CN116059328A - Timp3重组蛋白用于制备抑制高血压肾透明细胞癌的制剂的应用 - Google Patents

Timp3重组蛋白用于制备抑制高血压肾透明细胞癌的制剂的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116059328A
CN116059328A CN202211116728.1A CN202211116728A CN116059328A CN 116059328 A CN116059328 A CN 116059328A CN 202211116728 A CN202211116728 A CN 202211116728A CN 116059328 A CN116059328 A CN 116059328A
Authority
CN
China
Prior art keywords
timp3
cell carcinoma
clear cell
renal clear
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211116728.1A
Other languages
English (en)
Inventor
宋斐
黄卫人
罗巍
林佳敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Original Assignee
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS filed Critical Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority to CN202211116728.1A priority Critical patent/CN116059328A/zh
Priority to PCT/CN2022/137417 priority patent/WO2024055443A1/zh
Publication of CN116059328A publication Critical patent/CN116059328A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/8146—Metalloprotease (E.C. 3.4.24) inhibitors, e.g. tissue inhibitor of metallo proteinase, TIMP

Abstract

本申请涉及药物学领域，尤其涉及TIMP3重组蛋白用于治疗高血压肾透明细胞癌的制剂的应用。本申请发现组织金属蛋白酶抑制物3(TIMP3)在高血压肾透明细胞癌患者的肿瘤内皮细胞中显著低表达，且与肾透明细胞癌进展密切相关。小鼠皮下荷瘤实验及细胞共培养实验表明内皮来源的TIMP3可以抑制肾透明细胞癌细胞的增值与迁移能力。本申请揭示了TIMP3为高血压促进肾透明细胞癌进展的重要分子，并初步探讨了其作用机制，对伴有高血压的肾透明细胞癌患者的临床治疗具有潜在借鉴意义。

Description

TIMP3重组蛋白用于制备抑制高血压肾透明细胞癌的制剂的应用
技术领域
本申请涉及药物学领域，尤其涉及TIMP3重组蛋白用于治疗高血压肾透明细胞癌的制剂的应用。
背景技术
过往研究报道，组织金属蛋白酶抑制物TIMP3(TIMP3)可以抑制多种癌细胞的增殖和转移。除了通过抑制基质金属蛋白酶(MMP)阻止肿瘤细胞外基质成分降解外，TIMP3还可以通过抑制去整合素-金属蛋白酶(ADAM)的活性去减少细胞膜受体的胞外结构域的脱落﹑降低多种以分泌前体分泌到胞外的生长因子的剪切激活，对肿瘤细胞和肿瘤微环境具有重要作用。已知TIMP3可以参与多种细胞信号的调节，包括TNF、FAS、TGFβ、EGF、NOTCH、IL6、CXCL8和CCL7。此外，有报道称，TIMP3可以通过竞争抑制的方式阻断VEGF与VEGF2型受体的结合抑制血管生，并且这种抑制功能并不依赖于TIMP3蛋白酶抑制功能。因此，TIMP3可以通过减少肿瘤肿瘤组织的血管新生来抑制癌症的发生、进展和转移。
肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其中75-80％为肾透明细胞癌。目前尚无有效的治疗方法，肾癌不仅严重危害患者的身体健康，并且严重影响患者的生活质量，是泌尿系统肿瘤领域的重要研究课题之一。与肿瘤相似，高血压的患病率随着年龄的增长而显著增加，在18至39岁人群中发病率为22.4％，在59岁以上的人群中发病率上升为74.5％。因此，由于人口老龄化的增长，同时患有高血压和癌症的患者迅速增加。然而，缺乏对高血压促进肿瘤进展机制的了解阻碍了高血压患者癌症治疗的优化。此外，高血压也是肿瘤治疗众多副作用中最常见的心血管副作用。大量研究表明高血压与肾透明细胞癌的发病及预后高度相关，但是其潜在的分子机制仍不明确，因此，迫切需要揭示高血压与肾透明细胞癌的具体关连，开发出一类与高血压相关并能够调控肾透明细胞癌的新靶点。
发明内容
本申请的目的是提供TIMP3重组蛋白的应用。
本申请的再一目的是提供高血压肾透明细胞癌抑制剂。
本申请提供TIMP3重组蛋白用于制备抑制高血压肾透明细胞癌的制剂的应用，TIMP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
根据本申请的应用，其中，TIMP3重组蛋白用于制备抑制高血压肾透明细胞癌细胞的增值与迁移能力的制剂。
SEQ ID NO:1所示：
MTPWLGLIVLLGSWSLGDWGAEACTCSPSHPQDAFCNSDIVIRAKVVGKKLVKEGPFGTLVYTIKQMKMYRGFTKMPHVQYIHTEASESLCGLKLEVNKYQYLLTGRVYDGKMYTGLCNFVERWDQLTLSQRKGLNYRYHLGCNCKIKSCYYLPCFVTSKNECLWTDMLSNFGYPGYQSKHYACIRQKGGYCSWYRGWAPPDKSIINATDP
