KR101111926B1 - 폴리에틸렌글리콜-폴리 양이온 블록 공중합체 - Google Patents

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Abstract

폴리 (에틸렌글리콜) 세그먼트와 특정한 아민 잔기 1 종 이상을 측쇄에 갖는 폴리 (아미노산 유도체) 세그먼트로 이루어지는 블록 공중합체가 제공된다. 이러한 공중합체와 폴리뉴클레오티드 등과의 폴리이온 착물도 제공된다. 이들 블록 공중합체는, DNA 를 비롯한 작용 물질의 생체 내 전달용 캐리어로서 유용하다.
폴리에틸렌글리콜-폴리 양이온 블록 공중합체

Description

폴리에틸렌글리콜-폴리 양이온 블록 공중합체{POLYETHYLENE GLYCOL/POLYCATION BLOCK COPOLYMER}
본 발명은, 친수성 세그먼트로서 폴리에틸렌글리콜 구조 부분과 양이온성 세그먼트로서 여러 가지 구조의 아민 잔기 측쇄를 가지는 폴리아미노산 구조 부분을 갖는 블록 공중합체, 그리고 그 공중합체와 핵산 또는 음이온성 단백질의 폴리이온 착물에 관한 것이다.
양이온성의 블록 공중합체인 폴리에틸렌글리콜-block-폴리(L-리신) 으로 대표되는 폴리에틸렌글리콜-폴리 양이온 블록 공중합체와 음이온성 고분자는, 수중에서 양자 간에 작용하는 정전 상호 작용을 구동력으로 하여 구형의 미셀을 자발적으로 형성한다. 이 입자는, 입경이 수십 나노미터로, 코어 (또는 내핵) 에 양이온과 음이온의 폴리이온 착물, 쉘 (또는 외각) 에 폴리에틸렌글리콜 (이하, PEG 라고도 한다) 층을 갖는 코어-쉘 구조를 가지고 있으며, 폴리이온 착물 (PIC) 미셀이라고 불리고 있다 (예를 들어, 비특허문헌 1 참조. 문헌명 등은 후술한다. 이하, 동일). 이렇게, PIC 미셀은 내핵에 음이온성의 고분자를 유지하는 것이 가능하고, 수십 나노미터라는 입경과 코어-쉘 구조에 의해 생체의 이물 인식 기구를 회피하는 것을 기대할 수 있기 때문에, 현재 천연 음이온성 고분자인 DNA 의 운 반체 (벡터) 로서의 응용이 검토되고 있다. 이와 같이 양이온 블록 공중합체를 사용한 유전자 벡터 개발의 우위성이 명백해져 있음에도 불구하고, 현재 검토되고 있는 양이온성의 블록 공중합체는 합성 상의 제한 등과 같은 이유에서 PEG-block-폴리(L-리신), PEG-block-폴리(디메틸아미노에틸메타크릴레이트) (예를 들어, 특허문헌 1 참조), PEG-block-폴리에틸렌이민에 그치고 있다.
일반적으로 이들 PIC 미셀은 생리적 조건 하에서 상당히 안정적이지만, 실제 사용에 있어서는, 정맥 주사에 의한 투여 후의 희석에 의해 PIC 미셀이 해리되거나, 혈청 단백질과 상호 작용하는 등, 생리 조건 하에서의 안정성이 충분하지 않은 경우도 존재한다. 이 때문에, 확실하게 목적 부위에 도달할 때까지 또는 도달한 후, 일정 기간 해리되지 않고 안정적으로 존재하도록 PIC 미셀의 성질을 개변할 필요가 있다. 이러한 PIC 미셀의 성질을 개변하는 수단으로서, 예를 들어, 상기 PEG-block-폴리(L-리신) 의 폴리(L-리신) 세그먼트에 있어서의 일정한 비율의 L-리신 단위의 아미노기에 메르캅토알킬기를 도입하고, 그 기 사이에 디술파이드 결합을 형성함으로써 PIC 미셀의 안정성을 향상시키는 것이 제안되어 있다 (예를 들어, 특허문헌 2 참조).
또한, 새로운 타입의 것으로, PEG-block-폴리(β-벤질아스파르테이트) 의 벤질을, 예를 들어 N,N-디메틸에틸렌디아민 등으로 에스테르-아미드 교환한 공중합체도 제안되어 있다 (예를 들어, 비특허문헌 2 참조).
폴리 양이온과 DNA 에 의해 형성되는 미셀에 있어서 폴리 양이온 블록이 하는 역할은 DNA 와의 정전 상호 작용부로서의 역할이 중심이지만, 그 이외의 기능도 부여하는 것도 원리적으로 가능하다. 그 기능의 하나로서, 프로톤 스폰지 효과가 있다. 프로톤 스폰지 효과란, 프로톤화도가 낮은 폴리아민이 엔도좀 내에 주입되었을 때에, V 형 ATPase 에 의해 엔도좀 내에 공급되는 수소 이온을 차례차례로 흡수하여 엔도좀 내의 pH 의 저하를 방해하고, 그 결과 엔도좀 내의 침투압의 상승에 수반되는 물의 침입에 의해 엔도좀이 팽창하여, 결과적으로 엔도좀의 파괴를 유발시키는 것을 말한다. 이 효과에 의해, DNA 의 세포질로의 이행이 촉진되어, 유전자 발현 효율의 상승이 기대된다. 이 효과는 버퍼능을 가지고 있는 양이온에 있어서 관찰되는 효과로서, 이를 위해서는 pKa 가 낮은 양이온을 사용할 필요가 있다.
한편에서, 유전자 발현 효율에는 PIC 미셀의 안정성이나 내포된 DNA 의 응축 상태 등도 영향을 미치는 것으로 생각되며, 이들 요인도 폴리 양이온의 성질에 의존하는 것으로 생각된다. 그러나, 전술한 바와 같이, 지금까지는 폴리 양이온의 종류가 한정되어 있고, 또한 2 종류 이상의 폴리 양이온을 동시에 도입하여 역할을 분담시킨다는 발상도 없었기 때문에, 이들 요인을 컨트롤하기란 매우 어려웠다.
인용문헌의 리스트
특허문헌 1: 국제 공개 제98/46655호 팜플렛 (20～21페이지, 실시예 10 및 11 참조)
특허문헌 2: 일본 공개특허공보 2001-146556호
비특허문헌 1: Harada and Kataoka, Macromolecules. 1995, 28, 5294-5299
비특허문헌 2: Polymer Preprints, Japan Vol.51. No.5 (2002)
발명의 개시
예를 들어, 상기의 특허문헌 2 및 비특허문헌 2 에 기재되어 있는 PEG-block-폴리 양이온은 안정적으로 DNA 를 내포한 폴리이온 착물 미셀 (PIC 미셀) 을 형성하지만, DNA 등의 생리 활성 물질을 전달해야 할 생체의 표적 환경 또는 그 환경 하에서의 생리 활성 물질의 PIC 미셀로부터의 최적 방출 속도의 다양성을 고려하면, 한층 더 새로운 특성을 나타내는 PIC 를 제공할 필요가 있다.
