KR101335843B1

KR101335843B1 - 피롤로[2,3-ｄ]피리미딘 화합물

Info

Publication number: KR101335843B1
Application number: KR1020117003834A
Authority: KR
Inventors: 파멜라 조 버린스키; 매튜 조셉 버치메이어; 제리 웨인 바우만; 앤드레아 조이 곤잘레스; 스티븐 글렌 카멜링; 도널드 웨인 만; 마크 조셉 미턴-프리
Original assignee: 조에티스 엘엘씨
Priority date: 2008-08-20
Filing date: 2009-08-10
Publication date: 2013-12-02
Also published as: CA2733359A1; JP4884570B2; KR20110043697A; US20100075996A1; ES2467109T3; US9271981B2; JP2012500253A; US8987283B2; MX2011001904A; CN102131812A; US9161939B2; PT2384326E; CO6331437A2; EP2384326B1; AR106252A2; RU2493157C2; SI2384326T1; AU2009283844A1; NZ605292A; US8133899B2

Abstract

본 발명은 피롤로[2,3-D]피리미딘 화합물, 야누스(Janus) 키나제(JAK) 억제제로서의 이의 용도, 이들 화합물을 함유하는 약학 조성물, 및 이들 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

피롤로[2,3-Ｄ]피리미딘 화합물{PYRROLO[2,3-D]PYRIMIDINE COMPOUNDS}

본 발명은 N-메틸(4-(메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노)사이클로헥실)메탄설폰아미드, 이의 유사체, 야누스(Janus) 키나제(JAK) 억제제로서의 이의 용도, 이들 화합물을 함유하는 약학 조성물, 및 이들 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

단백질 키나제는 단백질의 특정한 잔사의 인산화를 촉매하는 효소의 부류로서, 넓게 티로신 키나제 및 세린/트레오닌 키나제로 분류된다. 돌연변이, 과발현 또는 부적절한 조절, 조절곤란 또는 조절해제 및 성장 인자 또는 사이토킨의 과다 생산 또는 과소 생산으로부터 야기된 부적절한 키나제 활성은 암, 심혈관 질병, 알레르기, 천식 및 다른 호흡기 질병, 자가면역 질환, 염증 질환, 골 질환, 대사 장애 및 신경학적 및 신경퇴행성 질환, 예를 들면 알츠하이머병을 포함하지만 이로 한정되지 않는 많은 질병에 관여하고 있다. 부적절한 키나제활성은 전술된 질병 및 관련 질병에 관여하는 세포 성장, 세포 분화, 생존, 세포사멸, 유사 분열 생식, 세포 주기 제어 및 세포 이동성에 관한 다양한 생물학적 세포 반응을 야기한다.

따라서, 단백질 키나제는 치료 개입용 목표로서 중요한 부류의 효소로서 알려져왔다. 특히, 세포 단백질 티로신 키나제의 JAK 패밀리(JAK-1, JAK-2, JAK-3, 및 Tyk-2)는 사이토카인 신호전달에서 중추적 역할을 한다 ([Kisseleva et al, Gene, 2002, 285, 1]; [Yamaoka et al. Genome Biology 2004, 5, 253]). 사이토카인이 수용체에 결합하면, 사이토카인은 JAK을 활성화시키고, 이는 사이토카인 수용체를 인산화시켜, 이에 의해 신호전달 분자, 특히 전사의 신호 전달자 및 활성화제(STAT)의 일원에 대한 부착 부위를 생성하여 궁극적으로 유전자 발현을 야기한다. 다양한 사이토카인이 JAK 패밀리를 활성화시키는 것으로 알려져 있다.

따라서, JAK-1, JAK-2, JAK-3, 및/또는 Tyk-2를 비롯한 JAK 효소를 효과적으로 억제하는 대안적 화합물에 대한 필요성이 있다.

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

[화학식 I]

상기 식에서,
R¹은 하이드록시로 선택적으로 치환된 -C_1-4알킬이다.

특히, R¹이 메틸인 화학식 I의 화합물이다.

특히, R¹이 에틸 또는 사이클로부틸인 화학식 I의 화합물이다.

다른 양태에서, 본 발명은 또한 하기의 것들을 제공한다:

약학적으로 허용가능한 담체 및 화학식 I의 화합물을 포함하는 약학 조성물;

치료 효과량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하는, 기관 이식 거부, 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선, 암, 골관절염 및 당뇨병에서 선택된 질환 또는 장애를 제어 또는 치료하는 방법;

치료 효과량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하는, 당뇨병, 암, 자가면역성 갑상선 질환, 궤양성 대장염, 크론병, 안구 건조증, 알츠하이머병, 백혈병, 및 면역억제 또는 면역조절이 바람직한 다른 질환에서 선택된 질환 또는 장애를 제어 또는 치료하는 방법;

치료 효과량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하는, 알레르기성 피부염, 습진, 아토피성 피부염, 소양증 및 다른 소양성 증세를 비롯한 알레르기 반응 및 염증성 질환, 예를 들면 대장 질병에서 선택되는 질환 또는 장애를 제어 또는 치료하는 방법;

치료 효과량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하는, 천식, 및 만성 또는 고질적 천식, 잠복성 천식, 기도 과반응성, 기관지염, 기관지 천식, 알레르기 천식, 본태성 천식, 외인성 천식, 분진 천식, 재발성 기도 폐색 및 만성 폐색성 폐 질병을 비롯한 다른 폐색성 기도 질환에서 선택된 질병 또는 질환을 제어 또는 치료하는 방법;

치료 효과량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하는, 단백질 티로신 키나제 또는 JAK-1, JAK-2, JAK-3 및/또는 Tyk-2를 억제하는 방법;

치료 효과량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하는, 단백질 티로신 키나제 또는 JAK-1, JAK-2, JAK-3 및/또는 Tyk-2를 억제하는 방법; 및

본 발명의 화합물의 제조 방법.

도 1은 N-메틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}메탄설폰아미드 말레산 염 (형태 A)의 특징적 X-선 분말 회절 패턴을 나타낸다.
도 2는 벼룩과 관련된 소양증 및 피부염 감소 분석법에서 벼룩 알레르기 개에서 실시예 1b에 대한 제27일의 VAS 점수를 나타낸다.
도 3은 벼룩과 관련된 소양증 및 피부염 감소 분석법에서 벼룩 알레르기 개에서 실시예 1b에 대해 4시간의 기록 기간당 소양증을 나타내는 시간(초)을 나타낸다.

상기 화합물에 관해 본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐 하기 용어는 하기 정의된 의미를 갖는다.

용어 "포유동물"은 가축 및 반려동물을 비롯한 동물 및 인간을 지칭한다. "반려동물"이란 애완동물로 키우는 동물을 지칭한다. 반려동물의 예는 고양이, 개 및 말을 포함한다. 용어 "가축"은 식품 또는 섬유와 같은 제품의 제조를 위해 또는 노동력을 위해 농업 환경에서 사육되거나 길러지는 동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 가축은 포유동물, 예를 들면 인간에게 섭취되기에 적합하다. 가축의 예는 포유동물, 예를 들면 소, 염소, 말, 돼지, 양(새끼 양 포함), 및 토끼, 및 조류, 예를 들면 닭, 오리 및 칠면조를 포함한다.

용어 질병의 "제어", "치료" 또는 "처리"는 (1) 질병의 예방, 즉 질병에 노출되거나 걸리기 쉽지만 아직 질병의 증후/증세를 경험하거나 나타내지는 않는 동물에서 질병의 임상적 증후 또는 증세가 전개되지 않도록 하는 것; (2) 질병의 억제, 즉 질병의 발전 또는 그의 임상적 증후/증세를 정지시키거나 감소시키는 것; 또는 (3) 질병의 경감, 즉, 질병 또는 그의 임상적 증후/증세가 퇴화되도록 하는 것을 포함한다.

용어 "치료 효과량"은 질병 치료를 위해 포유동물에게 투여되었을 때 질병의 이런 치료를 수행하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. "치료 효과량"은 화합물, 질병 및 질병의 심각성, 치료받는 포유동물의 연령, 체중 등에 따라 달라 다양하다.

X-선 분말 회절 패턴의 피크를 정의할 때 사용되는 경우, 용어 "약"은 언급된 2θ값 ± 0.2°θ로서 정의된다. 결정 형태가 형태 A 다형체인지 그리고 청구범위에 포함되는지에 대한 결정은 이 시험에서의 가변성을 고려하여 해석되어야만 한다.

"약학적으로 허용가능한"은 포유동물, 반려 동물 또는 가축에서 사용하기에 적합하다는 것을 의미한다.

다양한 탄화수소-함유 잔기의 탄소 원자 함량은 잔기 중의 탄소 원자의 최소 수 와 최대 수를 나타내는 접두사로 표시된다. 즉, 접두사 C_i _-j는 정수 "i" 내지 정수 "j"개(이들 포함)의 탄소 원자의 잔기를 나타낸다. 예를 들면 C₁ _-4 알킬은 1 내지 4개(이들 포함)의 탄소 원자를 포함하는 알킬을 의미한다.

용어 알킬은 직쇄, 분지쇄 및 환상 포화 1가 탄화수소 기를 의미하지만, "프로필"과 같은 개별적인 라디칼에 대한 언급은 단지 직쇄 라디칼만을 포함하고, 분지쇄 이성체, 예를 들면 "아이소프로필" 또는 환상 이성체, 예를 들면 사이클로프로필메틸 또는 사이클로펜틸은 특이적으로 언급된다.