根据本申请的高血压肾透明细胞癌抑制剂，所述抑制剂包括TIMP3重组蛋白。
本发明提供了过表达TGFBR2重组载体用于制备促进高血压肾透明细胞癌患者表达TIMP3的制剂的应用。
本发明提供了转录因子EGR1敲除系统用于制备促进高血压肾透明细胞癌患者表达TIMP3蛋白的制剂应用。
本申请的有益技术效果：
本申请发现组织金属蛋白酶抑制物3(TIMP3)在高血压肾透明细胞癌患者的肿瘤内皮细胞中显著低表达，且与肾透明细胞癌进展密切相关。
小鼠皮下荷瘤实验及细胞共培养实验表明内皮来源的TIMP3可以抑制肾透明细胞癌细胞的增值与迁移能力。
此外，相较正常血压肾透明细胞癌患者，高血压肾透明细胞癌患者血浆中miR-21-5p的浓度显著增高。通过将内皮细胞与肾透明细胞癌患者血浆及miR-21-5p类似物共孵育，发现相较正常血压肾透明细胞癌患者血浆及miRNA阴性对照组，高血压肾透明细胞癌患者的血浆及miR-21-5p类似物能够显著抑制内皮细胞中TIMP3的表达。有意思的是miR-21-5p对TIMP3的抑制作用并非通过直接靶向TIMP3的3'UTR实现mRNA降解，而是通过降低p38分子的磷酸化水平、上调转录因子EGR1的表达、最终下调TGFBR2表达实现的。在高血压模型小鼠荷瘤实验中，以TIMP3重组蛋白能够得到良好的治疗效果。
因此，本申请揭示了TIMP3为高血压促进肾透明细胞癌进展的重要分子，并初步探讨了其作用机制，对伴有高血压的肾透明细胞癌患者的临床治疗具有潜在借鉴意义。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1显示TIMP3在单细胞及组织块测序中的表达水平；
图2显示肾透明细胞癌组织中TIMP3 mRNA及蛋白表达水平；
图3显示786O与人脐静脉内皮细胞共培养后EdU增值检测；
图4为裸鼠皮下荷瘤实验中肿瘤质量及肿瘤体积变化曲线；
图5显示Caki-1与人脐静脉内皮细胞共培养后EdU增值检测；
图6显示条件培养基处理肾透明细胞癌类器官后EdU增值检测；
图7显示Trans-well实验；
图8显示Caki-1细胞划痕实验；
图9显示786O细胞划痕实验；
图10显示细胞划痕实验统计结果；
图11显示TIMP3重组蛋白处理后上皮间质转化标记物在肾透明细胞癌类器官的表达水平；
图12显示肾透明细胞癌组织免疫荧光染色；
图13显示肾透明细胞癌组织免疫组化双染；
图14显示肾透明细胞癌全细胞悬液及去除内皮细胞的悬液中TIMP3的mRNA水平；
图15显示肾透明细胞癌患者血浆处理内皮细胞后TIMP3的表达情况；
图16显示肾透明细胞癌患者血浆中miR-21-5p的表达情况；
图17显示miR-21-5p类似物处理脐静脉内皮细胞后TIMP3的表达情况；
图18显示miR-21-5p类似物处理脐静脉内皮细胞后TIMP3 3’UTR区段及启动子区段报告基因激活水平；
图19显示TGFBR2在单细胞及组织块测序中的表达水平；
图20显示肾透明细胞癌组织中TIMP3 mRNA及蛋白表达水平；
图21显示肾透明细胞癌全细胞悬液及去除内皮细胞的悬液中TGFBR2的mRNA表达水平；
图22显示TGFBR2 mRNA的表达水平；
图23显示TIMP3 mRNA的表达水平；
图24显示TIMP3及TGFBR2 mRNA的表达水平；
图25显示敲除TGFBR2后人脐静脉内皮细胞中相关通路蛋白及其磷酸化的表达水平；
图26显示TGFB1与TIMP3的表达相关性分析及TGFB1在高血压和正常血压肾透明细胞癌组织中的表达水平；
图27显示不同药物处理后人脐静脉内皮细胞中TIMP3的表达水平；
图28显示TIMP3的表达水平；
图29显示TIMP3启动子报告基因激活水平；
图30显示过表达及敲除TGFBR2后人脐静脉内皮细胞中相关转录因子的表达水平；
图31显示SB202190处理后人脐静脉内皮细胞中相关转录因子的表达水平；
图32显示过表达及敲除EGR1后人脐静脉内皮细胞中TIMP3 mRNA的表达水平及TIMP3启动子区段报告基因荧光强度；
图33显示高血压模型小鼠荷瘤实验中TIMP3重组蛋白的抑瘤效果，C：用盐水(n＝4)、Ang II(n＝5)和Ang II+TIMP3(n＝5)处理的NCG小鼠的异种移植肿瘤图片；H：肿瘤重量的统计分析(*P<0.05,t检验)；I：肿瘤体积统计分析(**P<0.01，****P<0.0001,肿瘤体积统计分析采用双向方差分析)。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请通过对肾透明细胞癌进行组织水平及单细胞水平转录组测序，发现组织金属蛋白酶抑制物3(TIMP3)在高血压肾透明细胞癌患者的肿瘤内皮细胞中显著低表达，且TIMP3与肾透明细胞癌进展密切相关。说明TIMP3可能是调控高血压与肾透明细胞癌的重要因子。但目前肿瘤组织中TIMP3表达的降低一直归因于肿瘤细胞中TIMP3表达的减少以及肿瘤细胞内与调控TIMP3表达的相关信号通路改变，未揭示肿瘤内皮细胞对肿瘤组织中TIMP3表达降低的调控作用及机制。
本申请探讨了高血压是否通过影响肿瘤内皮细胞的TIMP3进而影响肾癌的发生发展。
在正常生理情况下，EGR1在血管内皮细胞中表达量很低，内皮细胞在急性机械损伤或其他刺激下，如：血管紧张素II、剪切应力、细胞因子和生长因子，EGR1的表达量会迅速升高。通过与其他转录因子相互作用，EGR1即可以激活又可以抑制基因的转录。EGR1的DNA结合结构域包含三个锌指序列，通过这些锌指基序EGR1倾向与富含GC碱基的核苷酸序列结合。大量研究表明，EGR1与SP1共享富含GC序列的启动子结合位点，在这些结合位点上它们会竞争性置换彼此，这种置换被认为是几种可诱导基因，如：PDGF-A、PDGF-B和HGF受体基因的重要调控机制。先前的研究表明SP1可以反式激活TIMP323，我们认为表达上升的EGR1是通过在TIMP3的启动子区域竞争性置换SP1，下调了TIMP3的转录，从而降低了TIMP3的表达。