본 발명자들은, PEG-block-폴리 양이온 공중합체의 폴리 양이온 세그먼트를 낮은 pKa 의 부피가 큰 측쇄를 갖는 폴리 양이온 세그먼트로 함으로써, 예를 들어, 비특허문헌 2 에 기재된 공중합체에서는 PIC 미셀에 DNA 가 상당히 응축된 상태로 내포되는 데에 대하여, DNA 가 거의 프리한 상태로 내포되는 것을 발견하였다. 또한, 이와 같이 프리 상태에서 내포된 DNA 는, 예를 들어, 그것을 전달해야 할 표적 세포와 생리적 조건에서 접촉한 경우에는, 응축된 상태로 내포된 경우에 대하여 유의하게 늦게 방출되는 것도 발견하였다.
또한, 폴리 양이온 중에 1 급 아민과 2 급 또는 3 급 아민의 양쪽을 함유하는 경우, DNA 와의 회합체(會合體)의 형성에는 1 급 아민이 주로 관여하고 2 급 또는 3 급 아민은 거의 관여하고 있지 않은 것도 발견하여, 더욱 예의 검토를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, (1) 폴리에틸렌글리콜 또는 그 유도체로 이루어지는 A 세그먼트와, 폴리아미노산 또는 그 유도체 또는 그들의 염으로 이루어지는 B 세그먼트를 갖는 폴리에틸렌글리콜-폴리 양이온 블록 공중합체로서, B 세그먼트 중에, pKa 값이 7.4 이하인 부피가 큰 아민을 함유하거나, 또는 1 급 아민과 2 급 아민, 3 급 아민 또는 4 급 암모늄염의 양쪽을 함유하는 것을 특징으로 하는 공중합체; 특정한 양태로서, (2) 블록 공중합체의 구조가 일반식 (Ⅰ) 또는 (Ⅱ) 또는 그들의 염인 상기 (1) 에 기재된 공중합체:
Figure 112005063497312-pct00001
(식 중, R1 은 수소 원자 또는 비치환 또는 치환된 직쇄 또는 분지의 C1 -12 알킬기를 나타내고, L1, L2 는 연결기를 나타내고, R2 는 메틸렌기 또는 에틸렌기를 나타내고, R3 은 수소 원자, 보호기, 소수성기 또는 중합성기를 나타내고, R4 는 R5 와 동일하거나 또는 개시제 잔기이고, R5 는 각각 독립하여 수산기, 옥시벤질기, -NH-(CH2)a-X 기를 나타내고, 여기서 X 는 각각 독립하여 pKa 값이 7.4 이하인 부피가 큰 아민 화합물 잔기이거나, 또는 1 급, 2 급, 3 급 아민 또는 4 급 암모늄염 중 1 종류 또는 2 종류 이상을 함유하는 아민 화합물 잔기이거나, 또는 아민이 아닌 화합물 잔기이고, a 는 1～5 의 정수이고, m 은 5～20,000 의 정수이고, n 은 2～5,000 의 정수이고, x 는 0～5,000 의 정수이지만, x 는 n 보다 크지 않은 것으로 한다) ;
특정한 양태로서, (3) 블록 공중합체의 구조가 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ) 또는 그들의 염인 상기 (1) 에 기재된 공중합체:
Figure 112005063497312-pct00002
(식 중, R1 은 수소 원자 또는 비치환 또는 치환된 직쇄 또는 분지의 C1 -12 알킬기를 나타내고, L1, L2 는 연결기를 나타내고, R2 는 메틸렌기 또는 에틸렌기를 나타내고, R3 은 수소 원자, 보호기, 소수성기 또는 중합성기를 나타내고, R4 는 R5 와 동일하거나 또는 개시제 잔기이고, R5 는 각각 독립하여 수산기, 옥시벤질기, -NH-(CH2)a-X 기를 나타내고, 여기서 X 는 각각 독립하여 pKa 값이 7.4 이하인 부피가 큰 아민 화합물 잔기이거나, 또는 1 급, 2 급, 3 급 아민 또는 4 급 암모늄염 중 1 종류 또는 2 종류 이상을 함유하는 아민 화합물 잔기이거나, 또는 아민이 아닌 화합물 잔기이고, a 는 1～5 의 정수이고, R6 은 각각 독립하여 수소 원자 또는 보호기이고, 여기서 보호기란 통상 아미노기의 보호기로서 사용되고 있는 Z 기, Boc 기, 아세틸기, 트리플루오로아세틸기 등이고, m 은 5～20,000 의 정수이고, n 은 2～5,000 의 정수이고, y 는 0～4,999 의 정수이고, z 는 1～4,999 의 정수이지만, z 는 n 보다 작고, y＋z 는 n 보다 크지 않은 것으로 한다) ;
한층 더 특정한 양태로서, (4) R1 이 메틸기인 상기 (2) 또는 (3) 에 기재된 공중합체;
그리고, 더 특정한 양태로서, (5) R1 이 치환된 직쇄 또는 분지의 C1 -12 알킬기를 나타내고, 여기서 치환기가 아세탈화 포르밀기, 시아노기, 포르밀기, 카르복실기, 아미노기, C1 -6 알콕시카르보닐기, C2 -7 아실아미드기, 동일하거나 또는 다른 트리 C1 -6 알킬실록시기, 실록시기 또는 실릴아미노기인 상기 (2) 또는 (3) 에 기재된 공중합체 ;
그리고, 더 특정한 양태로서, (6) L1 이 -(CH2)b-NH- 이고, b 가 1～5 의 정수인 상기 (2) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 공중합체, (7) L2 가 -(CH2)c-CO- 이고, c 가 1～5 의 정수인 상기 (2) ;
더욱 특정한 양태로서, (3) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 공중합체 ;
그리고 한층 더 특정한 양태로서, (8) R2 가 메틸렌기인 상기 (2) 내지 (7) 중 어느 한 항에 기재된 공중합체; 더욱 특정한 양태로서, (9) X 가 하기의 A, B, C, D 또는 E 군에 나타낸 식으로 표시되는 기인 상기 (2) 내지 (8) 중 어느 한 항에 기재된 공중합체 ;
A 군:
Figure 112005063497312-pct00003
B 군:
Figure 112005063497312-pct00004
C 군:
-(CH2)f-NH2
D 군:
-(NR7(CH2)d)e-NHR8, -N(CH3)2 또는 -N(CH2CH3)2
E 군:
Figure 112005063497312-pct00005
(식 중, X2 는 수소 원자 또는 C1 -6 알킬기이고, X3 은 아미노 C1 -6 알킬기를 나타내고, R7 은 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고, d 는 1～5 의 정수를 나타내고, e 는 1～5 의 정수를 나타내고, f 는 0～15 의 정수를 나타내고, R8 은 보호기를 나타내고, 여기서 보호기란 통상 아미노기의 보호기로서 사용되고 있는 Z 기, Boc 기, 아세틸기, 트리플루오로아세틸기 등을 나타내고, g 는 0～15 의 정수를 나타낸다) ;
그리고 더욱 특정한 양태로서, (10) R3 이 아세틸기, 아크릴로일기 또는 메타크릴로일기인 상기 (2) 내지 (9) 중 어느 한 항에 기재된 공중합체 ;
또한 한층 더 특정한 양태로서, (11) R4 가 -NH-R9 이고, 여기서 R9 는 비치환 또는 치환된 직쇄 또는 분지의 C1 -20 알킬기를 나타내는 상기 (2) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 공중합체 ;
별도 양태로서, (12) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 한 항에 기재된 공중합체와 핵산 또는 음이온성 단백질을 함유하여 이루어지는 폴리이온 착물: 보다 특정한 별도의 양태로서, (13) 코어부에 핵산 또는 음이온성 단백질을 담지하고, 그리고 쉘부에 폴리에틸렌글리콜 세그먼트가 주로 존재하는 폴리머 미셀 형태에 있는 상기 (12) 에 기재된 폴리이온 착물, 에 관한 것이다.