동일한 분자식을 갖지만 원자의 결합 순서 또는 성질 또는 원자가 공간에서 배열되는 것이 상이한 화합물을 "이성체"라 부른다. 원자의 공간에서의 배열이 상이한 이성체는 "입체이성체"라 언급된다. 당 분야의 숙련자들은 화학식 I의 화합물이 시스- 및 트랜스- 비키랄 부분입체이성체로서 존재할 수 있음을 인식할 것이다. 특히, 본 발명의 화합물은 N-메틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}메탄설폰아미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 하기 화학식 IA의 화합물을 제공한다:

[화학식 IA]

본원에 개시된 화합물의 모든 이성체(예를 들면 시스-, 트랜스- 또는 부분입체이성제) 및 임의의 혼합물이 개시된 화합물의 범위에 포함된다. 에난티오머, 부분입체이성체, 시스, 트랜스, 신, 안티, 용매화물(수화물), 토토머, 및 이의 혼합물을 비롯한 모든 이런 형태가 개시된 화합물에 포함된다.

부분입체이성체 혼합물, 예를 들면 부분입체이성체의 혼합물은 적합한 분리 방법을 이용하여 공지된 방식으로 이들의 상응하는 이성체로 분리될 수 있다. 예를 들면 부분입체이성체 혼합물은 분획 결정화, 크로마토그래피, 용매 분배 및 유사한 방법을 이용하여 이들의 개별적인 부분입체이성체로서 분리될 수 있다. 이러한 분리는 출발 화합물중 하나의 수준에서 또는 화학식 I의 화합물 그 자체에서 일어날 수 있다. 에난티오머는 예를 들면 에난티오머-순수 키랄 산을 이용한 염 형성, 또는 키랄 리간드를 갖는 크로마토그래피 물질을 이용한 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC에 의해 부분입체이성체 염의 형성을 통해 분리될 수 있다.

투여 경로

포유동물(즉, 인간 및 동물)에서 질병을 치료하기 위한 치료적 용도에서, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적 조성물은 경구, 비경구, 국소, 직장, 점막내 또는 장내로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 전신 효과를 생성할 수 있는 간접적 주입 또는 고통받는 부위로의 직접적 주입을 포함한다. 국소 투여는 국소 적용, 예를 들면 눈 또는 귀에 의해 쉽게 접근가능한 피부 또는 기관의 치료를 포함한다. 이는 또한 전신 효과를 생성하는 경피 전달을 포함한다. 직장 투여는 좌약의 형태를 포함한다. 바람직한 투여 경로는 경구 및 비경구이다.

약학적 염

화학식 I의 화합물은 이의 천연 형태 또는 염으로서 이용될 수 있다. 안정한 비독성 산 또는 염기 염의 형성이 바람직한 경우, 약학적으로 허용가능한 염으로서의 화합물의 투여가 적절할 수 있다. 화학식 I의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 아세테이트, 아스코베이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에토글루타레이트, 에실레이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 글리세로포스페이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요다이드/요다이드, 이세테오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-납실레이트, 니코티네이트, 니트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/하이드로겐 포스페이트/다이하이드로겐 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트 및 트라이플루오로아세테이트 염을 포함한다.

조성물/제형

본 발명의 약학 조성물은 당 분야에 잘 공지된 방법, 예를 들면 종래의 혼합, 용해, 과립과, 드라제-제조, 분쇄(levigating), 유화, 캡슐화, 포획(entrapping), 동결건조 과정 또는 분무 건조에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따라 이용하기 위한 약학 조성물은 활성 화합물의 제형화 과정을 용이하게 하고, 약학적으로 사용될 수 있는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 이용하여 종래의 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형화는 선택된 투여 경로에 의존한다. 약학적으로 허용가능한 부형제 및 담체는 일반적으로 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있고, 따라서 본 발명에 포함된다. 이런 부형제 및 담체는 예를 들면, ["Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991)]에 개시되어 있다.

본 발명의 제형은 단기 작용, 신속한 방출, 장기 작용 및 지속 방출로 디자인될 수 있다. 따라서, 약학 제제는 또한 제어 방출 또는 느린 방출을 위해 제형화될 수 있다.

투여량

본 발명에서 사용하기에 적합한 약학 조성물은 활성 성분이 의도된 목적, 즉, 질병 또는 질환의 제어 또는 치료를 달성하기에 충분한 양으로 함유된 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로, 치료 효과량은 치료되는 대상의 질병의 증후/증세를 예방, 경감 또는 개선시키거나, 생존을 연장시키는 화합물의 양을 의미한다.

약학 조성물 또는 이의 단위 투여 형태 중의 본 발명의 화합물인 활성 성분의 양은 다양할 수 있거나, 투여 방식, 특정한 화합물의 효능 및 바람직한 농도에 따라 매우 변화되거나 조절될 수 있다. 치료 효과량의 결정은 당 분야의 숙련자들의 능력 이내이다. 일반적으로, 활성 성분의 양은 조성물의 0.01 중량% 내지 99 중량% 이내의 범위일 것이다.

일반적으로, 활성 성분의 치료 효과 투여량은 하루당 체중 1kg 당 약 0.01 내지 약 100mg, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10mg, 보다 바람직하게는 약 0.3 내지 3mg, 보다 더 바람직하게는 약 0.3 내지 1.5mg의 범위일 것이다. 투여량은 각각의 대상의 요구 조건, 및 치료되는 질병 또는 질환의 심각성에 따라 다양할 것이다.

바람직한 투여량은 통상적으로 단일 투여량 또는 적절한 간격, 예를 들면 하루에 2회, 3회, 4회 또는 그이상의 하위 투여량으로 투여되는 분할된 투여량으로 제시될 수 있다. 하위 투여량 그 자체는 예를 들면 다수의 별개의 느슨하게 이격된 투여로서 추가로 분할될 수 있다(예를 들면 취입기로부터의 여러회의 흡인 또는 눈으로 여러 방울을 점적).

또한, 투여되는 초기 투여량은 바람직한 혈장 농도를 신속하게 달성하기 위해 상기 상한 범위를 넘어서 증가될 수 있다. 한편으로, 초기 투여량은 최적양보다 더 적을 수 있고, 특정한 상황에 따라 치료 기간동안 1일 투여량이 점진적으로 증가될 수 있다. 필요한 경우, 1일 투여량은 또한 투여를 위해 다수의 투여량으로 분할될 수 있고, 예를 들면 하루에 2 내지 4회 분할될 수 있다.

의학적 및 수의학적 용도

본 발명의 화합물은 야누스 키나제-1(JAK-1), 야누스 키나제-2(JAK-2) 및 야누스 키나제-3(JAK-3)에 대해 효능을 갖는 야누스 키나제 억제제(JAK-i)이다. 따라서, 이들은 기관 이식, 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선, I형 당뇨병 및 당뇨병 합병증, 암, 천식, 아토피성 피부염, 자가면역 갑상선 질환, 궤양성 대장염, 크론병, 알츠하이머병, 백혈병, 골관절염, 소양증의 제어, 만성 호흡기 질환 및 면역억제/면역 조절이 바람직한 다른 질환용 치료제로서 유용하다.

또한, 동물에서 아토피성 피부염을 조절하기 위한 안전하고 효과적인 약물이 지속적으로 요구되고 있다. 동물에서 아토피성 피부염 치료 시장은 현재 코티코스테로이드가 주를 이루는데, 이는 동물, 특히 개와 같은 반려동물에게 고통을 주고 바람직하지 않은 부작용을 야기한다. 항히스타민제 또한 이용되지만, 거의 효과적이지 않다. 사이클로스포린(아토피카(ATOPICA(상표명))의 개 제제는 현재 아토피성 피부염을 위해 시판되고 있지만, 비싸고, 효능의 개시가 느리다. 또한, 아토피카(상표명)의 경우 GI 내성 문제가 있다. 본 발명의 화합물은 JAL-1 및 JAK-3에 대해 효능을 갖는 JAK 억제제이다. 이들 화합물은 스테로이드 이용에 대한 대안일 것이고, 아토피성 피부염에서 지속되는 만성 소양증 및 염증, 또는 알레르긴 또는 원인 물질을 제거한 후, 예를 들면 벼룩-알레르기 피부염에서 벼룩을 제거한 후에 느리게 복귀되는 만성 소양증 및 염증의 해결책을 제공할 것이다.

본 발명의 화합물은 약학적으로 허용가능한 형태 단독으로, 또는 포유동물 면역 시스템을 조절하는 하나 이상의 추가의 약물과 함께 또는 소염제와 함께 투여될 수 있다. 이들 약물은 사이클로스포린 A(예를 들면 산디뮨(Sandimmune.) RTM. 또는 네오랄(Neoral.) RTM., 라파마이신, FK-506(타크롤리무스), 레플루노마이드, 데옥시스퍼구알린, 마이코페놀레이트(예를 들면 셀셉트(Cellcept.) RTM., 아자티오프린(예를 들면 이뮤란(Imuran). RTM), 다클리주맙(예를 들면 제나팍스(Zenapax). RTM), OKT3(예를 들면 오르토콜론(Orthocolone) RTM), 앳갬(AtGam), 아스피린, 아세트아미노펜, 이부프로펜, 나프록센, 피록시캄 및 소염 스테로이드(예를 들면 프레드니솔론 또는 덱사메타손)을 포함하지만, 이로 한정되지는 않을 수 있다. 이들 시약은 당 분야의 숙련자들에게 공지된 표준 약학 관행에 따라 동일하거나 별개의 투여 형태의 일부로서 동일하거나 상이한 투여 경로를 통해 동일하거나 상이한 투여 스케쥴로 투여될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 효과량의 하나 이상의 화합물을 환자에게 투여함을 포함하는 대상, 예를 들면 인간 또는 비-인간 포유동물에서 JAK와 관련된 질병, 증세 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. JAK 관련 질병, 증세 또는 질환은 JAK-1, JAK-2, JAK-3 및/또는 Tyk-2와 관련될 수 있다. 치료될 수 있는 적합한 대상은 가축 또는 야생 동물, 반려 동물, 예를 들면 개, 고양이 말 등; 소 및 다른 반추동물, 돼지, 가금류, 토끼 등을 비롯한 가축; 영장류, 예를 들면 레수스 원숭이 및 사이노몰거스 원숭이(또는 게잡이 원숭이 또는 긴꼬리 원숭이로도 알려져 있다), 마모셋, 타마린, 침팬지, 마카크 원숭이 등; 및 설치류, 예를 들면 래트, 마우스, 게르빌루스 쥐, 기니아 피그 등. 한 실시양태에서, 화합물은 약학적적으로 허용가능한 형태, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체에서 투여된다.