根据本申请的具体实施例，初步通过共培养肾透明细胞癌细胞和人脐静脉内皮细胞证明内皮细胞分泌的TIMP3抑制肾透明细胞癌的增殖和迁移，但其具体机制尚不明确。通过测序发现相较正常血压肾透明细胞癌患者，高血压肾透明细胞癌患者血浆中miR-21-5p的浓度显著增高。进一步将内皮细胞与肾透明细胞癌患者血浆及miR-21-5p类似物共孵育，发现高血压肾透明细胞癌患者的血浆及miR-21-5p类似物能够显著抑制内皮细胞中TIMP3的表达，并且发现miR-21-5p对TIMP3的抑制作用并非通过直接靶向TIMP3的3'UTR实现mRNA降解，而是通过降低p38分子的磷酸化水平﹑上调转录因子EGR1的表达﹑最终下调TIMP3表达实现的。在高血压模型小鼠荷瘤实验中，发现以TIMP3重组蛋白能够得到良好的抑瘤效果。
综上所诉，实验表明了高血压通过下调肾透明细胞癌组织中肿瘤内皮细胞分泌的TIMP3，促进肾透明细胞癌的增殖和迁移。本申请对高血压促进肾透明细胞癌进展的机制提出了miR-21-5p/TGFBR2/p38/EGR1信号通路可调控TIMP3的表达，进而调控高血压患者ccRCC的进程的见解，对伴有高血压的肾透明细胞癌患者的临床治疗具有潜在借鉴意义。
在以下实施例中，涉及以下实验方法和材料：
1.1细胞培养
人肾透明细胞癌细胞系786O、Caki-1及293T细胞系购买于中国科学院细胞库，并在近三年内经过细胞系STR检测排除细胞系使用错误及交叉污染情况。786O细胞系培养于含有10％血清及青霉素-链霉素双抗的1640培养基；Caki-1细胞系培养于含有10％血清及青霉素-链霉素双抗的McCoy's 5A培养基；293T细胞系培养于含有10％血清及青霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养基。人脐静脉内皮细胞购买于美国典型培养物保藏中心，培养于EGMTM-2内皮细胞专用培养液。所有细胞放置于37℃、5％CO2孵育箱中进行培养。
1.2临床样本收集
所有操作及所收集的样本(手术切除的肾透明细胞癌组织、癌组织周围形态正常的癌旁组织、及手术患者的血浆)均已经过深圳市第二人民医院伦理委员会审批同意。所选取样本经组织病理学检测鉴定为肾透明细胞癌。
1.3小鼠皮下成瘤实验
动物实验获得中国科学院深圳先进技术研究院机构动物管理和使用委员会批准。将786O细胞(1.8×106)与病毒空白对照或过表达TIMP3的人脐静脉内皮细胞(2×105)混合重悬于100μl的基质胶中缓慢地注入七周龄的BALB/c裸鼠右背部。接种后每三天对肿瘤的长(L)和宽(W)进行测量，并采用以下公式对肿瘤的体积(V)进行测量：
V＝(L x W2)/2
接种肿瘤三十天后，处死小鼠并对肿瘤质量进行称量。
1.4RT-PCR
将肾透明细胞癌组织切成小块加入1mL Trizol。通过Tissue lyser LT(Qiagen,German)对肾透明细胞癌组织进行充分溶解。在体外细胞实验，细胞培养于六孔板中，吸出培养基并用冰冷的PBS洗涤细胞一次，然后向每孔中加入1mL Trizol。收集细胞裂解物并在室温下放置5分钟。向1ml Trizol中的细胞裂解物加入0.2ml氯仿并剧烈摇动15秒。在室温下孵育1-2分钟后，将混合物在4℃以12,000g离心15分钟。将上层透明水相转移到新管中并与0.5mL异丙醇混合。在数次轻轻摇动和孵育5分钟后，将混合物以最大速度离心15分钟。倒出上清液，用1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀3次。将风干的沉淀溶解在无核酸酶的水中。通过使用nanodrop测定RNA浓度。使用高容量cDNA逆转录试剂盒进行逆转录。PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix用于Real-time PCR准确检测靶基因的表达。Real-time PCR使用GAPDH作为内参基因，通过比较CT法计算相对基因表达量。
1.5Western Blot
将透明细胞肾癌组织切成小块，并放入1ml添加了PhosSTOP磷酸酶抑制剂和完全蛋白酶抑制剂混合物的冰冷RIPA裂解缓冲液中，再通过Tissue lyser LT使肾透明细胞癌组织充分溶解。在体外细胞实验，细胞培养于六孔板中，吸出培养基并用冰冷的PBS洗涤细胞一次，在每个孔中添加80μl RIPA裂解液。将细胞裂解物转移到1.5-mL管中，并在4℃以16,000g离心20分钟。通过pierce BCA蛋白质测定试剂盒测定样品的蛋白质浓度。样品加入5％β-巯基乙醇的上样缓冲液并通过在95℃煮沸5分钟进行变性。等量的蛋白质样品通过7％-12.5％SDS-PAGE进行分离。将分离的蛋白质以100V电压，90-120分钟电泳转移到Immune-Blot PVDF膜上。将膜浸润在含有3％牛血清白蛋白(BSA)的PBST中封闭1小时，然后在4℃孵育一抗过夜。将膜用PBST冲洗3次，然后在室温下与以1:3000的稀释比例稀释的相应HRP偶联二抗孵育2小时。将化学发光底物加到膜上，并通过AmershamTM Imager 680Blotand Gel Imagers化学发光检测仪测定信号强度。以GAPDH作为内参蛋白并通过ImageJ软件对蛋白质表达进行量化分析。
1.6免疫磁柱分离内皮细胞