발명의 효과
본 발명에 의해, PIC 미셀 중의 유전자의 응축 상태, 미셀로부터의 유전자의 방출 속도, 프로톤 스폰지 효과, 미셀의 안정성과 같은 유전자 도입 효율에 영향을 미치는 요인의 컨트롤이 가능해진다. 본 발명에 의해 높은 유전자 도입 효율을 갖는 PIC 미셀의 제공이 가능해진다. 본 발명에 의해 유용한 비(非)바이러스성 유전자 벡터의 제공이 가능해진다.
도 1 은, MeO-PEG-MOPA 와 p-DNA 의 여러 가지 N/P 비로 혼화한 용액의 전기 영동 결과 (각각 왼쪽으로부터, N/P 비: 0, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0) 를 나타내는 도면을 대신하는 사진이다 (또, N/P=0 이란, p-DNA 만을 영동한 레인을 가리킨다).
도 2 는, MeO-PEG-DET 와 p-DNA 의 여러 가지 N/P 비로 혼화한 용액의 전기 영동 결과 (각각 왼쪽으로부터, N/P 비: 10, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0) 를 나타내는 도면을 대신하는 사진이다 (또, N/P=0 이란, p-DNA 만을 영동한 레인을 가리킨다).
도 3 은, 동적 광산란 (DLS) 에 의해 측정된 MeO-PEG-MOPA 와 p-DNA 로 이루어지는 회합체의 입도 분포를 나타내는 그래프이다.
도 4 는, MeO-PEG-MOPA 와 p-DNA 로 이루어지는 회합체의 입경의 N/P 비 의존성의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5 는, 동적 광산란 (DLS) 에 의해 측정된 MeO-PEG-DET 와 p-DNA 로 이루어지는 회합체의 입도 분포를 나타내는 그래프이다.
도 6 은, MeO-PEG-DET 와 p-DNA 로 이루어지는 회합체의 입경의 N/P 비 의존성의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7 은, MeO-PEG-MOPA 와 p-DNA 로 이루어지는 회합체의 제타 전위 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8 은, MeO-PEG-DET 와 p-DNA 로 이루어지는 회합체의 제타 전위 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9 는, MeO-PEG-MOPA 와 p-DNA 로 이루어지는 회합체의 에티듐브로마이드 분석 (ethidium bromide assay) 의 결과 (10mM Tris-HCl 완충액, pH=7.4) 를 나타내는 그래프이다.
도 10 은, 생리염 농도 조건 하에서의 MeO-PEG-MOPA 와 p-DNA 로 이루어지는 회합체의 에티듐브로마이드 분석의 결과 (10mM Tris-HCl 완충액＋150mM NaCl, pH=7.4) 를 나타내는 그래프이다.
도 11 은, MeO-PEG-DET 와 p-DNA 로 이루어지는 회합체의 에티듐브로마이드 분석의 결과 (10mM Tris-HCl 완충액, pH=7.4) 를 나타내는 그래프이다.
도 12 는, MeO-PEG-MOPA 와 p-DNA 로 이루어지는 회합체 미셀 (N/P=5) 의 293T 세포로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다 (각각, 4 시간 및 24 시간 인큐베이션에 의한 것이다).
도 13 은, MeO-PEG-DET, MeO-PEG-DMAPA 또는 MeO-PEG-DAP 와 p-DNA 로 이루어지는 회합체 미셀 (N/P=10) 의 293T 세포로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다 (24 시간 인큐베이션에 의한 것이다).
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
일반식 (Ⅰ), (Ⅱ), (Ⅲ) 또는 (Ⅳ) 에 있어서, R1 은 수소 원자 또는 비치환 또는 치환된 직쇄 또는 분지의 C1 -12 알킬기를 나타내며, C1 -12 알킬로는, 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실, 데실, 운데실 등을 들 수 있다. 또한 치환된 경우의 치환기로는 아세탈화 포르밀기, 시아노기, 포르밀기, 카르복실기, 아미노기, C1 -6 알콕시카르보닐기, C2 -7 아실아미드기, 동일하거나 또는 다른 트리-C1 -6 알킬실록시기, 실록시기 또는 실릴아미노기를 들 수 있다. 치환기가 아세탈화 포르밀기일 때에는, 산성의 온화한 조건 하에서 가수분해하여 다른 치환기인 포르밀기 (-CHO: 또는 알데히드기) 로 전화할 수 있다. 이러한 포르밀기, 또는 카르복실기 또는 아미노기는, 예를 들어, 본 발명에 따르는 공중합체와 핵산 또는 음이온성 단백질과의 폴리이온 착물 미셀의 쉘부에 존재할 수 있고, 이들 기를 통하여, 항체 또는 그 특이 결합성을 갖는 단편 (F(ab')2, F(ab), 등) 및 그 밖의 기능성 또는 표적 지향성을 그 미셀에 부여할 수 있는 단백질 등을 그 미셀에 공유 결합시키는 데에 이용할 수 있다. 이러한 관능기를 한쪽 말단에 갖는 PEG 세그먼트는, 예를 들어, WO 96/32434, WO 96/33233, WO 97/06202 에 기재된 블록 공중합체의 PEG 세그먼트부의 제조법에 의해서 적절히 형성할 수 있다.
