcinoma), 연조직 종양, 난소암 (= 난소암종), 췌장암종 (= 췌장암), 자궁내막암, 간전이, 음경암, 설암, 담낭암(gallbladder cancer), 백혈병, 형질세포종(plasmocytoma), 눈꺼풀 종양, 전립선암 (= 전립선 종양) 등으로부터 선택된 암 또는 종양 질병을 포함할 수 있다.
이와 관련해서, 질병 또는 상태는, 이에 한정되지 않지만, 예를 들어, 하기로부터 선택된 감염 질환도 포함할 수 있다: SARS, 황열병, 라임(Lyme)병, 탄저병, 후천성 면역 결핍증(AIDS), 첨규콘딜롬(condyloma acuminata), 전염성 연속종 (molluscum contagiosum), 뎅그열(dengue fever), 3일 발열(three day fever), 이볼라 바이러스, 감기, 초여름 수막뇌염 (ESME), 유행성감기(influenza), 대상포진(shingles), 간염, I형 헤르페스 바이러스 감염증, II형 헤르페스 바이러스 감염증, 대상포진(herpes zoster), 일본 뇌염, 라사(Lassa)열, 마르부르크(Marburg) 바이러스, 홍역, 구제역, 단구 증가증, 이하선염, Norwalk 바이러스 감염, Pfeiffer 선열, 천연두, 소아마비(척수성 소아마비), pseuodcroup, 전염성 홍반, 광견병, 사마귀(warts), 웨스트나일(West Nile)열, 수두, 세포 확대 바이러스 (CMV), 세균성 감염 질환, 예를 들어, 임신중절(전립선염), 탄저병, 맹장염 (맹장의 염증), 보렐리아병(borreliosis), 보툴리누스 중독증, 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아트라코마티스(Chlamydia trachomatis)(요도, 결막의 염증), 콜레라, 디프테리아, donavonosis, 후두개염(epiglottitis), 이 매개성 발진티푸스(louse-borne typhus), 장티푸스, 가스 괴저병, 임질, 들토끼 전염병, 헬리코박터 파일로리, 백일해, 기후성 가래톳, 골수염, 냉방병(legionnaires' disease), 나병, 리스테리아병, 폐염, 뇌막염, 세균성 뇌막염, 탄저병, 중이염, 마이코 플라즈마 질염 (Mycoplasma hominis), neontal sepsis(융모양막염(chorioamnionitis)), 수암(noma), 파라티푸스 발열, 전염병, Reiter 증후군, 로키산열(Rocky Mountain spotted fever), 살모넬라 파라티푸스 발열, 살모넬라 장티푸스, 성홍열, 매독, 파상풍, 임질, 쯔쯔가무시(tsutsugamushi)열, 결핵, 발진티푸스, 질염(vaginitis) (질염(colpitis)), 기생충, 원생 동물 또는 균류에 기인한 연성 하감 및 전염병, 예를 들어, 아메바성 이질, 빌하르즈흡충증(bilharziosis), Chagas병, 에키노코쿠스(Echinococcus), 물고기 촌충, 어육 중독(ichthyotoxism)(시가테라(ciguatera)), 여우 촌충, 진균성 사상균병(mycosis pedis), 개 촌충, candiosis, ptyriasis, 가려움(옴(scabies)), 레슈마니아증, 피부 레슈마니아증, lamblian 이질 (giadiasis), 이, 말라리아, microscopy, 회선사상충증(onchocercosis)(사상충증(river blindness)), 곰팡이 질병, 쇠고기 촌충, 주혈흡충병, 수면병, 돼지 촌충, 주혈 원충병, 트리코모나스 감염증(trichomoniasis), 트리파노소마증(trypanosomiasis)(수면병), 내장 레슈마니아증, 기저귀 피부염 또는 왜소조충(dwarf tapeworm).
또한, 본 발명의 상황에서 질병은, 이에 한정되지 않지만, 하기로부터 선택된 바이러스에 의한 (감염성) 바이러스 질병을 포함할 수 있다: HIV, 오소팍스 천연두 바이러스(orthopox variola virus), 오소팍스 알라스트림 바이러스(orthopox alastrim virus), parapox ovis 바이러스, 전염성 연속종 바이러스(Molluscum contagiosum virus), 헤르페스 바이러스 1, 헤르페스 바이러스 2, 헤르페스 B 바이러스, 수두 대상 포진(varicella zoster) 바이러스, 가성광견병(pseudorabies) 바이러스, 인간 거대세포 (cytomegaly) 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6, 인간 헤르페스 바이러스 7, Epstein-Barr 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 8, B형 간염 바이러스, 치쿤구니야(chikungunya) 바이러스, O'nyong'nyong 바이러스, 루비바이러스(rubivirus), C형 간염 바이러스, GB 바이러스 C, 웨트스나일 바이러스, 뎅그열 바이러스, 황열병 바이러스, 도약병(louping ill) 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 일본 B 뇌염 바이러스, Powassan 바이러스, FSME 바이러스, SARS-관련 코로나 바이러스, 인간 코로나 바이러스 229E, 인간 코로나 바이러스 Oc43, Torovirus, 인간 T 세포 lymphotropic 바이러스 유형 I, 인간 T 세포 lymphotropic 바이러스 유형 II, HIV 타입-1, HIV 타입-2, 라사(Lassa) 바이러스, 림프 세포 맥락수막염 바이러스, Tacaribe 바이러스, Junin 바이러스, Machupo 바이러스, Borna 질병 바이러스, Bunyamwera 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, Rift Valley 발열 바이러스, 모레파리 발열 바이러스, 토스카나(Toscana) 바이러스, 크림 콩고 출혈성 발열 바이러스, 하자라(Hazara) 바이러스, 카산 바이러스, 한탄 바이러스, 서울 바이러스, 장래성 언덕 바이러스, Puumala 바이러스, Dobrava 벨그라드 바이러스, 튤라(Tula) 바이러스, 죄악 nombre 바이러스, 빅토리아호 Marburg 바이러스, 자이레 이볼라 바이러스, 수단 이볼라 바이러스, 코트디부아르 이볼라 바이러스, 유행성감기 바이러스 A 의 유행성감기 바이러스 B 의 유행성감기 바이러스 C 의 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 호흡 신시티얼(syncytial) 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 소낭 구내염 인디애나 바이러스, 광견병 바이러스, Mokola 바이러스, Duvenhage 바이러스, 유럽 박쥐 라이사바이르서(lyssavirus) 1 + 2, 오스트레일리아 박쥐 라이사바이러스, 아데노바이러스 A-F, 인체 유두종균, 습우 바이러스 6, 습우 바이러스 11, 폴리오마(polyoma) 바이러스, 아데노-관련 바이러스 2, 로타바이러스, 또는 오르비바이러스(orbivirus) 등. 이러한 질병은, 예를 들어, 본 발명에 따른 백신으로 치료될 수 있다.
또한, 질병 또는 상태는, 이에 한정되지 않지만, 관상 동맥 심장병, 동맥경화증, 졸중 및 고혈압을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는 심혈관 질환, 및 알쯔하이머 병, 근위축성 측방 경화증, 디스토니아, 간질, 다발성 경화증 및 파킨슨 질병 등으로부터 선택되는 신경 질환을 포함할 수 있다.
이와 관련해서, 질병 또는 상태는 또한 알러지 장애 또는 질병을 포함한다. 알레르기는 일반적으로 특정 외래 항원 또는 알레르겐에 대해 비정상적인, 후천적으로 면역학적 과민성을 수반하는 상태이다. 알레르기는 정상적으로 이러한 항원 또는 알레르겐에 대해 국소 또는 전신 면역반응을 일으키고 이러한 알레르겐에 대항하여 몸 속에 면역되게 한다. 이와 관련해서, 알레르겐은, 예를 들어, 잔디, 화분, 경토, 약물, 또는 수많은 환경적 자극 등을 포함한다. 특정 이론에 구애되지 않지만, 몇몇의 상이한 질병 매커니즘은 알레르기 발생에 관련있는 것으로 추측된다. P. Gell and R. Coombs에 의한 분류 체계에 따르면, "알레르기"라는 용어는 I형 과민증으로 제한되고, 이는 전통적인 IgE 매커니즘에 의한 것이다. I형 과민증은 IgE에 의한 비만 세포 및 호염기성 세포(basophils)의 초과 활성화로 인하여 콧물 같은 약한 증상에서 생명을 위협하는 과민성 쇼크와 죽음에 이르게 하는 전신 감염 반응이 일어나는 것으로 특징지어 진다. 잘 알려진 알레르기 종류는, 이에 한정되지 않지만, (코 점막의 팽윤의 원인이 되는) 알레르기성 천식, (결막의 붉어짐 및 가려움의 원인이 되는) 알레르기성 결막염, 알레르기성 비염 ("고초열"), 아나팔락시스(anaphylaxis), angiodema, 아토피성 피부염 (습진), 두드러기(두드러기성 구진), 호산구 증가증, 호흡기성, 곤충에 찔린 알레르기, 피부 알레르기 (각종 뾰루지, 예를 들어, 습진, 두드러기성 구진(hives)(두드러기) 및 (접촉) 피부염 포함), 음식 알레르기, 약에 대한 알레르기 등을 포함한다. 본 발명과 관련해서, 예를 들어, 본 발명의 복합체로서 알레르겐(예를 들어, 고양이 알레르겐, 먼지 알레르겐, 진드기 알레르겐, 식물 알레르겐 (예를 들어, 자작나무 알레르겐) 등)의 유전정보를 지정하는 RNA를 포함한 의약 조성물이 제공된다. 이에 따라, 코딩된 알레르겐은 환자의 면역반응을 둔삼하게 할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 의약 조성물은 (과잉) 면역반응을 더 강한 TH1 반응으로 인도하여 환자가 고통받는 원치 않는 IgE 반응을 억제 또는 상쇄시킬 수 있다.
또한, 본 명세서에 정의된 질병 또는 상태는 자기면역 질환을 포함할 수 있다. 자기면역 질환은, 각 질환의 임상병리적인 특징에 따라 전신 및 기관-특정 또는 국소 자기면역 장애로 넓게 분류될 수 있다. 자기면역 질환은 SLE, Sjorgen 증후군, 경피증, 류마티스 관절염 및 다발근육염(polyomyositis)을 포함하는 전신 신드롬, 또는 내분비내과(DM 타입-1, 하시모토 갑상선염, 애디슨 질병, 등등), 피부과(심상천포창(pemphigus vulgaris)), 혈액학 (자기 면역 용혈성 빈혈증), 신경학 (다발성 경화증)일 수 있는 국소 신드롬으로 분류될 수 있고, 또는 실제로 신체 조직의 전체에 영향을 끼칠 수 있다. 치료되어야 하는 자기면역 질환은 그룹으로부터 선택될 수있다. 치료되어야 하는 자기면역 질환은 I형 자기면역 질환 또는 II형 자기면역 질환 또는 type III형 자기면역 질환 또는 IV형 자기면역 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있는데, 예를 들어, 다발성 경화증 (MS), 류머티스성 관절염, 당뇨병, I형 당뇨병 (진성 당뇨병), 전신 홍반성 낭창 (SLE), 만성 다발성 관절염, 베이스도우 홍반(Basedow' erythematosus); 자가면역형 만성 간염, 궤양성 대장염(olitis ulcerosa), I형 알레르기 질병, II형 알레르기 질병, III형 알레르기 질병, IV형 알레르기 질병, 섬유근육통, 탈모, 벡테레프(Bechterew)병, 크론(Crohn)병, 중증 근무력증(Myasthenia gravis, 노이로데르미티스(neurodermitis), 급성 전신 경화증(progressive systemic sclerosis)(PSS), 건선, 라이터(Reiter) 증후군, 류머티즘 관절염, 건선, 맥관염(vasculitis) 등, 또는 II형 당뇨병으로부터 선택될 수 있다.
면역 시스템이 자가항원에 대한 면역 반응을 유도하는 정확한 모드는 아직까지 밝혀지지 않았지만, 병인학과 관련된 몇몇 발견들은 있었다. 따라서, 자가반응(autoreaction)은 T-세포 바이패스에 기인한 것일 수 있다. 정상 면역 시스템은 B 세포가 많은 양으로 항체를 생성할 수 있기 전에 T-세포에 의한 B-세포의 활성화를 필요로 한다. T-세포의 이러한 절차는 수퍼-항원을 생성하는 개체에 의한 감염과 같은 드문 경우들에 있어 우회될 수 있으며, 이것은 비특이적 방식으로 T-세포 수용체들의 일정 서브유닛에 직접적으로 결합함으로써 B-세포, 또는 심지어 T-세포의 폴리클로날 활성화를 시작할 수 있게 된다. 다른 설명은 분자 모방(molecular mimicry)으로부터 자가면역 질환을 추론한다. 외부 항원은 일정 숙주 항원과 구조적 유사성을 공유할 수 있으며; 따라서, (자가-항원과 유사한) 이러한 항원에 대해 생성된 어떠한 항체는 또한, 이론적으로는, 숙주 항원에 결합할 수 있으며, 해당 면역 반응을 증폭할 수 있다. 분자 모방의 가장 강력한 형태는 그룹 A 베타-용혈(haemolytic) 스트렙토코쿠스(streptococci)에서 관찰되며, 이것은 인간 심근과 항원을 공유하고, 류마티스성 열의 심장 발현에 일정 역할을 한다. 본 발명은 그러므로 본 발명의 복합체화된 RNA의 구성요소(또는 본 발명의 그러한 복합체화된 RNA를 포함하는 (액상) 조성물)로 자가항원을 코딩하는 RNA를 제공할 수 있고, 또는 (단백질로서, 또는 자가항원 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 DNA로서) 자가항원을 포함하는 약학 조성물 및 본 발명의 복합체화된 RNA를 제공할 수 있으며, 이 모든 것은 전형적으로 면역 시스템이 탈감작되도록 할 수 있다.