将肾透明细胞癌组织剪碎并转移到50ml离心管中，加入6ml消化酶混合物：胶原酶I(450U/mL)、中性蛋白酶(2U/ml)、DNAse(60U/ml)溶解于无血清F12培养基中。消化匀浆在37℃下摇动孵育10分钟。消化完成后，加入等体积的FACS缓冲液(含2mM EDTA和5％FBS的PBS)终止消化。消化终止后，消化匀浆通过40μm滤网，并将过滤后的单细胞悬液在4℃以1800rpm(300g)离心8分钟。去除上层液体，将沉淀细胞重悬于200μl FACS缓冲液中，然后加入15μl CD31磁性微珠在冰上孵育15分钟，然后用2ml FACS缓冲液洗涤。将细胞悬液在4℃条件下以1800rpm(300g)离心5分钟，同时将LS柱置于磁铁上并用3ml FACS缓冲液洗涤。将洗涤后的细胞沉淀重悬于1ml FACS缓冲液中并加入到洗涤过的LS柱上。当细胞液全部通过LS柱后，用4ml FACS缓冲液洗涤LS柱两次，收集流出液体，此细胞群为去除内皮细胞后的肾透明细胞癌组分。然后从磁铁中取出LS柱，将LS柱置于冰上的15ml试管中，并加入4ml FACS缓冲液。当LS柱中剩余1ml液体时时，推动注射器塞将液体挤入离心管中。在4℃，以300g离心min收集CD31阳性细胞，此细胞群为肾透明细胞癌的内皮细胞组分。
1.7质粒构建及慢病毒制备
将EGR1蛋白编码区克隆到pcDNA 3.1+载体上构建EGR1过表达质粒。将TGFBR2和TIMP3的蛋白编码区分别克隆到pLenti-CMV-3xFLAG-PGK-Puro和pLenti-EF1A-hTIMP3-CMV-EGFP-Puro载体上，以生成TGFBR2和TIMP3过表达慢病毒载体。靶向TIMP3的sgRNA序列如下：sgRNA 1 5'-GCCTGTAGGTCGCGTCTATGAG-3'；sgRNA 25'-GTCATAGACGCGACCTACAGGG-3'。将TIMP3 sgRNA的序列克隆到plenti-hU6-sgRNA-EFS-hCas9-IRES-puromycin慢病毒载体上。靶向TGFBR2的sgRNA序列如下：sgRNA 15'-TGCTGGCGATACGCGTCCACAGG-3'；sgRNA25'-GGACGATGTGCAGCGGCCACAGG-3'。TGFBR2 sgRNA的序列被克隆到plenti-hU6-sgRNA-hPGK-EGFP-IRES-Hygro慢病毒载体上。表达人类密码子优化的化脓链球菌Cas9蛋白和杀稻瘟素抗性的慢病毒骨架载体购自addgene。将慢病毒骨架载体与psPAX2和pMD2.G质粒共转染至293T细胞。转染后36和60小时，收集培养基，并通过5×104g，2小时的高速离心，收集释放到293T细胞培养液中的重组慢病毒。
1.8双荧光素酶报告基因检测
将TIMP3转录起始位点上游的2000bp和TIMP3 3'UTR区域的3000bp核苷酸序列分别克隆到pGL3-basic和PGL3-CMV-LUC-MCS载体上。本实验以pRL-SV40质粒作为对照组，并使用海肾荧光素酶活性作为内参。使用NeonTM转染系统将质粒转染到人脐静脉内皮细胞中。通过酶标仪和双荧光素酶报告分析试剂盒评估荧光素酶活性。所有测定均为复孔检测。
1.9Transwell肿瘤侵袭实验
在共培养系统中，786O和Caki-1被慢病毒标记为红色，人脐静脉内皮细胞被慢病毒标记为绿色。将2×105ccRCC细胞(786O和Caki-1)与2×105人脐静脉内皮细胞在无血清培养基中混合，并接种到具有8μm孔径的Trans-well小室中(Corning，3422)。Trans-well小室外加入500μL 10％FBS培养基。24小时后，取出Trans-well小室用PBS温和漂洗2遍，并用4％多聚甲醛固定10min。Trans-well小室用0.2％结晶紫染色10min，然后在蒸馏水中浸泡2-3分钟。用棉签将Trans-well小室内表面的细胞与结晶紫擦除干净，于倒置显微镜下对Trans-well小室外侧拍照，计数细胞数。
1.10细胞划痕实验
在共培养系统中，786O和Caki-1被慢病毒标记为红色，人脐静脉内皮细胞被慢病毒标记为绿色。然后将1×105ccRCC细胞(786O和Caki-1)与1×105人脐静脉内皮细胞混合并接种到12孔板中。当细胞达到95％汇合度时，用200μL移液吸头以十字方式刮擦细胞，在孔板中心形成一个十字形状刮痕。然后，用PBS洗掉漂浮的细胞。刮擦细胞后的0h、24h时拍照测量刮擦痕迹的宽度。迁移指数公式如下：
migration index＝(1-wound width at 24h/wound width at 0h)×100％。
1.11细胞增值检测
通过Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro Kit(Ribobio,中国)对细胞增殖能力进行了检测。将2×105ccRCC细胞(786O和Caki-1)与2×105人脐静脉内皮细胞混合均匀接种于在6孔板中，在70％汇合度时加入Edu孵育2小时。将类器官接种到涂有基质胶(康宁，美国)的24孔板上。三天后，加入Edu孵育8小时。然后将细胞消化成单细胞，再通过磁珠细胞分离技术分离内皮细胞。随后，对透明细胞肾癌细胞进行固定、透化和荧光标记EdU。通过Tcytoflex流式细胞仪(Beckman，美国)检测Edu阳性细胞百分比，并通过Flowjo软件进行分析。
1.12组织块转录组测序及分析
使用AllPrep DNA/RNA Mini Kit从透明细胞肾癌组织中分离出RNA。使用NEB
Figure BDA0003845896120000121
UltraTM RNA Library Prep Kit for
Figure BDA0003845896120000122