JAK/STAT 신호전달이 알레르기, 천식, 자기면역 질환, 예를 들면 이식(동종이식) 거부, 류마티스 관절염, 근위축성 측삭 경화증 및 다발성 경화증, 및 고형 및 혈액 종양, 예를 들면 백혈병 및 임파종의 매개에 관여한다. JAK/STAT 경로의 약학적 간섭의 리뷰에 대해서는 [Frank, (1999), Mol. Med. 5:432:456] 및 [Seidel et al., (2000), Oncogene 19:2645-2656]를 참조할 수 있다.

JAK-3은 특히 다양한 생물학적 과정에 관여하여 왔다. 예를 들면 IL-4 및 IL-9에 의해 유도되는 설치류 비만 세포의 증식 및 생존은 JAK-3 및 감마쇄 신호전달에 의존하는 것으로 보인다. [Suzuki et al., (2000), Blood 96:2172-2180]. JAK-3은 또한 IgE 수용체-매개된 비만 세포의 탈과립화 반응에서 중요한 역할을 하고 ([Malaviya et al., (1999), Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:807-813], JAK-3 키나제의 억제는 아나필랙시스를 비롯한 I형 과민성 반응을 나타내는 것으로 보인다 ([Malaviya et al., (1999), J. Biol. Chem. 274:27028-27038]). JAK-3 억제는 또한 동종 이식 거부를 위한 면역 억제를 나타내는 것으로 보인다 ([Kirken, (2001), Transpl. Proc. 33:3268-3270]). JAK-3 키나제는 또한 류마티스 관절염의 초기 및 말기 단계 ([Muller-Ladner et al., (2000), J. Immunal. 164:3894-3901]); 가족성 근위축성 측삭 경화증 ([Trieu et al., (2000), Biochem Biophys. Res. Commun. 267:22-25]); 백혈병 ([Sudbeck et al., (1999), Clin. Cancer Res. 5:1569-1582]); T-세포 림프종의 한 형태인 균상 식육종 ([Nielsen et al., (1997), Prac. Natl. Acad. Sci. USA 94:6764-6769]); 및 비정상적인 세포 성장 ([Yu et al., (1997), J. Immunol. 159:5206-5210]; [Catlett-Falcone et al., (1999), Immunity 10:105-115])에 관련된 기작에 포함되어왔다.

JAK-3을 비롯한 JAK 키나제는 소아 암의 가장 흔한 형태인 급성 림프모구 백혈병을 갖는 어린이에서 나온 원발성 백혈병 세포에서 풍부하게 발현되고, 연구는 신호 조절 세포사멸을 갖는 일부 세포에서의 STAT 활성화를 관련시켜왔다 ([Demoulin et al., (1996), Mol. Cell. Biol. 16:4710-6]; [Jurlander et al., (1997), Blood 89:4146-52]; [Kaneko et al., (1997), Clin. Exp. Immun. 109:185-193]; 및 [Nakamura et al.,(1996), J. Biol. Chem. 271: 19483-8]). 이들은 또한 림프구 분화, 작용 및 생존에 중요한 것으로 알려져 있다. JAK-3은 특히 림프구, 대식세포 및 비만 세포에서 필수적인 역할을 한다. 이 JAK 키나제의 중요성으로 인해, JAK-3에 선택적인 것들을 비롯하여 JAK 경로를 조절하는 화합물은 림프구, 대식 세포 또는 비만 세포의 기능이 관련된 질병 또는 질환의 치료에 유용할 수 있다 ([Kudlacz et al., (2004) Am. J. Transplant 4:51-57]; [Changelian (2003) Science 302:875-878]).

JAK 경로를 표적으로 하거나, JAK 키나제, 특히 JAK-3의 조절을 목표로 하는 것이 치료적으로 유용한 것으로 생각되는 질환으로는 관절염, 천식, 자가면역 질환, 암 또는 종양, 당뇨병, 일부 안 질병, 질환 또는 증세, 염증, 장 염증, 알레르기 또는 질환, 신경퇴화성 질환, 건선, 이식 거부 및 바이러스 감염이 포함된다. JAK-3의 억제로 인해 유리할 수 있는 질환은 하기에 더욱 상세하게 논의된다.

따라서, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학 조성물은 하기와 같은 다양한 질환 또는 질병을 치료하는데 이용될 수 있다:

류마티스 관절염, 청소념 관절염 및 건선 관절염을 비롯한 관절염;

만성 또는 고질적 천식, 후기 천식, 기도 과반응성, 기관지염, 기관지 천식, 알레르기 천식, 본태성 천식, 외인성 천식, 분진 천식, 재발성 기도 폐색 및 만성 폐색성 폐 질환을 비롯한 천식 및 기타 폐색성 기도 질병;

단일 기관 또는 단일 세포 유형 자가면역 질환, 예를 들면 하시모토 갑상선염, 자가면역성 용혈 빈혈, 악성 빈혈의 자가면역성 위축 위염, 자가면역성 뇌척수염, 자가면역성 고환염, 굿파스쳐병, 자가면역성 혈소판감소증, 교감성 안염, 중증 근육무력증, 그레이브병, 원발성 담즙성 간경변, 만성 공격성 간염, 궤양성 대장염 및 막 사구체병증으로 명명된 것들, 전신성 자가면역 질환, 예를 들면 전신성 홍반성 낭창, 류마티스 관절염, 소그렌 증후군, 라이터 증후군, 다발근육염-피부근염, 전신 경화증, 결절성 다발성 동멱염, 다발성 경화증 및 수포성 유천포창으로 명명된 것들, 및 코간(Cogan) 증후군, 강직 척추염, 바그너 육아종, 자가면역 탈모증, I형 또는 청소년기 개시 당뇨병 및 갑상선염을 비롯한 O-세포(체액성)계 또는 T-세포계 것일 수 있는 추가의 자가면역 질환을 비롯한 자가면역 질병 또는 질환;

소화관/위내장관 암, 대장암, 간암, 비만 세포 종양 및 편평 세포 암종을 비롯한 피부암, 유방암 및 유암, 난소암, 전립선암, 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 비롯한 백혈병, 신장암, 폐암, 근육암, 골암, 방광암, 뇌암, 경구 흑색종 및 전이성 흑색종을 비롯한 흑색종, 카포시 육종, 다발성 골수종을 비롯한 골수종, 골수증식 질병, 증식성 당뇨성 망막증, 및 고형 암을 비롯한 혈관신생-관련 질환을 비롯한 암 또는 종양;

I형 당뇨병 및 당뇨병으로 인한 합병증을 비롯한 당뇨병;

눈의 자가면역 질환, 각막 혼탁, 춘계 결막염, 베쳇병과 관련된 포도막염 및 렌즈-유도된 결막염을 비롯한 결막염, 각막염, 헤르페스 각막염, 원추각막 각막염, 각막 상피세포 이영양증, 각막 백반, 안구 프렘피구스(premphigus), 무렌 궤양, 공막염, 그레이브스병, 보그트-코야나기-하라다(Vogt-Koyanagi-Harada) 증후군, 건성 각 결막염(건조한 눈), 플릭테뉼(phlyctenule), 홍채섬모체염, 유육종증, 내분비 눈병증, 교감 눈병증, 알레르기성 결막염 및 안구 신혈관형성을 비롯한 안 질환, 질병 또는 증세;

크론병 및/또는 궤양성 대장염, 염증성 대장 질병, 세리악 병, 직장염, 호산성 위장염 및 비만 세포증을 비롯한 내장 염증, 알레르기 또는 질환;

운동신경세포병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 헌팅턴병, 대뇌 허혈 또는 외상성 손상, 발작, 글루타메이트 신경독성 또는 저산소증에 의해 야기된 신경퇴화 질병, 발작에서 허혈성/재관류 손상, 심근 허혈증, 신장 허혈증, 심근 경색, 심장 비대증, 죽상경화증 및 동맥경화증, 기관 저산소증, 혈소판 응집을 비롯한 신경퇴화 질병;

아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증, 소양증 및 다른 소양 질환을 비롯한 자가면역 질환 또는 질병;

말의 알레르기성 질환, 예를 들면 말의 물림에 대한 과민반응, 여름철 습진, 및 스위트 이치(sweet itch)를 비롯한 알레르기 반응;

췌장 섬 이식 거부, 골수 이식 거부, 이식편-대-숙주 질환, 기관 및 세포 이식 거부, 예를 들면 골수, 연골, 각막, 심장, 추간판, 섬, 신장, 팔다리, 간, 폐, 근육, 근모세포, 신경, 췌장, 피부, 소장 또는 기관, 및 이종 기관 이식을 비롯한 이식 거부.