이렇게 해서 형성되는 PEG 세그먼트 부분과 폴리 (아미노산 또는 그 유도체) 세그먼트 부분은, 일반식 (Ⅰ), (Ⅱ), (Ⅲ) 또는 (Ⅳ) 의 공중합체의 제조 방법에 따라서 어떠한 연결 양식도 취할 수 있고, 또 본 발명의 목적에 따르는 한, 어떠한 연결기로 결합되어 있어도 된다.
제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 한가지 방법으로서, 말단에 아미노기를 갖는 PEG 유도체를 사용하고, 그 아미노 말단에서, β-벤질-L-아스파르테이트, Nε-Z-L-리신 등의 보호 아미노산의 N-카르복실산 무수물 (NCA) 을 중합시켜 블록 공중합체를 합성하고, 그 후 측쇄를 변환함으로써, 본 발명의 공중합체를 얻는 방법을 들 수 있다. 이 경우 공중합체의 구조는 일반식 (Ⅰ) 또는 (Ⅲ) 이 되고, 연결기 L1 은 사용한 PEG 유도체의 말단 구조에 유래하는 구조가 되지만, 바람직하게는 -(CH2)b-NH- 이고, 또한 b 는 1～5 의 정수이다.
또, 폴리 (아미노산 또는 그 유도체) 세그먼트 부분을 합성하고 나서 PEG 세그먼트 부분과 결합시키는 방법으로도 본 발명의 공중합체를 제조할 수 있고, 이 경우 결과적으로 상기 방법으로 제조한 것과 동일한 구조가 되는 경우도 있지만, 일반식 (Ⅱ) 또는 (Ⅳ) 의 구조가 되는 경우도 있으며, 연결기 L2 는 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 -(CH2)c-CO- 이고, 또한 c 는 1～5 의 정수이다.
일반식 (Ⅰ), (Ⅱ), (Ⅲ) 또는 (Ⅳ) 중의 R5 는 각각 독립하여 수산기, 옥시벤질기, -NH-(CH2)a-X 기일 수 있지만, 대부분 (일반적으로는 85% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 특히 바람직하게는 100%) 이 -NH-(CH2)a-X 기인 것이 바람직하다. 또한 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ) 중의 R6 은 각각 독립하여 수소 원자 또는 보호기일 수 있지만, 대부분이 수소 원자인 것이 바람직하다. 여기서 보호기란 통상 아미노기의 보호기로서 사용되고 있는 Z 기, Boc 기, 아세틸기, 트리플루오로아세틸기 등을 말한다.
X 는 공중합체가 본 발명의 조건을 만족하는 (또는 본 발명의 목적에 따르는) 한 특별히 제한되지 않지만, 5 개 군으로 분류되는 잔기 중에서 선택된다.
즉, A 군: pKa 값이 7.4 이하인 부피가 큰 아민 화합물 잔기:
Figure 112005063497312-pct00006
; B 군: 1 급 아민과 2 급 아민, 3 급 아민 또는 4 급 암모늄염의 양쪽을 함유하는 아민 화합물 잔기:
Figure 112005063497312-pct00007
; C 군: 1 급 아민만을 함유하는 아민 화합물 잔기:
-(CH2)f-NH2
; D 군: 2 급 아민, 3 급 아민 또는 4 급 암모늄염만을 함유하는 아민 화합물 잔기로 A 군에 포함되지 않는 것:
-(NR7(CH2)d)e-NHR8, -N(CH3)2 또는 -N(CH2CH3)2
; E 군: 아민이 아닌 화합물 잔기:
Figure 112005063497312-pct00008
이다.
일반식 (Ⅰ) 또는 (Ⅱ) 의 공중합체의 경우, A 군 및 B 군의 잔기에서 선택되는 임의의 하나의 잔기만을 함유하는 것이어도 되고, C 군은 A 군 및 D 군의 잔기에서 선택되는 적어도 하나의 잔기를 동시에 함유해야 하고, D 군은 B 군 및 C 군의 잔기에서 선택되는 적어도 하나의 잔기를 동시에 함유해야 한다. 또한 E 군은 공중합체의 물성을 변화시키기 위해서 함유시킬 수 있지만, E 군을 제외한 부분으로 상기 조건을 만족시키고 있어야 한다. 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ) 의 공중 합체의 경우, R6 의 적어도 1 개 이상이 수소 원자이면, A 군, B 군 및 D 군의 잔기에서 선택되는 임의의 하나의 잔기만을 함유하는 것이어도 된다. C 군 및 E 군은 상기 조건과 동일하다.
각각의 군에 관해서 바람직한 잔기의 예를 식으로 나타낸다. 식 중, A 군에서 X2 는 수소 원자 또는 C1 -6 알킬기이고, B 군에서 X3 은 아미노 C1 -6 알킬기이고, R7 은 수소 원자 또는 메틸기이고, d, e 는 모두 1～5 의 정수이고, C 군에서 f 는 0 내지 15 의 정수이고, D 군에서 d, e 는 모두 1～5 의 정수이고, R8 은 Z 기, Boc 기, 아세틸기, 트리플루오로아세틸기 등의 보호기이고, E 군에서 g 는 0～15 의 정수일 수 있다.
폴리아미노산 구조의 측쇄에 이들 잔기를 도입하는 방법으로, 특히 폴리아스파라긴산 구조의 경우에는, 예를 들어, 일본 특허 제2777530호에 기재되어 있는 폴리(β-벤질-L-아스파르테이트) 부분의 아미놀리시스에 의한 에스테르에서 아미드에 대한 교환 반응에 의해 적절히 제조할 수 있다. 다른 방법으로는 벤질에스테르를 접촉 환원, 산, 알칼리 등에 의해 가수분해하여 폴리아스파라긴산 또는 폴리글루타민산으로 변환한 후, 축합제 등을 사용하여 이들 잔기를 갖는 화합물을 결합시키는 방법에 의해서도 제조할 수 있다.
이들 양이온 측쇄는 염으로 되어 있어도 되고, 이 경우 염을 형성하는 쌍이 온으로는 Cl-, Br-, I-, (1/2SO4)-, NO3 -, (1/2CO3)-, (1/3PO4)-, CH3COO-, CF3COO-, CH3SO3 -, CF3SO3 - 등을 들 수 있다.