마지막으로, 본 발명에 의해 치료될 수 있는 질병들은 또한 단세대(monogenetic) 질병, 즉, (세습성(hereditary)) 질환, 또는 일반적인 유전 질환을 포함한다. 그러한 유전 질환들은 일반적으로 유전적 결함(defect)에 의해 야기되는데, 예를 들어, 단백질 활성의 손실을 초래하는 유전자 돌연변이 또는 단백질의 전사 또는 번역을 불가능하게 하는 조절 돌연변이(regulatory mutation) 때문이다. 때때로, 이러한 질환들은 대사성 장애 또는 다른 증상, 예를 들어, 근육 퇴행위축을 초래한다. 따라서, 본 발명은 본 발명에서 정의된 바와 같은 복합체화된 RNA을 제공함으로써 이러한 질병들을 치료할 수 있다. 본 발명에서, 다음의 질병들이 치료될 수 있다: 3-베타-하이드록시스테로이드 디하이드로게나제 결핍 (타입 II); 3-케토티오라제 결핍; 6-머캅토퓨린 민감(sensitivity); Aarskog-Scott 신드롬; 무(無)베타지단백혈증; 무카탈라제혈증; 연골무형성증(Achondrogenesis); 연골무형성증-저연골형성증(hypochondrogenesis); 연골무형성(Achondroplasia); 색맹; 전완하퇴말단(Acromesomelic) 형성장애 (Hunter-Thompson 타입); ACTH 결핍; 아실-CoA 디하이드로게나제 결핍 (짧은-체인, 중 체인, 긴 체인); 선종성 결장폴립증; 아데노신-디아미나제 결핍; 아데닐로석시나제(Adenylosuccinase) 결핍; 아드할리노병증(Adhalinopathy); 선천적 신장 과형성 (11-베타-하이드록실라제 결핍에 기인; 17-알파-하이드록실라제 결핍에 기인; 21-하이드록실라제 결핍에 기인); 저성선자극호르몬성 성선부전증이 있는 선천적 신장 저형성증; 부신성기(Adrenogenital) 신드롬; 부신백색질형성장애증; 아드레노마이엘로신경병증(Adrenomyeloneuropathy); 무섬유소원혈증(Afibrinogenemia); 무감마글로불린혈증; Alagille 신드롬; 색소결핍증 (갈색, 눈(ocular), 눈피부(oculocutaneous), 적갈색(rufous)); 급성 알코올 과민; 알돌라제 A 결핍; 글루코코르티코이드-치료 가능한 알도스테론증; Alexander 질환; 알캅톤뇨증; 범발성 탈모증; 알파-1-항키모트립신(antichymotrypsin) 결핍; 알파-메틸아실-CoA 라세마제 결핍; 알파-지중해 빈혈/정신 지체(mental retardation) 신드롬; Alport 신드롬; 알쯔하이머 질환-1 (APP-관련); 알쯔하이머 질환-3; 알쯔하이머 질환-4; 사기질조직형성 부전증; 아밀로이드 신경병증(neuropathy) (가족성, 여러 대립유전자 타입들); 아밀로이드증 (Dutch 타입; Finnish 타입; 세습성(hereditary) 신장의; 신장의; 노인성 시스템적(senile systemic)); 근위축측삭경화증; 알부민결핍증; 안드로겐 둔감(insensitivity); 빈혈 (Diamond-Blackfan); 빈혈 (용혈성, PK 결핍에 기인); 빈혈 (용혈성, Rh-null, 억제자(suppressor) 타입); 빈혈 (신생아 용혈성, 치명적 및 거의 치명적(nearfatal)); 빈혈 (철적모구성, 기능 장애가 있음); 빈혈 (철적모구성/저색소성); G6PD 결핍에 기인한 빈혈; 동맥류 (가족성 동맥성); Angelman 신드롬; 혈관부종; 무홍채증; 전방 세그먼트 이상 및 백내장; 전방 세그먼트 중간엽 발생장애; 전방 세그먼트 중간엽 발생장애 및 백내장; 항트롬빈 III 결핍; 불안-관련 성격 특성(personality trait); Apert 신드롬; 일시 호흡 정지(Apnea) (마취후); ApoA-I 및 apoC-III 결핍 (혼합형); 아포리포단백질 A-II 결핍; 아포리포단백질 B-100 (리간드-결핍성); 겉보기(Apparent) 미네랄로코르티코이드 과다(고혈압에 기인); 아르기닌혈증; 아르기닌 호박산뇨(Argininosuccinic aciduria); 관절병증 (진행성 위(僞)류마티스성, 유년기); 아스파틸글루코사민뇨증(Aspartylglucosaminuria); (일시) 운동 실조; 분리된 비타민 E 결핍을 가지는 운동 실조; 운동 실조-모세혈관확장(telangiectasia); 아텔로스테오생성(Atelosteogenesis) II; ATP 의존성 DNA 리가제 I 결핍; 심방 유도 결핍을 가진 심방 격벽 결핍; 구진(papular) 병변을 가진 무모증(Atrichia); (석시닐퓨린에믹(purinemic)) 자폐증; 자가면역 다분비선(polyglandular) 질병, 타입 I; 자치 신경계 역기능; Axenfeld 이상; 무정자; Bamforth-Lazarus 신드롬; Bannayan-Zonana 신드롬; Barth 신드롬; Bartter 신드롬 (타입 2 또는 타입 3); 기저 세포 암종(Basal cell carcinoma); 기초 세포 모반 신드롬; BCG 감염; Beare-Stevenson 피부 gyrata 신드롬; 베커 근 위축증; Beckwith-Wiedemann 신드롬; Bernard- Soulier 신드롬 (타입 B; 타입 C); Bethlem 근육병증; 1차 담즙산 흡수 불량; Biotinidase 결핍; 방광암; 결핍성 트롬복세인 A2 수용체에 기인한 출혈 장애; Bloom 신드롬; 짧은발가락증(Brachydactyly) (타입 B1 또는 타입 C); Branchiootic 신드롬; Branchiootorenal 신드롬; 유방암 (침습적 관내증식; 소엽성; Reifenstein 신드롬을 가진 남성; 산재성); 유방암-1 (이른 개시); 유방암-2 (이른 개시); Brody 근육병증; Brugada 신드롬; Brunner 신드롬; Burkitt 림프종; (망막) 나비 영양 실조; C1q 결핍 (타입 A; 타입 B; 타입 C); C1r/C1s 결핍; 고립되는 C1s 결핍; C2 결핍; C3 결핍; C3b 불활성화자(inactivator) 결핍; C4 결핍; C8 결핍, 타입 II; C9 결핍; 상염색체 성 반전(reversal)을 가진 Campomelic 형성장애; Camptodactyly-관절증-고관절 varapericarditis 신드롬; Canavan 질병; Carbamoylphosphate 합성 효소 I 결핍; 탄수화물-결핍 당단백 신드롬 (타입 I; 타입 Ib; 타입 II); 폐의 카르치노이드 종양; Cardioencephalomyopathy (시토크롬 c 옥시다아제 결핍 기인, 치명적, 유아); 심근증 (확장된; X-연결 확장된; 가족 비대성; 비대성); 카르니틴 결핍 (전신적, 1차성); 카르니틴 아실카르니틴 트랜스로카제(translocase) 결핍; (가족성) 손목관절 갱도(Carpal tunnel) 신드롬; 백내장 (하늘색; 선천성; 크리스탈 aculeiform; 젊은 시절-개시; 다형태 및 층상; 작은 반점; 띠 가루모양(zonular pulverulent)); Coppock-유사 백내장; CD59 결핍; 중심 코어(Central core) 질병; 소뇌 운동 실조; 대뇌 아밀로이드 혈관병증; 피질하 경색 및 백색질뇌증이 있는 대뇌 동맥병증; 대뇌 동굴형 기형 1; Cerebrooculofacioskeletal 신드롬; 뇌힘줄황색종증; 뇌혈관성 질병; 지방갈색소증 (신경세포성, 다양한 젊은 타입, 과립상 오스미움친화성 침착물; 지방갈색소증 (신경세포성-1, 유아); 지방갈색소증 (신경세포성-3, 젊은이); Char 신드롬; Charcot-Marie-Tooth 질병; Charcot-Marie-Tooth 신경병; Charlevoix-Saguenay 타입; Chediak-Higashi 신드롬; 염화물 설사 (핀란드 타입); 담즙 분비 장애 (양성 재발성 간 내); 담즙 분비 장애 (가족성 간 내); 담즙 분비 장애 (진행성 가족성 간 내); 콜레스테릴 에스테르 저장 질병; 점상 연골형성장애 (brachytelephalangic; 어깨엉덩관절(rhizomelic); X-연결 우성; X-연결 열성; Grebe 타입); 연골육종; 범맥락막위축; 만성 육아종성 질병 (상염색체, CYBA 결핍에 기인); 만성 육아종성 질병 (X-연결); NCF-1의 결핍에 기인한 만성 육아종성 질병; NCF-2의 결핍에 기인한 만성 육아종성 질병; 가족성 킬로미크론혈증 신드롬; 시트룰린혈증(Citrullinemia); 전통적인(classical) 코케인 신드롬-1; 갈라진 입술, 쪼개진 조각 턱, 구개 파열; 갈라진 입술/구개 외배엽 형성장애 신드롬; 쇄골두개골(Cleidocranial) 형성장애; CMO II 결핍; 외투(Coats) 질병; 코케인(Cockayne) 신드롬-2, 타입 B; Coffin-Lowry 신드롬; 콜히친 내성(resistance); 결장 선암; 결장 암; 색맹 Colorblindness (녹색각이상; 적색각이상; 청색각이상); 결장직장 암; 복합(Combined) 인자 v 및 VIII 결핍; (가족성) 복합 고지방혈증; 복합(combined) 면역결핍(X-관련, 중증); 컴플렉스 I 결핍; 복잡한 신경성 질환; 추체(Cone) 영양 실조-3; 추체간체 영양 실조 3; 추체간체 영양 실조 6; 추체간체 망막 영양 실조-2; 정관(vas deferens)의 선천적인 양측(bilateral) 부재; 목질 결막염; 구축(Contractural) 거미가락증; 코프로포르피린증; 선천성 편평 각막; 각막 혼탁; 각막 영양 실조 (Avellino 타입; 방울-유사 아교질; Groenouw 타입 I; 격자 타입 I; Reis-Bucklers 타입); 코티솔 내성; 쿠마린 내성; Cowden 질병; 간 CPT 결핍 (타입 I; 타입 II); 외경련(Cramps) (가족성, 칼륨-격화); Craniofacial-deafness-hand 신드롬; 두개골조기유합증 (타입 2); 크레틴병; 크로이츠펠트야콥 질병; Crigler-Najjar 신드롬; Crouzon 신드롬; Currarino 신드롬; 이완피부증; 주기적인 조혈(hematopoiesis); 주기적인 비늘증; 실린드로마토시스(Cylindromatosis); 낭포성 섬유증; (신장애성) 시스틴증; 시스틴뇨증 (타입 II; 타입 III); 색맹; Darier 질병; D-두 가지 기능성(bifunctional) 단백질 결핍; 귀먹음, 상염색체 우성 1; 귀먹음, 상염색체 우성 11; 귀먹음, 상염색체 우성 12; 귀먹음, 상염색체 우성 15; 귀먹음, 상염색체 우성 2; 귀먹음, 상염색체 우성 3; 귀먹음, 상염색체 우성 5; 귀먹음, 상염색체 우성 8; 귀먹음, 상염색체 우성 9; 귀먹음, 상염색체 열성 1; 귀먹음, 상염색체 열성 2; 귀먹음, 상염색체 열성 21; 귀먹음, 상염색체 열성 3; 귀먹음, 상염색체 열성 4; 귀먹음, 상염색체 열성 9; 귀먹음, 비신드롬성 감각신경 13; 귀먹음, X-연결 1; 귀먹음, X-연결 3; 데브리소퀸(Debrisoquine) 민감성; Dejerine-Sottas 질병; 치매 (가족성 덴마크); 치매 (파킨슨성, 이마관자(frontotemporal)); 치아(dent) 질병; 치아 이상; Dentatorubro-pallidoluysian 쇠약; Denys-Drash 신드롬; 융기피부섬유육종; 데스모이드(Desmoid) 질병; (신원성(nephrogenic)) 요붕증; (신경뇌하수체성) 요붕증; 당뇨병 (인슐린 저항성); 당뇨병 (희귀 형태); 당뇨병 (타입 II); 이영양성 형성장애; 디하이드로피리미딘혈증(Dihydropyrimidinuria); 투여량-민감성(Dosage-sensitive) 성 반전(reversal); 망막의 Doyne 벌집 퇴보; Dubin-Johnson 신드롬; Duchenne 근 위축증; 혈소판 감소증을 동반한 이형적혈구조혈빈혈; 이상섬유소원혈증 (알파 타입; 베타 타입; 감마 타입); 선천성각화부전증-1; 이상프로트롬빈혈증; 디스토니아 (DOPA-반응성); (근육클로누스) 디스토니아; 디스토니아-1 (꼬임(torsion)); 외배엽 형성장애; 수정체편위(Ectopia lentis); 동공편위(Ectopia pupillae); 손발가락결손증 (외배엽 형성장애, 및 갈라진 입술/구개 신드롬 3); Ehlers-Danlos 신드롬 (조로(progeroid) 모양); Ehlers-Danlos 신드롬 (타입 I; 타입 II; 타입 III; 타입 IV; 타입 VI; 타입 VII); 엘라스틴 판상부(Supravalvar) 대동맥 협착증; 타원적혈구증-1; 타원적혈구증-2; 타원적혈구증-3; Ellis-van Creveld 신드롬; Emery-Dreifuss 근 위축증; 기종; 뇌질환; 심장 섬유탄력섬유증-2; 자궁내막 암; 종판(Endplate) 아세틸콜린에스터라제 결핍; 강화된 S-추체 신드롬; 확대된 안뜰수도관(Enlarged vestibular aqueduct); 표피박리증 수포성(bullosa); 표피박리증 수포성 근긴장성(dystrophica) (열성 또는 우성); 표피박리증 수포성(bullosa) 심플렉스; 표피박리성 과각화증; 표피박리성 손발바닥각질피부증(palmoplantar keratoderma); 간질 (전신성; 젊은; 간대성근경련(myoclonic); 야행성 전두엽; 진행성 간대성근경련); 신생아, 양성 간질 (타입 1 또는 타입 2); (다발성) 골단 형성장애; 일시적인 운동 실조 (타입 2); 일시적인 운동 실조/근육잔떨림 신드롬; 적혈병 (알파-; 형성장애); 적혈구증가증; 홍반각피증; 에스트로겐 내성; LDH-A 결핍에 기인한 운동시(Exertional) 미오글로빈뇨증; 외골증, 다발성 (타입 1; 타입 2); 삼출성 유리체망막병증, X-관련; Fabry 질병; 인자 H 결핍; 인자 VII 결핍; 인자 x 결핍; 인자 XI 결핍; 인자 XII 결핍; 인자 XIIIA 결핍; 인자 XIIIB 결핍; 가족성 지중해 발열; Fanconi 빈혈증; Fanconi-Bickel 신드롬; Farber 지질육아종증; (급성) 지방 간; 급성 용혈성 빈혈; 물고기 눈 질병; Foveal 형성 부전; 허약 X 신드롬; Frasier 신드롬; Friedreich 운동 실조; 과당-비스포스파타제 과당 과민성; 푸코시드축적증; 푸마라제 결핍; 흰점망막병증; 노란점눈바닥병; G6PD 결핍; GABA-아미노기전달효소 결핍; 백내장 수반 갈락토키나제 결핍; 갈락토스 에피머라제(epimerase) 결핍; 갈락토세미아(Galactosemia); 갈락토시알리도시스(Galactosialidosis); GAMT 결핍; Gardner 신드롬; 위 암; Gaucher 질병; 열병성 발작 플러스를 수반하는 전신성 간질; 생식 세포 종양; Gerstmann-Straussler 질병; 거대 세포 간염 (신생아); 거대 혈소판 장애; 거대 세포 섬유모세포종; Gitelman 신드롬; Glanzmann 혈소판무력증(thrombasthenia) (타입 A; 타입 B); 녹내장 1A; 녹내장 3A; 다형성아교모세포종; 사구체경화증 (초점 세그먼트성(focal segmental)); 포도당 수송 결필 (혈액-뇌 장벽); 포도당/갈락토스 흡수 불량; 글루코시다아제 I 결핍; 글루타르산 요증 (타입 