다른 실시양태는 JAK 효소를 본 발명의 화합물의 하나 이상의 비-치료양 또는 치료효과량과 접촉시킴을 포함하는 JAK-1, JAK-2, JAK-3 및/또는 Tyk-2를 비롯한 JAK 효소의 억제 방법을 제공한다. 이런 방법은 생체 내 또는 시험관 내에서 일어날 수 있다. 시험관내 접촉은 다양한 양 또는 농도에서 선택된 효소에 대해 하나 이상의 화합물의 효능을 측정하기 위한 스크리닝 분석법을 포함할 수 있다. 치료 효과량의 하나 이상의 화합물과의 생체 내 접촉은 접촉이 일어나는 동물에서 개시된 질병, 질환 또는 증세의 치료 또는 기관 이식 거부의 예방을 포함할 수 있다. JAK 효소 및/또는 숙주 동물에 미치는 하나 이상의 화합물의 효과 또한 결정 또는 측정될 수 있다. JAK 활성의 측정 방법은 실시예 및 제WO 99/65908호, 제WO 99/65909호, 제WO 01/42246호, 제WO 02/00661호, 제WO 02/096909호, 제WO 2004/046112호 또는 제WO 2007/012953호에 개시된 것들을 포함한다.

하기 반응식은 본 발명의 화합물의 일반적인 합성 과정을 예시한다. 모든 출발 물질은 이들 반응식에 개시된 과정에 의해 제조되거나, 당 분야의 숙련자들에 공지된 방법에 의해 제조된다.

[반응식 I]

당 분야의 숙련자들은 본 발명의 화합물의 합성동안 민감한 작용기 (Pg 또는 Pg1)가 보호되고 탈보호될 필요가 있을 수 있음을 인식할 것이다. 이는 종래의 방법, 예를 들면 ["Protective Groups in Organic Synthesis" by TW Greene and PGM Wuts, John Wiley & Sons Inc (1999)] 및 여기에 언급된 참고문헌에 개시된 방법에 의해 달성될 수 있다.

반응식 1에서, 4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (a)은 상업적으로 수득될 수 있다. 트랜스-4-(메틸아미노)-사이클로헥실]메탄올 (b)은 0 내지 60 ℃의 온도에서 여러 시간동안 비양성자성 무수 용매, 예를 들면 테트라하이드로푸란 중에서 리튬 알루미늄 하이드라이드와 같은 환원제로 처리되면 상응하는 카복실산인 트랜스-4-[(tert-부톡시카본일)아미노]사이클로헥산카복실산으로부터 수득될 수 있다.

반응식 I에 도시된 바와 같이, 화학식 (c)의 화합물은 90 ℃ 이하의 승온에서 여러 시간동안 트라이에틸아민 및 탄산칼륨과 같은 적합한 염기의 존재하에서 적합한 비양성자성 극성 용매, 예를 들면 N,N-다이메틸포름아미드, 수성 다이옥산 및 다이메틸설폭사이드 중에서 4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (a)의 트랜스-4-(메틸아미노)-사이클로헥실]메탄올 (b)과의 반응에 의해 합성될 수 있다.

화학식 (d)의 화합물은 화학식 (c)의 화합물로부터 2단계 과정으로 합성될 수 있다. 예를 들면 먼저 극성 비양성자성 용매, 예를 들면 메틸렌 클로라이드 중의 티오닐 브로마이드 또는 삼브롬화인과 같은 브롬화제를 이용하여 화학식 (d)의 화합물을 합성한 후, 두번째로 적합한 보호제, 예를 들면 토실 클로라이드를 첨가하여 화학식 (d)의 보호된 화합물을 수득할 수 있다.

화학식 (e)의 화합물은 화학식 (c)의 화합물로부터 단순한 보호 과정에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면 Pg 및 Pg₁이 모두 토실인 경우, 이는 극성 비양성자성 용매, 예를 들면 메틸렌 클로라이드, 촉매, 예를 들면 DMAP 및 약염기, 예를 들면 트라이에틸아민의 존재하에서 화학식 (c)의 비보호된 화합물을 토실 클로라이드로 처리하는 1단계 반응으로 수행될 수 있다.

화학식 (f)의 화합물은 적합한 친핵체를 이용한 S-알킬화에 의해 화학식 (e)의 화합물로부터 합성될 수 있다. 따라서, 보호기(Pg₁)가 적합한 하이드록실 보호기, 예를 들면 토실 또는 메실인 화학식 (e)의 화합물을 75 ℃까지의 승온에서 2시간동안 극성 용매, 예를 들면 다이메틸설폭사이드 또는 N-메틸피롤리딘 중의 칼륨 티오아세테이트와 반응시켜 화학식 (f)의 화합물을 생성한다.

화학식 (g)의 화합물은 화학식 (f)의 화합물로부터 산화 방법에 의해 합성될 수 있다. 많은 산화 조건은 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있고, 예를 들면 ["Handbook of Reagents for Organic Synthesis - Oxidising and Reducing Agents" edited by S.D. Burke and R. L. Danheiser]에 개시되어 있다. 예를 들면 선택적으로 물로 습윤된 화학식 (f)의 화합물은 포름산으로 처리된 후, 과산화수소를 느리게 첨가하여 처리될 수 있고, 이동안 실온에서 약 15시간동안 교반하여 화학식 (g)의 화합물을 생성한다. 다르게는, 옥손은 아세트산과 같은 극성 용매중에서 이용될 수 있고, 반응이 칼륨 아세테이트의 존재하에서 수행되면, 화학식 (g)의 화합물의 칼륨 염이 생성된다.

화학식 (g)의 화합물은 적합한 용매중의 적합한 황 친핵체, 예를 들면 황화나트륨으로 처리되면 화학식 (e)의 화합물로부터 직접 합성될 수 있는 것으로 생각된다. 유사하게, 화학식 (g)의 화합물은 황화나트륨을 이용한 친핵성 치환시 화학식 (d)의 화합물로부터 합성될 수 있다.

화학식 (g)의 설폰산을 극성 공용매, 예를 들면 N,N-다이메틸포름아미드와 함께 비양성자성 극성 용매, 예를 들면 메틸렌 클로라이드 중의 염소화제, 예를 들면 티오닐 클로라이드로 환류 처리하여 염소화된 화합물을 수득한다. 그런 다음, 염소화된 화합물을 비양성자성 무수 용매, 예를 들면 테트라하이드로푸란 중에서 순수한 기체 형태, 또는 비양성자성 무수 용매, 예를 들면 테트라하이드로푸란에 용해된 적합한 아민과 실온에서 반응시켜 화학식 (h)의 화합물을 생성한다. 선택적으로, 무수성 약염기, 예를 들면 트라이에틸아민을 이용하여 반응에서 생성된 염산을 제거할 수 있다.

본 발명의 화학식 I의 화합물은 당 분야의 숙련자들에게 공지된 탈보호 방법에 의해 Pg가 적합한 보호기인 화학식 (h)의 화합물로부터 제조될 수 있다. 예를 들면 보호기(Pg)가 토실인 경우, 적합한 탈보호 조건은 실온에서 여러 시간동안 양성자성 용매, 예를 들면 메탄올 또는 아이소프로판올 및 선택적으로 혼화성 조용매, 예를 들면 테트라하이드로푸란 및 물 중의 염기, 예를 들면 수산화리튬 또는 수산화칼륨과 반응시켜 화학식 I의 탈보호된 아민을 생성하는 것을 포함한다.

화학식 I의 화합물의 염은 양성자성 용매, 예를 들면 부탄올 및 선택적으로 물과 같은 조용매의 존재하에서 화학식 I의 화합물의 유리 염기를 적합한 산, 예를 들면 말레산과 반응시킴으로써 형성될 수 있다.

다르게는, 본 발명의 화합물은 하기 반응식 II에 따라 제조될 수 있다:

[반응식 II]

반응식 II에서, 4-메틸-7-[(4-메틸페닐)설폰일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (j)은 당분야에서 공지된 방법을 이용하여 토실 클로라이드와 같은 보호기를 이용하여 상업적으로 이용가능한 화학식 (a)로부터 수득될 수 있다. 트랜스-4-(메틸아미노)-사이클로헥실]메탄올 (b)은 0 내지 110℃의 온도에서 여러 시간동안 톨루엔과 같은 무수 용매중의 환원제, 예를 들면 비트라이드(Vitride)와 반응시, 상응하는 카복실산인, 트랜스-4-[(tert-부톡시카본일)아미노]사이클로헥산카복실산으로부터 수득될 수 있다.

반응식 II에 도시된 바와 같이, 화학식 (k)의 화합물은 60 ℃ 이하의 승온에서 몇시간동안 트라이에틸아미노와 같은 적합한 용매 및 촉매양의 요드화칼륨의 존재하에서 아세톤과 같은 적합한 용매 중에서 4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (j)의 트랜스-4-(메틸아미노)- 사이클로헥실]메탄올 (b)과의 반응에 의해 합성될 수 있다.

화학식 (k)의 화합물은 60 ℃ 이하의 승온에서 아세톤과 같은 적합한 용매중의 적합한 염기, 예를 들면 트라이에틸아민 또는 다이에틸아이소프로필아민의 존재하에서 적합한 메실화제, 예를 들면 메실 클로라이드를 첨가함으로써 화학식 (k)의 메탄설폰일 화합물을 생성함으로써 제조될 수 있다.

화학식 (l)의 화합물은 적합한 친핵체를 이용하여 화학식 (k)의 화합물로부터 단순한 S-알킬화 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 따라서, 화학식 (k)의 화합물은 90 ℃ 이하의 승온에서 아이소프로필알콜 또는 물 또는 톨루엔과 같은 용매중의 나트륨 설파이드와 4시간동안 처리하여 화학식 (l)의 화합물을 수득함으로써 제조될 수 있다.

