BRPI0816405B1 - Complexos de rna e pepitídeos catiônicos para transfecção e para imunoestimulação. - Google Patents

Complexos de rna e pepitídeos catiônicos para transfecção e para imunoestimulação. Download PDF

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orn
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Mariola Fotin-Mleczek
Patrick Baumhof
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Curevac Ag
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Publication of BRPI0816405B1 publication Critical patent/BRPI0816405B1/pt
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Abstract

complexos de rna e pepitídeos catiônicos paratransfecção e i?ara imunoestimulaçã0 a presente invenção refere·se a um rna complexado, compreendendo pelo menos um rna complexado com um ou mais oligopeptídeos, em que o oligopeptídeo, que tem a função de peptídeo de penetração celular (cpp), tem um comprimento de 8 a 15 aminoácidos e tem a fórmula empírica (arg)i;(;lys)m;(his)n;(orn)o;(xaa)x, com a maioria dos resíduos sendo se· lecionados de arg, lys, his, orn. a invenção também refere·se a um método para transfeccionar uma célula ou um organismo, assim aplicando o rna complexado inventiva. adicionalmente, composições farmacêuticas e kits compreendendo o rna complexado inventiva, como também o uso do rna complexado inventiva para transfeccionar uma célula, tecido ou um organismo e/ou para modular, preferivelmente induzir ou intensificar uma resposta imune, são descritos aqui.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPLEXOS DE RNA E PEPITÍDEOS CATIÔNICOS PARA TRANSFECÇÃO E PARA IMUNOESTIMULAÇÃO.
A presente invenção refere-se a um RNA complexado, compre5 endendo pelo menos um RNA (molécula) complexado com um ou mais oligopeptídeos, em que o oligopeptídeo tem um comprimento de 8 a 15 aminoácidos e tem a fórmula (Arg)i(Lys)m(His)n(Orn)o(Xaa)x. A invenção também refere-se a um método para transfeccionar uma célula ou um organismo, assim aplicando o RNA complexado inventivo. Adicionalmente, composições farmacêuticas e kits compreendendo o RNA complexado inventivo, como também o uso do RNA complexado inventivo para transfeccionar uma célula, tecido ou um organismo e/ou para modular, preferivelmente induzir ou intensificar, uma resposta imune, são descritos aqui.
Transfecção de ácidos nucleicos em células ou tecidos de paci15 entes por métodos de transferência gênica é um método central da medicina molecular e representa um papel crítico em terapia e prevenção de numerosas doenças. Métodos para transfecção de ácidos nucleicos podem conduzir à estimulação imune do tecido ou organismo. Alternativa ou adicionalmente, transfecção de ácidos nucleicos pode ser seguida por processamento da informação codificada pelos ácidos nucleicos introduzidos, isto é, tradução dos polipeptídeos ou proteínas desejados. DNA ou RNA como ácidos nucleicos formam abordagens alternativas para terapia de gene. Transfecção de ácidos nucleicos pode também conduzir à modulação, por exemplo, supressão ou intensificação da expressão gênica, dependente do tipo de ácido nu25 cleico transfeccionado. Transfecção destes ácidos nucleicos é tipicamente realizada usando métodos de transferência gênica.
Métodos de transferência gênica para dentro de células ou tecidos têm sido intensivamente estudados nas últimas décadas, porém, em parte com sucesso limitado. Métodos bem-conhecidos incluem métodos físi30 cos ou físico-químicos tais como injeção (direta) de ácidos nucleicos (livres) ou transferência gênica biolística. Transferência gênica biolística (também conhecida como bombardeio de partículas biolístieas) é um método desen2 volvido na Cornell University que permite introduzir material genético dentro de tecidos ou células da cultura. Transferência gênica biolística é tipicamente realizada por partículas de metal de revestimento da superfície, tais como partículas de ouro ou de prata, e atirando estas partículas de metal, compreendendo o DNA adsorvido, para dentro das células usando uma pistola de gene. Porém, métodos de transferência gênica biolística ainda não foram mostrados trabalhar com RNA, provavelmente devido à sua degradação rápida. Além disso, estes métodos não são adequados para aplicações in vivo, um assunto que representa uma limitação prática severa.
Um método físico ou físico-químico alternativo inclui o método de eletroporação in vitro. Eletroporação in vitro é com base no uso de corrente de voltagem alta para fazer membranas celulares permeáveis para permitir a introdução de DNA ou RNA novo dentro da célula. Portanto, as paredes das células são tipicamente enfraquecidas antes da transfecção ou usando químicas ou por um processo cuidadoso de congelamento para as tornar eletrocompetentes. Se as bactérias ou células eletrocompetentes (por exemplo, células eucarióticas) e DNA (ou RNA) forem misturadas entre si, o plasmídeo pode ser transferido para dentro da célula usando uma descarga elétrica para carregar o DNA (ou RNA) para dentro das células através da faísca cruzando a câmara de reação.
Outro método físico ou físico-químico alternativo inclui uso de nanoplexos (sistemas nanoparticulares), lipoplexos (sistemas lipossomais), ou o uso de poliplexos ou polímeros catiônicos. Tais nanoplexos (sistemas nanoparticulares) envolvem uso de poliacrilatos, poliamidas, poliestireno, cianoacrilatos, polilactato (PLA), poli(ácido làctico-co-glicólico) (PLGA), polietila, etc., como sistemas de veículo para o transporte dos ácidos nucleicos para dentro das células ou tecidos. Lipoplexos ou sistemas lipossomais tipicamente envolvem o uso de lipídios catiônicos que são capazes de mimetizar uma membrana celular. Assim, a metade positivamente carregada dos lipídios interage com a metade negativamente carregada dos ácidos nucleicos e desse modo permite a fusão com a membrana celular. Lipoplexos ou sistemas lipossomais incluem, por exemplo, DOTMA, DOPE, DOSPA, DO3
TAP, DC-chol, EDMPC, etc. Poliplexos (polímeros catiônicos) tipicamente formam um complexo com ácidos nucleicos negativamente carregados conduzindo a uma condensação de ácidos nucleicos e protegendo estes ácidos nucleicos contra degradação. Transporte para dentro das células usando poliplexos (polímeros catiônicos) tipicamente ocorre por meio de endocitose mediada por receptor. Assim, o DNA é acoplado a uma molécula distinta, tal como transferrina, por exemplo, por meio da poli-L-lisina do poliplexo (PLL) que se liga a um receptor de superfície e desencadeia endocitose. Poliplexos (polímeros catiônicos) incluem, por exemplo, poli-L-lisina (PLL), quitosana, polietilenimina (PEI), polidimetilaminoetilmetacrilato (PD-mAEMA), poliamidoamina (PAMAM).
Outros métodos físicos ou físico-químicos bem-conhecidos de transferência gênica para dentro de células ou organismos inclui métodos tais como métodos de transfecção com base em vírus. Como um exemplo particular, vírus de DNA podem ser usados como veículos de DNA. Por causa de suas propriedades de infecção, tais vírus têm uma taxa de transfecção muito alta. Os vírus tipicamente usados são geneticamente modificados de certo modo, que nenhuma partícula infecciosa funcional é formada na célula transfeccionada. Apesar desta precaução de segurança, porém, um risco de propagação descontrolada dos genes terapeuticamente ativos introduzidos e dos genes virais não pode ser determinado, por exemplo, por causa de possíveis eventos de recombinação.
Mais vantajoso neste contexto é o uso das assim chamadas proteínas translocadoras ou de domínios de transdução de proteína (PTDs) para o transporte de macromoléculas para dentro das células ou tecidos. Proteínas translocadoras são consideradas como um grupo de peptídeos capazes de realizar transporte de macromoléculas entre as células (proteínas translocadoras), tais como HIV tat (HIV), antennapedia (Drosophila antennapedia), HSV VP22 (Herpes simplex), FGF ou lactoferrina, etc.. Em contraste, os domínios de transdução de proteína (PTDs) são considerados como um grupo de peptídeos capazes de direcionar proteínas e peptídeos covalentemente ligados a estas sequênciá^^ra^ntro de uma célula por meio da membra4 na celular (Leifert e Whitton: Translocatory proteins and protein transduction domains: a criticai analysis of their biological effects and the underlying mechanisms. Molecular Therapy Vol. 8 No.1 2003). Comum às proteínas translocadoras como também aos PTDs é uma região básica que é considerada principalmente responsável pelo transporte dos peptídeos de fusão uma vez que é capaz de ligar poliânions tais como ácidos nucleicos. Sem estar preso a isto, PTDs podem agir similares aos reagentes de transfecção catiônicos usando endocitose absorptiva não-saturável dependente de receptor. PTDs são tipicamente acoplados às proteínas ou peptídeos a fim de realizar ou intensificar uma resposta de CTL ao administrar uma vacina com base em peptídeo (vide revisão: Melikov e Chernomordik, Arginino-rich cell penetra-ting peptides: from endosomal uptake to nuclear delivery, Cell. Mol. Life Sei. 2005.
Domínios de transdução de proteína (PTDs) às vezes são também denominados peptídeos de penetração celular (CPPs) devido à sua capacidade de penetrar na membrana celular e desse modo realizar o transporte de (macro)moléculas para dentro das células. CPPs são peptídeos pequenos e tipicamente compreendem um conteúdo alto de aminoácidos básicos e apresentam um comprimento de 7 a 30 aminoácidos. Macromoléculas, que foram mostradas ser transportadas para dentro das células por meio de CPPs, incluem peptídeos como também DNA, siRNA ou PNAs (ácidos nucleicos de peptídeo), em que o CPPs são tipicamente ligados a estas macromoléculas por meio de uma ligação covalente e transfeccionados para dentro das células. Embora os peptídeos de penetração celular (CPPs) vêm sendo de forma bem sucedida usados para mediar liberação intracelular de uma ampla variedade de moléculas de interesse farmacológico in vitro e in vivo, os mecanismos pelos quais a absorção celular ocorre ainda permanecem obscuros. O grupo de CPPs é altamente diverso e consiste em peptídeos antipáticos, helicoidais tàis como transportan, penetratina, peptídeos hidrofóbicos tais como MTS, VP22, MAP, KALA, PpTG20, peptídeos ricos em prolina, peptídeos de MPG, PEp-1, L-oligômeros, peptídeos de calcitonina, ou peptídeos catiônicos ricos em arginina, hidrófilos, incluindo CPPs ri5 cos em arginina, que medeiam as moléculas de absorção celular (covalentemente) conjugadas por meio de ligação aos proteoglicanos da célula, tais como o domínio de transdução da proteína de HIV-1 Tat (Revisão: Deshayes et al Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics.
Cell. Mol. Life Sei. 2005). Particularmente, CPPs ricos em arginina são descritos como veículos para proteínas ou DNA, por exemplo DNA de plasmídeo, etc. para dentro das células. Poliargininas podem ser também usadas para o transporte de (macro)moléculas para dentro das células, que tipicamente compreende um comprimento de pelo menos 60 a 80 aminoácidos (em particular argininas), mais tipicamente de 1000 a 15000 aminoácidos, e desse modo representa um composto de massa molecular alta. Embora o mecanismo de absorção celular para CPPs em geral permaneça obscuro, endocitose é sugerida como um mecanismo de absorção para poli-arginina. Endocitose é um processo celular pelo qual as macromoléculas podem en15 trar em uma célula sem atravessar a membrana celular, em que três mecanismos endocitóticos diferentes foram sugeridos (endocitose clatrinadependente, endocitose caveolina-dependente e/ou endocitose actina Fdependente, vide por exemplo revisão: Melikov e Chernomordik, Argininorich cell penetrating peptides: from endosomal uptake to nuclear delivery,
Cell. Mol. Life Sei. 2005). Sem estar preso a qualquer teoria, durante endocitose, a macromolécula complexada com CPP se liga primeiro aos glicosaminoglicanos de superfície celular negativamente carregados, (GAGs), incluindo heparanos (HS). Depois, a macromolécula ligada ao CPP entra dentro da célula através de endocitose clatrina-dependente, endocitose caveolina25 dependente e/ou endocitose actina F-dependente, por exemplo, mediante dobramento da membrana ao redor da macromolécula ligada ao CPP fora da célula. Isto resulta na formação de uma vesícula semelhante a saco à qual a macromolécula ligada ao CPP é incorporada. Tráfego da macromolécula ligada ao CPP através de endossomas tardio e/ou Golgi e/ou retículo endoplásmico (ER) libera a macromolécula ligada ao CPP no citoplasma, em que este estágio pode envolver abertura induzida por CPP dos poros transientes na bicamada de lipídio. Altemativamente, a macromolécula complexa6 da com CPP pode ser transportada para outras localizações na célula, por exemplo, no endossoma, dependente do modo de ação requerido para o propósito específico. Como um exemplo, receptores TLR-7 e TLR-8 ficam localizados no endossoma. Desse modo, transfecção das células com RNA imunoestimulante, que pode ser, por exemplo, ligantes dos receptores semelhantes a Toll (TLRs) selecionados de ligantes de TLR1-TLR13 (receptores semelhantes a Toll: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 ou TLR13) pode conduzir ao transporte para os endossomas e (dependendo da interação específica e dos pares de inte10 ração) à, por exemplo, imunoestimulação pelo ligante de RNA.
Peptídeos de penetração celular (CPPs) como definidos acima são bem-conhecidos na técnica e amplamente debatidos. Porém, o uso destes CPPs (como veículos) é estabelecido para o transporte de peptídeos, proteínas e DNA como carga, em que os CPPs são tipicamente ligados às moléculas de carga de uma maneira covalente. Em contraste, transporte celular de RNAs usando CPPs foi apenas mostrado para um número muito limitado de casos, particularmente para sequências de RNA curtas, por exemplo sequências de siRNA bifilamentar.
Através de exemplo, Futaki et al (The Journal of Biological Che20 mistry, Vol 276, No. 8, p.p. 5836-5840, 2001) descreve o uso de oligopeptídeos de veículo (Arg)n tendo um comprimento de 4-16 aminoácidos para transferência in vitro de peptídeos de carga, em que os peptídeos de veículo são covalentemente ligados aos peptídeos de carga. Uma translocação ótima foi demonstrada para (Arg)n tendo um comprimento de 6 ou 8 argininas, respectivamente.
Peptídeos ou peptidomiméticos de transporte de transmembrana por CPPs foram também mostrados por Deshayes et al (2005, supra). Deshayes et a/(2005, supra) descreve o uso de oligopeptídeos Arg7 e Arg9 para transferência in vitro de peptídeos de carga e transferência in vivo de proteínas de carga tais como ciclosporina ou catalase.
Para transfecção das células com macromoiéculas, tais como DNA, peptídeos ou proteínas, polipeptídeos de peso molecular alto tais co7 mo poli-L-argininas (por exemplo, tipicamente tendo um MW de cerca de 5000 Da a 15 kDa) ou poli-L-lisina (por exemplo, tipicamente tendo um MW de cerca de 54 kDa) como também PEI (polietilenoimina) de peso molecular alto (por exemplo, tipicamente tendo um MW de cerca de 25 kDa) foram usados de acordo com a técnica (vide também Bettinger et aí, Nucleic Acids Research, Vol. 29 No. 18 (2001)). Porém, poli-L-lisina de peso molecular alto e PEI pareciam ser ineficazes como moléculas de veículo. Também, ao usar poli-L-argininas de peso molecular alto em concentrações altas, foram observados efeitos tóxicos que levam à ativação do sistema de complemento. Desse modo, esforços foram empreendidos para desenvolver agentes de transfecção de peso molecular baixo, tais como, por exemplo, poli-argininas de peso molecular baixo. Porém, tais poli-argininas de peso molecular baixo tipicamente exibem uma baixa estabilidade do complexo veículo-carga, isto é, o complexo formado, por exemplo, de uma poli-arginina como o veículo e uma molécula de DNA como uma carga. Desse modo, McKenzie et al (McKenzie etalk potent new class of reductively activated peptide gene delivery agents; The Journal of Biological Chemistry Vol. 274 No. 14, 2000) tentou aumentar a estabilidade dos complexos de peptídeo-dNA reticulando estes peptídeos por meio de glutaraldeído para o DNA, assim formando uma base de Schiff. Porém, tal reticulação resulta em dissociação extremamente lenta do complexo na célula e, por conseguinte, expressão da proteína codificada é extremamente baixa com o passar do tempo. Para evitar este problema, McKenzie et al (2000, supra) introduziu resíduos de cisteína no veículo de CPP, que estabiliza o complexo formando ligações de dissulfeto entre CPP e DNA. Na transfecção, estas ligações de dissulfeto são clivadas na célula devido às condições redutoras dentro da célula, resultando em expressão aumentada dos peptídeos codificados. Porém, tal reticulação é elaborativa e pode causar outras modificações indesejadas do DNA.
Além disso, PEI peso molecular baixo (por exemplo, tipicamente tendo um MW de cerca de 2000 Da) e poli-L-lisinas de peso molecular baixo (por exemplo, tipicamente tendo um MW de cerca de 3400 Da) podem ser usados para transfecção de tais macromoléculas como mencionado acima.
Porém, embora uma transfecção melhorada fosse observada para PEI ou poli-L-lisina ambos de peso molecular baixo nestes experimentos, a expressão não foi detectável devido à formação de complexos extremamente estáveis destas moléculas de veículo com o DNA. Como resultado, estas moléculas de veículo não parecem exibir dissociação de seu DNA complexado, uma etapa necessária para tradução e expressão da proteína codificada (vide Bettinger etal, (2001), supra).
Transporte de DNA por CPPs foi também mostrado por Niidome et al (The Journal of Biological Chemistry, Vol 272., No. 24, págs. 1530715312, 1997). Niidome et al (1997, supra) descreve o uso de CPPs, particularmente de peptídeos alfa-helicoidais catiônicos com um conteúdo de arginina definido de 25% e um comprimento de 12 ou 24 aminoácidos, respectivamente, para o transporte de DNA do plasmídeo como metade de carga. Como resultado, foi descoberto que peptídeos longos e/ou hidrofóbicos podem ligar-se fortemente ao DNA e realizar transporte do DNA para dentro das células. Além disso, Niidome et al (Bioconjugate Chem. 1999, 10, 773780) mostrou que peptídeos tendo um comprimento de 16 a 17 aminoácidos eram muito eficientes para o transporte de DNA do plasmídeo. Porém, ao usar peptídeos pequenos (por exemplo, de cerca de 12 aminoácidos) como CPPs, eficiência da transfecção de DNA para dentro das células mostrou-se diminúir significativamente.
Para intensificar a eficiência de transfecção celular dàs moléculas de arginina curtas, Futaki et al (Bioconjugate Chem. 2001, 12, 10051011) usou oligopeptídeos estearilados (Arg)n tendo um comprimento de 416 aminoácidos. Estes oligopeptídeos foram usados em experimentos de transfecção em comparação aos oligopeptídeos não-estearilados (Arg)n tendo um comprimento de 4-16 aminoácidos e poli-arginina (MW 5000-15000) para transferência in vitro do DNa do plasmídeo que codifica para luciferase. Consequentemente, peptídeos de veículo usados para transfecção foram misturados com DNA do plasmídeo e formaram um complexo de veículo/carga. Uma translocação ótima foi demonstrada para (Arg)n estearilado tendo um comprimento de 8 argininas, enquanto que as argininas tendo um comprimento de 6-7 e 9-15 argininas mostraram uma atividade de transporte celular significativamente reduzida. Além disso, a atividade de transporte das argininas não-esteariladas e poli-arginina exibiram resultados ruins, indicando perda da atividade de transporte ao usar estes peptídeos de veículo. A diferença observada da eficiência de transfecção mostrada por Futaki et al (2001, supra) para peptídeos de veículo estearilados e não-estearilados é desse modo devido à presença de metades de lipídio que significativamente alteram as propriedades químicas dos CPPs usados nestes experimentos.
De acordo com Kim et al (Kim et al, Basic peptide system for efficient delivery of foreign genes, Biochimica et Biophysica Acta 1640 (2003) 129-136), peptídeos de veículo curtos de arginina tais como (Arg)9 a (Arg)i5 podem ser usados para complexação e transfecção celular de DNA, codificando proteína fluorescente verde PEGFP-N3. Ao usar argininas (Arg)9 a (Arg)i5, resultados ótimos foram obtidos com (Arg)15 mostrando que aumenta a eficiência de transfecção celular de (Arg)9 para (Arg)i5. Estes resultados indicam que as propriedades de transporte ótimo para transfeccionar células com DNA podem ser alcançadas com um peptídeo veículo (Arg)n, em que n é bem além de 15. Porém, aplicabilidade dos peptídeos curtos de arginina para propósitos de transfecção foi exclusivamente documentada para moléculas de DNA como metade de carga por Kim et al (2003, supra).
As células podem ser também transfeccionadas usando CPPs em combinação com RNA. Porém, apenas um número pequeno de exemplos úteis é realizado para o transporte celular de RNA, provavelmente devido à sua degradação rápida e baixa estabilidade nos complexos. Desse modo, transfecção de RNA usando CPPs parece ser restringida a RNAs bifilamentares mais estáveis, tais como siRNA. Através de exemplo, Tõnges et al (RNA (2006), 12:1431-1438) usou octa-arginina estearilada (Arg)8 para a transferência in vitro de siRNA curto bifilamentar para dentro de células neuronais do hipocampo, em que a octa-arginina estearilada (Arg)8 forma um complexo com siRNA. Com base nos resultados de Tõnges et a/(2006, supra) o componente de estearila dos peptídeos de veículo parece ser indispensável para o transporte de siRNA ou o transporte de outras moléculas de
RNA.
Veldhoen et al (2006) também publicou o uso de CPPs específicos em um complexo não-covalente para transfecção celular de sequências de siRNA curtas bifilamentares (Veldhoen et al, Cellular delivery of small interfering RNA by a non-covalently attached cell penetrating peptide: quantitative analysis of uptake and biological effect. Nucleic Acids Research 2006). Peptídeos usados por Veldhoen et al (2006) foram MPGalfa (AcGALFLAFLaLSLMGLWSQPKKKRKV-cya) e MPGalfa-mNLS (AcGALFLAFLaLSLMGLWSQPKSKRKV-cya). Estes peptídeos específicos foram adicionalmente modificados com uma metade de acetila (Ac) no término N e uma metade de cisteamida no término C. Veldhoen et al (2006) foi capaz de mostrar transferência de siRNA bifilamentar, tendo um comprimento de cerca de 18 a 40 nucleotídeos, para dentro das células usando os peptídeos de veículo acima mencionados.
Resumindo o acima, uso de CPPs ou outros peptídeos de veículo para o transporte celular de macromoléculas foi basicamente mostrado para peptídeos e para moléculas de DNA. Poucas publicações muito específicas descrevem propriedades de penetração de célula de siRNA bifilamentar.
Transferência de RNA representa uma ferramenta importante na medicina molecular moderna e exibe propriedades superiores em transfecção de célula de DNA, uma vez que as moléculas de DNA podem levar a problemas sérios. Por exemplo, aplicação de moléculas de DNA carrega o risco do DNA integrar-se no genoma do hospedeiro. Integração de DNA estranho no genoma do hospedeiro pode ter uma influência na expressão dos genes hospedeiros e possivelmente desencadear expressão de um oncogene ou destruição de um gene supressor de tumor. Um gene - e portanto o produto gênico - que é essencial ao hospedeiro pode também ser inativado por integração do DNA estranho na região de codificação deste gene. Há um perigo particular se a integração do DNA ocorrer em um gene que está envolvido na regulação de crescimento da célula. Neste caso, a célula hospedeira pode entrar em um estado degenerado e pode conduzir ao câncer ou à formação de tumor. Tal integração indesejada no DNA pode ser até mesmo mais problemática, se o DNA transfeccionado para dentro da célula compreender um promotor potente, tal como o promotor de CMV viral. Integração de tais promotores no genoma da célula tratada pode conduzir a alterações indesejáveis na regulação da expressão gênica na célula. Uma outra desvantagem é que as moléculas de DNA permanecem por muito tempo no núcleo de célula, ou como um epissoma ou, como mencionado, integradas no genoma do hospedeiro. Este fenômeno conduz tanto à produção de proteína transgênica que não é limitada ou não pode ser limitada no tempo e ao perigo de tolerância associada a esta proteína transgênica. O desenvolvimento de anticorpos anti-dNA (Gilkeson etal, J Clin Invest 95, 1398-1402 (1995)) e a indução de doenças autoimunes podem ser desencadeados, além disso, por injeção de DNA. Todos estes riscos listados são associados à aplicação de DNA. Em contraste, os mesmos não ocorrem se o RNA, particularmente mRNA, for usado em vez do DNA. Por exemplo, mRNA não se integra no genoma do hospedeiro, nenhuma sequência viral, tal como promotores etc., é requerida para transcrição eficaz etc. Uma desvantagem resultante do uso de RNA pode ser devido à sua instabilidade quando comparada ao DNA (enzimas degradantes de RNA, assim chamadas RNases (ribonucleases), em particular, mas também numerosos outros processos que desestabilizam o RNA são responsáveis pela instabilidade do RNA). Porém, métodos para estabilizar RNA foram enquanto isso descritos na técnica, tais como, por exemplo, em WO 03/051401, WO 02/098443, WO 99/14346, EP-a-1083232, US 5.580.859 e US 6.214.804. Métodos vêm também sendo desenvolvidos para proteger RNA contra degradação por ribonucleases, ou usando lipossomas (Martinon et al, Eur J Immunol 23, 1719-1722 (1993)) ou uma administração intracitosólica in vivo do ácido nucleico com um dispositivo balístico (pistola de genes) (Vassilev etal, Vaccine 19, 2012-2019 (2001)).
Uma vez que as moléculas de RNA como tal fornecem propriedades vantajosas sobre o DNA como debatido acima, é o objetivo da presente invenção prover um veículo adequado e eficiente para o transporte de RNA para dentro das células. Consequentemente, a presente invenção for12 nece uma solução que permite o RNA transfeccionar células de uma maneira eficiente.
Este objetivo da presente invenção é alcançado pelas modalidades da presente invenção como caracterizadas pelas reivindicações. Particularmente, o objetivo acima é solucionado por um RNA complexado (molécula), compreendendo pelo menos um RNA (molécula), preferivelmente um mRNA, complexado com um ou mais oligopeptídeos, em que o pelo menos um oligopeptídeo tem um comprimento de 8 a 15 aminoácidos, e em que o pelo menos um oligopeptídeo contém I resíduos Arg, m resíduos Lys, n resíduos His, o resíduos Orn e x resíduos Xaa posicionados em qualquer ordem dentro do pelo menos um oligopeptídeo tendo a fórmula empírica a seguir:
(Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)o;(Xaa)x (formulai) em que
I + m + n+o + x = 8-15, e
I, m, n ou o independentemente um do outro podem ser qualquer número selecionado de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, contanto que o conteúdo geral de Arg, Lys, His e Orn represente pelo menos 50%, por exemplo, pelo menos 60% ou 70%, de todos os aminoácidos do oligopeptídeo; e
Xaa pode ser qualquer aminoácido selecionado de aminoácidos nativos (= de ocorrência natural) ou estrangeiros exceto de Arg, Lys, His ou Orn; e x pode ser qualquer número selecionado de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, contanto que o conteúdo geral de Xaa não exceda 50%, por exemplo, não mais que 40% ou 30%, de todos os aminoácidos do oligopeptídeo.
No contexto da presente invenção, um RNA complexado será entendido como um RNA (molécula) como definido aqui, preferivelmente um mRNA, que é complexado para um ou mais oligopeptídeos de acordo com a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)o;(Xaa)x formando um complexo não-covalente entre o RNA e o(s) oligopeptídeo(s). Aqui, não-covalente significa que uma associação reversível de RNA e oligopeptídeo é formada através de interações não-covalentes destas moléculas, em que as molécu13
Ias são associadas junto por qualquer tipo de interação de elétrons, diferente de uma ligação covalente, por exemplo, através de ligações de van der Waals, isto é, uma atração eletrostática fraca que surge de uma força atrativa não-específica das moléculas complexadas. Associação de um RNA e pelo menos um oligopeptídeo está em equilíbrio com dissociação daquele complexo. Intracelularmente, sem ser preso à teoria, o equilíbrio parece ser deslocado para o RNA dissociado e oligopeptídeo(s).
O pelo menos um oligopeptídeo do RNA complexado de acordo com a presente invenção tem um comprimento de 8 a 15 aminoácidos, preferivelmente um comprimento de 8 a 14, 8 a 13, 8 a 12, ou 9 a 12 ou 9 a 11 aminoácidos, e mais preferivelmente um comprimento de 8 a 10, 9 a 11, 10 a 12, 11 a 13, 12 a 14 ou 13 a 15 aminoácidos, ou até mesmo mais preferivelmente pode ser selecionado de um peptídeo da fórmula acima tendo um comprimento de 8, 9, 10,11,12,13,14 ou 15 aminoácidos.
O oligopeptídeo do RNA complexado de acordo com a presente invenção tem a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x, como definida acima em que I + m + n +o + x = 8-15, e I, m, n ou o independentemente um do outro podem ser qualquer número selecionado de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, ou qualquer faixa formada por dois destes valores, contanto que o conteúdo geral de (os ahninoácidos básicos) Arg, Lys, His e/ou Orn represente pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, ou 59%) pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, ou 69%), pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, ou 79%), pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, ou 89%) pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99%), ou até mesmo 100% de todos os aminoácidos do oligopeptídeo do RNA complexado de acordo com a presente invenção. Os aminoácidos Arg, Lys, His e Orn (três código de letra) serão entendidos como os aminoácidos arginina, lisina, histidina e ornitina, respectivamente. Neste contexto, ornitina é um aminoácido cuja estrutura é NH2-CH2-CH2-CH2-CHNH2-COOH. Ornitina foi artificialmente incorporada como o 21° aminoácido e não pertence aos 20 aminoácidos de ocorrência natural no sentido que ornitina não é um aminoácido codificado pelo DNA, e, consequentemente, não está envolvido na síntese de proteína primária. Porém, ornitina é fornecida através da reação enzimática a partir de L-arginina. É acreditada que não ser uma parte do código genético porque os polipeptídeos contendo ornitinas desprotegidas sofrem lactamização espontânea. Ornitina será considerada como um aminoácido básico uma vez que é um dos produtos da reação da enzima Arginase em L-arginina, criando uréia.
De acordo com uma outra modalidade preferida os aminoácidos (simples) do oligopeptídeo do RNA complexado da presente invenção, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)o;(Xaa)x (fórmula I) como mostrada acima, podem ocorrer em qualquer frequência como definido acima para a fórmula empírica, isto é, cada aminoácido básico (como também Xaa) pode ocorrer na fórmula empírica acima definida dentro dos valores ou faixas definidos acima, em que qualquer faixa pode ser formada por dois dos valores como definidos acima. Porém, é particularmente preferido, se o conteúdo do aminoácido básico Arg na fórmula empírica acima for pelo menos 10%, mais preferivelmente pelo menos 20%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 30%, 40% ou até mesmo 50%, até mesmo mais preferivelmente pelo ménos 60%, 70%, 80% 90% ou até mesmo 100% com respeito à fórmula empírica inteira. De acordo com outra modalidade particularmente preferida o conteúdo do aminoácido básico Lys na fórmula empírica acima é pelo menos 10%, mais preferivelmente pelo menos 20%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 30%, 40% ou até mesmo 50%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80% 90% ou até mesmo 100% com respeito à fórmula empírica inteira. De acordo com uma outra modalidade particularmente preferida o conteúdo do aminoácido básico His na fórmula empírica acima é pelo menos 10%, mais preferivelmente pelo menos 20%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 30%, 40% ou até mesmo 50%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80% 90% ou até mesmo 100% com respeito à fórmula empírica inteira. De acordo com uma outra modalidade particularmente preférida o conteúdo do aminoácido básico Orn na fórmula empírica acima é pelo menos 10%, mais preferivelmente pelo menos 20%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 30%, 40% ou até mesmo 50%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80% 90% ou até mesmo 100% com respeito à fórmula empírica inteira. Qualquer um dos conteúdos, valores ou faixas definidos acima de aminoácidos básicos Arg, Lys, His e/ou Orn como definidos acima pode também ser combinado entre si, preferivelmente levando a um conteúdo geral de todos os aminoácidos básicos do oligopeptídeo do RNA complexado da presente invenção de pelo menos 50% (pelo menos 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, ou 59%) pelo menos 60% (pelo menos 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, ou 69%), pelo menos 70% (pelo menos 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, ou 79%), pelo menos 80% (pelo menos 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, ou 89%) pelo menos 90% (pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99%), ou até mesmo 100%, como definido inicialmente.
Os aminoácidos na fórmula acima (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x, isto é, Arg, Lys, His e/ou Orn podem ser além disso selecionados dos aminoácidos nativos (= de ocorrência natural) Arg, Lys, His e Orn ou de aminoácidos estrangeiros (= não de ocorrência natural) derivados destes aminoácidos. Como um aminoácido estrangeiro (= não de ocorrência natural) derivado dos aminoácidos Arg, Lys, His e Orn, qualquer derivado conhecido destes aminoácidos pode ser usado, que foi modificado quimicamente, contanto que estes derivados não sejam tóxicos para as células ou organismos, quando fornecidos com o oligopeptídeo acima. (Tais derivados de aminoácidos são distribuídos por diferentes companhias; vide, por exemplo, Sigma Aldrich (vide http://www.sigmaaldrich.com).
Além disso, o oligopeptídeo do RNA complexado de acordo com a presente invenção pode conter um aminoácido Xaa na fórmula empírica acima (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)o;(Xaa)x, que pode ser qualquer aminoácido selecionado de aminoácidos nativos (= de ocorrência natural) ou estrangeiros (= não de ocorrência natural) exceto de Arg, Lys, His ou Orn. Preferivelmente, Xaa pode ser sélecionado, sem ser limitado a estes, de aminoácidos de ocorrência natural neutros (e hidrofóbicos), isto é, aminoácidos tendo ca16 deias laterais neutras (e hidrofóbicas), tais como alanina (Ala), valina (Vai), leucina (Leu), isoleucina (lie), prolina (Pro), triptofano (Trp), fenilalanina (Phe), ou metionina (Met), e/ou de aminoácidos de ocorrência natural neutros (e polares), isto é, aminoácidos tendo cadeias laterais neutras (e polares), tais como glicina (Gly), serina (Ser), treonina (Thr), tirosina (Tyr), cisteína (Cys), asparagina (Asn), ou glutamina (Glu), e/ou de aminoácidos acídicos de ocorrência natural, isto é, aminoácidos tendo cadeias laterais acídicas tais como ácido aspártico (Asp) ou ácido glutâmico (Glu). Preferivelmente, o oligopeptídeo do RNA complexado de acordo com a presente invenção pode conter um aminoácido Xaa na fórmula empírica acima (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x, que é selecionado de aminoácidos que não têm nenhuma cadeia lateral acídica. Até mesmo mais preferivelmente, Xaa na fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x é selecionado de aminoácidos tendo uma cadeia lateral neutra, isto é, de aminoácidos tendo uma cadeia lateral neutra (e hidrofóbica) e/ou de aminoácidos tendo uma cadeia lateral neutra (e polar), como definidos acima. Adicionalmente, qualquer derivado conhecido de aminoácidos pode ser usado para Xaa na fórmula empírica acima (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x, isto é, aminoácidos que foram modificados quimicamente, contanto que estes derivados não sejam tóxicos para as células ou organismos, quando fornecidos com o oligopeptídeo acima. (Tais derivados de aminoácidos são distribuídos por diferentes companhias, vide por exemplo, Sigma Aldrich (vide http://www.sigmaaldrich.com). Xaa está tipicamente presente na fórmula acima em um conteúdo de 0-30%, 0-40% ou 0-50% de todos os aminoácidos da sequência de oligopeptídeo inteira, isto é, o conteúdo geral de Xaa pode não exceder 30%, 40% ou 50% de todos os aminoácidos da sequência de oligopeptídeo inteira, preferivelmente pode não exceder 20%, até mesmo mais preferivelmente não 10%, e o mais preferivelmente não 5% de todos os aminoácidos da sequência de oligopeptídeo inteira. Desse modo, x na fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)0;(Xaa)x como mostrada acima pode ser qualquer número selecionado de 0, 1,2,3, 4, 5, que 6, 7 ou 8, contanto que o conteúdo de Xaa não exceda o valor acima indicado de 30% (ou menos), 40% ou
50% de todos os aminoácidos inteiros do oligopeptídeo do RNA complexado.
Tipicamente, os aminoácidos Arg, Lys, His, Orn e Xaa do oligopeptídeo do RNA complexado de acordo com a presente invenção, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x como indicada acima, podem ser posicionados em qualquer posição da sequência de oligopeptídeo. Consequentemente, a fórmula empírica (I) não determina qualquer ordem específica dos aminoácidos, mas é intencionada do contrário refletir o tipo de aminoácidos e sua frequência de ocorrência no peptídeo, indicando que a cadeia de peptídeo contém vários I resíduos Arg, m resíduos Lys, n resíduos His, os resíduos Orn e x resíduos Xaa, sem especificar qualquer ordem destes resíduos dentro da cadeia peptídica.
Porém, é preferido, que o oligopeptídeo acima compreenda aminoácidos em uma ou, preferivelmente, ambas as extremidades terminais não compreendendo uma cadeia lateral acídica. Mais preferivelmente, a sequência de oligopeptídeo acima compreende aminoácidos neutros ou básicos em uma ou, preferivelmente, ambas as extremidades terminais, até mesmo mais preferivelmente aminoácidos básicos em uma ou ambas extremidades terminais. Em uma outra modalidade preferida, o oligopeptídeo de acordo com a fórmula geral dada acima contém pelo menos dois, mais preferivelmente pelo menos três, pelo menos quatro ou até mesmo pelo menos cinco resíduos básicos terminais, em particular Arg, Orn ou Lys, em qualquer término. De acordo com apenas outra modalidade preferida, o oligopeptídeo de acordo com a fórmula geral dada acima preferivelmente não compreende nenhum aminoácido catiônico (isto é, nenhum Arg, Orn ou Lys) em uma ou, preferivelmente, em ambas as extremidades terminais, até mesmo mais preferivelmente nenhum aminoácido catiônico (isto é, nenhum Arg, Orn ou Lys) em ambas as extremidades terminais. Em outras palavras, uma ou mais, preferivelmente ambas, extremidades terminais do oligopeptídeo de acordo com a fórmula geral dada acima podem compreender qualquer aminoácido não-catiônico como definido aqui, contanto que tal aminoácido não-catiônico seja selecionado de um aminoácido exceto Arg, Orn ou Lys ou qualquer variante ou derivado destes aminoácidos catiônicos. As extremidades terminais podem compreender, por exemplo, um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou até mesmo resíduos não-catiônicos mais básicos como definidos acima a partir da extremidade N e/ou terminal C da sequência particular.
De acordo com uma outra modalidade preferida, uma ou ambas extremidades terminais do oligopeptídeo do RNA complexado de acordo com a presente invenção podem compreender pelo menos uns resíduos de histidina em uma ou ambas de suas extremidades terminais, por exemplo o oligopeptídeo do RNA complexado de acordo com a presente invenção pode compreender um, dois, três ou mais resíduos de histidina em ordem sucessiva em uma ou ambas extremidades terminais, contanto que o comprimento geral do oligopeptídeo seja limitado a 8 a 15 aminoácidos como definido acima.
Adicionalmente, os resíduos Xaa do oligopeptídeo do RNA com15 plexado de acordo com a presente invenção são tipicamente separados uns dos outros por pelo menos um Arg, Lys, His ou Orn. Uma tal separação de resíduos Xaa preferivelmente evita agrupamentos de aminoácidos nãobásicos no oligopeptídeo, agrupamentos não-básicos como tais podem reduzir as propriedades vantajosas do oligopeptídeo como um peptídeo veícu20 Io para o RNA complexado de acordo com a presente invenção.
Porém, resíduos de aminoácido básicos do oligopeptídeo do
RNA complexado de acordo com a fórmula dada acima são selecionados de Arg, Lys, His ou Orn como definidos acima e tipicamente ocorrem em um agrupamento de pelo menos 2, preferivelmente pelo menos 3, 4, 5, ou até mesmo 6 ou mais aminoácidos básicos como definidos aqui. De acordo com uma modalidade particularmente preferida, tais agrupamentos podem também compreender 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou até mesmo 15 aminoácidos. Um tal agrupamento de aminoácidos básicos, preferivelmente um agrupamento de pelo menos 3, 4, 5, ou até mesmo 6 ou mais aminoácidos bási30 cos preferivelmente cria uma superfície básica ou região de ligação dentro do oligopeptídeo provendo propriedades vantajosas ao oligopeptídeo como um peptídeo veículo para o RNA complexado de acordo com a presente in19 venção.
De acordo com uma outra modalidade preferida o oligopeptídeo do RNA complexado da presente invenção, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)o;(Xaa)x (fórmula I) como mostrada acima, pode ser, sem ser restringido a estes, selecionado do subgrupo de fórmulas a seguir: Arg8l Arg9, Arg10, Arg11( Arg12, Argi3, Arg14, Arg15, (SEQ ID NOs: 1-8);
Lys8, Lysg, Lysw, Lysn, Lysi2, Lysi3, Lysu, Lysi5, (SEQ ID NOs: 9-16);
His8, Hisg, Hisio, Hisn, His12, HÍS13, Hisu, HíSi5, (SEQ ID NOs: 17-24);
Orn8, Orng, Orn™, Ornn, Orn12, Orn13, Orni4, Orni5, (SEQ ID NOs: 25-32);
De acordo com uma outra modalidade preferida o oligopeptídeo do RNA complexado da presente invenção, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (fórmula I) como mostrada acima, pode ser, sem ser restringido a estes, selecionado do subgrupo a seguir. Este subgrupo de modo exemplar define oligopeptídeos inventivos específicos que caem dentro da fórmula I empírica como definida acima, em que as fórmulas a seguir (como com fórmula empírica (I)) não especificam n,enhuma ordem de aminoácido, mas são intencionadas a refletir as fórmulas empíricas especificando exclusivamente os (núméro de) aminoácidos como componentes do respectivo peptídeo. Consequentemente, a fórmula empírica Arg(7.14)Lysi é intencionada a significar que os peptídeos que caem dentro desta fórmula contêm 7 a 14 resíduos Arg e 1 resíduo Lys de qualquer ordem. Se os peptídeos contiverem 7 resíduos Arg e 1 resíduo Lys, todas as variantes tendo 7 resíduos Arg e 1 resíduo Lys são abrangidas. O resíduo Lys pode ser posicionado, portanto, em qualquer lugar na, por exemplo, sequência de comprimento de 8 aminoácidos composta de 7 resíduos Arg e 1 Lys. O subgrupo preferivelmente compreende:
Arg(7.-|4)Lysi, i4)Orni,; Arg(6-i3)Lys2, i3)Orn2,; Arg(5-i2)Lys3,
Arg(7.i4)HiSi,
Arg(6.13)His2,
Arg(5-i2)His3,
Arg(7.i4)0m1,
Arg(6.i3)0m2,
Arg(5-i2)Orn3,
LyS(7-i4)HiSi,
LyS(6-i3)His2,
LyS(5-i2)His3,
Lys^uprnn
Lys(6-i3)Orn2,
LyS(5-i2)Orn3,
Hís(7HÍS(6HíS(5i2)Orn3,;
Arg(4-ii)Lys4, Arg(4-ii)His4, Arg(4-njOm4, Lys(4-ii)His4, Lys(4-ii)0m4, His(4.
11) Orn4);
Arg(3-io)Lys5, Arg(3.io)His5, Arg(3.io)Orn5, Lys(3-io)His5, LyS(3-io)Orn5, His(3.
10) 0rri5,;
Arg(2-9)Lys6, Arg(2-9)His6, Arg(2-9)Orn6, Lys(2-9)His6, Lys(2-9)Orn6, His(2-9)Om6,; Arg(1.8)Lys7, Arg(1.8)His7, Arg(1.8)Orn7, Lys(1.8)His7l Lys(i-8)Orn7, His(i-8)0m7,; Arg(6.i3)LysiHiSi, Arg(6-i3)LysiOrn1, Arg^i^HiSiOmn Arg^ysp-isjHisi,
Arg1LyS(6-i3)Orn1, Lys(6-i3)His10rn1, Arg^ysiHisp-is), Arg^isp-i^Orm,
LysiHis{6-i3)Orni,;
Arg(5-i2)Lys2HiSi, Arg(5-i2)LysiHis2, Arg(5-i2)Lys20rni, Arg(5-i2)LysiOrn2, Arg(512) His20rni( Arg(5.i2)HiSiOm2, Arg2LyS(5-i2)HiSi, Arg1Lys(5-i2)His2, Arg2Lys(5i^Orri!, Arg1LyS(5-i2)0m2> LyS(5-i2)His20rn1, LyS(5-i2)HiSiOrn2, Arg2LysiHis(5-i2), Arg1Lys2His(5-i2), A^Hisp-i^Orm, Arg1HÍS(5.i2)Orn2, Lys2HiS(5-i2)0m1, LysiHiS(5-i2)Orn2,;
Arg{4-ii)Lys3Hisi, Arg(4.1i)Lys2HiS2, Argp-njLysiHiss, Arg^-njLyssOrni, Arg(4.
11) Lys20rn2, Argp-njLySiOrris, Arg^^HissOrrin Arg(4.ii)HiS20rn2, Arg(4. njHiSiOrns, Arg3LyS(4-n)HiSi, Arg2LyS(4-ii)HiS2, ArgiLys(4-n)HiS3, Arg3Lys(4. njOrni, Arg2LyS(4-ii)Orn2, ArgiLyS(4.ii)Orn3, Lys(4-ii)His30rni, Lys(4. n)HiS20rn2, Lys^njHisiOrns, ArgsLysiHisp-n), Arg2l_ys2HiS(4-ii), ArgjLyssHis^-n), Arg3His(4.ii)Orni, Arg2His(4.1i)0m2l ArgiHis(4-ii)Orn3, Lys3His(4.ii)Orni, Lys2His(4-ii)Orn2, LysiHiS(4-ii)Orn3l;
^3(3-io)Lys4His1,Arg(3.io)Lys3His2, Argp-iojLySüHiSs,. Arg(3-io)LysiHis4, Arg(3 10)Lys4Orni, Ãrg(3-io)Lys30rn2, Arg(3-io)L.ys20rn3, Arg(3.10)LysiOrn4, Arg(3. io)His4Orni, Arg{3-io)HiS30rn2( Argp-wjHisgOrris, Arg(3.io)HiSiOrn4, Arg4Lys(3. 10)Hisi, Arg3LyS(3-io)HiS2, Arg2Lys(3-io)His3l Arg1Lys(3-io)His4, Arg4Lys(3-io)Orn1, Arg3LyS(3-io)Om2l Arg2Lys(3-io)Orn3, ArgiLys(3-io)Om4, Lys(3-io)His4Orni, Lys(3io)His3Om2, LyS(3-io)His2Orn3, Lys(3-io)HiSiOrn4, Arg4LysiHis(3-io), Arg3Lys2HiS(3-io), Arg2Lys3HiS(3.io), ArgiLys4His(3-io),
Arg3HiS(3-io)Orn2, Arg2HiS(3-io)Om3, Arg^isp-wjOrru,
Lys3HiS(3-io)Orn2, Lys2His(3-io)Orn3, LysiHiS(3.10)Om4;
Arg(2-9)Lys5Hisi, Arg(2-9)Lys4His2, Argp.gjLyssHiss, Arg(2-9)Lys2His4, Arg(2. 9)LysiHis5, Arg(2-9)Lys5Orni( Arg(2-9)Lys40rn2, Argp.gjLyssOrns, Arg(2.