I; 타입 IIB; 타입 IIC); 글루타티온 합성 효소 결핍; 글리세롤 키니아제 결핍; 글리신 수용체 (알파 1 폴리펩티드); 글리코겐 저장 질병 I; 글리코겐 저장 질병 II; 글리코겐 저장 질병 III; 글리코겐 저장 질병 IV; 글리코겐 저장 질병 VI; 글리코겐 저장 질병 VII; 글리코겐증 (간, 상염색체); 글리코겐증 (X-연결 간); GM1-강글리오시드증; GM2-강글리오시드증; 갑상선종 (성인, 다결정성); (선천성) 갑상선종; 갑상선종 (비풍토성(nonendemic), 간단한); 생식선 이상 발육 (XY 타입); 부패성 육아종증; Graves 질병; Greig cephalopolysyndactyly 신드롬; Griscelli 신드롬; 성장 호르몬 결핍 소인증; 귀먹음 및 정신 박약을 수반한 성장 지연; 여성형 유방 (가족성, 증가된 아로마타제 활성에 기인); 맥락막의 나선형 쇠약 및 오르니틴혈증 수반 망막 (B6 반응성 또는 비반응성); Hailey-Hailey 질병; Haim-Munk 신드롬; Hand-foot-uterus 신드롬; 하르데로포르피린뇨증(Harderoporphyrinuria); (가족성) HDL 결핍; 심장 차단 (비진행성 또는 진행성); Heinz 체 빈혈증; HELLP 신드롬; 혈뇨증 (가족성, 양성); 헴(Heme) 옥시게나제-1 결핍; 편마비 편두통; 혈색소침착증(Hemochromotosis); 헤모글로빈 H 질병; ADA 과잉에 기인한 용혈성 빈혈; 아데닐레이트 키니아제 결핍 기인 용혈성 빈혈; 밴드 3 결핌에 기인한 용혈성 빈혈; 글루코세포스페이트(glucosephosphate) 이성화효소 결핍 기인 용혈성 빈혈; 글루타치온 합성효소 결핍 기인 용혈성 빈혈; 헥소키나제 결핍 기인 용혈성 빈혈; PGK 결핍 기인 용혈성 빈혈; 용혈성 요독증 신드롬; 식혈세포성 림프조직구증(Hemophagocytic lymphohistiocytosis); 혈우병 A; 혈우병 B; 인자 V 결핍에 기인한 출혈 질병 체질; 헤모시데린증 (전신성, 아세룰로플라스미네미아(aceruloplasminemia) 기인); 간 리파제 결핍; 간모세포종; 간세포성 암종; 유전성 출혈 모세혈관확장증-1; 유전 출혈 모세혈관확장증-2; Hermansky- Pudlak 신드롬; 내장위치이상(Heterotaxy) (X-연결 내장); 이소증(Heterotopia) (뇌실주위); Hippel-Lindau 신드롬; Hirschsprung 질병; HRG 결핍 기인 히스티딘-풍부 당단백 혈전성향증; HMG-CoA 리아제 결핍; Holoprosencephaly-2; 통앞뇌증-3; 통앞뇌증-4; 통앞뇌증-5; Holt-Oram 신드롬; 호모시스틴뇨증; Hoyeraal-Hreidarsson; HPFH (삭제 타입 또는 비삭제(nondeletion) 타입); HPRT 관련된 통풍; Huntington 질병; 뇌수도관(aqueductal) 협착증 기인 뇌수종; 태아수증(Hydrops fetalis); 고베타지방단백혈증; 가족성 고콜레스테롤혈증; 고페리틴혈증(Hyperferritinemia)-백내장 신드롬; 고글리세롤혈증(Hyperglycerolemia); 고글리신혈증(Hyperglycinemia); 고이뮤노글로불린혈증(Hyperimmunoglobulinemia) D 및 주기적 발열 신드롬; 고인슐린혈증(Hyperinsulinism); 고인슐린혈증-고암모니아혈증(hyperammonemia) 신드롬; 고칼륨혈성 주기성 마비; 고리포단백혈증(Hyperlipoproteinemia); 고라이신혈증; 고메티오닌혈증(지속성(persistent), 상염색체, 우성, 메티오닌 기인, 아데노실트랜스퍼라제 I/III 결핍); 고오르니틴혈증-고암모니아호모시트룰린혈증(hyperammonemiahomocitrullinemia) 신드롬; 옥살산뇨증; 부갑상샘항진증; 프테린(pterin)-4아카르비놀아민(acarbinolamine) 탈수효소 결핍 기인 고페닐알라닌혈증; 고프로인슐린혈증; 고프롤린혈증; 고혈압; (선천성) 고트롬빈혈증(Hyperthroidism); 고트리글리세라이드혈증(Hypertriglyceridemia); 저알파리포단백질혈증(Hypoalphalipoproteinemia); 저베타지방단백혈증; 저칼륨혈증; 연골 발육부전; 저색소성 소구성 빈혈증; 치아발육부전증; 저섬유소원혈증; 저글로불린혈증(Hypoglobulinemia) 및 부재(absent) B 세포; (고생식샘자극호르몬) 성기능 부전; 고생식샘자극호르몬(Hypogonadotropic) (성기능 부전); 저칼륨성(Hypokalemic) 주기적 마비; 저마그네슘혈증; 저마엘린증 (선천성); 부갑상샘저하증; 저인산증 (성인; 유년기; 유아; 유전성); 저프로트롬빈혈증; 갑상샘 기능부전 (선천성; 세습성 선천성(hereditary congenital); 비갑상선종성(nongoitrous)); 비늘피부증모양홍색피부증(Ichthyosiform erythroderma); 비늘증; 지멘스 수포성 어린선; IgG2 결핍; 부동성 섬모 신드롬-1; 면역결핍 (T 세포 수용체/CD3 복합체); (고-IgM 관련, X-연결) 면역결핍; CD3-감마 결핍에 기인하는 면역결핍; 면역결핍-중심체 불안전성-안면(centromeric instabilityfacial) 이상 신드롬; 색소실조증; 통증 둔감(선천성, 땀없음증 수반); 불면증 (치명적, 가족성); 인터루킨-2 수용체 결핍 (알파 사슬); 추간 원판 질병; 이리도고니오발생장애(Iridogoniodysgenesis); 국한(isolated) 성장 호르몬 결핍 (GH가 없는 Illig 타입 및 생불활성(bioinactive) GH가 있는 Kowarski 타입); 아이소발레르산(酸)혈증(血症); Jackson-Weiss 신드롬; Jensen 신드롬; Jervell 및 Lange Nielsen 신드롬; Joubert 신드롬; Juberg-Marsidi 신드롬; Kallmann 신드롬; Kanzaki 질병; 각막염; (손발바닥(palmoplantar)) 각질피부증(Keratoderma); 손발바닥 선상 각화증(Keratosis palmoplantaris striata) I; 손발바닥 선상 각화증 II; SCOT 결핍 기인 케톤산증; Keutel 신드롬; Klippel-Trenaurnay 신드롬; Kniest 형성장애; Kostmann 호중구 감소증; Krabbe 질병; Kurzripp-Polydaktylie 신드롬; PDX1 결핍 기인 젖산혈증; Langer mesomelic 형성장애; Laron 소인증; Laurence-Moon-Biedl-Bardet 신드롬; LCHAD 결핍; Leber 선천성 흑내장; 좌우 축선 기형; Leigh 신드롬; 평활근종증 (확산성, Alport 신드롬 수반); 레프러콘화증(Leprechaunism); Leri-Weill 연골뼈형성이상; Lesch-Nyhan 신드롬; 백혈병 (급성 골수성; 급성 전골수구성; 급성 T 세포 림프모구성; 만성 골수성; 연소성 골수구단구성(myelomonocytic); 백혈병-1 (T 세포 급성 림프구성); 백혈구 부착 결핍; Leydig 세포 선종; Lhermitte- Duclos 신드롬; Liddle 신드롬; Li Fraumeni 신드롬; 리포아마이드 디하이드로게나제 결핍; 지방이상증; 리포이드 아드레날 과형성; 지단백질 리파제 결핍; (X-관련) 뇌이랑없음증(Lissencephaly); 뇌이랑없음증-1; 간 글리코겐 저장 질병 (타입 0); 긴(long) QT 신드롬-1; 긴 QT 신드롬-2; 긴 QT 신드롬-3; 긴 QT 신드롬-5; 긴 QT 신드롬-6; Lowe 신드롬; 폐암; 폐암 (비소(nonsmall) 세포); 폐암 (소 세포); 림프부종; 림프종 (B 세포 non-Hodgkin); 림프종 (확산성 큰(large) 세포); (소낭 모양) 림프종; 림프종 (MALT); 림프종 (만텔(mantel) 세포); (X-연결) 림프세포증식 신드롬; 라이시누릭(Lysinuric) 단백질 과민성; Machado-Joseph 질병; (5q 신드롬의) 불응성 대적혈구(Macrocytic) 빈혈증; 황반이영양증; 악성 중피종; 말로닐-CoA 탈카르복시화 효소 결핍; 만노축적증, (알파- 또는 베타-); 매플 시럽 소변 질병 (타입 Ia; 타입 Ib; 타입 II); Marfan 신드롬; Maroteaux-Lamy 신드롬; 마샬 신드롬; MASA 신드롬; 비만 세포 백혈병; 복합 혈액작용 장애를 가진 비만세포증(Mastocytosis); McArdle 질병; McCune-Albright 다골섬유이형성; McKusick 카프만 신드롬; McLeod 표현형; 골수 갑상선 암; 속질모세포종; Meesmann 각막 영양 실조; 비정상적으로 큰 적혈구 빈혈증-1; 흑색종; 막증식성(Membroproliferative) 사구체 신염; Meniere 질병; 수막종 (NF2-관련; SIS-관련); Menkes 질병; (X-관련) 정신 박약; 메페니토인(Mephenytoin) 불량 대사자(metabolizer); 중피종(Mesothelioma); 이염색백색질장애(Metachromatic leukodystrophy); 뼈몸통끝(Metaphyseal) 연골형성장애 (Murk Jansen 타입; Schmid 타입); 메트헤모글로빈혈증; 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 결핍 (상염색체 열성); 메틸코발라민 결핍 (cbl G 타입); 메틸말로닉산뇨증 (뮤타제 결핍타입); 메발로닉산뇨증(Mevalonicaciduria); MHC 클래스 II 결핍; 작은안구증 (백내장, 및 홍채 이상); Miyoshi 근질환; MODY; Mohr-Tranebjaerg 신드롬; 몰리브데눔(Molybdenum) 코팩터 결핍 (타입 A 또는 타입 B); 염주털(Monilethrix); 파브리 병(Morbus Fabry); 가우처 병(Morbus Gaucher); 점액다당질증; 점액성점착증(Mucoviscidosis); Muencke 신드롬; Muir-Torre 신드롬; Mulibrey 왜소; (바이오틴 반응성) 다발성 카복실라제 결핍; 다발성 내분비 신생물; 근육 글리코겐증; 근 위축증 (선천성, merosindeficient); 근육 영양 실조 (Fukuyama, 선천성); 근 위축증 (limb-girdle); 근 위축증 (Duchenne-유사); 단순성 수포 표피박리증 수반 근 위축증; Myasthenic 신드롬 (slow-channel, 선천성); 진균 감염 (비정형, 가족성, 전파성); 골수형성이상 신드롬; 골수 백혈병; 골수성 악성 종양; 마이엘로퍼록시다제 결핍; 마이오아데닐레이트 탈아미노 효소 결핍; PGK 결핍 기인 미오글로블린뇨증(Myoglobinuria)/용혈; 근신경위장관(Myoneurogastrointestinal) 뇌근육병증(encephalomyopathy) 신드롬; 근질환 (액틴; 선천성; 데스민-관련; 심장골격(cardioskeletal); 원위성; 네말민(nemaline)); CPT II 결핍 기인 근질환; 포스포글리세레이트 뮤타제 결핍 기인 근 질환; 선천성 근 긴장; 근 긴장 레비어(levior); 근 긴장성 영양실축; 점액성 지질육종; NAGA 결핍; Nailpatella 신드롬; 네말린(Nemaline) 근 질환 1 (상염색체 우성); 네말린(Nemaline) 근 질환 2 (상염색체 열성); 신생아 부갑상샘항진증; 신석증; (청소년기) 콩팥황폐증; 신장병 (만성 저보체혈증(hypocomplementemic)); 신장증(Nephrosis)-1; 신증 신드롬; Netherton 신드롬; 신경아 종(Neuroblastoma); 신경섬유종증 (타입 1 또는 타입 2); 뉴로렘모마토시스(Neurolemmomatosis); 신경원성-5 세로이드(Ceroid)-지질갈색소증; 신경병; 호중구 감소증 (자가면역, 신생아); Niemann-Pick 질병 (타입 A; 타입 B; 타입 C1; 타입 D); 야맹증 (선천성, 정적(stationary)); Nijmegen 파손 신드롬; 좌 심실 심근의 비압축(Noncompaction); 비표피박리 손발바닥 각질피부증(Nonepidermolytic palmoplantar keratoderma); Norrie 질병; Norum 질병; 뉴클레오시드 포스포릴라제 결핍; 비만; 후두 경적(Occipital horn) 신드롬; 눈 색소 결핍증 (Nettleship-Falls 타입); 눈인두근육퇴행위축; Oguchi 질병; 치아부족증; Omenn 신드롬; Opitz G 신드롬; 신장 질병 수반 시신경 결손(coloboma); 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍; 오로틱산뇨증(Oroticaciduria); 직립성 과민증(Orthostatic intolerance); OSMED 신드롬; 등뼈의 뒤 경도 인대의 골화; 골관절증; 불완전골형성증; 뼈용해증(Osteolysis); 골화석증 (퇴행성 또는 특발성); 골육종; 난소 암; 난소 이상 발육; 선천손발톱비대증 (Jackson-Lawler 타입 또는 Jadassohn-Lewandowsky 타입); 뼈의 Paget 질병; Pallister-Hall 신드롬; 췌장 무발생; 췌장암; 췌장염; Papillon-Lefevre 신드롬; 부신경절종(Paragangliomas); 선천성 이상근육긴장증(Paramyotonia congenita); 마루뼈구멍(Parietal foramina); 파킨슨 질병 (가족성 또는 청소년); 발작성 밤 헤모글로빈혈증; Pelizaeus-Merzbacher 질병; Pendred 신드롬; 회음 요도밑열림증(hypospadias); 정기적인 발열; 퍼록시소말(Peroxisomal) 생체생성 장애; 유년기의 지속적 고인슐린 저혈당증; 지속적인 Mullerian 덕트 신드롬 (타입 II); Peters 이상; Peutz-Jeghers 신드롬; Pfeiffer 신드롬; 페닐케톤뇨증(Phenylketonuria); 포스포리보실(Phosphoribosyl) 파이로인산 합성효소관련 통풍; 간과 근육의 포스포릴라제 키나제 결핍; 얼룩백색증(Piebaldism); 털바탕질종(Pilomatricoma); 양측성 망막모세포종이 수반된 송과체종(Pinealoma); 뇌하수체 ACTH 분비 선종; 뇌하수체 호르몬 결핍; 뇌하수체 종양; 태반성(Placental) 스테로이드 설파타제(sulfatase) 결핍; 플라스민 억제제 결핍; 플라스미노겐 결핍 (타입 I와 II); 플라스미노겐 Tochigi 질병; 혈소판 장애; 혈소판 당단백 IV 결핍; 혈소판 활성화인자 아세틸하이드롤라제 결핍; 다낭(Polycystic) 신장병; 경화성 백색질뇌증을 수반하는 다낭 리포막성 골형성장애(Polycystic lipomembranous osteodysplasia); 축뒤(postaxial) 다지증(Polydactyly); 폴립증; 오금 익상편(pterygium) 신드롬; 포르피린증(Porphyria) (급성 간성 또는 급성 간헐적 또는 선천성 적혈구조혈성(erythropoietic)); 지연피부포르피린증; 간적혈구 조혈성 포르피린증; 얼룩 포르피린증; Prader-Willi 