0 내지 40 ℃의 온도에서 N,N-다이메틸포름아미드와 같은 극성 조용매와 함께 비양성자성 극성 용매, 예를 들면 THF 또는 메틸렌 클로라이드 중에서 화학식 (l)의 설폰산을 염소화제, 예를 들면 티오닐 클로라이드로 처리하면 염소화된 화합물이 생성된다. 그런 다음, 실온에서 염소화된 화합물을 테트라하이드로푸란과 같은 비양성자성 무수 용매중에서 바람직하게는 순수한 기체 형태 또는 비양성자성 무수 용매, 예를 들면 테트라하이드로푸란에 용해된 형태의 적합한 아민, 예를 들면 메틸 아민, 사이클로부틸 아민 또는 2-하이드록시아제티딘과 반응시켜 화학식 (h)의 화합물을 생성한다. 선택적으로, 무수 약염기, 예를 들면 트라이에틸아민을 이용하여 반응에서 생성된 염산을 제거할 수 있다.

실시예

제조예 1: N-메틸-1-[트랜스-4-(메틸{7-[(4-메틸페닐)설폰일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}아미노)사이클로헥실]메탄설폰아미드

방법 (a) 테트라하이드로푸란 (1.0 l) 중의 제조예 2의 화합물 (308.0 g 습윤 중량, 214.5 g 건조 중량, 0.41 mol)의 용액에 메틸아민 (테트라하이드로푸란 중의 2M, 687 ml)을 1시간동안 첨가하였다. 실온에서 30분동안 교반한 후, 추가의 메틸아민 (테트라하이드로푸란 중의 2M, 53 ml)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 18시간동안 교반하였다. 혼합물을 진공 증류를 통해 600 ml의 체적으로 감소시키고, 테트라하이드로푸란 (300 ml)을 첨가한 후, 혼합물을 다시 약 750 ml의 체적으로 감소시켰다. 45 ℃에서 가열된 혼합물에 2-프로판올 (247 ml) 및 물 (693 ml)을 첨가하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 고형 물질을 여과에 의해 수집하고, 물 (2 x 250 ml)로 세척하고, 65 ℃에서 진공 하에서 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다 (180.4 g).

¹H-NMR (d ₆-DMSO): 1.17 - 1.32 (2H), 1.57 - 1.73 (4H), 1.76 - 1.92 (1H), 1.93 - 2.08 (2H), 2.30 - 2.39 (3H), 2.53 - 2.62 (3H), 2.87 - 2.98 (2H), 3.07 - 3.17 (3H), 4.53 - 4.75 (1H), 6.81 - 6.94 (1H), 7.38 - 7.47 (2H), 7.56 - 7.65 (1H), 7.92 - 8.02 (2H), 8.15 - 8.27 (1H).

방법 (b) 0 내지 5 ℃에서, THF (1.65 l) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (5.0 ml) 중의 제조예 2의 화합물 (165 g, 0.34 mol)의 용액에 25분동안 티오닐 클로라이드 (125 ml, 17 mol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0 내지 5 ℃에서 30분동안 교반한 후, 8시간동안 40 ℃로 서서히 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 용매를 감압 하에서 증발시키고, THF와 함께 공비하여 티오닐 클로라이드를 제거하였다. 수득된 설포닐 클로라이드에 신선한 THF (1.65 l)를 첨가하고, 혼합물을 0 ℃로 냉각하였다. 무수 N-메틸아민 기체를 30분동안 퍼징하고, 반응물을 실온에서 추가 4시간동안 교반하였다. 용매를 그의 체적의 절반 (800 ml)까지 증발시키고, 헵탄 (1.5 l)을 첨가하였다. 생성물이 침전되고, 여과하고, 물 (1 l)로 세척하여, 표제 화합물을 수득하였다 (80 g).

¹H-NMR (d ₆-DMSO): 1.17 - 1.32 (2H), 1.57 - 1.73 (4H), 1.76 - 1.92 (1H), 1.93 - 2.08 (2H), 2.30 - 2.39 (3H), 2.53 - 2.62 (3H), 2.87 - 2.98 (2H), 3.07 - 3.17 (3H), 4.53 - 4.75 (1H), 6.81 - 6.94 (1H), 7.38 - 7.47 (2H), 7.56 - 7.65 (1H), 7.92 - 8.02 (2H), 8.15 - 8.27 (1H)

제조예 2: [트랜스-4-(메틸{7-[(4-메틸페닐)설폰일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}아미노)사이클로헥실]메탄설폰일 클로라이드

다이클로로메탄 (1.2 l) 및 N,N-다이메틸포름아미드 (4.1 ml) 중의 제조예 3의 화합물 (210.0 g, 0.42 mol)의 용액에 티오닐 클로라이드(151.0 ml, 2.1 mol)를 25분동안 첨가하였다. 반응 혼합물을 18 시간동안 환류 가열한 후, 진공 증류를 통해 800 ml의 체적으로 감소시켰다. 약 30 ℃에서 가열된 혼합물에, 에틸 아세테이트 (1.1 l)를 1시간동안 첨가한 후, 헵탄 (546 ml)을 실온에서 20분동안 첨가하였다. 혼합물을 0 ℃까지 냉각시키고, 1시간동안 교반하고, 생성된 침전물을 질소 하에서의 여과에 의해 수집하였다. 고형물을 헵탄 (2 x 125 ml)으로 세척하여, 표제 화합물 (308.0 g 습윤 중량)을 수득하고, 이를 질소 하에서 저장하고 직접 이용하였다.

제조예 3: [트랜스-4-(메틸{7-[(4-메틸페닐)설폰일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}아미노)사이클로헥실]메탄설폰산

방법 (a) 제조예 4의 화합물 (100.0 g 습윤 중량, 23.5 g 건조 중량, 47.8 mmol)과 포름산 (82.0 g, 68.0 ml, 1.8 mol)의 혼합물에 과산화수소 (물 중 35 wt.%, 21.0 ml, 0.26mol)를 10분간 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15 시간동안 교반한 후, 수성 나트륨 메타바이설페이트 또는 메타바이설파이트 용액 (33 wt.%, 35 ml)에 첨가하였다. 혼합물에 물 (5 ml), 2-프로판올 (50 ml) 및 수성 수산화나트륨 용액 (33 wt.%, 161 ml)을 첨가하고, 슬러리를 실온에서 1시간동안 교반하였다. 고형 물질을 여과에 의해 수집하고, 물 (100 ml)로 세척하고, 60 ℃에서 진공 하에서 건조시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (26.0 g).

¹H-NMR (d ₆-DMSO): 0.98 - 1.18 (2H), 1.55 - 1.76 (5H), 1.99 - 2.13 (2H), 2.29 - 2.39 (5H), 3.05 - 3.15 (3H), 4.47 - 4.76 (1H), 6.77 - 6.92 (1H), 7.38 - 7.48 (2H), 7.54 - 7.62 (1H), 7.91 - 8.02 (2H), 8.17 - 8.25 (1H)

방법 (b) IPA-물 (585 ml 각각, 1:1, V/V) 중의 제조예 3의 화합물의 용액에 황산 나트륨을 첨가하고, 혼합물을 80 내지 90 ℃로 24시간동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 용매를 50%까지 증발시키고, 아세트산을 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 3 내지 4의 범위로 조절하였다. 톨루엔 (1 l)을 첨가하고, 혼합물을 80%까지 증발시켰다. 추가의 톨루엔 (1 l)을 첨가하고, 혼합물을 4시간동안 환류하였다. 톨루엔을 따라내고 생성된 표제 화합물을 진공 하에서 건조시켜 수득하였다 (168 g).

제조예 4: S-{[트랜스-4-(메틸{7-[(4-메틸페닐)설폰일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}아미노)사이클로헥실]메틸}에탄티오에이트

다이메틸 설폭사이드 (30 ml) 중의 칼륨 티오아세테이트 (11.4 g, 99.4 mmol)의 용액에 다이메틸 설폭사이드 (130 ml) 중의 제조예 5 (50.0 g, 87.9 mmol)의 화합물을 첨가하였다. 반응 혼합물을 55℃에서 3시간동안 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 수성 탄산수소나트륨 용액 (0.1M, 640 ml)을 첨가하여 급냉시켰다. 혼합물을 13 ℃로 냉각시키고, 생성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 물 (250 ml)로 세척하여, 표제 화합물을 수득하였다 (204.0 g 습윤 중량).

¹H-NMR (d ₆-DMSO): 1.06 - 1.23 (2H), 1.39 - 1.51 (1H), 1.51 - 1.70 (4H), 1.74 - 1.88 (2H), 2.30 - 2.40 (6H), 2.73 - 2.84 (2H), 3.06 - 3.14 (3H), 4.44 - 4.76 (1H), 6.76 - 6.94 (1H), 7.36 - 7.49 (2H), 7.56 - 7.62 (1H), 7.90 - 8.02 (2H), 8.17 - 8.26 (1H)

제조예 5: [트랜스-4-(메틸{7-[(4-메틸페닐)설폰일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}아미노)사이클로헥실]메틸 4-메틸벤젠설폰에이트

다이클로로메탄 (1 l) 중의 제조예 6의 화합물 (42.0 g, 0.16 mol)의 용액에 트라이에틸아민 (68.3 g, 0.68 mol) 및 4-다이메틸아미노피리딘 (1.0 g, 8.2 mmol)을 첨가한 후, p-톨루엔설폰일 클로라이드(62 g, 0.33 mol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반한 후, 추가의 p-톨루엔설폰일 클로라이드(45.5 g, 0.24 mol)를 첨가하였다. 18시간동안 교반한 후, 혼합물을 진공 하에서 농축하고, 잔사의 일부(약 309 g)를 15분동안 메탄올 (758 ml)에 슬러리화시켰다. 슬러리에 물 (600 ml) 및 포화 수성 탄산수소나트륨 (142 ml)을 첨가하고, 혼합물을 1시간동안 교반하였다. 고형 물질을 여과에 의해 수집하고, 메탄올 : 물 [1:1, 50 ml], 물 (50 ml) 및 헥산 (50 ml)으로 세척하였다. 고형물을 진공하에서 60 ℃에서 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다 (87.1 g).