일반식 (Ⅰ), (Ⅱ), (Ⅲ) 또는 (Ⅳ) 에서의 R2 는 메틸렌기 또는 에틸렌기를 나타내지만, 메틸렌기의 경우는 폴리 (아스파라긴산 유도체), 에틸렌기의 경우는 폴리 (글루타민산 유도체) 에 상당한다. 이들 일반식 중, R2 가 메틸렌기 및 에틸렌기의 양자를 나타내는 경우, 아스파라긴산 유도체 및 글루타민산 유도체의 반복 단위는, 각각 블록을 형성하여 존재하거나 또는 랜덤하게 존재할 수 있다.
일반식 (Ⅰ) 또는 (Ⅲ) 에서의 R3 은 수소 원자, 보호기, 소수성기 또는 중합성기를 나타내지만, 보호기로는 C1 -6 알킬카르보닐기를 들 수 있고, 바람직하게는 아세틸기이다. 소수성기로는 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 피렌 등의 유도체를 들 수 있다. 중합성기로는 메타크릴로일기, 아크릴로일기를 들 수 있고, 이러한 중합성기를 일반식 (Ⅰ) 또는 (Ⅲ) 의 공중합체가 갖는 경우에는 이들 공중합체는 소위 마크로머(macromer)로서 사용할 수 있으며, 예를 들어, PIC 미셀을 형성한 후, 필요에 따라 다른 코모노머를 사용하여 이들 중합성기를 통해 가교시킬 수도 있다.
이들 보호기, 소수성기, 중합성기를 공중합체의 말단에 도입하는 방법으로는, 산할로겐화물을 사용하는 방법, 산무수물을 사용하는 방법, 활성 에스테르를 사용하는 방법 등, 통상적인 합성에서 사용되고 있는 수법을 들 수 있다.
일반식 (Ⅱ) 또는 (Ⅳ) 에 있어서의 R4 는 R5 와 마찬가지로 수산기, 옥시벤질기, -NH-(CH2)a-X 기일 수 있지만, 저분자의 개시제를 사용하여 보호 아미노산의 NCA 를 중합시켜 폴리 (아미노산 또는 그 유도체) 세그먼트를 합성한 다음 PEG 세그먼트와 결합시키는 방법으로 블록 공중합체를 제조하는 경우에는, 사용한 개시제에 유래하는 구조를 취할 수도 있다. 즉 -NH-R9 이고, R9 가 비치환 또는 치환된 직쇄 또는 분지의 C1 -20 알킬기이다.
PEG 세그먼트의 사슬 길이 및 폴리 (아미노산 또는 그 유도체) 세그먼트의 사슬 길이를 규정하는 m 및 n 은, 각각 5～20,000 의 정수, 바람직하게는 10～5,000, 특히 바람직하게는 40～500, 및 2～5,000, 보다 바람직하게는 5～1,000, 특히 바람직하게는 10～200 이지만, 일반식 (Ⅰ), (Ⅱ), (Ⅲ) 또는 (Ⅳ) 의 공중합체가 핵산 또는 음이온성 단백질과 PIC 미셀을 형성는 것이라면 한정되지 않는다. 따라서, 본 명세서에서는 편의상 폴리에틸렌글리콜, 폴리 양이온 등으로 칭하고 있지만, 「폴리」라는 단어에는 소위 「올리고」로 분류되는 것도 포함되는 개념으로서 사용하고 있다.
또한, 폴리 (아미노산 또는 그 유도체) 세그먼트의 구성 비율을 규정하는 x, y, z 는, 각각 0～5,000 의 정수 (단 n 보다 크지 않다), 0～4,999 의 정수, 1～4,999 의 정수 (단 z 는 n 보다 작고, y＋z 는 n 보다 크지 않다) 이며, z 는 10～ n－10 의 범위인 것이 보다 바람직하다. 또한 각 구성 성분은 랜덤하게 분포되어 있는 것이나 블록형상으로 분포되어 있는 것이나 어느 쪽도 가능하다.
일반식 (Ⅰ), (Ⅱ), (Ⅲ) 또는 (Ⅳ) 로 나타내는 공중합체는, 핵산, 예를 들어, 공지의 유전자 치료 등에 사용할 수 있는 유전자 또는 치료상 필요한 단백질을 코드하는 유전자, 이러한 유전자를 함유하는 플라스미드 등의 DNA 단편, RNA 단편, 안티센스 DNA 등, 또는 음이온성 (특히 생리적 pH 에 있어서 음이온에 하전할 수 있는) 단백질 (또는 펩티드) 과 수성 매체 (수혼화성의 유기 용매를 함유하고 있어도 된다) 중, 실온 하에 교반함으로써, 공중합체의 폴리 양이온부와 예를 들어 핵산과의 폴리이온 착물을 코어부로 하고, PEG 층을 쉘부로 하는 PIC 미셀을 적절하게 형성할 수 있다. 본 발명에 의하면, 이러한 PIC 또는 PIC 미셀 그 자체도 제공된다.
이하, 구체예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 예는 설명만을 목적으로 하는 것으로 이해되고 있다.
실시예 1: 폴리에틸렌글리콜-폴리(β-벤질-L-아스파르테이트)-Ac 블록 공중합체의 합성
한쪽 말단이 메톡시, 다른쪽 말단이 아미노프로필이고 평균 분자량이 12,000 인 폴리에틸렌글리콜 (MeO-PEG-NH2) 을 염화메틸렌에 용해하고, β-벤질-L-아스파르테이트-N-카르복실산 무수물 (BLA-NCA) 을 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 와 염화메 틸렌의 혼합 용매에 용해하여 첨가하고, 40℃ 에서 2 일간 반응시켜서 폴리에틸렌글리콜-폴리(β-벤질-L-아스파르테이트) 블록 공중합체 (MeO-PEG-PBLA) 를 얻고, 다시 무수아세트산에 의해 N 말단의 아세틸화를 실시하여, MeO-PEG-PBLA-Ac 를 얻었다.
1H-NMR 에 의한 해석으로부터, PBLA 부분의 평균 분자량은 14,000, 중합도는 68 이었다.
실시예 2: 모르폴리노프로필아민에 의한 아미놀리시스에서의 폴리에틸렌글리콜-폴리 양이온 블록 공중합체의 제조
Figure 112005063497312-pct00009
[상기 식 중, R=
Figure 112005063497312-pct00010
]
실시예 1 에서 얻어진 MeO-PEG-PBLA-Ac 를 벤젠에 용해하여 동결 건조시켰다. 또한 모르폴리노프로필아민을, 수소화칼슘을 건조제로 하여 감압 증류하였다.