Arg4HiS(3-io)Orni,
Lys4His(3-io)Orn1,
9)Lys20rn4, Arg(2-9)LysiOrn5, Arg(2-9)His50rni, Arg(2-9)HiS40rn2) Arg(29)His30rn3, Arg(2-9)His20rn4, Arg(2.9)HisiOrn5) Arg5LyS(2-9)HiSi, Arg4Lys{2-9)His2) Arg3LyS(2-9)HiS3, Arg2LyS(2-9)His4! Arg1Lys(2-9)His5, Arg5Lys(2-9)Orni, Arg4Lys(2 9)Orn2, Arg3LyS(2-9)Orn3, Arg2Lys(2-9)0m4, Arg1Lys(2-9)Orn5, Lys(2-9)His50rn1) LyS(2-9)HiS40rn2) LyS(2-9)His30rn3, LyS(2-9)His20rn4, LyS(2-9)HiSiOrn5,
Arg5Lys1His(2-9), Arg4Lys2HiS(2-9), Arg3Lys3His{2-9), Arg2Lys4HiS(2-9),
Arg1Lys5His(2-9), Arg5His(2-9)Orn1) Arg4HiS(2-9)Orn2, Arg3HiS(2-9)Orn3l Arg2HiS(2 9) Orn4, ArgiHis(2-9)Orn5> Lys5HiS(2-9)Orn1, Lys4His(2-9)Orn2, Lys3HiS(2-9)Orn3, Lys2HiS(2-9)Orn4, Lysi HiS(2-9)Orn5;
Arg(i.8)Lys6His1l Arg(1.8)Lys5HiS2, Arg{1.8)Lys4HiS3, Arg(1.8)Lys3His4, Arg(i. 8)Lys2HiS5, Arg(i.8)LysiHis6, Arg(i-8)Lys60rn1l Arg(i.8)Lys50rn2, Arg(1. 8)Lys40rn3, Arg(1.8)Lys30rn4, Arg(1.8)Lys20rn5, Arg(1.8)LysiOrn6, Arg(i. 8)His60rrii, Arg^HiSsOrr^, Arg(i.8)His40m3, Arg(1.8)His30rn4, Arg(i.8)His20rn5, Arg(1.8)HiSiOm6, Arg6LyS(i-8)HiSi, Arg5LyS(i-8)His2l Arg4LyS(i-8)His3, Arg3Lys(i8)Hís4, Arg2LyS(i-8)His5, ArgiLys(i-8)His6, Arg6Lys(i.8)Orni, ArgsLySd-sjOrr^, Arg4LyS(i-8)Orn3> Arg3LyS(i-8)Orn4, Arg2LyS(i-8)Orn5l ArgiLyS(i-8)Orn6) Lys(i8)His60rni, LyS(i-8)HiS50rn2) LyS(i-8)HiS40rn3, Lys(i-8)HiS30m4, LyS(i-8)His20rn5, Lys(i-8)HiSiOrn6, Arg6LysiHiS(i=8)l Arg5Lys2His(i-8), Arg4Lys3HiS(i-8)) Arg3Lys4HiS(i-8), Arg2LyS5HiS(i-8), ArgiLys6His(i-8), Arg6His(1-8)Orn1, Arg5His(i8)Orn2, Arg4HiS(i-8)Orn3, Arg3His(1.8)Orn4, Arg2HiS(i-8)Orn5, ArgiHis(i-8)Orn6, Lys6HiS(i-8)0rni, Lys5HiS(i.8)Orn2, Lys4HiS(i.8)Orn3, Lys3HiS(i-8)Orn4, Lys2His(i. 8)Orn5, LysiHiS(i-8)Orn6,;
Arg(5-i2)LysiHiSiOrni, Arg1LyS(5-i2)HiSiOmi, Arg1LysiHiS(5-i2)Orni, ArgiLysiHis10rn(5-i2);
Arg(4.ii)Lys2HiSiOrni, Arg(4-ii)LysiHis2Qrn1, Arg(4-ii)LysiHiSiOrn2, Arg2Lys(4njHiSiOrn-i, Arg1LyS(4-ii)His20rni, ArgiLyS(4-ii)HiSiOrn2, Arg2LysiHis(4-ii)0m1, Arg1Lys2HiS(4-ii)Orni, ArgiLysiHiS(4-ii)Orn2, Arg2LysiHiSiOiTi(4-ii), ArgiLys2HiSiOrn(4-ii), Arg1Lys1His20rn(4-ii);
Arg(3.io)Lys3HisiOrni, Arg(3-io)Lys2His2Orn1, Arg(3-io)Lys2His1Orn2l Arg(3.
10) LysiHis2Orn2, Arg(3-io)LysiHisiOm3) Arg3LyS(3-io)HiSiOrni, Arg2LyS(3. io)His2Orn1, Arg2LyS(3.io)HiSiOrn2) Arg1Lys(3-io)HiS20rn2, Arg1LyS(3.io)HisiOm3, ArgaLys^iso-ioiOrrin Arg2Lys2HiS(3-io)Orni, Arg2Lys1HiS(3-io)Orn2,
Arg1Lys2HiS(3-io)Orn2, Arg2Lys2His1Om(3-io), ArgTLysTHiSsOrnp-io); Argp-gjLysAHis^rrin 9)Lys3His20mi, 9)Lys2HisiOm3, 9)Lys2His20rn2,
ArgiLysiHiS(3-io)Orn3,
Arg2LysiHis2Om(3-io),
Arg3LysiHisiOrn(3-io),
ArgiLys2His2Orn(3-io),
Arg(2-9)LysiHiSiOrn4,
Arg(2.9)Lys2His30rn1,
Arg(2-9)LysiHis30m2,
Arg(2.
Arg(2.
Arg(2.
ArgAysp.gBis^rrH, Arg^ysp.
Argp-gjLysiHis^rrh,
Arg(2-9)Lys3HisiOm2,
Arg(2-9)LysiHis20rn3,
Arg4Lys(2-9)HisiOrni, 9)HisiOrn4, Arg3LyS(2-9)His20rn1, Arg3Lys(2.g)HiSiOrn2, Arg2Lys(2-9)His30rni, Arg2LyS(2.9)HiSiOrn3, ArgiLys(2.9)His20rn3l Arg1Lys(2.9)His30m2, Arg2Lys(2. 9)His20rn2, Arg4LysiHiS(2-g)Orn1, ArgiLys^iSp.gjOmí, ArgiLysiHisp.gjOrru, ArgsLysgHiSp-gjOmn Arg3LysiHis(2-9)Orn2, ArggLysgHisp-gjOrnn Arg2LysiHis(2. g)Orn3, Arg1Lys2HiS(2-9)Orn3, ArgiLys3HiS(2.g)Orn2, Arg2Lys2His(2.g)Orn2,
Arg4LysiHiSiOrn(2-9), Arg3Lys2HiSiOrn(2-g), Arg2Lys1His30rn(2.9)J Arg2Lys2His20rri(2-9); Arg(i.8)Lys5HisiOrni, 8)Lys4His20rni, 8)LysiHis20rn4, sjLyssHiSsOrri!,
ArgiLys4His10rn(2.9),
Arg3LysiHis20rn(2.g),
Arg1Lys2His30rn(2.9),
ArgAysiHis^rnp-g),
Arg2Lys3HisiOrn(2.9),
ArgiLys3His20rn(2.9),
Arg^LysiHis^rng,
Arg(i-8)Lys2HiSiOrn4,
Arg(i-8)Lys4HiSiOrn2,
Arg(i.
Arg(i.
Arg(i.
Arg(1.8)LysiHis30rn3, Arg5Lys(iArg^LysiHiSsOrrh,
Arg(i-8)Lys2His40rn1l Arg(1.8)LysiHis40rn2)
Arg(1.8)Lys3HiSiOm3, sjHiSiOrrii, ArgiLyS(i.8)His50rn1, ArgiLys(1.8)HiSiOrn5, Arg4Lys(i-8)His20rni, Arg2LyS(i-8)His40rni, Arg2Lys(i-8)HisiOrn4, ArgiLyS(i.8)His20rn4, ArgiLys(1. 8)His40rn2, Arg4Lys{1.8)HiSiOrn2, Arg3LyS(1-8)His30rn1) ArgsLyso-sjHiSiOrns, ArgiL.yS(i-8)His30rn3, Arg5LysiHiS(i.8)0mi, Arg1Lys5HiS(i-8)Om1, ArgiLysiHis(i8)Orn5, Arg4Lys2His(1-8)Orni, Arg2Lys4HiS(i-8)Orni, Arg2Lys1His(i.8)Orn4,
ArgiLys2HiS(i-8)Orn4, Arg1Lys4His(i-8)0m2) Arg4LysiHis(i-8)Om2) Arg3Lys3HiS(i. sjOrnn ArgsLysiHiSfi-sjOrns, ArgiLys3HiS(i.8)Orn3, Arg5LysiHiSiOm(i.8),
ArgiLyssHiSiOrno-s), ArgiLysiHis50rn(1.8),
Arg2Lys4HiSiOm(i-8), Arg2Lys1His40rn(i.8),
ArgiLys4His20m(i-8), Arg4LysiHis20rn(1.8),
Arg3LysiHis30rn(i-8), ArgiLys3His30rn(i-8).
De acordo com uma modalidade preferida, o oligopeptídeo do
Arg4Lys2HiSiOrn(1.8),
Arg1Lys2His40rn(i-8),
Arg3Lys3HisiOrn(1.8),
RNA complexado da presente invenção, que tem a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x como mostrada acima, é selecionado do subgrupo que consiste em: Arg8, Arg9, Argi0, Argn, Arg12, Argi3, Argu, Arg15, (SEQ ID NOs: 1-8); Lys8, Lys9, Lysio, Lysn, Lysi2, Lysi3, Lysu, Lysi5, (SEQ ID NOs: 9-16); His8, Hisg, Hisio, Hisu, Hisi2, Hisi3, Hisu, Hisi5, (SEQ ID NOs: 17-24); ou Orn8, Orng, Ornio, Omn, Orni2, Orn13, Om14, Om15, (SEQ ID NOs: 25-32).
De acordo com outra modalidade preferida, o oligopeptídeo do RNA complexado da presente invenção, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x como mostrada acima, é Selecionado do subgrupo que consiste nas fórmulas gerais Argg (também denominado R9), ArggHis3 (também denominado R9H3), His3ArggHis3 (também denominado H3R9H3), TyrSerSerArggSerSerTyr (também denominado YSSR9SSY), His3ArggSerSerTyr (também denominado H3R9SSY), (ArgLysHis)4 (também denominado (RKH)4), Tyr(ArgLysHis)2Arg (também denominado Y(RKH)2R). Até mesmo mais preferivelmente, estas fórmulas gerais são definidas como segue:
Arg9: Arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg (SEQ ID NO: 2)
ArggHis3: Arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-His-His-His (SEQ ID
NO: 39)
His3ArggHis3: His-His-His-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-His-His-HÍS (SEQ ID NO: 40)
TyrSerSerArggSerSerTyr: Tyr-Ser-Ser-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-argSer-Ser-Tyr (SEQ ID NO: 41)
His3ArggSerSerTyr: His-His-His-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-Ser-SerTyr (SEQ ID NO: 42) (ArgLysHis)4: Arg-Lys-His-arg-Lys-His-arg-Lys-His-arg-Lys-His (SEQ
ID NO: 43)
Tyr(ArgLysHis)2Arg: Tyr-arg-Lys-His-arg-Lys-His-arg (SEQ ID NO: 44)
O pelo menos um oligopeptídeo do RNA complexado (molécula) da presente invenção, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x como mostrada acima, pode ser adicionalmente modificado. Modificações no contexto da presente invenção tipicamente compreendem qualquer modificação adequada para peptídeos, contanto que estas modificações não interfiram com as capacidades de transfecção do RNA complexado resultante.
Modificações típicas podem, desse modo, incluírem por exemplo o uso de aminoácidos modificados como definidos acima. Além disso, os resíduos de aminoácido terminais do oligopeptídeo, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x como mostrada acima, com seus grupos carbóxi (término C) e amino (término N) (como também grupos carbóxi ou amida de cadeia lateral de aminoácido, vide acima) podem estar presentes em sua forma protegida (por exemplo, o término C protegido por um grupo amida) e/ou desprotegida, usando grupos de proteção amino ou carboxila apropriados. Também, sais de adição de ácido do oligopeptídeo, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x como mostrada acima, podem ser usados. Sais de adição de ácido comuns são sais de ácido hidroálico, isto é, HBr, Hl, ou mais preferivelmente, HCI.
PEGilação dos grupos carboxila terminais ou de cadeia lateral ou do grupo epsilo-amino de lisina que ocorre no oligopeptídeo, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)o;(Xaa)x como mostrada acima, confere resistência à aglomeração e degradação de soró e está também dentro do escopo da presente invenção.
O pelo menos um oligopeptídeo do RNA complexado (molécula) da presente invenção, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o; (Xaa)x como mostrada acima, pode ser além disso modificado para ligar ou ser acoplado a pelo menos um ligante específico, em que o pelo menos um ligante específico pode ser ligado ou acoplado a uma ou ambas extremidades terminais do pelo menos um oligopeptídeo. O pelo menos um ligante específico ligado ou acoplado a uma ou ambas extremidades terminais do oligopeptídeo pode ser idêntico ou diferente e pode ser selecionado de qualquer composto capaz de ligar ou interagir com um receptor ou uma proteína ou um complexo de proteína/receptor, por exemplo, na superfície celular, e, por exemplo, sem ser limitado a estes, RGD-peptídeo, transferrina ou manose, etc..
Outras modificações preferidas que resultam em derivados do oligopeptídeo, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x como mostrada acima, é com base em carboidratos e/ou lipídios que podem ser covalentemente acoplados ao oligopeptídeo. Preferiu-se acoplar carboidratos e/ou lipídios à serina, treonina, asparagina, glutamina ou tirosina ou glutamato ou aspartato por meio de suas metades de cadeia lateral reativa. Alternativamente, carboidratos e/ou lipídios podem ser também ligados às metades terminais do oligopeptídeo como definido aqui. Além disso, o oligopeptídeo pode ser acoplado a uma metade de peptídeo ou proteína funcionalmente diferente que pode também estabilizar o oligopeptídeo e/ou pode servir para melhorar as propriedades de transporte do oligopeptídeo nos fluidos do corpo, em particular sangue. Peptídeos ou proteínas adequados podem ser, por exemplo, selecionados de albumina, transferrina etc., que podem ser acoplados diretamente ao oligopeptídeo, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x como mostrada acima, ou por meio de um peptídeo ou sequência de ligador orgânico. Preferivelmente, estes peptídeos ou proteínas são ligados a um dos términos do oligopeptídeo.
Neste contexto, é para ser observado que uma modificação do oligopeptídeo com lipídios, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x como mostrada acima, tipicamente não inclui o uso de ácidos graxos (saturados ou não-saturados), particularmente não o uso de ácidos graxos de cadeia longa (saturados ou não-saturados) (em particular com um comprimento de cadeia de > C12, > C14 ou > Ο-ιβ). Desse modo, no contexto da presente invenção, modificação do oligopeptídeo com ácidos graxos, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x como mostrada acima, não forma uma parte integrante da presente invenção. Porém, se ácidos graxos forem usados para modificar 0 peptídeo veículo, os mesmos podem ser selecionados, sem serem limitados a estes, do grupo que compreende, por exemplo, ácido gra26 xo butanoico (ácido graxo butírico), ácido graxo pentanoico (ácido graxo valérico), ácido graxo hexanoico (ácido graxo caproico), ácido graxo octanoico (ácido graxo caprílico), ácido graxo nonanoico (ácido graxo pelargônico), ácido graxo decanoico (ácido graxo cáprico), ácido graxo dodecanoico (áci5 do graxo láurico), ácido graxo tetradecanoico (ácido graxo mirístico), ácido graxo hexadecanoíco (ácido graxo palmítico), ácido graxo heptadecanoico (ácido graxo margárico (datúrico)), ácido graxo octadecanoico (ácido graxo esteárico), ácido graxo eicosanoico (ácido graxo araquídico), ácido graxo docosanoico (ácido graxo beênico), ácido graxo tetracosanoico (ácido graxo lignocérico), ácido graxo hexacosanoico (ácido graxo cerótico), ácido graxo heptacosanoico (ácido graxo carbocérico), ácido graxo octacosanoico (ácido graxo montânico), ácido graxo triacontanoico (ácido graxo melíssico), ácido graxo dotriacontanoico (ácido graxo laceroico), ácido graxo tritriacontanoico (ácido graxo ceromelíssico (psílico)), ácido graxo tetratriacontanoico (ácido graxo gédico), ácido graxo pentatriacontanoico (ácido graxo ceroplástico), etc., ou seus análogos não-saturados. Como um exemplo particular, a presente invenção tipicamente não inclui o uso de ácido graxo octadecanoico (ácido graxo esteárico) ou seus análogos não-saturados para modificação dos peptídeos de veículo da fórmula I, isto é, tipicamente nenhum oligopep20 tídeo estearilado da fórmula I pode ser aqui usado para complexação do componente de RNA do complexo inventivo.
Para evitar o problema de degradação do oligopeptídeo, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)0;(Xaa)x como mostrada acima, de acordo com outra modalidade da presente invenção, um isômero retroinver25 tido do oligopeptídeo acima, composto de aminoácidos D ou pelo menos parcialmente composto de aminoácidos D, pode ser usado. O termo isômero de retroinvertido refere-se a um isômero de um peptídeo linear em que a direção da sequência é invertida e a quiralidade de cada resíduo de aminoácido é invertida (vide, por exemplo, Jameson et al, Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al, Nature, 368, 692-693 (1994)). A respeito ao peptídeo pai, o peptídeo retroinvertido é montado na ordem contrária dos aminoácidos, tipicamente com derivados de aminoácido de F-moc. Tipicamente, os peptí27 deos brutos podem ser purificados através de HPLC de fase reversa.
Outras modificações que podem ser introduzidas no oligopeptídeo tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)o;(Xaa)x como mostrada acima, referem-se às modificações da cadeia principal peptídica. Preferivelmente, os oligopeptídeos modificados são miméticos de andaime. Sua cadeia principal é diferente da cadeia principal de ocorrência natural, enquanto suas estruturas de cadeia lateral são idênticas com os oligopeptídeos ou fragmentos dos mesmos, variantes ou derivados. Em geral, miméticos de andaime exibem uma modificação de um ou mais dos membros de cadeia de cadeia principal (NH, CH, CO), ou como substituição (preferivelmente) ou Cõmo uma inserção. Substituintes são, por exemplo, (l)-O-, -S-, ou -gH2- em vez de -NH-; (II) -N-, C-alquil-, ou -BH- em vez de -cHR- e (lll)-cS-, -cH2-, SOn-, -P=O(OH)-, ou -B(OH)- em vez de -cO-. Um peptídeo mimético de um oligopeptídeo, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)o;(Xaa)x, como definida aqui, pode ser uma combinação de cada uma destas modificações. Em particular, modificações de cada um dos grupos I, II e III podem ser combinadas. Em um peptídeo mimético cada membro de cadeia da cadeia principal pode ser modificado ou, alternativamente, apenas um certo número de membros da cadeia pode ser trocado por uma metade de ocorrência não-natural. Preferivelmente, todos os membros de cadeia da cadeia principal de um oligopeptídeo, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x, como definida aqui, de qualquer um -NH-, cHR- ou CO é trocado por outro grupo de ocorrência não-natural. No caso de a ligação de amida (-NH-cO-) da cadeia principal do oligopeptídeo ser substituída (na molécula inteira ou pelo menos em uma posição simples), as metades de substituição preferíveis são bioisostérica, por exemplo, ligações de amida retroinvertidas (-cO-NH-), hidroxil etileno (-cH(OH)-cH2-), alqueno (CH2=CH-), carba (CH2-cH2-) e/ou -P=O(OH)-cH2-). Alternativamente, o alongamento de cadeia da cadeia principal através de inserções pode ocorrer em um andaime mimético do oligopeptídeo, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x como definida aqui, por exemplo, flanqueando as metades do átomo C-alfa. Em qualquer lado do átomo C-alfa, por exemplo -O-, -S-, -cH-, -NH- pode ser inserido.
Particularmente preferida é estrutura da cadeia principal peptídica de oligocarbamato do oligopeptídeo, tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x, como definida aqui. Assim ligação de amida pode ser substituída por uma metade de earbamato. Os carbonatos de amino alquila N-protegidos monoméricos são acessíveis por meio dos aminoácidos ou amino alcoóis correspondentes. Os mesmos são convertidos em ésteres ativos, por exemplo, éster de p-nitro fenila usando a metade de F-moc ou um grupo nitroariloxicarbonila fotossensível através de síntese de fase sólida.
O RNA complexado da presente invenção também compreende pelo menos um RNA (molécula) adequado para propósitos de transfecção, em que este pelo menos um RNA (molécula) é complexado com um ou mais oligopeptídeos, como descrevedo acima com á fórmula I empírica ((Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x).
O pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ter qualquer comprimento (preferivelmente dependente do tipo de RNA a ser aplicado como um RNA complexado de acordo com a presente invenção). Sem ser restringido a estes, o pelo menos um RNA (molécula) pode ter um comprimento de 5 a 20000 nucleotídeos, mais preferivelmente um comprimento de 5 a 10000 ou de 300 a 10000 nucleotídeos, até mesmo mais preferivelmente um comprimento de 5 a 5000 nucleotídeos, e o mais preferivelmente um comprimento de 20 a 5000, de 50 a 5000, de 100 a 5000 ou de 300 a 10000 nucleotídeos dependendo do tipo de RNA a ser transfeccionado (vide descreveção abaixo).
O pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ser qualquer RNA, preferivelmente, sem ser limitado a estes, um oligonucleotídeo de RNA curto (comprimento preferível 5 a 80 ou, mais preferivelmente 20 a 80 nucleotídeos), um RNA de codificação, um RNA imunoestimulante, um siRNA, um RNA antissenso, ou riboswitches, ribozimas ou aptâmeros. Além disso, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ser um RNA uni ou bifilamen29 tar (que pode também ser considerado como um RNA (molécula) devido à associação não-covalente de dois RNAs unifilamentares (moléculas)) ou um RNA parcialmente bifilamentar (que é tipicamente formado por uma molécula de RNA unifilamentar mais longa e uma mais curta ou por duas moléculas de RNA unifilamentar que são quase iguais em comprimento, em que uma molécula de RNA unifilamentar é parcialmente complementar à outra molécula de RNA unifilamentar e ambas desse modo formam uma molécula de RNA bifilamentar nesta região). Preferivelmente, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ser um RNA unifilamentar. O pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode também ser um RNA circular ou linear, preferivelmente um RNA linear. Mais preferivelmente, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ser um RNA (linear) unifilamentar. O pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ser um RNA ribossômico (rRNA), um RNA de transferência (tRNA), um RNA mensageiro (mRNA), ou um RNA viral (vRNA), preferivelmente um mRNA. A presente invenção permite todos estes RNAs serem transfeccionados para dentro da célula. Neste contexto, um mRNA é tipicamente um RNA que é composto de vários elementos estruturais por exemplo uma região 5'-UTR, um sítio de ligação ribossômico posicionado a montante seguido por uma região de codificação, uma região 3‘-UTR opcional que pode ser seguida por um policauda A (e/ou uma policauda C). Um mRNA pode ocorrer como um RNA mono, di, ou mesmo multicistrônico, isto é, um RNA que carrega as sequências de codificação de uma, duas ou mais proteínas. Tais sequências de codificação em mRNA di ou mesmo multicistrônico podem ser separadas por pelo menos uma sequência de IRES, por exemplo, como definido aqui.
OLIGONUCLEOTÍDEOS DE RNA CURTOS
Em uma primeira modalidade, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ser um oligonucleotídeo de RNA curto. Oligonucleotídeos de RNA curtos no contexto da presente invenção podem compreender qualquer RNA como definido acima. Preferivelmen30 te, o oligonucleotídeo de RNA curto pode ser um oligonucleotídeo de RNA uni ou bifilamentar, mais preferivelmente um oligonucleotídeo de RNA unifilamentar. Até mesmo mais preferivelmente, o oligonucleotídeo de RNA curto pode ser um oligonucleotídeo de RNA unifilamentar linear.
Preferivelmente, os oligonucleotídeos de RNA curtos como aqui usados compreendem um comprimento como definido acima em geral para moléculas de RNA, mais preferivelmente um comprimento de 5 a 100, de 5 a 50, ou de 5 de 30, ou, alternativamente, um comprimento de 20 a 100, de 20 a 80, ou, até mesmo mais preferivelmente, de 20 de 60 nucleotídeos. Oligonucleotídeos de RNA curtos podem ser usados para vários propósitos, por exemplo para estimulação imune (não-específica), ou reduzir/suprimir transcrição/tradução dos genes.
RNA DE CODIFICAÇÃO
Em uma segunda modalidade, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ser um RNA de codificação. O RNA de codificação do RNA complexado da presente invenção pode ser qualquer RNA como definido acima. Preferivelmente, o RNA de codificação pode ser um RNa uni ou bifilamentar, mais preferivelmente um RNA unifilamentar, e/ou um RNA circular ou linear, mais preferivelmente um RNA linear. Até mesmo mais preferivelmente, o RNA de codificação pode ser um RNA unifilamentar (linear). O mais preferivelmente, o RNA de codificação pode ser um RNA mensageiro ((linear) unifilamentar) (mRNA).
O RNA de codificação pode também codificar uma proteína ou um peptídeo, que podem ser selecionados, sem serem restringidos a estes, por exemplo, de proteínas ou peptídeos terapeuticamente ativos, antígenos tumorais, anticorpos, proteínas ou peptídeos imunoestimulantes, etc., ou de qualquer outra proteína ou peptídeo adequados para uma aplicação específica (terapêutica), em que o pelo menos um RNA (molécula) codificando a proteína será transportado para dentro de uma célula, um tecido ou um organismo e a proteína é expressada subsequentemente nesta célula, tecido ou organismo.
Neste contexto, proteínas terapeuticamente ativas podem ser selecionadas de qualquer proteína reçombinante ou isolada conhecida a um versado na técnicaanterior. Sem serem restringidas a estas, proteínas terapeuticamente ativas quando codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui podem ser selecionadas de fatores apoptóticos ou proteínas relacionadas à apoptose incluindo AIF, Apaf por exemplo Apaf-1, Apaf-2, Apaf-3, ou APO-2 (L), APO-3 (L), Apopaína, Bad, Bak, Bax, Bcl-2, BcI-Xl, Bcl-xs, bik, CAD, Calpaína, Caspase, por exemplo Caspase-1, Caspase-2, Caspase-3, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-6, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9, Caspase-10, Caspase-11, ced-3, ced-9, c-Jun, c-myc, crm A, citocromo C, CdR1, DcR1, DD, DED, DISC, DNA-PKcs, DR3, DR4, DR5, FADD/MORT-1, FAK, Fas (CD95/fas de ligante de Fas (receptor)), FLICE/MACH, FLIP, fodrina, fos, G-actina, Gas-2, gelsolina, granzima A/B, ICAD, ICE, JNK, lamina A/B, MAP, MCL-1, Mdm-2, MEKK-1, MORT-1, NEDD, NF-capaB, NuMa, p53, PAK-2, PARP, perforina, PITSLRE,
PKCdelta, pRb, presenilina, prICE, RAIDD, Ras, RIP, esfingomielinase, timidinquinase de herpes simples, TRADD, TRAF2, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, transglutaminase, etc.
Proteínas terapeuticamente ativas quando codificadas pelo menos por um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui podem também ser selecionadas de proteínas recombinantes, incluindo proteínas selecionadas do grupo que consiste em 0ATL3, 0FC3, 0PA3, 0PD2, 4-1BBL, 5T4, 6Ckine, 707-aP, 9D7, A2M, AA, AAAS, AACT, AASS, ABAT, ABCA1, ABCA4, ABCB1, ABCB11, ABCB2, ABCB4, ABCB7, ABCC2, ABCC6, ABCC8, ABCD1, ABCD3, ABCG5, ABCG8, ABL1, ABO, ABR ACAA1, ACA25 CA, ACADL, ACADM, ACADS, ACADVL, ACAT1, ACCPN, ACE, ACHE, ACHM3, ACHM1, ACLS, ACPI, ACTA1, ACTC, ACTN4, ACVRL1, AD2, ADA, ADAMTS13, ADAMTS2, ADFN, ADH1B, ADH1C, ADLDH3A2, ADRB2, ADRB3, ADSL, AEZ, AFA, AFD1, AFP, AGA, AGL, AGMX2, AGPS, AGS1, AGT, AGTR1, AGXT, AH02, AHCY, AHDS, AHHR, AHSG, AIC, AIED, AIH2,
AIH3, AIM-2, AIPL1, AIRE, AK1, ALAD, ALAS2, ALB, HPG1, ALDH2, ALDH3A2, ALDH4A1, ALDH5A1, ALDH1A1, ALDOA, ALDOB, ALMS1, ALPL, ALPP, ALS2, ALX4, AMACR, AMBP, AMCD, AMCD1, AMCN, AMELX, A32
MELY, AMGL, AMH, AMHR2, AMPD3, AMPD1, AMT, ANC, ANCR, ANK1, AN0P1, AOM, AP0A4, AP0C2, AP0C3, AP3B1, APC, aPKC, APOA2, APOA1, APOB, APOC3, APOC2, APOE, APOH, APP, APRT, APS1, AQP2, AR, ARAF1, ARG1, ARHGEF12, ARMET, ARSA, ARSB, ARSC2, ARSE, ART-4,
ARTC1/m, ARTS, ARVD1, ARX, AS, ASAH, ASAT, ASD1, ASL, ASMD, ASMT, ASNS, ASPA, ASS, ASSP2, ASSP5, ASSP6, AT3, ATD, ATHS, ATM, ATP2A1, ATP2A2, ATP2C1, ATP6B1, ATP7A, ATP7B, ATP8B1, ATPSK2, ATRX, ATXN1, ATXN2, ATXN3, AUTS1, AVMD, AVP, AVPR2, AVSD1, AXIN1, AXIN2, AZF2, B2M, B4GALT7, B7H4, BAGE, BAGE-1, BAX,
BBS2, BBS3, BBS4, BCA225, BCAA, BCH, BCHE, BCKDHA, BCKDHB, BCL10, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BCPM, BCR, BCR/ABL, BDC, BDE, BDMF, BDMR, BEST1, beta-catenina/m, BF, BFHD, BFIC, BFLS, BFSP2, ~ BGLAP,BGN, BHD, BHR1, BING-4, BIRC5, BJS, BLM, BLMH, BLNK, BMPR2, BPGM, BRAF, BRCA1, BRCA1/m, BRCA2, BRCA2/m, BRCD2,
BRCD1, BRDT, BSCL, BSCL2, BTAA, BTD, BTK, BUB1, BWS, BZX, C0L2A1, G0L6AÍ, C1NH, C1QA, C1QB, C1QG, C1S, C2, C3, C4A, C4B, C5, C6, C7, C7orf2, C8A, C8B, C9, CA125, CA15-3/CA 27-29, CA195, CA19-9, CA72-4, CA2, CA242, CA50, CABYR, CACD, CACNA2D1, CAC. NA1A, CACNA1F, CACNA1S, CACNB2, CACNB4, CAGE, CA1, ÇALB3,
CALCA, CALCR, CALM, CALR, CAM43, CAMEL, CAP-1, CAPN3, CARD15, CASP-5/m, CASP-8, CASP-8/m, CASR, CAT, CATM, CAV3, CB1, CBBM, CBS, CCA1, CCAL2, CCAL1, CCAT, CCL-1, CCL-11, CCL-12, CCL-13, CCL-14, CCL-15, CCL-16, CCL-17, CCL-18, CCL-19, CCL-2, CCL-20, CCL21, CCL-22, CCL-23, CCL-24, CCL-25, CCL-27, CCL-3, CCL-4, CCL-5,
CCL-7, CCL-8, CCM1, CCNB1, CCND1, CCO, CCR2, CCR5, CCT, CCV, CCZS, CD1, CD19, CD20, CD22, CD25, CD27, CD27L, cD3, CD30, CD30, CD30L, CD33, CD36, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD44v, CD44v6, CD52, CD55, CD56, CD59, CD80, CD86, CDAN1, CDAN2, CDAN3, CDC27, CDÇ27/m, CDC2L1, CDH1, CDK4, CDK4/m, CDKN1C,
CDKN2A, CDKN2A/m, CDKN1A, CDKN1C, CDL1, CDPD1, CDR1, CEA, CEACAM1, CEACAM5, CECR, CECR9, CEPA, CETP, CFNS, CFTR, CGF1, CHAC, CHED2, CHED1, CHEK2, CHM, CHML, CHR39C, CHRNA4, CHR33
ΝΑ1, CHRNB1, CHRNE, CHS, CHS1, CHST6, CHX10, CIAS1, CIDX, CKN1, CLA2, CLA3, CLA1, CLCA2, CLCN1, CLCN5, CLCNKB, CLDN16, CLP, CLN2, CLN3, CLN4, CLN5, CLN6, CLN8, C1QA, C1QB, C1QG, C1R, CLS, CMCWTD, CMDJ, CMD1A, CMD1B, CMH2, MH3, CMH6, CMKBR2, CMKBR5, CML28, CML66, CMM, CMT2B, CMT2D, CMT4A, CMT1A, CMTX2, CMTX3, C-mYC, CNA1, CND, CNGA3, CNGA1, CNGB3, CNSN, CNTF, COA-1/m, COCH, COD2, COD1, COH1, COL10A, COL2A2, COL11A2, COL17A1, COL1A1, COL1A2, COL2A1, COL3A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL4A6, COL5A1, COL5A2, COL6A1, COL6A2, COL6A3, COL7A1, COL8A2, COL9A2, COL9A3, COL11A1, COL1A2, COL23A1, COL1A1, COLQ, COMP, COMT, CORD5, CORD1, COX10, COX-2, CP, CPB2, CPO, CPP, CPS1, CPT2, CPT1A, CPX, CRAT, CRB1, CRBM, CREBBP, CRH, CRHBP, CRS, CRV, CRX, CRYAB, CRYBA1, CRYBB2, CRYGA, CRYGC, CRYGD, CSA, CSE, CSF1R, CSF2RA, CSF2RB, CSF3R, CSF1R, CST3, CSTB, CT, CT7, CT-9/BRD6, CTAA1, CTACK, CTEN, CTH, CTHM, CTLA4, CTM, CTNNB1, CTNS, CTPA, CTSB, CTSC, CTSK, CTSL, CTS1, CUBN, CVD1, CX3CL1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CYB5, CYBA, CYBB, CYBB5; , CYFRA 21-1, CYLD, CYLD1, CYMD, CYP11B1, CYP11B2, CYP17, CYP17A1, CYP19, CYP19A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP21A2, CYP27A1, CYP27B1, CYP2A6, CYP2C, CYP2C19, CYP2C9, CYP2D, CYP2D6, CYP2D7P1, CYP3A4, CYP7B1, CYPB1, CYP11B1, CYP1A1, CYP1B1, CYRAA, D40, DADI, DAM, DAM10/MAGE-B1, DAM-6/MAGE-B2, DAX1, DAZ, DBA, DBH, DBI, DBT, DCC, DC-cK1, DCK, DCR, DCX, DDB 1, DDB2, DDIT3, DDU, DECR1, DEK-cAN, DEM, DES, DF.DFN2, DFN4, DFN6, DFNA4, DFNA5, DFNB5, DGCR, DHCR7, DHFR, DHOF, DHS, DIA1, DIAPH2, DIAPH1, DIH1, DIO1, DISCI, DKC1, DLAT, DLD, DLL3, DLX3, DMBT1, DMD, DM1, DMPK, DMWD, DNAI1, DNASE1, DNMT3B, DPEP1, DPYD, DPYS, DRD2, DRD4, DRPLA, DSCR1, DSG1, DSP, DSPP, DSS, DTDP2, DTR, DURS1, DWS, DYS, DYSF, DYT2, DYT3, DYT4, DYT2, DYT1, DYX1, EBAF, EBM, EBNA, EBP, EBR3, EBS1, ECA1, ECB2, ECE1, ECGF1, ECT, ED2, ED4, EDA, EDAR,
ECA1, EDN3, EDNRB, EEC1, EEF1A1L14, EEGV1, EFEMP1, EFTUD2/m, EGFR, EGFR/Herí, EGI, EGR2, EIF2AK3, elF4G, EKV, El IS, ELA2, ELF2, ELF2M, ELK1, ELN, ELONG, EMD, EML1, EMMPRIN, EMX2, ENA-78, ΕΝ AM, END3, ENG, ENO1, ENPP1, ENUR2, ENUR1, EOS, EP300, EPB41, EPB42, EPCAM, EPD, EphA1, EphA2, EphA3, EphrinA2, EphrinA3, EPHX1, EPM2A, EPO.EPOR, EPX, ERBB2, ERCC2 ERCC3,ERCC4, ERCC5, ERCC6, ERVR, ESR1, ETFA, ETFB, ETFDH, ETM1, ETV6-aML1, ETV1, EVC, EVR2, EVR1, EWSR1, EXT2, EXT3, EXT1, EYA1, EYCL2, EYCL3, EYCL1, EZH2, F10, F11, F12, F13A1, F13B, F2, F5, F5F8D, F7, F8, F8C, F9, FABP2, FACL6, FAH, FANÇA, FANCB, FANCC, FANCD2, FANCF, FasL, FBN2, FBN1, FBP1, FCG3RA,FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCHL, FCMD, FCP1, FDPSL5, FECH, FEO, FEOM1, FES, FGA, FGB, FGD1, FGF2, FGF23, FGF5, FGFR2, FGFR3, FGFRÍ, FGG, FGS1, FH, FIC1, FIH, F2, FKBP6, FLNA, FLT4, FMO3.FMO4, FMR2, FMR1, FN, FN1/m, FOXC1, FOXE1, FOXL2, FOXO1A, FPDMM, FPF, Fra-1, FRAXF, FRDA, FSHB, FSHMD1A, FSHR, FTH1, FTHL17, FTL, FTZF1, FUCA1, FUT2, FUT6, FUT1, FY, G250, G250/CAIX, G6PC, G6PD, G6PT1, G6PT2, GAA, GABRA3, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GALC, GALE, GALK1, GALNS, GALT, GAMT, GAN, GAST, GASTRIN17, GATA3, GATA, GBA, GBE, GC, GCDH, GCGR, GCH1, GCK, GCP-2, GCS1, G-cSF, GCSH, GCSL, GCY, GDEP.GDF5, GDI1, GDNF, GDXY, GFAP, GFND, GGCX, GGT1, GH2, GH1, GHR, GHRHR, GHS/GIF, GINGF, GIP, GJA3, GJA8, GJB2, GJB3, GJB6, GJB1, GK, GLA, GLB, GLB1, GLC3B, GLC1B, GLC1C, GLDC, GLI3, GLP1, GLRA1, GLUD1, GM1 (fuc-GM1), GM2A, GM-cSF, GMPR, GNAI2, GNAS, GNAT1, GNB3, GNE, GNPTA, GNRH, GNRH1, GNRHR, GNS, GnT-V, gp100, GP1BA, GP1BB, GP9, GPC3, GPD2, GPDS1, GPI, GP1BA, GPN1LW, GPNMB/m, GPSC, GPX1, GRHPR, GRK1, GRO, GRO, GRO, GRPR, GSE, GSM1, GSN, GSR, GSS, GTD, GTS, GUCA1A, GUCY2D, GULOP, GUSB, GUSM, GUST, GYPA, GYPC, GYS1, GYS2, H0KPP2, H0MG2, HADHA, HADHB, HAGE, HAGH, HAL, HAST-2, HB 1, HBA2, HBA1, HBB, HBBP1, HBD, HBE1, HBG2, HBG1, HBHR, HBP1, HBQ1, HBZ, HBZP, HCA, HCC-1, HCC-4, HCF2,
HCG, HCL2, HCL1, HCR, HCVS, HD, HPN, HER2, HER2/NEU, HER3, HERV-K-mEL, HESX1, HEXA, HEXB, HF1, HFE, HF1, HGD, HHC2, HHC3, HHG, HK1 HLA-a, HLA-a*0201-R170l, HLA-all/m, HLA-a2/m, HLA-dPB1 HLA-dRA, HLCS, HLXB9, HMBS, HMGA2, HMGCL, HMI, HMN2, HMOX1, HMS1 HMW-mAA, HND, KNE, HNF4A, HOAC, HOMEOBOX NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HOXA1 HOXD13, HP, HPC1, HPD, HPE2, HPE1, HPFH, HPFH2, HPRT1, HPS1, HPT, HPV-E6, HPV-E7, HR, HRAS, HRD, HRG, HRPT2, HRPT1, HRX, HSD11B2, HSD17B3, HSD17B4, HSD3B2, HSD3B3, HSN1, HSP70-2M, HSPG2, HST-2, HTC2, HTC1, hTERT, HTN3, HTR2C, HVBS6, HVBS1, HVEC, HV1S, HYAL1, HYR, I-309, IAB, IBGC1, IBM2, ICAM1, ICAM3, iCE, ICHQ, ICR5, ICR1, ICS 1, IDDM2, IDDM1, IDS, IDUA, IF, IFNa/b, IFNGR1, IGAD1, IGER, IGF-1R, IGF2R, IGF1, IGH, IGHC, IGHG2, IGHG1, IGHM, IGHR, IGKC, IHG1, IHH, IKBKG, IL1, IL-1 RA, IL10, IL-11, IL12, IL12RB1, IL13, IL-13Ra2, IL-15, IL-16, IL-17, IL18, IL-1 a, IL-1 a, IL-1b, IL-Ιβ, IL1RAPL1, IL2, IL24, IL-2R, IL2RA, IL2RG, IL3, IL3RA.IL4, IL4RJL4R, IL-5, IL6, IL-7, IL7R, IL-8, IL-9, receptor de laminina imaturo, IMMP2L, INDX, INFGR1, INFGR2, INFa, IFNp, INFy, INS, INSR, INVS, IP-10, IP2, IPF1, IP1, IRF6, IRS1, ISCW, ÍTGA2, ITGA2B, ITGA6, ITGA7, ITGB2, ITGB3, ITGB4, ITIH1, ITM2B, IV, IVD, JAG1, JAK3, JBS, JBTS1, JMS, JPD, KAL1, KAL2, KALI, KLK2, KLK4, KCNA1, KCNE2, KCNE1, KCNH2, KCNJ1, KCNJ2, KCNJ1, KCNQ2, KCNQ3, KCNQ4, KCNQ1, KCS, KERA, KFM, KFS, KFSD, KHK, ki-67, KIAA0020, KIAA0205, KIAA0205/m, KIF1B, KIT, KK-LC-1, KLK3, KLKB1, KM-HN-1, KMS, KNG, KNO, K-RAS/m, KRAS2, KREV1, KRT1, KRT10, KRT12, KRT13, KRT14, KRT14L1, KRT14L2, KRT14L3, KRT16, KRT16L1, KRT16L2, KRT17, KRT18, KRT2A, KRT3, KRT4, KRT5, KRT6 A, KRT6B, KRT9, KRTHB1, KRTHB6, KRT1, KSA, KSS, KWE, KYNU, L0H19CR1, L1CAM, LAGE, LAGE-1, LALL, LAMA2, LAMA3, LAMB3, LAMB1, LAMC2, LAMP2, LAP, LCA5, LCAT, LCCS, LCCS 1, LCFS2, LCS1, LCT, LDHA, LDHB, LDHC, LDLR, LDLR/FUT, LEP, LEWISY, LGCR, LGGF-PBP, LGI1, LGMD2H, LGMD1A, LGMD1B, LHB, LHCGR, LHON, LHRH, LHX3, LIF, LIGt, LIMM, LIMP2, LlPA, LIPA, LIPB, LIPC, LIVIN, L1CAM, LMAN1, LMNA, LMX1B, LOLR, LOR,
LOX, LPA, LPL, LPP, LQT4, LRP5, LRS 1, LSFC, LT-β, LTBP2, LTC4S, LYL1, XCL1, LYZ, M344, MA50, MAA, MADH4, MAFD2, MAFD1, MAGE, MAGE-a1, MAGE-a10, MAGE-a12, MAGE-a2, MAGE-a3, MAGE-a4, MAGEa6, MAGE-a9, MAGEB1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-cl, MAGE-C2, MAGEc3, MAGE-cH, MAGE-d2, MAGE-d4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-f1,MAGEH1, MAGEL2, MGB1, MGB2, MAN2A1, MAN2B1, MANBA, MANBB, MAOA, MAOB, MAPK8IP1, MAPT, MART-1, MART-2, MART2/m, MAT1A, MBL2, MBP, MBS1, MC1R, MC2R, MC4R, MCC, MCCC2, MCCC1, MCDR1, MCF2, MCKD, MCL1, MC1R, MCOLN1, MCOP, MCOR, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCPH2, MCPH1, MCS, M-cSF, MDB, MDCR, MDM2, MDRV, MDS 1, ME1, ME1/m, ME2, ME20, ME3, MEAX, MEB, MEC CCL-28, MECP2, MEFV, MELANA, MELAS, MEN1 MSLN, MET, MF4, MG50, MG50/PXDN, MGAT2, MGAT5, MGC1 MGCR, MGCT, MGI, MGP, MHC2TA, MHS2, MHS4, MIC2, MIC5, MIDI, MIF, MIP, MIP-5/HCC-2, MITF, MJD, MKI67, MKKS, MKS1, MLH1, MLL, MLLT2, MLLT3, MLLT7, MLLT1, MLS, MLYCD, MMA1a, MMP 11, MMVP1, MN/CA IX-antígeno, MNG1, MN1, MOC31, MOCS2, MOCS1, MOG, MORC, MOS, MOV18, MPD1, MPE, MPFD, MPI, MPIF-1, MPL, MPO, MPS3C, MPZ, MRE11A, MROS, MRP1, MRP2, MRP3, MRSD, MRX14, MRX2, MRX20, MRX3, MRX40, MRXA, MRX1, MS, MS4A2, MSD, MSH2, MSH3, MSH6, MSS, MSSE, MSX2, MSX1, MTATP6, MTC03, MTCO1, MTCYB, MTHFR, MTM1, MTMR2, MTND2, MTND4, MTND5, MTND6, MTND1, MTP, MTR, MTRNR2, MTRNR1, MTRR.MTTE, MTTG, MTTI, MTTK, MTTL2, MTTL1, MTTN, MTTP, MTTSÍ, MUC1,MUC2, MUC4, MUC5AC, MUM-1, MUM-1/m, MUM-2, MUM2/m, MUM-3, MUM-3/m, MÜT, p21 ras mutante, MUTYH, MVK, MX2, MXI1, MY05A, MYB, MYBPC3, MYC, MYCL2, MYH6, MYH7, MYL2, MYL3, MYMY, MYO15A, MYO1G, MYO5A, MYO7A, MYOC, Miosina/m, MYP2, MYP1, NA88-a, N-acetilglicosaminiltransferase-V, NAGA, NAGLU, NAMSD, NAPB, NAT2, NAT, NBIA1, NBS1, NCAM, NCF2, NCF1, NDN , NDP, NDUFS4, NDUFS7, NDUFS8, NDUFV1, NDUFV2, NEB, NEFH, NEM1, Neo-PAP, neoPAP/m, NEU1, NEUROD1, NF2, NF1, NFYC/m, NGEP, NHS, NKS1,
ΝΚΧ2Ε, ΝΜ, ΝΜΕ1, ΝΜΡ22, NMTC, NODAL, NOG, NOS3, NOTCH3, NOTCH1, NP, NPC2, NPC1, NPHL2, NPHP1, NPHS2, NPHS1, NPM/ALK, NPPA, NQO1, NR2E3, NR3C1, NR3C2, NRAS, NRAS/m, NRL, NROB1, NRTN, NSE, NSX, NTRK1, NUMA1, NXF2, NY-cO1, NY-ESO1, NY-ESO-B, NY-LU5 12, ALDOA, NYS2, NYS4, NY-SAR-35, NYS1, NYX, ÕA3, OA1, OAP, OASD, OAT, OCA1, OCA2, OCD1, OCRL, OCRL1, OCT, ODDD, ODT1, OFC1, OFD1, OGDH, OGT, OGT/m, OPA2, OPA1, OPD1, OPEM, OPG, OPN, OPN1LW, 0PN1MW, OPN1SW, OPPG, OPTB1, TTD, ORM1, ORP1, OS-9, 0S-9/m, OSM LIF, OTC, OTOF, OTSC1, OXCT1, OYTES1, P15,
P190 MINOR BCR-aBL, P2RY12, P3, P16, P40, P4HB, P-501, P53, P53/m,
P97, PABPN1, PAFAH1B1, PAFAH1P1, PAGE-4, PAGE-5, PAH, PAI-1, PAI2, PAK3, PAP, PAPPA, PARK2, PART-1, PATE, PAX2, PAX3, PAX6, PAX7, PAX8, PAX9, PBCA, PBCRA1, PBT, PBX1, PBXP1, PC, PCBD, PCCA, PCCB, PCK2, PCK1, PCLD, PCOS1, PCSK1, PDB1, PDCN, PDE6A,
PDE6B, PDEF, PDGFB, PDGFR, PDGFRL, PDHA1, PDR, PDX1, PECAM1, PEE1, PEO1, PEPD, PEX10, PEX12, PEX13, PEX3, PEX5, PEX6, PEX7, PEX1, PF4, PFBI, PFC, PFKFB1, PFKM, PGAM2, PGD, PGK1, PGK1PÍ, PGL2, PGR, PGS, PHA2A, PHB, PHEX, PHGDH, PHKA2, PHKA1, PHKB, PHKG2, PHP, PHYH, PI, PI3, PIGA, PIM1-KINASE, PIN1, PIP5K1B, PITX2,
PITX3, PKD2, PKD3, PKD1, PKDTS, PKHD1, PKLR, PKP1, PKU1, PLA2G2A, PLA2G7, PLAT, PLEC1, PLG, PLI, PLOD, PLP1, PMEL17, PML, PML/RARa, PMM2, PMP22, PMS2, PMS1, PNKD, PNLIP, POF1, POLA, POLH, POMC, PON2, PONT, PORC, POTE, POU1F1, POU3F4, POU4F3, POU1F1, PPAC, PPARG, PPCD, PPGB, PPH1, PPKB, PPMX, PPOX,
PPP1R3A, PPP2R2B, PPT1, PRAME, PRB, PRB3, PRCA1, PRCC, PRD, PRDX5/m, PRF1, PRG4, PRKAR1A, PRKCA, PRKDC, PRKWNK4, PRNP, PROC, PRODH, PROM1, PROP1, PROS1, PRST, PRP8, PRPF31, PRPF8, PRPH2, PRPS2, PRPS1, PRS, PRSS7, PRSS1, PRTN3, PRX, PSA, PSAP, PSCA, PSEN2, PSEN1, PSG1, PSGR, PSM, PSMA, PSORS1, PTC, PTCH,
PTCH1, PTCH2, PTEN, PTGS1, PTH, PTHR1, PTLAH, PTOS1, PTPN12, PTPNI I, PTPRK, PTPRK/m, PTS, PUJO, PVR, PVRL1, PWCR, PXE, PXMP3, PXR1, PYGL, PYGM, QDPR, RAB27A, RAD54B, RAD54L, RAG2,
RAGE, RAGE-1, RAG1, RAP1, RARA, RASA1, RBAF600/m, RB1, RBP4, RBP4, RBS, RCA1, RCAS1, RCCP2, RCD1, RCV1, RDH5, RDPA, RDS, RECQL2, RECQL3, RECQL4, REG1A, REHOBE, REN, RENBP, RENS1, RET, RFX5, RFXANK, RFXAP, RGR, RHAG, RHAMM/CD168, RHD, RHO, Rip-1, RLBP1, RLN2, RLN1, RLS, RMD1, RMRP, ROM1, ROR2, RP, RP1, RP14, RP17, RP2, RP6, RP9, RPD1, RPE65, RPGR, RPGRIP1, RP1, RP10, RPS19, RPS2, RPS4X, RPS4Y, RPS6KA3, RRAS2, RS1, RSN, RSS, RU1, RU2, RUNX2,RUNXI, RWS, RYR1, S-100, SAA1, SACS, SAG, SAGE, SALL1, SARDH, SART1, SART2 , SART3, SAS, SAX1, SCA2, SCA4, SCA5, SCA7, SCA8, SCA1, SCC, SCCD, SCF, SCLC1, SCN1A, SCN1B, SCN4A, SCN5A, SCNN1A, SCNN1B, SCNN1G, SCO2, SCP1, SCZD2, SCZD3, SCZD4, SCZD6, SCZD1, SDF-Ια/β SDHA, SDHD, SDYS, SEDL, SERPENA7, SERPINA3, SERPINA6, SERPINA1, SERPINC1, SERPIND1, SERPINE1, SERPINF2, SERPING1, SERPINI1, SFTPA1, SFTPB, SFTPC, SFTPD, SGCA, SGCB, SGCD, SGCE, SGM1, SGSH, SGY-1, SH2D1A, SHBG, SHFM2, SHFM3, SHFM1, SHH, SHOX, SI, SIAL, SIALYL LEWISX , SIASD, S11, SIM1, SIRT2/m, SIX3, SJS1, SKP2, SLC10A2, SLC12A1, SLC12A3, SLC17A5, SLC19A2, SLC22A1L, SLC22A5, SLC25A13, SLC25A15, SLC25A20, SLG25A4, SLC25A5, SLC25A6, SLC26A2, SLC26A3, SLG26A4, SLC2A1, SLC2A2, SLC2A4, SLC3A1, SLC4A1, SLC4A4, SLC5A1, SLC5A5, SLC6A2, SLC6A3, SLC6A4, SLC7A7, SLC7A9, SLC11A1, SLOS, SMA, SMAD1, SMAL, SMARCB1, SMAX2, SMCR, SMCY, SM1, SMN2, SMN1, SMPD1, SNCA, SNRPN, SOD2, SOD3, SOD1, SOS1, SOST, SOX9, SOX10, Sp17, SPANXC, SPG23, SPG3A, SPG4, SPG5A, SPG5B, SPG6, SPG7, SPINK1, SPINK5, SPPK, SPPM, SPSMA, SPTA1, SPTB, SPTLC1, SRC, SRD5A2, SRPX, SRS, SRY, BhCG, SSTR2, SSX1, SSX2 (HOM-mEL40/SSX2), SSX4, ST8, STAMP-1, STAR, STARP1, STATH, STEAP, STK2, STK11, STn/ KLH, STO, STOM, STS, SUOX, SURF1, SURVIVIN-2B, SYCP1, SYM1, SYN1, SYNS1, SYP, SYT/SSX, SYT-SSX-1, SYT-SSX 2, TA-90, TAAL6, TACSTD1, TACSTD2, TAG72, TAF7L, TAF1, TAGE, TAG72, TALI, ΤΑΜ, TAP2, TAP1, TAPVR1, TARC, TARP, TAT, TAZ, TBP, TBX22, TBX3, TBX5, TBXA2R, TBXAS1, TCAP, TCF2, TCF1, TCIRG1, T39
CL2, TCL4, TCL1A, TCN2, TCOF1, TCR, TCRA, TDD, TDFA, TDRD1, TECK, TECTA, TEK, TEL/AML1, TELAB1, TEX15, TF, TFAP2B, TFE3, TFR2, TG, TGFa, TGFp, TGFpl, TGFpl, TGFPR2, TGFpRE, TGFy, TGFpRIl, TGIF, TGM-4, TGM1, TH, THAS, THBD, THC, THC2, THM, THPO, THRA, THRB, TIMM8A, TIMP2, TIMP3, TIMP1, TITF1, TKCR, TKT, TLP, TLR1, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLX1, TM4SF1, TM4SF2, TMC1, TMD, TMIP, TNDM, TNF, TNFRSF11A, TNFRSF1A, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, TNFa, TNFp, TNNI3, TNNT2, TOC, TOP2A, TOP1, TP53, TP63, TPA, TPBG, TPI, TPI/m, TPI1, TPM3, TPM1, TPMT, TPO, TPS, TPTA, TRA, TRAG3, TRAPPC2, TRC8, TREH, TRG, TRH, TRIM32, TRIM37, TRP1, TRP2, TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, TRPS1, TS, TSC2, TSC3, TSC1, TSG101, TSHB, TSHR, TSP-180, TST, TTGA2B, TTN, TTPA, TTR, TU M2-PK, TULP1, TWIST, TYH, TYR, TYROBP, TYROBP, TYRP1, TYS, UBE2A, UBE3A, UBE1, UCHL1, UFS, UGT1A, ULR, UMPK, UMPS, UOX, UPA, UQCRC1, URO5, UROD, UPK1B, UROS, USH2A, USH3A, USH1A, USH1C, USP9Y, UV24, VBCH, VCF, VDI, VDR, VEGF, VEGFR-2, VEGFR-1, VEGFR-2/FLK-1, VHL, VIM, VMD2, VMD1, VMGLOM, VNEZ, VNF, VP, VRNI, VWF, VWS, WAS, WBS2, WFS2, WFS1, WHCR, WHN, WISP3, WMS, WRN, WS2A, WS2B, WSN, WSS, WT2, WT3/WT1, WTS, WWS, XAGE, XDH, XIC, XIST, XK, XM, XPA, XPC, XRCC9, XS, ZAP70, ZFHXÍB, ZFX, ZFY, ZIC2, ZIC3, ZNF145, ZNF261, ZNF35, ZNF41, ZNF6, ZNF198, e ZWS1.