¹H-NMR (d ₆-DMSO): 1.02 - 1.20 (2H), 1.53 - 1.75 (7H), 2.31 - 2.39 (3H), 2.39 - 2.47 (3H), 3.04 - 3.12 (3H), 3.80 - 3.91 (2H), 4.34 - 4.76 (1H), 6.78 - 6.93 (1H), 7.37 - 7.54 (4H), 7.54 - 7.64 (1H), 7.75 - 7.84 (2H), 7.91 - 8.01 (2H), 8.14 - 8.25 (1H)

제조예 6: {트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}-메탄올

물 (1 l) 및 1,4-다이옥산 (100 ml) 중의 트랜스-4-(메틸아미노)사이클로헥실]메탄올 (제WO 2002/14267호에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다)(50.0 g, 0.35 mol), 4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (상업적으로 이용가능함, 42.9 g, 0.27 mol) 및 탄산칼륨 (57.3 g, 0.42 mol)의 혼합물을 90 ℃에서 15시간동안 가열하였다. 혼합물에 제조예 7의 화합물 (2.0 g, 14.0 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 90 ℃에서 추가 1시간동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 1시간동안 교반하고, 고형 물질을 여과하여 수집하고, 물 (150 ml)로 세척하고, 65 ℃에서 진공 하에서 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다 (72.7 g).

¹H-NMR (d₆-DMSO): 1.00 - 1.19 (2H), 1.30 - 1.45 (1H), 1.52 - 1.77 (4H), 1.77 - 1.91 (2H), 3.09 - 3.20 (3H), 3.20 - 3.29 (2H), 4.37 - 4.51 (1H), 6.45 - 6.57 (1H), 7.06 - 7.17 (1H), 8.01 - 8.14 (1H)

제조예 7: [트랜스-4-(메틸{7-[(4-메틸페닐)설폰일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}아미노)사이클로헥실]메탄설피네이트

아세톤 (600 ml) 중의 제조예 4의 화합물 (60.0 g, 0.418 mol)의 용액에 트라이에틸아민 (117.5 ml, 0.837 mol) 및 촉매양의 칼륨 요다이드 (3.4 g, 0.05 mol)를 첨가한 후, 4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (상업적으로 이용가능함, 102.8 g, 0.335 mol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 22시간동안 60 ℃로 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 아세톤 (300 ml)을 첨가한 후, 트라이에틸아민 (146.9 ml, 1.04 mol), 그런 다음 메실 클로라이드(81.7 ml, 1.047 mol)를 첨가하였다. 실온에서 4시간동안 교반한 후, 물 (1.8 l)을 첨가하고, 이때 생성물이 침전되었다. 생성물을 여과하고, 건조시키고, MTBE-헵탄 (6:4, 600 ml)의 혼합물로 저작하였다. MTBE-헵탄으로부터의 두번째 저작을 수행하고, 생성된 표제 화합물을 수득하였다 (120g).

¹H-NMR (d ₆-DMSO):

제조예 8: [트랜스-4-(메틸아미노)사이클로헥실]메탄올

1시간동안 비트라이드 용액 (65%, 767 ml, 2.465 mol)을 톨루엔 (1 l) 중의 트랜스-4-[(tert-부톡시카본일)아미노]사이클로헥산카복실산 (상업적으로 이용가능함, 100 g, 0.4109 mol)의 용액에 적가하였다. 첨가가 완료된 후, 반응 혼합물을 100 내지 110 ℃에서 환류 가열하였다. 반응 혼합물을 10 ℃ 미만의 온도에서 수성 황산 나트륨 용액 (800 ml)으로 급냉시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여과 압분체를 DCM (500 ml)으로 세척한 후, 물 (100 ml)로 세척하였다. 유기 층을 분리시키고, 수성 층을 DCM (600 ml, 그런 다음 400 ml)으로 2회 추출하였다. 조합된 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공에서 농축하여 표제 화합물을 수득하였다 (62 g).

¹H-NMR (CD₃OD): 1.08 - 1.31 (4H), 1.51 - 1.64 (1H), 1.93 - 2.05 (2H), 2.10 - 2.22 (2H), 2.38 - 2.50 (1H), 2.50 - 2.54 (3H), 3.48 - 3.55 (2H)

실시예 1a: N-메틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}메탄설폰아미드의 제조.

2-프로판올 (1.2 l) 중의 제조예 1의 화합물 (250.0 g, 0.48 mol)의 용액에 물 (1.2 l) 중의 수산화리튬 (48.7 g, 2.03 mol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40 ℃에서 8시간동안 가열한 후, 실온에서 18시간동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 2-프로판올:물 (1:1, 100 ml)을 통해 세척하고, 염산 (6N)을 첨가하여 여과액을 pH 7.5로 조절하였다. 1시간동안 교반한 후, 고형 물질을 여과에 의해 수집하고, 2-프로판올:물 (1:2, 240 ml)로 세척하고, 60 ℃에서 진공 하에서 건조시켜 표제 화합물을 유리 염기(실시예 1a)로서 수득하였다 (148.7 g).

¹H-NMR (d ₆-DMSO): 1.20 - 1.39 (2H), 1.62 - 1.75 (4H), 1.77 - 1.91 (1H), 1.97 - 2.11 (2H), 2.54 - 2.63 (3H), 2.89 - 2.99 (2H), 3.10 - 3.21 (3H), 4.44 - 4.86 (1H), 6.43 - 6.61 (1H), 7.01 - 7.19 (1H), 7.94 - 8.16 (1H)

실시예 1b: N-메틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}메탄설폰아미드 말레산 염의 제조

1-부탄올 (3200 ml) 및 물 (400 ml) 중의 실시예 1a의 화합물 (212.0 g, 628.3 mmol) 및 말레산 (67.2 g, 579.0 mmol)의 혼합물을 실온에서 18시간동안 교반하였다. 혼합물을 진공 증류 (55 ℃, 100 mbar)를 통해 1600 ml의 체적으로 감소시킨 후, 0 ℃로 냉각시켰다. 생성된 고형물을 여과에 의해 수집하고, 헵탄 (500 ml)으로 세척하고, 진공에서 35 ℃에서 건조시켜 N-메틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]-사이클로헥실}메탄설폰아미드의 말리에이트 염 (253.0 g)을 형태 A로서 공지된 결정 형태로서 수득하였다.

실험적 MH⁺: 338.2; 예측치: 338.2.

¹H-NMR (d ₆-DMSO): 1.24 - 1.38 (2H), 1.68 - 1.92 (5H), 2.00 - 2.11 (2H), 2.56 - 2.61 (3H), 2.91 - 3.00 (2H), 3.15 - 3.27 (3H), 4.39 - 4.70 (1H), 6.53 - 6.73 (1H), 7.16 - 7.36 (1H), 8.07 - 8.29 (1H).

실시예 1c: N-메틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}-메탄설폰아미드 말레산 염 (형태 A)의 분말 X-선 회절의 수집 방법

N-메틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}-메탄설폰아미드 말레산 염, 형태 A에 대한 분말 X-선 회절 패턴을 자동 시료 교환기, θ-θ각도계, 자동 빔 발산 슬릿 및 PSD 반텍(Vantec)-1 검출기가 부착된 브루커(Bruker)-AXS Ltd의 D4 분광 X-선 회절계를 이용하여 수집하였다. 낮은 바탕값 공동 실리콘 웨이퍼 시료 마운트 상에 탑재함으로써 시료를 분석에 대해 준비시켰다. 구리 K-알파₁ X-선 (파장 = 1.5406 Å)으로 조사하는 동안 시료를 회전시켰고, X-선 튜브를 40kV/35mA에서 조작하였다. 2°내지 55°의 2θ 범위에 걸쳐 0.018°단계 당 0.2초 계수에 대한 연속적 방식으로 각도계를 구동시켜 분석을 수행하였다. 결과를 표 1 및 2에서 요약하였다.

당 분야의 숙련자들에게 이미 명확한 바와 같이, 심지어 동일한 롯트의 재료에서 수행되는 경우에조차 X-선 분말 회절의 결과는 다양할 수 있고, 후속적인 XRPD가 동일하지 않을 것이다. 이 편차는 시험 시료 제조, 온도, 사용된 X-선 회절계의 특정 모델, 조작자의 기술 등에 기인한 것일 수 있다. 용어 "약"은 X-선 분말 회절 패턴에서의 피크를 한정하는데 이용된 경우 언급된 2θ값 ±0.2°2θ로서 정의된다. 결정 형태가 형태 A 다형성인지 그리고 청구범위에 포함되는지에 대한 임의의 측정은 이 시험에서의 변이성의 측면에서 이해되어야만 한다.

이 변이성은 도 1에 입증되어 있다. N-메틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}-메탄설폰아미드 말레산 염 형태 A의 2가지의 서로 다른 롯트가 동일한 XRPD 회절계에 제출되었다. 도 1의 특징적인 피크는 이것이 형태 A 다형성임을 확인한다. 그러나, 이들 피크의 상대 강도 및 다른 확인 피크는 약간 달라진다.

실시예 2: N-사이클로부틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}메탄설폰아미드의 제조

하기 실시예 1의 일반적인 방법에 따라 비-결정적인 변형을 가하고, 전구체를 사이클로부탄아민으로 대체하여 표제 화합물을 수득하였다.

실험적 MH⁺: 378.0; 예상값: 378.2

¹H-NMR (d ₆-DMSO): 1.22 - 1.32 (2H), 1.47 - 1.70 (6H), 1.78 - 2.04 (5H), 2.16 - 2.24 (2H), 2.85 - 2.86 (2H), 3.15 (3H). 3.68 - 3.78 (1H), 4.60 - 4.72 (1H), 6.51 - 6.54 (1H), 7.11 - 7.12 (1H), 7.44 - 7.49 (1H), 8.08 (1H), 11.60 (1H)

실시예 3: N-에틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}메탄설폰아미드의 제조

하기 실시예 1의 일반적인 방법에 따라 비-결정적인 변형을 가하고, 전구체를 에탄아민으로 대체하여 표제 화합물을 수득하였다.