MeO-PEG-PBLA-Ac 를 건조 DMF 에 용해하고, PBLA 유닛에 대하여 10 배량의 모르폴리노프로필아민을 첨가하여, 아르곤 분위기 하, 40℃ 에서 24 시간 교반하였 다. 24 시간 후, 반응 용액을 10% 아세트산 수용액에 적하하고, 이것을 분획 분자량 3,500 의 투석막으로 0.01N-염산 수용액에 대하여 투석하여, 투석막 내 액을 증발시키고, 동결 건조시킴으로써 백색 고체의 목적물 (MeO-PEG-MOPA) 을 얻었다. 얻어진 폴리머의 구조는, 1H-NMR 에 의해 확인하였다.
그 결과, MeO-PEG-PBLA-Ac 의 벤질기에 귀속되는 피크가 완전히 소실되고, 새롭게 아미드 형성에 유래하는 프로톤 시그널이 확인되었다. 적분치로부터, 고분자 측쇄의 아미놀리시스가 거의 정량적으로 진행되었음이 확인되었다.
실시예 3: 디에틸렌트리아민에 의한 아미놀리시스에서의 폴리에틸렌글리콜-폴리 양이온 블록 공중합체의 제조
[상기 식 중, R=
Figure 112005063497312-pct00011
]
실시예 1 에서 얻어진 MeO-PEG-PBLA-Ac 를 벤젠에 용해하여 동결 건조시켰다. 또한 디에틸렌트리아민을, 수소화칼슘을 건조제로 하여 감압 증류하였다.
MeO-PEG-PBLA-Ac 를 건조 DMF 에 용해하고, PBLA 유닛에 대하여 50 배량의 디에틸렌트리아민을 첨가하여, 아르곤 분위기 하, 40℃ 에서 24 시간 교반하였다. 24 시간 후, 반응 용액을 10% 아세트산 수용액에 적하하고, 이것을 분획 분자량 3,500 의 투석막으로 0.01N-염산 수용액에 대하여 투석하여, 투석막 내 액을 동결 건조시킴으로써 백색 고체의 목적물 (MeO-PEG-DET) 을 얻었다.
얻어진 폴리머의 구조는, 1H-NMR 에 의해 확인하였다.
그 결과, MeO-PEG-PBLA-Ac 의 벤질기에 귀속되는 피크가 완전히 소실되고, 새롭게 아미드 형성에 유래하는 프로톤 시그널이 확인되었다. 적분치로부터, 고분자 측쇄의 아미놀리시스가 거의 정량적으로 진행되었음이 확인되었다.
비교예 1
N,N-디메틸프로필아민에 의한 아미놀리시스에서의 폴리에틸렌글리콜-폴리 양이온 블록 공중합체의 제조
[상기 식 중, R=
Figure 112005063497312-pct00012
]
실시예 1 에서 얻어진 MeO-PEG-PBLA-Ac 를 벤젠에 용해하여 동결 건조시켰다. 또한 N,N-디메틸프로필아민을, 수소화칼슘을 건조제로 하여 감압 증류하였다.
MeO-PEG-PBLA-Ac 를 건조 DMF 에 용해하고, PBLA 유닛에 대하여 10 배량의 N,N-디메틸프로필아민을 첨가하여, 아르곤 분위기 하, 40℃ 에서 24 시간 교반하였다. 24 시간 후, 반응 용액을 10% 아세트산 수용액에 적하하고, 이것을 분획 분자량 3,500 의 투석막으로 0.01N-염산 수용액에 대하여 투석하여, 투석막 내 액을 증발시키고, 동결 건조시킴으로써 백색 고체의 목적물 (MeO-PEG-DMAPA) 을 얻었다.
얻어진 폴리머의 구조는, 1H-NMR 에 의해 확인하였다.
그 결과, MeO-PEG-PBLA-Ac 의 벤질기에 귀속되는 피크가 완전히 소실되고, 새롭게 아미드 형성에 유래하는 프로톤 시그널이 확인되었다. 적분치로부터, 고분자 측쇄의 아미놀리시스가 거의 정량적으로 진행되었음이 확인되었다.
비교예 2
디아미노프로판에 의한 아미놀리시스에서의 폴리에틸렌글리콜-폴리 양이온 블록 공중합체의 제조
[상기 식 중, R=
Figure 112005063497312-pct00013
]
실시예 1 에서 얻어진 MeO-PEG-PBLA-Ac 를 벤젠에 용해하여 동결 건조시켰다. 또한 디아미노프로판을, 수소화칼슘을 건조제로 하여 감압 증류하였다.
MeO-PEG-PBLA-Ac 를 건조 DMF 에 용해하고, PBLA 유닛에 대하여 50 배량의 디아미노프로판을 첨가하여, 아르곤 분위기 하, 40℃ 에서 24 시간 교반하였다. 24 시간 후, 반응 용액을 10% 아세트산 수용액에 적하하고, 이것을 분획 분자량 3,500 의 투석막으로 0.01N-염산 수용액에 대하여 투석하여, 투석막 내 액을 증발시키고, 동결 건조시킴으로써 백색 고체의 목적물 (MeO-PEG-DAP) 을 얻었다.
얻어진 폴리머의 구조는, 1H-NMR 에 의해 확인하였다.
그 결과, MeO-PEG-PBLA-Ac 의 벤질기에 귀속되는 피크가 완전히 소실되고, 새롭게 아미드 형성에 유래하는 프로톤 시그널이 확인되었다. 적분치로부터, 고분자 측쇄의 아미놀리시스가 거의 정량적으로 진행되었음이 확인되었다.
실시예 4: 블록 공중합체와 플라스미드 DNA 에 의한 PIC 미셀의 조제
루시페라제를 코드한 플라스미드 DNA (p-DNA, pGL3-Luc) 는 키아겐사의 Maxi kit 에 의해 정제하고, 50㎍/㎖ 가 되도록 트리스-염산 완충액 (10mM, pH=7.4) 으로 용액 조제한 것을 사용하였다. 실시예 2, 실시예 3, 비교예 1 또는 비교예 2 에서 제작한 공중합체 용액 (트리스-염산 완충액 (10mM, pH=7.4)) 과 p-DNA 용액을 각 N/P 비를 만족하도록 혼화하고, 이 용액을 실온 어두운 곳에서 하룻밤 정치하였다. 용액은 투명하고, 응집체, 침전의 생성은 확인되지 않았다. 또 N/P 비란 [블록 공중합체 중의 양이온 잔기의 농도]/[p-DNA 중의 인산기 농도] 이지만, 실시예 3 에서 제작한 MeO-PEG-DET 에 한하여 1 급 아미노기만의 농도로 계산하고 있다.