Adicionalmente, proteínas terapeuticamente ativas quando codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui podem também ser selecionadas de hormônios de crescimento ou fatores de crescimento, por exemplo para promover crescimento em um ser vivo (transgênico), tal como, por exemplo, TGFa e os IGFs (fatores de crescimento semelhantes à insulina), proteínas que influenciam o metabolismo e/ou haematopoiese, tal como, por exemplo, α-anti-tripsina, receptor de LDL, eritropoietina (EPO), insulina, GATA-1, etc., ou proteínas tais como, por exemplo, fatores VIII e XI do sistema de coagulação de sangue, etc. Tais proteínas também incluem enzimas, tais como, por exemplo, β-galactosidase (lacZ), enzimas de restrição de DNA (por exemplo, EcoRI, Hindlll, etc.), lisozimas, etc., ou proteases, tais como, por exemplo, papaína, bromelaína, ceratinases, tripsina, quimiotripsina, pepsina, renina (quimosina), suizima, nortase, etc. Estas proteínas podem ser codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui. Consequentemente, a invenção fornece uma tecnologia que permite substituir proteínas que são defeituosas no organismo a ser tratado (por exemplo, ou devido a mutações, devido a expressão defeituosa ou perdida) e assim expressão eficaz e aumentada das proteínas, que não são funcionais no organismo a ser tratado como por exemplo ocorrendo em distúrbios monogenéticos, preferivelmente sem conduzir a uma resposta imune inata.
Alternativamente, proteínas terapeuticamente ativas quando codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui podem também ser selecionadas de proteases etc. que permite curar uma doença específica devido, por exemplo, à (supra)expressão de umas proteínas disfuncionais ou exógenas que causam distúrbios ou doenças. Consequentemente, a invenção pode ser usada para terapeuticamente introduzir o RNA complexado dentro do organismo, que ataca um organismo patogênico (vírus, bactérias etc). Por exemplo RNA que codifica proteases terapêuticas pode ser usado para clivar proteínas virais que são essenciais ao conjunto viral ou outras etapas essenciais da produção do vírus.
Proteínas terapeuticamente ativas quando codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui podem também ser selecionadas de proteínas que modulam as várias vias intracelulares por exemplo mediante modulação da transmissão do sinal (inibição ou estimulação) que pode influenciar os processos intracelulares pivotantes como apoptose, crescimento celular, etc, em particular com respeito ao sistema imune do organismo. Consequentemente, moduladores imunes, por exemplo citocinas, linfocinas, monocinas, interferonas etc. podem ser expressados eficientemente pelo RNA complexado como definido aqui. Preferivelmente, estas proteínas portanto também incluem, por exemplo, citocinas da classe I da família de citocina contendo 4 resíduos de cisteína conserva41 dos posição-específicos (CCCC) e um motivo de sequência conservada TrpSer-X-Trp-Ser (WSXWS), em que X representa um aminoácido nãoconservado. Citocinas da classe I da família de citocina incluem a subfamília de GM-cSF, por exemplo IL-3, IL-5, GM-cSF, a subfamília de IL-6, por exemplo IL-6, IL-11, IL-12, ou a subfamília de IL-2, por exemplo IL-2, IL-4, IL7, IL-9, IL-15, etc., ou as citocinas IL-1 a, 1L-1 β, IL-10 etc. Por analogia, tais proteínas podem também incluir citocinas da classe II da família de citocina (a família de receptor de interferona) que igualmente contém 4 resíduos de cisteína conservados posição-específicos (CCCC) mas nenhum motivo da sequência conservada Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS). Citocinas da classe II da família de citocina incluem, por exemplo, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, etc. Proteínas codificadas por pelo menos um (m)RNA modificado (da composição imunossupressoía inventiva) usado de acordo com a invenção podem também incluir outras citocinas da família de necrose tumoral, por exemplo TNFa, TNF-β, TNF-RI, TNF-RII, CD40, Fas, etc., ou citocinas da família de quimocina contendo 7 hélices de transmembrana e interagem com a proteína G, por exemplo IL-8, MIP-1, RANTES, CCR5, CXR4, etc. Tais proteínas podem ser também selecionadas de fatores de apoptose ou proteínas relacionadas ou ligadas à apoptose, incluindo AIF, Apaf, por exemplo Apaf-1, Apaf2, Apaf-3, ou APO-2 (L), APO-3 (L), apopaína, Bad, Bak, Bax, Bcl-2, BcI-xl, Bcl-xs, bik, CAD, calpaína, caspases, por exemplo caspase-1, caspase-2, caspase-3, caspase-4, caspase-5, caspase-6, caspase-7, caspase-8, caspase-9, caspase-10, caspase-11, ced-3, ced-9, c-Jun, c-myc, crm A, citocromo C, CdR1, DcR1, DD, DED, DISC, DNA-PKCS, DR3, DR4, DR5, FADD/MORT-1, FAK, Fas (ligante de Fas CD95/fas (receptor)), FLICE/MACH, FLIP, fodrina, fos, G-actina, Gás-2, gelsolina, granziomas A/B, ICAD, ICE, JNK, lâmina A/B, MAP, MCL-1, Mdm-2, MEKK-1, MORT-1, NEDD, NF-κΒ, NuMa, p53, PAK-2, PARP, perforina, PITSLRE, PKCõ, pRb, presenilina, prICE, RAIDD, Ras, RIP, esfingomielinase, timidina quinase do herpes simples, TRADD, TRAF2, TRAIL, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, transglutaminase, etc.
Adicionalmente, proteínas terapeuticamente ativas quando codi42 ficadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui podem também codificar para receptores de célula T antígenoespecíficos. O receptor de célula T ou TCR é uma molécula encontrada na superfície dos linfócitos T (ou células T) que são em geral responsáveis por reconhecer antígenos ligados às moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). É um heterodímero que consiste em uma cadeia alfa e beta em 95% de células T, enquanto 5% das células T têm TCRs que consiste em cadeias gama e delta. Encaixe do TCR com o antígeno e o MHC resulta na ativação de seu linfócito T através de uma série de eventos bioquímicos mediados por enzimas associadas, correceptores e moléculas acessórias especializadas. Consequentemente, estas proteínas permitem especificamente alvejar antígeno específico e podem suportar a funcionalidade do sistema imune devido às suas propriedades de alvejamento. Consequentemente, a transfecção de células in vivo administrando o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui codificando para estes receptores ou, preferivelmente, uma abordagem de transfecção celular ex vivo (por exemplo, especificamente transfeccionando certas células imunes), pode ser buscada. As moléculas de receptor de célula T introduzidas reconhecem os antígenos específicos na molécula de MHC e podem assim suportar a consciência do sistema imune dos antígenos a serem atacados.
As proteínas terapeuticamente ativas, que podem ser codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui, podem além disso compreender uma proteína adjuvante. Neste contexto, uma proteína adjuvante é preferivelmente para ser entendido como qualquer proteína que seja capaz de suscitar uma resposta imune inata como definido aqui. Preferivelmente, uma tal resposta imune inata compreende uma ativação de um receptor de reconhecimento padrão, tal como por exemplo um receptor selecionado da família de receptor semelhante a Toll (TLR), incluindo por exemplo um receptor semelhante a Toll selecionado de TLR1 a TLR10 humanos ou receptor semelhante a Toll de TLR1 a TLR13 murinos. Preferivelmente, uma resposta imune inata é suscitada em um mamífero, mais preferivelmente em um ser humano. Preferivelmente, a pro43 teína adjuvante é selecionada de proteínas adjuvantes humanas ou de proteínas adjuvantes patogênicas, em particular de proteínas adjuvantes bacterianas. Além disso, mRNA que codifica proteínas humanas envolvidas em efeitos adjuvantes pode ser usado também.
Proteínas adjuvantes humanas, que podem ser codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui, tipicamente compreendem qualquer proteína humana que seja capaz de suscitar uma resposta imune inata (em um mamífero), por exemplo como uma reação da ligação de um ligante de TLR exógeno a um TLR. Mais preferivelmente, proteínas adjuvantes humanas, que podem ser codificadas pelo RNA complexado da presente invenção, são selecionadas do grupo que consiste em, sem serem limitadas a este, citocinas que induzem ou intensificam uma resposta imune inata, incluindo IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL21CCL21, GM-cSF e TNF-alfa; citocinas que são liberadas de macrófagos, incluindo IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 e TNF-alfa; de componentes do sistema de complemento incluindo C1q, MBL, C1r, C1s, C2b, Bb, D, MASP-1, MASP-2, C4b, C3b, C5a, C3a, C4a, C5b, C6, C7, C8, C9, CR1, CR2, CR3, CR4, C1qR, C1INH, C4bp, MCP, DAF, Η, I, P e CD59; de proteínas que são componentes das redes de sinalização dos receptores de reconhecimento padrões incluindo TLR e IL-1R1, enquanto que os componentes são ligantes dos receptores de reconhecimento padrões incluindo IL-1 alfa, IL-1 beta, Beta-defensina, proteínas de choque térmico, tais como HSP10, HSP60, HSP65, HSP70, HSP75 e HSP90, gp96, Fibrinogênio, domínio A extra de repetição de Typlll da fibronectina; os receptores, incluindo IL-1 RI, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11; os transdutores de sinal incluindo componentes de sinalização de GTPases pequenas (RhoA, Ras, Rac1, Cdc42 etc.), componentes de sinalização de PIP (PI3K, Src-quinases, etc.), componentes de sinalização MyD88dependente (MyD88, IRAK1, IRAK2, etc.), componentes de sinalização MyD88-independente (TICAM1, TICAM2 etc.); fatores de transcrição ativados incluindo por exemplo NF-κΒ, c-fos, c-Jun, c-myc; e genes alvos induzidos incluindo por exemplo IL-1 alfa, IL-1 beta, Beta-defensina, IL-6, IFN ga44 ma, IFN alfa e IFN beta; de moléculas coestimuladoras, incluindo ligante de CD28 ou CD40 ou PD1; domínios de proteína, incluindo LAMP; proteínas da superfície da célula; ou proteínas adjuvantes humanas incluindo CD80, CD81, CD86, trif, ligante de flt-3, timopentina, Gp96 ou fibronectina, etc., ou qualquer homólogo de espécies de qualquer um das proteínas adjuvantes humanas acima.
Proteínas adjuvantes patogênicas, que podem ser codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui, tipicamente compreendem qualquer proteína patogênica (adjuvante) que seja capaz de suscitar uma resposta imune inata (em um mamífero), mais preferivelmente selecionadas de proteínas patogênicas (adjuvantes) derivadas de bactérias, protozoários, vírus, ou fungos, animais, etc., e até mesmo mais preferivelmente de proteínas adjuvantes patogênicas selecionadas do grupo que consiste em, sem serem limitadas a este, proteínas bacterianas, proteínas protozoárias (por exemplo, proteína semelhante à profilina de Toxoplasma gondii), proteínas virais, ou proteínas fúngicas, proteínas animais, etc.
Neste contexto, proteínas bacterianas (adjuvantes), que podem ser codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui, podem compreender qualquer proteína bacteriana que seja capaz de suscitar uma resposta imune inata (preferivelmente em um mamífero). Mais preferivelmente, as proteínas bacterianas (adjuvantes) que podem ser codificadas pelo RNA complexado podem compreender proteínas adjuvantes bacterianas selecionadas do grupo que consiste em, sem serem limitadas a este, flagelinas bacterianas, incluindo Agrobacterium, Aquifex, Azospirillum, Bacillus, Bartonella, Bordetella, Borrelia, Burkholderia, Campylobacter, Caulobacte, Clostrídium, Escherichia, Helicobacter, Lachnospiraceae, Legionella, Listeria, Proteus, Pseudomonas, Rhizobium, fíhodobacter, Roseburía, Salmonella, Serpulina, Serratia, Shigella, Treponema, Vibrio, Wo30 linella, Yersinia, mais preferivelmente flagelinas das espécies, sem serem limitadas a estas, Agrobacterium tumefaciens, Aquifex pyrophilus, Azospirillum brasilense, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bartonella bacillifor45 mis, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Caulobacter crescentus, clone 1 da cepa Bennett de Clostridium botulinum, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Lachnospiraceae bacterium, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeroguinosa, Pseudomonas syringae, fíhizobium meliloti, Rhodobacter sphaeroides, fíoseburia cecicola, Roseburis hominis, Salmonella typhimurium, Salmonella bongori, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Serpulina hyodysenteriae, Serratia marcescens, Shigella boydii, Treponema phagedenis, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Wolinella succinogenes e Yersinia enterocolitica.
Flagelinas bacterianas, que podem ser codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado Como definido aqui, são particularmente preferidas e podem ser selecionadas de qualquer flagelina bacteriana que mostre caráter adjuvante, mais preferivelmente de flagelinas bacterianas selecionadas do grupo que consiste em proteínas de choque térmico bacterianas ou chaperonas, incluindo Hsp60, Hsp70, Hsp90, HsplOO; OmpA (proteína de membrana externa) de bactérias gram-negativas; porinas bacterianas, incluindo OmpF; toxinas bacterianas, incluindo toxina da coqueluche (PT) de Bordetella pertussis, toxina CyaA e CyaC da adenilato ciclase de coqueluche de Bordetella pertussis, mutante de PT-9K/129G da toxina da coqueluche, toxina CyaA e CyaC da adenilato ciclase de coqueluche de Bordetella pertussis, toxina do tétano, toxina da cólera (CT), toxina da cólera subunidade B, toxina da cólera de muante de CTK63, mutante da CT de CTE112K, enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LT), subunidade B da enterotoxina termolábil (LTB) mutantes da enterotoxina termolábil de Escherichia coli com toxicidade reduzida, incluindo LTK63, LTR72; modulina solúvel em fenoí; proteína de ativação dos neutrófilos (HP-NAP) de Helicobacter pylori-, proteína de Tensoativo D; lipoproteína da proteína de superfície externa A de Borrelia burgdorferi, Ag38 (antígeno de 38 kDa) de Mycobacterium tuberculosis-, proteínas de fímbrias bacterianas; Enterotoxina CT de Vibrio cholerae, Pilina de pêlos das bactérias gram-negativas, e proteína de Tensoativo A; etc., ou qualquer homólogo das espécies de qualquer uma das proteínas bacterianas (adjuvantes) acima.
Flagelinas bacterianas, que podem ser codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui, até mesmo mais preferivelmente compreendem uma sequência selecionada do grupo que compreende quaisquer das sequências a seguir como referidas com seus números de acesso:
Organismo Espécies Nome do gene No de acesso No de Gl
Agrobacteríum Agrobacteríum tumefaciens FlaD (flaD) FlhB (flhB) FliG (fliG) FUN (fliN) FliM (fliM) MotA (motA) FlgF (flgF) Flil (flil) FlgB (flgB) FlgC (flgC) FliE (fliE) FlgG (flgG) FlgA (flgA) Flgl(flgl) FlgH (flgH) FliL (f liL) FliP (fliP) FlaA (flaA) FlaB (flaB) FlaC (flaC) U95165 Gl: 14278870
Aquifex Aquifex pyrophilus U17575 G 1:596244
Azospirillum Azospirillum brasilense Laf1 U26679 Gl: 1173509
Bacillus Bacillus subtilis hag AB033501 Gl :14278870
Bacillus Bacillus thuringiensis « X67138 GI:46019718
Bartonella Bartonella bacilliformis L20677 GL304184
Bordetella Bordetella bronchiseptica flaA L13034 G1:289453
Borrelia Borrelia burgdorferi X16833 G1:39356
Burkholderia Burkholderia cepacia fíiC AFO11370 G1:2935154
Campylobac- ter Campylobacter jejuni flaA flaB J05635 GL144197
Caulobacter Caulobacter crescentus J01556 Gl :144239
Clostrídium Clostrídium botulinum strain Bennett clone 1 FlaA DQ845000 Gl: 11405488 6
Escheríchia Escheríchia coli hag M14358 GL146311
AJ 884569 (EMBL- SVA)
Helicobacter Helicobacter pylori flaA X60746 G1:43631
Lachnospira- ceae Lachnospiraceae bacteri- um DQ789131 Gl:11391161 5
Legionella Legionella pneumophila flaA X83232 G 1:602877
Listería Listería monocytogenes flaA X65624 G 1:44097
Proteus Proteus mirabilis FlaD (flaD) FlaA (flaA) FlaB (flaB) FliA (fliA) FliZ (fHZ) AF221596 Gl :6959881
Pseudomonas Pseudomonas aeroguinosa flaA M57501 GL151225
Pseudomonas Pseudomonas syringae fliC EF544882 Gl: 14633561 9
fíhizobium Rhizobium flaA M24526 Gl :152220
meliloti flaB
fíhodobacter Rhodobacter sphaeroides fliC AF274346 Gl:10716972
Roseburia . Roseburia cecicola M20983 GI :152535
Roseburia Roseburis hominis Fla2 DQ789141 Gl:11391163 2
Salmonella Salmonella typhimurium D13689 (NCBI ID) G1:217062
Salmonella Salmonella bongori fliC AY603412 Gl:51342390
Salmonella Salmonella typhi flag L21912 GL397810
Salmonella Salmonella enteritidis fliC M84980 GI:154015
Serpulina Serpulina hyodysenterí- ae flaB2 X63513 G1:450669
Serratia Serratia mar- cescens hag M27219 GI :152826
Shigella Shigella boydii fliC-SB D26165 G1:442485
Treponema Treponema phagedenis flaB2 M94015 GI: 155060
Vi brio Vibrio alginolyticus flaA EF125175 G 1:11943439 5
Vibrio s Vibrio parahaemolyticus AF069392 Gl:7327274
Wolinella Wolinella succinogenes flag M82917 GI :155337
Yersinia Yersinia enterocolitica L33467 G1:496295
Proteínas protozoárias, que podem ser codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA. complexado como definido aqui, podem ser selecionadas de qualquer proteína protozoária que mostre caráter adjuvante, mais preferivelmente, do grupo que consiste em, sem serem limitadas a es5 te, Tç52 de Trypanosoma cruzi, PFTG de Trypanosoma gondii, proteínas de choque térmico de Protozoário, LeIF de Leishmania spp., proteína semelhante à profilina de Toxoplasma gondii, etc.
Proteínas virais, que podem ser codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui, podem ser selecionadas de qualquér proteína viral que mostre caráter adjuvante, mais preferivelmente, do grupo que consiste em, sem serem limitadas a este, glicoproteína de fusão do Vírus Sincicial Respiratório (proteína F), proteína do envelope do vírus de MMT, proteína do vírus da leucemia de camundongo, proteína de Hemaglutinina do vírus do sarampo do tipo selvagem, etc.
Proteínas fúngicas, que podem ser codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui, podem ser selecionadas de qualquer proteína fúngica que mostre caráter adjuvante, mais preferivelmente, do grupo que consiste em, sem serem limitadas a este, proteína imunomoduladora fúngica (FIP; LZ-8), etc.
Por fim, proteínas adjuvantes patogênicas que pòdem ser codificadas por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui, podem ser selecionadas, por fim, de qualquer outra proteína patogênica que mostre caráter adjuvante, mais preferivelmente, do grupo que consiste em, sem serem limitadas a este, hemocianina de lapa (KLH), OspA, etc.
O, pelo menos, um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode alternativamente codificar um antígeno. De acordo com a presente invenção, o termo antígeno refere-se a uma substância que é reconhecida pelo sistema imune e é capaz de desencadear uma resposta imune antígeno-específica, por exemplo para a formação de anticorpos. Antígenos podem ser classificados de acordo com sua origem. Consequentemente, há duas classes principais de antígenos: antígenos exógenos e endógenos. Antígenos exógenos são antígenos que entram dentro da célula ou do corpo de fora (da célula ou do corpo), por exemplo por inalação, ingestão ou injeção, etc. Estes antígenos são células de apresentação de antígeno interiorizadas (APCs, tais como células dendríticas ou macrófagos) e processados em fragmentos. APCs depois apresentam os fragmentos às célu50
Ias T auxiliares (por exemplo, CD4+) pelo uso de moléculas de MHC II em sua superfície. Reconhecimento destes fragmentos de antígeno por células T leva à ativação das células T e secreção das citocinas. Citocinas são substâncias que podem ativar a proliferação das células imunes tais como células
T citotóxicas, células B ou macrófagos. Em contraste, antígenos endógenos são antígenos que foram gerados dentro da célula, por exemplo como resultado do metabolismo da célula normal. Fragmentos destes antígenos são apresentados nas moléculas de MHC I na superfície de APCs. Estes antígenos são reconhecidos por células CD8+ T citotóxicas antígeno-específicas ativadas. Após reconhecimento, aquelas células T reagem na secreção de toxinas diferentes causando lise ou apoptose da célula de apresentação de antígeno. Antígenos endógenos compreendem antígenos, por exemplo proteínas ou peptídeos codificados por um ácido nucleico estranho dentro da célula como também proteínas ou peptídeos codificados pela informação genética da própria célula, ou antígenos de vírus de ocorrência intracelular. Uma classe de antígenos endógenos é a classe de antígenos tumorais. Aqueles antígenos são apresentados pelas moléculas de MHC I na superfície das células tumorais. Este classe pode ser dividida também em antígenos tumor-específicos (TSAs) e antígenos associados ao tumor (TAAs). TSAs podem apenas ser apresentados através de células tumorais e nunca através de células normais saudáveis. Eles tipicamente resultam de uma mutação tumor-específica. TAAs, que são mais comuns, são usualmente apresentados por células tumorais e saudáveis. Estes antígenos são reconhecidos e a célula de apresentação de antígeno pode ser destruída por células T citotóxicas. Adicionalmente, antígenos tumorais podem também ocorrer na superfície do tumor na forma de, por exemplo, um receptor mutado. Neste caso, eles podem ser reconhecidos através de anticorpos.
Antígenos, que podem ser codificados por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, podem incluir por e30 xemplo proteínas, peptídeos ou fragmentos dos mesmos. Preferivelmente, antígenos são proteínas e peptídeos ou fragmentos dos mesmos, tais como epítopos daquelas proteínas ou peptídeos. Epítopos (também chamados determinantes de antígeno), tipicamente, são fragmentos localizados na superfície externa de tais estruturas de proteína ou peptídeo antigênicas tendo 5 a 15, preferivelmente 9 a 15, aminoácidos (epítopos de células B e epítopos de células T são tipicamente apresentados nas moléculas de MHC, em que por exemplo MHC-i tipicamente apresenta epítopos com um comprimento de cerca de 9 aa e MHC-il tipicamente apresenta epítopos com um comprimento de cerca de 12-15 aa). Além disso, antígenos codificados por pelo menos um RNA (molécula) do complexo de acordo com a invenção podem também compreender qualquer outra biomolécula, por exemplo, lipí10 dios, carboidratos, etc., que podem ser covalente ou não-covalentemente ligados ao RNA (molécula).
De acordo com a invenção, antígenos, que podem ser codificados por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, podem ser antígenos exógenos ou endógenos. Antígenos endó15 genos compreendem antígenos gerados na célula, especialmente em células degeneradas tais como células tumorais. Estes antígenos são referidos como antígenos tumorais. Preferivelmente, sem serem restringidos a estes, eles ficam localizados na superfície da célula. Além disso, antígenos tumorais significam também antígenos expressos em células que são (foram) não por eles mesmos (ou originalmente não por eles) degenerados mas estão associados ao tumor suposto. Antígenos que são conectados com vasos de provisão de tumor ou (re)formação dos mesmos, em particular aqueles antígenos que são associados à neovascularização, por exemplo fatores de crescimento, tais como VEGF, bFGF etc., são também inclusos aqui. Além disso, antígenos conectados com um tumor incluem antígenos de células ou tecidos, tipicamente envolvendo o tumor. Também, algumas substâncias (usualmente proteínas ou peptídeos) são expressadas em pacientes que sofrem (consciente ou não-conscientemente) de uma doença cancerosa e elas ocorrem em concentrações aumentadas nos fluidos do corpo dos ditos pacientes, por exemplo proteínas que são associadas à invasão e migração das células tumorais. Estas substâncias são também referidas como antígenos tumorais, porém elas não são antígenos no significado rigoroso de uma substância de indução de resposta imune. Uso dos mesmos é também abrangido pelo escopo da presente invenção.
Antígenos, que podem ser codificados por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, podem ser exemplarmente selecionados, sem serem restringidos a estes, por exemplo de qualquer antígeno adequado para o propósito específico, por exemplo de antígenos que são relevantes (ou causais) às doenças de infecção específicas, tais como definidas aqui, de antígenos de câncer tais como antígenos de superfície tumor-específicos, de antígenos expressos em doenças de câncer, de antígenos mutantes expressos em doenças de câncer, ou de antígenos de proteína envolvidos na etiologia de outras doenças, por exemplo doenças autoimunes, alergias, etc. Por exemplo estes antígenos podem ser usados para dessensibilizar um paciente administrando um antígeno causando o estado alérgico ou autoimune do paciente.
(Poli)peptídeos antigênico(s) exemplar(es) preferido(s) codificado(s) por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui incluem todos peptídeos antigênicos conhecidos, por exemplo antígenos tumorais, etc. Exemplos específicos de antígenos tumorais são inter alia antígenos de superfície tumor-específicos (TSSAs), por exemplo 5T4, alfaõbetal-integrina, 707-aP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, Bcr-abl, antígeno de MN/C IX, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, beta-catenina/m, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27/m, CD 30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6aML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/new, HLA-a*0201R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (ou hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-a, MART-2/Ski, MC1R, miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-a, PAP, proteinase-3, bcrabl secundário de p190, Pml/RARalfa, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 ou RU2, SAGE, SART-1 ou SART-3, survivina, TEL/AML1, TGFbeta, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF e WT1, ou de sequências tais como, por exemplo, NY-Eso-1 ou NY-Eso-B. Qualquer classe de antígenos tumorais é adequada para o propósito da presente invenção, por exemplo antígenos tumorais conhecidos por estarem envolvidos na neovascularização, influenciando a estrutura da matriz extracelular etc. Fragmentos e análogos dos antígenos acima são também abrangidos.
Exemplos de antígenos tumorais, que podem ser codificados por 5 pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, são mostrados nas Tabelas 1 e 2 abaixo. Estas tabelas ilustram antígenos (proteína) específicos (isto é, antígenos tumorais) com respeito à doença de câncer, eles se associam. De acordo com a invenção, os termos doenças de câncer e doenças tumorais são usados aqui sinonimicamente.