신드롬; 조숙 사춘기; 조숙한 난소 기능부전(failure); 유전조로증 타입 I; 유전조로증 타입 II; 진행성 외부 눈근육마비(ophthalmoplegia); 진행성 간내 담즙 분비 장애-2; 프로락틴분비종양(Prolactinoma) (부갑상샘항진증, 카르치노이드 신드롬); 프로리다제(Prolidase) 결핍; 프로피오닉산혈증(Propionicacidemia); 전립선암; 단백질 S 결핍; 단백뇨증(Proteinuria); (적혈구조혈성) 프로토포르피린증; 가(假)연골무형성증(Pseudoachondroplasia); 가암수한몸증(Pseudohermaphroditism); 가저알돌스테론증(Pseudohypoaldosteronism); 가부갑상샘저하증(Pseudohypoparathyroidism); 질성 회음 음낭부 요도하열(Pseudovaginal perineoscrotal hypospadias); 위(僞)비타민(Pseudovitamin) D 결핍 구루병; 탄력섬유거짓황색종 (상염색체 우성; 상염색체 열성); 폐 폐포 단백증; 폐 고혈압; 전격성 자반병; 파이크노다이소스토시스(Pycnodysostosis); 열성변형적혈구증가(증); 파이루베이트 카복실라제 결핍; 파이루베이트 디하이드로게나제 결핍; Rabson-Mendenhall 신드롬; Refsum 질병; 신장 세포 암; 신장 관 산성증; 귀먹음 수반 신장 관 산성증; 신장 관 산성증-골화석증 신드롬; 세망증 (가족성, 조직구성(histiocytic)); 망막 퇴보; 망막 영양 실조; 색소 망막염; 흰점망막염; 망막모세포종; 레티놀 결합 단백질 결핍; 망막층간분리; Rett 신드롬; Rh (mod) 신드롬; Rhabdoid 경향 신드롬; Rhabdoid 종양; 횡문근육종; (폐표) 횡문근육종; 어깨엉덩관절 점상 연골형성장애; Ribbing-신드롬; 구루병 (비타민 D-내성); Rieger 이상; Robinow 신드롬; Rothmund-Thomson 신드롬; Rubenstein-Taybi 신드롬; 사카로핀뇨증; Saethre-Chotzen 신드롬; Salla 질병; Sandhoff 질병 (유아, 유소년, 및 성인 형태); Sanfilippo 신드롬 (타입 A 또는 타입 B); Schindler 질병; 뇌갈림증; (만성) 정신 분열증; (산발성) 신경집종; SCID (상염색체 열성, T-음성/B양성 타입); 분비 통로(Secretory pathway) w/TMD; 선천성 SED; Segawa 신드롬; 선택적인 T 세포 결점; SEMD (파키스탄 타입); SEMD (Strudwick 타입); 중격-시신경 형성장애; 심한 복합 면역결핍 (B-세포음성); 심한 복합 면역결핍 (T-세포 음성, B-세포/천연 킬러 세포-양성 타입); 심한 복합 면역결핍 (X-관련); ADA 결핍 기인 심한 복합 면역결핍; 성 반전 (XY, 신장 기능부전 수반); Sezary 신드롬; Shah-Waardenburg 신드롬; 짧은 키(Short stature); Shprintzen-Goldberg 신드롬; 시알산 저장 장애; 시알산증 (타입 I 또는 타입 II); 시알뇨증(Sialuria); 낫적혈구 빈혈증; Simpson-Golabi-Behmel 신드롬; 위치 모호(Situs ambiguus); Sjogren-Larsson 신드롬; Smith-Fineman-Myers 신드롬; Smith-Lemli-Opitz 신드롬 (타입 I 또는 타입 II); 성장호르몬종양)Somatotrophinoma); 소르스비 펀더스(Sorsby fundus) 영양 실조; 경련성 하반신 불수; 구형적혈구증; 구형적혈구증-1; 구형적혈구증-2; 케네디의 척추와 구근 근육 쇠약; 척추 근육 쇠약; 척수소뇌(Spinocerebellar) 운동 실조; 스폰딜로코스탈(Spondylocostal) 뼈발생이상; 지연 척추사지골단형성이상; Spondylometaphyseal 형성장애 (일본 타입); Stargardt 질병 1; 여러피부지방낭종; Stickler 신드롬; Sturge-Weber 신드롬; 피질하 박판상 헤테로피아(Subcortical laminal heteropia); 피질하 박판상 헤테로토피아(heterotopia); 석시닉 세미알데하이드 디하이드로게나제 결핍; 자당 과민성; Sutherland-Haan 신드롬; CF 없는 땀 염화물 상승; 손가락마디융합증(Symphalangism); Synostoses 신드롬; 신폴리다크틸리(Synpolydactyly); 탄자니아 질병; Tay-Sachs 질병; T-세포 급성 림프모구 백혈병; T-세포 면역결핍; T-세포 풋림프구성(prolymphocytic) 백혈병; 지중해빈혈 (알파- 또는 델타-); Hb Lepore 기인 지중해빈혈; 타나토포릭(Thanatophoric) 형성장애 (티입 I 또는 II); 티아민-반응성 큰적혈모세포 빈혈 신드롬; 고혈소판증; (디스플라스미노게네믹(dysplasminogenemic)) 혈전성향증; 헤파린 공인자 II 결핍 기인 혈전성향증(Thrombophilia); 단백질 C 결핍 기인 혈전성향증; 트롬보모듈린 결핍 기인 혈전성향증; 갑상선 선종; 갑상선 호르몬 내성; 타이로이드 아이오딘 퍼록시다제 결핍; Tietz 신드롬; 톨부타마이드 불량 대사자(metabolizer); Townes-Brocks 신드롬; 트랜스코발라민(Transcobalamin) II 결핍; Treacher Collins 아래턱얼굴뼈발생이상(mandibulofacial dysostosis); Trichodontoosseous 신드롬; 모발 비지절 신드롬; 모발 유황 이영양증; 3기능성(Trifunctional) 단백질 결핍 (타입 I 또는 타입 II); 트립시노겐 결핍; 결절이 있는 경화증-1; 결절이 있는 경화증-2; Turcot 신드롬; 티로신 인산 가수분해 효소; 티로신혈증; Ulnar-mammary 신드롬; 요석증 (2,8-디하이드록시아데닌); Usher 신드롬 (타입 1B 또는 타입 2A); 정맥 기형; 심실 빈맥; 남성화; 비타민 K-의존성 응고 결핍; VLCAD 결핍; Vohwinkel 신드롬; 폰 Hippel-Lindau 신드롬; 폰 Willebrand 질병; Waardenburg 신드롬; Waardenburg 신드롬/눈 색소 결핍증; Waardenburg-Shah 신경학상 변이; Waardenburg-Shah 신드롬; Wagner 신드롬; 와파린 민감성; 왓슨(Watson) 신드롬; Weissenbacher-Zweymuller 신드롬; Werner 신드롬; Weyers 아크로덴탈(acrodental) 뼈발생이상; 백색 스폰지 모발(White sponge nevus); Williams-Beuren 신드롬; Wilms 종양 (타입 1); 윌슨 질병; Wiskott-Aldrich 신드롬; Wolcott-Rallison 신드롬; Wolfram 신드롬; Wolman 질병; 황색뇨증 (타입 I); 색소성 건피증; X-SCID; Yemenite 귀머거리-눈먼(blind) 저색소성 신드롬; 와이포칼시뉴릭(ypocalciuric) 고칼슘혈증 (타입 I); Zellweger 신드롬; Zlotogora-Ogur 신드롬.
유전적으로 물려받은 배경을 가지고, 일반적으로 단일 유전자 결핍에 의해 야기되며, 만델의 법칙에 따라 유전되는 치료될 수 있는 바람직한 질병들은, 바람직하게는, 보통염색체열성(autosomal-recessive)으로 유전된 질병들, 예를 들어, 아데노신 디아미나제 결핍, 가족성 고콜레스테롤혈증, Canavan 신드롬, Gaucher 질병, Fanconi 빈혈, 신경 지방 갈색소증(neuronal ceroid lipofuscinosis), 뮤코비시도시스 (낭성 섬유증), 낫적혈구 빈혈, 페닐케톤요증, 알캅톤뇨증, 색소결핍증, 갑상샘저하증(hypothyreosis), 갈락토스혈증(galactosaemia), 알파-1-항-트립신 결핍, 색소성 건피증, Ribbing 신드롬, 뮤코다당질축적증, 구순열(cleft lip), 턱(jaw) 갈림증, 구개(palate) 갈림증, Laurence Moon Biedl Bardet 신드롬, 짧은 늑골(short rib) 다지증(polydactylia) 신드롬, 크레틴병, Joubert 신드롬, 타입 II 유전조로증, 단지증, 부신성기(adrenogenital) 신드롬, 및 X-염색체 유전 질환들, 예를 들어, 색맹, 예를 들어, 적색/녹색 색맹, 허약(fragile) X 신드롬, 근육 퇴행위축 (Duchenne 및 Becker-Kiener 타입), 혈우병(haemophilia) A 및 B, G6PD 결핍, Fabry 질환, 점액다당류증, Norrie 신드롬, 망막색소변성, 부패성 육아종증(septic granulomatosis), X-SCID, 오르니틴 트랜스카브라밀라제 결핍, Lesch-Nyhan 신드롬, 또는 보통염색체우성(autosomal-dominant)으로 유전된 질병들, 예를 들어, 세습성 혈관부종, Marfan 신드롬, 신경섬유종증, 타입 I 유전조로증, 불완전골형성증, Klippel-Trenaurnay 신드롬, Sturge-Weber 신드롬, Hippel-Lindau 신드롬 및 결절성 경화증(tuberosis sclerosis)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 유전되지 않은 질병, 또는 위의 카테고리에서 요약되지 않은 질병의 치료를 가능하게 한다. 그러한 질병들은 예를 들어, 특정 단백질 인자(factor), 예를 들어, 위에서 언급된 특정 치료적으로 활성인 단백질이 필요한 환자의 치료를 포함한다. 이것은 예를 들어, 투석 환자를 포함하며, 예를 들어, (정기적인) 신장 또는 신 투석을 받으며, 위에서 설명된 특정 치료적으로 활성인 단백질, 예를 들어, 에라이트로포이에틴(EPO) 등을 필요로 하는 환자를 포함한다.
다른 구현에 따르면, 본 발명은 세포 또는 개체를 트랜스펙션하기 위한 본 발명에 따른 적어도 하나의 복합체화된 RNA의 용도를 포함한다. 세포 또는 개체의 트랜스펙션은 바람직하게는 본 발명의 복합체화된 RNA로 세포 또는 조직을 트랜스펙션하기 위한 상기 (in vitro 또는 in vivo) 트랜스펙션 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
다른 구현에 따르면, 본 발명은 상기 언급된 질병, 장애, 상태(condition) 또는 병리학적 상태(pathological state)의 치료를 위한 (치료제의 제조를 위한) 본 발명에 따른 적어도 하나의 복합체화된 RNA의 사용(용도)을 포함한다. 본 명세서에서 치료제(agent)는 예를 들어, 위에서 정의된 바와 같은 약학 조성물 또는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 주사 완충액일 수 있으며, 추가적으로 본 발명의 복합체화된 RNA, 백신 등을 포함한다. 하나 이상의 복합체화된 RNA 분자 타입이 사용된다면, 상기 복합체화된 RNA들은 그들의 RNA (분자들)가 다를 수 있으며, 그것에 의해 적어도 두 개의 구별되는 복합체화된 RNA (분자) 타입들의 혼합물을 형성한다. 하나 이상의 복합체화된 RNA가 상기 언급된 질병들의 어떠한 것의 치료를 위해(한) (치료제의 제조를 위해) 사용된다면, 동일한 또는 (적어도 두 개의) 다른 RNA (분자) 타입들이 이러한 복합체화된 RNA 혼합물들 내에 포함될 수 있다. 본 명세서에서, 위에서 언급된 RNA (분자들) 중 어떠한 것이 본 발명의 복합체화된 RNA를 위해 사용될 있으며, 예를 들어, 짧은 RNA 올리고뉴클레오타이드, 코딩 RNA, 면역자극 RNA, siRNA, 안티센스 RNA, 또는 리보스위치(riboswitch), 리보자임(ribozyme) 또는 아프타머(aptamer) 등일 수 있다. 더 바람직하게는, 코딩 RNA (분자), 더욱더 바람직하게는 선형 코딩 RNA (분자), 및 가장 바람직하게는 mRNA가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 코딩 RNA (분자), 더 바람직하게는 선형 코딩 RNA (분자), 및 더욱 바람직하게는 mRNA가 상기 복합체화된 RNA를 위해 사용되고, 상기 RNA (분자)는 일반적으로 특정 질병의 치료에 적합한 단백질 또는 펩타이드를 코딩하며, 예를 들어, (특정) 암 등을 치료할 때 특정 암 항원 또는 종양 항원에 결합할 수 있는 항체를 코딩한다. 적당한 RNA (분자들)의 혼합은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있으며, 본 발명의 개시로부터 파악할 수 있다.
본 발명의 다른 구현에 따르면, 치료 동안 면역 반응을 (추가적으로) 이끌어내는, 예를 들어, 유도 또는 촉진하는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 면역 반응은 다양한 방식으로 일어날 수 있다. 적당한 면역 반응을 위한 실질적인 요인은 다른 T-세포 서브-군(population)의 자극이다. T-림프구는 일반적으로 두 개의 서브-군, 즉, T-헬퍼 1 (Th1) 세포 및 T-헬퍼 2 (Th2) 세포로 나뉘며, 면역 시스템은 이들과 함께 세포 내 (Th1) 및 세포 외 (Th2) 병원체 (예를 들어, 항원)를 파괴할 수 있다. 두 개의 Th 세포 군은 그들에 의해 생성되는 이펙터(effector) 단백질 (사이토카인)의 패턴에 있어 차이가 있다. 따라서, Th1 세포는 마크로파지 및 세포독성 T-세포의 활성화를 통하여 세포성 면역 반응을 돕니다. 한편 Th2 세포는 플라즈마 세포로의 전환을 위한 B-세포 활성화 및 (예를 들어, 항원에 대한) 항체의 생성에 의해 체액성 면역 반응을 촉진한다. 그러므로, Th1/Th2 비율은 면역 반응에 있어 매우 중요하다. 본 발명에 의해 치료될 다양한 질병들에 있어, 면역 반응의 Th1/Th2 비율은 바람직하게는 세포성 반응 (Th1 반응) 쪽 방향으로 이동하고, 이것에 의해 세포성 면역 반응이 유도된다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 면역 반응 이동(shift)을 복귀시키기 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 상기 언급된 질병의 치료를 위한 (치료제의 제조를 위한) 본 발명에 따른 적어도 하나의 복합체화된 RNA의 사용을 포함하고, 여기에서 상기 치료제 (및/또는 복합체화된 RNA)는 위에서 설명된 바와 같이 조직 또는 개체 내 면역 반응을 이끌어 낼 수, 예를 들어, 유도 또는 촉진할 수 있다. 다시, 본 발명의 치료제는 예를 들어, 위에서 설명된 바와 같은 약학 조성물, 또는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 주사용 완충액일 수 있으며, 이것은 본 발명 복합체화된 RNA 등을 포함한다. 본 발명에서 위에서 언급된 질병들 중 어떠한 것의 치료를 위해(한) (치료제의 제조를 위해) 하나 이상의 복합체화된 RNA 타입이 사용된다면, 복합체화된 RNA 타입들은 그들의 RNA (분자)가 다를 수 있으며, 구별되는 RNA 타입의 혼합물을 형성할 수 있다.