실시예 5: 전기 영동에 의한 캐릭터리제이션
0.9wt% 의 아갈로스겔을 조제하고, p-DNA 농도=0.17㎍/lane, 영동 버퍼는 트리스-염산 완충액 (3.3mM, pH=7.4) 을 사용하여, 인가 전압 50V, 영동 시간 2 시간의 조건으로 영동하였다. 종료 후, 에티듐브로마이드 용액 (0.5㎎/ℓ) 으로 1 시간 염색하였다.
도 1 에 MeO-PEG-MOPA 와 p-DNA 의 혼합 용액의 결과를, 도 2 에 MeO-PEG-DET 와 p-DNA 의 혼합 용액의 결과를 나타낸다. 모두 N/P 비＞1 에 있어서 프리한 p-DNA 에 기인하는 밴드는 소실되어 있어, PIC 미셀이 형성되었음이 시사되었다. 또한 N/P 비의 정의 방식에서 생각할 때, MeO-PEG-DET 에서는 회합체의 형성에는 블록 공중합체 중의 1 급 아민이 주로 관여하고, 2 급 아민은 거의 관여하고 있지 않다는 것이 시사되었다. 회합체 중에서는 2 급 아민이 탈프로톤 상태에서 계 중에 잔류하고 있어, 버퍼능을 유지하고 있는 것으로 생각할 수 있다.
실시예 6: 동적 광산란법 (DLS) 에 의한 캐릭터리제이션
입경을 동적 광산란에 의해 측정하였다. 결과를 도 3～6 에 나타낸다. 도 3, 4 는 MeO-PEG-MOPA 와 p-DNA 의 혼합 용액에 관한 결과이고, 도 5, 6 은 MeO-PEG-DET 와 p-DNA 의 혼합 용액에 관한 결과이다. 도 3, 5 는 N/P 비가 1 일 때의 입도 분포의 도면이고, 도 4, 6 은 여러 가지 N/P 비에 있어서의 입경 측정의 결과이다. 이들 결과로부터, 모든 계가 입경이 80～100나노미터의 단봉성(單峰性) 회합체 입자를 형성하고 있어, N/P 비에 상관없이 거의 일정한 입경의 값을 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 7: 제타 전위 측정에 의한 캐릭터리제이션
제타 전위의 측정 결과를 도 7, 8 에 나타낸다. 도 7 은 MeO-PEG-MOPA 와 p-DNA 의 혼합 용액에 관한 결과이고, 도 8 은 MeO-PEG-DET 와 p-DNA 의 혼합 용액에 관한 결과이다. 모든 계가, N/P 비의 상승에 동반하여 약간 정(正)의 전하를 띠는 경향이 관찰되지만, 절대치는 매우 작아 거의 0mV 에 가까운 제타 전위를 나타내었다.
이는 형성된 회합체 입자의 표면이 전기적으로 중성에 가깝다는 것으로, 표면에 PEG 층을 갖고, 내핵에 폴리이온 착물을 갖는 코어-쉘형의 미셀 구조임을 시사하는 것이다.
실시예 8: 에티듐브로마이드 분석에 의한 캐릭터리제이션
PIC 미셀 내부의 p-DNA 의 응축 정도를, 에티듐브로마이드 분석에 의해 평가하였다. 590㎚ 의 형광 강도는, 미셀 내부의 p-DNA 의 응축 정도를 반영하고 있다. 즉, 형광 강도가 높을수록 p-DNA 는 완화된 (프리한) 상태이고, 형광 강도가 낮을수록 응축된 상태에 있다고 할 수 있다. 또, 플롯에 있어서는, 소정 농도의 p-DNA 에 에티듐브로마이드를 첨가했을 때의 590㎚ 의 형광 강도를 100 으로 규격화하여, 그것에 대한 상대 강도로서 플롯하고 있다.
MeO-PEG-MOPA 와 p-DNA 로 이루어지는 미셀에 관한 측정 결과를 도 9 에 나타낸다. N/P 비의 상승에 동반하여 형광 강도가 약간 감소해가는 경향이 관찰되지만, N/P=10 에서도 약 70 이라는 값을 나타내었다. 종래 연구되어 온 블록 공중합체와 비교하여 이 값은 대단히 높은 값이다 (통상, 폴리리신 등의 DNA 를 효율적으로 응축시키는 폴리 양이온을 사용한 경우에는, 상대 형광 강도는 N/P＞1 에서 5 정도까지 감소한다).
또한, 생리적 농도 (150mM) 의 식염을 첨가한 계에서 동일하게 측정한 결과를 도 10 에 나타낸다. 상대 형광 강도는 더욱 100 에 근접하여, 미셀 내의 p-DNA 가 프리 p-DNA 와 거의 같은 정도까지 완화 상태임을 알 수 있다. 실제로 배양 세포, 생체 내에 미셀을 투여하는 경우에는 도 9 보다도 도 10 에 나타낸 결과의 상태인 쪽이 보다 가까운 조건인 것으로 생각된다.
MeO-PEG-DET 와 p-DNA 로 이루어지는 미셀에 관한 측정 결과를 도 11 에 나타낸다. N/P 비가 0～2 까지의 사이에는, N/P 비의 상승에 동반하여 급격한 형광 강도의 감소가 관찰되고, N/P 비가 2～10 의 사이에서도 완만하게 형광 강도가 감소하는 경향이 관찰되었다.
실시예 9: 유전자 도입 효율의 평가
N/P=5 로 MeO-PEG-MOPA 와 p-DNA 의 미셀을 조제하고, 이것을 배양 세포 (293T 세포) 와 일정 시간 접촉시킨 후, 배지를 교환하여, 다시 24 시간 배양한 후, 루시페라제 분석, 단백질의 정량에 의해 유전자 도입 효율을 평가하였다. 결과를 도 12 에 나타낸다. 미셀과 세포의 접촉 시간이 4 시간인 경우와 24 시간인 경우를 비교하면, 접촉 시간의 연장에 의해 비약적으로 유전자 도입 효율이 향상되고 있음을 알 수 있다. 이는, 미셀 중에 내포된 유전자의 방출 속도의 변화에 기인하는 것으로 생각된다.