生成测序文库，并将索引代码添加到每个样本的属性序列中。使用Illumina Novaseq对RNA文库进行了150bp的配对测序。通过Fastp使用默认参数去除低质量和适应体污染的读数。然后，使用STAR(v2.2.0)将序列读数与参考基因组(UCSC hg19)进行比对。使用RSEM(v1.2.22)计算以TPM(TranscriptsPer Kilobase Million)为标准的基因表达值。用Wilcoxon脚本对差异通路富集进行分析。使用clusterProfiler package进行GSEA分析。使用TCGAbiolinks package下载TCGA队列中每个ccRCC患者的FPKM归一化基因表达谱，然后将FPKM值转换为TPM水平。TIMP3的生存分析使用Survival package进行分析。
1.13单细胞转录组测序及分析
收集2名高血压及2名正常血压患者的ccRCC肿瘤组织，然后解离成单细胞悬液，并对细胞活力进行量化。使用死细胞去除试剂盒(Miltenyi Biotec，美国)去除死细胞，使用10X Genomics Single Cell Reagent Kits v3方法调整细胞浓度为10,000个/样品，以制备文库。文库在Nova 6000平台上进行测序。然后用10X Genomics i7索引及使用10XGenomics CellRanger v3.0.0工具对BCL文件进行去多重化。提取的成对的fastq文件被映射到hg19基因组上，并使用cellRanger计数功能生成每个样本的原始表达矩阵。使用R语言中的Seurat3脚本处理每个样品的原始UMI(唯一分子标识符)计数矩阵。nFeature_RNA>4000，或nCount_RNA>25000，或线粒体衍生的UMI计数超过50％的细胞被视为低质量细胞。低质量细胞和双细胞被排除出以后分析。然后，对UMI矩阵进行对数归一化，并选择最多的3500个可变基因。使用和谐脚本去除每个样本的批次效应。随后，使用PCA对前50个PC进行降维处理，然后使用tSNE进行分析。最后，使用基于K-近邻图的方法对细胞进行聚类。使用R语言中的VAM(Variance-adjusted Mahalanobis)进行单细胞水平的基因集富集分析。使用Seurat软件包中的FindMarker模块检测差异表达基因和差异富集途径。
以下结合附图，详细说明本申请各实施例提供的技术方案。
实施例1TIMP3在高血压患者的肾透明细胞癌组织中表达降低
为了研究高血压对是否通过影响肾透明细胞癌组织中的内皮细胞功能进而促进肿瘤的进展，将高血压/正常血压患者肾透明细胞癌组织水平差异表达基因及单细胞转录组测序中内皮细胞群差异表达基因与主要表达于内皮细胞群的基因取交集。发现内皮细胞群中TIMP3、TGFBR2、GRB 10和TMEM150C的表达水平显着高于其他细胞群，相较正常血压肾透明细胞癌患者，它们的表达水平在高血压肾透明细胞癌患者的内皮细胞群及整个肿瘤组织显著降低。在四个基因中，TIMP3是唯一可以编码具有旁分泌和内分泌功能蛋白的基因，具有介导内皮细胞和肿瘤之间相互作用的可能。实验进一步验证了TIMP3在肾透明细胞癌组织中的表达水平。与组织水平及单细胞水平测序结果一致(图1)，高血压肾透明细胞癌患者癌组织中TIMP3 mRNA及蛋白表达水平显著降低(图2)。
实施例2TIMP3抑制肾透明细胞癌细胞的增值和迁移
为了研究内皮TIMP3对肾透明细胞癌细胞的增殖和转移的影响，将两种广泛使用的肾透明细胞癌细胞系786O和Caki-1与人脐静脉内皮细胞共培养，并通过流式细胞技术及5-Ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU)增殖测定法检测肾透明细胞癌细胞的增值情况。实验结果显示：与人脐静脉内皮细胞对照组处理组相比，人脐静脉内皮细胞过表达TIMP3组的786O及Caki-1细胞的增殖能力显著降低(图3，图5)。
通过条件培养基方法，研究重组TIMP3蛋白及脐静脉内皮细胞来源的TIMP3对肾透明细胞癌肿瘤类器官增值能力的影响。与来自脐静脉内皮细胞对照组及条件培养基对照组相比，添加了TIMP3重组蛋白的脐静脉内皮细胞(条件培养基及添加了2μg/ml TIMP3重组蛋白的脐静脉内皮细胞)处理的肾透明细胞癌类器官的增殖能力显著被抑制(图6)。
随后，进一步通过小鼠皮下荷瘤实验验证TIMP3对肾透明细胞癌增值的调控作用。将正常表达或过表达TIMP3的脐静脉内皮细胞与786O按1：9的比例混合接种于裸鼠皮下并进行实时监测。发现：与脐静脉内皮细胞对照组相比，过表达TIMP3的脐静脉内皮细胞组的裸鼠皮下肿瘤细胞的生长受到显著抑制，肿瘤变小且重量显著减轻。
将脐静脉内皮细胞与786O或Caki-1共培养，通过Trans-well实验和划痕实验检测TIMP3对786O和Caki-1迁移能力的影响。发现与脐静脉内皮细胞对照组相比，过表达TIMP3的脐静脉内皮细胞组的786O和Caki-1细胞的迁移速率受到了显著抑制(图7)。
进一步通过划痕实验发现，与脐静脉内皮细胞对照组相比，过表达TIMP3的脐静脉内皮细胞组的786O和Caki-1的划痕愈合能力显著降低(图8，图9，图10，786O和Caki-1被预先标记为红色，脐静脉内皮细胞被预先标记为绿色)。
为了研究TIMP3是否通过抑制EMT来抑制肾透明细胞癌的增值和迁移，将肾透明细胞癌类器官与2μg/ml TIMP3重组蛋白共孵育，72h后，检测Cdh1、Cdh2、Slug、Snail、Twist、Vimentin等上皮间质转化标记物。发现2μg/ml TIMP3重组蛋白对肾透明细胞癌类器官的上皮间质转化并没有显著影响(图11)。
实施例3确定肿瘤内皮细胞是TIMP3在肾透明细胞癌中的主要来源
通过免疫荧光和免疫组织化学染色发现，CD31(一种内皮细胞标志物)与TIMP3在肾透明细胞癌中存在共定位现象(图12，图13)。
通过免疫磁珠分离试剂盒，将肾透明细胞癌样本中内皮细胞进行去除，发现肾透明细胞癌中TIMP3 mRNA的表达水平减少了约60％，说明在肾透明细胞癌中，肿瘤内皮细胞是TIMP3 mRNA的主要贡献细胞群(图14)。