그러나, 본 발명의 구현에 있어, 이러한 복합체화된 RNA들 중 적어도 하나가 치료 동안 면역 반응을 유도 또는 촉진한다면, 다른 복합체화된 RNA(들)은 상기 면역 반응을 유도 또는 촉진할 필요가 없거나 어떠한 면역 반응을 예방하기 위해 사용될 수 있는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 위에서 언급된 RNA (분자들) 중 어떠한 것이 본 발명의 복합체화된 RNA를 위해 사용될 있으며, 예를 들어, 짧은 RNA 올리고뉴클레오타이드, 코딩 RNA, 면역자극 RNA, siRNA, 안티센스 RNA, 또는 리보스위치(riboswitch), 리보자임(ribozyme) 또는 아프타머(aptamer) 등일 수 있다. 더 바람직하게는, 코딩 RNA (분자), 더욱더 바람직하게는 선형 코딩 RNA (분자), 및 가장 바람직하게는 mRNA가 복합체화된 RNA를 위해 사용될 수 있다. 만약 RNA (분자)가 코딩 RNA (분자), 더 바람직하게는 선형 코딩 RNA (분자), 및 더욱 바람직하게는 mRNA라면, 그것은 일반적으로 특정 질병의 치료에 적합한 단백질 또는 펩타이드를 코딩하며, 예를 들어, (특정) 암 등을 치료할 때 특정 암 항원에 결합할 수 있는 항체를 코딩한다. 하나 이상의 복합체화된 RNA가 치료제 내에 포함된다면, 단백질들 또는 펩타이드들의 다른 조합이 선택될 수 있다. 적당한 RNA (분자)들 (및, 코딩 RNA가 사용된다면, 코딩 단백질들 또는 펩타이드들의) 그러한 조합은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있으며, 본 발명의 개시에서 정의된 바와 같은 치료적으로 효과적인 단백질 등을 코딩하는 RNA들로부터 조합될 수 있다. 위에서 정의된 바와 같은 하나의 약학 조성물 또는 치료제를 사용한 특정 질병의 치료와 동반하는 면역 반응의 유도 또는 촉진은 특히 유도된 또는 촉진된 면역 반응이 위에서 언급된 특정 질병의 치료를 보완하는 역할을 하는 경우들에 있어 유리할 수 있다.
대안적으로, 질병의 치료 및 면역 반응의 유도 또는 촉진은 시차적 방법으로 위에서 정의된 것과 같은 다른 약학 조성물들 또는 치료제들을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 특정 질병의 치료에 적합한 짧은 RNA 올리고뉴클레오타이드, 코딩 RNA, 면역촉진 RNA, siRNA, 안티센스 RNA, 또는 리보스위치,리보자임 또는 아프타머 등과 같은 본 발명의 복합체화된 RNA를 포함할 수 있는, 본 명세서에서 정의된 일정 약학 조성물 또는 치료제를 투여하기 전에(또는 동시에) 본 발명의 복합체화된 (면역촉진) RNA를 포함하는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 다른 약학 조성물 또는 치료제를 투여함으로써 면역 반응을 유도 또는 촉진할 수 있다.
일 구현에 따르면, 본 발명은 게다가 위에서 설명된 바와 같은 조직 또는 생체 내 면역 반응을 조절, 바람직하게는 유도 또는 촉진하기 위하여, 더 바람직하게는 위에서 언급된 질병 또는 상태를 보완(support)하기 위한 (치료제의 제조를 위한) 본 발명에 따른 적어도 하나의 복합체화된 RNA의 용도를 포함한다. 이로써, 본 발명 복합체화된 RNA는 면역 시스템을 비특이적으로 활성화하기 위하여, 예를 들어, 일정 사이토카인의 생성을 촉발하기 위하여 사용될 수 있다. 복합체화된 RNA는 그러므로 특정 면역 반응, 예를 들어, 병원체 또는 종양으로부터 유래된 항원에 의해 야기되는 면역 반응을 보완(support)하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서의 치료제는 예를 들어, 본 발명의 복합체화된 RNA, 백신 등을 포함하는 위에서 설명된 바와 같은 약학 조성물 또는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 주사 완충액일 수 있다. 면역 반응은 길이가 8 내지 15개 아미노산이고, 실험식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x를 가지는 하나 이상의 올리고펩타이드 때문에 적어도 하나의 복합체화된 RNA에 의해 및/또는 복합체화된 RNA의 RNA에 의해 코딩되는 단백질의 면역촉진 성질에 의해 조절될 수 있다.
본 발명은 그러므로, 적절할 때마다, 다양한 목적을 달성하기 위하여 이용될 수 있다. 복합체화된 RNA가 그 상태로 또는 본 발명 조성물의 구성요소로 그 자체로 본 발명 복합체의 구성요소로서의 RNA의 트랜스펙션 성질을 개선할 수 있다. 본 발명 복합체화된 RNA의 이러한 근원적인 성질은 매우 다양한 적용에 있어 유리하다. RNA를 세포 내로 도입하는 것이 필요할 때마다, 개선된 트랜스펙션 효율은 본 발명에 의해 확보된다. 이러한 성질은 본 발명이 매우 다양한 질병들의 치료, 예를 들어, 위에서 설명된 바와 같은 단일유전성(monogenetic) 또는 유전성 질병의 치료를 위해 사용될 수 있도록 한다.
게다가, 본 발명은 면역 장애, 예를 들어, 알러지 또는 자가면역 질병의 치료가 예견될 때 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 그것의 비특이적 또는 특이적 면역 반응을 촉짐함으로써 환자의 면역 시스템을 활성화할 수 있다. 따라서, 그것은 질병을 치료하기 위하여 적절할 때마다 비특이적 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 그리고, 요구될 때마다, 그것은 (항원과 본 발명 복합체화된 RNA의 조합, 예를 들어, 동일한 조성물 내에서, 조합에 의해 또는 본 발명 복합체의 구성요소로서 RNA에 의한 항원을 코딩함으로써) 그러한 것과 같은 특이적 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 요구될 때마다, 본 발명의 복합체화된 RNA는 면역 반응을 조절할 수 있는 (바람직하게는 면역 반응을 유도 또는 촉진할 수 있는, 또는 알러지 또는 자가면역 질환의 경우 특이 알러젠 또는 자가항원에 대한 환자의 면역 시스템을 탈감작함으로써) 위에서 설명한 바와 같은 항원 또는 항체, 또는 어떠한 다른 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 조직 또는 생체에서 면역 반응을 조절, 예를 들어, 유도 또는 촉진하기 위하여, 복합체화된 RNA는 위에서 설명한 바와 같은 조직 또는 생체에 그러한 상태로 또는 위에서 정의된 바와 같은 치료제로 투여될 수 있다. 사용될 수 있는 투여 모드는 약학 조성물에 대해 위에서 설명된 바와 동일할 수 있다. 치료제의 투여는 위에서 언급된 질병 또는 상태의 치료 전에, 동시에 및/또는 후에 발생할 수 있으며, 예를 들어, 이러한 질병 또는 상태의 치료에 적합한 치료 또는 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 해당 치료제의 투여가 있을 수 있다.
대안 구현에서, 본 발명은 또한 명세서에서 정의된 바와 같은 RNA (분자)와 복합체 형태의 펩타이드 (Arg)7 또는 펩타이드 (Arg)7 단독의 면역 반응, 바람직하게는 예를 들어, 위에서 정의된 바와 같이 조직 또는 생체 내 사이토카인의 생성을 촉발함으로써 비특이적 면역 반응을 조절, 바람직하게는 이끌어내기 위한, 예를 들어, 유도 또는 촉진하기 위한, 또 바람직하게는 본 명세서에서 언급된 질병 또는 상태를 보완하기 위한 (치료제의 제조를 위한) 용도를 포함한다. 본 발명 식 (I)의 펩타이드의 범위를 결정함에 있어, 본 발명자들은 매우 놀랍게도 (Arg)7이 핵산, 특히 RNA가 hPBMC 내로 트랜스펙션 되는 것이 관찰되지 않더라도 hPBMC 내 면역 반응을 유의적으로 유도 또는 촉진할 수 있다는 놀라운 발견을 하였다. RNA (분자)는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 어떠한 RNA (분자)일 수 있으며, 바람직하게는, 짧은 RNA 올리고뉴클레오타이드, 코딩 RNA, 면역촉진 RNA, siRNA, 안티센스 RNA, 또는 리보스위치(riboswitch), 리보자임(ribozyme) 또는 아프타머(aptamer)이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다시, 본 명세서의 치료제(agent)는 예를 들어, 위에서 정의된 약학 조성물, 또는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 주사 완충액일 수 있으며, 부가적으로 본 발명 복합체화된 RNA 등을 포함하고, 여기에서 본 발명에서 정의된 바와 같은 치료제 내의 복합체화된 RNA 내 복합체 RNA는 본 명세서에서 정의된 RNA (분자)와의 복합체 형태의 (Arg)7 또는 펩타이드 (Arg)7 단독에 의해 대체된다.
다른 대안적 구현에서, 본 발명은 또한 명세서에서 정의된 바와 같은 RNA (분자)와 복합체 형태의 펩타이드 (Arg)7 또는 펩타이드 (Arg)7 단독의 상기 언급된 질병 또는 상태의 치료를 위한 (치료제의 제조를 위한) 용도를 포함한다.
마지막 구현에 따라, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 복합체화된 RNA 및/또는 본 발명에 따른 약학 조성물뿐만 아니라, 선택적으로 본 발명에 따른 복합체화된 RNA의 투여 및 투여량에 관한 정보를 가진 기술 지시서 및/또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 별도로 다음의 그룹의 요소들 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: 적어도 하나의 항원 또는 적어도 하나의 항체 또는 항원 또는 항체를 포함하는 조성물, 추가 애주번트(adjuvant) 또는 적어도 하나의 애주번트를 포함하는 조성물 및/또는 적어도 하나의 사이토카인 또는 적어도 하나의 사이토카인을 포함하는 조성물. 상기 항원, 항체 및/또는 사이토카인은 그러한 상태(단백질)로 제공될 수 있으며, 또는 그러한 항원, 항체 또는 사이토카인을 코딩하는 DNA 또는 RNA로 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에서 설명된 바와 같은 RNA (분자)와 복합체화된 펩타이드 (Arg)7 또는 펩타이드 (Arg)7 단독과 선택적으로 펩타이드 (Arg)7의 투여 및 투여량에 관한 정보를 포함하느 기술 지시서를 포함하는 키트를 제공한다. 그러한 키트는 예를 들어, 앞서 언급된 적용 또는 용도, 바람직하게는 앞서 언급된 질병들 중 어느 하나의 치료를 위한 본 발명의 적어도 하나의 복합체화된 RNA의 (치료제의 제조를 위한) 용도를 위해 이용된다. 키트는 또한 상기 언급된 질병들 중 어느 하나의 치료를 위한 (치료제의 제조를 위한) 본 발명에 따른 적어도 하나의 복합체화된 RNA의 용도를 위해 적용될 수 있으며, 여기에서 상기 치료제(agent) (및/또는 복합체화된 RNA)는 위에서 정의된 조직 또는 생체(organism) 내에서 면역 반응을 유도 또는 촉진할 수 있다. 그러한 키트는 추가로 위에서 정의된 바와 같은 조직 또는 생체 내에서, 면역 반응을 조절하기 위하여, 바람직하게는 면역 반응을 이끌어 내기 위해, 예를 들어, 유도 또는 촉진하기 위해, 바람직하게는 본 명세서에서 언급된 바와 같은 질병 또는 상태를 보완하기 위하여 (치료제의 제조를 위한) 본 발명에 따른 적어도 하나의 복합체화된 RNA의 용도를 위해 적용될 수 있다.
다음의 도면들은 본 발명을 더 예시적으로 보여주기 위해 제공된다. 이들은 본 발명의 범위를 한정할 의도로 제공되는 것은 아니다.
도 1: 안정화된 루시퍼라제 mRNA 서열을 보여주며, 여기에서 mRNA를 코딩하는 원래의 자연적 루시퍼라제는 폴리-A/폴리-C-태그(A70-C30)로 변형된다. 이러한 첫 번째 구조물(컨스트럭트 CAP-Ppluc(wt)-muag-A70-C30, 서열정보 번호: 35)는 다음의 서여 엘리먼트들을 포함한다:
알파-글로빈 유전자로부터 유래한 안정화하는 서열,
3'-말단 엔드(폴리-A-테일)의 70×아데노신,
3'-말단 엔드(폴리-C-테일)의 30×사이토신;
다음의 심볼들이 의미하는 바는 아래와 같다.
Figure 112010021098252-pct00011

도 2: 안정화된 루시퍼라제 mRNA 서열을 보여주며, 여기에서 서열정보 번호: 35(도 1 참조)에 따른 구조물은 더 좋은 코돈 사용을 위한 GC-최적화 서열로 더 변형된다. 최종 구조물 (컨스트럭트 CAP-Ppluc(GC)-muag-A70-C30, 서열정보 번호: 36)은 다음의 서열 엘리먼트들을 포함한다:
좋은 코돈 사용(better codon usage)을 위한 GC-최적화(optimized) 서열
알파-글로빈 유전자로부터 유래한 안정화하는 서열,
3'-말단 엔드(폴리-A-테일)의 70×아데노신,
3'-말단 엔드(폴리-C-테일)의 30×사이토신;
다음의 심볼들이 의미하는 바는 아래와 같다.
Figure 112010021098252-pct00012

도 3: 서열정보 번호: 35(도 1 참조)에 따른 서열의 코딩 서열(서열정보 번호: 37)을 보여준다.
도 4: 서열정보 번호: 36(도 2 참조)에 따른 서열의 GC-최적화 코딩 서열(서열정보 번호: 38)을 보여준다. GC-최적화 코돈은 밑줄이 그어져 있다.
도 5: IL-6 생성을 측정하여, hPMBC 세포 내에서 노나-아르기닌((Arg)9)으로 복합체화된 RNA의 면역촉진 효과를 보여준다. 도 5에 나타나는 바와 같이, hPBMC 세포는 노나-아르기닌((Arg)9)으로 복합체화된 RNA의 유의적인 IL-6 생성, 즉, 유의적인 면역촉진 효과를 나타낸다.
도 6: TNF-알파 생성을 측정하여, hPMBC 세포 내에서 노나-아르기닌((Arg)9)으로 복합체화된 RNA의 면역촉진 효과를 보여준다. 도 6에 나타나는 바와 같이, hPBMC 세포는 노나-아르기닌((Arg)9)으로 복합체화된 RNA의 유의적인 TNF-알파 생성, 즉, 유의적인 면역촉진 효과를 나타낸다.
도 7: hPBMC 내에서 각각 노나-아르기닌((Arg)9) 또는 폴리-L-아르기닌으로 복합체화된 RNA의 면역촉진 효과를 비교하여 보여준다. 이롭게도, 1:5 (RNA:노나-아르기닌)보다 낮은 질량 비율 (1:10; 1:8; 1:5; 1:2; 1:1; 2:1)에서 유의적인 면역촉진 효과가 관찰될 수 있다. 그러나, RNA:노나-아르기닌 (5:1)의 질량 비율을 사용할 때는 유의적인 TNF-알파 생성이 관찰될 수 없다. 유사한 촉진 실험이 노나-아르기닌 ((Arg)9) 또는 mRNA 단독을 이용하여 수행된다. 부가적으로, 폴리-L-아르기닌과 RNA의 복합체화는 노나-아르기닌((Arg)9)과 비교하여 TNF-알파 생성의 유의적인 낮은 유도를 나타내는 것으로 관찰되었다. 분명하게, 폴리-L-아르기닌의 더 높은 농도는 그것으로 트랜스펙션된 세포들에 독성이고, 특히 1:2 RNA:폴리-L-아르기닌:RNA 또는 더 높은 질량 비율을 사용할 때 그러하였으며, 세포들은 용해하였다.
도 8: HeLa 세포 내에서 노나-아르기닌((Arg)9)과 RNA의 복합체의 트랜스펙션 시 루시퍼라제가 발현되는 것을 보여준다. 도 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 2:1 (RNA:노나-아르기닌)보다 적은 질량 비율이 유리하다는 것을 나타낸다. 대조적으로, (높은 분자량) 폴리-L-아르기닌과의 복합체는 유의적인 루시퍼라제 활성을 이끌지 않는다. 따라서, (높은 분자량) 폴리-L-아르기닌은 mRNA의 트랜스펙션에 적합한 것으로 보이지 않는다.