실험적 MH⁺: 352.0; 예상값 352.2

¹H-NMR (CDCl₃): 1.24 - 1.44 (5H), 1.64 - 1.74 (2H), 1.87 - 2.09 (3H), 2.15 - 2.21 (2H), 2.97 - 2.99 (2H), 3.18 - 3.27 (5H), 4.46 - 4.52 (1H), 4.74 - 4.86 (1H), 6.55 (1H), 7.04 (1H), 8.28 (1H)

실시예 4: JAK 효소 분석

재료: 재조합 JAK-2 (카탈로그 번호 PV4210) 및 JAK-3 (카탈로그 번호 PV3855)을 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation: 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에서 구입하였다. 이 연구에 이용된 재조합 JAK-1 (GST-JAK-1 (852-1142)) 및 Tyk-2 (GST-Tyk2 (870-1187, C1187S))는 화이자 실험실에서 발현되고 정제되었다. 아데노신 5'-트라이포스페이트 (ATP)를 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Company: 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)에서 구입하였다. JAKtide 펩타이드 (펩타이드 서열, FITC-KGGEEEEYFELVKK (서열 번호:1))를 JAK-2 및 JAK-3 분석에 이용하고, IRS-1 펩타이드 (펩타이드 서열, 5-FAM-KKSRGDYMTMQIG (서열 번호:2))을 JAK-1 분석에 이용하고, Tyk-2 분석을 어메리칸 펩타이드 캄파니 (American Peptide Company: 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)에서 구입하였다. 코팅 시약 3을 캘리퍼 라이프 사이언시즈 (Caliper Life Sciences; 미국 매사추세츠주 홉킨톤 소재)에서 구입하였다.

방법: JAKtide (JAK-2 및 JAK-3) 또는 IRS-1 펩타이드 (JAK-1 및 Tyk-2)의 인산화를 정량화하기 위해 펩타이드 이동성 시프트 분석법을 이용하였다. 10 마이크로리터의 총 체적으로 384-웰 플레이트 (매트리칼(Matrical) MP-101)에서 반응을 수행하였다. 반응 혼합물은 20 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM 마그네슘 클로라이드, 0.01% 소의 혈청 알부민 (BSA), 0.0005% 트윈-20, ATP (JAK-2 및 JAK-3의 경우 4 μM, JAK-1의 경우 40μM, Tyk-2의 경우 7μM), 2% DMSO 및 1 μM의 펩타이드 기질 (JAK-2 및 JAK-3의 경우 JAKtide, 또는 JAK-1 및 Tyk-2의 경우 IRS-1 펩타이드)를 함유하였다. 화합물을 100% 다이메틸 설폭사이드에 연속 희석하고 이중 또는 사중으로 11점 투여 반응으로 시험하였다 (10 ㎕의 반응물 당 200 nl의 화합물/DMSO를 첨가하였다). 2 nM의 JAK-2, 1 nM의 JAK-3, 7 nM의 Tyk2 또는 20 nM의 JAK-1의 최종 농도로 효소를 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 분석법은 JAK-1의 경우 240분, JAK-2의 경우 150분, JAK-3의 경우 90분 및 Tyk-2의 경우 60분간 수행하였다. 20 ㎕의 140 mM HEPES, 22.5 mM EDTA 및 0.15% 코팅 시약(Coating Reagent) 3을 이용하여 특정 시간에 분석을 중단하였다. 플레이트를 랩칩(LabChip) 3000 (LC3000) 장치 (캘리퍼 라이프 사이언시즈(Caliper Life Sciences))에 놓고 인산화된 펩타이드의 형성을 측정하였다. 캘리퍼 라이프 사이언시즈의 힛츠 웰 애널라이저 소프트웨어(Hits Well Analyzer Software)를 이용하여 자료를 분석하여 형성된 생성물의 양을 수득하였다.

그런 다음, 자료를 각각의 자료 점이 억제되지 않고 효소가 없는 대조군을 기준으로 억제율%로서 표현되는 내부 적용으로 들여왔다. 그런 다음, 투여량-반응 자료를 4변수 로지스틱 식(수학식 1)을 이용하여 부합시켜 IC₅₀ 값을 측정하였다.

[수학식 1]

이때 최대는 부합된 억제되지 않은 값이고,

최소는 부합된 완전 억제 값이고,

s는 기울기 인자이다.

이 프로토콜을 이용하여 실시예 1 및 2의 표제 화합물에 대해 다음의 결과를 생성하였다.

실시예 5: 개의 시험관내 T-세포 증식 분석

T-세포 활성화는 다양한 염증성 질환 및 자가면역 질환, 및 천식, 알레르기 및 소양증에서 중요한 역할을 한다. T-세포 활성화가 부분적으로 JAK-STAT 경로를 통하여 신호전달되는 사이토카인에 의해 야기될 수 있기 때문에, JAK 억제제는 이상 T-세포 활성화가 관련된 이런 질병에 대해 효과적일 수 있다.

방법: 29마리의 비글 개 및 23마리의 혼혈견에서 얻은 개의 전혈을 나트륨 헤파린 튜브에 수집하였다. 비히클 대조군 또는 시험 화합물 (0.001 내지 10 μM), 콘카나발린(concanavalin) A (ConA; 1 μg/ml, 시그마(Sigma) C5275), 및 개의 인터루킨-2 (IL-2; 50 ng/ml, R&D 시스템스(Systems) 1815-CL/CF)를 함유하는 180 ㎕의 배지 (1%의 열 불활성화된 우태 혈장, 깁코 #10082-39, 292 ㎍/ml L-글루타민, 깁코 #250030-081, 100 u/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신, 깁코 #15140-122를 갖는 RPMI 1640, 깁코(Gibco) #21870-076)가 있는 96웰 플레이트(코스타(Costar) 3598)에 전혈(20 ㎕)을 도말하였다. 전혈, 비히클 대조군을 함유하고, ConA 또는 IL-2가 없는 웰을 바탕값 대조군으로서 이용하였다. 플레이트를 37℃에서 48시간동안 항온처리하였다. 삼중수소 티미딘, 0.4 μCi/웰 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), Net027A-005MC)을 추가 20시간동안 첨가하였다. 플레이트를 동결한 후 해동하고, 세척하고, 브랜델(Brandel) MLR-96 세포 수확기 및 예비습윤 매트 (왈락(Wallac) 1205-401, 퍼킨 엘머)를 이용하여 여과하였다. 필터를 60 ℃에서 1시간동안 건조 (프레시즌(Precision) 16EG 대류식 오븐)시키고, 10 mL의 섬광제 (왈락 1205-440, 퍼킨 엘머)가 있는 필터 시료 백 (왈락 1205-411, 퍼킨 엘머)에 두었다. 밀봉된 필터를 LKB 왈락 1205 베타플레이트 액체 섬광 계수기 상에서 계수하였다. 자료를 지텀 베타플레이트 (Gterm Betaplate) 프로그램 v1.1 (왈락 판권 1989-1990)을 통해 수집하고, 하기 수학식을 이용하여 계산되는 억제율%로 전환시켰다.

그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) 4.0을 이용하여 자료를 억제율%로서 그래프로 나타내고, IC₅₀ 곡선을 점 대 점 분석을 이용하여 부합시켰다.

결과: 비글에서 나온 전혈을 이용하여 수득된 평균 IC₅₀ 값은 실시예 1a의 화합물의 경우 66.3 nM, 실시예 2의 화합물의 경우 410 nM, 및 실시예 3의 화합물의 경우 83 nM이다. 혼혈견에서 나온 전혈을 이용하여 수득된 평균 IC₅₀ 값은 실시예 1a의 화합물의 경우 138 nM였다. 이들 자료는 본 발명의 화합물이 많은 질병에서 주요한 특징인 T-세포 증식을 억제하는데 효과적임을 제안한다.

실시예 6: 벼룩과 관련된 소양증 및 피부염 감소 분석법

벼룩과 관련된 소양증 및 피부염은 개에서 흔한 피부 질환이다. 소양증은 벼룩과 관련된 피부염의 가장 심한 임상 증후중 하나이고, 지속적인 긁음, 얼굴 문지름 및 발 씹기는 홍반, 부종, 탈모증, 태선화 및 과다착색과 같은 다양한 피부 변화를 야기할 수 있다. 벼룩과 관련된 소양증 및 피부염은 실험적으로 유도될 수 있다. 이들 모델에서, 염증 세포 및 사이토카인은 알레르겐에 대한 면역 반응을 매개하는 것으로 나타났다. 따라서, 소양증원인성 사이토카인 및 친염증성 사이토카인 수용체의 신호 전달을 억제하는 JAK 억제제가 벼룩과 관련된 소양증 및 피부병을 억제, 감소 또는 최소화하는데 효과적일 수 있다.

연구 디자인

체중이 5 내지 35 kg의 범위이고 1살 이상인 28마리의 수컷 및 암컷 혼혈견에게 투여를 시작하기 14일 전에 약 100마리의 공복인 개 벼룩 성충(크테노세팔리데스 펠리스(Ctenocephalides felis))을 풀어놓고, 연구 기간 내내 4일마다 30마리의 벼룩을 다시 풀어놓았다. 투여하기 7일 전에, 24마리의 개를 피부 병변에 대한 시각적 아날로그 지수(VAS) 점수에 근거하여, 위약, 0.5 mg/kg 또는 0.25 mg/kg의 화학식 Ib의 화합물의 3가지의 서로 다른 처리군으로 무작위 분류하였다. 처리군에게는 28일동안 매일 2회 투여하였고, 소양증 행동 및 홍반 및 피부 병변을 연구 기간동안 평가하였다. 개를 비디오 기록 장치가 있는 축사에 넣고 이들의 행동을 4시간동안 기록함으로써 소양증 행동을 기록하였다. 개가 긁는데 소비하는 시간(초)을 측정함으로써 소양증 행동을 정량화하였다. 복부, 사타구니 영역을 찍은 영상에 의해 피부 병변을 기록하고, 시각적 아날로그 지수(VAS)에 따라 심각성의 등급을 매겼다.