MeO-PEG-DET 에 대해서는, 비교예 1, 2 에서 제작한 MeO-PEG-DMAPA 및 MeO-PEG-DAP 를 비교 대조 시료로 하여 평가하였다. MeO-PEG-DET 는 1 급 아민과 2 급 아민을 동시에 갖는 것, MeO-PEG-DMAPA 는 3 급 아민만을 갖는 것, MeO-PEG-DAP 는 1 급 아민만을 갖는 것이다. 3 종류의 공중합체 각각과 p-DNA 의 미셀을 N/P=10 로 조제하고, 이들을 배양 세포 (293T 세포) 와 24 시간 접촉시킨 다음, 배지를 교환하여, 다시 24 시간 배양한 후, 루시페라제 분석, 단백질의 정량에 의해 유전자 발현 효율을 평가하였다. 결과를 도 13 에 나타낸다. MeO-PEG-DET 는 다른 2 종류의 공중합체에 비해 높은 유전자 도입 효율을 나타내었다. 이것은 착물 형성에 관여하는 아민 (1 급) 과 버퍼능의 발휘가 기대되는 아민 (2급) 을 하나의 공중합체 중에 도입함으로써, 세포 내에 주입된 PIC 미셀에 내포된 P-DNA 의 세포질로의 이행이, 프로톤 스폰지 효과에 의해 촉진되는 것에 기인하는 것으로 생각된다.
본 발명에 따르면, 높은 유전자 도입 효율을 갖는 PIC 미셀의 제공이 가능해진다. 또한, 본 발명에 의해 유용한 비바이러스성 유전자 벡터의 제공도 가능해진다. 따라서, 본 발명은 의료 산업에서 이용 가능하다.

Claims (13)

  1. 하기 일반식 (Ⅰ) 또는 (Ⅱ) 로 나타내는 블록 공중합체 또는 그들의 염:
    Figure 112011035522036-pct00032
    상기 식 중,
    m 은 5～20,000 의 정수이고,
    n 은 2～5,000 의 정수이고,
    x 는 0～5,000 의 정수이지만, 단, x 는 n 보다 크지 않고,
    R1 은 수소 원자 또는 비치환 또는 치환된 직쇄 또는 분지의 C1-12 알킬기를 나타내고,
    L1, L2 는 연결기를 나타내고,
    R2 는 메틸렌기 또는 에틸렌기를 나타내고,
    R3 은 수소 원자, 보호기, 소수성기 또는 중합성기를 나타내고,
    R4 는 R5 와 동일하거나 또는 개시제 잔기이고,
    R5 는 각각 독립하여 수산기, 옥시벤질기 또는 -NH-(CH2)a-X 기를 나타내고, 단, R5 의 85% 이상이 -NH-(CH2)a-X 기이고, X 는 각각 독립하여 하기로 표시된다:
    Figure 112011035522036-pct00033
    ,
    Figure 112011035522036-pct00034
    , -(NR7)(CH2)d)e-NH2, -(CH2)f-NH2, -(NR7(CH2)d)e-NHR8, -N(CH3)2 또는 -N(CH2CH3)2
    (상기 식 중,
    a 는 1～5 의 정수를 나타내고,
    X2 는 수소 원자 또는 C1-6 알킬기이고,
    X3 은 아미노 C1-6 알킬기를 나타내고,
    R7 은 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고,
    d 는 1～5 의 정수를 나타내고,
    e 는 1～5 의 정수를 나타내고,
    f 는 0～15 의 정수를 나타내고,
    R8 은 Boc 기, 아세틸기 또는 트리플루오로아세틸기를 나타낸다).
  2. 하기 일반식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ) 로 나타내는 블록 공중합체 또는 그들의 염:
    Figure 112011035522036-pct00035
    상기 식 중,
    m 은 5～20,000 의 정수이고,
    n 은 2～5,000 의 정수이고,
    x 는 0～5,000 의 정수이지만, 단, x 는 n 보다 크지 않고,
    R1 은 수소 원자 또는 비치환 또는 치환된 직쇄 또는 분지의 C1-12 알킬기를 나타내고,
    L1, L2 는 연결기를 나타내고,
    R2 는 메틸렌기 또는 에틸렌기를 나타내고,
    R3 은 수소 원자, 보호기, 소수성기 또는 중합성기를 나타내고,
    R4 는 R5 와 동일하거나 또는 개시제 잔기이고,
    R5 는 각각 독립하여 수산기, 옥시벤질기 또는 -NH-(CH2)a-X 기를 나타내고, 단, R5 의 85% 이상이 -NH-(CH2)a-X 기이고, X 는 각각 독립하여 하기로 표시되고:
    Figure 112011035522036-pct00036
    ,
    Figure 112011035522036-pct00037
    , -(NR7)(CH2)d)e-NH2, -(CH2)f-NH2, -(NR7(CH2)d)e-NHR8, -N(CH3)2 또는 -N(CH2CH3)2
    (상기 식 중,
    a 는 1～5 의 정수를 나타내고,
    X2 는 수소 원자 또는 C1-6 알킬기이고,
    X3 은 아미노 C1-6 알킬기를 나타내고,
    R7 은 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고,
    d 는 1～5 의 정수를 나타내고,
    e 는 1～5 의 정수를 나타내고,
    f 는 0～15 의 정수를 나타내고,
    R8 은 Boc 기, 아세틸기 또는 트리플루오로아세틸기를 나타낸다), 그리고
    R6 은 각각 독립하여 수소 원자, Boc 기, 아세틸기 또는 트리플루오로아세틸기를 나타낸다.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R1 이 메틸기인 공중합체.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R1 이 치환된 직쇄 또는 분지 C1-12 알킬기를 나타내고, 여기서 치환기가 아세탈화 포르밀기, 시아노기, 포르밀기, 카르복실기, 아미노기, C1-6 알콕시카르보닐기, C2-7 아실아미드기, 동일하거나 또는 다른 트리 C1-6 알킬실록시기, 실록시기 또는 실릴아미노기인 공중합체.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, L1 이 -(CH2)b-NH- 이고, b 가 1～5 의 정수인 공중합체.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, L2 가 -(CH2)c-CO- 이고, c 가 1～5 의 정수인 공중합체.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R2 가 메틸렌기인 공중합체.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R3 이 아세틸기, 아크릴로일기 또는 메타크릴로일기인 공중합체.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R4 가 -NH-R9 이고, 여기서 R9 는 비치환 또는 치환된 직쇄 또는 분지의 C1-20 알킬기를 나타내는 공중합체.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 공중합체와 핵산 또는 음이온성 단백질을 함유하여 이루어지는 폴리이온 착물.
  11. 제 10 항에 있어서, 코어부에 핵산 또는 음이온성 단백질을 담지하고, 그리고 쉘부에 폴리에틸렌글리콜 세그먼트가 주로 존재하는 폴리머 미셀 형태에 있는 폴리이온 착물.
  12. 삭제
  13. 삭제
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