实施例4TIMP3的调控
4.1miR-21-5p在高血压肾透明细胞癌患者血浆中浓度升高，并抑制TIMP3在内皮细胞中的表达
为了确定高血压肾透明细胞癌患者血液中分泌因子是否参与内皮细胞TIMP3表达的调控，将肾透明细胞癌患者血浆与人脐静脉内皮细胞进行共孵育，检测人脐静脉内皮细胞中TIMP3的表达。发现与正常血压肾透明细胞癌患者血浆处理相比，高血压肾透明细胞癌患者血浆处理后人脐静脉内皮细胞中TIMP3的表达下调(图15)，说明高血压患者血液中某种分泌因子参与了TIMP3的调控。已有研究表明，与正常血压人群相比，高血压患者血液中miRNAs的表达谱系发生明显改变，miR-21-5p是血液中浓度较高的几种miRNA之一，且miR-21-5p被报道可下调TIMP3的表达。研究高血压患者血液中调控TIMP3表达的因子是否为miR-21-5p，首先通过qPCR方法进行了验证，结果发现高血压肾透明细胞癌患者血浆中miR-21-5p的浓度明显高于正常血压的肾癌患者(图16)。进一步通过miR-21-5p类似物进行处理，发现与对照处理组相比，miR-21-5p类似物处理人脐静脉内皮细胞后，TIMP3的表达显著降低(图17)，初步说明miR-21-5p为血管内皮细胞中TIMP3表达调控的主要因子。
为了探究miR-21-5p调控TIMP3的作用机制，首先构建了重组报告基因质粒(荧光素酶报告基因分别置于TIMP3的启动子区段调控或TIMP3的3'UTR区段)，转染内皮细胞后加入miR-21-5p类似物，结果发现由TIMP3的3'UTR区段驱动的荧光素酶信号强度保持不变，但由TIMP3的启动子区段驱动的荧光素酶信号强度显著降低。说明miR-21-5p并非直接靶向TIMP3的3'UTR区段下调TIMP3的表达，而是通过调控其他因子去影响TIMP3的转录导致TIMP3表达的降低(图18)。
4.2miR-21-5p通过下调TGFBR2降低TIMP3在内皮细胞中的表达
为了进一步探究何种因子参与了miR-21-5p下调TIMP3表达的进程，发现肾透明细胞癌中TGFBR2和TIMP3的表达模式存在强相关性。
为了进一步验证TGFBR2确实对TIMP3的调控作用，分析了肾透明细胞癌组织水平及单细胞水平转录组测序数据，发现与正常血压肾透明细胞癌患者相比，高血压肾透明细胞癌患者TGFBR2的表达水平在肾透明细胞癌组织中及肾透明细胞癌内皮细胞中均降低(图19)，与qPCR、蛋白质印迹验证的mRNA及蛋白结果一致(图20)。此外，发现在肾透明细胞癌中TGFBR2也是主要表达于内皮细胞中，并且内皮细胞贡献了肾透明细胞癌中约60％的总TGFBR2 mRNA量(图21)，进一步作证了内皮细胞中miR-21-5p可能通过此基因调控TIMP3的表达。
为了进一步确定miR-21-5p是否通过内皮中的TGFBR2抑制TIMP3表达，将人脐静脉内皮细胞与miR-21-5p类似物以及高血压/正常血压肾透明细胞癌患者的血浆进行共孵育后检测TGFBR2的表达。结果发现：与对照处理组及正常血压肾透明细胞癌患者的血浆处理组相比，人脐静脉内皮细胞中TGFBR2的表达被miR-21-5p类似物及高血压肾透明细胞癌患者血浆所抑制(图22)。
此外，过表达TGFBR2慢病毒的人脐静脉内皮细胞经miR-21-5p类似物处理后TIMP3的表达降低状况被逆转(图23)。
进一步通过Crispr-Cas9系统在人脐静脉内皮细胞敲除TGFBR2后，TIMP3的表达水平显著降低。然而，通过Crispr-Cas9系统敲除TIMP3后，TGFBR2的表达水平未见显著变化(图24)。说明肿瘤内皮细胞中TGFBR2是TIMP3的重要调控因子。因此，miR-21-5p可以通过下调TGFBR2的表达抑制TIMP3在内皮细胞中的表达。
TGFBR2主要通过两种途径引起细胞内的生理化学变化：1)经典的SMAD依赖性信号传导途径；2)非经典的SMAD非依赖性信号传导途径，包括：磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K/AKT)通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的几个分支，例如ERK、p38和JNK。因此，进一步检测了TGFBR2敲除对人脐静脉内皮细胞中各种下游信号通路的影响。与对照组相比，内皮细胞敲除TGFBR2后，Smad2和p38的磷酸化水平降低、AKT和ERK1/2的磷酸化水平上升、JNK的磷酸化水平保持不变(图25)。
TCGA数据库的分析显示：在肾透明细胞癌中，TGFB1和TIMP3的表达水平没有相关性(图26)。此外，TGF-β1(TGF-β通路受体激动剂)和A83-01(TGFBR I型受体抑制剂)处理人脐静脉内皮细胞后，TIMP3的表达水平并没有发生改变，这表明TGFBR2不是通过TGF-β/SMAD信号轴对人脐静脉内皮细胞中TIMP3表达进行调节调控的(图27)。然而，SB202190，一种高效的p38通路抑制剂，可显著降低人脐静脉内皮细胞中TIMP3的表达(图27)。鉴于TGFBR2的敲除导致p38的磷酸化降低，因此认为p38信号通路可能参与了人脐静脉内皮细胞中TGFBR2对TIMP3的调节。
为了探究在人脐静脉内皮细胞中TGFBR2敲除是否通过激活AKT和ERK1/2信号通路来抑制TIMP3的表达，在人脐静脉内皮细胞对照组及人脐静脉内皮细胞TGFBR2敲除组中加入AKT和ERK1/2信号通路的拮抗剂MK2206和SCH772984。实验结果显示，人脐静脉内皮细胞中由TGFBR2敲除引起的TIMP3表达水平的降低并没有因为AKT和ERK1/2信号通路的抑制而得到恢复。在人脐静脉内皮细胞对照组中，MK2206和SCH772984的处理后，TIMP3的表达水平降低(图28)。综上所述，结果表明：在人脐静脉内皮细胞中，TGFBR2是通过p38通路，而不是TGF-β/SMAD、Akt和Erk1/2通路，调控TIMP3的表达。