도 9: HeLa 세포 내에서 헵타-아르기닌((Arg)7)과 RNA의 복합체의 트랜스펙션 시 루시퍼라제가 발현되는 것을 비교하여 보여준다. 도 9로부터 알 수 있는 바와 같이, 헵타-아르기닌((Arg)7)과 RNA의 복합체의 트랜스펙션은 유의적인 루시퍼라제 활성을 이끌지 않는다. 따라서, 헵타-아르기닌((Arg)7)은 mRNA의 트랜스펙션에 적합한 것으로 보이지 않는다.
도 10: hPBMC 세포 내에서 헵타-아르기닌((Arg)7)과 복합체화된 RNA의 면역촉진 효과를 IL-6 생성을 측정하여 보여준다. 보여지는 바와 같이, hPBMC 세포는 유의적인 IL-6 생성을 보이며, 즉, 헵타-아르기닌((Arg)7)과 복합체화된 RNA의 유의적인 면역촉진 효과를 보여준다.
도 11: hPBMC 세포 내에서 헵타-아르기닌((Arg)7)과 복합체화된 RNA의 면역촉진 효과를 TNF-알파 생성을 측정하여 보여준다. 보여지는 바와 같이, hPBMC 세포는 유의적인 TNF-알파 생성을 보이며, 즉, 헵타-아르기닌((Arg)7)과 복합체화된 RNA의 유의적인 면역촉진 효과를 보여준다.
도 12: HeLa 세포에서, 루시퍼라제의 발현에 미치는 R9 펩타이드와 복합체화된 RNA의 영향을 보여준다.
도 13: HeLa 세포에서, 루시퍼라제의 발현에 미치는 R9H3 펩타이드와 복합체화된 RNA의 영향을 보여준다.
도 14: HeLa 세포에서, 루시퍼라제의 발현에 미치는 H3R9H3 펩타이드와 복합체화된 RNA의 영향을 보여준다.
도 15: HeLa 세포에서, 루시퍼라제의 발현에 미치는 YYYR9SSY 펩타이드와 복합체화된 RNA의 영향을 보여준다.
도 16: HeLa 세포에서, 루시퍼라제의 발현에 미치는 H3R9SSY 펩타이드와 복합체화된 RNA의 영향을 보여준다.
도 17: HeLa 세포에서, 루시퍼라제의 발현에 미치는 (RKH)4 펩타이드와 복합체화된 RNA의 영향을 보여준다.
도 18: HeLa 세포에서, 루시퍼라제의 발현에 미치는 Y(RKH)2R 펩타이드와 복합체화된 RNA의 영향을 보여준다.
도 19: 트랜스펙션 효율에 미치는 말단 위치 내 히스티딘의 영향을 보여준다.
도 20: 트랜스펙션 효율에 미치는 말단 위치 내 중성 아미노산(neutral amino acid)들의 영향을 보여준다.
도 21: hPBMC 내에서, TNF알파의 분비에 영향을 미치는 R9H3와 복합체화된 RNA의 면역촉진 효과를 보여준다.
도 22: hPBMC 내에서, IL-6의 분비에 영향을 미치는 R9H3와 복합체화된 RNA의 면역촉진 효과를 보여준다.
다음의 실시예들은 본 발명을 더 예시적으로 보여주기 위한 것이다. 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 용도로 제공되는 것은 아니다.
실시예 1 - 루시퍼라제 mRNA 구조물(construct)의 제조
다음의 실험들에서, 안정화된 루시퍼라제 mRNA 서열이 제조되었고, 서열들은 트랜스펙션 실험들을 위해 사용되었으며, 여기에서 mRNA를 코딩하는 자연발생 루시퍼라제는 폴리-A/폴리-C-태그(A70-C30)로 변형되었으며, 더 나은 코돈-사용(codon-usage)을 위하여 GC-최적화되었으며, 추가로 안정화되었다.
첫 번째 구조물(컨스트럭트 CAP-Ppluc(wt)-muag-A70-C30, 서열정보 번호: 35)는 다음의 서열 엘리먼트들을 포함하였다:
알파-글로빈 유전자로부터 유래한 안정화하는 서열들
3'- 말단의 70 ( 아데노신
3'- 말단의 70 ( 사이토신
후속하는 실험들에 사용된 최종 구조물(컨스트럭트 CAP-Ppluc(GC)-muag-A70-C30, 서열정보 번호: 36)는 다음의 서열 엘리먼트들을 포함하였다:
더 나은 코돈 사용을 위한 GC-최적화된 서열
알파-글로빈 유전자로부터 유래한 안정화하는 서열들
3'- 말단의 70 ( 아데노신
3'- 말단의 70 ( 사이토신
이러한 서열들은 도 1 및 2(서열정보 번호: 35 및 36)에 또한 개시된다. 각 코딩 서열들은 도 3 및 4(서열정보 번호: 35 및 36)에 개시된다.
실시예 2 - 안정화된 루시퍼라제 mRNA의 In vitro 전사(transcription)
서열정보 번호: 35 또는 36 (Luc-RNActive)에 따른 안정화된 루시퍼라제 mRNA가 제조자의 지시서에 따라 T7-폴리머라제 (T7-Opti mRNA Kit, CureVac, T
Figure 112010021098252-pct00013
bingen, Deutschland)를 사용하여 in vitro 전사되었다.
모든 mRNA-전사물(transkript)은 70 염기의 폴리-A-테일 및 5'-Cap-구조(structure)를 포함하였다. 5'-Cap-구조는 과량의 N7-메틸-구아노신-5'-트리포스파트(Triphosphat)-5'-구아노신을 첨가하여 얻었다.
실시예 3 - 각각 노나-아르기닌((Arg) 9 ), 폴리-L-아르기닌 또는 (Arg) 9 에 기초한 추가 펩타이드들과 RNA의 복합체의 형성
서열정보 번호: 36 (Luc-RNActive)에 따른 15 ㎍의 RNA 안정화된 루시펄제 mRNA가 노나-아르기닌 (Arg9) 또는 폴리-L-아르기닌 (Sigma-Aldrich; P4663; 5000-15000 g/mol)과 다른 질량비로 혼합되었고, 이것에 의해 복합체를 형성하였다. ((Arg)9)에 대해 예시적으로 보이는 것과 같이, 다음의 질량비들이 사용되었다. 폴리-L-아르기닌은 동일한 방식으로 비교 실시예들에서 사용되었다.
Figure 112010021098252-pct00014
부가로, (Arg)9에 기초한 추가 복합체화된 RNA들이 복합체화를 위하여 다음의 펩타이드들을 사용하여 위와 같이 제조되었다:
R9: Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg
R9H3: Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-His-His-His
H3R9H3: His-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-His-His-His
YSSR9SSY: Tyr-Ser-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Tyr
H3R9SSY: His-His-His-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Tyr
(RKH)4: Arg-Lys-His-Arg-Lys-His-Arg-Lys-His-Arg-Lys-His
Y(RKH)2R: Tyr-Arg-Lys-His-Arg-Lys-His-Arg
복합체화를 위하여, 서열정보 번호: 36 (Luc-RNActive)에 따른 4 ㎍의 안정화된 루시퍼라제 mRNA가 각각의 펩타이드들(식 I에 따라)과 여러 중량비로 혼합되었으며, 이로써 복합체를 형성하였다. 후에 생성된 용액은 물을 이용하여 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 하였으며, 실온에서 30분 동안 인큐베이션되었다. 사용된 비율은 아래의 표들과 같다. HeLa-세포(150×103/well)가 그 후 트랜스펙션 1일 전에 24-웰 마이크로타이터 플레이트에 시딩되었고, 트랜스펙션이 수행될 때 70% confluence가 되도록 하였다.
Figure 112010021098252-pct00015
Figure 112010021098252-pct00016
Figure 112010021098252-pct00017
Figure 112010021098252-pct00018
Figure 112010021098252-pct00019
Figure 112010021098252-pct00020
Figure 112010021098252-pct00021

실시예 4 - HeLa 세포에서 서열정보 번호: 35 또는 36에 따른 안정화된 루시퍼라제 mRNA의 노나-아르기닌((Arg) 9 )-매개 트랜스펙션 및 발현
Hela-세포(150×103/well)가 24-웰 마이크로타이터 플레이트 상에 트랜스펙션 1일 전에 시딩되어, 트랜스펙션이 수행될 때 70% confluence가 되도록 하였다. 트랜스펙션을 위하여 (40 ㎕) 50 ㎕의 실시예 3에서 개시된 RNA/(펩타이드)-용액이 250 ㎕의 혈청이 없는 매질과 혼합되었고, 세포에 첨가되었다(최종 RNA 농도: 13 ㎍/ml). 트랜스펙션 용액의 첨가 전에, HeLa-세포는 가볍게 세척되었고, 웰 당 1 ml의 Optimen (Invitrogen)으로 2번 주의깊게 세척되었다. 그 후, 트랜스펙션 용액 (웰 당 300 ㎕)이 세포에 첨가되었고, 세포들은 4시간 동안 37℃에서 배양되었다. 그 후, 10% FCS를 포함하는 RPMI-매질 (Camprex)이 웰 당 300 ㎕ 씩 첨가되었고, 세포들으 37℃에서 추가 20시간 동안 배양되었다. 트랜스펙션 용액은 트랜스펙션 24시간 후에 흡입 제거되었고, 세포들은 300 ㎕의 용해 완충액(25 mM Tris-PO4, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton-X 100, 2 mM DTT)에서 용해되었다. 상등액은 그 후 루시페린 완충액(25 mM 글리실글리신(Glycylglycin), 15 mM MgSO4, 5 mM ATP, 62,5 μM 루시페린)과 혼합되었고, 발광(luminiscence) 정도가 루미노미터(Lumat LB 9507 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany))를 사용하여 검출되었다. 이러한 실험들의 결과는 도 8 및 12 내지 18에 나타내었다.
실시예 5 - 노나-아르기닌 ((Arg) 9 ) 또는 폴리-L-아르기닌과 RNA 복합체의 트랜스펙션 시 면역 촉진(immune stimulation) (비교 실시예)
a) 트랜스펙션 실험들
건강한 기증자의 말초 혈액으로부터 유래한 HPBMC 세포가 Ficoll gradient를 사용하여 분리되었고, 그 후 1×PBS(phophate-buffered saline)로 세척되었다. 세포들은 그 후 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 시딩되었다(200×103/웰). hPBMC 세포는 X-VIVO 15 매질(BioWhittaker) 내에서 10 ㎕의 RNA/펩타이드 복합체(RNA 최종 농도: 6 ㎍/ml; 동일 양의 RNA가 사용됨)로 실시예 4와 동일하게 24시간 동안 배양되었다(최종 RNA 농도: 10 ㎍/ml). hPBMC 세포에 대한 면역촉진 효과는 사이토카인 (인터루킨-6 및 종양 괴사 인자 알파)의 생성을 검출하여 평가하였다. 그러므로, ELISA 마이크로타이터 플레이트(Nunc Maxisorb)가 하룻밤 동안 (o/n) 추가로 특이 사이토카인 항체를 포함하는 결합(binding) 완충액(0,02% NaN3, 15 mM Na2CO3, 15 mM NaHCO3, pH 9,7)과 함께 배양되었다. 세포들은 그 후 1% BSA (bovine serum albumin)를 포함하는 1×PBS로 블로킹되었다. 세포 상등액은 첨가되었고, 4시간 동안 37℃에서 배양되었다. 그 후, 마이크로타이터 플레이트는 1×PBS, 0,05% Tween-20으로 세척되었고, 그 후 바이오틴-표지된 2차 항체(BD Pharmingen, Heidelberg, Germany)와 배양되었다. 스트렙타비딘-커플된 당근과산화효소(horseraddish peroxidase)가 상기 플레이트에 첨가되었다. 그 후, 상기 플레이트는 다시 0.05% Tween-20을 포함하는 1×PBS로 세척되었고, ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설포닉산)이 기질로 첨가되었다. 사이토카인의 양은 Tecan(Crailsheim, Germany)의 Sunrise ELISA-리더로 405 nm (OD405)에서의 흡광도를 측정하고 재조합 사이토카인(BD Pharmingen, Heidelberg, Germany)의 표준 커브를 사용하여 평가되었다.
b) 결과들
i) 노나-아르기닌 ((Arg) 9 )으로 복합체화된 RNA의 면역촉진 효과
i1) HPBMC 세포는 위에서 설명된 바와 같이 노나-아르기닌 ((Arg)9)으로 복합체화된 RNA와 함께 24시간 동안 배양되었으며, 여기에서 RNA:(Arg)9의 질량비는 1:1이었다. 그 후, IL-6 생성이 ELISA를 사용하여 세포 상등액에서 측정되었다. 결과로, HPBMC 세포는 유의적인 IL-6 생성을 나타내었고, 즉, 노나-아르기닌 ((Arg)9)으로 복합체화된 RNA의 유의적인 면역촉진 효과를 나타낸다(도 5 참조).
i2) HPBMC 세포는 위에서 설명된 바와 같이 노나-아르기닌 ((Arg)9)으로 복합체화된 RNA와 함께 24시간 동안 배양되었으며, 여기에서 RNA:(Arg)9의 질량비는 1:1이었다. 그 후, TNF-알파 생성이 ELISA를 사용하여 세포 상등액에서 측정되었다. 결과로, HPBMC 세포는 유의적인 TNF-알파 생성을 나타내었고, 즉, 노나-아르기닌 ((Arg)9)으로 복합체화된 RNA의 유의적인 면역촉진 효과를 나타낸다(도 6 참조).
ii) 각각 노나-아르기닌 ((Arg) 9 ) 또는 폴리-L-아르기닌으로 복합체화된 RNA의 면역촉진 효과의 비교(비교 실시예)
hPBMC가 다른 중량비(RNA:노나-아르기닌 1:10; 1:8; 1:5; 1:2; 1:1; 2:1, 5:1; 8:1 및 10:1)의 RNA 및 노나-아르기닌 ((Arg)9) 또는 폴리-L-아르기닌 등과 함께 각각 24시간 동안 배양되었다. 그 후, TNF-알파 생성이 ELISA를 이용하여 측정하였다.
이롭게도, 유의적인 면역촉진 효과가 5:1 (RNA:노나-아르기닌)보다 낮은 중량비(1:10; 1:8; 1:5; 1:2; 1:1; 2:1)에서 관찰될 수 있다(도 7 참조). RNA:노나-아르기닌 (5:1)의 질량비를 사용할 때, 유의적인 TNF알파 생성은 관찰되지 않았다. 노나-아르기닌 ((Arg)9) 또는 mRNA 단독을 사용하여 동일한 촉진 실험이 수행되었다(도 7, 왼쪽 참조).
게다가, mRNA와 폴리-L-아르기닌의 복합체는 노나-아르기닌 ((Arg)9)과 비교하여 TNF-알파 생성이 유의적으로 낮게 유도된다(도 7 참조, 오른쪽 참조). 부가적으로, 더 높은 농도의 폴리-L-아르기닌은 그것으로 트랜스펙션된 세포에 독성인 것으로 관찰되었고, 특히 1:2 RNA:폴리-L-아르기닌 또는 더 낮은 중량비를 사용할 때 그러하였는데, 이때 세포들은 용해하였다.
실시예 6 - HeLa 세포 내에서 각각 노나-아르기닌 ((Arg) 9 ) 또는 폴리-L-아르기닌과 RNA 복합체의 트랜스펙션 시 루시퍼라제 발현(비교 실시예)
a) HeLa 세포 내에서 노나-아르기닌 ((Arg)9)과 RNA 복합체의 트랜스펙션 시 루시퍼라제 발현. HeLa-세포는 루시퍼라제를 코딩하는 RNActive로 트랜스펙션되었고, 이것은 다른 비율의 노나-아르기닌 또는 폴리-L-아르기닌으로 각각 복합체화되었다. 24시간 후, 루시퍼라제-활성이 측정되었다. 분명히, 2:1 (RNA:노나-아르기닌)보다 낮은 중량비에서 매우 유리한 것으로 보인다(도 8 참조).
b) 비교로, (높은 중량비) 폴리-L-아르기닌과의 복합체는 유의적 레벨로 루시퍼라제-활성을 증가시키지 않는다. 따라서 (높은 중량비) 폴리-L-아르기닌은 mRNA의 트랜스펙션에 적합한 것으로 보이지 않는다(도 8 참조).