통계적 분석

소양증 행동이 비디오에 잡힌 경과 시간은 반복된 측정에 대한 혼합 선형 모델을 이용하여 분석되었다. 이 모델은 처리 및 연구일의 고정된 효과, 및 처리와 연구일 사이의 상호작용을 포함한다. 무작위 효과는 블록, 블록과 처리의 상호작용 및 오차를 포함한다. 소양증 행동에 대한 기저선 자료(제 -1일)를 소양증 행동의 분석에서 공변량으로 이용하였다. 최소 제곱 평균을 처리 수단의 견적으로 이용하였다. 최소 제곱의 표준 오차를 평가하고, 90% 신뢰도 구간을 구축하였다. 로그-전환된 자료에 대한 최소 제곱 평균으로부터 기하 평균을 계산하였다. 선험적 대조를 이용하여 처리군을 평가하였다. 처리군의 차이를 10% 유의성 수준에서 평가하였다 (P ≤0.10).

결과

처리 결과를 도 2 및 도 3에 나타낸다. 부종 및 홍반은 0.5 mg/kg 군에서는 유의하게 감소되었다. 도 2는 벼룩 알레르기 개에서 실시예 1b에 대한 제 27 일의 VAS 점수를 나타낸다(최소 제곱 평균). 양쪽 군 모두에 대한 연구동안 다양한 시점에서 10% 유의성 수준에서 위약에 비해 소양증의 유의한 감소가 나타났다(0.25 mg/kg 투여량의 경우 제1일, 제4일 및 제12일, 0.5 mg/kg 투여의 경우 제1일 및 제20일). 도 3은 벼룩 알레르기 개에서 실시예 1b에 대한 4시간의 기록당 소양증 시간(초)을 나타낸다(긴 기하 평균).

실시예 7: 세포 증식 억제 분석

고양이 세포주: MYA-1 및 FETJ는 ATCC(버지니아주 매나사스)에서 얻은 고양이 T-림프모세포 세포주이다. 이들 세포를 37 ℃에서 5% CO₂가 있는 가습 배양기 중에서 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 완전 배지에서 배양하였다.

생체 외 개 림프종 결절 조직

미시간 대학교(MSU)의 수의학대에서 수의학 스태프가 악성 림프 결절을 절제하여 이동 배지 (10% 우태 혈청 (FBS), 100U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 0.25 ㎍/mL 암포테신 B (인비트로겐/깁코(Invitrogen/Gibco))가 보충된 어드밴스드(Advanced RPMI) 1640 완전 배지)에 두었다. 절제된지 24시간 이내에 결절을 작은 조각으로 갈고 조직 체를 통과시킴으로서 처리하였다. 세포 현탁액을 200 x g에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 실온에서 10분동안 NH₄Cl에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 원심분리에 의해 펠렛으로 만들고; NH₄Cl을 제거하고, 행크스 밸런스드 솔트 용액(Hanks Balanced Salt Solution: HBSS)으로 세척한 후, 증식 배지 (어드밴스드 RPMI 완전 배지, 1% FBS, 50nM 2-머캅토에탄올, 100U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 0.25 ㎍/mL 암포테신 B)에 다시 현탁시켰다. 그런 다음, 세포 현탁액을 100㎛ 나일론 셀 여과기 (BD-팔콘(Falcon))에 통과시키고, 혈구계수기를 이용하여 계수하였다. 세포를 증식 배지 단독에서, 0.005% 판소빈(Pansorbin: 등록상표) (열불활성화된 포르말린-고정된 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus Aureus ) 세포 (SAC), 칼바이오켐(Calbiochem), 및 10 ng/mL 개의 IL-2 (R&D 시스템스))이 보충된 증식 배지에서, 또는 125 ng/mL 콘카발린 A (시그마) 및 125 ng/mL 리포폴리사카라이드 (LPS; 칼바이오켐)가 보충된 완전 배지에서 배양하였다.

시험관 내 항-증식 분석 방법

상기 개시된 배지에서 배양된 세포를 1 x 10³ 세포/웰 (고양이 세포주) 또는 2x10⁵ 세포/웰 (림프 결절 세포)의 밀도로 96-웰 코스타 플레이트(코닝)에 도말하고, 5% CO₂를 갖는 습식 배양기에서 37 ℃에서 다양한 농도의 시험 화합물에 5일까지 노출시켰다. 증식에 대한 효과를 제조자의 지시에 따라 셀타이터 (CellTiter) 96 AQ_ueous 비-방사활성 세포 증식 분석 (프로메가)을 이용하여 측정하였다. 일반적으로 증식은 가용성 테트라졸륨 염(MTS) 및 전자 커플링제를 이용하여 간접적으로 측정되었다. 조직 배양 배지에 용해된 포르마잔 생성물로의 MTS 생물변환을 소프트맥스 프로 (Softmax Pro) 4.6 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices))를 이용하여 스펙트라맥스 (Spectramax) 플레이트 판독기 상에서 490nM에서의 흡광에 의해 모니터링하였다. 자료를 그래프패드 프리즘 4.00을 이용하여 DMSO 대조군의 %로서 그래프로 나타내었으며, 비-선형 회귀 모델을 이용하여 IC₅₀ 곡선을 시그모이드 투여 반응에 부합시켰다.

결과

표 4는 화학식 1의 화합물이 증식을 위해 IL-2에 의존하는 고양이 림프모 세포주인 MYA-1의 증식은 억제시킬 수 있지만, IL-2 독립적 세포주(FETJ)는 억제할 수 없음을 입증한다. 화학식 IA의 화합물 또는 이의 염은 또한 T-세포 또는 B-세포 림프종으로 진단된 개에서 수득된 개의 결절 조직의 증식을 억제할 수 있다. 이들 결과는 JAK 억제제가 개와 고양이 림프종의 치료에 효과적일 수 있다고 제안한다.

종	세포주 또는 림프 결절	설명	배양 배지에서의 자극제	IC50(nM)
고양이	MYA-1	림프구 모세포주		122(n=2)
고양이	FETj	림프구 모세포주		>1000
개	MSU LN 8	드 노보(De novo) T-세포 림프종	LPS+ConA	357
개	MSU LN 8	드 노보 T-세포 림프종	SAC+IL-2	38
개	MSU LN 9	드 노보 B-세포 림프종	LPS+ConA	147
개	MSU LN 9	드 노보 B-세포 림프종	SAC+IL-2	100
개	MSU LN 10	화학치료 내성 B-세포 림프종	LPS+ConA	687
개	MSU LN 11	드 노보 B-세포 림프종	LPS+ConA	64

Claims

하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
화학식 I

상기 식에서,
R¹은 하이드록시로 선택적으로 치환된 C₁ _-4 알킬이다.
제 1 항에 있어서,
R¹이 메틸인 화합물.
제 1 항에 있어서,
R¹이 에틸 또는 사이클로부틸인 화합물.
제 1 항에 있어서,
N-메틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}메탄설폰아미드인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제 1 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 알레르기 반응, 알레르기성 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 소양증, 신경퇴화 질병, 각막결막염, 만성 호흡기 질환, 자가면역 질환, 염증성 대장 질환, 종양, 관절염 질환, 암, 백혈병, 루푸스 또는 다발성 골수종을 치료하기 위한 약학 조성물.
치료 효과량의 제 1 항에 따른 화합물을 이를 필요로 하는 인간을 제외한 포유동물에게 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 알레르기 반응, 알레르기성 피부염, 아토피성 피부염, 습진 또는 소양증을 치료하는 방법.
제 6 항에 있어서,
치료 효과량이 하루에 체중 1kg 당 0.01 mg 내지 100 mg인 방법.
제 6 항에 있어서,
치료 효과량이 하루에 체중 1kg 당 0.1 mg 내지 10 mg인 방법.
제 6 항에 있어서,
포유동물이 반려 동물을 포함하는 방법.
제 9 항에 있어서,
반려 동물이 개인 방법.
제 6 항에 있어서,
포유동물이 가축을 포함하는 방법.
제 6 항에 있어서,
제 1 항에 따른 화합물을 경구, 비경구 또는 국소 투여하는 방법.
치료 효과량의 제 1 항에 따른 화합물을 이를 필요로 하는 인간을 제외한 포유동물에게 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 신경퇴화 질병, 각막결막염, 만성 호흡기 질환, 자가면역 질환, 염증성 대장 질환, 종양 또는 관절염 질환을 치료하는 방법.
치료 효과량의 제 1 항에 따른 화합물을 이를 필요로 하는 인간을 제외한 포유동물에게 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 암, 백혈병, 루푸스 또는 다발성 골수종을 치료하는 방법.
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6.178, 8.519, 12.601, 13.819, 15.478, 15.719, 16.32, 17.997, 18.539, 20.298, 20.659, 21.583, 22.642, 23.08, 24.86, 25.602, 26.582, 27.02, 27.721, 28.161 및 28.38의 °2θ로 표현되는 특징적인 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴을 포함하는, N-메틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}메탄설폰아미드 말레산 염.
N-메틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}메탄설폰아미드를 말레산과 반응시킴을 포함하는, 제 18 항에 따른 N-메틸-1-{트랜스-4-[메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노]사이클로헥실}메탄설폰아미드 말레산 염의 제조 방법.