为了探究人脐静脉内皮细胞中TGFBR2的敲除及p38信号通路的抑制是否通过转录层面抑制TIMP3的表达，进行了TIMP3启动子报告基因检测。实验结果显示：在人脐静脉内皮细胞中敲除TGFBR2和抑制p38信号通路降低了TIMP3启动子报告基因的荧光强度。这表明TGFBR2的敲除及p38信号通路的抑制可以通过TIMP3的转录降低TIMP3的表达(图29)。因此，通过生信分析，筛选出可能与TIMP3启动子区域结合的转录因子。
选择了在内皮细胞中中具有显著功能并与TIMP3启动子区段具有高概率结合的11个转录因子(请补充11个转录因子为.....)进行下一步研究。分别在人脐静脉内皮细胞中分别过表达、敲除TGFBR2及通过SB202190抑制p38信号通路，之后检测11个候选转录因子的表达情况。结果发现EGR1：一种与多种血管疾病相关的转录因子，在TGFBR2敲除或SB202190处理后的人脐静脉内皮细胞中表达水平显著升高，并在TGFBR2过表达后的人脐静脉内皮细胞中表达水平显著降低(图30，图31)。
为了探究在脐静脉内皮细胞中EGR1是否能通过转录层面调控TIMP3的表达，进一步检测了EGR1过表达及敲除后TIMP3mRNA的表达水平及TIMP3启动子区段报告基因荧光强度。实验结果显：在脐静脉内皮细胞中，EGR1过表达和敲除分别抑制和促进了TIMP3 mRNA的表达及TIMP3启动子区段报告基因荧光强度(图32)。在高血压模型小鼠荷瘤实验中，发现以TIMP3重组蛋白能够得到良好的抑瘤效果(图33)。
综上所述，本申请发现TIMP3为肾透明细胞癌的重要抑癌因子，高血压通过上调血液中miR-21-5p的浓度抑制内皮细胞中TGFβR2/p38/EGR1信号通路，进而促进高血压患者肾透明细胞癌的进程。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (5)

1.TIMP3重组蛋白用于制备抑制高血压肾透明细胞癌的制剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，TIMP3重组蛋白用于制备抑制高血压肾透明细胞癌细胞的增值与迁移能力的制剂。
3.一种高血压肾透明细胞癌抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括TIMP3重组蛋白。
4.过表达TGFBR2的重组载体用于制备促进高血压肾透明细胞癌患者表达TIMP3的制剂的应用。
5.转录因子EGR1敲除系统用于制备促进高血压肾透明细胞癌患者表达TIMP3蛋白的制剂应用。
CN202211116728.1A 2022-09-14 2022-09-14 Timp3重组蛋白用于制备抑制高血压肾透明细胞癌的制剂的应用 Pending CN116059328A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211116728.1A CN116059328A (zh) 2022-09-14 2022-09-14 Timp3重组蛋白用于制备抑制高血压肾透明细胞癌的制剂的应用
PCT/CN2022/137417 WO2024055443A1 (zh) 2022-09-14 2022-12-08 Timp3重组蛋白用于制备抑制高血压肾透明细胞癌的制剂的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211116728.1A CN116059328A (zh) 2022-09-14 2022-09-14 Timp3重组蛋白用于制备抑制高血压肾透明细胞癌的制剂的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116059328A true CN116059328A (zh) 2023-05-05

Family

ID=86179262

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211116728.1A Pending CN116059328A (zh) 2022-09-14 2022-09-14 Timp3重组蛋白用于制备抑制高血压肾透明细胞癌的制剂的应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN116059328A (zh)
WO (1) WO2024055443A1 (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1587955A4 (en) * 2002-12-24 2007-03-14 Biosite Inc DIFFERENTIAL DIAGNOSTIC MARKERS AND METHODS OF USE
WO2009030254A1 (en) * 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
JPWO2021229979A1 (zh) * 2020-05-13 2021-11-18

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024055443A1 (zh) 2024-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Verginelli et al. Transcription factors FOXG1 and Groucho/TLE promote glioblastoma growth