실시예 7 - HeLa 세포 내에서, 헵타-아르기닌 ((Arg) 7 )과 RNA의 복합체의 트랜스펙션 시 루시퍼라제 발현(비교 실시예)
HeLa-세포는 루시퍼라제를 코딩하는 RNActive로 트랜스펙션되었고, 이것은 다른 비율의 헵타-아르기닌 ((Arg)7)으로 복합체화되었다. 24시간 후, 루시퍼라제-활성이 측정되었다. 분명히, 헵타-아르기닌 ((Arg)7)과의 복합체는 유의적 레벨로 루시퍼라제-활성을 증가시키지 않는다. 따라서, 헵타-아르기닌 ((Arg)7)은 mRNA의 트랜스펙션에 적합한 것으로 보이지 않는다(도 9 참조).
실시예 8 - Immune stimulation upon transfection of complexes of RNA with hepta-아르기닌 ((Arg) 7 ) (Comparative 실시예)
a) 트랜스펙션 실험
헵타-아르기닌 ((Arg)7)을 이용하여 상시 실시예 5의 실험과 유사하게 트랜스펙션 실험이 수행되었다.
b) 헵타-아르기닌 ((Arg) 7 )과 RNA 복합체의 면역촉진 효과의 결과
i) HPBMC 세포는 위에서 설명된 바와 같이 24시간 동안 헵타-아르기닌 ((Arg)7)으로 복합체화된 RNA와 배양되었고, 여기에서 RNA:(Arg)7의 중량비는 1:1이었다. 그 후, IL-6 생성이 ELISA를 사용하여 세포 상등액에서 측정되었다. 결과로, HPBMC 세포는 유의적인 IL-6 생성을 보여주었으며, 즉, 헵타-아르기닌 ((Arg)7)과 복합체화된 RNA의 유의적인 면역촉진 효과를 보여준다(도 10 참조).
ii) HPBMC 세포는 게다가 위에서 설명된 바와 같이 24시간 동안 헵타-아르기닌 ((Arg)7)으로 복합체화된 RNA와 배양되었고, 여기에서 RNA:(Arg)7의 중량비는 1:1이었다. 그 후, THF-알파 생성이 ELISA를 사용하여 세포 상등액에서 측정되었다. 결과로, HPBMC 세포는 또한 유의적인 THF-알파 생성을 보여주었으며, 즉, 헵타-아르기닌 ((Arg)7)과 복합체화된 RNA의 유의적인 면역촉진 효과를 보여준다(도 11 참조).
실시예 9 - 트랜스펙션 효율에 미치는 히스티딘의 영향 측정
트랜스펙션 효율에 미치는 히스티딘의 영향을 평가하기 위하여, 트랜스펙션이 다른 히스티딘 농도를 가지는 펩타이드들을 사용하여 위에서 설명된 트랜스펙션 실험과 유사하게 수행되었다. 그러므로, 서열정보 번호: 36 (Luc-RNActive)에 따른 4 ㎍의 안정화된 루시퍼라제 mRNA가 (식 I에 따른) 각 펩타이드, 특히, R9, R9H3 또는 H3R9H3와 몰 비율들로 혼합되었고, 이것으로 복합체를 형성한다. 그 후, 생성되는 용액은 물을 이용하여 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 조정되었고, 실온에서 30분 동안 배양되었다. 각 실험에서 사용된 비율은 1:10000, 1:5000 및 1:1000이었다. HeLa-세포 (150×103/well)는 그 후 트랜스펙션 하루 전에 24-웰 마이크로타이터 플레이트게 시딩되었고, 트랜스펙션이 수행될 때 70% confluence가 되었다. 트랜스펙션을 위해 50 ㎕의 RNA/(펩타이드)-용액이 250 ㎕ 혈청이 없는 매질과 혼합되었고, 세포들에 첨가되었다(최종 RNA 농도: 13 ㎍/ml). 트랜스펙션 용액의 첨가 전에, HeLa-세포는 웰 당 1 ml Optimen (Invitrogen)을 이용하여 부드럽고, 주의깊게 세척되었다. 그 후, 트랜스펙션 용액(웰 당 300 ㎕)이 세포들에 첨가되었고, 세포들은 4시간 동안 37℃에서 배양되었다. 그 후, 10% FCS를 포함하는 300 ㎕ RPMI-배지(Camprex)가 웰 당 첨가되었고, 세포들은 37℃ 추가로 20시간 동안 배양되었다. 트랜스펙션 용액은 트랜스펙션 24시간 후에 흡입 제거되었고, 세포들은 300 ㎕ 용해 완충액(25 mM Tris-PO4, 2 mM EDTA, 10% 글리세롤, 1% Triton-X 100, 2 mM DTT)로 용해되었다. 상등액은 그 후 루시페린 완충액(25 mM 글리실글리신, 15 mM MgSO4, 5 mM ATP, 62.5 μM 루시페린)과 혼합되었고, 발광 정도가 루미노미터(Lumat LB 9507 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany))로 측정되었다.
결과들은 도 19에 나타내었다. 도 19로부터 알 수 있는 바와 같이, 한쪽 말단에 위치한 일 스트레치(a stretch)의 3개 히스티딘은 이미 복합체화된 RNA의 트랜스펙션 효율을 증가시키고, 여기에서 양쪽 말단 끝의 일 스트레치(a stretch)의 3 히스티딘은 복합체화된 RNA의 트랜스펙션 효율을 유의적으로 증가시킨다.
실시예 10 - 트랜스펙션 효율에 미치는 중성 아미노산의 영향 평가
트랜스펙션 효율에 미치는 중성 아미노산의 영향을 평가하기 위하여, 추가적인 트랜스펙션 실험이 펩타이드 H3R9CCS를 사용하여 실시예 9의 트랜스펙션 실험과 유사하게 수행되었다. 이러한 추가 실험의 결과들은 도 20에 개시하였다.
실시예 11 - hPBMC 내에서 R9H3을 이용한 면역촉진
hPBMC 내에서 R9H3이 면역촉진에 미치는 영향이 시험되었다. 그러므로, 실시예 3에서 개시된 바와 같은 R9H3와 RNA의 복합체가 제조되었다. 그 후, 건강한 기증자의 말초 혈액으로부터 유래한 HPBMC 세포가 Ficoll gradient를 이용하여 분리되었고, 그 후 1×PBS(phophate-buffered saline)로 세척되었다. 세포는 그 후 96-웰 마이크로타이터 플레이트(200×103/well)에 시딩되었다. hPBMC 세포는 실시예 4에서 설명된 바와 동일한 방법으로, X-VIVO 15 미디엄 (BioWhittaker) 내에서 10 ㎕의 RNA/펩타이드 복합체 (RNA 최종 농도: 6 ㎍/ml; 동일한 양의 RNA가 사용됨)와 함께 24시간 동안 배양되었다. hPBMC 세포에 대한 면역촉진 효과는 사이토카인(인터루킨-6 및 종양 괴사 인자 알파) 생성을 측정하여 평가되었다. 그러므로, ELISA 마이크로타이터 플레이트(Nunc Maxisorb)가 특이 사이토카인 항체를 부가적으로 포함하는 결합 완충액 (0,02% NaN3, 15 mM Na2CO3, 15 mM NaHCO3, pH 9,7)과 함께 하룻밤 동안 (o/n) 배양되었다. 세포는 1% BSA (bovine serum albumin)를 포함하는 1×PBS로 블로킹되었다. 세포 상등액이 첨가되었고, 4시간 동안 37℃에서 배양되었다. 그 후, 마이트로타이터 플레이트는 1×PBS, 0,05% Tween-20로 세척되었고, 그 후 바이오틴-표지 2차 항체(BD Pharmingen, Heidelberg, Germany)와 배양되었다. 스트렙타비딘-커플된 당근 과산화효소가 플레이트에 첨가되었다. 그 후, 플레이트는 다시 0.05% Tween-20을 포함하는 1×PBS로 세척되었고, ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설포닉산)이 기질로 첨가되었다. 사이토카인의 양이 405 nm (OD405)에서의 흡광도를 측정하고, 재조합 사이토카인 (BD Pharmingen, Heidelberg, Germany)을 이용한 표준 커브를 이용하여, Tecan (Crailsheim, Germany)의 Sunrise ELISA-Reader로 측정되었다. 결과들은 도 21 및 22에 개시되었다. 보이는 바와 같이, 유의적인 면역촉진이 1:5000 RNA:R9H3의 비율에서 나타났다.
SEQUENCE LISTING <110> CureVac GmbH <120> Transfection of complexed RNA <130> CU01P052WO1 <150> PCT/EP2007/007702 <151> 2007-09-04 <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Inventive oligopeptide having the general formula: (Arg)l(Lys(m)(His)n(Orn)o(Xaa)x according to formula I; <400> 1 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Inventive oligopeptide having the general formula: (Arg)l(Lys(m)(His)n(Orn)o(Xaa)x according to formula I; <400> 2 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Inventive oligopeptide having the general formula: (Arg)l(Lys(m)(His)n(Orn)o(Xaa)x according to formula I; <400> 3 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Inventive oligopeptide having the general formula: (Arg)l(Lys(m)(His)n(Orn)o(Xaa)x according to formula I; <400> 4 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Inventive oligopeptide having the general formula: (Arg)l(Lys(m)(His)n(Orn)o(Xaa)x according to formula I; 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<220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 31 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Inventive oligopeptide having the general formula: (Arg)l(Lys(m)(His)n(Orn)o(Xaa)x according to formula I; <220> <221> misc_feature <223> Xaa = Ornithine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 32 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 33 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Beschreibung der Sequenz: Koszak-Sequenz (s. Beschreibung S. 31) <400> 33 gccgccacca ugg 13 <210> 34 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Beschreibung der Sequenz: generische Sequenz einer Stabilisierungssequenz (s. Beschreibung S. 32) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n = C oder U <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n = jedes natuerlich auftretende Nukleotid oder ein Analog davon <220> <221> repeat_unit <222> (5)..(5) <223> x = beliebig <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n = U oder A <220> <221> repeat_unit <222> (10)..(10) <223> x = beliebig <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> n = pyrimidine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n = C oder U <400> 34 nccancccnn ucncc 15 <210> 35 <211> 1882 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> description of sequence: construct CAP-Ppluc(wt)-muag-A70-C30 <400> 35 gggagaaagc uuggcauucc gguacuguug guaaagccac cauggaagac gccaaaaaca 60 uaaagaaagg cccggcgcca uucuauccgc uggaagaugg aaccgcugga gagcaacugc 120 auaaggcuau gaagagauac gcccugguuc cuggaacaau ugcuuuuaca gaugcacaua 180 ucgaggugga caucacuuac gcugaguacu ucgaaauguc cguucgguug gcagaagcua 240 ugaaacgaua ugggcugaau acaaaucaca gaaucgucgu augcagugaa aacucucuuc 300 aauucuuuau gccgguguug ggcgcguuau uuaucggagu ugcaguugcg cccgcgaacg 360 acauuuauaa ugaacgugaa uugcucaaca guaugggcau uucgcagccu accguggugu 420 ucguuuccaa aaagggguug caaaaaauuu ugaacgugca aaaaaagcuc ccaaucaucc 480 aaaaaauuau uaucauggau ucuaaaacgg auuaccaggg auuucagucg auguacacgu 540 ucgucacauc ucaucuaccu cccgguuuua augaauacga uuuugugcca gaguccuucg 600 auagggacaa gacaauugca cugaucauga acuccucugg aucuacuggu cugccuaaag 660 gugucgcucu gccucauaga acugccugcg ugagauucuc gcaugccaga gauccuauuu 720 uuggcaauca aaucauuccg gauacugcga uuuuaagugu uguuccauuc caucacgguu 780 uuggaauguu uacuacacuc ggauauuuga uauguggauu ucgagucguc uuaauguaua 840 gauuugaaga agagcuguuu cugaggagcc uucaggauua caagauucaa agugcgcugc 900 uggugccaac ccuauucucc uucuucgcca aaagcacucu gauugacaaa uacgauuuau 960 cuaauuuaca cgaaauugcu ucugguggcg cuccccucuc uaaggaaguc ggggaagcgg 1020 uugccaagag guuccaucug ccagguauca ggcaaggaua ugggcucacu gagacuacau 1080 cagcuauucu gauuacaccc gagggggaug auaaaccggg cgcggucggu aaaguuguuc 1140 cauuuuuuga agcgaagguu guggaucugg auaccgggaa aacgcugggc guuaaucaaa 1200 gaggcgaacu gugugugaga gguccuauga uuauguccgg uuauguaaac aauccggaag 1260 cgaccaacgc cuugauugac aaggauggau ggcuacauuc uggagacaua gcuuacuggg 1320 acgaagacga acacuucuuc aucguugacc gccugaaguc ucugauuaag uacaaaggcu 1380 aucagguggc ucccgcugaa uuggaaucca ucuugcucca acaccccaac aucuucgacg 1440 caggugucgc aggucuuccc gacgaugacg ccggugaacu ucccgccgcc guuguuguuu 1500 uggagcacgg aaagacgaug acggaaaaag agaucgugga uuacgucgcc agucaaguaa 1560 caaccgcgaa aaaguugcgc ggaggaguug uguuugugga cgaaguaccg aaaggucuua 1620 ccggaaaacu cgacgcaaga aaaaucagag agauccucau aaaggccaag aagggcggaa 1680 agaucgccgu guaauucuag uuauaagacu gacuagcccg augggccucc caacgggccc 1740 uccuccccuc cuugcaccga gauuaauaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa auauuccccc cccccccccc cccccccccc 1860 cccccucuag acaauuggaa uu 1882 <210> 36 <211> 1857 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> description of sequence: construct CAP-Ppluc(GC)-muag-A70-C30 <400> 36 gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60 cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120 ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180 guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240 ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300 ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360 gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420 gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480 gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540 cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600 caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660 cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720 cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780 ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840 gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900 cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960 gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020 cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080 ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140 ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200 gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260 cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320 cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380 gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440 cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500 gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560 cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620 ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680 agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740 auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaauauu cccccccccc cccccccccc cccccccccc ucuagacaau uggaauu 1857 <210> 37 <211> 1653 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> description of sequence: coding sequence of the sequence according to SEQ ID NO: 35 <400> 37 auggaagacg ccaaaaacau aaagaaaggc ccggcgccau ucuauccgcu ggaagaugga 60 accgcuggag agcaacugca uaaggcuaug aagagauacg cccugguucc uggaacaauu 120 gcuuuuacag augcacauau cgagguggac aucacuuacg cugaguacuu cgaaaugucc 180 guucgguugg cagaagcuau gaaacgauau gggcugaaua caaaucacag aaucgucgua 240 ugcagugaaa acucucuuca auucuuuaug ccgguguugg gcgcguuauu uaucggaguu 300 gcaguugcgc ccgcgaacga cauuuauaau gaacgugaau ugcucaacag uaugggcauu 360 ucgcagccua ccgugguguu cguuuccaaa aagggguugc aaaaaauuuu gaacgugcaa 420 aaaaagcucc caaucaucca aaaaauuauu aucauggauu cuaaaacgga uuaccaggga 480 uuucagucga uguacacguu cgucacaucu caucuaccuc ccgguuuuaa ugaauacgau 540 uuugugccag aguccuucga uagggacaag acaauugcac ugaucaugaa cuccucugga 600 ucuacugguc ugccuaaagg ugucgcucug ccucauagaa cugccugcgu gagauucucg 660 caugccagag auccuauuuu uggcaaucaa aucauuccgg auacugcgau uuuaaguguu 720 guuccauucc aucacgguuu uggaauguuu acuacacucg gauauuugau auguggauuu 780 cgagucgucu uaauguauag auuugaagaa gagcuguuuc ugaggagccu ucaggauuac 840 aagauucaaa gugcgcugcu ggugccaacc cuauucuccu ucuucgccaa aagcacucug 900 auugacaaau acgauuuauc uaauuuacac gaaauugcuu cugguggcgc uccccucucu 960 aaggaagucg gggaagcggu ugccaagagg uuccaucugc cagguaucag gcaaggauau 1020 gggcucacug agacuacauc agcuauucug auuacacccg agggggauga uaaaccgggc 1080 gcggucggua aaguuguucc auuuuuugaa gcgaagguug uggaucugga uaccgggaaa 1140 acgcugggcg uuaaucaaag aggcgaacug ugugugagag guccuaugau uauguccggu 1200 uauguaaaca auccggaagc gaccaacgcc uugauugaca aggauggaug gcuacauucu 1260 ggagacauag cuuacuggga cgaagacgaa cacuucuuca ucguugaccg ccugaagucu 1320 cugauuaagu acaaaggcua ucagguggcu cccgcugaau uggaauccau cuugcuccaa 1380 caccccaaca ucuucgacgc aggugucgca ggucuucccg acgaugacgc cggugaacuu 1440 cccgccgccg uuguuguuuu ggagcacgga aagacgauga cggaaaaaga gaucguggau 1500 uacgucgcca gucaaguaac aaccgcgaaa aaguugcgcg gaggaguugu guuuguggac 1560 gaaguaccga aaggucuuac cggaaaacuc gacgcaagaa aaaucagaga gauccucaua 1620 aaggccaaga agggcggaaa gaucgccgug uaa 1653 <210> 38 <211> 1653 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> description of sequence: the GC-optimized coding sequence of the sequence according to SEQ ID NO: 36 <400> 38 auggaggacg ccaagaacau caagaagggc ccggcgcccu ucuacccgcu ggaggacggg 60 accgccggcg agcagcucca caaggccaug aagcgguacg cccuggugcc gggcacgauc 120 gccuucaccg acgcccacau cgaggucgac aucaccuacg cggaguacuu cgagaugagc 180 gugcgccugg ccgaggccau gaagcgguac ggccugaaca ccaaccaccg gaucguggug 240 ugcucggaga acagccugca guucuucaug ccggugcugg gcgcccucuu caucggcgug 300 gccgucgccc cggcgaacga caucuacaac gagcgggagc ugcugaacag cauggggauc 360 agccagccga ccgugguguu cgugagcaag aagggccugc agaagauccu gaacgugcag 420 aagaagcugc ccaucaucca gaagaucauc aucauggaca gcaagaccga cuaccagggc 480 uuccagucga uguacacguu cgugaccagc caccucccgc cgggcuucaa cgaguacgac 540 uucgucccgg agagcuucga ccgggacaag accaucgccc ugaucaugaa cagcagcggc 600 agcaccggcc ugccgaaggg gguggcccug ccgcaccgga ccgccugcgu gcgcuucucg 660 cacgcccggg accccaucuu cggcaaccag aucaucccgg acaccgccau ccugagcgug 720 gugccguucc accacggcuu cggcauguuc acgacccugg gcuaccucau cugcggcuuc 780 cggguggucc ugauguaccg guucgaggag gagcuguucc ugcggagccu gcaggacuac 840 aagauccaga gcgcgcugcu cgugccgacc cuguucagcu ucuucgccaa gagcacccug 900 aucgacaagu acgaccuguc gaaccugcac gagaucgcca gcgggggcgc cccgcugagc 960 aaggaggugg gcgaggccgu ggccaagcgg uuccaccucc cgggcauccg ccagggcuac 1020 ggccugaccg agaccacgag cgcgauccug aucacccccg agggggacga caagccgggc 1080 gccgugggca aggugguccc guucuucgag gccaaggugg uggaccugga caccggcaag 1140 acccugggcg ugaaccagcg gggcgagcug ugcgugcggg ggccgaugau caugagcggc 1200 uacgugaaca acccggaggc caccaacgcc cucaucgaca aggacggcug gcugcacagc 1260 ggcgacaucg ccuacuggga cgaggacgag cacuucuuca ucgucgaccg gcugaagucg 1320 cugaucaagu acaagggcua ccagguggcg ccggccgagc uggagagcau ccugcuccag 1380 caccccaaca ucuucgacgc cggcguggcc gggcugccgg acgacgacgc cggcgagcug 1440 ccggccgcgg ugguggugcu ggagcacggc aagaccauga cggagaagga gaucgucgac 1500 uacguggcca gccaggugac caccgccaag aagcugcggg gcggcguggu guucguggac 1560 gaggucccga agggccugac cgggaagcuc gacgcccgga agauccgcga gauccugauc 1620 aaggccaaga agggcggcaa gaucgccgug uaa 1653 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: exemplary oligopeptide according to generic formula (I) <400> 39 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His His His 1 5 10 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: exemplary oligopeptide according to generic formula (I) <400> 40 His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His His His 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: exemplary oligopeptide according to generic formula (I) <400> 41 Tyr Ser Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ser Tyr 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: exemplary oligopeptide according to generic formula (I) <400> 42 His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ser Tyr 1 5 10 15 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: exemplary oligopeptide according to generic formula (I) <400> 43 Arg Lys His Arg Lys His Arg Lys His Arg Lys His 1 5 10 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: exemplary oligopeptide according to generic formula (I) <400> 44 Tyr Arg Lys His Arg Lys His Arg 1 5

Claims (32)

  1. 하나 이상의 올리고펩타이드와 복합체화된 적어도 하나의 RNA를 포함하고,
    상기 올리고펩타이드가 8-15개 아미노산 길이를 가지고, 상기 올리고펩타이드가 l개의 Arg, m개의 Lys, n개의 His, o개의 Orn, 및 x개의 Xaa를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA(complexed single-strand RNA):
    여기에서,
    ·l + m + n +o + x = 8-15, 및
    l, m, n 또는 o는 서로 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 어떠한 수이며, 다만 Arg, Lys, His 및 Orn의 총 함량은 상기 올리고펩타이드의 총 아미노산의 적어도 50%이고; 및
    ·Xaa는 Arg, Lys, His 또는 Orn를 제외한 천연(native) 또는 비-천연(non-native) 아미노산으로부터 선택된 어떠한 아미노산이며; 및
    ·x는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8로부터 선택된 어떠한 수이고, 다만, Xaa의 총 함량은 상기 올리고펩타이드의 총 아미노산의 50%를 초과하지 않으며; 및
    상기 l개의 Arg 잔기, m개의 Lys 잔기, n개의 His 잔기, o개의 Orn 잔기, 및 x개의 Xaa 잔기는 적어도 하나의 올리고펩타이드 내에 어떠한 순서로도 위치할 수 있으며; 및
    상기 l개의 Arg 잔기, m개의 Lys 잔기, n개의 His 잔기, o개의 Orn 잔기, 및 x개의 Xaa 잔기는 각각 독립적으로 위치하고,
    여기에서, 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA의 니트로겐/포스페이트 비율(N/P-ratio)은 0.5-50임.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 RNA는 mRNA인 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 8 내지 14개의 아미노산 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 Arg, Lys, His 및 Orn의 총 함량은 상기 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA의 상기 올리고펩타이드의 총 아미노산의 적어도 60%인 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, Xaa는 중성 소수성 사이드 체인을 가지는 아미노산 및 중성 극성 사이드 체인을 가지는 아미노산을 포함하는 중성 사이드 체인을 가지는 아미노산으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 한쪽 또는 양쪽 말단 끝에 산성 사이드 체인(acidic side chain)을 포함하는 아미노산을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 한쪽 또는 양쪽 말단 끝에 중성 또는 염기성 아미노산을 포함하거나, 또는 한쪽 또는 양쪽 말단 끝에 염기성 아미노산을 포함하거나, 또는 양쪽 말단 끝에 적어도 하나의 염기성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 그것의 서열 내에 적어도 3개의 연속된 염기성 아미노산의 지역(stretch)을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 한쪽 또는 양쪽 말단 끝에 적어도 1, 2, 또는 3개의 비-양이온성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA의 적어도 하나의 RNA는 mRNA이고, 여기에서 mRNA는 약학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드, 면역촉진 단백질 또는 펩타이드, 종양 항원 또는 항체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 RNA는 야생형(wt, wild-type) RNA와 비교하여 안정화된 RNA인 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 야생형 RNA와 비교하여 안정화된 RNA의 코딩 영역의 G/C 함량은 야생형(wild-type) RNA의 코딩 영역의 G/C 함량과 비교하여 증가하여 있는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  13. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA의 적어도 하나의 RNA 대 하나 이상의 올리고펩타이드의 중량비는 1:100 내지 1:0.5의 범위이거나, 또는 1:50 내지 1:1, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1: 45, 1:40, 1:35, 1:30, 1:25, 1:20, 1:15, 1:10, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1 또는 1:0.5의 값을 가지는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  14. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA의 적어도 하나의 RNA 대 하나 이상의 올리고펩타이드의 몰비(molar ratio)는 1:20000 내지 1:500 또는 1:250의 범위이거나, 또는 1:10000 내지 1:1000의 범위이거나, 또는 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500, 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:500, 1:450, 1: 400, 1:350, 1:300, 또는 1:250의 값을 갖는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  15. 삭제
  16. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 Arg9His3, His3Arg9His3, TyrSerSerArg9SerSerTyr, His3Arg9SerSerTyr, (ArgLysHis)4, Tyr(ArgLysHis)2Arg로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나, 또는
    Arg8, Arg9, Arg10, Arg11, Arg12, Arg13, Arg14, Arg15, (서열정보 번호: 1-8);
    Lys8, Lys9, Lys10, Lys11, Lys12, Lys13, Lys14, Lys15, (서열정보 번호: 9-16);
    His8, His9, His10, His11, His12, His13, His14, His15, (서열정보 번호: 17-24); 및
    Orn8, Orn9, Orn10, Orn11, Orn12, Orn13, Orn14, Orn15, (서열정보 번호: 25-32)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  17. 제 1항 또는 제2항에 따른 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA 및 약학적으로 허용가능한 운반체(carrier)를 포함하는 암 질환, 심혈관 질환, 감염 질환, 자가면역 질환, 알러지 질환 또는 유전자 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  18. a. 하나 이상의 올리고펩타이드와 복합체화된 적어도 하나의 면역자극성 단일-가닥 RNA를 포함하는 제 1항 또는 제2항에 따른 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA를 준비 및 제공하는 단계;
    여기서 상기 올리고펩타이드는 l개의 Arg, m개의 Lys, n개의 His, o개의 Orn, 및 x개의 Xaa를 포함하고,
    ·l + m + n +o + x = 8-15, 및
    l, m, n 또는 o는 서로 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 어떠한 수이며, 다만 Arg, Lys, His 및 Orn의 총 함량은 상기 올리고펩타이드의 총 아미노산의 적어도 50%이고; 및
    ·Xaa는 Arg, Lys, His 또는 Orn를 제외한 천연(native) 또는 비-천연(non-native) 아미노산으로부터 선택된 어떠한 아미노산이며; 및
    ·x는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8로부터 선택된 어떠한 수이고, 다만, Xaa의 총 함량은 상기 올리고펩타이드의 총 아미노산의 50%를 초과하지 않으며; 및
    상기 l개의 Arg 잔기, m개의 Lys 잔기, n개의 His 잔기, o개의 Orn 잔기, 및 x개의 Xaa 잔기는 적어도 하나의 올리고펩타이드 내에 어떠한 순서로도 위치할 수 있으며; 및
    상기 l개의 Arg 잔기, m개의 Lys 잔기, n개의 His 잔기, o개의 Orn 잔기, 및 x개의 Xaa 잔기는 각각 독립적으로 위치함,
    b. 단계 a)에 따라 준비 및 제공된 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA를 사용하여 분리된 세포 또는 분리된 조직을 트랜스펙션하는 단계
    를 포함하는 분리된 세포 또는 분리된 조직의 인비트로(in vitro) 트랜스펙션 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 분리된 세포 또는 분리된 조직은 인간, 염소, 소, 돼지, 개, 고양이, 당나귀, 원숭이, 유인원 또는 생쥐, 햄스터 및 토끼를 포함하는 설치류를 포함하는 그룹으로부터 선택된 포유류로부터 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제1항에 따른 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA, 및
    사이토카인; 사이토카인을 포함하는 조성물; 아쥬반트; 및 아쥬반트를 포함하는 조성물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 키트.
  24. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 한쪽 또는 양쪽 말단 끝에 중성 또는 염기성 아미노산을 포함하거나, 또는 한쪽 또는 양쪽 말단 끝에 염기성 아미노산을 포함하거나, 또는 양쪽 말단 끝에 적어도 두 개의 염기성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  25. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 한쪽 또는 양쪽 말단 끝에 중성 또는 염기성 아미노산을 포함하거나, 또는 한쪽 또는 양쪽 말단 끝에 염기성 아미노산을 포함하거나, 또는 양쪽 말단 끝에 적어도 세 개의 염기성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  26. 제 9항에 있어서, 상기 비-양이온성 아미노산은 히스티딘인 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  27. 제 12항에 있어서, 상기 야생형 RNA와 비교하여 안정화된 RNA의 코딩된 아미노산 서열은 야생형 RNA의 코딩된 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  28. a. 하나 이상의 올리고펩타이드와 복합체화된 적어도 하나의 면역자극성 단일-가닥 RNA를 포함하는 제 1항 또는 제 2항에 따른 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA를 준비 및 제공하는 단계;
    여기서 상기 올리고펩타이드는 l개의 Arg, m개의 Lys, n개의 His, o개의 Orn, 및 x개의 Xaa를 포함하고,
    ·l + m + n +o + x = 8-15, 및
    l, m, n 또는 o는 서로 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 어떠한 수이며, 다만 Arg, Lys, His 및 Orn의 총 함량은 상기 올리고펩타이드의 총 아미노산의 적어도 50%이고; 및
    ·Xaa는 Arg, Lys, His 또는 Orn를 제외한 천연(native) 또는 비-천연(non-native) 아미노산으로부터 선택된 어떠한 아미노산이며; 및
    ·x는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8로부터 선택된 어떠한 수이고, 다만, Xaa의 총 함량은 상기 올리고펩타이드의 총 아미노산의 50%를 초과하지 않으며; 및
    상기 l개의 Arg 잔기, m개의 Lys 잔기, n개의 His 잔기, o개의 Orn 잔기, 및 x개의 Xaa 잔기는 적어도 하나의 올리고펩타이드 내에 어떠한 순서로도 위치할 수 있으며; 및
    상기 l개의 Arg 잔기, m개의 Lys 잔기, n개의 His 잔기, o개의 Orn 잔기, 및 x개의 Xaa 잔기는 각각 독립적으로 위치함,
    b. 단계 a)에 따라 준비 및 제공된 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA를 사용하여 인간을 제외한 동물의 세포 또는 조직을 트랜스펙션하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 세포 또는 조직의 트랜스펙션 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 인간을 제외한 동물은 염소, 소, 돼지, 개, 고양이, 당나귀, 원숭이, 유인원 또는 생쥐, 햄스터 및 토끼를 포함하는 설치류를 포함하는 그룹으로부터 선택된 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 9 내지 12개의 아미노산 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  31. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 Arg, Lys, His 및 Orn의 총 함량은 상기 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA의 상기 올리고펩타이드의 총 아미노산의 적어도 90%인 것을 특징으로 하는 면역자극성 복합체화된 단일-가닥 RNA.
  32. 삭제
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