TABELA 1: ANTÍGENOS EXPRESSADOS EM DOENÇAS DE CÂNCER
Antígeno tumoral Nome Sítio de expressão
5T4 câncer colorretal, câncer gástrico, câncer ovariano
707-aP 707 alanina prolina melanoma
9D7 carcinoma de célula renal
AFP alfa-fetoproteína carcinoma hepatocelular, câncer de vesícula biliar, câncer testicular, câncer ovariano, câncer da bexiga,
AlbZIP HPG1 câncer de próstata
alfaõbetal integrina
alfa5beta6- integrina câncer do cólon
alfa-metilacilcoenzima A ra- cemase câncer de próstata
ART-4 antígeno de adenocarci.noma reconhecido por células T4 câncer pulmonar, câncer da cabeça e pescoço, leucemia, câncer esofagiano, câncer gástrico, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de mama, carcinoma de célula escamosa
B7H4 câncer ovariano
BAGE-1 Antígeno B câncer da bexiga, câncer da cabeça e pescoço, câncer pulmonar, melanoma, carcinoma de célula escamosa,
BCL-2 leucemia
BING-4 melanoma
CA 15-3/CA 2729 câncer de mama, câncer ovariano, câncer pulmonar, câncer de próstata
CA 19-9 câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de fígado, câncer de mama, câncer da vesícula, câncer do cólon, câncer ovariano, câncer pulmonar
CA 72-4 câncer ovariano
CA125 câncer ovariano, câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer de útero, carcinoma de cerviz, câncer do cólon, câncer de mama, câncer pulmonar
calreticulina câncer da bexiga
CAMEL Antígeno reconhecido por CTL em melanoma melanoma
CASP-8 caspase-8 câncer da cabeça e pescoço
Catepsina B câncer de mama
Catepsina L câncer de mama
CD19 malignidades de célula B
CD20
CD22
CD25
CD30
CD33
CD4
CD52
CD55
CD56
CD80
CEA antígeno carcinoembriônico carcinoma do intestino, câncer colorretal, câncer do cólon, câncer hepatocelular, câncer pulmonar, câncer de mama, câncer da tiroide, cân-
cer pancreático, câncer do cerviz, câncer do fígado, câncer da bexiga, melanoma
CLCA2 canal-2 de cloreto ativado por cálcio câncer pulmonar
CML28 leucemia
Proteína semelhante à coactosina câncer pancreático
Colágeno XXIII câncer de próstata
COX-2 câncer ovariano, câncer de mama, câncer colorretal
CT-9/BRD6 proteína testículo-específica de bromodomínio
Cten proteína semelhante à tensina C-terminal câncer de próstata
Ciclina B1
Ciclina D1 câncer ovariano
cyp-B ciclofilina B câncer da bexiga, câncer pulmonar, leucemia de célula T, carcinoma de célula escamosa
CYPB1 1B1 do citocromo P450 leucemia
DAM-10/MAGE- B1 melanoma de antígeno de diferenciação 10 melanoma, tumores cutâneos, câncer ovariano, câncer pulmonar
DAM-6/MAGE-B2 melanoma de antígeno de diferenciação 6 melanoma, tumores cutâneos, câncer ovariano, câncer pulmonar
EGFR/Her1 câncer pulmonar, câncer ovariano, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cólon, câncer pancreático, câncer de mama
EMMPRIN indutor de metaloproteinase de matriz extracelular ássociada à célula tumoral/ câncer pulmonar, câncer de mama, câncer da bexiga, câncer ovariano, câncer do cérebro, linfoma
EpCam molécula de adesão de célula epitelial câncer ovariano, câncer de mama, câncer do cólon, câncer pulmonar
EphA2 receptor do tipo A de efrina 2 glioma
EphA3 receptor do tipo A de efrina 2 melanoma, sarcoma, câncer pulmonar
ErbB3 câncer de mama
EZH2 (intensificador do homólogo Zeste 2) câncer do endométrio, melanoma, câncer de próstata, câncer de mama
FGF-5 fator 5 de crescimento de fibroblasto carcinoma de célula renal, câncer de mama, câncer de próstata
FN fibronectina melanoma
Fra-1 antígeno relacionado a Fos1 câncer de mama, câncer esofagiano, carcinoma de célula renal, câncer da tiroide
G250/CAIX glicoproteína 250 leucemia, carcinoma de célula renal, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cólon, câncer ovariano, câncer cervical
GAGE-1 G antígeno 1 câncer da bexiga, câncer pulmonar, sarcoma, melanoma, câncer da cabeça e pescoço
GAGE-2 G antígeno 2 câncer da bexiga, câncer pulmonar, sarcoma, melanoma, câncer da cabeça e pescoço
GAGE-3 G antígeno 3 câncer da bexiga, câncer pulmonar, sarcoma, melanoma, câncer da cabeça e pescoço
GAGE-4 G antígeno 4 câncer da bexiga, câncer pulmonar, sarcoma, melanoma, câncer da cabeça e pescoço
GAGE-5 G antígeno 5 câncer da bexiga, câncer pulmonar, sarcoma, melanoma, câncer da cabeça e pescoço
GAGE-6 G antígeno 6 câncer da bexiga, câncer pulmonar, sarcoma, melanoma, câncer da cabeça e pescoço
GAGE-7b G antígeno 7b câncer da bexiga, câncer pulmonar, sarcoma, melano-
ma, câncer da cabeça e pescoço
GAGE-8 G antígeno 8 câncer da bexiga, câncer pulmonar, sarcoma, melanoma, câncer da cabeça e pescoço
GDEP gene diferencialmente expresso em próstata câncer de próstata
GnT-V N- acetilglucosaminiltransferase V glioma, melanoma
gpioo glicoproteína 100 kDa melanoma
GPC3 glipican 3 carcinoma hepatocelular, melanoma
HAGE antígeno de helicase câncer da bexiga
HAST-2 tumor-2 do anel de sinete humano
hepsina próstata
Her2/neu/ErbB2 receptor-2 epidérmico humano/neurológico câncer de mama, câncer da bexiga, melanoma, câncer ovariano, câncer do pâncreas, câncer gástrico
HERV-K-mEL melanoma
HNE elastase de neutrófilo humano leucemia
homeobox NKX 3.1 câncer de próstata
HOM-TES- 14/SCP-1 câncer ovariano
HOM-TES-85
HPV-E6 câncer cervical
HPV-E7 câncer cervical
HST-2 câncer gástrico
hTERT transcriptase reversa de telomerase humana câncer de mama, melanoma, câncer pulmonar, câncer ovariano, sarcoma, linfoma de não-Hodgkin, leucemia aguda
iCE carboxil esterase intestinal carcinoma de célula renal
IGF-1R câncer colorretal
IL-13Ra2 Cadeia alfa 2 do receptor de interleucina 13 glioblastoma
IL-2R câncer colorretal
IL-5
receptor de laminina imaturo carcinoma de célula renal
Calicreína 2 câncer de próstata
Calicreína 4 câncer de próstata
Ki67 câncer de próstata, câncer de mama, linfoma de nãoHodgkin, melanoma
KIAA0205 câncer da bexiga
KK-LC-1 antígeno do câncer pulmonar de Kita-kyushu 1 câncer pulmonar
KM-HN-1 câncer da língua, carcinomas hepatocelulares, melanoma, câncer gástrico, esofagiano, câncer do cólon, câncer pancreático
LAGE-1 Antígeno L câncer da bexiga, câncer da cabeça e pescoço, melanoma
livina câncer da bexiga, melanoma
MAGE-al antígeno-a1 de melanoma câncer da bexiga, câncer da cabeça e pescoço, melanoma, câncer do cólon, câncer pulmonar, sarcoma, leucemia
MAGE-a10 antígeno-a10 de melanoma câncer da bexiga, câncer da cabeça e pescoço, melanoma, câncer do cólon, câncer pulmonar, sarcoma, leucemia
MAGE-a12 antígeno-a12 de melanoma câncer da bexiga, câncer da cabeça e pescoço, melanoma, câncer do cólon, câncer pulmonar, sarcoma, leucemia, câncer de próstata, mieloma, tumores cerebrais
MAGE-a2 antígeno-a2 de melanoma câncer da bexiga, câncer da cabeça e pescoço, melanoma, câncer do cólon, câncer pulmonar, sarcoma, leucemia
MAGE-a3 antígeno-a3 de melanoma câncer da bexiga, câncer da cabeça e pescoço, melanoma, câncer do cólon, câncer pulmonar, sarcoma, leucemia
MAGE-a4 antígeno-a4 de melanoma câncer da bexiga, câncer da
cabeça e pescoço, melanoma, câncer do cólon, câncer pulmonar, sarcoma, leucemia
MAGE-a6 antígeno-a6 de melanoma câncer da bexiga, câncer da cabeça e pescoço, melanoma, câncer do cólon, câncer pulmonar, sarcoma, leucemia
MAGE-a9 antígeno-a9 de melanoma câncer da bexiga, câncer da cabeça e pescoço, melanoma, câncer do cólon, câncer pulmonar, sarcoma, leucemia
MAGE-B1 antígeno-B1 de melanoma melanoma
MAGE-B10 antígeno-B10 de melanoma melanoma
MAGE-B16 antígeno-B16 de melanoma melanoma
MAGE-B17 antígeno-B17 de melanoma melanoma
MAGE-B2 antígeno-B2 de melanoma melanoma
MAGE-B3 antígeno-B3 de melanoma melanoma
MAGE-B4 antígeno-B4 de melanoma melanoma
MAGE-B5 antígeno-B5 de melanoma melanoma
MAGE-B6 antígeno-B6 de melanoma melanoma
MAGE-C1 antígeno-c1 de melanoma câncer da bexiga, melanoma
MAGE-C2 antígeno-c2 de melanoma melanoma
MAGE-C3 antígeno-c3 de melanoma melanoma
MAGE-d1 antígeno-d1 de melanoma melanoma
MAGE-d2 antígeno-d2 de melanoma melanoma
MAGE-d4 antígeno-d4 de melanoma melanoma
MAGE-E1 antígeno-E1 de melanoma câncer da bexiga, melanoma
MAGE-E2 antígeno-E2 de melanoma melanoma
MAGE-ft antígeno-f1 de melanoma melanoma
MAGE-H1 antígeno-H1 de melanoma melanoma
MAGEL2 2 semelhante a MAGE melanoma
Mamaglobina A câncer de mama
MART-1/Melan-a antígeno de melanoma reconhecido por célula T1/antígeno A de melanoma melanoma
MART-2 antígeno de melanoma reconhecido por célula T-2 melanoma
proteína de matriz 22 câncer da bexiga
MC1R receptor de melanocortina 1 melanoma
M-cSF gene do fator de estimulação de colônia de macrófagos câncer ovariano
Mesotelina câncer ovariano
MG50/PXDN câncer de mama, glioblastoma, melanoma
MMP 11 fosfoproteína 11 da fase M leucemia
antígeno IX de MN/CA carcinoma de célula renal
MRP-3 proteína 3 associada à resistência a multifármacos câncer pulmonar
MUC1 mucina 1 câncer de mama
MUC2 mucina 2 câncer de mama, câncer ovariano, câncer pancreático
NA88-a Clone de cDNA de NA de paciente M88 melanoma
N- acetilglicosaminil- transferase-V
Neo-PAP Neo-poli(A) polimerase
NGEP câncer de próstata
NMP22 câncer da bexiga
NPM/ALK proteína de fusão de nucleofosmina/quinase de linfoma anaplástico
NSE enolase neurônio-específica câncer de célula pequena do pulmão, neuroblastoma, tumor de Wilm, melanoma, câncer da tiroide, câncer do rim, câncer do testículo, câncer do pâncreas
NY-ESO-1 esôfago 1 de Nova Iorque câncer da bexiga, câncer da cabeça e pescoço, melanoma, sarcoma, linfoma B, hepatoma, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de mama
NY-ESO-B
OA1 proteína tipo 1 de albinismo ocular melanoma
OFA-iLRP receptor de laminina antígé- leucemia
no-imatura oncofetal
OGT gene de N-acetilglicosamina transferase O-ligado
OS-9
osteocalcina câncer de próstata
osteopontina câncer de próstata, câncer de mama, câncer ovariano
p15 proteína 15
p15 melanoma
bcr-abl secundário de p190
p53
PAGE-4 proteína-4 semelhante a GAGE de próstata câncer de próstata
PAI-1 inibidor 1 do ativador de plasminogênio câncer de mama
PAI-2 inibidor 2 do ativador de plasminogênio câncer de mama
PAP acic fosfatase de próstata câncer de próstata
PART-1 câncer de próstata
PATE câncer de próstata
PDEF câncer de próstata
Pim-1-quinase
Pin1 Propil isomerase câncer de próstata
POTE câncer de próstata
PRAME antígeno preferencialmente expresso de melanoma melanoma, câncer pulmonar, leucemia, câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de célula renal, sarcoma
prosteína câncer de próstata
proteinase-3
PSA antígeno próstata-específico câncer de próstata
PSCA câncer de próstata
PSGR câncer de próstata
PSM
PSMA antígeno de membrana próstata-específico câncer de próstata
RAGE-1 antígeno renal câncer da bexiga, câncer renal, sarcoma, câncer do cólon
RHAMM/CD168 receptor para motilidade mediada por ácido hialurônico leucemia
RU1 renal ubíquo 1 câncer da bexiga, melanoma, câncer renal
RU2 renal ubíquo 1 câncer da bexiga, melanoma, sarcoma, tumor de cérebro, câncer esofagiano, câncer renal, câncer do cólon, câncer de mama
S-100 melanoma
SAGE antígeno de sarcoma
SART-1 Tumor de rejeição de antígeno escamoso 1 câncer esofagiano, câncer da cabeça e pescoço, câncer pulmonar, câncer uterino
SART-2 Tumor de rejeição de antígeno escamoso 1 câncer da cabeça e pescoço, câncer pulmonar, carcinoma de célula renal, melanoma, tumor de cérebro
SART-3 Tumor de rejeição de antígeno escamoso 1 câncer da cabeça e pescoço, câncer pulmonar, leucemia, melanoma, câncer esofagiano
SCC antígeno de carcinoma de célula escamosa câncer pulmonar
Sp17 proteína de esperma 17 mieloma múltiplo
SSX-1 sarcoma sinovial X ponto de ruptura 1 carcinoma de célula hepatocelular, câncer de mama
SSX-2/H0M- mEL-40 sarcoma sinovial X ponto de ruptura 2 câncer de mama
SSX-4 sarcoma sinovial X ponto de ruptura 4 câncer da bexiga, carcinoma de célula hepatocelular, câncer de mama
STAMP-1 câncer de próstata
STEAP próstata de antígeno epitelial de seis transmembranas câncer de próstata
survivina câncer da bexiga
survivina-2B Survivina de retenção de íntron 2 câncer da bexiga
TA-90 melanoma
TAG-72 carcinoma de próstata
TARP câncer de próstata
TGFb TGFbeta
TGFbRIl Receptor de TGFbeta II
TGM-4 transglutaminase próstataespecífica câncer de próstata
TRAG-3 proteína associada resistente a taxol 3 câncer de mama, leucemia, e melanoma
TRG gene relacionado aa testina
TRP-1 proteína 1 relacionada à tirosina melanoma
TRP-2/6b TRP-2/éxon novel 6b melanoma, glioblastoma
TRP-2/INT2 TRP-2/íntron 2 melanoma, glioblastoma
Trp-p8 câncer de próstata
Tirosinase melanoma
UPA ativador de plasminogênio do tipo uroquinase câncer de mama
VEGF fator de crescimento endotelial vascular
VEGFR-2/FLK-1 receptor-2 do fator de crescimento endotelial vascular
WT1 gene do tumor de Wilm câncer gástrico, câncer do cólon, câncer pulmonar, câncer de mama, câncer ovariano, leucemia
TABELA 2: ANTÍGENOS MUTANTES EXPRESSADOS EM DOENÇAS DE CÂNCER
Antígeno mutante Nome Sítio de expressão
alfa-actinina-4/m carcinoma pulmonar
ARTC1/m melanoma
bcr/abl proteína de fusão de Abelson da região de agrupamento do ponto de ruptura CML
beta-catenina/m beta-catenina melanoma
BRCA1/m câncer de mama
BRCA2/m câncer de mama
CASP-5/m câncer colorretal, câncer gástrico, carcinoma endometrial
CASP-8/m câncer da cabeça e pescoço, carcinoma de célula escamosa
CDC27/m ciclo de divisão celular 27
CDK4/m quinase 4 ciclina-dependente melanoma
CDKN2A/m melanoma
CML66 CML
COA-1/m câncer colorretal
DEK-cAN proteína de fusão AML
EFTUD2/m melanoma
ELF2/m Alongamento fator 2 carcinoma de célula escamosa pulmonar
ETV6-aML1 proteína de fusão do gene 6 da variante Ets/gene da leucemia mieloide aguda 1 ALL
FN1/m Fibronectina 1 melanoma
GPNMB/m melanoma
HLA-a*0201- R170I Permuta de arginina para isoleucina no resíduo 170 da hélice alfa do domínio alfa2 no gene HLA-a2 carcinoma de célula renal
HLA-a11/m melanoma
HLA-a2/m carcinoma de célula renal
HSP70-2M proteína de choque térmico 70-2 mutada carcinoma de célula renal, melanoma, neuroblastoma
KIAA0205/m tumor da bexiga
K-Ras/m carcinoma pancreático, carcinoma colorretal
LDLR-fUT proteína de fusão de LDR- fucosiltransferase melanoma
MART2/m melanoma
ME1/m carcinoma pulmonar de célula não- pequena
MUM-1/m melanoma ubíquo mutado 1 melanoma
MUM-2/m melanoma ubíquo mutado 2 melanoma
MUM-3/m melanoma ubíquo mutado 3 melanoma
Classe de Miosi- na l/m melanoma
neo-PAP/m melanoma
NFYC/m carcinoma pulmonar de célula escamosa
N-Ras/m melanoma
OGT/m carcinoma colorretal
0S-9/m melanoma
p53/m
Pml/RARa receptor alfa de ácido retinoi- co/leucemia promielocítica APL, PML
PRDX5/m melanoma
PTPRK/m proteína-tirosina fosfatase capa do tipo receptor melanoma
RBAF600/m melanoma
SIRT2/m melanoma
SYT-SSX-1 Proteína de fusão de sinapto- tagmina l/sarcoma siovial X sarcoma
SYT-SSX-2 Proteína de fusão de sinapto- tagmina l/sarcoma siovial X sarcoma
TEL-aML1 Proteína de fusão de leucemia da família de Ets de translocação/leucemia mie- loide aguda 1 AML
TGFbRIl Receptor de TGFbeta II carcinoma colorretal
TPI/m triosefosfato isomerase melanoma
Em uma modalidade preferida de acordo com a invenção, exemplos de antígenos tumorais que podem ser codificados por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção são selecionados do grupo que consiste em 5T4, 707-aP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1,5 1integrina, 5 6-integrina, -actinina-4/m, metilacil-coenzima A racemase, ART4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, catenina/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, calreticulina, CAMEL, CASP-8/m, catepsina B, catepsina L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, C0A-1/m, proteína semelhante à coactosina, colágeno XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, ciclina B1, ciclina D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-cAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-aMLl, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST2, hepsina, Her2/neu, HERV-K-mEL, HLA-a*0201-R17l, HI_A-a11/m, HLAa2/m, HNE, homeobox NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPVE6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, r^gptgr de Jamininaimaturo, ealicreína-2, caiicreína-4, Ki67, KIAA0205, KlA&%205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-aí, LDLR-fUT, MAGE-al, MAGE-a2, MAGE-a3, MAGÉ-a4, MAGE-a6, MAGE-a9, MAGE-a10, MAGE-a12, MAGEB1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-cl, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-d1, MAGEd2, MAGE-d4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-fl, MAGE-H1, MAGEL2, mamaglobina A, MART-1/melan-a, MART-2, MART-2/m, proteína de matriz 22, MC1R, M-cSF, ME1/m, mesotelina, MG50/PXDN, MMP11, antígeno IX de MN/CA, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, miosina classe l/m, NA88-a, N-acetilglicosaminiltransferase-V, Neo-PAP, NeoPAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, osteocalcina, osteopontina, ρ15, bcr-abl secundário de p190, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-quinase, Pin-1, Pml/PARa, POTE, PRAME, PRDX5/m, prosteína, proteinase-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX2/HOM-mEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP, survivina, survivina-2B, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-aML1, TGFp, TGFpRIl, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, tirosinase, UPA, VEGF, VEGFR-2/FLK-1, e WT1.
Em uma modalidade preferida de acordo com a invenção, exemplos de antígenos tumorais, que podem ser codificados por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção são selecionados do grupo que consiste em MAGE-a1 [número de acesso M77481], MAGE-a6 [número de acesso NM_005363], melan-a [número de acesso NM_005511], GP100 [número de acesso M77348], tirosinase [número de acesso NM_000372], survivina [número de acesso AF077350], CEA [número de acesso NM_004363], His-2/neu [número de acesso M11730], WT1 [número de acesso NM_000378], PRAME [número de acesso NM_006115], EGFRI (receptor 1 do fator de crescimento epidérmico) [número de acesso AF288738], mucina-1 [número de acesso NM_002456] e SEC61G [número de acesso NM_014302].
Como uma outra alternativa, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode codificar um anticorpo. De acordo com a presente invenção, um tal anticorpo pode ser selecionado de qualquer anticorpo, por exemplo quaisquer anticorpos recombinantemente produzidos ou de ocorrência natural, conhecidos na técnica, em particular anticorpos adequados para propósitos terapêuticos, diagnósticos ou científicos, ou anticorpos que foram identificados em relação às doenças de câncer específicas. Aqui, o termo anticorpo é usado em seu sentido mais vasto e especificamente abrange anticorpos monoclonais e policlonais (incluindo agonista, antagonista, e anticorpos de bloqueio ou neutralização) e espécies de anticorpo com especificidade poliepitópica. De acordo com a invenção, anticorpo tipicamente compreende qualquer anticorpo conhecido na técnica (por exemplo, anticorpos de IgM, IgD, IgG, IgA e IgE), tais como anticorpos de ocorrência natural, anticorpos gerados por imunização em um organismo hospedeiro, anticorpos que foram isolados e identificados de anticorpos de ocorrência natural ou anticorpos gerados por imunização em um organismo hospedeiro e recombinantemente produzidos por métodos biomoleculares conhecidos na técnica, como também anticorpos quiméricos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos biespecíficos, intracorpos, isto é, anticorpos expressados em células e opcionalmente localizados em compartimentos celulares específicos, e fragmentos e variantes dos anticorpos acima mencionados. Em geral, um anticorpo consiste em uma cadeia curta e uma cadeia longa tendo domínios variável e constante. A cadeia curta consiste em um domínio variável N-terminal, VL, e um domínio constante C-terminal, Cl. Em contraste, a cadeia pesada do anticorpo de IgG, por exemplo, é compreendida de um domínio variável N-terminal, Vh, e três domínios constantes, Ch1, Ch2 e CH3. Anticorpos de cadeia simples podem ser codificados por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado como definido aqui como bem, preferivelmente por um RNA unifilamentar, mais preferivelmente por um mRNA.
De acordo com uma primeira alternativa, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode codificar um anticorpo policlonal. Neste contexto, o termo, anticorpo policlonal tipicamente significa misturas de anticorpos direcionados para antígenos específicos ou imunógenos ou epítopos de uma proteína que foi gerada por imunização de um organismo hospedeiro, tal como um mamífero, por exemplo incluindo cabra, boi, porcos, cachorro, gato, burro, macaco, bugio, um roedor tal como um camundongos, hamster e coelho. Anticorpos policlonais são em geral não-idênticos, e desse modo usualmente reconhecem epítopos diferentes ou regiões do mesmo antígeno. Desse modo, em um tal caso, tipicamente uma mistura (uma composição) de moléculas de RNA diferentes complexadas como reivindicado pela presente invenção será aplicada, cada codificando um anticorpo específico (monoclonal) que é direcionado para antígenos ou imunógenos ou epítopos específicos de uma proteína.
De acordo com uma outra alternativa, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode codificar um anticorpo monoclonal. O termo anticorpo monoclonal aqui tipicamente refere5 se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos com exceção das possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades secundárias. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados para um sítio anti10 gênico simples. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos (policlonais) convencionais que tipicamente incluem anticorpos diferentes direcionados para determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado para um determinante simples no antígeno. Por exemplo, anticorpos monoclonais como definidos acima podem ser feitos pri15 meiro pelo método de hibridoma descrito por Kohler e Milstein, Nature, 256:495 (1975), ou podem ser feitos através de métodos de DNA recombinantes, por exemplo como descritos na Patente U.S. 4.816.567. Anticorpos monoclonais podem também ser isolados de bibliotecas de fago geradas usando as técnicas descritas em McCafferty et al, Nature, 348:552-554 (1990), por exemplo. De acordo com Kohler e Milstein, um imunógeno (antígeno) de interesse é injetado em um hospedeiro tal como um camundongo e linfócitos de célula B produzidos em resposta ao imunógeno são colhidos após um período de tempo. As células B são combinadas com células de mieloma obtidas de camundongo e introduzidas em um meio que permite as células B fundirem-se com as células de mieloma, produzindo hibridomas. Estes células fundidas (hibridomas) são depois colocadas em poços separados em placas de microtitulação e crescidas para produzir anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais são testados para determinar quais deles são adequados para detectar o antígeno de interesse. Após serem sele30 cionados, os anticorpos monoclonais podem ser crescidos em culturas de célula ou injetando os hibridomas nos camundongos. Porém, para o propósito da presente invenção, as sequências de peptídeo destes anticorpos mo70 noclonais têm que ser sequenciadas e as sequências de RNA codificando estes anticorpos podem ser preparadas de acordo com os procedimentos bem-versados na técnica.
Para propósitos terapêuticos em seres humanos, anticorpos monoclonais ou policlonais não-humanos, tais como anticorpos murinos podem também ser codificados por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção. Porém, tais anticorpos são tipicamente apenas de uso limitado, uma vez que eles em geral induzem uma resposta imune para a produção de anticorpos humanos direcionados para os ditos anticorpos não-humanos, no corpo humano. Portanto, um anticorpo nãohumano particular pode apenas ser administrado uma vez ao ser humano. Para solucionar este problema, anticorpos quiméricos não-humanos, humanizados e humanos podem ser codificados por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção. Anticorpos quiméricos, que podem ser codificados por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, são preferivelmente anticorpos em que os domínios constantes de um anticorpo descritos acima são substituídos por sequências de anticorpos de outros organismos, preferivelmente sequências humanas. Anticorpos humanizados (não-humanos), que podem ser também codificados por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, são anticorpos em que os domínios constantes e variáveis (com exceção dos domínios hipervariáveis) descritos acima de um anticorpo são substituídos por de sequências humanas. De acordo com outra alternativa, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode codificar anticorpos humanos, isto é, anticorpos que têm apenas sequências humanas. Tais anticorpos humanos podem ser isolados de tecidos humanos ou de organismos hospedeiros nãohumanos imunizados que são transgene para o locus do gene de IgG humano, sequências de RNA sequenciadas podem ser preparadas de acordo com os procedimentos bem-conhecidos na técnica. Adicionalmente, anticorpos humanos podem ser fornecidos pelo uso de uma exibição de fago.
Além disso, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode codificar anticorpos biespecíficos. Anticorpos biespecíficos no contexto da invenção são preferivelmente anticorpos que atuam como um adaptador entre um efetor e um respectivo alvo, por exemplo para o propósito de recrutar moléculas efetoras tais como toxinas, fármacos, citocinas, etc., alvejar células efetoras tais como CTL, células NK, macrófagos, granulócitos, etc. (vide para revisão: Kontermann R.E., Acta Pharmacol. Sin, 2005, 26(1): 1-9). Anticorpos biespecíficos como descritos aqui são, em geral, configurados para reconhecer, por exemplo dois antígenos diferentes, imunógenos, epítopos, fármacos, células (ou receptores em células), ou outras moléculas (ou estruturas) como descritas acima. Biespecificidade quer dizer que as regiões de ligação de antígeno dos anticorpos são específicas para dois epítopos diferentes. Desse modo, antígenos, imunógenos ou epítopos diferentes, etc. podem ser reunidos, o que, opcionalmente, permite uma interação direta dos dois componentes. Por exemplo, células diferentes tais como células efetoras e células-alvo podem ser conectadas por meio de um anticorpo biespecífico. Abrangidos, mas nãolimitados, pela presente invenção são anticorpos ou fragmentos dos mesmos que ligam, por um lado, um antígeno solúvel como descrito aqui, e, por outro lado, um antígeno ou receptor na superfície de uma célula tumoral.
Em resumo, de acordo com a invenção, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode também codificar anticorpos como definidos acima. Uma vez que estes anticorpos são anticorpos intracelularmente expressados, isto é, anticorpos que são codificados através de ácidos nucleicos localizados em compartimentos específicos da célula e também expressos lá, tais anticorpos podem ser também denominados intracorpos.
Anticorpos como codificados por pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção podem preferivelmente compreender anticorpos de comprimento total, isto é, anticorpos compostos das cadeia curta totais e longas totais, como descritas acima. Porém, derivados de anticorpos tais como fragmentos de anticorpo, variantes ou adutos podem ser codificados pelo acima no pelo menos um RNA do RNA complexado de acordo com a presente invenção.
O pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção podem também codificar fragmentos de anticorpo selecionados de fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fc, Facb, pFc1, Fd e Fv dos anticorpos acima mencionados. Em geral, fragmentos de anticorpo são versados na técnica. Por exemplo, um fragmento Fab (fragmento, ligação de antígeno) é composto de um domínio constante e uma variável de cada uma da cadeia longa e curta. Os dois domínios variáveis ligam o epítopo em antígenos específicos. As duas cadeias são conectadas por meio de uma ligação de dissulfeto. Um fragmento scFv (fragmento variável de cadeia simples), por exemplo, tipicamente consiste nos domínios variáveis das cadeias curtas e longa. Os domínios são ligados por uma ligação artificial, em geral uma ligação de polipeptídeo tal como um peptídeo composto de 15-25 resíduos de glicina, prolina e/ou serina.
De acordo com a invenção, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode codificar fragmentos e/ou variantes das proteínas terapeuticamente ativas, antígenos ou anticorpos acima mencionados, em que os fragmentos e/ou variantes podem ter uma identidade de sequência a uma das proteínas terapeuticamente ativas, antígenos ou anticorpos acima mencionados de pelo menos 70%, 80% ou 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% e o mais preferivelmente pelo menos 99% no comprimento inteiro das sequências de ácido nucleico ou de aminoácido de codificação que codificam estes proteínas terapeuticamente ativas, antígenos ou anticorpos. Preferivelmente, os fragmentos e/ou variantes têm a mesma função biológica ou atividade específica comparada às proteínas terapeuticamente ativas, antígenos ou anticorpos nativos de comprimento total, por exemplo capacidade de ligação específica (por exemplo, de antígenos particulares), atividade catalítica (por exemplo, de proteínas terapeuticamente ativas), etc. Neste contexto, função biológica dos anticorpos descritos aqui também compreende neutralização de antígenos, ativação de complemento ou opsonização. Assim, anticorpos tipicamente reconhecem quaisquer epítopos nativos na superfície da célula ou antígenos livres. Anticorpos como definidos acima podem interagir com os antígenos de apresentação de célula e podem iniciar mecanismos de defesa diferentes. Por um lado, o anticorpo pode iniciar mecanismos de sinalização na célula alvejada que leva à autodestruição da célula (apoptose). Por outro lado, pode marcar a célula em um tal modo que outros componentes ou células efetoras do sistema imune do corpo podem reconhecer e atacar. Os mecanismos de ataque são referidos como citotoxicidade mediada por complemento anticorpo-dependente (CMC) e citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC). ADCC envolve um reconhecimento do anticorpo por células imunes que se unem às células marcadas com anticorpo e, ou através de sua ação direta ou através do recrutamento de outros tipos de célula, levam à morte da célula marcada. CMC é um processo onde uma cascata de proteínas de complemento diferentes é ativada, usualmente quando vários anticorpos estão em proximidade íntima um ao outro, ou resultando em lise das células ou atraindo outras células imunes para esta localização para função de célula efetora. Na neutralização de um antígeno, o anticorpo pode ligar um antígeno e neutralizar o mesmo. Tal reação de neutralização, por sua vez, leva em geral ao bloqueio do anticorpo. Desse modo, o anticorpo pode ligar apenas um antígeno, ou, no caso de um anticorpo biespecífico, dois antígenos. Em particular, os fragmentos de anticorpo de scFv são úteis para reações de neutralização porque eles não contêm as funcionalidades do domínio constante de um anticorpo. Na ativação do complemento, o sistema complexo de proteínas de complemento pode ser ativado por meio da ligação de um anticorpo que é independente da parte de Fc de um anticorpo. Produtos finais da cascata de complemento resultam na lise da célula e geração de um ambiente inflamatório. Os patógenos ou outras partículas nãocelulares tornam-se acessíveis aos fagócitos por meio da ligação do domínio constante de um anticorpo na opsonização. Alternativamente, células reconhecidas como estranhas podem ser lisadas por meio de citotoxicidade mediada por célula anticorpo-dependente (ADCC). Em particular, células NK podem exibir funções de lise mediante ativação dos receptores Fc.
Para determinar a porcentagem na qual as duas sequências de RNA (nucleico ou aminoácido) são idênticas, as sequências podem ser alinhadas para serem subsequentemente comparadas entre si. Portanto, por exemplo intervalos podem ser inseridos na sequência da primeira sequência e o componente na posição correspondente da segunda sequência pode ser comparado. Se uma posição na primeira sequência for ocupada pelo mesmo componente como é o caso em uma posição na segunda sequência, as duas sequências são idênticas nesta posição. A porcentagem na qual duas sequências são idênticas é uma função do número de posições idênticas dividido pelo número total de posições.
A porcentagem na qual duas sequências são idênticas pode ser determinada usando um algoritmo matemático. Um exemplo preferido, mas não-limitativo, de um algoritmo matemático que pode ser usado é o algoritmo de Karlin et al (1993), PNAS USA, 90:5873-5877 ou Altschul et al (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402. Um tal algoritmo é integrado no programa BLAST. Sequências que são até certo ponto idênticas às sequências do RNA do RNA complexado da presente invenção podem ser identificadas por este programa.
Aquelas pelo menos uma moléculas de RNA (do RNA complexado da presente invenção) codificando sequências de aminoácido tendo (a) substituição(ões) conservadora(s) comparada(s) em particular à sequência fisiológica enquadram-se no termo variantes. Substituições em que os aminoácidos codificados que originam da mesma classe são trocados por outros são chamadas substituições conservadoras. Em particular, estes são aminoácidos codificados codificados por cadeias laterais alifáticas, cadeias laterais positiva ou negativamente carregadas, grupos aromáticos nas cadeias laterais ou aminoácidos codificados, as cadeias laterais destes podem entrar em pontes de hidrogênio, por exemplo cadeias laterais tendo uma função hidroxila. Isto significa que, por exemplo, um aminoácido tendo uma cadeia lateral polar é substituído por outro aminoácido tendo uma cadeia lateral igualmente polar, ou, por exemplo, um aminoácido caracterizado por uma cadeia lateral hidrofóbica é substituído por outro aminoácido tendo uma cadeia lateral i75 gualmente hidrofóbica (por exemplo, serina (treonina) à treonina (serina) ou leucina (isoleucina) à isoleucina (leucina)). Inserções e substituições são possíveis, em particular, naquelas posições de sequência que não causam nenhuma modificação à estrutura tridimensional ou não afetam a região de ligação. Modificações para uma estrutura tridimensional através de inserção(ões) ou deleção(ões) podem ser facilmente determinadas por exemplo usando espectros de CD (espectros de dicroismo circular) (Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, em: Modem Physical Methods in Biochemistry, Neuberger ef a/(ed.), Elsevier, Amsterdã).
RNA IMUNOESTIMULANTE
De acordo com uma terceira modalidade, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ser um RNA imunoestimulante. Assim, o RNA imunoestimulante já pode exibir um efeito imunoestimulante antes da complexação do RNA com o oligopeptídeo inventivo de acordo com a fórmula (I) como definida acima, ou, mais preferivelmente, uni efeito imunoestimulante do RNA como aqui usado pode ser intensificado ou mesmo induzido por complexação do RNA com o oligopeptídeo inventivo de acordo com a fórmula (I) como definida acima. O RNA imunoestimulante do RNA complexado da presente invenção pode ser qualquer RNA, por exemplo, um RNA de codificação, como definido acima. Preferivelmente, o RNA imunoestimulante pode ser um RNA unifilamentar, um bifilamentar ou um parcialmente bifilamentar, mais preferivelmente um RNA unifilamentar, e/ou um RNA circular ou linear, mais preferivelmente um RNA linear. Mais preferivelmente, o RNA imunoestimulante pode ser um RNA unifilamentar (linear). Até mesmo mais preferivelmente, o RNA imunoestimulante pode ser um RNA mensageiro ((linear) unifilamentar) (mRNA). Um RNA imunoestimulante pode também ocorrer como um oligonucleotídeo de RNA curto como definido acima.
Um RNA imunoestimulante como aqui usado pode ser selecionado além disso de qualquer classe de moléculas de RNA, encontradas na natureza ou sendo sinteticamente preparadas, e que possa induzir uma resposta imune. Neste contexto, uma resposta imune pode ocorrer de vários modos. Um fator substancial para uma resposta imune adequada é a estimulação de subpopulações de células T diferentes. Linfócitos T são tipicamente divididos em duas subpopulações, as células T auxiliares 1 (Th1) e as células T auxiliares 2 (Th2), com as quais o sistema imune é capaz de destruir patógenos intracelulares (Th1) e extracelulares (Th2) (por exemplo, antígenos). As duas populações de células Th diferem no padrão das proteínas efetoras (citocinas) produzidas por eles. Desse modo, células Th1 ajudam a resposta imune celular mediante ativação dos macrófagos e células T citotóxicas. Por outro lado, células Th2 promovem a resposta imune humoral por estimulação das células B por conversão em células plasmáticas e por formação de anticorpos (por exemplo, contra antígenos). A razão Th1/Th2 é, portanto, de grande importância na resposta imune. Com relação à presente invenção, a razão Th1/Th2 da resposta imune é preferivelmente deslocada na direção para a resposta celular (resposta de Th1) e uma resposta imune celular é assim induzida. De acordo com um exemplo, o sistema imune pode ser ativado através de ligantes de receptores semelhantes a Toll (TLRs). TLRs são uma família de polipeptídeos do receptor de reconhecimento de padrão altamente conservados (PRR) que reconhecem padrões moleculares associados ao patógeno (PAMPs) e representam um papel crítico na imuni20 dade inata em mamíferos. Correntemente pelo menos treze membros da família, designados TLR1-TLR13 (receptores semelhantes a Toll: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 ou TLR13), foram identificados. Além disso, vários ligantes de TLR específicos foram identificados. Descobriu-se, por exemplo, que DNA bacteriano não-métilado e análogos sintéticos dos mesmos (DNA de CpG) são ligantes para TLR9 (Hemmi H et a/(2000) Nature 408:740-5; Bauer S et a/(2001) Pro NatlAcadSci USA 98, 9237-42). Além disso, foi relatado que ligantes para certos TLRs incluem certas moléculas de ácido nucleico e que certos tipos de RNA são imunoestimulantes em uma maneira sequência-independente ou sequência-dependénte, em que estes vários RNAs imunoestimulantes podem por exemplo estimular TLR3, TLR7, ou TLR8, ou receptores intracelulares tais como RIG-i, MDA-5, etc. Por exemplo, Lipford et al determinou certos oligorribonucleotídeos contendo G, U como imunoestimulantes atuando na via TLR7 e TLR8 (vide WO 03/086280). Os oligorribonucleotídeos imunoestimulantes contendo G, U descritos por Lipford et a/foram acreditados ser deriváveis de fontes de RNA incluindo RNA ribossômico, RNA de transferência, RNA mensageiro, e RNA viral.
De acordo com a presente invenção, descobriu-se que qualquer
RNA (molécula) como por exemplo definido acima (independente de seu comprimento específico, filamentação, modificação e/ou sequência de nucleotídeo) complexado com um peptídeo veículo de acordo com a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (fórmula I) pode ter propriedades imunoestimulantes, isto é, intensificar a resposta imune. RNA complexado como definido acima com um peptídeo veículo de acordo com a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (fórmula I) podem ser desse modo usados para intensificar imunoestimulação (não-específica), se adequado e desejado para um tratamento específico. Consequentemente, pode ser uma propriedade intrínseca do RNA complexado da invenção proporcionar efeitos imunoestimulantes por complexação de qualquer RNA com um peptídeo de acordo com a fórmula (I).
O pelo menos um RNA (imunoestimulante) (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode desse modo compreender qualquer sequência de RNA conhecida ser imunoestimulante, incluindo, sem ser limitado a estas, sequências de RNA representando e/ou codificando ligantes de TLRs, preferivelmente selecionados de membros da família TLR1-TLR13, mais preferivelmente de TLR7 e TLR8, ligantes para receptores intracelula25 res para RNA (tais como RIG-i ou MAD-5, etc.) (vide, por exemplo, Meylan, E., Tschopp, J. (2006). Toll-like receptors and RNA helicases: two parallel ways to trigger antiviral responses. Mol. Cell 22, 561-569), ou qualquer outra sequência de RNA imunoestimulante. Além disso, (classes de) moléculas de RNA que podem ser usadas como RNA imunoestimulante podem incluir qualquer outro RNA capaz de suscitar uma resposta imune. Sem estar limitado a estes, tal RNA imunoestimulante pode incluir RNA ribossômico (rRNA), RNA transferente (tRNA), RNA mensageiro (mRNA), e RNA viral (vR78
ΝΑ).
Tais outras (classes de) moléculas de RNA, que podem ser usadas como o pelo menos um RNA (molécula) (imunoestimulante) do RNA complexado da presente invenção, podem compreender, sem ser limitados a estas, por exemplo uma molécula de RNA da fórmula (lia):
θίΧητιθη, em que:
G é guanosina, uracila ou um análogo de guanosina ou uracila;
X é guanosina, uracila, adenosina, timidina, citosina ou um análogo dos nucleotídeos supracitados;
I é um número inteiro de 1 a 40, em que quando I = 1 G é guanosina ou um análogo da mesma, quando I > 1 pelo menos 50% dos nucleotídeos são guanosina ou um análogo da mesma;
m é um número inteiro e é pelo menos 3;
em que quando m = 3 X é uracila ou um análogo da mesma, quando m > 3 pelo menos 3 uracilas sucessivas ou análogos de uracila ocorrem;
n é um número inteiro de 1 a 40, em que quando n = 1 G é guanosina ou um análogo da mesma, quando n > 1 pelo menos 50% dos nucleotídeos são guanosina ou um análogo da mesma.
Além disso, tais outras (classes de) moléculas de RNA, que podem ser usadas com o pelo menos um RNA (molécula) (imunoestimulante) do RNA complexado da presente invenção podem compreender, sem ser limitadas a estas, por exemplo uma molécula de RNA da fórmula (llb): C|XmCn, em que:
C é citosina, uracila ou um análogo de citosina ou uracila;
X é guanosina, uracila, adenosina, timidina, citosina ou um análo79 go dos nucleotídeos supracitados;
I é um número inteiro de 1 a 40, em que quando I = 1 C é citosina ou um análogo da mesma, quando I > 1 pelo menos 50% dos nucleotídeos são citosina ou um análogo da mesma;
m é um número inteiro e é pelo menos 3;
em que quando m = 3 X é uracila ou um análogo da mesma, quando m > 3 pelo menos 3 uracilas sucessivas ou análogos de uracila ocorrem;
n é um número inteiro de 1 a 40, em que quando n = 1 C é citosina ou um análogo da mesma, quando n > 1 pelo menos 50% dos nucleotídeos são citosina ou um análogo da mesma.
Preferivelmente, as moléculas de RNA imunoestimulantes como aqui usadas como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção compreendem um comprimento como definido acima em geral para moléculas de RNA do RNA complexado da presente invenção, mais preferivelmente um comprimento de 5 a 5000, de 500 a 5000 ou, mais preferivelmente, de 1000 a 5000 ou, alternativamente, de 5 a 1000, 5 a 500, 5 a 250, de 5 a 100, de 5 a 50 ou, mais preferivelmente, de 5 a 30 nucleotídeos.
O pelo menos um RNA imunoestimulante como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ser além disso modificado, preferivelmente quimicamente modificado para intensificar as propriedades imunoestimulantes do dito DNA. O termo modificação química significa que o RNA usado como RNA imunoestimulante de acordo com a invenção é modificado por substituição, por inserção ou por remoção de átomos individuais ou vários átomos ou grupos atômicos comparados com espécies de RNA de ocorrência natural.
Preferivelmente, a modificação química do RNA compreende pelo menos um análogo de nucleotídeos de ocorrência natural. Em uma lista que não é de maneira nenhuma conclusiva, exemplos que podem ser mencionados para análogos de nucleotídeo que podem ser usados de acordo com a invenção são análogos de guanosina, uracila, adenosina, timidina, citosina. As modificações podem recorrer nas modificações da base, na porção de ribose e/ou na porção da cadeia principal de fosfato. Neste contexto, análogos de guanosina, uracila, adenosina, e citosina incluem, sem implicar qualquer limitação, qualquer guanosina, uracila, adenosina, timidina ou citosina de ocorrência natural ou não que foram alteradas quimicamente, por exemplo através de acetilação, metilação, hidroxilação, etc., incluindo 1metil-adenosina, 1-metil-guanosina, 1-metil-inosina, 2,2-dimetil-guanosina, 2,6-diaminopurina, 2'-amino-2'-desoxiadenosina, 2'-amino-2'-desoxicitidina, 2‘-amino-2'-desoxiguanosina, 2'-amino-2'-desoxiuridina, 2-amino-6-cloropurinaribosídeo, 2-aminopurina-ribosídeo, 2'-araadenosina, 2'-aracitidina, 2'arauridina, 2'-azido-2,-desoxiadenosina, 2'-azido-2'-desoxicitidina, 2'-azido2'-desoxiguanosina, 2'-azido-2'-desoxiuridina, 2-cloroadenosina, 2'-fluoro-2'desoxiadenosina, 2'-fluoro-2'-desoxicitidina, 2'-fluoro-2'-desoxiguanosina, 2'fluoro-2'-desoxiuridina, 2'-fluorotimidina, 2-metil-adenosina, 2-metilguanosina, 2-metil-tio-N6-isopenenil-adenosina, 2'-O-metil-2-aminoadenosina, 2'-O-metil-2'-desoxiadenosina, 2'-O-metil-2,-desoxicitidina, 2'-O-metil2'-desoxiguanosina, 2'-O-metil-2,-desoxiuridina, 2'-O-metil-5-metilúridina, 2'O-metilinosina, 2'-O-metilpseudouridina, 2-Tiocitidina, 2-tio-citosina, 3-metilcitosina, 4-acetil-citosina, 4-Tiouridina, 5-(carbóxi-hidroximetil)-uracila, 5,6-dihidrouridina, 5-aminoalilcitidina, 5-aminoalil-desóxi-uridina, 5-Bromouridina, 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracila, 5-carboximetilamonometil-uracila, 5cloro-ara-citosina, 5-fluoro-uridina, 5-iodouridina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, 5-metóxi-uridina, 5-metil-2-tio-uridina, 6-azacitidina, 6-azauridina, 6cloro-7-deaza-guanosina, 6-cloropurinaribosídeo, 6-mercapto-guanosina, 6metil-mercaptopurina-ribosídeo, 7-deaza-2'-desóxi-guanosina, 7deazaadenosina, 7-metil-guanosina, 8-azaadenosina, 8-Bromo-adenosina, 8-Bromo-guanosina, 8-mercapto-guanosina, 8-Oxoguanosina, Benzimidazolribosídeo, Beta-d-manosil-queosina, di-hidro-uracila, inosina, N1metiladenosina, N6-([6-amino-hexil]carbamoilmetil)-adenosina, N681 isopentenil-adenosina, N6-metil-adenosina, N7-metil-xantosina, éster de metila de ácido N-uracil-5-oxiacético, Puromicina, Queosina, ácido uracil-5oxiacético, éster de metila de ácido uracil-5-oxiacético, Wibutoxosina, Xantosina, e Xilo-adenosina. A preparação de tais análogos é conhecida a uma versado na técnica, por exemplo das patentes US 4.373.071, US 4.401.796, US 4.415.732, U.S. 4.458.066, US 4.500.707, US 4.668.777, US 4.973.679, US 5.047.524, US 5.132.418, US 5.153.319, US 5.262.530 e 5.700.642. No caso de um análogo como descrito acima, preferência particular é dada de acordo com a invenção àqueles análogos que aumentam a imunogenicidade da sequência de RNA imunoestimulante aqui usada como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção e/ou não interferem com uma outra modificação que foi introduzida no dito RNA imunoestimulante.
siRNA
Em uma outra modalidade, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ser na forma de siRNA. Um siRNA é de interesse particular com relação ao fenômeno de interferência de RNA. Atenção foi chamada para o fenômeno de interferência de RNA no curso da investigação imunológica. Nos últimos anos, um mecanismo de defesa baseado em RNA foi descoberto que ocorre tanto no reino dos fungos como no reino vegetal e reino animal e atua como um sistema imune do genoma. O sistema foi descrito originalmente em várias espécies independentemente uma das outras, primeiro em C. elegans, antes de ser possível identificar os mecanismos subjacentes dos processos como sendo idênticos: resistência de vírus mediada por RNA em plantas, PTGS (silenciamento de gene pós-transcricional) em plantas, e interferência de RNA em eucariotos é consequentemente com base em um procedimento comum. A técnica in vitro de interferência de RNA (RNAi) é com base nas moléculas de RNA bifilamentar (dsRNA) que desencadeia a supressão sequência-específica da expressão gênica (Zamore (2001) Nat. Struct. Biol. 9: 746-750; Sharp (2001) Genes Dev. 5:485-490: Hannon (2002) Nature 41: 244-251). Na transfecção das células mamíferas com dsRNA longo, a ativação da proteína quinase R e RnaseL provoca efeitos não-específicos, tais como, por exemplo, uma resposta de interferon (Stark et a/(1998) Annu. Rev. Biochem. 67: 227-264; He e Katze (2002) Immunol Viral. 15: 95-119). Estes efeitos não-específicos são evitados quando por exemplo 21 a 23 mer assim chamado sirna curto, (interferência de RNA pequena), for usado, porque efeitos não-específicos não são desencadeados por siRNA que é mais curto que 30 bp (Elbashir et al (2001) Nature 411: 494-498). Recentemente, moléculas de dsRNA têm também sido usadas in vivo (McCaffrey et al (2002), Nature 418: 38-39; Xia et al (2002), Nature Biotech. 20: 1006-1010; Brummelkamp et al (2002), Câncer Cell 2: 243-247). Desse modo, um siRNA como usado para o RNA complexado de acordo com a presente invenção tipicamente compreende uma sequência de RNA (uni ou) bifilamentar, preferivelmente um bifilamentar, com aproximadamente 8 a 30 nucleotídeos, preferivelmente 17 a 25 nucleotídeos, até mesmo mais preferivelmente de 20 a 25 e o mais preferivelmente de 21 a 23 nucleotídeos. Em princípio, todas as seções tendo um comprimento de 17 a 29, preferivelmente de 19 a 25, o mais preferivelmente de 21 a 23 pares de base ocorrendo na região de codificação de uma sequência de RNA como mencionada acima, por exemplo de uma sequência de (m)RNA, podem servir como sequência-alvo para um siRNA. Igualmente, siRNAs podem ser também direcionados contra sequências de nucleotídeo de uma proteína ou antígeno (terapeuticamente relevantes) descritos anteriormente que não fica na região de codificação, em particular na região de não-codificação de 5' do RNA, por exemplo, portanto, contra regiões de nãocodificação do RNA tendo uma função reguladora. A sequência-alvo do siRNA pode ficar portanto na região traduzida e/ou não-traduzida do RNA e/ou na região dos elementos de controle. A sequência-alvo de um siRNA pode também ficar na região de sobreposição de sequência não-traduzida e traduzida; em particular, a sequência-alvo pode compreender pelo menos um nucleotídeo a montante do tripleto de começo da região de codificação do RNA.
RNA ANTISSENSO
De acordo com uma quinta modalidade, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ser um RNA antissenso. No contexto da presente invenção, um RNA antissenso é preferivelmente uma molécula de RNA (unifilamentar) transcrita em base da codificação, ao invés do modelo, fita do DNA, de forma que seja complementar ao RNA sentido (mensageiro). Um RNA antissenso como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção tipicamente forma um duplex entre as moléculas de RNA sentido e antissenso e é desse modo capaz de bloquear a tradução do mRNA. Um RNA antissenso como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ser direcionado contra (pode ser complementar a) qualquer porção da sequência de mRNA que possa codificar uma proteína ou antígeno (terapeuticamente relevante) (por exemplo, como descrito anteriormente), se assim a tradução da proteína codificada for reduzida/suprimida. Consequentemente, a sequência-alvo do RNA antissenso no mRNA alvejado pode ser localizada na região traduzida e/ou nãotraduzida do mRNA, por exemplo na região dos elementos de controle de mRNA, em particular na região de não-codificação de 5' do RNA exercendo uma função reguladora. A sequência-alvo de um RNA antissenso no mRNA alvejado pode também ser construída de modo que o RNA antissenso liguese ao mRNA cobrindo com sua sequência uma região que é parcialmente complementar à sequência não-traduzida e traduzida (codificação) do mRNA alvejado; em particular, o RNA antissenso pode ser complementar à sequência de mRNA alvo em pelo menos um nucleotídeo a montante do tripleto de começo da região de codificação do mRNA alvejado. Preferivelmente, o RNA antissenso como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção compreende um comprimento como em geral definido acima para as moléculas de RNA (do RNA complexado da presente invenção). Tipicamente, o RNA antissenso como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção será um fragmento do mRNA alvejado. Em mais detalhe, o RNA antissenso pode ter mais preferivelmente um comprimento de 5 a 5000, de 500 a 5000, e, mais preferivelmente, de 1000 a 5000 ou, alternativamente, de 5 a 1000, 5 a 500, 5 a 250, de 5 a 100, de 5 a 50 ou de 5 a 30 nucleotídeos, ou, altemativamente, e até mesmo mais preferivelmente um comprimento de 20 a 100, de 20 a 80, ou de 20 a 60 nucleotídeos.
MODIFICAÇÕES DO RNA
De acordo com uma modalidade, o RNA como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção (independente de por exemplo seu potencial terapêutico específico, comprimento, e/ou sequência) particularmente o oligonucleotídeo de RNA curto, o RNA de codificação, o RNA imunoestimulante, o siRNA, o RNA antissenso, os riboswitches, ribozimas ou aptâmeros, podem ser fornecidos como um RNA modificado, em que qualquer modificação, em particular uma modificação descreveda no seguinte) pode ser introduzida (em qualquer combinação ou como tal) no RNA (moléculas) como definido acima. Porém, certos tipos de modificações podem ser mais adequadas para tipos de RNA específicos (por exemplo, mais adequadas por RNA de codificação), enquanto outras modificações podem ser aplicadas a qualquer molécula de RNA, por exemplo como definida aqui sem ser restringida aos tipos de RNA específicos. Consequentemente, modificações do RNA podem ser introduzidas para alcançar efeitos específicos ou complexos que podem desejados para o uso do tema em questão da invenção. Consequentemente, modificações podem ser projetadas por exemplo, para estabilizar o RNA contra degradação, intensificar sua eficácia de transfecção, melhorar sua eficácia de tradução, para aumentar seu potencial imunogênico e/ou intensificar seu potencial terapêutico (por exemplo, intensificar seu silenciamento ou propriedades antissenso). É particularmente preferido, se o RNA modificado Como componente do RNA complexado inventivo permitir combinar melhoria de pelo menos uma, mais preferivelmente de pelo menos duas propriedades funcionais, por exemplo para estabilizar o RNA e melhorar o potencial terapêutico ou imunogênico.
Em geral, é um objetivo primário estabilizar o RNA como aqui Usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção que permite estender seu tempo de meia-vida in vivo. Preferivelmente, o tempo de meia-vida de um RNA modificado sob condições in vivo é estendido (quando comparado ao RNA inalterado) em pelo menos 20, mais preferivelmente pelo menos 40, mais preferivelmente pelo menos 50 e até mesmo mais preferivelmente pelo menos 70, 80, 90, 100, 150 ou 200%. A estabilização alcançada pela modificação pode estender o tempo da meiavida do mRNA modificado em pelo menos 5, 10, 15, 30 ou mais preferivelmente pelo menos 60min quando comparado ao RNA inalterado.
De acordo com uma modalidade, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, preferivelmente um RNA de codificação, por exemplo mRNA, pode ser estabilizado modificando o conteúdo de G/C, por exemplo, da região de codificação do RNA. Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, o conteúdo de G/C da região de codificação do RNA (do RNA complexado da presente invenção) é alterado, particularmente aumentado, comparado ao conteúdo de G/C da região de codificação de seu RNA do tipo selvagem correspondente, isto é, o RNA inalterado. A sequência de aminoácido codificada do RNA modificado é preferivelmente não-alterada quando comparada à sequência de aminoácido codificada pelo RNA do tipo selvagem correspondente.
Esta modificação do RNA como aqui usada como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção é com base no fato que a sequência de codificação de qualquer RNA a ser traduzido é importante para tradução eficaz daquele RNA. Em particular, sequências tendo um conteúdo aumentado G (guanosina)/C (citosina) é mais estável que sequências tendo um conteúdo aumentado A (adenosina)/U (uracila). De acordo com a invenção, os códons do RNA são portanto alterados comparados ao RNA do tipo selvagem, retendo a sequência de aminoácido traduzida, de modo que eles incluem uma quantidade aumentada de nucleotídeos de G/C. A respeito do fato que vários códons codificam para um e o mesmo aminoácido (assim chamado degeneração do código genético), os códons mais favoráveis podem ser determinados para a estabilidade (assim chamado uso de códon alternativo).
Dependendo do aminoácido a ser codificado pelo RNA como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, há várias possibilidades para modificação da sequência de RNA, comparada à sua sequência do tipo selvagem. No caso de aminoácidos que são codificados por códons que contêm exclusivamente nucleotídeos G ou C, nenhuma modificação do códon é necessária. Desse modo, os códons para Pro (CCC ou CCG), Arg (CGC ou CGG), Ala (GCC ou GCG) e Gly (GGC ou GGG) não requerem nenhuma modificação, uma vez que nenhum A ou U está presente.
Em contraste, códons que contêm nucleotídeos A e/ou U podem ser modificados por substituição de outros códons que codificam para os mesmos aminoácidos mas não contêm nenhum A e/ou o U. Exemplos destes são:
os códons para Pro podem ser modificados de CCU ou CCA para CCC ou CCG;
os códons para Arg podem ser modificados de CGU ou CGA ou AGA ou AGG para CGC ou CGG;
os códons para Ala podem ser modificados de GCU ou GCA para GCC ou GCG;
os códons para Gly podem ser modificados de GGU ou GGA para GGC ou GGG.
Em outros casos, embora os nucleotídeos A ou U não possam ser eliminados dos códons, é porém possível diminuir o conteúdo de A e U usando códons contendo um conteúdo inferior de nucleotídeos A e/ou U. Exemplos destes são:
os códons para Phe podem ser modificados de UUU para UUC;
os códons para Leu podem ser modificados de UUA, UUG, CUU ou CUA para CUC ou CUG;
os códons para Ser podem ser modificados de UCU ou UCA ou AGU para UCC, UCG ou AGC;
o códon para Tyr pode ser modificado de UAU para UAC;
o códon para Cys pode ser modificado de UGU para UGC;
o códon para His pode ser modificado de CAU para CAC;
o códon para Gin pode ser modificado de CAA para CAG;
os códons para lie podem ser modificados de AUU ou AUA para AUC; os códons para Thr podem ser modificados de ACU ou ACA para ACC ou ACG;
o códon para Asn pode ser modificado de AAU para AAC;
o códon para Lys pode ser modificado de AAA para AAG;
os códons para Vai podem ser modificados de GUU ou GUA para GUC ou GUG;
o códon para Asp pode ser modificado de GAU para GAC;
o códon para Glu pode ser modificado de GAA para GAG;
o códon de parada UAA pode ser modificado para UAG ou UGA.
No caso dos códons para Met (AUG) e Trp (UGG), por outro lado, não há nenhuma possibilidade de modificação da sequência.
As substituições listadas acima podem ser usadas individualmente ou em todas as possíveis combinações para aumentar o conteúdo de G/C do RNA como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção comparado a seu RNA do tipo selvagem particular (isto é, a sequência original). Desse modo, por exemplo, todos os códons para Thr que ocorre na sequência do tipo selvagem podem ser modificados para ACC (ou ACG). Porém, preferivelmente por exemplo, combinações das possibilidades de substituição acima são usadas: substituição de todos os códons que codificam para Thr na sequência original (RNA do tipo selvagem) para ACC (ou ACG) e substituição de todos os códons que codificam originalmente para ser a UCC (ou UCG ou AGC);
substituição de todos os códons que codificam para lie na sequência original para AUC e substituição de todos os códons que codificam originalmente para Lys para AAGe substituição de todos os códons que codificam originalmente para Tyr a UAC;
substituição de todos os códons que codificam para Vai na sequência original para GUC (ou GUG) e substituição de todos os códons que codificam originalmente para Glu Para GAGe substituição de todos os códons que codificam originalmente para o Ala para GCC (ou GCG) e substituição de todos os códons que codificam originalmente para Arg para CGC (ou CGG);
substituição de todos os códons que codificam para Vai na sequência original para GUC (ou GUG) e substituição de todos os códons que codificam originalmente para Glu para GAG e substituição de todos os códons que codificam originalmente para Ala para GCC (ou GCG) e substituição de todos os códons que codificam originalmente para Gly para GGC (ou GGG) e
Substituição de todos os códons que codificam originalmente para Asn para AAC;
substituição de todos os códons que codificam para Vai na sequência original pâra GUC (ou GUG) e substituição de todos os códons que codificam originalmente para Phe para UUC e substituição de todos os códons que codificam originalmente para Cys para UGCe substituição de todos os códons que codificam originalmente para Leu a CUG (ou CUC) e substituição de todos os códons que codificam originalmente para Gin a CAG e substituição de todos os códons que codificam originalmente para Pro a CCC (ou CCG); etc.
Preferivelmente, o conteúdo de G/C da região de codificação do RNA como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção é aumentado em pelo menos 7%, mais preferivelmente em pelo menos 15%, particularmente de preferência em pelo menos 20%, comparado ao conteúdo de G/C da região codificada do RNA do tipo selvagem que codifica para uma proteína. De acordo com uma modalidade específica pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 80% e o mais preferivelmente pelo menos 90%, 95% ou até mesmo 100% dos códons substituíveis na região que codifica para uma proteína ou a sequência inteira da sequência de RNA do tipo selvagem são substituídos, assim aumentando ou mesmo maximizando o conteúdo GC da dita sequência.
Neste contexto, é particularmente preferível aumentar o conteúdo de G/C do RNA como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção para o máximo (isto é, 100% dos códons substituíveis), em particular na região que codifica para uma proteína, comparada à sequência do tipo selvagem.
De acordo com a invenção, uma outra modificação preferida do RNA como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção é com base na descoberta que a eficiência da tradução é também determinada por uma frequência diferente na ocorrência de tRNAs nas células. Desse modo, se os assim chamados códons raros estiverem presentes em uma sequência de RNA a uma proporção aumentada, a sequência de RNA modificada correspondente é traduzida para um grau significativamente mais fraco que no caso onde os códons que codificam para tRNAs relativamente frequentes estão presentes.
De acordo com a invenção, no RNA como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, a região que codifica para a proteína é modificada comparada à região correspondente do RNA do tipo selvagem de modo que pelo menos um códon da sequência do tipo selvagem que codifica para um tRNA que é relativamente raro nà célula é trocado por um códon que codifica para um tRNA que é relativamente frequente na célula e carrega o mesmo aminoácido como o tRNA relativamente raro. Por esta modificação, as sequências de RNA são modificadas de modo que os códons, para os quais os tRNAs de ocorrência frequente estão disponíveis, são inseridos. Em outras palavras, de acordo com a invenção, por esta modificação todos os códons da sequência do tipo selvagem que codificam para um tRNA que é relativamente raro na célula podem em cada caso ser trocados por um códon que codifica para um tRNA que é relativamente frequente na célula e que, em cada caso, carrega o mesmo aminoácido que o tRNA relativamente raro.
Quais tRNAs ocorrem relativamente frequentes na célula e quais, em contraste, ocorrem relativamente raros é conhecido a uma pessoa versada na técnica; conforme, por exemplo, Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666. Os códons que usam para o aminoácido particular o tRNA que ocorre o mais frequentemente, por exemplo o códon de Gly que usa o tRNA que ocorre mais frequentemente na célula (humana), são particularmente preferidos.
De acordo com a invenção, é particularmente preferível ligar o conteúdo de G/C sequencial que é aumentado, em particular maximizado, no RNA como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, com os códons frequentes sem modificar a sequência de aminoácido da proteína codificada pela região de codificação do RNA. Esta modalidade preferida permite provisão de um RNA em particular eficazmente traduzido e estabilizado (modificado) do RNA complexado de acordo com a presente invenção.
A determinação do conteúdo de G/C de um RNA como aqui usado como o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção (conteúdo aumentado de G/C; permuta de tRNAs) pode ser realizada usando o programa de computação explicado em WO 02/098443 o conteúdo da descreveção deste é incluído em seu escopo total na presente invenção. Usando este programa de computação, a sequência de nucleotídeo de qualquer RNA desejado pode ser modificada com a ajuda do código genético ou a natureza degenerativa do mesmo de modo que um conteúdo de G/C máximo resulta, em combinação com o uso de códons que codificam para tRNAs que ocorrem tão frequentemente quanto possível na célula, a sequência de aminoácido codificada pelo RNA (molécula) preferivelmente não sendo modificado comparada à sequência não-modificada. Alternativa5 mente, é também possível modificar apenas o conteúdo de G/C ou apenas o uso de códon comparado à sequência original. O código fonte em Visual Basic 6.0 (ambiente de desenvolvimento usado: Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 com Servicepack 3) é também descrito na WO 02/098443.
Em uma outra modalidade preferida da presente invenção, o conteúdo de A/U no ambiente do sítio de ligação do ribossoma do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado dá presente invenção é aumentado comparado ao conteúdo de A/U no ambiente do sítio de ligação de ribossoma de seu RNA do tipo selvagem particular. Esta modificação (um conteúdo de A/U aumentado ao redor do sítio de ligação de ribossoma) au15 menta a eficiência da ligação do ribossoma ao RNA modificado. Uma ligação eficaz do ribossoma ao sítio de ligação de ribossoma (sequência de Kozak: GCCGCCACCAUGG (SEQ ID NO: 33), o AUG forma o códon de começo) por sua vez tem o efeito de uma tradução eficaz do RNA modificado.
De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ser modificado com respeito aos elementos da sequência potencialmente desestabilizantes. Particularmente, a região de codificação e/ou a região não-traduzida de 5' e/ou 3' deste RNA pode ser modificada comparada ao RNA do tipo selvagem particular de modo que não contenha nenhum e25 lemento de sequência desestabilizante, a sequência de aminoácido codificada do RNA (molécula) preferivelmente não sendo modificada comparada a seu RNA do tipo selvagem particular. É conhecido que, por exemplo, em sequências de RNA eucarióticas, os elementos de sequência desentabilizantes (DSE) ocorrem, aos quais as proteínas sinais ligam-se e regulam a de30 gradação enzimática do RNA in vivo. Para mais estabilização do RNA (molécula), opcionalmente na região que codifica para uma proteína, uma ou mais tais modificações comparadas à região correspondente do RNA do tipo selvagem podem ser portanto realizadas, de forma que nenhum ou substancialmente nenhum elemento de sequência desestabilizante é contido lá. De acordo com a invenção, DSEs presentes nas regiões não-traduzidas (31e/ou 5'-UTR) podem também ser eliminados do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção por tais modificações.
Tais sequências desestabilizantes são, por exemplo, sequências ricas em AU (AURES), que ocorre nas seções de 3'-UTR de numerosos RNAs instáveis (Caput et al, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 1986, 83: 1670 a 1674). O RNA do RNA complexado de acordo com a presente invenção é, portanto, preferivelmente modificado comparado ao RNA do tipo selvagem de modo que o RNA não contenha nenhuma de tais sequências desestabilizantes. Isto também se aplica àqueles motivos de sequência que são reconhecidos através de possíveis endonucleases, por exemplo, a sequência GAACAAG que está contida no segmento de 3'-UTR do gene que codifica para o receptor de transferrina (Binder et al, EMBO J. 1994, 13: 1969 a 1980). Estes motivos de sequência são também preferivelmente removidos de acordo com a invenção no pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção.
De acordo com a presente invenção, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode ter uma estrutura 5' cap. Exemplos de estruturas cap que podem ser usadas de acordo com a invenção são m7G(5')ppp, (5'(A,G(5')ppp(5')A e G(5')ppp(5')G.
Outra modificação que intensifica a estabilidade do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção é com base em alongamentos de 5' ou 3' do RNA, tipicamente alongamentos de homonucleotídeo de um comprimento de 10 a 200 nucleotídeos. Estes alongamentos podem conter, particularmente se o RNA for fornecido como mRNA, uma cauda poli-a no término 3' de tipicamente cerca de 10 a 200 nucleotídeos de adenosina, preferivelmente cerca de 10 a 100 nucleotídeos de adenosina, mais preferivelmente cerca de 20 a 70 nucleotídeos de adenosina ou até mesmo mais preferivelmente cerca de 20 a 60 nucleotídeos de adenosina. Alternativa ou adicionalmente, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode conter, particularmente se o RNA for fornecido como mRNA, uma cauda poli-c no término 3' de tipicamente cerca de 10 a 200 nucleotídeos de citosina, preferivelmente cerca de 10 a 100 nucleotídeos de citosina, mais preferivelmente cerca de 20 a 70 nucleotídeos de citosina ou até mesmo mais preferivelmente cerca de 20 a 60 ou até mesmo 10 a 40 nucleotídeos de citosina.
Outra modificação que pode ocorrer no pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, particularmente se o RNA for fornecido como mRNA, refere-se preferivelmente a pelo menos uma IRES e/ou pelo menos uma sequência de estabilização de 5' e/ou 3'. De acordo com a invenção, um ou mais do assim chamado IRES (sítio de entrada ribossômico interno) podem ser inseridos no RNA. Um IRES pode, desse modo, funcionar como o sítio de ligação de ribossoma exclusivo, mas pode também servir para fornecer um RNA que codifica várias proteínas que serão traduzidas pelos ribossoma independentemente um do outro (RNA multicistrônico). Exemplos de sequências de IRES que podem ser usadas de acordo com a invenção são aquelas de picornavírus (por exemplo, FMDV), pestivírus (CFFV), poliovírus (PV), vírus da encefalomiocardite (ECMV), vírus da doença do pé e boca (FMDV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da febre suína clássica (CSFV), vírus do leucoma de camundongo (MLV), vírus da imunodeficiência símia (SIV) ou vírus da paralisia de grilo (CrPV).
De acordo com a invenção, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode apresentar pelo menos uma sequência de estabilização de 5' e/ou 3‘ como conhecida da técnica. Estas sequências de estabilização nas regiões não-traduzidas de 5' e/ou 3' têm o efeito de aumentar a meia-vida do RNA no citosol. Estas sequências de estabilização podem ter 100% de homologia de sequência às sequências de ocorrência natural que ocorrem em vírus, bactérias e eucariotos, mas podem também ser em parte ou completamente sintéticas. As sequências nãotraduzidas (UTR) do gene de globina, por exemplo de Homo sapiens ou Xenopus laevis podem ser mencionadas como um exemplo de sequências de estabilização que podem ser usadas na presente invenção para um RNA estabilizado. Outro exemplo de uma sequência de estabilização tem a fórmula geral (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC (SEQ ID NO: 34) que está contida na 3'UTR do RNA muito estável que codifica para globina, (I)colágeno, 15-lipoxigenase ou para tirosina hidroxilase (conforme Holcik et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1997, 94: 2410 a 2414). Tais sequências de estabilização podem ser usadas claro que individualmente ou em combinação umas com as outras e também em combinação com outras sequências de estabilização conhecidas a um versado na técnica. O pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção está portanto preferivelmente presente como RNA estabilizado (regiões não-traduzidas) de UTR de globina, em particular como RNA estabilizado (regiões não-traduzidas) de UTR de 3globina.
Se desejado, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode conter modificações de cadeia principal. Uma modificação de cadeia principal com relação à presente invenção é uma modificação em que o fosfato da cadeia principal dos nucleotídeos contidos no RNA é modificado quimicamente. Tais modificações de cadeia principal tipicamente incluem, sem implicar qualquer limitação, modificações do grupo que consiste em metilfosfonatos, fosforamidatos e fosforotioatos (por exemplo, citidina-5'-O-( 1 -tiofosfato)).
O pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode adicional ou alternativamente também conter modificações de açúcar. Uma modificação de açúcar com relação à presente invenção é uma modificação química do açúcar dos nucleotídeos presentes e tipicamente inclui, sem implicar qualquer limitação, modificações de açúcar selecionadas do grupo que consiste em 2'-desóxi-2'-fluoro-oligoribonucleotídeo (2,-fluoro-2'-desoxicitidinà-5,-trifosfato, 2,-fluoro-2'-desoxiuridina-5,-trifosfato), oligoribonucleotídeo de 2'-desóxi-2'-deamina (2,-amino-2'-desoxicitidina-5'trifosfato, 2'-amino-2'-desoxiuridina-5,-trifosfato), oligoribonucleotídeo de 2'O-alquila, oligoribonucleotídeo de 2'-desóxi-2'-c-alquila (2‘-O-metilcitidina-5'trifosfato, 2'-metiluridina-5'-trifosfato), oligoribonucleotídeo de 2‘-c-alquila, e isômeros dos mesmos (2'-aracitidina-5'-trifosfato, 2'-arauridina-5'-trifosfato), ou azidotrifosfato (2,-azido-2,-desoxicitidina-5'-trifosfato, 2'-azido-2ldesoxiuridina-5'-trifosfato).
O pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção pode adicional ou alternativamente também conter pelo me5 nos uma modificação de base que é preferivelmente adequada para aumentar a expressão da proteína codificada para por pelo menos um RNA (molécula) significativamente quando comparada com a sequência de RNA inalterada, isto é, natural (= nativa). Significativo neste caso significa um aumento na expressão da proteína comparada com a expressão da sequência de
RNA nativa em pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 30%, 40%, 50% ou 60%, mais preferivelmente em pelo menos 70%, 80%, 90% ou até mesmo 100% e o mais preferivelmente em pelo menos 150%, 200% ou até mesmo 300%. Com relação à presente invenção, um nucleotídeo que tem uma modificação de base é preferivelmente selecionado do grupo dos nu15 cleotídeos modificados na base que consistem em 2-amino-6cloropurinaribosídeo-5'-trifosfato, 2-aminoadenosina-5'-trifosfato, 2tiocitidina-5'-trifosfato, 2-tiouridina-5'-trifosfato, 4-tiouridina-5'-trifosfato, 5aminoalilcitidina-5'-trifosfato, 5-aminoaliluridina-5'-trifosfato, 5-bromocitidina5'-trifosfato, 5-bromouridina-5'-trifosfato, 5-iodocitidina-5'-trifosfato, 520 iodouridina-5'-trifosfato, 5-metilcitidina-5'-trifosfato, 5-metiluridina-5'-trifosfato, 6-azacitidina-5'-trifosfato, 6-azauridina-5'-trifosfato, 6-cloropurinaribosídeo-5'trifosfato, 7-deazaadenosina-5'-trifosfato, 7-deazaguanosina-5'-trifosfato, 8azaadenosina-5'-trifosfato, 8-azidoadenosina-5'-trifosfato, benzimidazolribosídeo-5'-trifosfato, N1-metiladenosina-5'-trifosfato, N1-metilguanosino-5'25 trifosfato, N6-metiladenosina-5'-trifosfato, O6-metilguanosino-5'-trifosfato, pseudouridina-5'-trifosfato, ou puromicin-5'-trifosfato, xantosino-5'-trifosfato. Preferência particular é dada aos nucleotídeos para modificações de base selecionados do grupo de nucleotídeos modificados na base que consistem em 5-metilcitidina-5'-trifosfato, 7-deazaguanosino-5'-trifosfato, 530 bromocitidina-5'-trifosfato, e pseudouridina-5'-trifosfato.
O pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção possa adicional ou alternativamente também conter peío menos uma modificação de um nucleosídeo de um nucleotídeo como contido no pelo menos um RNA (molécula) que atua como imunossupressor, isto é, é preferivelmente adequado para impedir ou diminuir uma resposta imune, quando administrado a um paciente em necessidade do mesmo. Tal pelo menos uma modificação é preferivelmente selecionada de modificações de nucleosídeo selecionadas de:
a) uma modificação química na posição 4, 5 ou 6 da base de pirimidina dos nucleosídeos de citidina e/ou uridina;
b) uma modificação química na posição 2, 6, 7 ou 8 da base de purina dos nucleosídeos de adenosina, inosina e/ou guanosina; e/ou
c) uma modificação química na posição 2' do açúcar dos nucleosídeos de adenosina, inosina, guanosina, citidina e/ou uridina.
Neste contexto, um (m)RNA é uma cadeia de ácido nucleico formada por vários nucleotídeos tipicamente selecionados de adenosina-51monofosfato, guanosina-5'-monofosfato, inosino-5'-monofosfato, citidina-5'monofosfato e/ou uridina-5'-monofosfato. Aqueles nucleotídeos são ligados uns aos outros por meio de seu monofnsfato Nucleotídeos comproondcnv nucleosídeos e um 5'-monofosfato como um componente estrutural, em que os nucleosídeos são tipicamente formados por uma núcleo-base, isto é, uma pirimidina (uracila ou citosina) ou uma base de purina (adenina ou guanina), e um açúcar. Consequentemente, uma modificação de um nucleosídeo de pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção é sempre intencionada a significar urina modificação na estrutura de nucleosídeo do respectivo nucleotídeo do dito pelo menos um RNA (molécula).
De acordo com uma primeira modificação a), pelo menos um nucleosídeo do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, pode ser modificado com uma modificação química na posição 5 ou 6 da base de pirimidina dos nucleosídeos citidina e/ou uridina. Sem serem limitadas a estes, tais modificações químicas na posição 4, 5 ou 6 da pirimidina de base dos nucleosídeos citidina e/ou uridina podem ser selecionadas do grupo que consiste em: 4-tio, 5-iodo-/(5-i-), 5-bromo-/(5-Br-), 5-aminoalil-, 5-fluoro-/(5-f-), 5-hidróxi-, 5^hidro-/(5-H-), 5-nitro-, 5-propinil-/(597 (C^C-cH3)-), 5-metil-, 5-metil-2-tio-, 5-formil-, 5-hidroximetil-, 5-metóxi-, éster de metila de ácido 5-oxiacético-, ácido 5-oxiacético-, 5-carboxi-hidroximetil-, éster de metila de 5-(carboxi-hidroximetil)pirimidina-, 5-metoxicarbonilmetil-, 5-metoxicarbonilmetil-2-tio, 5-aminometil-, 5-aminometil-2-tio-, 5-aminometil2-seleno-, 5-metilaminometil-, 5-carbamoilmetil-, 5-carboximetilaminometil-, 5-carboximetilaminometil-2-tio-, 5-carboximetil-, 5-metildi-hidro-, 5taurinometil-, 5-taurinometil-2-tiouridina, 5-isopentenilaminometil-, 5isopentenilaminometil-2-tio-, 5-aminopropil-/(5-(C3H6NH3)-), 5-metóxi-etóximetil-/(5-(CH2-O-C2H4-O-cH3)-), ou 6-aza-.
De acordo com a segunda modificação b), pelo menos um nucleosídeo do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, adequado para suprimir e/ou evitar uma resposta imunoestimulante (inata) em um mamífero tipicamente apresentada ao administrar o pelo menos um RNA (molécula) correspondente inalterado, pode ser modificado alternativamente com uma modificação química na posição 2, 6, 7 ou 8 da base de purina dos nucleosídeos adenosina, inosina e/ou guanosina. Sem serem limitadas a estas, tais modificações químicas na posição 2, 6. 7 ou 8 da base de purina dos nucleosídeos adenosina, inosina e/ou guanosina podem ser selecionadas do grupo que consiste em 2-amino-, 7-deaza-, 8aza-, ou 8-azido-.
De acordo com uma terceira modificação c), pelo menos um nucleosídeo do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção, adequado para suprimir e/ou evitando uma resposta imunoestimulante (inata) em um mamífero tipicamente apresentada ao administrar o pelo menos um RNA (molécula) correspondente inalterado, pode ser modificado com pelo menos uma modificação química na posição 2' do açúcar dos nucleosídeos adenosina, inosina, guanosina, citidina e/ou uridina, quando incorporados na sequência de RNA. Sem serem limitadas a estas, tais modificações químicas na posição 2' do açúcar dos nucleosídeos adenosina, inosina, guanosina, citidina e/ou uridina podem ser selecionadas do grupo que consiste em: 2'-desóxi-, 2'-amino-2'-desóxi-, 2'-amino-, 2'-fluoro-2'desóxi-, 2'-fluoro-, 2,-O-metil-2'-desóxi-ou 2'-O-metil-.
De acordo com uma modalidade particularmente preferida, pelo menos um nucleosídeo do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção foi modificado na posição 4, 5 ou 6 da pirimidina de base dos nucleosídeos citidina e/ou uridina e na posição 2' do açúcar de ribose de acordo com as modificações a) e c) como definidas acima.
De acordo com outra modalidade particularmente preferida, pelo menos um nucleosídeo do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção foi modificado na posição 2, 6, 7 ou 8 da base de purina dos nucleosídeos adenosina, inosina e/ou guanosina e na posição 2' do açúcar de ribose de acordo com as modificações b) e c) como definidas acima, mais preferivelmente como definidas acima.
De acordo com ainda uma outra modalidade particularmente preferida, pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da presente invenção foi modificado levando aos nucleotídeos quimicamente modificados (do (m)RNA) selecionados do grupo a seguir: 4-tio-uridina-5'-(mono)fosfato, 2-aminopurina-ribosídeo-5'-(mono)fosfato, S-aminoalilcitidina-S1(mono)fosfato , 5-aminoaliluridina-5‘-(mono)fosfato , S-Bromonitidina-õ1-(mono)fosfato, 5-Bromo-2'-desoxicitidina-5'-(mono)fosfato, 5-Bromouridina5'-(mono)fosfato, 5-Bromo-2'-desoxiuridina-5'-(mono)fosfato, 5-iodocitidina5'-(mono)fosfato, 5-iodo-2'-desoxicitidina-5'-(mono)fosfato, 5-iodouridina-5'(mono)fosfato, 5-iodo-2'-desoxiuridina-5'-(mono)fosfato, 5-Propinil-2'desoxicitidina-5'-(mono)fosfato, 5-Propinil-2'-desoxiuridina-5'-(mono)fosfato, 5-formilcitidina-5'-(mono)fosfato, 5,2'-O-dimetilcitidina-5'-(mono)fosfato, 5hidroximetilcitidina-5'-(mono)fosfato, 5-formil-2'-O-metilcitidina-5'(mono)fosfato, S^-O-dimetiluridina-õXmonoJfosfato, 5-metil-2-tiouridina-5'(mono)fosfato, 5-hidroxiuridina-5'-(mono)fosfato, 5-metoxiuridina-5'(mono)fosfato, 5-ácido oxiacético-5'-(mono)fosfato de uridina, uridina 5-éster de metila de ácido oxiacético-5'-(mono)fosfato, 5-(carboxihidroximetiOuridina-õXmonoJfosfato, éster-5'-(mono)fosfato de metila de 5(carboxi-riidroximetil)uridina, õ-metoxicarbonilmetiluridina-SHmonoJfosfato, 5-metoxicarbonilmetil-2'-0-metiluridina-5'-(mono)fosfato, 5metoxicarbonilmetil-2-tiouridina-5'-(mono)fosfato, 5-aminometil-2-tiouridina99
5'-(mono)fosfato, 5-metilaminometiluridina-5'-(mono)fosfato, 5metilaminometil-2-tiouridina-5'-(mono)fosfato, 5-metilaminometil-2selenouridina-5'-(mono)fosfato, 5-carbamoilmetiluridina-5'-(mono)fosfato, 5carbamoilmetil-2'-O-metiluridina-5'-(mono)fosfato, 5carboximetilaminometiluridina-õXmoncOfosfato, 5-carboximetilaminometil-2'O-metiluridina-5'-(mono)fosfato, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina-5'(mono)fosfato, 5-carboximetiluridina-5'-(mono)fosfato, 5-metildi-hidrouridina5'-(mono)fosfato, 5-taurinometiluridina-5'-(mono)fosfato, 5-taurinometil-2tiouridina-5'-(mono)fosfato, 5-(isopentenilaminometil)uridina-5'-(mono)fosfato, 5-(isopentenilaminometil)-2-tiouridina-5'-(mono)fosfato, 5(isopentenilaminometil)-2'-O-metiluridina-5'-(mono)fosfato, 6-azacitidina-5'(mono)fosfato, 7-deazaadenosina-5'-(mono)fosfato, 7-deazaguanosino-5'(mono)fosfato, 8-azaadenosina-5'-(mono)fosfato, 8-azidoadenosina-5'(mono)fosfato, Pseudouridina-5'-(mono)fosfato, 2'-amino-2'-desoxicitidina(mono)fosfato, 2'-fluorotimidino-5,-(mono)fosfato, inosino-5'-(mono)fosfato, 2'-0-metil-inosino-5'-(mono)fosfato.
_Se desejado, o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complo xado da presente invenção pode conter substituições, adições ou deleções de nucleotídeos que são preferivelmente introduzidas para alcançar efeitos funcionais. Estes vários tipos de modificações de nucleotídeo podem ser introduzidos, se o RNA, por exemplo o mRNA, for derivado de uma sequência WT. Por este meio, uma matriz de DNA é usada para preparação do RNA do RNA complexado de acordo com a presente invenção por técnicas de mutagênese loco dirigida bem-conhecidas (vide por exemplo Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001). Em um tal processo, para a preparação do RNA, uma molécula de DNA correspondente pode ser transcrita in vitro. Esta matriz de DNA tem um promotor adequado, por exemplo um promotor T7 ou SP6, para transcrição in vitro que é seguida pela sequência de nucleotídeo desejada para o RNA para ser preparado e um sinal de terminação para transcrição in vitro. De acordo com a invenção, a molécula de DNA que forma a matriz de um RNA de interesse pode ser prepara100 da por proliferação fermentativa e isolamento subsequente como parte de um plasmídeo que pode ser replicado em bactérias. Plasmídeos que podem ser mencionados como adequados para a presente invenção são por exemplo os plasmídeos pT7Ts (número de acesso do GenBank U26404; Lai etal, Development 1995, 121: 2349 a 2360), série pGEM®, por exemplo pGEM®1 (número de acesso do GenBank X65300; de Promega) e pSP64 (número acesso do GenBank X65327); conforme também Mezei e Storts, Purification of PCR Products, em: Griffin e Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.
A massa ou a razão molar dos componentes do RNA complexo de acordo com a presente invenção, que significa a massa ou a razão molar do RNA (quer seja unifilamentar quer seja bifilamentar) para o um ou mais oligopeptídeos tipicamente, é de forma alguma restrita e é escolhida como adequada para a aplicação particular. Porém, a massa ou a razão molar do um ou mais oligopeptídeos e do RNA pode ser menos que 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, ou menos que 1:20. Alternativamente, a massa ou a razão molar do um nu mais oligopeptídeos e do RNA pode mais alta que 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1,9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1,20:1. Preferivelmente, a massa ou razão molar do um ou mais oligopeptídeos e do RNA pode ser não menos que 1:5 com respeito ao conteúdo do um ou mais oligopeptídeos. Mais preferivelmente, a razão (molar ou) de massa do um ou mais oligopeptídeos e do RNA é de 1:5 a 20:1, mais preferivelmente de 1:3 a 15:1.
De acordo com uma modalidade preferida particular, a razão de massa dos componentés do RNA complexo de acordo com a presente invenção, particularmente a razão de massa do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado para o um ou mais oligopeptídeos é preferivelmente em uma faixa de cerca de 1:100 a cerca de 1:0,5, mais preferivelmente tem um valor de cerca de 1:50 a cerca de 1:1, ou até mesmo mais preferivelmente cerca de 1:100, cerca de 1:90, cerca de 1:80, cerca de 1:70, cerca de 1:60, cerca de 1:50, cerca de 1: 45, cerca de 1:40, cerca de 1:35, cerca de
101
1:30, cerca de 1:25, cerca de 1:20, cerca de 1:15, cerca de 1:10, cerca de 1:5, cerca de 1:4, cerca de 1:3, cerca de 1:2, cerca de 1:1 ou igual a cerca de 1:0,5 com relação à razão de RNA:peptídeo no complexo, em que qualquer faixa pode ser formada combinando dois dos valores especificamente acima indicados. O mais preferivelmente, a razão de massa do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado para o um ou mais oligopeptídeos pode ser em uma faixa de cerca de 1:50 a cerca de 1:1.
Igualmente, a razão molar dos componentes do RNA complexo de acordo com a presente invenção, particularmente a razão molar do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado para o um ou mais oligopeptídeos é preferivelmente, de acordo com uma modalidade preferida particular, em uma faixa de cerca de 1:20000 a cerca de 1:500 ou até mesmo 1:250, mais preferivelmente em uma faixa de cerca de 1:10000 a cerca de 1:1000, ou até mesmo mais preferivelmente tem um valor de cerca de 1:9500, cerca de 1:9000, cerca de 1:8500, cerca de 1:8000, cerca de 1:7500, cerca de 1:7000, cerca de 1:6500, cerca de 1:6000, cerca de 1:5500, cerca de 1:5000, cerca de 1:4500, cerca de 1:4000, cerca dê 1:3500, corna der 1:3000, cerca de 1:2500, cerca de 1:2000, cerca de 1:1500, cerca de 1:1000, cerca de 1:500, cerca de 1:450, cerca de 1: 400, cerca de 1:350, cerca de 1:300, ou cerca de 1:250 com relação à razão de RNA:peptídeo no complexo, em que qualquer faixa pode ser formada combinando dois dos valores acima especificamente indicados. O mais preferivelmente, a razão molar do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado para o um ou mais oligopeptídeos pode ser em uma faixa de cerca de 1:10000 a cerca de 1:1000. Para propósitos de imunoestimulação, a razão molar dos componentes do RNA complexo de acordo com a presente invenção pode ser em uma faixa de cerca de 1:10000 a cerca de 1:100 ou até mesmo em uma faixa de cerca de 1:10000 a cerca de 1:500.
No contexto da presente invenção, a razão molar e a razão de massa são tipicamente dependentes uma da outra, em que cada uma destas razões pode ser influenciada por fatores tais como comprimento de RNA ou comprimento de peptídeo. Porém, para propósitos de determinação, a razão
102 de massa e a razão molar podem ser calculadas para um tamanho de complexo médio, em que uma razão de massa de cerca de 1:50-1:1 corresponde aproximadamente a uma razão molar de cerca de 1:10000-1:1000. Um esquema exemplar de razões molar e de massa é dado nos Exemplos que podem ser adicionalmente usados para cálculo.
Além disso, a razão dos componentes do complexo de RNA de acordo com a presente invenção, particularmente a razão do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado para o um ou mais oligopeptídeos, pode também ser calculada com base na razão de nitrogênio/fosfato (razão N/P) do complexo de RNA inteiro. Por exemplo, 1 pg de RNA tipicamente contém cerca de 3 nmol de resíduos de fosfato, contanto que o RNA exiba uma distribuição estatística de bases. Adicionalmente, 1 pg de peptídeo tipicamente contém cerca de x nmol de resíduos de nitrogênio, dependente do peso molecular e do número de aminoácidos básicos. Quando exemplarmente calculado para (Arg)9 (peso molecular 1424 g/mol, 9 átomos de nitrogênio), 1 pg (Arg)g contém cerca de 700 pmol (Arg)g e desse modo 700 x 9=6300 pmols aminoácidos básicos = 6,3 nmols de átomos do nitrogênio. Para uma razão de massa de cerca de 1:1 RNA/(Arg)9 uma razão de N/P pode ser calculada de cerca de 2. Quando exemplarmente calculado para protamina (peso molecular cerca de 4250 g/mol, 21 átomos de nitrogênio, quando protamina de salmão for usada) com uma razão de massa de cerca de 2:1 com 2 pg de RNA, 6 nmol de fosfato para serem calculados para o RNA; 1 pg de protamina contém cerca de 235 pmols de moléculas de protamina e desse modo 235 x 21 = 4935 pmols de átomos de nitrogênio básicos = 4,9 nmols de átomos de nitrogênio. Para uma razão de massa de cerca de 2:1 RNA/protamina, uma razão de N/P pode ser calculada de cerca de 0,81. Para uma razão de massa de cerca de 8:1 RNA/protamina, uma razão de N/P pode ser calculada de cerca de 0,2. No contexto da presente invenção, uma razão N/P é preferivelmente na faixa de cerca de 0,2-50, preferivelmente em uma faixa de cerca de 0,5-50 e o mais preferivelmente em uma faixa de cerca de 0,75-25 ou 1-25 com relação à razão de RNA:peptídeo no complexo, até mesmo mais preferivelmente na faixa de cerca de 10-50 e o
103 mais preferivelmente na faixa de cerca de 25-50).
Outra modalidade da presente invenção refere-se a uma composição, preferivelmente uma composição farmacêutica, compreendendo um RNA complexado de acordo com a presente invenção e opcionalmente um veículo (farmaceuticamente) adequado e/ou outras substâncias auxiliares e aditivos. A composição (farmacêutica) empregada de acordo com a presente invenção tipicamente compreende uma quantidade segura e eficaz de um RNA complexado de acordo com a presente invenção. Como aqui usado, uma quantidade segura e eficaz significa uma quantidade de um RNA complexado de acordo com a presente invenção tal como para fornecer um efeito em células ou tecidos in vitro ou in vivo, por exemplo significativamente induzir uma expressão (in vitro ou in vivo) de uma proteína codificada como descrito acima, tal como uma proteína terapeuticamente ativa, um anticorpo ou um antígeno, ou qualquer outra proteína ou peptídeo como descritos acima, para induzir uma alteração positiva de um estado a ser tratado (in vivo) em uma célula, um tecido ou um organismo, por exemplo uma doença de tumor ou doença dé câncer, uma dnpnça narriiovasntilnr, nmn dnnnça infecciosa, uma doença autoimune, doenças (mono)genéticas, etc. como descritas aqui, e/ou induzir ou intensificar uma resposta imune. Porém, ao mesmo tempo uma quantidade segura e eficaz é baixa o bastante para evitar efeitos colaterais sérios, particularmente na terapia de doenças como mencionadas aqui, quer dizer dar uma possível razão razoável de vantagem e risco. Determinação destes limites tipicamente fica dentro da faixa do julgamento médico razoável. Portanto , a concentração do RNA complexado de acordo com a invenção em tais composições (farmacêuticas) pode variar, por exemplo, sem estar limitada a esta, dentro de uma gama extensiva de por exemplo 0,1 ng a 1.000 mg/ml ou até mesmo mais. Uma tal quantidade segura e eficaz de um RNA complexado de acordo com a invenção pode variar com relação ao estado particular a ser tratado e a idade e o estado físico do paciente a ser tratado, a severidade do estado, a duração do tratamento, a natureza da terapia concomitante, do veículo particular (farmaceuticamente) adequado usado e fatores similares dentro do conhecimento e
104 experiência do médico acompanhante. A composição (farmacêutica) descrita aqui pode ser empregada para propósitos de medicina humana e também veterinária.
A composição (farmacêutica) de acordo com a invenção descrita aqui pode opcionalmente compreender um veículo adequado, preferivelmente um veículo farmaceuticamente adequàdo. O termo veículo adequado usado aqui preferivelmente inclui um ou mais enchedores compatíveis sólidos ou líquidos, ou diluentes ou compostos de encapsulação que sejam adequados para administração a uma pessoa. O termo compatível como aqui usado significa que os constituintes da composição são capazes de serem misturados com o RNA complexado de acordo com a invenção e a substância auxiliar opcionalmente contida na composição, como tal e um com o outro de uma maneira de modo que nenhuma interação que substancialmente reduziría a efetividade (farmacêutico) da composição sob condição usuais de uso ocorre, tal como por exemplo reduziría a atividade (farmacêutica) das proteínas codificadas ou até mesmo suprimiria ou prejudicaria a expressão das proteínas codificadas ou porOxemploJnibina o^oteneial 4mtrnogênico do RNA complexado. Veículo adequado tem que ter uma pureza suficientemente alta e uma toxicidade suficientemente baixa, claro que, para o tornar adequado para administração a uma pessoa a ser tratada.
Veículos são selecionados dependendo da forma de administração, quer seja na forma sólida ou líquida. Consequentemente, a escolha de um veículo (farmaceuticamente) adequado como descrito acima é em particular determinada pelo modo em que a composição (farmacêutica) de acor25 do com a invenção é administrada. A composição (farmacêutica) de acordo com a invenção pode ser administrada, por exemplo, sistemicamente. Rotas de administração incluem por exemplo rotas intra ou transdérmica, oral, parenteral, incluindo subcutânea, intramuscular, injeções i.a. ou intravenosas, tópica e/ou intranasal. A quantidade adequada da composição (farmacêuti30 ca) de acordo com a invenção que será usada pode ser determinada através de experimentos de rotina usando modelos animais. Tais modelos incluem, mas sem serem limitados a estes, modelos dos modelos de coelho, ovelha,
105 camundongo, rato, cachorro e primata não-humano.
Se administrado na forma líquida, por exemplo através de injeção, o veículo pode ser selecionado de água livre de pirogênio; solução salina isotônica e soluções tamponadas, por exemplo soluções tamponadas de fosfato. Formas de dose de unidade preferida para injeção incluem soluções estéreis de água, solução salina fisiológica ou misturas das mesmas, por exemplo solução de Ringer-Lactat. O pH de tais soluções deveria ser ajustado em cerca de 7,0 a cerca de 7,6, preferivelmente cerca de 7,4.
Preferivelmente, a composição (farmacêutica) contém o RNA complexado inventivo em água. Alternativamente, a composição (farmacêutica) de acordo com a invenção pode conter um tampão de injeção como veículo para preparação líquida que preferivelmente melhora a transfecção e, se o RNA do RNA complexado da presente invenção codifica para uma proteína, também a tradução da proteína codificada, em células, tecidos ou um organismo. A composição (farmacêutica) de acordo com a invenção pode compreender, por exemplo, um tampão de injeção aquoso ou água contendo, com respeito à composição (farmacêutica) total, se esta estiver na forma líquida, um sal de sódio, preferivelmente pelo menos sal de sódio a 50 mM, um sal de cálcio, preferivelmente pelo menos sal de cálcio a 0,01 mM e/ou de magnésio, e opcionalmente um sal de potássio, preferivelmente pelo menos sal de potássio a 3 mM. De acordo com uma modalidade preferida, os sais de sódio, de cálcio e/ou sais de magnésio e opcionalmente sais de potássio contidos em um tal tampão de injeção são na forma de haletos, por exemplo cloretos, iodetos ou brometos, ou na forma de seus hidróxidos, carbonatas, bicarbonatos ou sulfatas. Exemplos que serão mencionados aqui são para o sal de sódio NaCI, Nal, NaBr, Na2CO3, NaHCO3, e/ou Na2SO4, para o sal de potássio KCI opcionalmente presente, Kl, KBr, K2CO3, KHCO3, e/ou K2SO4, e para o sal de cálcio e/ou de magnésio CaCI2, Cal2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca(OH)2, MgCI2, Mgl2, MgBr2, MgCO3, MgSO4, e/ou Mg(OH)2. O tampão de injeção pode também conter ârlions orgânicos dos cátions acima mencionados. Em uma modalidade particularmente preferida, um tal tampão de injeção contém como sais cloreto de sódio (NaCI), cloreto
106 de cálcio (CaCI2) e cloreto de potássio opcionalmente (KCI), sendo também possível para outros ânions estarem presentes além dos cloretos.
Estes sais estão tipicamente presentes no tampão de injeção opcionalmente usado na composição (farmacêutica) de acordo com a inven5 ção, com respeito à composição (farmacêutica) total (se esta estiver na forma líquida), em uma concentração de pelo menos cloreto de sódio a 50 mM (NaCl), pelo menos cloreto de potássio a 3 mM (KCI) e pelo menos 0,01 mM de cálcio e/ou cloreto de magnésio (CaCI2). O tampão de injeção pode ser na forma de tampões de injeção hipertônicos e isotônicos ou hipotônicos.
Com relação à presente invenção, neste contexto o tampão de injeção é hipertônico, isotônico ou hipotônico em cada caso com respeito ao meio de referência particular, isto é, o tampão de injeção ou tem um conteúdo de sal mais alto, o mesmo ou um mais baixo comparado ao meio de referência particular, tais concentrações dos sais acima mencionados não levam dano às células causado por osmose ou outros efeitos de concentração preferivelmente sendo empregados. Meios de referência aqui são, por exemplo, líquidos que ocorrem em métodos in vivo, tais como, por exemplo, sangue, fluido de linfa, fluidos de citosol ou outros fluidos que ocorrem no corpo, ou líquidos ou tampões empregados convencionalmente em métodos in vitro.
Tais líquidos e tampões são conhecidos a uma pessoa versada na técnica.
O tampão de injeção opcionalmente contido na composição (farmacêutica) de acordo com a invenção pode também conter outros componentes, por exemplo açúcares (mono, di, tri ou polissacarídeos), em particular glicose ou manitol. Em uma modalidade preferida, porém, nenhum a25 çúcar está presente no tampão de injeção usado. É também preferível para o tampão de injeção precisamente não conter nenhum componente nãocarregado, tal como, por exemplo, açúcares. O tampão de injeção tipicamente contém cátions de metal, em particular do grupo que consiste em metais alcalinos ou alcalinoterrosos, exclusivamente e ânions, em particular os â30 nions descritos acima. O pH do tampão de injeção usado, com respeito à composição (farmacêutica) total, se esta estiver na forma líquida, é preferivelmente entre 1 e 8,5, preferivelmente entre 3 e 5, mais preferivelmente
107 entre 5,5 e 7,5, em particular entre 5,5 e 6,5. Se apropriado, o tampão de injeção pode também conter um sistema de tampão que fixa o tampão de injeção a um pH tamponado. Isto pode ser, por exemplo, um sistema de tampão de fosfato, HEPES ou Na2HPO4/NaH2PO4. Porém, o tampão de injeção usado muito particularmente de preferência não contém nenhum dos sistemas de tampão acima mencionados ou não contém absolutamente nenhum sistema de tampão.
O tampão de injeção opcionalmente contido na composição (farmacêutica) de acordo com a invenção pode conter, além ou como uma alternativa aos cátions monovalentes e divalentes descritos, cátions divalentes, em particular do grupo que consiste em metais alcalinosterrosos, tal como, por exemplo, magnésio (Mg2 +), ou também ferro (Fe2+), e cátions monovalentes, em particular dos grupos que consistem em metais alcalinos, tais como, por exemplo, lítio (Li+). Estes cátions monovalentes são preferivelmente na forma de seus sais, por exemplo na forma de haletos, por exemplo cloretos, iodetos ou brometos, ou na forma de seus hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos ou sulfatos. Exemplos que serão mencionados aqui não, para o sal de lítio LiCI, Lil, LiBr, Li2CO3, LÍHCO3, Li2SO4, para 0 sal de magnésio MgCI2, Mgl2, MgBr2, MgCO3, MgSO4, e Mg(OH)2, e para o sal de ferro FeCI2, FeBr2, Fel2, FeF2, Fe2O3, FeCO3, FeSO4, Fe(OH)2. Todas as combinações de cátions di e/ou monovalentes, como descritos acima, são igualmente inclusas. Tais tampões de injeção contendo apenas cátions divalentes, apenas monovalentes ou di e monovalentes podem ser desse modo usados na composição (farmacêutica) de acordo com a invenção. Tais tampões de injeção contendo apenas um tipo de cátions di ou monovalentes, particularmente de preferência, por exemplo, apenas cátions Ca2+, ou um sal do mesmo, por exemplo CaCI2, podem ser igualmente usados. As molaridades dadas acima para Ca2+ (como um cátion divalente) e Na1+ (como um cátion monovalente) (quer dizer tipicamente concentrações de pelo menos Na+ a 50 mM pelo menos 0,01 mM de Ca2+ e opcionalmente pelo menos 3 mM de K+) no tampão de injeção podem ser também levados em conta se outro cátion di ou monovalente, em particular outros cátions do grupo que consiste
108 nos metais alcalinosterrosos e metais alcalinos, são empregados em vez de alguns ou todos Ca2+ ou, respectivamente, Na1+ no tampão de injeção usado de acordo com a invenção para a preparação da solução de injeção. Todos Ca2+ ou Na1+, como mencionados acima, podem ser substituídos de fato por, em cada caso, outros cátions di ou, respectivamente, monovalentes no tampão de injeção usado, por exemplo também por uma combinação de outros cátions divalentes (em vez de Ca2+) e/ou uma combinação de outros cátions monovalentes (em vez de Na1+) (em particular uma combinação de outros cátions divalentes do grupo que consiste nos metais alcalinosterrosos ou, respectivamente, de outros cátions monovalentes do grupo que consiste nos metais alcalinos), mas é preferível substituir no máximo alguns do Ca2+ ou Na1+, isto é, em pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 40%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 60 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 80% das molaridades totais particulares dos cátions mono e divalentes na injeção a ser ocupada por Ca2+ e, respectivamente, Na1+. Porém, é muito particularmente preferível se o tampão de injeção opcionalmente contido na composição farmacêutica Hp annrrln nnm a inwenr.ãn r.nntivnr Ca2+ exclusivamente como um cátion divalente e Na1+ como um cátion monovalente, quer dizer, com respeito à composição farmacêutica total, Ca2+ representa 100% da molaridade total dos cátions divalentes, da mesma maneira que Na1+ representa 100% da molaridade total dos cátions monovalentes. A solução aquosa do tampão de injeção pode conter, com respeito à composição farmacêutica total, até 30 % em mol dos sais contidos na solução, preferivelmente até 25 % em mol, preferivelmente até 20 % em mol, além disso preferivelmente até 15 % em mol, mais preferivelmente até 10 % em mol, até mesmo mais preferivelmente até 5 % em mol, igualmente mais preferivelmente até 2 % em mol dois sais insolúveis ou fracamente solúveis. Sais que são fracamente solúveis no contexto da presente invenção são aqueles do que o produto da solubilidade é < 10'4. Sais que são facilmente solúveis são aqueles do que o produto de solubilidade é > 10’4. Preferivelmente,, o tampão de injeção opcionalmente contido na composição farmacêutica de acordo com a invenção é de 50 mM a 800 mM, preferivelmente
109 de 60 mM a 500 mM, mais preferivelmente de 70 mM a 250 mM, particularmente de preferência 60 mM a 110 mM em cloreto de sódio (NaCI), de 0,01 mM a 100 mM, preferivelmente de 0,5 mM a 80 mM, mais preferivelmente de 1,5 mM a 40 mM em cloreto de cálcio (CaCI2) e opcionalmente de 3 mM a 500 mM, preferivelmente de 4 mM a 300 mM, mais preferivelmente de 5 mM a 200 mM em cloreto de potássio (KCI). Ânions orgânicos podem também ocorrer como outros ânions além dos ânions inorgânicos acima mencionados, por exemplo haletos, sulfatos ou carbonatos. Entre estes, podem ser mencionados succinato, lac^bjçnato, lactato,malato, maleato etc., que podem também estar present^è tia combinação. .
Um tampão de injeção opcionalmente contido na composição (farmacêutica) de acordo com a invenção preferivelmente contém lactato. Se contiver um ânion orgânico, um tal tampão de injeção particularmente de preferência contém lactato exclusivamente como o ânion orgânico. Lactato no contexto da invenção pode ser qualquer lactato desejado, por exemplo Llactato e D-lactato. Sais de lactato que ocorrem com relação à presente invenção são tipicamente lactato dn sódio a/ou lactato da nsloin, onpnninlmon te se o tampão de injeção contiver apenas Na+ como um cátion monovalente e Ca2+ como um cátion divalente. Um tampão de injeção opcionalmente usado na composição (farmacêutica) de acordo com a invenção e como descrito acima preferivelmente contém, com respeito à composição farmacêutica total, de 15 mM a 500 mM, mais preferivelmente de 15 mM a 200 mM, e até mesmo o mais preferivelmente de 15 mM a 100 mM de lactato.
Se formulada em forma não-líquida (por exemplo, em forma sólida ou semissólida), a composição farmacêutica da invenção pode conter compostos que podem servir como veículos adequados ou constituintes dos mesmos, por exemplo açúcares, tais como, por exemplo, lactose, glicose e sucrose; amidos, tais como, por exemplo, amido de milho ou amido de batata; celulose e seus derivados, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose, acetato de celulose; tragacanto pulverizado; malte; gelatina; sebo; lubrificantes sólidos, tais como, por exemplo, ácido esteárico, estearato de magnésio; sulfato de cálcio; óleos vegetais, tais como, por e110 xemplo, óleo de amendoim, óleo de caroço de algodão, óleo de gergelim, azeite de oliva, óleo de milho e óleo de Theobroma; polióis, tais como, por exemplo, polipropileno glicol, glicerol, sorbitol, manitol e polietileno glicol; ácido algínico. Porém, os compostos acima podem ser também usados para a provisão de composições líquidas.
Outros componentes que podem ser incluídos em uma composição farmacêutica da invenção são por exemplo emulsificantes, tais como, por exemplo, Tween®; agentes umectantes, tais como, por exemplo, lauril sulfato de sódio; agentes corantes; agentes aromatizantes; veículos de me10 dicamento; agentes formadores de tablete; estabilizantes; antioxidantes; conservantes.
Outros veículos adequados para injeção incluem hidrogéis, dispositivos para liberação controlada ou atrasada, ácido polilático e matrizes de colágeno. Veículos adequados que podem ser usados aqui incluem aque15 les que são adequados para o uso em loções, cremes, géis e outros. Se o composto for para ser administrado peroralmente, tabletes, cápsulas e outros é a forma de dose de unidade preferida Os veículos arieqiinrinn pnrn npreparação de formas de dose de unidade que podem ser usadas para administração oral são bem-conhecidos na técnica anterior. Sua escolha de20 penderá das considerações secundárias, tais como aromatizante, custo e estabilidade sob armazenamento, que não são críticos para o propósito da presente invenção e podem ser implementados sem dificuldades por uma pessoa versada na técnica.
A presente invenção também fornece um método de transfecção (in vitro ou in vivo) para transfeccionar células ou um tecido com o RNA complexado da presente invenção como descrito acima. O método inventivo (in vitro ou in vivo) de transfecção preferivelmente compreende as etapas a seguir:
a) Opcionalmente preparar e/ou fornecer um RNA complexado de acordo com a presente invenção, compreendendo pelo menos um RNA complexado com um ou mais oligopeptídeos tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x;
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b) Transfeccionar uma célula, um tecido (vivo) ou um organismo (in vitro ou in vivo) usando o RNA complexado preparado e/ou fornecido de acordo com a etapa a).
Preparar e/ou fornecer um RNA complexado como definido aci5 ma de acordo com a etapa a) do método de transfecção in vitro ou in vivo inventivo para transfeccionar células ou um tecido com o RNA complexado da presente invenção, pode ser realizado por qualquer método conhecido na técnica. Um RNA complexado como aqui usado compreende pelo menos um RNA complexado com um ou mais oligopeptídeos tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x. Preparar e/ou fornecer um RNA complexádo como definido acima de acordo com a etapa a) pode desse modo compreender a preparação e/ou provisão do pelo menos um RNA e o um ou mais oligopeptídeos tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n; (Orn)0;(Xaa)x.
Métodos para preparação de sequências de peptídeo curtas tais como (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)o;(Xaa)x, são extensamente conhecidos na técnica e podem empregar por exemplo síntese dp fase sólida tnl mmn níntese de fase sólida de Fmoc ou outros métodos adequados (vide por exemplo R. Martin, Ed., Protein Synthesis: Methods and Protocols. Methods in
Molecular Biology, Vol. 77 Humana Press (1998)).
Preparar e/ou fornecer o pelo menos um RNA (molécula) como componente do complexo inventivo como definido acima pode compreender, de acordo com a etapa a) uma primeira subetapa a1), a saber, provisão e/ou preparação de um modelo de ácido nucleico que tipicamente compreende uma sequência que corresponde ao RNA desejado. A sequência do modelo de ácido nucleico pode ser qualquer ácido nucleico, por exemplo um DNA simples ou bifilamentar, cDNA, DNA genômico ou fragmentos dos mesmos, etc., que possa codificar uma proteína terapeuticamente ativa, um anticorpo ou um antígeno, ou qualquer outra proteína ou peptídeo como descritos aci30 ma. Tipicamente, sequências de DNA, por exemplo plasmídeos de DNA, preferivelmente na forma linearizada, podem ser empregadas para este propósito. Preferivelmente, a sequência do modelo de ácido nucleico pode ser
112 um vetor (expressão), mais preferivelmente um vetor (expressão) tendo um sítio de ligação de RNA polimerase. Qüaisquer vetores (expressão) conhecidos na técnica anterior, por exemplo vetores (expressão) comercialmente disponíveis (vide acima), podem ser usados para isto. Vetores (expressão) preferidos são, por exemplo, aqueles que têm um sítio de ligação SP6 ou um T7 ou T3 a montante e/ou a jusante do sítio de clonagem. O vetor pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína terapeuticamente ativa, um anticorpo ou um antígeno, ou qualquer outra proteína ou peptídeo como descritos acima que são tipicamente clonados no vetor (expressão), por exemplo por meio de um sítio de clonagem múltiplo do vetor usado.
Antes da transcrição, o vetor (expressão) é tipicamente clivado com enzimas de restrição no sítio no qual a extremidade 3' futura do RNA será encontrada, usando uma enzima de restrição adequada, e o fragmento é purificado. Isto impede do RNA transcrito de conter sequências de vetor, e uma transcrição de RNA de comprimento definido pode ser obtida. Neste contexto, preferivelmente nenhuma enzima de restrição que g^ra extramidades de extensão (tais como, por exemplo, Aatll, Apal, Banll, Bgll, Bsp1286, BstXI, Cfol, Haell, HgiAI, Hhal, Kpnl, Pstl, Pvul, Saci, Sacll, Sfil, Sphl, etc.) é usada. Tais enzimas de restrição não obstante devem ser usadas, a extremidade de extensão 3' preferivelmente pode ser preenchida, por exemplo com Klenow ou T4 DNA polimerase.
Como uma alternativa ao acima, o modelo de ácido nucleico usado para preparar e/ou fornecer o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da invenção, pode ser preparado empregando uma reação em cadeia de polimerase (PCR). O modelo de ácido nucleico preferivelmente e um dos iniciadores usados portanto, tipicamenté contém a sequência de um sítio de ligação de RNA polimerase. Além disso, a extremidade 5' do iniciador usado preferivelmente contém uma extensão de cerca de 10 - 50 outros nucleotídeos, mais preferivelmente de 15 a 30 outros nucleotídeos e o mais preferivelmente de cerca de 20 nucleotídeos.
113
Antes da transcrição in vitro, o ácido nucleico, por exemplo o modelo de DNA ou de cDNA, usado como modelo de transcrição, é tipicamente purificado e isentado de RNase para assegurar um rendimento alto. Neste contexto, purificação de tal modelo pode ser realizada com a ajuda de qualquer método conhecido na técnica anterior, por exemplo usando um gradiente de cloreto de césio, métodos de permuta de íons ou por purificação por meio de eletroforese em gel de agarose.
Subsequente à preparação e/ou fornecimento do modelo de ácido nucleico, uma reação de transcrição in vitro de acordo com uma segunda subetapa a2) pode ser realizada para preparar o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado desejado da invenção usando o modelò de ácido nucleico preparado de acordo com a primeira subetapa a1) como definido acima.
A reação de transcrição in vitro de acordo com uma segunda subetapa a2) é tipicamente realizada em uma reação de transcrição in vitro. Um meio de transcrição in vitro adequado compreende o modelo de ácido nucleico inicialmente como descrito acima, por exemplo cerca rle 0,1 -10 pg, preferivelmente cerca de 1 - 5 pg, mais preferivelmente 2,5 pg e o mais preferivelmente cerca de 1 pg de tal um ácido nucleico. Um meio de transcrição in vitro adequado além disso opcionalmente compreende um agente redutor, por exemplo DTT, mais preferivelmente cerca de 1-20 pl de 50 mM de DTT, até mesmo mais preferivelmente cerca de 5 pl de 50 mM de DTT. O meio de transcrição in vitro tipicamente compreende nucleotídeos, por exemplo uma mistura de nucleotídeo, no caso da presente invenção compreendendo uma mistura de nucleotídeos de A, G, C ou U, tipicamente cerca de 0,1-10 mM por nucleotídeo, preferivelmente 0,1 a 1 mM por nucleotídeo, preferivelmente cerca de 4 mM no total. Um meio de transcrição in vitro adequado igualmente compreende uma RNA polimerase, por exemplo T7 RNA polimerase (por exemplo, kit de mRNA T7-0pti, CureVac, Tübingen, Alemanha), T3 ou SP6 RNA polimerase, tipicamente cerca de 10 a 500 U, preferivelmente cerca de 25 a 250 U, mais preferivelmente cerca de 50 a 150 U, e o mais preferivelmente cerca de 100 U de RNA polimerase. O meio de transcrição in vitro é
114 além disso preferivelmente mantido livre da RNase para evitar degradação do pelo menos um RNA (molécula) transcrito do RNA complexado da invenção. Um meio de transcrição in vitro adequado portanto opcionalmente em adição compreende um inibidor de RNase.
O modelo de ácido nucleico pode ser depois incubado no meio de transcrição in vitro e é transcrito o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da invenção, que pode codificar para uma proteína terapeuticamente ativa, um anticorpo ou um antígeno, ou qualquer outra proteína ou peptídeo como descritos acima. Os tempos de incubação são tipicamente cerca de 30 a 240 minutos, preferivelmente cerca de 40 a 120 minutos e o mais preferivelmente cerca de 90 minutos. As temperaturas de incubação são tipicamente cerca de 30-45°C, preferivelmente 37-42°C. A temperatura de incubação depende da RNA polimerase usada, por exemplo para T7 RNA polimerase é quase 37°C. O pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado da invenção obtido pela transcrição é preferivelmente um mRNA. Os rendimentos obtidos na transcrição in vitro são, para as quantidades de partida declaradas ar.ima ampregartas, tipinamrnte na região rirr cerca de 30 pg de RNA por pg de DNA modelo usado. No contexto da presente invenção, os rendimentos obtidos na transcrição in vitro podem ser aumentados por escalonamento linear. Para isto, as quantidades de partida declaradas empregadas acima são preferivelmente aumentadas de acordo com os rendimentos requeridos, por exemplo por um fator de multiplicação de 5, 10, 50, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000 etc.
Após incubação, uma purificação do pelo menos um RNA (molécula) transcrito do RNA complexado da invenção pode opcionalmente ocorrer. Qualquer método adequado conhecido na técnica anterior, por exemplo métodos de purificação cromatográfica, por exemplo cromatografia de afinidade, filtração em gel etc., pode ser usado para isto. Por purificação, nãoincorporada, isto é, os nucleotídeos de excesso e DNA modelo podem ser removidos do meio de transcrição in vitro e um RNA limpo pode ser obtido. Por exemplo, após a transcrição, a mistura de reação com o RNA transcrito podem ser tipicamente digerido com DNase para ainda remover o modelo de
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DNA contido na mistura de reação. O pelo menos um RNA (molécula) transcrito do RNA complexado da invenção pode ser subsequentemente ou como alternativa precipitado com LiCI. Purificação do RNA transcrito pode depois ocorrer por meio de IP RP-HPLC. Isto torna possível em particular separa5 ção eficaz dos fragmentos mais longos e mais curtos um do outro.
Preferivelmente, neste contexto purificação do RNA pode ocorrer por meio de um método para purificação de RNA em uma escala preparativa, que é distinguida em que o RNA é purificado por meio de HPLC usando uma fase reversa porosa como a fase estacionária (Mensageiro PURO). Por exemplo, para a purificação, uma fase reversa pode ser empregada como a fase estacionária para a purificação de HPLC. Para a cromatografia com fases reversas, um composto não-polar tipicamente serve como fases estacionárias, e um solvente polar, tal como misturas de água, que é usualmente empregado na forma de tampões com acetonitrila e/ou metanol, serve como a fase móvel para a elução. Preferivelmente, a fase reversa porosa tem um tamanho de partícula de 8,0 ± 2 pm, preferivelmente ± 1 pm, mais preferivelmente +/- 0,5 urn. O material ria íasej^uema pnrln r.nrna forma rle r.nn-~ tas. A purificação pode ser realizada em uma maneira particularmente favorável com uma fase reversa porosa tendo este tamanho de partícula, opcio20 nalmente na forma de contas, particularmente bons resultados de separação sendo obtidos. A fase reversa empregada é preferivelmente porosa uma vez que com fases reversas estacionárias que não são porosas, tal como é descrito por exemplo por Azarani A. e Hecker K. H., pressões que são muito altas são formadas, de forma que purificação preparativa do RNA é possível, sob qualquer condição, apenas com grande dificuldade. A fase reversa preferivelmente tem um tamanho de poro de 200 a 5.000, em particular um tamanho de poro de 300 a 4.000. Tamanhos de poro particularmente preferidos para as fases reversas são 200 - 400, 800 - 1.200 e 3.500 - 4.500. Com uma fase reversa tendo estes tamanhos de poro, particularmente resultados bons são alcançados em relação à purificação do RNA transcrito. O material para a fase reversa é preferivelmente um poliestireno-divinilbenzeno, e poliestireno-divinilbenzenos não-alquilados podem ser empregados em particu116 lar. Fases estacionárias com poliestireno-divinilbenzeno são conhecidas per se. Para a purificação, os poliestireno-divinilbenzenos que são conhecidos per se e já empregados para métodos de HPLC e são comercialmente obteníveis podem ser usados. Um poliestireno-divinilbenzeno não-alquilado poroso em particular tem um tamanho de partícula de 8,0 ± 0,5 pm e um tamanho de poro de 250 - 300, 900 - 1.100 ou 3.500 - 4.500 é muito particularmente de preferência usado para a purificação. As vantagens descritas acima podem ser alcançadas em uma maneira particularmente favorável com este material para as fases reversas.
A purificação de HPLC pode ser realizada pelo método de par de íon, um íon tendo uma carga positiva sendo adicionado à fase móvel como um contraíon para o RNA negativamente carregado. Um par de íons tendo um caráter lipofílico que é reduzido na velocidade pela fase estacionária não-polar do sistema de fase reverso é formado desta maneira. Na prática, as condições precisas para o método de par de íons devem ser trabalhadas empiricamente para cada problema de separação específico. O tamanho do contraíon, sua concentração e o pH da solução contribuem grandemente para o resultado da separação. De uma maneira favorável, sais de alquilamônio, tais como compostos acetato de trietilamônio e/ou tetraalquilamônio são acrescentados, tais como tetrabutilamônio, à fase móvel. Preferivelmente, acetato de trietilamônio a 0,1 M é adicionado e o pH é ajustado para cerca de 7. A escolha da fase móvel depende da natureza da separação desejada. Isto significa que a fase móvel encontrada para uma separação específica, tal como pode ser conhecida, por exemplo, da técnica anterior, não pode ser transferida facilmente para outro problema de separação com prospecto adequado de sucesso. As condições de elução ideais, em particular a fase móvel usada, devem ser determinadas para cada problema de separação através de experimentos empíricos. Uma mistura de um solvente aquoso e um solvente orgânico pode ser empregada como a fase móvel para elução do RNA pelo método de HPLC. Neste contexto, é favorável se um tampão que tem, em particular, um pH de cerca de 7, por exemplo 6,5 - 7,5, por exemplo 7.0, for usado como solvente aquoso; preferivelmente, o tampão
117 acetato de trietilamônio é usado, particularmente de preferência um tampão de acetato de trietilamônio a 0,1 M, como descrito acima, também atua como um contraíon para o RNA no método de par de íon. O solvente orgânico empregado na fase móvel pode ser acetonitrila, metanol ou uma mistura destes dois, muito particularmente de preferência acetonitrila. A purificação do RNA usando um método de HPLC como descrito é realizada em uma maneira particularmente favorável com estes solventes orgânicos. A fase móvel é particularmente de preferência uma mistura de de acetato de trietilamônio a 0,1 M, pH 7, e acetonitrila. Tem parecido ser de maneira igual particularmente favorável se a fase móvel contiver 5,0 % em volume, a 20,0 % em volume, de solvente orgânico, com base na fase móvel, e o restante para compor 100 % em volume, é o solvente aquoso. É muito particularmente favorável para o método de acordo com a invenção se a fase móvel contiver 9,5 % em volume, a 14,5 % em volume, de solvente orgânico, com base na fase móvel, e o restante para compor 100 % em volume, é o solvente aquoso. Elução do RNA pode subsequentemente ser realizada isocraticamente ou por meio de uma separação dfi grarlipntp Mn caso dp Iimn nnpnraçãn ignnrátir.ay a elução do RNA é realizada com um agente de elução simples ou uma mistura de vários agentes de elução que permanecem constantes, sendo possível para os solventes descritos acima em detalhes ser empregados como o agente eluente.
Alternativamente, o pelo menos um RNA (molécula) de acordo com a etapa a) do método inventivo de transfecção pode ser bem preparado através de síntese química. Aqui, vários métodos conhecidos podem ser usados na técnica. O método de fosforoamidita é amplamente usado como um método de quimicamente sintetizar oligonucleotídeos, por exemplo fragmentos dè RNA (Nucleic Acid Research, 17:7059-7071, 1989). Em geral, este método de fosforoamidita faz uso de uma reação de condensação entre uma fosforoamidita do nucleosídeo e um nucleosídeo como uma reação fundamental usando tetrazol como um acelerador. Porque esta reação usualmente ocorre competitivamente em ambos o grupo hidroxila em uma metade de açúcar e o grupo amino em uma metade de base de nucleosídeo, a rea118 ção seletiva em apenas o grupo hidroxila em uma metade de açúcar é requerida para sintetizar um nucleotídeo desejado. Consequentemente, a reação lateral no grupo amino é usualmente impedida mediante proteção do grupo amino. O grupo protetor é removido quando síntese for acabada. Mais informação específica acerca de como sintetizar moléculas de RNA pode ser recuperada de Arnold et al, Chloridite and Amidite Automated Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides Using Amidine Protected Nucleosides, relatado em 7th Symposium Chem. Nucleic Acid Components, Nucleic Acids Symposium Series, 18, 181-184 (30 de agosto 1987); Chemical Abstracts,
108(19), pág. 692, N° do Resumo 167875z (9 de maio de 1988); Hayakawa et al, Benzimidazolium Triflate as an Efficient Promoter for Nucleotide Synthesis via the Phosphoramidite Method, J. Organic Chemistry, 61(23), 79967997 (15 de novembro de 1996); Pirrung etal, Proofing of Photolithographic DNA Synthesis with 3',5'-dimethoxybenzoinyloxycarbonyl-Protected Deoxy15 nucleoside Phosphoramidites, J. Organic Chemistry, 63(2), 241-246 (23 de jan, 1998); Effenberger et al, Trifluoromethanesulfonic Imidazolide - A Convenient Reagent for Introducing the TriflateJSroüp^Tetraheéfen-Letters?T98fr (45), 3947-3948 (set., 1980), todos estes incorporados aqui por referência.
Preparação do RNA complexado de acordo com a etapa a) da presente invenção tipicamente ocorre de acordo com a subetapa a3) adicionando uma quantidade específica do pelo menos um RNA (molécula) a uma quantidade específica para o um ou mais oligopeptídeos tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)o;(Xaa)x. Assim, razões molares ou de massa como indicadas acima do pelo menos um RNA (molécula) e o um ou mais oligopeptídeos tendo a fórmula empírica definida aqui (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)o;(Xaa)x são tipicamente visadas. Formação do ‘ícõmplexo tipicamente ocorre ao misturar ambos os componentes. Assim, o componente peptídico é tipicamente adicionado ao componente de RNA, em alguns casos, porém, vice-versa.
Uma tal etapa de preparação de acordo com a etapa a) do método, porém, é opcional e pode não ocorrer se o RNA complexado de acordo com a presente invenção já estiver disponível. Consequentemente, as sube119 tapas a1), a2) e a3) como definidas acima são também opcionais e não necessitam ser realizadas, se o RNA usado para o RNA complexado já estiver disponível. Similarmente, o um ou mais oligopeptídeos tendo a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)o;(Xaa)x podem ser usados diretamente e não necessitam ser preparados, se já disponíveis, por exemplo de um fornecedor.
De acordo com a etapa b) do método inventivo para transfeccionar células ou tecidos in vitro ou in vivo uma célula ou um tecido pode ser transfeccionado usando o RNA complexado fornecido e/ou preparado de acordo com a etapa a). Transfecção das células ou tecidos in vitro ou in vivo é em geral realizada adicionando o RNA complexado fornecido e/ou preparado de acordo com a etapa a) às células ou tecido. Preferivelmente, o RNA complexado depois entra nas células usando mecanismos celulares, por exemplo endocitose. Adição do RNA complexado como tal às células ou tecidos pode ocorrer, de acordo com a invenção, sem adição de qualquer outro componente devido ao potencial transfeccional do RNA complexado (molécula) da invenção. Alternativamente, a adição do RNA complexado fornecida e/ou preparado de acordo com a etapa a) às células ou tecido pode ocorrer na forma de uma composição, por exemplo como componente de uma solução aquosa, preferivelmente uma composição farmacêutica como definida acima que pode opcionalmente conter componentes adicionais para intensificação adicional da atividade de transfecção.
Células (ou células hospedeiras) neste contexto para transfecção do RNA complexado (fornecido e/ou preparado de acordo com a etapa a)) in vitro inclui qualquer célula, e preferivelmente, sem restringido a estas, células que serão transfeccionadas por qualquer molécula de RNA (como definido acima) usando o RNA complexado inventivo. Em particular, transfecção de RNA pode permitir expressão de uma proteína codificada pelo RNA do RNA complexado de acordo com a invenção na célula ou pode permitir o RNA (por exemplo, siRNA, RNA antissenso) do complexo inventivo atenuar oú suprimir a expressão de um gene celular. Células neste contexto preferivelmente incluem células eucarióticas cultivadas (por exemplo,
120 células de levedura, células vegetais, células animais e células humanas) ou células procarióticas (por exemplo, células de bactéria etc.) ou induz uma resposta imune. Células de organismos multicelulares são preferivelmente escolhidas se modificações pós-translacionais, por exemplo glicosilação da proteína codificada, forem necessárias (N e/ou O-acoplada). Em contraste com as células procarióticas, tais células eucarióticas (mais altas) tornam as modificações pós-translacionais da proteína sintetizadas possíveis. A pessoa versada na técnica conhece um número grande de tais células eucarióticas mais altas ou linhagens celulares, por exemplo 293T (linhagem celular de rim embrionário), HeLa (células de carcinoma de cerviz humano), CHO (células dos ovários do hamster chinês) e outras linhagens celulares, incluindo tais células e linhagens celulares desenvolvidas para propósitos de laboratório, tais como, por exemplo, células hTERT-mSC, HEK293, Sf9 ou COS. Células eucarióticas adequadas incluem células ou linhagens celulares que são prejudicadas por doenças ou infecções além disso, por exemplo células cancerosas, em particular células cancerosas de qualquer um dos tipos de câncer mencionados aqui na descrição. células prejudicadas por HIV, e/ou células do sistema imune ou do sistema nervoso central (CNS). Células adequadas podem ser igualmente derivadas de microorganismos eucarióticos, tais como levedura, por exemplo Saccharomyces cerevisiae (Stinchcomb et al,. Nature, 282:39, (1997)), Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia, e fungos filamentosos dos gêneros Aspergillus, Penicillium, etc. Células adequadas igualmente incluem células procarióticas, tais como por exemplo células de bactéria, por exemplo de Escherichia coli ou de bactérias gerais do Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Streptococcus, Staphylococcus, preferivelmente E. coli, etc. Células humanas ou células animais, por exemplo de animais como mencionados aqui, são particularmente preferidas como células eucarióticas. Além disso, células de apresentação de antígeno (APCs) podem ser usados para transfecção ex vivo do RNA complexado de acordo com a presente invenção. Particularmente preferidas são células dendríticas que podem ser usadas para transfecção ex vivo do RNA complexado de acordo com a presente invenção.
121
De acordo com uma modalidade particularmente preferida, células sanguíneas e/ou células hemopoiéticas, ou populações parciais das mesmas, isto é, qualquer tipo de células, que podem ser isoladas do sangue (total) e/ou que podem ser derivadas de linhagens celulares cultivadas derivadas daquelas células, podem ser transfeccionadas com um RNA complexado como definido aqui usando o método de transfecção acima, por exemplo, células sanguíneas vermelhas (eritrócitos), granulócitos, células mononucleares (células mononucleares de sangue periférico, PBMCs) e/ou plaquetas sanguíneas (trombócitos), APSs, DCs, etc. Preferivelmente, células sanguíneas são populações usadas, especialmente parciais das mesmas, que são caracterizadas em particular em que as mesmas contêm uma proporção pequena de APCs profissionais bem diferenciadas, tais como DCs. As células transfeccionadas podem conter preferivelmente menos que 5%, particularmente de preferência não mais que 2%, de DCs quando usadas para transfecção. No contexto da presente invenção células sanguíneas são preferivelmente entendidas como uma mistura ou uma população de células sanguíneas vermelhas enriquecidas a substancialmentepuras,granulócitosy células mononucleares (PBMCs) e/ou plaquetas sanguíneas de sangue total, soro de sangue ou outra fonte, por exemplo do baço ou linfonodos, apenas uma proporção pequena de APCs profissionais que está presente. As células sanguíneas como usadas de acordo com a presente invenção são preferivelmente células sanguíneas frescas, isto é, o período entre a coleta das células sanguíneas (especialmente abstinência de sangue) e a transfecção sendo apenas curto, por exemplo menos que 12 h, preferivelmente menos que 6 h, particularmente de preferência menos que 2 h e muito particularmente de preferência menos que 1 h. Além disso, as células sanguíneas a ser transfeccionadas usando o método acima para transfeccionar o RNA complexado de acordo com a presente invenção preferivelmente origina-se do paciente atual que será tratado com a composição farmacêutica da presente invenção. O uso de células sanguíneas, células hematopoiéticas ou populações parciais das mesmas como definidas acima é com base na descoberta surpreendente que para vacinação de um paciente a ser tratado
122 contra certos antígenos codificados por um mRNA como definido aqui, não é necessário diferenciar as células sanguíneas, por exemplo PBMCs, obtidas por exemplo do sangue de um indivíduo, especialmente do paciente atual a ser tratado, por meio de técnicas de cultura celular laboriosas, prolongadas e caras, em uma população de células com uma proporção alta de células de apresentação de antígeno profissional (APCs), células especialmente dendríticas (DCs), mas que é suficiente, para uma estimulação imune com sucesso, transfeccionar as células sanguíneas diretamente com o mRNA que codifica para um ou mais antígenos para se obter uma composição farmacêutica que realiza uma estimulação imune adequada por exemplo no paciente atual de quem as células sanguíneas, especialmente as populações parciais acima mencionadas das mesmas, foram obtidas, a dita estimulação imune preferivelmente sendo direcionada contra um ou mais antígenos de um tumor ou um ou mais antígenos de um germe ou agente patogênico. Transfecção de um RNA complexado como definido aqui em células sanguíneas ou células derivadas do mesmo (isoladas do mesmo ou das respectivas linhagens celulares cultivadas) não é limitada a antígenos e, claro que, refere-se a qualquer RNA como definido aqui usado para um RNA complexado, por exemplo qualquer outro RNA imunoestimulante como definido aqui, qualquer RNA de codificação, etc.
Embora haja a necessidade para transfeccionar células cultivadas in vitro (por exemplo, células humanas ou animais) ou transfeccionar células explantadas (por exemplo, células humanas ou animais) in vitro (antes da retransplantação para o organismo hospedeiro), administração direta do RNA complexado da invenção para pacientes para transfecção in vivo é visada também. Consequentemente, transfecção do RNA complexado (fornecido e/ou preparado de acordo com a etapa a)) pode também ocorrer in vivo de acordo com a etapa b), isto é, pode ser administrado a tecidos e/ou organismos vivos. Portanto, o RNA complexado fornecido de acordo com a etapa a) do método de transfecção inventivo ou pode ser administrado a um tecido vivo ou um organismo como tal ou por exemplo como componente de uma composição (líquida), em particular uma composição aquosa, por e123 xemplo uma composição farmacêutica como definida acima. Neste contexto, um organismo (ou um ser) tipicamente significa mamíferos, selecionados de, sem ser restringidos a estes, o grupo compreendendo seres humanos, e animais, incluindo por exemplo porco, cabra, gado, suínos, cachorro, gato, burro, macaco, símio ou roedores, incluindo camundongo, hamster e coelho. Além disso, tecidos vivos como mencionados acima, são preferivelmente derivados destes organismos. Administração do RNA complexado a aqueles tecidos e/ou organismos vivos pode ocorrer por meio de qualquer rota de administração adequada, por exemplo sistemicamente, e inclui por exemplo rotas intra ou transdérmicas, orais, parenterais, incluindo injeções subcutâneas, intramusculares ou intravenosas, tópicas e/ou intranasais como definidas acima.
Além disso, o método para transfecção que pode ser usado in vitro ou ex vivo pode também ser bem adaptado para uso in vivo, por exemplo como método de tratamento de várias doenças como mencionadas aqui. Em uma forma preferida de um método de tratamento de acordo com a invenção uma outra etapa pode ser incluída que pode conter administração de outra substância farmaceuticamente eficaz por exemplo um anticorpo, um antígeno (em particular um patogênico ou um antígeno tumoral como descrevedo aqui) ou a administração de pelo menos uma citocina. Ambos podem ser administrados separadamente do RNA complexado como DNA ou RNA que codificam para por exemplo a citocina ou o antígeno, ou a citocina ou antígeno podem ser administrados como tais. O método de tratamento pode também compreender a administração de um adjuvante adicional (como descrevedo aqui) que pode também ativar o sistema imune.
De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, o RNA complexado como definido acima, compreendendo pelo menos um RNA complexado com um ou mais oligopeptídeos, em que o oligopeptídeo mostra um comprimento de 8 a 15 aminoácidos e tem a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x, pode ser usado para tratamento e/ou profilaxia de doenças específicas como mencionadas aqui. Tratamento e/ou profilaxia de doenças específicas é/são tipicamente dependente(s) da seleção
124 de uma proteína adequada codificada pelo RNA do RNA complexado da presente invenção. Tratamento neste contexto ou pode ocorrer administrando o RNA complexado de acordo com a presente invenção (codificando esta proteína) como tal ou administrando a composição (farmacêutica) de acordo com a presente invenção como definida acima.
Sem estar limitado a estes, doenças õu estados incluem neste contexto, por exemplo, câncer ou doenças tumorais selecionados de melanomas, melanomas malignos, carcinomas de cólon, linfomas, sarcomas, blastomas, carcinomas de rim, tumores gastrintestinais, gliomas, tumores de próstata, câncer da bexiga, tumores retais, câncer de estômago, câncer de oesofagiano, câncer pancreático, câncer hepático, carcinomas mamários (= câncer de mama), câncer uterino, câncer cervical, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL), hepatomas, tumores induzidos por vírus diversos, tais como por exemplo carcinomas induzidos por vírus do papiloma (por exemplo, carcinoma do cerviz = câncer cervical), adenocarcinomas, tumores induzidos por vírus do herpes (por exemplo, linfoma de Burkitt, linfoma de célula B induzido por EBV), tumores induzidos por hepatite B (carcinomas hepatocelular), linfomas induzidos por HTLV-1 e HTLV-2, neurinoma acústico, carcinomas pulmonares (= câncer pulmonar = carcinoma bfonquial), carcinomas pulmonares de célula pequena, câncer da garganta, carcinoma anal, glioblastoma, carcinoma do reto, astrocitoma, tumores cerebrais, retinoblastoma, basalioma, metástase cerebral, meduloblastomas, câncer vaginal, câncer testicular, carcinoma da tiroide, síndrome de Hodgkin, meningeomas, doença de Schneeberger, tumor pituitário, micose fungoide, carcinoides, neurinoma, espinalioma, linfoma de Burkitt, câncer laríngeo, câncer do rim, timoma, carcinoma de corpo, câncer de osso, linfomas de nãoHodgkin, câncer uretral, síndrome de CUP, tumores da cabeça/pescoço, oligodendroglioma, câncer vulvar, câncer intestinal, carcinoma do cólon, carcinoma oesofagiano (= câncer oesofagiano), condições de verruga, tumores do intestino delgado, craniofarineomas, carcinoma ovariano, tumores de tecido macio, câncer ovariano (= carcinoma ovariano), carcinoma pancreático
125 (= câncer pancreático), carcinoma do endométrio, metástase hepática, câncer do pênis, câncer da língua, câncer da vesícula biliar, leucemia, plasmocitoma, tumor da pálpebra, câncer da próstata (= tumores de próstata) etc.
Doenças ou estados podem também incluir neste contexto doenças infecciosas selecionadas de, por exemplo, doenças infecciosas virais selecionadas de, sem ser limitadas a estas, SARS, febre amarela, Lyme, antraz, AIDS, condyloma acuminata, molluscum contagiosum, febre da dengue, febre de três dias, vírus Ebola, resfriados, meningoencefalite de verão precoce (ESME), influenza, herpes, hepatite, herpes simples do tipo I, herpes simples do tipo II, herpes zoster, influenza, encefalite japonesa, febre de Lassa, vírus de Marburg, sarampo, doença do pé e boca, mononucleose, caxumba, infecção do vírus Norwalk, febre glandular de Pfeiffer, varíola, pólio (poliomielite), pseudocrupe, eritema infeccioso, raiva, verrugas, febre do Nilo Ocidental, varíola do frango, citomegalovírus (CMV), doenças infecciosas bacterianas, tais como aborto (inflamação de próstata), antraz, apendicite (inflamação do ceco), borreliose, botulismo, Campylobacter, Clamidia trachomatis (inflamação da uretra, conjuntiva), cólera, difteria, donavonose, epiglotite, tifo lepidêmico, febre tifoide, gangrena gasosa, gonorréia, pestilência de lebre, Helicobacter pylori, tosse quintosa, bubo climático, osteomielite, doença dos legionários, lepra, listeriose, pneumonia, meningite, meningite bacteriana, antraz, inflamação do ouvido médio, Mycoplasma hominis, sepse neonatal (corioamnionite), noma, paratifo, pestilência, síndrome de Reiter, febre maculosa das Montanhas Rochosas, paratifo de Salmonela, febre tifoide de salmonela, febre escarlatina, sífilis, tétano, gonorréia, febre tsutsugamushi, tuberculose, tifo, vaginite (colpite), cancro macio e doenças infecciosas causadas por parasitas, protozoários ou fungos, tais como disenteria amébica, bilharziose, doença de Chagas, Echinococcus, solitária de peixe, ictiotoxismo (ciguatera), solitária de raposa, micose do pé, solitária de cachorro, candiose, ptiríase, coceira (sarna), leishmaniose, leishmaníose cutânea, disenteria lambliana (giardíase), piolho, malária, microscopia, oncocercose (cegueira de rio), doenças fúngicas, solitária da carne bovina, esquistossomíase, doença do sono, solitária da carne suína, toxoplasmose,
126 tricomoníase, tripanosomíases (doença do sono), leishmaníase visceral, dermatite de fralda ou tênia anã.
Doenças no contexto da presente invenção igualmente incluem, sem serem limitadas a estas, doenças virais (infecciosas) causadas por vírus selecionados de, sem serem limitadas a estes, HIV, ortopox vírus da varíola, ortopox vírus de alastrim, vírus parapox ovis, vírus do molluscum contagiosum, vírus do herpes simples 1, vírus do herpes simples 2, vírus do herpes B, zoster vírus da varicela, vírus de pseudorraivas, citomegalovírus humano, vírus do herpes humano 6, vírus do herpes humano 7, vírus de Epstein-Barr, vírus do herpes humano 8, vírus da hepatite B, vírus chikungunya, vírus de O'nyong'nyong, rubivírus, vírus da hepatite C, vírus de GB C, vírus do Nilo Ocidental, vírus da dengue, vírus da febre amarela, vírus encefalomielite ovina, vírus da encefalite de St. Louis, vírus da encefalite B do Japão, vírus de Powassan, vírus de FSME, vírus de coroa associado a SARS, vírus de coroa humana 229E, vírus de coroa humano Oc43, Torovírus, vírus linfotrópico de célula T humano do tipo I, vírus linfotrópico de célula T humano do tipo II, vírus da imunodeficiência humana tipo 1, vírus da imunodeficiência humana tipo 2, vírus de Lassa, vírus de coriomeningite linfocítica, vírus de Tacaribe, vírus de Junin, vírus de Machupo, vírus da doença de Borna, vírus de Bunyamwera, vírus da encefalite californiana, vírus da febre do Rift Valley, vírus da febre do flebótomo de Nápoles, vírus de Toscana, vírus da febre hemorrágica de Crimean-congo, vírus de Hazara, vírus de Khasan, vírus de Hantaan, vírus de Seul, vírus de Prospect Hill, vírus de Puumala, vírus de Dobrava Belgrado, vírus de Tula, vírus sin nombre, vírus Lake Victoria Marburg, vírus Ebola do Zaire, vírus Ebola do Sudão, vírus Ebola da Costa de Marfim, vírus influenza A, vírus influenza B, vírus influenza C, vírus da parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus sincicial respiratório, metapneumovírus humano, vírus indiano de estomatite vesicular, vírus da raiva, vírus de Mokola, vírus de Duvenhage, lissavírus de morcego europeu 1 + 2, lissavírus de morcego australiano, adenovírus A-f, vírus do papiloma humano, vírus de condiloma 6, vírus de condiloma 11, vírus de polioma, adenovírus 2 associado, rotavírus, ou orbivírus etc. Estas doenças podem ser, por exemplo, trata127 das por uma vacina de acordo com a invenção.
Adicionalmente, doenças ou estados podem incluir doenças cardiovasculares selecionadas de, sem serem limitados a estes, cardiopatia coronariana, arteriosclerose, apoplexia e hipertensão, e doenças neuronais selecionadas da doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica, disstonia, epilepsia, esclerose múltipla e doença de Parkinson etc.
Doenças ou estados podem também incluir neste contexto um distúrbio ou doença alérgicos. Alergia é uma condição que tipicamente envolve uma hipersensibilidade imunológica anormal, adquirida a certos antígenos ou alergênios estranhos. Alergias normalmente resultam em uma resposta inflamatória local ou sistêmica para estes antígenos ou alergênios e conduzindo a uma imunidade no corpo contra estes alergênios. Alergênios neste contexto incluem por exemplo gramas, pólens, mofos, fármacòs, ou numerosos desencadeadores ambientais, etc. Sem estar preso a qualquer teoria, vários mecanismos de doença diferentes são supostos estar envolvidos no desenvolvimento de alergias. De acordo com um esquema de classificação por P. Gell e R. Coombs, a palavra alergia foi restringida a hipersensibilidades do tipo I, que são causadas pelo mecanismo de IgE clássico. Hipersensibilidade do tipo I é caracterizada por ativação excessiva de mastócitos e basófilos por IgE, resultando em uma resposta inflamatória sistêmica que pode resultar em sintomas tão benignos quanto um corrimento nasal, a choque anafilático de risco de vida e morte. Tipos bem-conhecidos de alergias incluem, sem serem limitados a estes, asma alérgica (conduzindo à inchação da mucosa nasal), conjuntivite alérgica (conduzindo à vermelhidão e coceira da conjuntiva), rinite alérgica (febre do feno), anafilaxia, angiodema, dermatite atópica (eczema), urticária (urticárias), eosinofilia, respiratória, alergias a picadas de insetos, alergias de pele (conduzindo e incluindo várias erupções cutâneas, tais como eczema, urticárias (urticária) e (contato) dermatite), alergias alimentícias, alergias a medicamentos, etc. Com respeito à presente invenção, por exemplo uma composição farmacêutica é fornecida contendo por exemplo um RNA que codifica para um alergênio (por exemplo, de üm alergênio de gato, um alergênio de pó, um antígeno de ácaro, um
128 antígeno de planta (por exemplo, um antígeno de vidoeiro) etc.) como um complexo da invenção. Por este meio, o alergênio codificado pode dessensibilizar a resposta imune do paciente. Alternativamente, as composições farmacêuticas da presente invenção podem alterar a resposta imune (excedente) para uma resposta de TH1 mais forte, assim suprimindo ou atenuando a resposta de IgE indesejada do paciente sofre.
Além disso, doenças ou estados como aqui definidos podem incluir doenças autoimunes. Doenças autoimunes podem ser divididas amplamente em distúrbios sistêmicos e órgão-específicos ou localizados autoimunes, dependendo das características clinicopatológicas principais de cada doença. Doença autoimune pode ser dividida nas categorias de síndromes sistêmicas, incluindo SLE, síndrome de Sjõrgen, Escleroderma, artrite reumatoide e poliomiosite ou síndromes locais que podem ser endocrinológicas (DM Tipo 1, tiroidite de Hashimoto, doença de Addison, etc.), dermatológica (pênfigo vulgar), hematológica (anemia autoimune hemolítica), neural (esclerose múltipla) ou pode envolver virtualmente qualquer massa circunscrita de tecido do corpo. As doenças autoimunes a serem tratadas podem ser selecionadas do grupo que consiste em doenças autoimunes do tipo I ou doenças autoimunes do tipo II ou doenças autoimunes do tipo III ou doenças autoimunes do tipo IV, tais como, por exemplo, esclerose múltipla (MS), artrite reumatoide, diabetes, diabetes do tipo I (diabetes melito), lúpus sistêmico eritematoso (SLE), poliartrite crônica, doença de Basedow, formas autoimunes de hepatite crônica, ulcerosa de colite, doenças alérgicas do tipo I, doenças alérgicas do tipo II, doenças alérgicas do tipo III, doenças alérgicas do tipo IV, fibromialgia, perda de cabelo, doença de Bechterew, doença de Crohn, Miastenia grave, neurodermite, Polimialgia reumática, esclerose sistêmica progressiva (PSS), psoríase, síndrome de Reiter, artrite reumática, psoríase, vasculite, etc, ou diabetes do tipo II.
Embora o modo exato porque o sistema imune induz uma reação imune contra autoantígenos não tenha sido elucidado até agora, há várias descobertas com respeito à etiologia. Consequentemente, a autorreação pode ser devido a um Bypass de Células T. Um sistema imune normal re129 quer a ativação das células B pelas células T antes o primeiro possa produzir anticorpos em quantidades grandes. Este requerimento de uma célula T pode ser desviado em circunstâncias raras, tal como infecção por organismos produzindo superantígenos, que são capazes de iniciar a ativação policlonal das células B ou até mesmo das células T, ligando diretamente à subunidade dos receptores de células T em uma maneira não-específica. Outra explanação deduz doenças autoimunes de uma imitação molecular. Um antígeno exógeno pode compartilhar similaridades estruturais com certos antígenos hospedeiros; desse modo, qualquer anticorpo produzido contra este antígeno (que imita os autoantígenos) pode também, teoricamente, ligar aos antígenos hospedeiros e amplificar a resposta imune. A forma mais notável de imitação molecular é observada nos estreptococos betahaemolíticos do Grupo A que compartilham antígenos com miocárdio humano e são responsável pelas manifestações cardíacas de febre reumática. A presente invenção, portanto, permite fornecer um RNA que codifica para um autoantígeno como componente do RNA complexado da invenção (ou uma composição (líquida) que contém um tal RNA complexado da invenção) ou fornecer uma composição farmacêutica que contém um autoantígeno (como proteína, mRNA ou DNA que codificam para uma proteína de autoantígeno) e um RNA complexado da invenção, todos estes tipicamente permitem dessensibilizar o sistema imune.
Por fim, as doenças a serem tratadas no contexto da presente invenção igualmente incluem doenças monogenéticas, isto é, doenças (hereditárias), ou doenças genéticas em geral. Tais doenças genéticas são tipicamente causadas por defeitos genéticos, por exemplo devido a mutações gênicas que resultam em perda da atividade da proteína ou mutações reguladoras que não permitem a transcrição ou tradução da proteína. Frequentemente, estas doenças conduzem a distúrbios metabólicos ou outros sintomas, por exemplo distrofia muscular. Consequentemente, a presente invenção permite tratar estas doenças fornecendo o RNA complexado como definido aqui. Até então, as doenças a seguir podem ser tratadas: Deficiência de 3-beta-hidroxisteroide desidrogenase (tipo II); Deficiência de 3-cetotiolase;
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Sensibilidade a 6-mercaptopurina; Síndrome de Aarskog-Scott; Abetalipoproteinemia; Acatalasemia; Acondrogênese; Acondrogênesehipocondrogênese; Acondroplasia; Acromatopsia; Displasia acromesomélica (tipo Hunter-Thompson); Deficiência de ACTH; Deficiência de acil-coA desidrogenase (cadeia curta, cadeia média, cadeia longa); Polipose coli adenomatosa; Deficiência de Adenosina-desaminase; Deficiência de Adenilossucquinase; Adalinopatia; Hiperplasia ad-renal, congênita (devido à deficiência de 11-beta-hidroxilase; devido à deficiência de 17-alfa-hidroxilase; devido à deficiência de 21-hidroxilase); Hipoplasia ad-renal, congênita, com hipogonadismo hipogonadotrópico; Síndrome adrenogenital; Adrenoleucodistrofia; Adrenomieloneuropatia; Afibrinogenemia; Agamaglobulinemia; Síndrome de Alagille; Albinismo (marrom, ocular, oculocutâneo, rufoso); Intolerância a álcool, aguda; Deficiência de aldolase A; Aldosteronismo, tratável com glicocorticoide; Doença de Alexander; Alcaptonuria; Alopecia universal; Deficiência de alfa-1-antiquimotripsina; Deficiência de alfa-metilacil-coA racemase; Síndrome de Alfa-talassemia/retardamento mental; Síndrome de Alport; Doença de Alzheimer-1 (relacionado à APP); Doença de Alzheimer-3; Doença de Alzheimer-4; Amelogênese imperfeita; Neuropatia amiloide (tipos alélicos familiais, vários); Amiloidose (tipo holandês; tipo finlandês; hereditária renal; renal; senil sistêmica); Esclerose lateral amiotrófica; Analbuminemia; Insensibilidade andrógena; Anemia (Diamond-Blackfan); Anemia (hemolítica, devido à deficiência de PK); Anemia (tipo hemolítico, Rh nulo, supressora); Anemia (neonatal hemolítica, fatal e nearfatal); Anemia (sideroblástica, com ataxia); Anemia (sideroblástica/hipocrômica); Anemia devido à deficiência de G6PD; Aneurisma (familial arterial); Síndrome de Angelman; Angioedema; Aniridia; Anomalias de segmento anterior e catarata; Disgênese mesenquimal de segmento anterior; Disgênese mesenquimal de segmento anterior e catarata; Deficiência de antitrombina III; Traços de personalidade relacionados à ansiedade; Síndrome de Apert; Apnéia (pós-anestésica); Deficiência de ApoA-i e apoC-ilI (combinada); Deficiência de apolipoproteína A-il; Apolipoproteína B-100 (ligante-defeituoso); Excesso de mineralocorticoide evidente (devido à hipertensão); Argipinemia; Argininossuccinicaciduria; Artropatia
131 (pseudorrumática progressiva, de infância); Aspartilglucosaminuria; Ataxia (episódica); Ataxia com deficiência de vitamina E isolada; Ataxiatelangiectasia; Atelosteogênese II; Deficiência DNA Ligase I ATPdependente; Defeito septal atrial com defeitos de condução atrioventricular; Atriquia com lesões papulares; Autismo (succinilpurinâmico); Doença poliglandular autoimune, tipo I; Disfunção do sistema nervoso autonômico; Anomalia de Axenfeld; Azoospermia; Síndrome de Bamforth-Lazarus; Síndrome de Bannayan-Zonana; Síndrome de Barth; Síndrome de Bartter (tipo 2 ou tipo 3); Carcinoma de células basais; Síndrome de célula basal nervosa; Infecção de BCG; Síndrome de Beare-Stevenson cutis gyrata; distrofia muscular de Becker; Síndrome de Beckwith-Wiedemann; síndrome de Bernard-Soulier (tipo B; tipo C); Miopatia de Bethlem; Má absorção do ácido da bílis, primário; Deficiência de biotinidase; Câncer da bexiga; Distúrbio de sangramento devido ao receptor defeituoso de tromboxano de A2; síndrome de Bloom; Braquidactilila (tipo B1 ou tipo C); Síndrome branquioótica; Síndrome branquiootorrenal; Câncer de mama (intraductal invasivo; lobular; masculino, com síndrome de Reifenstein; esporádica); Câncer de mama-1 (princípio prematuro); Câncer de mama-2 (princípio prematuro); Miopatia de Brody; Síndrome de Brugada; Síndrome de Brunner; Linfoma de Burkitt; Distrofia de borboleta (retiniana); Deficiência de C1q (tipo A; tipo B; tipo C); Deficiência de C1r/C1s; Deficiência de C1s, isolada; Deficiência de C2; Deficiência de C3; Deficiência de inativador de C3b; Deficiência de C4; Deficiência de C8, tipo II; Deficiência de C9; Displasia campomélica com reversão de sexo autossômica; Síndrome de camptodactilil-artropatia-pericardite da coxa vara; Doença de Canavan; Deficiência de Carbamoilfosfato sintetase I; Síndrome de glicoproteína carboidrato-deficiente (tipo I; tipo Ib; tipo II); Tumor carcinoide do pulmão; Cardioencefalomiopatia (fatal infantil, devido à deficiência da citocromo c oxidase); Cardiomiopatia (dilatada; ligada ao X dilatada; hipertrófica familial; hipertrófica); Deficiência de carnitina (sistêmica primária); Deficiência de carnitino-acilcarnitina translocase; Síndrome do túnel de carpo (familial); Catarata (cerúlea; congênita; cristalino aculeiforme; juvenil princípio; polimórfico e lamelar; punctata; zonular pulverulento); Catarata,
132 semelhante a Coppock; Deficiência de CD59; Doença de núcleo central; Ataxia oerebelar; Angiopatia amiloide cerebral; Arteriopatia cerebral com infartos subcorticais e leucoencefalopatia; Malformação-1 cerebral cavernosa; Síndrome cerebrooculofacioesquelética; Xantomatose cerebrotendinosa; Doença cerebrovascular; Lipofuscinose ceroide (tipo juvenil neuronal, variante, com depósitos osmiofílicos granulares); Lipofuscinose ceroide (neuronal1, infantil); Lipofuscinose ceroide (neuronal-3, juvenil); Síndrome de Char; Doença de Charcot-marie-Thoot; Neuropatia de Charcot-marie-Thoot; Tipo Charlevoix-Saguenay; Síndrome de Chediak-Higashi; Diarréia de cloreto (tipo finlandês); Cholestase (intra-hepática recorrente benigna); Colestase (intra-hepática familial); Colestase (intra-hepática familial progressiva); Doença de armazenamento de éster de colesterila; Condrodisplasia punctata (braquitelefalângica; rizomélica; Dominante ligado ao X; ligado ao X recessivo; tipo Grebe); Condrossarcoma; Coroideremia; Doença granulomatosa crônica (autossômica, devido à deficiência de CYBA); Doença granulomatosa crônica (ligada ao X); Doença granulomatosa crônica devido à deficiência de NCF-1; Doença granulomatosa crônica devido à deficiência de NCF-2; Síndrome da quilomicronemia, familial; Citrulinemia; Síndrome de Cockayne clássica 1; Lábio leporino, fenda mandibular, fenda palatina; Síndrome de displasia ectodérmica de fenda labial/palatina; Displasia cleidocranial; Deficiência de CMO II; Doença de Coats; Síndrome de Cockayne 2, tipo B; síndrome Coffin-Lowry; Resistência à Colquicina; Adenocarcinoma do cólon; Câncer do cólon; Daltonismo (deutan; protan; tritan); Câncer colorretal; Deficiência de fator V e VIII combinado; Hiperlipemia combinada (familial); Imunodeficiência combinada (ligada ao X, moderada); Deficiência do complexo I; Distúrbio neurológico complexo; Distrofia de cones 3; Distrofia de cones e bastonetes 3; Distrofia de cones e bastonetes 6; Distrofia de cones e bastonetes retinianos 2; Ausência bilateral congênita de vas deferens; Conjuntivite, lígnea; Arachnodactilia contratural; Coproporfiria; Córnea plana congênita; Turvação da córnea; Distrofia da córnea (tipo Avellino; semelhante à gota gelatinosa; Groenouw tipo I; Lattice tipo I; Tipo Reis-Bucklers); Resistência a cortisol; Resistência a cumarina; Doença de Cowden; Deficiência de CPT,
133 hepática (tipo I; tipo II); Câimbras (familiais, agravada com potássio); Síndrome craniofacial-surdez-mão; Craniosinostose (tipo 2); Cretinismo; Doença de Creutzfeldt-Jakob; Síndrome de Crigler-Najjar; Síndrome de Crouzon; Síndrome de Currarino; Cútis flácida; Hematopoiese cíclica; Ictiose cíclica; Cilindromatose; Fibrose cística; Cistinose (nefropática); Cistinuria (tipo II; tipo III); Daltonismo; Doença de Darier; Deficiência de proteína bifuncional D; Surdez, autossômica dominante 1; Surdez, autossômica dominante 11; Surdez, autossômica dominante 12; Surdez, autossômica dominante 15; Surdez, autossômica dominante 2; Surdez, autossômica dominante 3; Surdez, autossômica dominante 5; Surdez, autossômica dominante 8; Surdez, autossômica dominante 9; Surdez, autossômica recessiva 1; Surdez, autossômica recessiva 2; Surdez, autossômica recessiva 21; Surdez, autossômica recessiva 3; Surdez, autossômica recessiva 4; Surdez, autossômica recessiva 9; Surdez, não-sindrômica sensorineural 13; Surdez, ligada ao X 1; Surdez, ligada ao X 3; Sensibilidade à debrisoquina; Doença de Dejerine-Sottas; Demência (dinamarquesa familial); Demência (frontotemporal, com parkinsonismo); Doença de Dent; Anomalias dentais; Atrofia dentatorrubropalidoluisiana; Síndrome de Denys-drash; Dermatofibrossarcoma protuberans; Doença desmoide; Diabetes insípida (nefrogênica); Diabetes insípida (neuroipofiseal); Diabetes melito (insulino-resistente); Diabetes melito (forma rara); Diabetes melito (tipo II); Displasia diastrófica; Di-hidropirimidinuria; Reversão de sexo sensível à dosagem; Degeneração da retina em favo de mel de Doyne; Síndrome de Dubin-Johnson; Distrofia muscular de Duchenne; Anemia diseritropoiética com trombocitopenia; Disfibrinogenemia (tipo alfa; tipo beta; tipo gama); Disceratose congênita 1; Disprotrombinemia; Distonia (responsiva a DOPA); Distonia (mioclônica); Distonia-1 (torção); Displasia ectodérmica; Ectopia lentis; Ectopia da pupila; Ectrodactilia (displasia ectodérmica, e Síndrome da fissura labial/palatina 3); Síndrome de Ehlers-danlos (forma progeroide); Síndrome de Ehlers-danlos (tipo I; tipo II; tipo III; tipo IV; tipo VI; tipo VII); Estenose aórtica supravalvular da elastina; Eliptocitose-1; Eliptocitose-2; Eliptocitose-3; Síndrome de Ellis-van Creveld; Distrofia muscular de Esmery-dreifuss; Enfisema; Encefalopatia; Fibroelastose endocardí134 aca 2; Carcinoma endometrial; Deficiência de acetilcolinesterase da placa motora; Síndrome de cones S intensificada; Aqueduto vestibular aumentado; Epidermólise bolhosa; Epidermólise bolhosa distrófica (dominante ou recessiva); Epidermólise bolhosa simples; Hiperceratose epidermolítica; Ceratoderma palmoplantar epidermolítica; Epilepsia (generalizada; juvenil; mioclônica; lóbulo frontal noturno; mioclônica progressiva); Epilepsia, benigna, neonatal (tipo 1 ou tipo 2); Displasia epifiseal (múltipla); Ataxia episódica (tipo 2); Síndrome de ataxia/mioquimia episódica; Eritremias (alfa-; displasia); Eritrocitose; Eritroceratoderma; Resistência a estrogênio; Mioglobinuria por esforço devido à deficiência de LDH-a; Exostoses, múltipla (tipo 1; tipo 2); Vitreorretinopatia exsudativa, ligada ao X; Doença de Fabry; Deficiência de fator H; Deficiência de fator VII; Deficiência de fator de X; Deficiência de fator XI; Deficiência de fator XII; Deficiência de fator XII IA; Deficiência de fator XIIIB; Febre mediterrânea familial; Anemia de Fanconi; Síndrome dê Fanconi-Bickel; Lipogranulomatose de Farber; Fígado gorduroso (agudo); Favismo; Doença de olho-de-peixe; Hipoplasia foveal; Síndrome X frágil; Síndrome de Frasier; Ataxia de Friedreich; Intolerância à frutose-frutose bisfosfatase; Fucosidose; Deficiência de fumarase; Fundus Albipunctatus; Fundus Flavimaculatus; Deficiência de G6PD; Deficiência de GABA-transaminase; Deficiência de galactoquinase com cataratas; Deficiência de galactose epimerase; Galactosemia; Galactosialidose; Deficiência de GAMT; Síndrome de Gardner; Câncer gástrico; Doença de Gaucher; Epilepsia generalizada com ataques apopléticos febris mais; Tumores de células germinais; Doença de Gerstmann-Straussler; Hepatite de célula gigante (neonatal); Distúrbio de plaqueta gigante; Fibroblastoma de célula gigante; Síndrome de Gitelman; Trombastenia de Glanzmann (tipo A; tipo B); Glaucoma 1A; Glaucoma 3A; Glioblastoma multiforme; Glomerulosclerose (focal segmentária); Defeito de transporte de glicose (barreira hematoencefálica); Má absorção de gligose/galactose; Deficiência de glicosidase I; Glutaricaciduria (tipo I; tipo IIB; tipo IIC); Deficiência da glutationa sintetase; Deficiência de glicerol quinase; Receptor de glicina (polipeptídeo alfa-1); Doença de armazenamento de glicogênio I; Doença de armazenamento de glicogênio II; Doença de armaze135 namento de glicogênio III; Doença de armazenamento de glicogênio IV; Doença de armazenamento de glicogênio VI; Doença de armazenamento de glicogênio VII; Glicogenose (hepática, autossômica); Glicogenose (ligada ao X, hepática); GM1-gangliosidose; GM2-gangliosidose; Bócio (multinodular adolescente); Bócio (congênito); Bócio (não-endêmico, simples); Disgênese gonádica (tipo XY); Granulomatose, séptica; Doença de Graves; Síndrome de cefalopolisindactilia de Greig; Síndrome de Griscelli; Dwarfismo deficiente do hormônio do crescimento; Retardamento de crescimento com surdez e retardamento mental; Ginecomastia (familial, devido à atividade de aromatase aumentada); Atrofia girata da coroide e retina com ornitinamia (B6responsiva ou indiferente); Doença de Hailey-Hailey; Síndrome de Haimmunk; Síndrome de mão-pé-útero; Harderoporfirinuria; Deficiência de HDL (familial); Bloqueio aurículo ventrilcular (não-progressivo ou progressivo); Anemia de corpo de Heinz; Síndrome de HELLP; Hematúria (familial benigna); Deficiência de heme oxigenase-1; Enxaqueca hemiplégica; Hemocromotose; Doença da hemoglobina H; Anemia hemolítica devido ao excesso de ADA; Anemia hemolítica devido à deficiência de adeniiato quinase; Anemia hemolítica devido ao defeito da banda 3; Anemia hemolítica devido à deficiência de glucosefosfato isomerase; Anemia hemolítica devido à deficiência de glutationa sintetase; Anemia hemolítica devido à deficiência de hexoquinase; Anemia hemolítica devido à deficiência de PGK; Síndrome Hemolítica-urêmica; Linfoistiocitose hemofagocítica; Hemofilia A; Hemofilia B; Diátese hemorrágica devido à deficiência do fator V; Hemossiderose (sistêmica, devido à aceruloplasminemia); Deficiência de lipase hepática; Hepatoblastoma; Carcinoma hepatocelular; Telangiectasia-1 hemorrágica hereditária; Telangiectasia-2 hemorrágica hereditária; Síndrome de HermanskyPudlak; Heterotaxia (ligada ao X visceral); Heterotopia (periventricular); Síndrome de Hippel-Lindau; Doença de Hirschsprung; Trombofilia de glicoproteína rica em histidina devido à deficiência de HRG; Deficiência de HMG-coA liase; Holoprosencefalia-2; Holoprosencefalia-3; Holoprosencefalia-4; Holoprosencefalia-5; Síndrome de Holt-Oram; Homocistinuria; HoyeraalHreidarsson; HPFH (tipo de deleção ou tipo de não-deíeção); Gota HPRT136 relacionada; Doença de Huntington; Hidrocefalia devido à estenose aquedutal; Hydrops Fetalis; Hiperbetalipoproteinemia; Hipercolesterolemia, familial; Síndrome de hiperferritinemia-catarata; Hiperglicerolemia; Hiperglicinemia; Hiperimunoglobulinemia D e síndrome de febre periódica; Hiperinsulinismo; Síndrome de hiperinsulinismo-hiperamonemia; Paralisia periódica hipercalêmica; Hiperlipoproteinemia; Hiperlisinemia; Hipermetioninemia (persistente, autossômica, dominante, devido à deficiência de metionina, adenosiltransferase l/lll); Síndrome de hiperornitinamia-hiperamonemiaomocitrulinemia; Hiperoxalúria; Hiperparatiroidismo; Hiperfenilalaninemia devido à deficiência de pterin-4acarbinolamina desidratase; Hiperproinsulinemia; Hiperprolinemia; Hipertensão; Hipertroidismo (congênito); Hipertrigliceridemia; Hipoalfalipoproteinemia; Hipobetalipoproteinemia; Hipocalcemia; Hipocondroplasia; Anemia microcítica hipocrômica; Hipodontia; Hipofibrinogenemia; Hipoglobulinemia e células B ausentes; Hipogonadismo (Hipergonadotrópico); Hipogonadotrópico (hipogonadismo); Paralisia periódica hipocalêmica; Hipomagnesemia; Hipomielinação (congênita); Hipoparatiroidismo; Hipofosfatasia (adulta; infância; infantil; hereditária); Hipoprotrombinemia; Hipotireoidismo (congênito; hereditário congênito; não-bociado); Eritrodermia Ictiosiforme; Ictiose; Ictióse boihosa de Siemens; Deficiência de lgG2; Síndrome-1 de cílios imóveis; Imunodeficiência (complexo de receptor de célula T/CD3); Imunodeficiência (ligada ao X, com IgM hiperativa); Imunodeficiência devido a defeito em CD3-gama; Imunodeficiência-síndrome de anomalias faciais de instabilidade centromérica; Incontinentia Pigmenti; Insensibilidade à dor (congênita, com anidrose); Insônia (fatal familial); Deficiência do receptor de interleucina2 (cadeia alfa); Doença do disco intervertebral; Iridogoniodisgênese; Deficiência de hormônio de crescimento isolada (tipo lllig com GH ausente e tipo Kowarski com GH bioinativo); Isovalericacidemia; Síndrome de JacksonWeiss; Síndrome de Jensen; Síndrome de Jervell e Lange-Nielsen; Síndrome de Joubert; Síndrome de Juberg-marsidi; Síndrome de Kallmann; Doença de Kanzaki; Ceratite; Ceratoderma (paimoplantar); Ceratose palmoplantar estriada I; Ceratose palmoplantar esfriada II; Cetoacidose devido à deficiência de SCOT; Síndrome de Keutel; Síndrome de Klippel-Trenaurnay; Displa137 sia de Kniest; Neutropenia de Kostmann; Doença de Krabbe; Síndrome de Kurzripp-Polidaktylie; Lacticacidemia devido à deficiência de PDX1; Displasia mesomélica de Langer; Dwarfismo de Laron; Síndrome de Laurence-moonBiedl-Bardet; Deficiência de LCHAD; Amaurose congênita de Leber; Malformação do eixo esquerda-direito; Síndrome de Leigh; Leiomiomatose (difusa, com síndrome de Alport); Leprechaunismo; Discondrosteose de Leri-Weill; Síndrome de Lesch-Nyhan; Leucemia (aguda mieloide; promielocítica aguda; linfoblástica aguda de células T; crônica mieloide; mielomonocítica juvenil; Leucemia-1 (linfocítica aguda de células T); Deficiência de adesão de leucócitos; Adenoma de célula de Leydig; Síndrome de Lhermitte-duclos; Síndrome de Liddle; Síndrome de Li-fraumeni; Deficiência de lipoamida desidrogenase; Lipodistrofia; Hiperplasia ad-renal lipoide; Deficiência da lipoproteína lipase; Lissencefalia (Ligada ao X); Lissencefalia-1; Doença de armazenamento de glicogênio hepático (tipo 0); Síndrome-1 de QT longo; Síndrome-2 de QT longo; Síndrome-3 de QT longo; Síndrome-5 de QT longo; Síndrome6 de QT longo; Síndrome de Lowe; Câncer pulmonar; Câncer pulmonar (célula não-pequena); Câncer pulmonar (célula pequena); Linfodema; Linfoma (não-Hodgkin de célula B); Linfoma (difusa de célula grande); Linfoma (folicular); Linfoma (MALT); Linfoma (célula de mantel); Síndrome linfoproliferátiva (ligada ao X); Intolerância à proteína lisinúrica; Doença de MachadoJoseph; Anemia macrocítica refratária (de síndrome 5q); Distrofia macular; Mesotelioma maligno; Deficiência de malonil-coA descarboxilase; Manosidose, (alfa ou beta); Doença da urina em xarope de bordo (tipo Ia; tipo Ib; tipo II); Síndrome de Marfan; Síndrome de Maroteaux-Lamy; Síndrome de Marshall; Síndrome de MASA; Leucemia de mastócitos; Mastocitose com distúrbio hematológico associado; Doença de McArdle; Displasia fibrosa poliostótica de McCune-albright; Síndrome de McKusick-Kaufman; Fenótipo de McLeod; Carcinoma da tiroide medular; Meduloblastoma; Distrofia córnea de Meesmann; Anemia-1 megaloblástica; Melanoma; Glomerulonefrite membroproliferativa; Doença de Meniere; Meningioma (relacionado a NF2; relacionado a SIS); Doença de Menkes; Retardamento mental (Ligado ao X); Metabolizador de mefenitoína fraca; Mesotelioma; Leucodistrofia metacro138 mática; Condrodisplasia metafiseal (tipo Murk Jansen; tipo Schmid); Metemoglobinemia; Deficiência de metionina adenosiltransferase (autossômica recessiva); Deficiência de metilcobalamina (tipo cbl G); Metilmalonicaciduria (tipo de deficiência de mutase); Mevalonicaciduria; Deficiência da classe II de Ml-fC; Microftalmia (cataratas, e anormalidades da íris); Miopatia de Miyoshi; MODY; Síndrome de Mohr-Tranebjaerg; Deficiência de co-fator de molibdênio (tipo A ou tipo B); Moniletrix; Morbus Fabry; Morbus Gaucher; Mucopolissacaridose; Mucoviscidose; Síndrome de Muencke; Síndrome de Muir-Torre; Nanismo de Mulibrey; Deficiência de carboxilase múltipla (responsiva à biotina); Neoplasia endócrina múltipla; Glicogenose muscular; Distrofia muscular (merosina-deficiente, congênita); Distrofia muscular (Fukuyama congênita); Distrofia muscular (membro-cintura); Distrofia muscular (semelhante a Duchenne); Distrofia muscular com epidermólise bolhosa simples; Síndrome miastênica (canal lento, congênita); Infecção micobacteriana (atípica, familial disseminada); Síndrome mielodisplástica; Leucemia mielogenosa; Malignidade mieloide; Deficiência de mieloperoxidase; Deficiência de mioadenilato desaminase; Mioglobinuria/hemólise devido à deficiência de PGK; Síndrome de encefalomiopatia mioneurogastrintestinal; Miopatia (actina; congênita; relacionada à adesmina; cardioesquelética; distai; nemalina); Miopatia devido à deficiência de CPT II; Miopatia devido à deficiência de fosfoglicerato mutase; Miotonia congênita; Miotonia de Levior; Distrofia miotônica; Lipossarcoma mixoide; Deficiência de NAGA; Síndrome de Nailpatella; Miopatia de nemalina 1 (autossômica, dominante); Miopatia de nemalina 2 (autossômica, recessiva); Hiperparatiroidismo neonatal; Nefrolitíase; Nefronoftise (juvenil); Nefropatia (hipocomplementêmica crônica); Nefrose-1; Síndrome nefrótica; Síndrome de Netherton; Neuroblastoma; Neurofibromatose (tipo 1 ou tipo 2); Neurolemomatose; Lipofuscinose ceroide neuronal-5; Neuropatia; Neutropenia (aloimmune neonatal); Doença de Niemann-Pick (tipo A; tipo B; tipo C1; tipo D); Cegueira noturna (congênita estacionária); Síndrome de quebra de Nijmegen; Não-compacção do miocárdio ventricular esquerdo; Ceratoderma palmoplantar não-epidermolítica; Doença de Norrie; Doença de Norum; Deficiência de fosforilase de nucleosídeo; Obesidade;
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Síndrome do corno ocipital; Albinismo ocular (tipo Nettleship-falls); Distorfia muscular oculofaríngeo; Doença de Oguchi; Oligodontia; Síndrome de 0menn; Síndrome de Opitz G; Còloboma do nervo ótico com doença renal; Deficiência de ornitina transcarbamilase; Oroticaciduria; Intolerância ortostática; Síndrome de OSMED; Ossificação de ligamento longitudinal posterior da espinha; Osteoartrose; Osteogênese imperfeita; Osteólise; Osteopetrose (recessiva ou idiopática); Osteossarcoma; Carcinoma ovariano; Disgênese ovariano; Paquioniquia congênita (tipo Jackson-Lawler ou tipo JadassohnLewandowsky); Doença de Paget do osso; Síndrome de Pallister-Hall; Agenesia pancreática; Câncer pancreático; Pancreatite; Síndrome de PapillonLefevre; Paragangliomas; Paramiotonia congênita; Foramina parietal; Doença de Parkinson (familial ou juvenil); Hemoglobinuria noturna paroxismal; Doença de Pelizaeus-merzbacher; Síndrome de Pendred; Hipospadias perineais; Febre periódica; Distúrbio da biogênese peroxissomal; Hipoglicemia hiperinsulinêmica persistente de infância; Síndrome mullerian persistente do duto (tipo II); Anomalia de Peters; Síndrome de Peutz-Jeghers; Síndrome de Pfeiffer; Fenilcetonuria; Gota relacionada à fosforibosil pirofosfato sintetase; Deficiência de fosforilase quinase do fígado e músculo; Piebaldismo; Pilomatricoma; Pínealoma com retinoblastoma bilateral; Adenoma de segregação de ACTH da pituitária; Deficiência do hormônio da pituitária; Tumor da pituitária; Deficiência de esteroide sulfatase placentária; Deficiência do inibidor da plasmina; Deficiência de plasminogênio (tipos I e II); Doença de Tochigi de Plasminogênio; Distúrbio de plaquetas; Deficiência da glicoproteína IV das plaquetas; Deficiência de acetilidrolase do fator de ativação das plaquetas; Doença de rim policístico; Osteodisplasia policística lipomembranosa com leucenencefalopatia esçlerosante; Polidactilia, pós-axial; Polipose; Síndrome de pterigio popliteal; Porfiria (aguda hepática ou intermitente aguda ou eritropoiética congênita); Porfiria cutânea tardia; Porfiria hepatoeritropoiética; Porfiria variada; Síndrome de Prader-Willi; Puberdade precoce; Insuficiência ovariana prematura; Progeria tipo I; Progeria tipo II; Oftalmoplegia externa progressiva; Colestase-2 intra-hepática progressiva; Prolactinoma (Hiperparatiroidismo, síndrome carcinoide); Deficiência de prolidase; Propioni140 cacidemia; Câncer de próstata; Deficiência da proteína S; Proteinuria; Protoporfiria (eritropoiética); Pseudoacondroplasia; Pseudo-hermafroditismo; Pseudo-hipoaldosteronismo; Pseudo-hipoparatiroidismo; Hipospadias perineoscrotais pseudovaginais; Raquitismos de deficiência de pseudovitamina D; Pseudoxantoma elástico (autossômico, dominante; autossômico, recessivo); Proteinose alveolar pulmonar; Hipertensão pulmonar; Púrpura Fulminans; Picnodisostose; Piropoiquilocitose; Deficiência de piruvato carboxilase; Deficiência de piruvato desidrogenase; Síndrome de Rabson-mendenhall; Doença de Refsum; Carcinoma de célula renal; Acidose tubular renal; Acidose tubular renal com surdez; Síndrome de acidose tubular renalosteopetrose; Reticulose (histiocítíca familial); Degeneração retiniana; Distrofia retiniana; Retinite pigmentosa; Retinite punctata albescens (Retiníts punctara albescens); Retinoblastoma; Deficiência da proteína ligadora de retinol; Retinosquise; Síndrome de Rett; Síndrome de Rh(mod); Síndrome de predisposição rabdoide; Tumores rabdoides; Rabdomiossarcoma; Rabdomiossarcoma (alveolar); Condrodisplasia punctata rizomélica; síndrome de Ribbing; Raquitismos (resistente à vitamina D); Anomalia de Rieger; Síndrome de Robinow; Síndrome de Rothmund-Thomson; Síndrome de RubensteinTaybi; Sacaropinuria; Síndrome de Saethre-chotzen; Doença de Salla; Doença de Sandhoff (infantil, juvenil, e a forma adulta); Síndrome de Sanfilippo (tipo A ou tipo B); Doença de Schindler; Esquizencefalia; Esquizofrenia (crônica); Schwannoma (esporádica); SCID (autossômica recessivo, tipo Tnegativa/B-positiva); W/TMD da via secretória; SED congênita; Síndrome de Segawa; Defeito de células T seletivas; SEMD (tipo paquistanês); SEMD (tipo de Strudwick); Displasia septo-óptica; Imunodeficiência combinada severa (negativa de células B); Imunodeficiência combinada severa (negativa de células T, células B/tipo positiva de células assassinas naturais); Imunodeficiência combinada severa (ligada ao X); Imunodeficiência combinada severa devido à deficiência de ADA; Reversão de sexo (XY, com insuficiência ad-renal); Síndrome de Sezary; Síndrome de Shah-Waardenburg; Estatura curta; Síndrome de Shprintzen-Goldberg; Distúrbio de armazenamento de ácido siálico; Sialidose (tipo I ou tipo II); Sialuria; Anemia de células falcifor141 mes; Síndrome de Simpson-Golabi-Behmel; Situs Ambiguus; Síndrome de Sjogren-Larsson; Síndrome de Smith-fineman-myers; Síndrome de SmithLemli-Opitz (tipo I ou tipo II); Somatotrofinoma; Distrofia de Sorsby fundus; Paraplegia espasmódica; Esferocitose; Esferocitose-1; Esferocitose-2; Atrofia muscular espinhal e bulbar de Kennedy; Atrofia muscular espinhal; Ataxia espinocerebelar; Disostose espondilocostal; Displasia espondiloepifisária tardia; Displasia espondilometafiseal (tipo japonês); Doença de Stargardt 1; Esteatocistoma multiplex; Síndrome de Stickler; Síndrome de Sturge-Weber; Heteropia subcortical laminai; Heterotopia subcortical laminar; Deficiência de semialdeído succínico desidrogenase; Intolerância à sucrose; Síndrome de Sutherland-Haan; Elevação de cloreto do suor sem CF; Sinfalangismo; Síndrome de Sinostoses; Sinpolidactilia; Doença de Tangier; Doença de TaySachs; Leucemia linfoblástica aguda de células T; Imunodeficiência de células T; Leucemia prolinfocítica de células T; Talassemia (alfa ou delta); Talassemia devido a Hb Lepore; Displasia tanatofórica (tipos I ou II); Síndrome de anemia megaloblástica responsiva à tiamina; Trombocitemia; Trombofilia (displasminogenêmica); Trombofilia devida à deficiência do cofator de heparina II; Trombofilia devido à deficiência de proteína C; Trombofilia devido ao defeito de trombomodulina; Adenoma da tiroide; Resistência ao hormônio da tiroide; Deficiência de iodo peroxidase da tiroide; Síndrome de Tietz; Metabolizador de tolbutamida fraco; Síndrome de Townes-Brocks; Deficiência de transcobalamina II; Disostose mandibulofacial de Treacher Collins; Síndrome tricodonto-ósseo; Síndrome de tricorinofalangeal; Tricotiodistrofia; Deficiência de proteína trifuncional (tipo I ou tipo II); Deficiência de tripsinogênio; Esclerose tuberosa-1; Esclerose tuberosa-2; Síndrome de Turcot; Tirosina fosfatase; Tirosinemia; Síndrome mamária de Ulnar; Urolitíase (2,8-dihidroxiadenina); Síndrome de Usher (tipo 1B ou tipo 2A); Malformações venosas; Taquicardia ventricular; Virilização; Defeito de coagulação dependente de vitamina K; Deficiência de VLCAD; Síndrome de Vohwinkel; Síndrome de von Hippel-Lindau; Doença de von Willebrand; Síndrome de Waardenburg; Síndrome de Waardenburg/albinismo ocular; Variante neurológica de Waardenburg-Shah; Síndrome de Waardenburg-Shah; Síndrome de Wag142 ner; Sensibilidade à Warfarina; Síndrome de Watson; Síndrome de Weissenbacher-Zweymuller; Síndrome de Werner; Disostose acrodental de Weyers; Nevo branco esponjoso; Síndrome de Williams-Beuren; Tumor de Wilms (typel); Doença de Wilson; Síndrome de Wiskott-aldrich; Síndrome de Wolcott-Rallisòn; Síndrome de Wolfram; Doença de Wolman; Xantinuria (tipo I); Xeroderma pigmentosa; X-SCID; Síndrome de hipopigmentação de surdocego de Yemenite; hipercalcemia hipocalciúrica (tipo I); Síndrome de Zellweger; Síndrome de Zlotogora-Ogur.
Doenças preferidas a serem tratadas tendo uma base herdada genética e que é tipicamente causada por um defeito de gene simples e é herdado de acordo com as leis de Mendel são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste em doenças herdadas autossômicas-recessivas, tais como, por exemplo, deficiência de adenosina desaminase, hipercolesterolemia familial, síndrome de Canavan, doença de Gaucher, anemia de Fanconi, lipofuscinose ceroide neuronal, mucoviscidose (fibrose cística), anemia de células falciforme, fenilcetonuria, alcaptonuria, albinismo, hipotireose, galactosaemia, deficiência de alfa-1-antitripsina, de Xeroderma pigmentosa, síndrome de Ribbing, mucopolisacarídeo, lábio leporino, mandíbula, paladar, síndrome de Laurence Moon Biedl Bardet, síndrome de polidactilia de costela curta, cretinismo, síndrome de Joubert, progeria do tipo II, braquidactilia, síndrome adrenogenital, e doenças herdadas do cromossomo X, tais como, por exemplo, cegueira de cor, por exemplo cegueira de vermelho/verde, síndrome X frágil, distrofia muscular (tipo Duchenne e Becker-Kiener), haemofilia A e B, deficiência de G6PD, doença de Fabry, mucopolissacarídeo, síndrome de Norrie, Retinite pigmentosa, granulomatose séptica, X-SCID, deficiência de ornitina transcarbamilase, síndrome de Lesch-Nyhan, ou de doenças herdadas dominantes autossômicas, tais como, por exemplo, angioedema hereditária, síndrome de Marfan, neurofibromatose, progeria tipo I, Osteogênese imperfeita, síndrome de Klippel-Trenaurnay, síndrome de Sturge-Weber, síndrome de Hippel-Lindau e esclerose tuberosa.
A presente invenção também permite o tratamento de doenças, que não foram herdadas ou que podem ser resumidas sob as categorias
143 acima. Tais doenças podem incluir por exemplo o tratamento de pacientes que estão em necessidade de um fator de proteína específica, por exemplo, uma proteína específica terapeuticamente ativa como mencionada acima. Esta pode por exemplo incluir pacientes de diálise, por exemplo pacientes que sofrem de uma diálise (regular) do rim ou renal, e que podem ser em necessidade de proteínas ativas terapeuticamente específicas como definidas acima, por exemplo eritropoietina (EPO), etc.
De acordo com outra modalidade, a presente invenção compreende o uso do pelo menos um RNA complexado de acordo com a presente invenção para transfeccionar uma célula ou um organismo. Transfecção da célula ou o organismo pode ser preferivelmente realizada usando o método de transfecção acima (in vitro ou in vivo) para transfeccionar células ou um tecido com o RNA complexado da presente invenção.
De acordo com uma outra modalidade, a presente invenção compreende o uso de pelo menos um RNA complexado de acordo com a presente invenção (para a preparação de um agente) para o tratamento de qualquer uma das doenças, distúrbios, condições ou estados patológicos supracitados. Um agente neste contexto pode ser por exemplo uma composição farmacêutica como definida acima ou um tampão de injeção como definido aqui, adicionalmente contendo o RNA complexado inventivo, uma vacina, etc. Se mais de uma molécula de RNA tipo complexado for usado, os RNAs complexados podem ser diferentes por seu RNA (moléculas) assim formando uma mistura de pelo menos dois tipos de RNAs (molécula) complexados distintos. Se mais de um RNA complexado for usado (para a preparação de um agente) para o tratamento de qualquer uma das doenças supracitadas, tipos iguais ou diferentes (pelo menos dois) de RNAs (molécula) podem ser contidos nestas misturas de RNA complexadas. Neste contexto, qualquer um do RNA supracitado (moléculas) pode ser usado para o RNA complexado inventivo, por exemplo um oligonucleotídeo de RNA curto, um RNA de codificação, um RNA imunoestimulante, um siRNA, um RNA antíssenso, ou riboswitches, ribozimas ou aptâmeros, etc. Mais preferivelmente um RNA (molécula) de codificação, até mesmo mais preferivelmente
144 um RNA (molécula) de codificação linear, e o mais preferivelmente um mRNA pode ser usado. Preferivelmente, um tal RNA (molécula) de codificação, mais preferivelmente um RNA (molécula) de codificação linear, e mais preferivelmente um mRNA é usado para o RNA complexado, o RNA (molécula) tipicamente codifica uma proteína ou peptídeo adequados para a terapia da doença específica, por exemplo um anticorpo que é capaz de se ligar a um antígeno de câncer específico ou um antígeno tumoral, ao tratar um câncer (específico), etc. As combinações de RNA (moléculas) adequado são conhecidas a um versado na técnicae da descreveção da presente invenção.
De acordo com outra modalidade da presente invenção, pode ser preferido (adicionalmente) suscitar, por exemplo induzir ou intensificar, uma resposta imune durante a terapia. Neste contexto, uma resposta imune pode ocorrer de vários modos. Um fator substancial para uma resposta imune adequada é a estimulação de subpopulações de células T diferentes. Lin15 fócitos T são tipicamente divididos em duas subpopulações, as células T auxiliares 1 (Th1) e as células T auxiliares 2 (Th2), com as quais o sistema imune é capaz de destruir patógenos intracelulares (Th1) e extracelulares (Th2) (por exemplo, antígenos). As duas populações de células Th diferem no padrão das proteínas efetoras (citocinas) produzidas por os mesmos.
Desse modo, células Th1 ajudam a resposta imune celular mediante ativação de macrófagos e células T citotóxicas. Por outro lado, células Th2 promovem a resposta imune humoral mediante estimulação das células B por conversão em células plasmáticas e por formação de anticorpos (por exemplo, contra antígenos). A razão de Th1/Th2 é portanto de importância princi25 pal para a resposta imune. Para várias doenças a serem tratada pela presente invenção, a razão de Th1/Th2 da resposta imune é preferivelmente alterada na direção para a resposta celular (resposta de Th1) e uma resposta imune celular é assim induzida. Consequentemente, a presente invenção pode também ser usada para reverter esta alteração da resposta imune.
Portanto, a presente invenção abrange também o uso de pelo menos um RNA complexado de acordo com a presente invenção (para a preparação de um agente) para o tratamento de quaisquer doenças supracitadas, em que o
145 agente (e/ou o RNA complexado) pode ser capaz de suscitar, por exemplo induzir ou intensificar, uma resposta imune em um tecido ou um organismo como definidos acima. Novamente, um agente neste contexto pode ser por exemplo uma composição farmacêutica como definida acima, ou um tampão de injeção como definido aqui que contém o RNA complexado inventivo etc. Se mais de um tipo de RNA complexado for usado neste contexto (para a preparação de um agente) para o tratamento de quaisquer doenças supracitadas, os tipos de RNA complexados podem ser diferentes com respeito a seu RNA (moléculas) e podem formar uma mistura de tipos de RNA distintos.
Porém, para a modalidade presente, é preferido que pelo menos um destes RNAs complexados induzam ou intensifiquem a resposta imune durante a terapia, enquanto outros RNA(s) complexado(s) não necessitam induzir ou intensificar a resposta imune ou podem ser usados para impedir uma resposta imune. Neste contexto, qualquer do RNA (moléculas) supracitado pode ser usado para o RNA complexado inventivo, por exemplo um oligonucleotídeo de RNA curto, um RNA de codificação, um RNA imunoestimulante, um siRNA, um RNA antissenso, ou riboswitches, ribozimas ou aptâmeros, etc. Mais preferivelmente, um RNA (molécula) de codificação, até mesmo mais preferivelmente uma RNA (molécula) de codificação linear, e o mais preferivelmente um mRNA pode ser usado para o RNA complexado. Se o RNA (molécula) for um RNA (molécula) de codificação, mais preferivelmente um RNA (molécula) de codificação linear, e mais preferivelmente um mRNA, este tipicamente codifica uma proteína ou peptídeo adequados para a terapia da doença específica, por exemplo um anticorpo que é capaz de se ligar a um antígeno de câncer específico ao tratar um câncer (específico), etc. Se mais de um RNA complexado estiver contido no agente, combinações diferentes de proteínas ou peptídeos podem ser selecionadas. Tais combinações de RNA (moléculas) adequadas (e, se um RNA de codificação for usado, das proteínas ou peptídeos codificadas) são conhecidas a um versado na técnicaou podem ser combinadas de RNA que codificam proteínas terapeuticamente eficazes, etc., como definido na descreveção da pre146 sente invenção. Indução ou intensificação da resposta imune simultâneo ao tratamento de uma doença específica usando uma composição farmacêutica ou agente como definidos acima pode ser particularmente vantajoso em casos onde uma resposta imune induzida ou intensificada suportar o tratamento de uma doença específica como mencionada acima.
Alternativamente, tratamento da doença e indução ou intensificação da resposta imune podem ser realizados usando diferentes composições farmacêuticas ou agentes como definidos acima de uma maneira com tempo escalonado. Por exemplo pode-se induzir ou intensificar a resposta imune administrando uma composição farmacêutica ou um agente como definidos aqui, contendo um RNA inventivo complexado (imunoestimulante), antes de (ou simultâneo) a administração de outra composição farmacêutica ou um agente como definidos aqui que podem conter um RNA complexado inventivo, por exemplo um oligonucleotídeo de RNA curto, um RNA de codificação, um RNA imunoestimulante, um siRNA, um RNA antissenso, ou riboswitches, ribozimas ou aptâmeros, etc., que sejam adequados para a terapia da doença específica.
De acordo com uma modalidade, a presente invenção além disso compreende o uso de pelo menos um RNA complexado de acordo com a presente invenção (para a preparação de um agente) para modular, preferivelmente induzir ou intensificar, uma resposta imune em um tecido ou um organismo como definidos acima, mais preferivelmente para suportar uma doença ou estado como mencionados aqui. Por este meio, o RNA complexado inventivo pode ser usado para ativar o sistema imune de forma nãoespecífica, por exemplo para desencadear a produção de certas citocinas. O RNA complexado pode ser usado para suportar a resposta imune específica que é suscitada, portanto, por exemplo por um antígeno derivado de patógenos ou tumores. Um agente neste contexto pode ser por exemplo uma composição farmacêutica como definida acima ou um tampão de injeção como definido aqui, contendo o RNA complexado inventivo, uma vacina, etc. A resposta imune ou pode ser modulada por pelo menos um RNA complexado devido ao um ou mais oligopeptídeos tendo um comprimento de 8 a 15 ami147 noácidos e mostrando a fórmula empírica (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)X) e/ou pelas propriedades imunoestimulantes da proteína codificada pelo RNA do RNA complexado.
A presente invenção pode portanto, sempre que apropriado, bem servir para alcançar vários objetivos. Um RNA complexado como tal ou como um componente de uma composição inventiva pode melhorar por si as propriedades de transfecção do RNA só como componente do complexo inventivo. Esta propriedade subjacente do RNA complexado inventivo é benéfica a uma ampla variedade de aplicações. Sempre que for intencionado introduzir um RNA em uma célula, eficácia de transfecção melhorada é assegurada pela presente invenção. Esta propriedade como tal pode permitir usar a presente invenção para o tratamento de uma variedade enorme de doenças, por exemplo o tratamento monogenético ou doenças genéticas como definidas acima.
Além disso, a presente invenção pode ser usada sempre que tratamento de distúrbios imunes, por exemplo alergias ou doenças autoimunes, for visado. Além disso, a presente invenção pode ativar o sistema imune dos pacientes intensificando sua resposta imune não-específica ou específica. Consequentemente, pode suscitar uma resposta imune nãoespecífica, sempre que apropriado, para curar uma doença. E, sempre que requerido, pode suscita uma resposta imune específica como tal (por exemplo, codificando um antígeno pelo RNA como componente do complexo inventivo) ou por uma combinação do RNA complexado inventivo com um antígeno, por exemplo na mesma composição. Sempre que requerido; o RNA complexado inventivo pode ser preferivelmente um antígeno ou um anticorpo, ou qualquer outra proteína ou peptídeo como definidos acima, capazes de modular a resposta imune (preferivelmente de induzir ou intensificar mesmo ou, no caso de alergias ou doenças autoimunes dessensibilizando o sistema imune do paciente para um alergênio específico ou autoantígeno). Para modular, por exemplo induzir ou intensificar, uma resposta imune em um tecido ou um organismo, o RNA complexado pode ser administrado a este tecido ou organismo como definido acima ou como tal ou como um a148 gente como definido acima. Os modos de administração que podem ser usados podem ser iguais ao descrito acima para composições farmacêuticas. Administração do agente pode ocorrer antes, simultâneo e/ou subsequente a uma terapia de doenças ou estados como mencionado aqui, por exemplo pela administração do agente antes, simultâneo e/ou subsequente a uma terapia ou uma administração de um terapêutico adequado para estes doenças ou estados.
De acordo com uma modalidade alternativa, a presente invenção também abrange o uso do peptídeo (Arg)7 em um complexo com um RNA (molécula) como definido aqui ou o peptídeo (Arg)7 sozinho (para a preparação de um agente) para modular, preferivelmente suscitar, por exemplo induzir ou intensificar, uma resposta imune, preferivelmente uma resposta imune não-específica, por exemplo, desencadeando a produção de citocinas, em um tecido ou um organismo como definidos acima, e preferivelmente para suportar uma doença ou estado como mencionados aqui. Embora determinando as faixas do peptídeo da fórmula inventiva (I), os inventores presentes descobriram surpreendentemente que (Arg)7 é capaz de significativamente induzir ou intensificar uma resposta imune em hPBMCs, até mesmo se nenhuma transfecção dos ácidos nucleicos, particularmente RNA em hPBMCs, tiver sido observado. Um RNA (molécula) pode ser qualquer RNA (molécula) como definido aqui, preferivelmente, sem ser limitado a estes, um oligonucleotídeo de RNA curto, um RNA de codificação, um RNA imunoestimulante, um siRNA, um RNA antissenso, ou riboswitches, ribozimas ou aptâmeros. Novamente, um agente neste contexto pode ser por exemplo uma composição farmacêutica como definida acima, ou um tampão de injeção como definido aqui que adicionalmente contém o RNA complexado inventivo etc., em que no RNA complexado inventivo no agente como definido aqui foi substituído pelo peptídeo (Arg)7 em um complexo com um RNA (molécula) como definido aqui ou o peptídeo (Arg)7 sozinho.
De acordo com outra modalidade alternativa, a presente invenção também abrange o uso do peptídeo (Arg)7 em um complexo com um RNA (molécula) como definido aqui ou o peptídeo (Arg)7 sozinho (para a
149 preparação de um agente) para o tratamento de qualquer uma das doenças ou estados supracitados.
De acordo com uma modalidade final, a presente invenção também fornece kits que contêm um RNA complexado de acordo com a invenção e/ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção como também, opcionalmente instruções, técnicas com informação sobre a administração e dosagem do RNA complexado de acordo com a invenção e/ou a composição farmacêutica de acordo com a invenção. O kit pode separadamente também compreender um ou mais do grupo de componentes a seguir: pelo menos um antígeno ou pelo menos um anticorpo ou uma composição contendo um antígeno ou um anticorpo, um adjuvante adicional ou uma composição que contêm pelo menos um adjuvante e/ou pelo menos uma citocina ou uma composição que contêm pelo menos uma citocina. O antígeno, anticorpo e/ou a citocina podem ser fornecidos como tais (proteínas) ou podem ser fornecidos como DNA ou RNA que codificam para o antígeno, anticorpo ou citocina.
A presente invenção também fornece kits que contêm o peptídeo (Arg)7 em um complexo com um RNA (molécula) como definido aqui ou o peptídeo (Argfr sozinho também, opcionalmente instruções, técnicas com informação sobre a administração e dosagem do peptídeo (Arg)7. Tais kits podem aplicados por exemplo a qualquer uma das aplicações ou usos supracitados, preferivelmente para o uso de pelo menos um RNA complexado de acordo com a presente invenção (para a preparação de um agente) para o tratamento de qualquer uma das doenças supracitadas. Os kits podem ser também aplicados ao uso de pelo menos um RNA complexado de acordo com a presente invenção (para a preparação de um agente) para o tratamento de qualquer uma das doenças supracitadas, em que o agente (e/ou o RNA complexado) pode ser capaz de induzir ou intensificar uma resposta imune em um tecido ou um organismo como definidos acima. Tais kits podem ser também aplicados para o uso de pelo menos um RNA complexado dê acordo com a presente invenção (para a preparação de um agente) para modular, preferivelmente suscitar, por exemplo induzir ou intensificar, uma
150 resposta imune em um tecido ou um organismo como definidos acima, e preferivelmente suportar uma doença ou estado como mencionados aqui. FIGURAS
É intencionado que as Figuras a seguir ilustrem a invenção também. Não é intencionado que as mesmas limitem o assunto da invenção a estas.
Figura 1: descreve a sequência de uma sequência de mRNA de luciferase estabilizada, em que o mRNA de codificação de luciferase nativa é modificado com um poli-a/poli-c-marcador (A70-C30). Esta primeira construção (construção CAP-Ppluc(wt)-muag-a70-c30, SEQ ID NO: 35) continha os elementos de sequência a seguir:
sequências de estabilização do gene de alfa-globina, x Adenosina na extremidade 3'-terminal (cauda poli-a), x Citosina na extremidade 3'-terminal (cauda poli C);
representada seguindo os símbolos:
_= sequência de codificação = 3'-UTR do gene de globina alfa
.......= cauda poli A ___= cauda poli C
Figura 2: mostra a sequência de uma sequência de mRNA de luciferase estabilizada, em que a construção de acordo com a SEQ ID NO: 35 (vide Figura 1) é também modificada com uma sequência otimizada em GC para um uso de códon melhor. A construção final (construção CAPPpluc(GC)-muag-a70-c30, SEQ ID NO: 36) continha os elementos da sequência a seguir:
sequência otimizada em GC para um uso de códon melhor sequências de estabilização do gene de alfa-globina x Adenosina na extremidade 3'-terminal (cauda poli A), x Citosina na extremidade 3'-terminal (cauda poli C);
representada seguindo os símbolos:
_= sequência de codificação == 3'-UTR modificada do gene de globina alfa
151
......,= cauda poli A ___= cauda poli C
Figura 3: mostra a sequência de codificação da sequência de acordo com a SEQ ID NO: 35 (SEQ ID NO: 37) (vide Figura 1).
Figura 4: mostra a sequência de codificação otimizada em
GC da sequência de acordo com a SEQ ID NO: 36 (SEQ ID NO: 38) (vide Figura 2). Os códons Otimizados em GC estão sublinhados.
Figura 5: mostra o efeito imunoestimulante do RNA complexado com nona-arginina ((Arg)9) em células de hPBMC medindo a produ10 ção de IL-6. Como pode ser visto, células de hPBMC mostram uma produção significativa de IL-6, isto é, um efeito imunoestimulante significativo de RNA complexado com nona-arginina ((Arg)9).
Figura 6: mostra o efeito imunoestimulante do RNA complexado com nona-arginina ((Arg)9) em células de hPBMC medindo a produ15 ção de TNF-alfa. Como pode ser visto, as células de hPBMC mostram uma produção TNF-alfa significativa, isto é, um efeito imunoestimulante significativo de RNA complexado com nona-arginina ((Arg)9).
Figura 7: mostra um exemplo comparativo da comparação dos efeitos imunoestimulantes do RNA complexado com qualquer nona20 arginina ((Arg)9) ou poli-L-arginina, respectivamente, em hPBMCs. Vantajosamente, um efeito imunoestimulante significativo pode ser observado para razões de massa menores que 1:5 (RNAmona-arginina) (1:10; 1:8; 1:5; 1:2; 1:1; 2:1). Porém, ao usar razões de massa de RNA:nona-arginina (5:1) nenhuma produção de TNFalfa significativa pode ser observada. O mesmo se aplica a experimentos de estimulação, usando nona-arginina ((Arg)9) ou mRNA sozinho. Adicionalmente, foi observado, que a complexação de mRNA com poli-L-arginina leva à indução significativamente inferior da produção de TNF-alfa em comparação com a nona-arginina ((Arg)9). Aparentemente, concentrações mais altas de poli-L-arginina parecem ser tóxicas às células transfeccionadas com a mesma, particularmente ao usar uma razão de massa de 1:2 RNA:poli-L-arginina:RNA ou mais alta, uma vez que as células foram lisadas.
152
Figura 8: mostra expressão de luciferase na transfecção dos complexos de RNA com nona-arginina ((Arg)9) em células HeLa. Como pode ser derivada da Figura 8, uma razão de massa de menos que 2:1 (RNA:nona-arginina) parece ser vantajoso. Em contraste, complexação com poli-L-arginina (massa molecular alta) não leva a uma atividade de luciferase significativa. Desse modo, poli-L-arginina (massa molecular alta) não parece ser adequada para transfecção do mRNA.
Figura 9: descreve em um exemplo comparativo a expressão de luciferase sob transfecção dos complexos de RNA com heptaarginina ((Arg)7) em células HeLa. Como pode ser derivado da Figura 9, transfecção dos complexos de RNA com hepta-arginina ((Arg)7) não leva a uma atividade de luciferase significativa. Desse modo, hepta-arginina ((Arg)7) também não parece ser adequada para transfecção do mRNA.
Figura 10: mostra o efeito imunoestimulante do RNA complexado com hepta-arginina ((Arg)7) em células de hPBMC medindo a produção de IL-6. Como pode ser visto, as células de hPBMC mostram uma produção significativa de IL-6, isto é, um efeito imunoestimulante significativo de RNA complexado com hepta-arginina ((Arg)7).
Figura 11: mostra o efeito imunoestimulante do RNA complexado com hepta-arginina ((Arg)7) em células de hPBMC medindo a produção de TNF-alfa. Como pode ser visto, as células de hPBMC mostram uma produção de TNF-alfa significativa, isto é, um efeito imunoestimulante significativo do RNA complexado com hepta-arginina ((Arg)7).
Figura 12: mostra o efeito do RNA complexado com peptídeo de R9 na expressão de luciferase em células HeLa.
Figura 13: mostra o efeito do RNA complexado com peptídeo de R9H3 na expressão de luciferase em células HeLa.
Figura 14: mostra o efeito do RNA complexado com peptídeo
H3R9H3 na expressão de luciferase em células HeLa.
Figura 15: mostra o efeito do RNA complexado com peptídeo
YR9SSY na expressão de luciferase em células HeLa.
Figura 16: mostra o efeito do RNA complexado com peptídeo
153
H3R9SSY na expressão de luciferase em células HeLa.
Figura 17: mostra o efeito do RNA complexado com peptídeo (RKH)4 na expressão de luciferase em células HeLa.
Figura 18: mostra o efeito do RNA complexado com peptídeo
Y(RKH)2R na expressão de luciferase em células HeLa.
Figura 19: mostra o efeito de Histidina nas posições terminais na eficácia da transfecção,
Figura 20: mostra o efeito dos aminoácidos neutros nas posições terminais na eficácia da transfecção.
Figura 21: mostra o efeito imunoestimulante do RNA complexado com R9H3 na secreção de TNFalfa em hPBMCs.
Figura 22: mostra o efeito imunoestimulante do RNA complexado com R9H3 na secreção de IL-6 em hPBMCs.
EXEMPLOS
É intencionado que os exemplos a seguir ilustrem a invenção também. Não é intencionado que eles limitem o assunto da invenção a estes.
EXEMPLO 1 - PREPARAÇÃO DE LUCIFERASE MRNA CONSTRUÇÕES
Nos experimentos a seguir uma sequência de mRNA de luciferase estabilizada foi preparada e usada para experimentos de transfecção, em que a luciferase nativa que codifica o mRNA foi modificada com um marcador poli-a/poli-c (A70-C30) e foi Otimizada em GC para um uso de códon melhor e também estabilizada.
Uma primeira construção (construção CAP-Ppluc(wt)-muag-a70c30, SEQ ID NO: 35) continha os elementos de sequência a seguir: sequências de estabilização do gene de alfa-globina x Adenosina na extremidade 3'-terminal x Citosina na extremidade 3'-terminal
A construção final (construção CAP-Ppluc(GC)-muag-a70-c30, SEQ ID NO: 36), como aqui usada para os experimentos a seguir, continha os elementos de sequência a seguir:
sequência GC-otimizada para um uso de códon melhor
154 sequências de estabilização do gene de alfa-globina x Adenosina na extremidade 3'-terminal x Citosina na extremidade 3'-terminal
Estas sequências são também mostradas nas Figuras 1 e 2 (SEQ ID NOs: 35 e 36). As respectivas sequências de codificação são mostradas nas Figuras 3 e 4 (SEQ ID NOs: 35 e 36).
EXEMPLO 2 - TRANSCRIÇÃO IN VITRO DO mRNA ESTABILIZADO DE LUCIFERASE
O mRNA estabilizado de luciferase de acordo com a SEQ ID NO: 35 ou 36 (Luc-RNAtivo) foi transcrito in vitro usando T7-polimerase (Kit de mRNA T7-0pti, CureVac, Tübingen, Alemanha) seguindo as instruções de fabricação.
Todos as transcrições do mRNA continham uma cauda Polia A de 70 bases e uma estrutura de 5'-cAP. A estrutura de 5‘-cAP foi obtida adicionando um excesso de N7-metil-Guanosin-5'-Trifosfat-5'-Guanosina.
EXEMPLO 3 - FORMANDO UM COMPLEXO DE RNA COM NONAaRGININA '((Arg)9), POLI-L-aRGININA OU OUTROS PEPTÍDEOS COM BASE EM (Arg)g, RESPECTIVAMENTE pg de mRNA de luciferase de RNA estabilizado de acordo com a SEQ ID NO: 36 (Luc-RNAtivo) foram misturados em razões de massa diferentes com nona-arginina (Arg9) ou poli-L-arginina (Sigma-aldrich; P4663; 5000-15000 g/mol), assim formando um complexo. Razões de massa a seguir oram usadas como exemplarmente mostrado para ((Arg)g). PoliL-arginina foi usada para os exemplos comparativos seguindo as mesmas
RNA (Arg)9 (Arg)9 (Arg)9 RNA (Arg)9 H20 Concentração (Arg)9 [μΜ] Razão (ArgVRNA
pg pl pl Pl
1 Mock 70,0 0
2 (Arg)9 sozinho 150 3 67,0 151,32
3 RNA sozinho 15 3,8 66,3 0,00
4 1 10 15 150,0 3,8 3,0 63,3 151,32 10:1
5 1 8 15 120,0 3,8 2,4 63,9 121,06 8:1
6 1 5 15 75,0 3,8 1,5 64,8 75,66 5:1
155
7 1 2 15 30,0 3,8 0,6 65,7 30,26 2:1
8 1 1 15 15,0 3,8 15,0 51,3 15,13 1:1
9 2 1 15 7,5 3,8 7,5 58,8 7,57 1:2
10 5 1 15 3,0 3,8 3,0 63,3 3,03 1:5
11 8 1 15 1,9 3,8 1,9 64,4 1,89 1:8
12 10 1 15 1,5 3,8 1,5 64,8 1,51 1:10
Adicionalmente, outros RNAs complexados com base em (Arg)9 foram preparados acima usando os peptídeos a seguir para complexação: R9: Arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg
R9H3: Arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-His-His-His
H3R9H3: His-His-His-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-His-His-His YSSR9SSY: Tyr-Ser-Ser-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-Ser-Ser-Tyr H3R9SSY: His-His-His-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-Ser-Ser-Tyr (RKH)4: Arg-Lys-His-arg-Lys-His-arg-Lys-His-arg-Lys-His
Y(RKH)2R: Tyr-arg-Lys-His-arg-Lys-His-arg
Para complexação, 4 pg de mRNA estabilizado de luciferase de acordo com a SEQ ID NO: 36 (Luc-RNAtivo) foram misturados em razões molares respectivamente com o peptídeo (de acordo com a fórmula I), assim formando um complexo. Depois a solução resultante foi ajustada com água a um volume final de 50 μΙ e incubada durante 30 minutos em temperatura ambiente. As razões usadas estão indicadas nas tabelas dadas abaixo. Células HeLa (150x103/poço) foram depois semeadas 1 dia antes da transfecção em placas de microtitulação de 24 poços que levam a uma confluência de 70% quando transfecção foi realizada.
R9:
Formulação - > N/P R9
Razão molar Razão de massa N/P
RNA R9 pg de RNA pg de peptídedo
1,00 10000,00 1,00 23,72 50,00
1,00 5000,00 1,00 11,86 25,00
1,00 2500,00 1,00 5,93 12,50
1,00 1000,00 1,00 2,37 5,00
1,00 500,00 1,00 1,19 2,50
156
1,00 100,00 1,00 0,24 0,50
1,00 10,00 1,00 0,02 0,05
R9H3:
Formulação - > N/P R9H3
Razão molar Razão de massa N/P
RNA R9H3 pg de RNA pg de peptídedo
1,00 10000,00 1,00 30,58 50,00
1,00 5000,00 1,00 15,29 25,00
1,00 2500,00 1,00 7,65 12,50
1,00 1000,00 1,00 3,06 5,00
1,00 500,00 1,00 1,53 2,50
1,00 100,00 1,00 0,31 0,50
1,00 1.0,00 1,00 0,03 0,05
H3R9H3:
Formulação - > N/P H3R9H3
Razão molar Razão de massa N/P
RNA H3R9H3 pg de RNA pg de peptídedo
1,00 10000,00 1,00 37,43 50,00
1,00 5000,00 1,00 18,72 25,00
1,00 2500,00 1,00 9,36 12,50
1,00 1000,00 1,00 3,74 5,00
1,00 500,00 1,00 1,87 2,50
1,00 100,00 1,00 0,37 0,50
1,00 10,00 1,00 0,04 0,05
YSSR9SSY:
Formulação - > N/P YSSR9SSY
Razão molar Razão de massa N/P
RNA YSSR9SSY pg de RNA pg de peptídedo
1,00 10000,00 1,00 34,95 50,00
1,00 5000,00 1,00 17,48 25,00
157
1,00 2500,00 1,00 8,74 12,50
1,00 1000,00 1,00 3,50 5,00
1,00 500,00 1,00 1,75 2,50
1,00 100,00 1,00 0,35 0,50
1,00 10,00 1,00 0,03 0,05
H3R9SSY:
Formulação - > N/P H3R9SSY
Razão molar Razão de massa N/P
RNA H3R9SSY pg de RNA pg de pep- tídedo
1,00 10000,00 1,00 36,18 50,00
1,00 5000,00 1,00 18,09 25,00
1,00 2500,00 1,00 9,05 12,50
1,00 1000,00 1,00 3,62 5,00
1,00 500,00 1,00 1,81 2,50
1,00 100,00 1,00 0,36 0,50
1,00 10,00 1,00 0,04 0,05
(RKH)4:
Formulação - > N/P (RKH)4
Razão molar Razão de massa N/P
RNA (RKH)4 pg de RNA pg de pep- tídedo
1,00 10000,00 1,00 28,38 44,44
1,00 5000,00 1,00 14,19 22,22
1,00 2500,00 1,00 7,10 11,11
1,00 1000,00 1,00 2,84 4,44
1,00 500,00 1,00 1,42 2,22
1,00 100,00 1,00 0,28 0,44
1,00 10,00 1,00 0,03 0,04
158
Y(RKH)2R:
Formulação - > N/P Y(RKH)2R
Razão molar Razão de massa N/P
RNA Y(RKH)2R pg de RNA pg de pep- tídedo
1,00 10000,00 1,00 19,67 27,78
1,00 5000,00 1,00 9,83 13,89
1,00 2500,00 1,00 4,92 6,94
1,00 1000,00 1,00 1,97 2,78
1,00 500,00 1,00 0,98 1,39
1,00 100,00 1,00 0,20 0,28
1,00 10,00 1,00 0,02 0,03
EXEMPLO 4 - TRANSFECÇÃO MEDIADA POR NONA-aRGININA((Arg)9) E EXPRESSÃO DE mRNA ESTABILIZADO DE LUCIFERASE DE ACORDO
COM A SEQ ID NO: 35 OU 36 (LUC-RNACTIVE) EM CÉLULAS HeLa
Células Hela (150x103/poço) foram semeadas 1 dia antes da transfecção em placas de microtitulação de 24 poços que levam a uma confluência de 70% quando transfecção foi realizada. Para transfecção (40 pl) 50 μΙ da solução de RNA/(peptídedo) como descreveda no Exemplo 3 foram misturados com 250 μΙ de meio livre de soro e acrescentadas às células (concentração de RNA final: 13 pg/ml). Antes da adição da solução de transfecção, as células HeLa foram lavadas 2 vezes suave e cuidadosamente com 1 ml de Optimen (Invitrogen) por poço. Depois, a solução de transfecção (300 μΙ por poço) foi acrescentada às células e as células foram incuba15 das por 4 h a 37°C. Subsequentemente 300 μΙ de meio de RPMI (Camprex) contendo 10% de FCS foram adicionados por poço e as células foram incubadas durante 20 h adicionais a 37°C. A solução de transfecção foi sugada 24 h após transfecção e as células foram lisadas em 300 pl de tampão de lise (Tris-PO4 a 25 mM de EDTA a 2 mM, glicerol a 10%, de Triton-X a 1%
100, DTT a 2 mM). Os sobrenadantes foram depois misturados com tampão
159 de luciferina (Glicilglicina a 25 mM, de MgSCU a 15 mM, ATP a 5 mM, luciferina a 62,5 μΜ) e luminescência foi detectada usando um luminômetro (Lumat LB 9507 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemanha)). Os resultados destes experimentos estão mostrados nas Figuras 8 e 12 a 18. EXEMPLO 5 - ESTIMULAÇÃO IMUNE SOB TRANSFECÇÃO DE COMPLEXOS DE RNA COM NONA-aRGININA ((Arg)9) OU POLI-L-aRGININA (EXEMPLO COMPARATIVO)
a) EXPERIMENTOS DE TRANSFECÇÃO
Células de HPBMC dè sangue periférico de doadores saudáveis foram isoladas usando um gradiente de Ficoll e lavadas subsequentemente com 1xPBS (solução salina tamponada de fosfato). As células foram depois semeadas em placas de microtitulação de 96 poços (200x103/poço). As células de hPBMC foram incubadas por 24 h, como descritas sob o Exemplo 4, supra, com 10 μΙ do complexo de RNA/peptídedo (Concentração final de RNA: 6 pg/ml; as mesmas quantidades de RNA foram usadas) em Meio XVIVO 15 (BioWhittaker) (Concentração de RNA final: 10 pg/ml). O efeito imunoestimulante nas células de hPBMC foi medido detectando a produção de citocina (lnterleucina-6 e fator de necrose tumoral alfa). Portanto, placas de microtitulação de ELISA (Nunc Maxisorb) foram incubadas durante a noite (o/n) com tampão de ligação (NaN3 a 0,02% Na2CO3a 15 mM, NaHCO3 a 15 mM pH 9,7), adicionalmente contendo um anticorpo de citocina específico. As células foram depois bloqueadas com 1xPBS, contendo BSA a 1% (albumina de soro bovino). O sobrenadante celular foi adicionado e incubado por 4 h a 37°C. Subsequentemente, a placa de microtitulação foi lavada com 1xPBS, 0,05% de Tween-20 e depois incubada com um anticorpo secundário marcado com Biotina (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemanha). Peroxidase de raiz forte acoplado à estreptavidina foi adicionada à placa. Depois, a placa foi lavada novamente com 1xPBS, contendo Tween-20 a 0,05%, e ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etil-benztiazolino-6-sulfônico) foi adicionado como um substrato. A quantidade de citocina foi determinada medindo a absorção a 405 nm (OD405) usando uma curva padrão com Citocinas recombinantes (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemanha) com a leitora de ELISA
160
Sunrise de Tecan (Crailsheim, Alemanha).
b) RESULTADOS
i) Efeito imunoestimulante do RNA complexado com nona-arginina ((Arg)g)
11) Células de HPBMC foram incubadas com RNA complexado com nona-arginina ((Arg)9) por 24 h como descrevedo acima, em que a razão de massa de RNA:(Arg)9 foi 1:1. Depois, produção de IL-6 foi medida nos sobrenadantes celulares usando ELISA. Como resultado, as células de HPBMC mostraram uma produção de IL-6 significativa, isto é, um efeito imunoestimulante significativo de RNA complexado com nona-arginina ((Arg)9) (vide Figura 5).
12) As células de HPBMC foram incubadas com RNA complexado com nona-arginina ((Arg)9) por 24 h como descrevedo acima, em que a razão de massa de RNA:(Arg)9 foi 1:1. Depois, produção de THF-alfa foi medida nos sobrenadantes celulares usando ELISA. Como resultado, as células de HPBMC mostraram uma produção TNF-alfa significativa, isto é, um efeito imunoestimulante significativo de RNA complexado com nona-arginina ((Arg)9) (vide Figura 6).
ii) Comparação do efeito imunoestimulante do RNA complexado com qualquer nona-arginina ((Arg)9) ou poli-L-arginina, respectivamente (Exemplo Comparativo) hPBMCs foram incubados em razões de massa diferentes (RNA:nona-arginina 1:10; 1:8; 1:5; 1:2; 1:1; 2:1, 5:1; 8:1 e 10:1) com um complexo de RNA e nona-arginina ((Arg)9) ou poli-L-arginina, etc., respectivamente, por 24 h. Subsequentemente, a produção de TNF-alfa foi medida usando ELISA.
Vantajosamente, um efeito imunoestimulante significativo pôde ser observado para razões de massa menores que 5:1 (RNA:nona-arginina) (1:10; 1:8; 1:5; 1:2; 1:1; 2:1) (vide Figura 7). Ao usar razões de massa de RNA:nona-arginina (5:1) nenhuma produção de TNF-alfa significativa pôde ser observada. O mesmo se aplica a experimentos de estimulação, usando nona-arginina ((Arg)9) ou mRNA sozinho (vide Figura 7,.esquerda).
161
Além disso, complexação de mRNA com poli-L-arginina leva à indução significativamente inferior da produção de TNF-alfa em comparação à nona-arginina ((Arg)9) (vide Figura 7, direita). Adicionalmente, foi observado que concentrações mais altas de poli-L-arginina parecem ser tóxicas às células transfeccionadas com a mesma, particularmente ao usar uma razão de massa de 1:2 RNA:poli-L-arginina ou menor, uma vez que as células foram lisadas.
EXEMPLO 6 - EXPRESSÃO DE LUCIFERASE EM TRANSFECÇÃO DE COMPLEXOS DE RNA COM NONA-aRGININA ((Arg)9) OU POLI-LaRGININA, RESPECTIVAMENTE, EM CÉLULAS HELA (EXEMPLO COMPARATIVO)
a) Expressão de Luciferase em transfecção de complexos de RNA com nona-arginina ((Arg)9) em células HeLa. Células HeLa foram transfeccionadas com RNAtivo que codifica luciferase que foi complexada com razões diferentes de nona-arginina ou Poli-L-arginina respectivamente. 24 h mais tarde, a atividade da luciferase foi medida. Aparentemente, uma razão de massa de menos que 2:1 (RNA:nona-arginina) parece ser vantajosa (vide Figura 8).
b) Em comparação, a complexação com poli-L-arginina (massa molecular alta) não aumenta a atividade da luciferase para um nível significativo. Desse modo, poli-L-arginina (massa molecular alta) não parece ser adequada para transfecção de mRNA (vide Figura 8).
EXEMPLO 7 - EXPRESSÃO DE LUCIFERASE EM TRANSFECÇÃO DOS COMPLEXOS DE RNA COM HEPTA-aRGININA ((Arg)7) EM CÉLULAS HELA (EXEMPLO COMPARATIVO)
Células HeLa foram transfeccionadas com RNAativo que codifica luciferase, que foi complexada com razões diferentes de hepta-arginina ((Arg)7). 24 h mais tarde, a atividade da luciferase foi medida. Aparentemente, complexação com hepta-arginina ((Arg)7) não aumenta a atividade da luciferase para um nível significativo. Desse modo, hepta-arginina ((Arg)7) não parece ser adequada para transfecção de mRNA (vide Figura 9). EXEMPLO 8 - ESTIMULAÇÃO IMUNE EM TRANSFECÇÃO DE COMPLE162
XOS DE RNA COM HEPTA-aRGININA ((Arg)7) (EXEMPLO COMPARATIVO)
a) Experimentos de transfecção
Experimentos de transfecção foram realizados para hepta5 arginina ((Arg)7) analogamente aos experimentos no Exemplo 5 como mostrado acima.
b) Resultados do efeito imunoestismulador de RNA complexado com hepta-arginina ((Arg)7)
Células de HPBMC foram incubadas com RNA complexado com hepta-arginina ((Arg)7) por 24 h como descrevedo acima, em que a razão de massa de RNA:(Arg)7 foi 1:1. Depois, produção de IL-6 foi medida nos sobrenadantes de célula usando ELISA. Como resultado, as células de HPBMC mostraram uma produção de IL-6 significativa, isto é, um efeito imunoestimulante significativo de RNA complexado com hepta-arginina ((Arg)7) (vide Figura 10).
As células de HPBMC além disso foram incubadas com RNA complexado com hepta-arginina ((Arg)7) por 24 h como descrevedo acima, em que a razão de massa de RNA:(Arg)7 foi 1:1. Depois, a produção de THF-alfa foi medida nos sobrenadantes de célula usando ELISA. Como re20 sultado, as células de HPBMC também mostraram uma produção TNF-alfa significativa, isto é, um efeito imunoestimulante significativo de RNA complexado com hepta-arginina ((Arg)7) (vide Figura 11).
EXEMPLO 9 - DETERMINAÇÃO DO EFEITO DE HISTIDINA NA EFICIÊNCIA DE TRANSFECÇÃO
Para determinar o efeito de Histidina na eficiência da transfecção, uma transfecção foi analogamente realizada aos experimentos de transfecção acima usando peptídeos com conteúdo de Histidina diferente. Portanto, 4 pg de mRNA estabilizado de luciferase de acordo com a SEQ ID NO: 36 (Luc-RNAtivo) foram misturados em razões molares respectivamente com o peptídeo (de acordo com a fórmula I), particularmente R9, R9H3 ou H3R9H3, assim formando um complexo. Depois a solução resultante foi ajustada com água a um volume final de 50 pl e incubada durante 30 minutos
163 em temperatura ambiente. As razões usadas são em cada experimento 1:10000, 1:5000 e 1:1000. Célula HeLa (150x103/poço) foram depois semeadas 1 dia antes da transfecção às placas de microtitulação de 24 poços levando a uma confluência de 70% quando a transfecção foi realizada. Para transfecção, 50 pl da solução de RNAZ(peptídèdo) foram misturados com 250 μΙ de meio livre de soro e adicionados às células (concentração de RNA final: 13 pg/ml). Antes da adição da solução de transfecção, as células HeLa foram lavadas 2 vezes suave e cuidadosamente com 1 ml de Optimen (Invitrogen) por poço. Depois, a solução de transfecção (300 μΙ por poço) foi adicionada às células e as células foram incubadas para 4 h a 37°C. Subsequentemente 300 μΙ de meio de RPMI (Camprex) contendo 10% de FCS foram adicionados por poço e as células foram incubadas por um adicional de 20 h a 37°C. A solução de transfecção foi sugada 24 h após a transfecção e as células foram lisadas em 300 μΙ de tampão de lise (Tris-PO4 a 25 mM, de EDTA a 2 mM, glicerol a 10%, Triton-X 100 a 1%, DTT a 2 mM). Os sobrenadantes foram depois misturados com tampão de luciferina (Glicilglicina a 25 mM, MgSO4 a 15 mM, ATP a 5 mM, luciferina a 62,5 μΜ) e luminescência foi detectada usando um luminômetro (Lumat LB 9507 (Berthold Technologies, Wildbad, Alemanha)).
Os resultados estão mostrados na Figura 19. Como pode ser visto, um alongamento de 3 histidina em uma extremidade terminal já aumenta a eficácia de transfecção do RNA complexado, em que um alongamento de 3 histidina em ambas as extremidades terminais aumenta significativamente a eficácia de transfecção do RNA complexado.
EXEMPLO 10 - DETERMINAÇÃO DO EFEITO DE AMINOÁCIDOS NEUTROS NA EFICIÊNCIA DE TRANSFECÇÃO
Para determinar o efeito dos aminoácidos neutros na eficiência da transfecção, um experimento de transfecção também foi realizado analogamente aos experimentos de transfecção acima no Exemplo 9 usando o peptídeo H3R9CCS. Os resultados deste experimento adicional são mostrados na Figura 20.
EXEMPLO 11 - IMUNOESTIMULAÇÃO USANDO R9H3 EM HPBMCS
164
O efeito de R9H3 na imunoestimulação foi testado em hPBMCs. Portanto, um complexo de R9H3 e RNA como mostrado acima no Exemplo 3 foi preparado. Além disso, células de HPBMC de sangue periférico de doadores saudáveis foram isoladas usando um gradiente de Ficoll e lavadas subsequentemente com 1xPBS (solução salina tamponada de fosfato). As células foram depois semeadas em placas de microtitulação de 96 poços (200x103/poço). As células de hPBMC foram incubadas por 24 h, como descrito sob Exemplo 4, supra, com 10 pi do complexo de RNA/peptídedo (concentração final de RNA: 6 pg/ml; as mesmas quantidades de RNA foram usadas) em Meio X-VIVO 15 (BioWhittaker). O efeito imunoestimulante nas células de hPBMC foi medido detectando a produção de citocina (Interleucina-6 e fator alfa de necrose tumoral). Portanto, placas de microtitulação de ELISA (Nunc Maxisorb) foram incubadas durante a noite (o/n) com tampão de ligação (NaN3 a 0,02%, Na2CO3 a 15 mM, NaHCO3 a 15 mM pH 9,7), adicionalmente contendo um anticorpo de citocina específico. Células foram depois bloqueadas com 1xPBS, contendo 1% de BSA (albumina de soro bovino). O sobrenadante celular foi adicionado e incubado por 4 h a 37°C. Subsequentemente, a placa de microtitulação foi lavada com 1xPBS, Tween20 a 0,05% e depois incubada com um anticorpo secundário marcado com Biotina (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemanha). Peroxidase de raiz-forte acoplada à estreptavidina foi acrescentada à placa. Depois, a placa foi lavada novamente com 1xPBS, contendo Tween-20 a 0,05%, e ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etil-benztiazolino-6-sulfônico) foi adicionado como um substrato. A quantidade de citocina foi determinada medindo a absorção a 405 nm (OD405) usando uma curva-padrão com Citocinas recombinantes (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemanha) com a leitora Sunrise ELISA de Tecan (Craiisheim, Alemanha). Os resultados são vistos nas Figuras 21 e 22. Como pode ser visto, uma imunoestimulação significativa foi apresentada a uma razão de 1:5000 RNA:R9H3.

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. RNA de fita simples complexado imunoestimulante, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um RNA (molécula) complexado com um ou mais oligopeptídeos, que não são covalentemente ligados
    5 ao RNA, em que a razão de nitrogênio/fosfato (razão N/P) do pelo menos um RNA do RNA complexado para o um ou mais oligopeptídeos está em uma faixa de 0,5-50, e o oligopeptídeo tem um comprimento de 8 a 15 aminoácidos e tem a fórmula empírica a seguir:
    (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (fórmula I)
    10 em que l + m + n +o + x = 8-15, e
    1. m, n ou o independentemente um do outro podem ser qualquer número selecionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, contanto que o teor geral de Arg, Lys, His e Orn represente pelo menos 50%
    15 de todos os aminoácidos do oligopeptídeo; e
    Xaa pode ser qualquer aminoácido selecionado de aminoácidos nativos ou não-nativos com exceção de Arg, Lys, His ou Orn; e x pode ser qualquer número selecionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8, contanto que o teor geral de Xaa não exceda 50% de todos os amino20 ácidos do oligopeptídeo.
  2. 2. RNA complexado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um RNA (molécula) é um mRNA.
  3. 3. RNA complexado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo tem um comprimento de 8 a 14,
    25 8 a 13, 8 a 12, ou 9 a 12 ou 9 a 11 aminoácidos.
  4. 4. RNA complexado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o teor geral de Arg, Lys, His e Orn representa pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% de todos os aminoácidos do oligopeptídeo do RNA complexado.
    30 5. RNA complexado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que Xaa na fórmula empírica (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x é selecionado dos aminoácidos tendo uma
    Petição 870180146486, de 31/10/2018, pág. 4/232 cadeia lateral neutra incluindo aminoácidos tendo uma cadeia lateral hidrofóbica neutra e aminoácidos tendo uma cadeia lateral polar neutra.
    6. RNA complexado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo de acordo com
  5. 5 a fórmula empírica (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x não compreende aminoácidos em uma ou ambas as extremidades terminais, que compreendem uma cadeia lateral acídica.
  6. 7. RNA complexado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo de acordo com
  7. 10 a fórmula empírica (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x compreende aminoácidos neutros ou básicos em uma ou ambas as extremidades terminais, ou aminoácidos básicos em uma ou ambas as extremidades terminais ou pelo menos um, preferivelmente pelo menos dois, mais preferivelmente pelo menos três, aminoácidos básicos em ambas as extremidades terminais.
    15 8. RNA complexado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo de acordo com a fórmula empírica (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x compreende uma extensão de pelo menos 3 aminoácidos básicos contíguos dentro de sua sequência.
    20 9. RNA complexado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo de acordo com a fórmula empírica (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x compreende pelo menos 1, 2, ou 3 aminoácido(s) não-catiônico(s) em uma ou ambas as extremidades terminais, o aminoácido não-catiônico preferivelmente sendo seleciona25 do de histidina.
    10. RNA complexado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado é um mRNA, em que o mRNA codifica para uma proteína ou peptídeo terapeuticamente ativos, uma proteína ou peptídeo
    30 imunoestimulantes, um antígeno tumoral ou um anticorpo.
  8. 11. RNA complexado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o RNA é um RNA modificado,
    Petição 870180146486, de 31/10/2018, pág. 5/232 em particular um RNA estabilizado, quando comparado ao RNA do tipo selvagem.
  9. 12. RNA complexado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a razão em massa do pelo
    5 menos um RNA (molécula) do RNA complexado para o um ou mais oligopeptídeos está em uma faixa de 1:100 a 1:0,5, ou tem um valor de 1:50 a 1:1, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:45, 1:40, 1:35, 1:30, 1:25, 1:20, 1:15, 1:10, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1 ou 1:0,5.
  10. 13. RNA complexado de acordo com qualquer uma das reivindi10 cações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a razão molar do pelo menos um RNA (molécula) do RNA complexado para o um ou mais oligopeptídeos está em uma faixa de 1:20000 a 1:500 ou 1:250, ou em uma faixa de 1:10000 a 1:1000, ou tem um valor de 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500,
    15 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:500, 1:450, 1: 400, 1:350, 1:300, ou 1:250.
  11. 14. RNA complexado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a razão de nitrogênio/fosfato (razão N/P) está em uma faixa de 0,75-25.
    20
  12. 15. RNA complexado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo é selecionado do grupo que consiste em:
    ArggHis3, His3ArggHis3, TyrSerSerArggSerSerTyr, His3ArggSerSerTyr, (ArgLysHis)4, Tyr(ArgLysHis)2Arg;
    25 ou de
    Args, Argg, Argw, Argn, Arg12, Argw, Argw, Arg15, (SEQ ID NOs: 1-8);
    Lyss, Lysg, Lysw, Lysn, Lys12, Lysw, Lysw, Lys15, (SEQ ID NOs: g-
  13. 16);
    His8, Hisg, His10, Hisn, His-12, His-13, His14, His-15, (SEQ ID NOs: 17-24); e Orn8, Orng, Ornw, Ornn, Orn12, Ornw, Orn14, Orn15, (SEQ ID NOs: 25-32).
    30 16. RNA complexado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o RNA complexado é formulado como uma composição farmacêutica.
    Petição 870180146486, de 31/10/2018, pág. 6/232
  14. 17. Uso de RNA de fita simples complexado imunoestimulante, compreendendo pelo menos um RNA (molécula) complexado com um ou mais oligopeptídeos, que não são covalentemente ligados ao RNA, em que a razão de nitrogênio/fosfato (razão N/P) está em uma faixa de 0,5-50, e o oligopeptídeo tem um comprimento de 8 a 15 aminoácidos e tem a fórmula empírica a seguir:
    (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (fórmula I) em que l + m + n +o + x = 8-15, e l, m, n ou o independentemente um do outro podem ser qualquer número selecionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, contanto que o teor geral de Arg, Lys, His e Orn represente pelo menos 50% de todos os aminoácidos do oligopeptídeo; e
    Xaa pode ser qualquer aminoácido selecionado de aminoácidos nativos ou não-nativos com exceção de Arg, Lys, His ou Orn; e x pode ser qualquer número selecionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8, contanto que o teor geral de Xaa não exceda 50% de todos os aminoácidos do oligopeptídeo, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença selecionada de um tumor ou doença de câncer, uma doença cardiovascular, uma doença infecciosa, uma doença viral (infecciosa), uma doença autoimune, uma doença (mono)genética e/ou uma alergia.
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