Huang et al. IGF2-AS affects the prognosis and metastasis of gastric adenocarcinoma via acting as a ceRNA of miR-503 to regulate SHOX2
Karmakar et al. RNA polymerase II-associated factor 1 regulates stem cell features of pancreatic cancer cells, independently of the PAF1 complex, via interactions with PHF5A and DDX3
Xiang et al. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha promotes the invasion, metastasis and angiogenesis of neuroblastoma cells via targeting matrix metalloproteinase 14
Ma et al. Estrogen receptor-mediated miR-486-5p regulation of OLFM4 expression in ovarian cancer
Ma et al. Long noncoding RNA lnc‐ABCA12‐3 promotes cell migration, invasion, and proliferation by regulating fibronectin 1 in esophageal squamous cell carcinoma
Lin et al. Oncogenic circular RNA Hsa‐circ‐000684 interacts with microRNA‐186 to upregulate ZEB1 in gastric cancer
Chang et al. Exosomes derived from miR-1228 overexpressing bone marrow-mesenchymal stem cells promote growth of gastric cancer cells
Gao et al. Sp1-mediated up-regulation of lnc00152 promotes invasion and metastasis of retinoblastoma cells via the miR-30d/SOX9/ZEB2 pathway
Zeng et al. Hsa_circRNA_100146 promotes prostate cancer progression by upregulating TRIP13 via sponging miR-615-5p
Wang et al. GPR115 contributes to lung adenocarcinoma metastasis associated with LAMC2 and predicts a poor prognosis
Hou et al. HMGB1 positive feedback loop between cancer cells and tumor-associated macrophages promotes osteosarcoma migration and invasion
Luo et al. LncRNA CASC2 inhibits proliferation and migration of adenocarcinoma cells via miR‐4735‐3p and mTOR
KR101885982B1 (ko) 구강암 예후측정용 마커로서의 nab2의 용도
CN116059328A (zh) Timp3重组蛋白用于制备抑制高血压肾透明细胞癌的制剂的应用
Yang et al. ZNF326 promotes colorectal cancer epithelial–mesenchymal transition
Lei et al. Knockdown of carboxypeptidase A4 (CPA4) inhibits gastric cancer cell progression via cell cycle arrest and apoptosis
CN113699240B (zh) Nrk在肺癌治疗和预后诊断中的医药用途
CN110229896B (zh) Steap1在卵巢癌诊断、治疗和预后中的应用
CN115287359B (zh) Mcoln2在结直肠癌中的应用
Lu et al. Profile analysis reveals transfer RNA fragments involved in mesangial cells proliferation
CN114231625B (zh) Qser1基因的用途及其相关药物
CN111789965B (zh) 一种miR-522-3p吸附因子在制备治疗癌症的药物中的应用
Hou et al. Overexpression of lncRNA MAGI2-AS3 Retards Tumor Progression and Angiogenesis by Regulating ACY1 via Interacting with Transcription Factor HEY1
Lin et al. CENPK Interacts with SOX6 to Promote Cervical Cancer Stemness and Chemoresistance Through Wnt and P53 Signaling

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination