WO2010098265A1 - プロテアソームインヒビター内包高分子ミセル - Google Patents

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WO2010098265A1
WO2010098265A1 PCT/JP2010/052556 JP2010052556W WO2010098265A1 WO 2010098265 A1 WO2010098265 A1 WO 2010098265A1 JP 2010052556 W JP2010052556 W JP 2010052556W WO 2010098265 A1 WO2010098265 A1 WO 2010098265A1
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poly
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cancer
proteasome inhibitor
pharmaceutical composition
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PCT/JP2010/052556
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French (fr)
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一則 片岡
カブラル、ホラシオ
伸宏 西山
陽子 松本
俊介 中川
雄一郎 宮本
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国立大学法人 東京大学
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure

Definitions

  • the present invention relates to a polymeric micelle containing a proteasome inhibitor, and relates to the field of cancer treatment.
  • the tumor suppressor protein p53 is added with ubiquitin (labeled protein) by the ubiquitin ligase MDM2 and is degraded by the intracellular proteosome.
  • ARF alternative reading ⁇ frame
  • the proteasome is responsible for the degradation of I-kB, an inhibitor of NF-kB, a transcriptional activator of many oncogenic proteins, and the ubiquitin proteasome system is also involved in the activation of NF-kB It is known.
  • bortezomib (trade name VELCADE) is an agent for multiple myeloma. Antitumor effect is recognized, and it is the only clinical application. In addition to multiple myeloma, bortezomib has been shown to have antitumor effects against ovarian cancer cell lines transplanted into nude mice in the field of gynecological cancer, There is Phase 1 study combined with drugs (Paclitaxel and Carboplatin) (Non-patent Document 1).
  • the human papillomavirus (HPV) E6 oncoprotein which is the cause of cervical cancer, is transferred to the ubiquitin proteasome system via ubiquitin ligase E6AP.
  • HPV human papillomavirus
  • the present inventors analyzed that the above mechanism was based on a study using a cell line. It has been found that it has antitumor effects on the body and restores the expression of tumor suppressor protein that is degraded by HPV, increasing the sensitivity of drugs and radiation, etc. at the 59th Annual Meeting of the Japan Society of Obstetrics and Gynecology Announced.
  • proteasome inhibitors are not clinically applied because of their low stability in the blood, and even bortezomib, which has been clinically applied, has strong side effects such as thrombocytopenia. There are problems in use, such as no administration.
  • block copolymers including a block copolymer composed of a poly (ethylene glycol) segment and a polyamino acid segment as a material for a carrier for in vivo delivery of a drug.
  • Polymer micelles containing various drugs or physiologically active substances using copolymers have been provided (Patent Documents 1 to 6).
  • JP 2004-352972 A International Publication No. 2006/132430 Pamphlet JP-A-8-188541 International Publication No. 02/26241 Pamphlet JP-A-6-107560 JP-A-6-107565
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and a problem to be solved is to provide a drug capable of avoiding side effects such as bone marrow suppression and realizing excellent proteasome inhibitory activity.
  • the present inventors have found that by incorporating a proteasome inhibitor in a polymer micelle, the anticancer activity can be enhanced and the side effects can be reduced. Based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a pharmaceutical composition comprising a proteasome inhibitor as an active ingredient, wherein the proteasome inhibitor is encapsulated in a polymer micelle comprising a block copolymer having a hydrophilic segment and a hydrophobic segment.
  • the pharmaceutical composition according to the above (1) or (2), wherein the block copolymer is represented by the following general formula (I) or (II).
  • R 1 represents a hydrogen atom or an unsubstituted or substituted linear or branched C 1 to C 12 alkyl group
  • L 1 and L 2 represent a linking group
  • R 2 represents a methylene group or an ethylene group
  • R 3 represents a hydrogen atom, a saturated or unsaturated C 1 -C 29 aliphatic carbonyl group or an arylcarbonyl group
  • R 4 represents a hydroxyl group, a saturated or unsaturated C 1 to C 30 aliphatic oxy group or an aryl-lower alkyloxy group
  • Each R 5 independently represents —OR 6 or —NHR 6 (R 6 represents a hydrogen atom, an alkyl group, a benzyl-substituted alkyl group or an aryl group);
  • m represents an integer of 4 to 2500
  • n represents an integer of 2 to 300
  • x represents an integer of 0 to 300, but x is not greater than n.
  • the hydrophobic segment is poly ( ⁇ -alkyl aspartate), poly ( ⁇ -alkyl aspartate-co-aspartate), poly ( ⁇ -aralkyl aspartate), poly ( ⁇ -aralkyl aspartate-co- Aspartic acid), poly ( ⁇ -alkylglutamate), poly ( ⁇ -alkylglutamate-co-glutamic acid), poly ( ⁇ -aralkylglutamate), poly ( ⁇ -alkylaspartamide), poly ( ⁇ -alkylaspartamide) -Co-aspartic acid), poly ( ⁇ -aralkylaspartamide), poly ( ⁇ -aralkylaspartamide-co-aspartic acid), poly ( ⁇ -alkylglutamide), poly ( ⁇ -alkylglutamide-co -Glutamic acid), poly ( ⁇ -aralkylglutamide), poly ( ⁇ -aralkylglutamide-co- Consisting of at least one selected from the group consisting of glutamic acid), the (1) the pharmaceutical composition according to
  • the pharmaceutical composition according to (5) above, wherein the cancer is cervical cancer.
  • a polymeric micelle comprising a block copolymer having a hydrophilic segment and a hydrophobic segment encapsulating a proteasome inhibitor.
  • a method for treating or preventing cancer comprising a step of administering the pharmaceutical composition according to any one of (1) to (6) above to a subject in need thereof.
  • the treatment or prevention method according to (9) above, wherein the cancer is cervical cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has high blood stability, and the polymer micelles are selectively and effectively accumulated in the tumor, and thus exhibit an excellent therapeutic effect on the tumor. Furthermore, since polymeric micelles do not accumulate in the bone marrow, the pharmaceutical composition of the present invention can avoid side effects such as bone marrow suppression that are problematic in the use of ordinary proteasome inhibitors.
  • Example 1 the particle size distribution of polymer micelles obtained from PEG-PBLA 12-40 is shown.
  • Example 1 the particle size distribution of MG-132-encapsulating polymer micelles obtained from PEG-PBLA 12-40 and MG-132 (1 mM) is shown.
  • Example 1 the particle size distribution of MG-132-encapsulating polymer micelles obtained from PEG-PBLA 12-40 and MG-132 (2 mM) is shown.
  • Example 1 the particle size distribution of MG-132-encapsulating polymer micelles obtained from PEG-PBLA 12-40 and MG-132 (3 mM) is shown.
  • Example 1 the particle size distribution of MG-132-encapsulating polymer micelles obtained from PEG-PBLA 12-40 and MG-132 (4 mM) is shown.
  • Example 2 the particle size distribution of polymer micelles obtained from PEG-PBLA 12-40 (1 mg / ml) is shown.
  • Example 2 the particle size distribution of MG-132-encapsulating polymer micelles obtained from PEG-PBLA 12-40 (1 mg / ml) and MG-132 (0.5 mg / ml) is shown.
  • Example 2 the particle size distribution of MG-132-encapsulating polymer micelles obtained from PEG-PBLA 12-40 (1 mg / ml) and MG-132 (1 mg / ml) is shown.
  • Example 2 the particle size distribution of MG-132-encapsulating polymer micelles obtained from PEG-PBLA 12-40 (1 mg / ml) and MG-132 (1.5 mg / ml) is shown.
  • Example 3 the particle size distribution of polymeric micelles obtained from PEG-PBLG (1 mg / ml) is shown.
  • the particle size distribution of MG-132-encapsulating polymer micelles obtained from PEG-PBLG (1 mg / ml) and MG-132 (0.5 mg / ml) in Example 3 is shown.
  • Example 3 the particle size distribution of MG-132-encapsulating polymer micelles obtained from PEG-PBLG (1 mg / ml) and MG-132 (1 mg / ml) is shown.
  • Example 3 the particle size distribution of MG-132-encapsulating polymer micelles obtained from PEG-PBLG (1 mg / ml) and MG-132 (1.5 mg / ml) is shown.
  • Example 4 the particle size distribution of MG-132-encapsulating polymer micelles obtained from PEG-PBLG (2 mg / ml) and MG-132 (0.5 mg / ml) is shown.
  • Test Example 1 the results of measuring the tumor volume of CaSki tumor-bearing mice are shown.
  • Experimental example 1 the result of measuring the volume of the tumor of a HeLa tumor-bearing mouse is shown.
  • the result of having measured the volume of the tumor of the C33a tumor-bearing mouse in Test Example 1 is shown.
  • Test Example 1 the results of immunostaining of the treated HeLa and CaSki tumor tissues are shown.
  • Experiment 2 the result of having measured the weight gain of the CaSki cancer-bearing mouse is shown.
  • Test Example 2 the results of measuring the weight gain of a HeLa cancer-bearing mouse are shown.
  • Test Example 3 the results of measuring the fluorescence intensity of the ear skin of HeLa cancer-bearing mice administered with fluorescently labeled MG-132 alone and micelle-encapsulated fluorescently labeled MG-132 are shown.
  • the upper line is “Vessel” and the lower line is “Tissue”.
  • FIG. 22 shows an enlarged view of the range (0-600) on the vertical axis of the graph of FIG.
  • Test Example 3 the results of measuring fluorescence intensity of blood vessels and tumors of HeLa tumor-bearing mice are shown. The maximum fluorescence intensity of the drug circulating in the blood vessel is taken as 1, and each measured value is shown as relative fluorescence intensity. Each broken line is Vessel (MG132 micelle), Tissue (MG132 micelle), Vessel (MG132), and Tissue (MG132) from the top at the time point of 1000 seconds. In Test Example 3, the results of measuring the fluorescence intensity of each tissue 24 hours after intravenous injection are shown. Each bar graph has “MG132 micelle” on the right and “MG132” on the left.
  • the proteasome inhibitor is not particularly limited as long as it is a compound having proteasome inhibitory activity.
  • peptide aldehydes MG-132:
  • MG-115 Z-LLF-CHO (proteasome inhibitor II), ALLN (LLNL or MG-101), PSI (proteasome inhibitor I), Z-GPFL-CHO (proteasome inhibitor IV), Tyropeptin A, etc.); peptide boronates (Bortezomib:
  • MG-262 proteasome inhibitor IX, etc.
  • vinyl sulfones Cbz-LLL-VS, NIP-LLL-VS, NP-LLL-VS, AdaAhx 3 L 3 VS, etc.
  • lactacystin ⁇ -lactones
  • ⁇ -lactones crust- Lactacystin ⁇ -lactone, ⁇ -methylomuralide ( ⁇ -methylomuralide), proteasome inhibitor VII, proteasome inhibitor VIII, etc.
  • the polymer micelle is derived from a block copolymer having a hydrophilic segment and a hydrophobic segment.
  • Such polymeric micelles are usually of the core-shell type in which the hydrophilic segment forms the shell portion and the hydrophobic segment forms the core portion.
  • Such polymer micelles are usually micelles by hydrophobic interaction, but may be micelles by other actions.
  • “encapsulated” in a polymer micelle usually means supported on the core portion.
  • proteasome inhibitors have a hydrophobic portion, in the polymer micelle preparation method described later, a hydrophobic bond is easily generated between the hydrophobic segment of the block copolymer and is efficiently encapsulated in the polymer micelle.
  • hydrophilic segment examples include poly (ethylene glycol), polysaccharide, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, and those having a chitosan structure. From the viewpoint of stabilization of a drug in vivo, poly (ethylene glycol), polyacrylamide, polymethacrylamide, Those having a (ethylene glycol) structure are preferred.
  • the hydrophobic segment having a poly (ethylene glycol) structure can be formed by, for example, the production method described in WO96 / 32434, WO96 / 33233, and WO97 / 06202.
  • hydrophobic segment examples include those having a poly (amino acid), poly (lactide) structure, and poly (lactone) structure, and those having a poly (amino acid) are preferable from the viewpoint of interaction with a proteasome inhibitor. .
  • the block copolymer having a hydrophobic segment having poly (amino acid) is preferably represented by the following general formula (I) or (II).
  • R 1 represents a hydrogen atom or an unsubstituted or substituted linear or branched C 1 to C 12 alkyl group
  • L 1 and L 2 represent a linking group
  • R 2 represents a methylene group or an ethylene group
  • R 3 represents a hydrogen atom, a saturated or unsaturated C 1 -C 29 aliphatic carbonyl group or an arylcarbonyl group
  • R 4 represents a hydroxyl group, a saturated or unsaturated C 1 to C 30 aliphatic oxy group or an aryl-lower alkyloxy group
  • Each R 5 independently represents —OR 6 or —NHR 6 (R 6 represents a hydrogen atom, an alkyl group, a benzyl-substituted alkyl group or an aryl group);
  • m represents an integer of 4 to 2500
  • n represents an integer of 2 to 300
  • x represents an integer of 0 to 300, but x is not greater than n.
  • the linking group L 1 is not particularly limited, and is, for example, (CH 2 ) b —NH—, and b is an integer of 1 to 5. Further, the linking group L 2 is not particularly limited, and is, for example, — (CH 2 ) c —CO—, and c is an integer of 1 to 5.
  • block copolymers include, for example, a hydrophilic segment made of poly (ethylene glycol), poly ( ⁇ -alkylaspartate), poly ( ⁇ -alkylaspartate-co-aspartic acid), poly ( ⁇ -Aralkyl aspartate), poly ( ⁇ -aralkyl aspartate-co-aspartic acid), poly ( ⁇ -alkyl glutamate), poly ( ⁇ -alkyl glutamate-co-glutamic acid), poly ( ⁇ -aralkyl glutamate), poly ( ⁇ -alkylaspartamide), poly ( ⁇ -alkylaspartamide-co-aspartic acid), poly ( ⁇ -aralkylaspartamide), poly ( ⁇ -aralkylaspartamide-co-aspartic acid), poly ( ⁇ -alkylglutamide), poly ( ⁇ -alkylglutamide-co-glutami) Acid), poly (.gamma.
  • aralkyl glutamide examples include those having at least one hydrophobic segment selected from the group consisting of glutamic acid).
  • poly includes “oligo”.
  • the alkyl in the hydrophobic segment is a C 1 -C 22 linear or branched alkyl, such as methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, tert-butyl, n-pentyl, n C 1 -C 6 lower alkyl such as -hexyl, intermediate alkyl of C 7 -C 12 , and C 13 -C 22 higher alkyl such as tetradecyl, hexadecyl, octodecyl, docosanyl and the like.
  • Aralkyl may include phenyl-C 1 -C 4 alkyl, such as benzyl, optionally substituted on the benzene ring by 1 to 3 halogens or lower alkyl.
  • the block copolymer can be produced by a known method.
  • preferable production methods include the methods described in Japanese Patent No. 277530 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-352972.
  • hydrophobic segments having a poly (lactide) structure or a poly (lactone) structure include, for example, poly (lactide), poly (lactide-co-glycolide), poly ( ⁇ -caprolactone), and poly ( ⁇ -valerolactone). And poly ( ⁇ -butyrolactone). Examples of the method for producing such a hydrophobic segment include those described in WO96 / 32434, WO96 / 33233, and WO97 / 06202.
  • the amount of the proteasome inhibitor encapsulated in the polymer micelle is usually 0.1 to 0.5 mg / ml, preferably 0.3 to 0.4 mg / ml with respect to 2 mg / ml of the block copolymer.
  • the production method of the polymeric micelle encapsulating the proteasome inhibitor of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include the methods described in Japanese Patent No. 277530 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-226294. The following methods are exemplified.
  • “dispersion dissolution” means not only that the solute block copolymer and proteasome inhibitor are completely dissolved, but also solubilized, for example, in a dispersed state as a polymer micelle. It also means to do. Further, in the present specification, the “solution” may include a liquid in a dispersed state as described above.
  • a proteasome inhibitor is dissolved in a water-miscible organic solvent if necessary and mixed with an aqueous block copolymer dispersion. In some cases, it is possible to promote the encapsulation of the proteasome inhibitor into the polymer micelle by heating at the time of stirring and mixing.
  • Solvent volatilization method A water-immiscible organic solvent solution of a proteasome inhibitor and a block copolymer dispersion aqueous solution are mixed, and the organic solvent is volatilized while stirring.
  • a dialysis membrane eg, Spectrapore (fractionated molecular weight 1000)
  • Others Disperse and dissolve the proteasome inhibitor and block copolymer in a water-immiscible organic solvent, mix the resulting solution with water, and stir to form an oil-in-water (O / W) emulsion, then organic Volatilize the solvent.
  • the organic solvent is not limited as long as it can be removed by evaporation or dialysis.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMAc N-dimethylacetamide
  • NMP N-methyl-2-pyrrolidine
  • Methanol Methanol
  • ethanol propanol and the like.
  • the dialysis method is preferable in that it can control the kinetics of the association of the block copolymer, and a micelle having a narrow distribution and a small size is prepared.
  • the average particle size of the polymer micelle of the present invention is usually 50 to 200 nm, preferably 90 to 150 nm.
  • the particle size distribution index is usually 0.1 to 0.3.
  • Examples of a method for measuring the average particle size and the particle size distribution index include a method using a dynamic light scattering photometer (eg, DLS-7000DH type, manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.).
  • Polymer micelles having an average particle size of about 50 to 200 nm are 0.22 ⁇ m used in the preparation of injections (for subcutaneous injection, intravenous injection, arterial injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.) Even if it is sterilized by filtration using a filter, it is excellent in that it can be recovered in an extremely high yield and can provide an injection efficiently.
  • the solvent include water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil and the like.
  • solubilizer include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like.
  • Suitable examples of the suspending agent include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate; Examples thereof include hydrophilic polymers such as alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose.
  • Preferable examples of the isotonic agent include sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like.
  • Preferable examples of the buffer include buffer solutions such as phosphate, acetate, carbonate, citrate and the like.
  • Preferable examples of the soothing agent include benzyl alcohol.
  • Preferable examples of the preservative include paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • Preferable examples of the antioxidant include sulfite and ascorbic acid.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has an excellent proteasome inhibitory action and low toxicity.
  • the polymeric micelles constituting the pharmaceutical composition of the present invention tend to selectively and effectively accumulate in cancer by enhancing permeability of tumor blood vessels in cancer tissues and constructing an undeveloped lymphatic system. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention treats cancer (eg, solid cancer, blood cancer, etc.) of mammals (eg, human, monkey, horse, cow, pig, rabbit, rat, mouse, dog, cat, etc.). Or it is useful as a preventive agent.
  • cancer eg, solid cancer, blood cancer, etc.
  • mammals eg, human, monkey, horse, cow, pig, rabbit, rat, mouse, dog, cat, etc.
  • it is useful as a preventive agent.
  • Solid tumors include sarcomas and carcinomas, specifically fibrosarcoma, mucosal sarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma, chordoma, angiosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphatic endothelial sarcoma, lubrication Membranous, mesothelioma, Ewing tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, stomach cancer, esophageal cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell carcinoma, basal Cell cancer, adenocarcinoma, sweat gland cancer, sebaceous gland cancer, papillary cancer, papillary adenocarcinoma, sac adenocarcinoma, bone marrow cancer, bronchogenic cancer, renal cell cancer, ureteral cancer, liver cancer, bile
  • Hematological cancers include myeloma and lymphoma, specifically acute myeloid leukemia, acute promyelocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, Hodgkin disease, non-Hodgkin lymphoma Adult T-cell leukemia lymphoma, multiple myeloma and the like.
  • solid cancer is preferred in view of the ease of accumulation of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • human papillomavirus-positive cancers in which cancer is formed using the in vivo mechanism of proteasomes, specifically cervical cancer, etc. are more preferred.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When used for treatment or prevention of cancer, it can be used in combination with an existing anticancer agent.
  • the administration order of the pharmaceutical composition of the present invention and the existing anticancer agent may be simultaneous or separate.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be either before or after the administration of the existing anticancer agent, but after the expression of p53 or the like whose degradation has been enhanced in the cancer cells is recovered, the existing anticancer agent is administered. Since it is considered that the therapeutic effect is remarkable, it is preferable to administer the anticancer agent.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be applied to diseases caused by disruption of proteasome homeostasis.
  • diseases include inflammatory diseases (eg, arthritis, myocarditis, nephritis, etc.), autoimmune diseases (eg, rheumatism, type I diabetes, etc.), neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, peripheral neuropathy, etc.), etc. Can be mentioned.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be variously selected depending on the administration route and the symptoms of the patient to be treated, but is usually selected from the range of about 1 mg to 300 mg, preferably about 1 mg to 100 mg per adult. These can be administered in 1 to 3 divided doses per day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be safely administered orally or parenterally to mammals (eg, mouse, rat, rabbit, cat, dog, cow, horse, monkey, human).
  • mammals eg, mouse, rat, rabbit, cat, dog, cow, horse, monkey, human.
  • the administration method of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it provides a preventive and therapeutic effect on the above-mentioned disorder or disease.
  • parenteral administration intravenous administration, intramuscular administration, direct administration into tissue, intraperitoneal administration, intradermal administration, transdermal administration, intraarterial administration, intrathecal administration, intranasal administration, etc.
  • oral administration Can be administered.
  • the dosage form is not particularly limited, and various dosage forms such as oral preparations (granule, powder, tablet, capsule, syrup, emulsion, suspension, etc.), injection, infusion, It can be administered as an external preparation (nasal preparation, transdermal preparation, ointment, etc.).
  • DLS dynamic light scattering
  • Example 1 Polyethylene glycol (molecular weight 12000) -co-poly (benzyl aspartate) (degree of polymerization of aspartic acid 40) (esterification rate 100%) (hereinafter referred to as PEG-PBLA 12-40) was used as the block copolymer.
  • PEG-PBLA 12-40 5 mM in PBLA units
  • MG-132 (0, 1, 2, 3, 4 mM) were dissolved in DMSO, mixed, and water was gradually added to the system.
  • Example 2 PEG-PBLA 12-40 (1 mg / ml) and MG-132 (0, 0.5, 1, 1.5 mg / ml) were dissolved in DMAc, mixed, and water was gradually added to the system. It was. After confirmation of 100 nm micelle aggregation by DLS, the mixture was dialyzed against water (room temperature, 24 hours, dialysis membrane: Spectrapore (fractional molecular weight 1000), exchange 2 L of external liquid 6 times), proteasome inhibitor To obtain polymer micelles. The result of measuring the particle size distribution by DLS is shown in FIG. 6-9. Each average particle size and particle size distribution index were measured by DLS. The results are shown in Table 1 below.
  • Example 3 Polyethylene glycol (molecular weight 12000) -poly ( ⁇ -benzyl-L-glutamate) (hereinafter referred to as PEG-PBLG) (1 mg / ml) and MG-132 (0, 0.5, 1, 1.5 mg / ml) Were dissolved in DMAc, mixed, and water was gradually added to the system. After confirmation of 100 nm micelle aggregation by DLS, the mixture was dialyzed against water (room temperature, 24 hours, dialysis membrane: Spectrapore (fractional molecular weight 1000), exchange 2 L of external liquid 6 times), proteasome inhibitor To obtain polymer micelles. The results of measuring the particle size distribution by DLS are shown in FIGS. 10-13. Each average particle size and particle size distribution index were measured by DLS. The results are shown in Table 2 below.
  • Example 4 Production of MG-132-supported polymer micelle for in vivo administration
  • PEG-PBLG (2 mg / ml) and MG-132 (0.5 mg / ml) were dissolved in DMAc, mixed, and water was gradually added to the system. Added to. After confirmation of 100 nm micelle aggregation by DLS, the mixture was dialyzed against water (room temperature, 24 hours, dialysis membrane: Spectrapore (fractional molecular weight 1000), exchange 2 L of external liquid 6 times), proteasome inhibitor To obtain polymer micelles. The result of measuring the particle size distribution by DLS is shown in FIG. The average particle size was 120 nm and the particle size distribution index was 0.15.
  • the obtained polymer micelle solution was freeze-dried to a micelle concentration of 2 mg / ml, dissolved in DMSO, and dialyzed against DMSO.
  • the drug loading was measured by UV absorption (270 nm) and found to be 0.4 mg / ml (20% by weight).
  • Test example 1 (Examination of therapeutic effects on cervical cancer) Three types of tumor-bearing mice were prepared by the SCID mouse subcutaneous transplantation method: HeLa and CaSki, which are HPV-positive cervical cancer cell lines, and C33a, which is an HPV-negative cervical cancer cell line with mutations in p53.
  • MG-132 (hereinafter referred to as micelle MG-132) encapsulated in physiological saline (control), MG-132 (1 mg / kg / dose), polymer micelle (PEG-PBLA 12-40) It was intravenously injected twice from the tail vein (1 mg / kg / dose as MG-132, amount of drug solution per one time was 0.2 ml). The therapeutic effect was determined by the tumor volume (mm 3 ). Volume measurement was performed at the time of injection. The results are shown in FIGS. 15-17.
  • the tumor volume increased 5-10 times in the control with both HeLa and CaSki, and about 2 times with MG-132 alone. Increased. However, no increase in tumor volume was observed with micelle MG-132 administration.
  • FIG. 18 shows the results of immunostaining for the treated HeLa and CaSki tumor tissues. From these results, it was confirmed that micelle MG-132 administration increased the expression of multiple HPV target tumor suppressor proteins including p53.
  • Test example 2 (Examination of side effects) The side effect was examined by measuring the body weight of the mouse of Test Example 1. The results are shown in FIGS.
  • control and MG-132 administration groups gained more weight than the micelle MG-132 administration group.
  • weight gain is thought to be mainly due to tumor growth.
  • Test example 3 (Examination of pharmacokinetics) A tumor-bearing mouse of HeLa cells in which GFP is constantly expressed in histone H2B and the nucleus shines was prepared by the SCID mouse subcutaneous transplantation method. After binding a fluorescent substance (Bodipy-TR (registered trademark)) to MG-132, the fluorescent MG-132 and the fluorescent MG-132 encapsulated in the polymer micelle (PEG-PBLA 12-40) are respectively described above.
  • Tumor-bearing mice were intravenously injected via the tail vein (MG-132 concentration 0.5 mg / ml, amount of drug solution per one time 0.2 ml). In tumor and ear skin (normal tissue), the fluorescence intensity of blood vessels and tissues was measured. A confocal microscope was used to measure the fluorescence intensity. The results are shown in FIGS.
  • FIG. 22 is an enlarged view of a part of FIG.
  • FIG. 23 shows the maximum fluorescence intensity circulating through the blood vessels in unity.
  • the drug in the blood vessel was almost metabolized and disappeared in about 10 minutes with MG-132 alone, whereas the drug in the blood vessel circulated at a high concentration in the micelle-encapsulated MG-132. Subsequently, the uptake into the tumor tissue was also high.
  • the amount of drug taken into each tissue was compared by measuring the fluorescence intensity of each tissue (tumor, skin, brain, lung, muscle, liver, spleen and kidney) 24 hours after intravenous injection. The results are shown in FIG.

Abstract

　骨髄抑制などの副作用を回避し、優れたプロテアソーム阻害活性を実現し得る医薬を提供する。プロテアソームインヒビターを有効成分として含有し、該プロテアソームインヒビターが親水性セグメント及び疎水性セグメントを有するブロック共重合体からなる高分子ミセルに内包されてなる医薬組成物。

Description

プロテアソームインヒビター内包高分子ミセル
　本発明は、プロテアソームインヒビター内包高分子ミセルに関し、癌の治療分野に関する。
　細胞内で癌抑制蛋白質p53は、ユビキチンリガーゼMDM2によりユビキチン（標識蛋白質）を付加され、細胞内のプロテオソームによって分解を受ける。ARF（alternative reading frame）は、MDM2に結合する調節因子であり、ARF-MDM2-p53経路は、細胞周期制御やアポトーシスなどの癌抑制機構に深く関わっていることが、従来より知られている。また、多くの発癌関連蛋白質の転写活性因子であるNF-kBの阻害蛋白質であるI-kBの分解を、プロテアソームが担っており、NF-kBの活性化にもユビキチンプロテアソームシステムが関与していることが、知られている。
　このように、発癌に関与するプロテアソームの働きを阻害するプロテアソームインヒビターは、最近注目を集めている薬剤であるが、中でも、ボルテゾミブ(Bortezomib)（商品名ベルケード(VELCADE)）は、多発性骨髄腫に対し抗腫瘍効果が認められ、唯一臨床応用されている。また、ボルテゾミブには、多発性骨髄腫の他にも、婦人科癌領域において、ヌードマウスに移植した卵巣癌細胞株に対して抗腫瘍効果を認めたという研究や、進行癌に対して他の薬剤（PaclitaxelやCarboplatin）と組み合わせたPhase 1 studyがある(非特許文献１)。これらのボルテゾミブの抗腫瘍効果は、卵巣癌においては、おそらく前述のMDM2-p53経路を阻害することでp53の発現を増幅しアポトーシスを誘導したり、NF-kBの不活化を介したりすることによるものと考えられる。
　また、本発明者らが行ってきた子宮頚癌発癌のメカニズムの解析から、子宮頚癌の原因であるヒトパピローマウイルス（HPV）のE6癌蛋白質が、ユビキチンリガーゼE6APを介して、ユビキチンプロテアソームシステムにより、p53蛋白質など複数の癌抑制蛋白質を分解することが分かっているが、本発明者らは、上記メカニズムを解析する際、細胞株を用いた研究により、プロテアソームインヒビターが、HPV陽性の子宮頚癌組織に対し抗腫瘍効果を有し、また、HPVによって分解される癌抑制蛋白質の発現を回復させ、薬剤や放射線などの感受性が上げることを見出し、第５９回日本産婦人科学会学術講演会等において発表した。
　しかし、プロテアソームインヒビターの多くは、血中における安定性が低いため、臨床応用されておらず、また、臨床応用されているボルテゾミブであっても、血小板減少などの副作用が強いために、小児への投与が認められない等、使用上の問題点がある。
　一方、本発明者らは、薬剤の生体内送達用キャリアの材料として、ポリ（エチレングリコール）セグメントとポリアミノ酸セグメントからなるブロック共重合体を始めとする様々なブロック共重合体を開発し、かかる共重合体を用いて種々の薬物又は生理活性物質を内包した高分子ミセルを提供してきた（特許文献１～６）。
特開２００４－３５２９７２号公報 国際公開第２００６／１３２４３０号パンフレット 特開平８－１８８５４１号公報 国際公開第０２／２６２４１号パンフレット 特開平６－１０７５６０号公報 特開平６－１０７５６５号公報
Phase I trial of the proteasome inhibitor bortezomib in combination with carboplatin in patients with platinum- and taxane-resistant ovarian cancer.　Ramirez PT, Landen CN Jr, Coleman RL, Milam MR, Levenback C, Johnston TA, Gershenson DM.　Gynecol Oncol. 2008 Jan;108(1):68-71
　本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、骨髄抑制などの副作用を回避し、優れたプロテアソーム阻害活性を実現し得る医薬を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、プロテアソームインヒビターを高分子ミセルに内包させることにより、制癌活性を増強し、且つ、副作用を軽減し得ることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）プロテアソームインヒビターを有効成分として含有し、該プロテアソームインヒビターが親水性セグメント及び疎水性セグメントを有するブロック共重合体からなる高分子ミセルに内包されてなる医薬組成物。
（２）親水性セグメントが、ポリ（エチレングリコール）構造を有する、上記（１）記載の医薬組成物。
（３）ブロック共重合体が、下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される、上記（１）又は（２）記載の医薬組成物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
［上記各式中
Ｒ１は水素原子又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１～Ｃ１２アルキル基を表し、
Ｌ１、Ｌ２は連結基を表し、
Ｒ２はメチレン基又はエチレン基を表し、
Ｒ３は水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ１～Ｃ２９脂肪族カルボニル基又はアリールカルボニル基を表し、
Ｒ４は水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ１～Ｃ３０脂肪族オキシ基又はアリール－低級アルキルオキシ基を表し、
Ｒ５はそれぞれ独立して－ＯＲ６又は－ＮＨＲ６（Ｒ６は水素原子、アルキル基、ベンジル置換アルキル基又はアリール基を示す）を表し、
ｍは４～２５００の整数、ｎは２～３００の整数、ｘは０～３００の整数をそれぞれ表すが、ｘはｎより大きくないとする］
（４）疎水性セグメントが、ポリ（β－アルキルアスパルテート）、ポリ（β－アルキルアスパルテート－コ－アスパラギン酸）、ポリ（β－アラルキルアスパルテート）、ポリ（β－アラルキルアスパルテート－コ－アスパラギン酸）、ポリ（γ－アルキルグルタメート）、ポリ（γ－アルキルグルタメート－コ－グルタミン酸）、ポリ（γ－アラルキルグルタメート）、ポリ（β－アルキルアスパルタミド）、ポリ（β－アルキルアスパルタミド－コ－アスパラギン酸）、ポリ（β－アラルキルアスパルタミド）、ポリ（β－アラルキルアスパルタミド－コ－アスパラギン酸）、ポリ（γ－アルキルグルタミド）、ポリ（γ－アルキルグルタミド－コ－グルタミン酸）、ポリ（γ－アラルキルグルタミド）、ポリ（γ－アラルキルグルタミド－コ－グルタミン酸）からなる群より選ばれる少なくとも１種からなる、上記（１）～（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）癌の治療又は予防剤である、上記（１）～（４）のいずれか記載の医薬組成物。
（６）癌が子宮頸癌である、上記（５）に記載の医薬組成物。
（７）プロテアソームインヒビターを親水性セグメント及び疎水性セグメントを有するブロック共重合体からなる高分子ミセルに内包する工程を含む、生体内で安定化されるプロテアソームインヒビター製剤の製造方法。
（８）プロテアソームインヒビターを内包する、親水性セグメント及び疎水性セグメントを有するブロック共重合体からなる高分子ミセル。
（９）上記（１）～（６）のいずれかに記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、癌の治療又は予防方法。
（１０）癌が子宮頸癌である、上記（９）記載の治療又は予防方法。
　本発明の医薬組成物は、血中安定性が高く、また、高分子ミセルは腫瘍に選択的かつ効果的に集積するため、腫瘍に対して優れた治療効果を示す。さらに、高分子ミセルは骨髄に集積しないことから、本発明の医薬組成物は、通常のプロテアソームインヒビターの使用において問題となる骨髄抑制等の副作用を回避できる。
実施例１において、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０から得られた高分子ミセルの粒度分布を示す。 実施例１において、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０とＭＧ－１３２（１ｍＭ）とから得られたＭＧ－１３２内包高分子ミセルの粒度分布を示す。 実施例１において、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０とＭＧ－１３２（２ｍＭ）とから得られたＭＧ－１３２内包高分子ミセルの粒度分布を示す。 実施例１において、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０とＭＧ－１３２（３ｍＭ）とから得られたＭＧ－１３２内包高分子ミセルの粒度分布を示す。 実施例１において、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０とＭＧ－１３２（４ｍＭ）とから得られたＭＧ－１３２内包高分子ミセルの粒度分布を示す。 実施例２において、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０（１ｍｇ／ｍｌ）から得られた高分子ミセルの粒度分布を示す。 実施例２において、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０（１ｍｇ／ｍｌ）とＭＧ－１３２（０．５ｍｇ／ｍｌ）とから得られたＭＧ－１３２内包高分子ミセルの粒度分布を示す。 実施例２において、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０（１ｍｇ／ｍｌ）とＭＧ－１３２（１ｍｇ／ｍｌ）とから得られたＭＧ－１３２内包高分子ミセルの粒度分布を示す。 実施例２において、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０（１ｍｇ／ｍｌ）とＭＧ－１３２（１．５ｍｇ／ｍｌ）とから得られたＭＧ－１３２内包高分子ミセルの粒度分布を示す。 実施例３において、ＰＥＧ－ＰＢＬＧ（１ｍｇ／ｍｌ）から得られた高分子ミセルの粒度分布を示す。 実施例３におけるＰＥＧ－ＰＢＬＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とＭＧ－１３２（０．５ｍｇ／ｍｌ）とから得られたＭＧ－１３２内包高分子ミセルの粒度分布を示す。 実施例３において、ＰＥＧ－ＰＢＬＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とＭＧ－１３２（１ｍｇ／ｍｌ）とから得られたＭＧ－１３２内包高分子ミセルの粒度分布を示す。 実施例３において、ＰＥＧ－ＰＢＬＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とＭＧ－１３２（１．５ｍｇ／ｍｌ）とから得られたＭＧ－１３２内包高分子ミセルの粒度分布を示す。 実施例４において、ＰＥＧ－ＰＢＬＧ（２ｍｇ／ｍｌ）とＭＧ－１３２（０．５ｍｇ／ｍｌ）とから得られたＭＧ－１３２内包高分子ミセルの粒度分布を示す。 試験例１において、CaSkiの担癌マウスの腫瘍の体積を測定した結果を示す。 試験例１において、HeLaの担癌マウスの腫瘍の体積を測定した結果を示す。 試験例１において、C33aの担癌マウスの腫瘍の体積を測定した結果を示す。 試験例１において、治療後のHeLa、CaSki腫瘍組織について、免疫染色した結果を示す。 試験例２において、CaSkiの担癌マウスの体重増加を測定した結果を示す。 試験例２において、HeLaの担癌マウスの体重増加を測定した結果を示す。 試験例３において、蛍光標識ＭＧ－１３２単体およびミセル内包蛍光標識ＭＧ－１３２を投与したHeLaの担癌マウスの耳の皮膚の蛍光強度を測定した結果を示す。いずれのグラフも、上の折れ線が「Vessel」で、下の折れ線が「Tissue」である。 図２１のグラフの縦軸のレンジ（０－６００）の拡大図を示す。いずれのグラフも、上の折れ線が「Vessel」で、下の折れ線が「Tissue」である。 試験例３において、HeLaの担癌マウスの血管および腫瘍の蛍光強度を測定した結果を示す。血管を循環する薬剤の最高蛍光強度を１として、各測定値を相対蛍光強度で示す。各折れ線は、1000秒の時点において、上から、Vessel(MG132 micelle)、Tissue(MG132 micelle)、Vessel(MG132)、Tissue(MG132)である。 試験例３において、静注後２４時間における各組織の蛍光強度を測定した結果を示す。各棒グラフは、右が「MG132 micelle」で、左が「MG132」である。
　本発明において、プロテアソームインヒビターは、プロテアソーム阻害活性を有する化合物であれば特に限定されず、例えば、ペプチドアルデヒド類（ＭＧ－１３２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
ＭＧ－１１５、Z-LLF-CHO（プロテアソームインヒビターII）、ALLN(LLNL又はＭＧ－１０１)、PSI(プロテアソームインヒビターＩ)、Z-GPFL-CHO（プロテアソームインヒビターIV）、TyropeptinA等）；ペプチドボロネイト類（ボルテゾミブ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
ＭＧ－２６２、プロテアソームインヒビターIX等）、ビニルスルホン類（Cbz-LLL-VS、NIP-LLL-VS、NP-LLL-VS、AdaAhx3L3VS等）；ラクタシスチン；β－ラクトン類（クラスト－ラクタシスチンβ－ラクトン、α－メチルオムラリド（α－methylomuralide）、プロテアソームインヒビターVII、プロテアソームインヒビターVIII等）；エポキソミシン（Epoxomicin）等が挙げられる。
　本発明において、高分子ミセルは、親水性セグメント及び疎水性セグメントを有するブロック共重合体に由来するものである。かかる高分子ミセルは、通常、親水性セグメントがシエル部分を、疎水性セグメントがコア部分を形成するコア－シエル型である。また、かかる高分子ミセルは、通常、疎水的相互作用によりミセル化するものであるが、他の作用によってミセル化するものであってもよい。本発明において、高分子ミセルに「内包」されるとは、通常、上記コア部分に担持されることをいう。また、プロテアソームインヒビターは、疎水性部分を有するので、後述する高分子ミセルの調製方法において、ブロック共重合体の疎水性セグメントとの間で疎水結合を生じやすく、効率的に高分子ミセルに内包される。
　親水性セグメントは、ポリ（エチレングリコール）、ポリサッカリド、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、キトサン構造を有するものがあげられるが、生体内での薬物の安定化の観点から、ポリ（エチレングリコール）構造を有するものが好ましい。ポリ（エチレングリコール）構造を有する疎水性セグメントは、例えば、ＷＯ９６／３２４３４、ＷＯ９６／３３２３３、ＷＯ９７／０６２０２に記載の製造法によって形成し得る。
　疎水性セグメントは、例えば、ポリ（アミノ酸）、ポリ（ラクチド）構造、ポリ（ラクトン）構造を有するものが挙げられるが、プロテアソームインヒビターとの相互作用の観点から、ポリ（アミノ酸）を有するものが好ましい。
　疎水性セグメントがポリ（アミノ酸）を有するブロック共重合体は、下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）により示されるものが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
［上記各式中
Ｒ１は水素原子又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１～Ｃ１２アルキル基を表し、
Ｌ１、Ｌ２は連結基を表し、
Ｒ２はメチレン基又はエチレン基を表し、
Ｒ３は水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ１～Ｃ２９脂肪族カルボニル基又はアリールカルボニル基を表し、
Ｒ４は水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ１～Ｃ３０脂肪族オキシ基又はアリール－低級アルキルオキシ基を表し、
Ｒ５はそれぞれ独立して－ＯＲ６又は－ＮＨＲ６（Ｒ６は水素原子、アルキル基、ベンジル置換アルキル基又はアリール基を示す）を表し、
ｍは４～２５００の整数、ｎは２～３００の整数、ｘは０～３００の整数をそれぞれ表すが、ｘはｎより大きくないとする］
　連結基Ｌ１は特に限定されるものではないが、例えば、（ＣＨ２）ｂ－ＮＨ－であり、かつｂは１～５の整数である。また、連結基Ｌ２も特に限定されるものではないが、例えば、－（ＣＨ２）ｃ－ＣＯ－であり、かつｃは１～５の整数である。
　さらに好適なブロック共重合体としては、例えば、ポリ（エチレングリコール）からなる親水性セグメントと、ポリ（β－アルキルアスパルテート）、ポリ（β－アルキルアスパルテート－コ－アスパラギン酸）、ポリ（β－アラルキルアスパルテート）、ポリ（β－アラルキルアスパルテート－コ－アスパラギン酸）、ポリ（γ－アルキルグルタメート）、ポリ（γ－アルキルグルタメート－コ－グルタミン酸）、ポリ（γ－アラルキルグルタメート）、ポリ（β－アルキルアスパルタミド）、ポリ（β－アルキルアスパルタミド－コ－アスパラギン酸）、ポリ（β－アラルキルアスパルタミド）、ポリ（β－アラルキルアスパルタミド－コ－アスパラギン酸）、ポリ（γ－アルキルグルタミド）、ポリ（γ－アルキルグルタミド－コ－グルタミン酸）、ポリ（γ－アラルキルグルタミド）、ポリ（γ－アラルキルグルタミド－コ－グルタミン酸）からなる群より選ばれる少なくとも１種の疎水性セグメントとを有するものが挙げられる。なお、本明細書において「ポリ」なる接頭語は、「オリゴ」を包含する。
　上記疎水性セグメントにおけるアルキルとしては、Ｃ１－Ｃ２２の直鎖もしくは分枝のアルキルであり、メチル、エチル、ｎ－プロピル、iso－プロピル、ｎ－ブチル、tert－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル等のＣ１－Ｃ６低級アルキル、さらにＣ７－Ｃ１２の中級アルキル、また、テトラデシル、ヘキサデシル、オクトデシル、ドコサニル等のＣ１３－Ｃ２２の高級アルキルが挙げられる。これらの基は、場合により、１以上のハロゲン（例えば、フッ素、塩基、臭素）で置換されていてもよく、また、中～高級アルキルにあっては、１個の水酸基で置換されていてもよい。アラルキルとしては、フェニル－Ｃ１－Ｃ４アルキル、例えばベンジルを挙げることができ、場合によって、ベンゼン環上で１～３個のハロゲン又は低級アルキルによって置換されていてもよい。
　上記ブロック共重合体は、公知の方法によって製造することができる。好ましい製造方法として、例えば、特許第２７７５３０号公報、特開２００４－３５２９７２号公報に記載の方法が挙げられる。
　また、ポリ（ラクチド）構造、ポリ（ラクトン）構造を有する疎水性セグメントは、例えば、ポリ（ラクチド）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）、ポリ（ε－カプロラクトン）、ポリ（δ－バレロラクトン）及びポリ（γ－ブチロラクトン）等が挙げられる。かかる疎水性セグメントの製造方法は、例えば、ＷＯ９６／３２４３４、ＷＯ９６／３３２３３、ＷＯ９７／０６２０２に記載のものが挙げられる。
　高分子ミセルに内包されるプロテアソームインヒビターの量は、ブロック共重合体２ｍｇ／ｍｌに対し、通常、０．１～０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、０．３～０．４ｍｇ／ｍｌである。
　本発明のプロテアソームインヒビターを内包した高分子ミセルの製造方法は、特に制限されるものでないが、例えば、特許第２７７５３０号公報、特開２００１－２２６２９４号公報に記載の方法が挙げられ、具体的には、下記の方法等が例示される。なお、本明細書において「分散溶解」するとは、溶質であるブロック共重合体とプロテアソームインヒビターとを、完全に溶解した状態することだけでなく、可溶化され、例えば、高分子ミセルとして分散状態にすることも意味する。また、本明細書において「溶液」とは、上記のような分散状態の液をも包含することがある。
ａ）撹拌による薬物の封入法
　プロテアソームインヒビターを、必要により水混和性の有機溶媒に溶解して、ブロック共重合体分散水溶液と撹拌混合する。なお、撹拌混合時に加熱することによりプロテアソームインヒビターの高分子ミセル内への封入を促進できる場合もある。
ｂ）溶媒揮散法
　プロテアソームインヒビターの水非混和性の有機溶媒溶液と、ブロック共重合体分散水溶液とを混合し、撹拌しながら有機溶媒を揮散させる。
ｃ）透析法
　水混和性の有機溶媒にプロテアソームインヒビター及びブロック共重合体を分散溶解した後、得られる溶液を透析膜（例、スペクトラポア（分画分子量１０００））を用いて、緩衝液及び／又は水に対して透析する。
ｄ）その他
　水非混和性の有機溶媒にプロテアソームインヒビター及びブロック共重合体を分散溶解し、得られる溶液を水と混合し、撹拌して水中油（Ｏ／Ｗ）型エマルジョンを形成し、次いで有機溶媒を揮散させる。
　有機溶媒は、蒸発または透析により除去可能なものであれば制限されないが、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ジクロロメタン、酢酸、Ｎ－メチル－２－ピロリジン（ＮＭＰ）、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。
　上記調製方法のうち、透析法が、ブロック共重合体の会合のキネティックスを制御でき、分布の狭く、サイズの小さいミセルが調製される点で、好ましい。
　本発明の高分子ミセルの平均粒径は、通常、５０～２００ｎｍ、好ましくは９０～１５０ｎｍである。また、粒度分布指数は、通常、０．１～０．３である。平均粒径及び粒度分布指数の測定方法としては、例えば、動的光散乱光度計（例、大塚電子（株）社製、ＤＬＳ－７０００ＤＨ型）を用いる方法が挙げられる。平均粒子径が約５０～２００ｎｍである高分子ミセルは、注射剤（皮下注射用、静脈注射用、動脈注射用、筋肉注射用、腹腔内注射用等）の調製に際して使用される０．２２μｍのフィルターを用いて除菌濾過しても、極めて高収率で回収し得、注射剤が効率よく提供できる点で優れている。
　本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体と配合し、静脈、皮下、筋肉内注射剤として非経口的に投与することができる。その際、必要により、自体公知の方法によって、凍結乾燥物とすることも可能である。薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤などの製剤添加物を用いることもできる。溶剤の好適な例としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。溶解補助剤の好適な例としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤の好適な例としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤;例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。等張化剤の好適な例としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ－マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤の好適な例としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えば、ベンジルアルコールなどが挙げられる。防腐剤の好適な例としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤の好適な例としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、優れたプロテアソーム阻害作用を有し、かつ、毒性は低い。本発明の医薬組成物を構成する高分子ミセルは、癌組織における腫瘍血管の透過性の亢進と未発達なリンパ系の構築によって、癌に選択的かつ効果的に集積する傾向がある。従って、本発明の医薬組成物は、哺乳動物（例、ヒト、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、ネコなど）の癌（例、固形癌、血液癌など）の治療又は予防剤として有用である。
　固形癌としては、肉腫及び癌腫が包含され、具体的には、繊維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢腺癌、骨髄癌、気管支原性癌、腎細胞癌、尿管癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮内膜癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、骨髄芽種、頭蓋咽頭癌、喉頭癌、舌癌、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、腹膜播腫、奇形腫、神経芽細胞腫、髄芽腫及び網膜芽細胞腫などが挙げられる。
　血液癌としては、骨髄腫及びリンパ腫が包含され、具体的には、急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、Hodgkin病、非Hodgkinリンパ腫、成人T細胞白血病リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられる。
　このうち、本発明の医薬組成物の集積のしやすさを考慮すると、固形癌が好ましい。中でも、生体内のプロテアソームの機構を利用して癌が形成されるヒトパピローマウイルス陽性の癌、具体的には子宮頚癌などがより好ましい。
　本発明の医薬組成物を癌の治療又は予防に用いる場合、既存の抗癌剤と併用することも可能である。併用する場合、本発明の医薬組成物と既存の抗癌剤との投与順序は、同時又は別々であってもよい。別々の場合、本発明の医薬組成物は、既存の抗癌剤の投与前又は投与後のいずれでもよいが、癌細胞で分解が亢進されたｐ53等の発現を回復させた後に、既存の抗癌剤を投与することが治療効果が著しいと考えられるので、抗癌剤の投与前が好ましい。
　また、本発明の医薬組成物は、プロテアソームによる恒常性が破綻したことに起因する疾患にも適用することができる。かかる疾患としては、炎症性疾患（例、関節炎、心筋炎、腎炎など）、自己免疫疾患（例、リウマチ、Ｉ型糖尿病など）、神経変性疾患（例、アルツハイマー病、末梢神経障害など）などが挙げられる。
　本発明の医薬組成物の１日投与量は、投与経路、治療すべき患者の症状により種々選択できるが、通常、成人１人あたり、約１ｍｇ～３００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ～１００ｍｇの範囲から選択でき、これらを１日１～３回に分けて投与される。
　本発明の医薬組成物は、哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、サル、ヒト）に対して、経口的あるいは非経口的に安全に投与することができる。
　本発明の医薬組成物の投与方法としては、上記障害又は疾患に対する予防的及び治療的な効果が得られる経路であれば特に限定されない。例えば、非経口的投与（静脈内投与、筋肉内投与、組織内直接投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、動脈内投与、髄液内投与、鼻腔内投与など）または経口投与により投与することができる。また、剤型としても特に制限されることなく、各種投与剤型、例えば、経口剤（顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤など）、注射剤、点滴剤、外用剤（経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤など）として投与することが可能である。
　以下に実施例及び試験例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　粒度分布、平均粒径及び粒度分布指数は、動的光散乱（以下、ＤＬＳという）により測定した。なお、ＤＬＳは、Zetasizer Nano ZS (Malvem Instruments Ltd., Malvem, UK)を用いて、２５℃で行った。
実施例１
　ブロックコポリマーには、ポリエチレングリコール（分子量１２０００）－コ－ポリ（アスパラギン酸ベンジルエステル）（アスパラギン酸重合度４０）（エステル化率１００％）（以下、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０という）を用いた。ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０（ＰＢＬＡ単位で５ｍＭ）とＭＧ－１３２（０、１、２、３、４ｍＭ）とを、それぞれＤＭＳＯに溶解した後、混合し、水を徐々に系に加えた。ＤＬＳにより１００ｎｍのミセルの凝集が確認された後、混合物を水に対して透析し（室温、２４時間、透析膜：スペクトラポア（分画分子量１０００）、外液２Ｌを６回交換）、プロテアソームインヒビターを内包した高分子ミセルを得た。ＤＬＳにより粒度分布を測定した結果を、図１－５に示す。
実施例２
　ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０（１ｍｇ／ｍｌ）とＭＧ－１３２（０、０．５、１、１．５ｍｇ／ｍｌ）とを、それぞれＤＭＡｃに溶解した後、混合し、水を徐々に系に加えた。ＤＬＳにより１００ｎｍのミセルの凝集が確認された後、混合物を水に対して透析し（室温、２４時間、透析膜：スペクトラポア（分画分子量１０００）、外液２Ｌを６回交換）、プロテアソームインヒビターを内包した高分子ミセルを得た。ＤＬＳにより粒度分布を測定した結果を、図６－９に示す。
　また、ＤＬＳにより、それぞれの平均粒径及び粒度分布指数を測定した。結果を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例３
　ポリエチレングリコール（分子量１２０００）－ポリ（γ－ベンジル－Ｌ－グルタメート）（以下、ＰＥＧ－ＰＢＬＧという）（１ｍｇ／ｍｌ）とＭＧ－１３２（０、０．５、１、１．５ｍｇ／ｍｌ）とを、それぞれＤＭＡｃに溶解した後、混合し、水を徐々に系に加えた。ＤＬＳにより１００ｎｍのミセルの凝集が確認された後、混合物を水に対して透析し（室温、２４時間、透析膜：スペクトラポア（分画分子量１０００）、外液２Ｌを６回交換）、プロテアソームインヒビターを内包した高分子ミセルを得た。ＤＬＳにより粒度分布を測定した結果を、図１０－１３に示す。
　また、ＤＬＳにより、それぞれの平均粒径及び粒度分布指数を測定した。結果を下記表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例４
生体内投与用ＭＧ－１３２担持高分子ミセルの製造
　ＰＥＧ－ＰＢＬＧ（２ｍｇ／ｍｌ）とＭＧ－１３２（０．５ｍｇ／ｍｌ）とを、それぞれＤＭＡｃに溶解した後、混合し、水を徐々に系に加えた。ＤＬＳにより１００ｎｍのミセルの凝集が確認された後、混合物を水に対して透析し（室温、２４時間、透析膜：スペクトラポア（分画分子量１０００）、外液２Ｌを６回交換）、プロテアソームインヒビターを内包した高分子ミセルを得た。ＤＬＳにより粒度分布を測定した結果を、図１４に示す。平均粒径は、１２０ｎｍ、粒度分布指数０．１５であった。
　また、得られた高分子ミセル溶液を、凍結乾燥してミセル濃度を２ｍｇ／ｍｌとした後、ＤＭＳＯに溶解し、ＤＭＳＯに対して透析した。ＵＶ吸収（２７０ｎｍ）により、薬物充填量を測定したところ、０．４ｍｇ／ｍｌ（２０重量％）であった。
試験例１
（子宮頸癌に対する治療効果についての検討）
　SCIDマウス皮下移植法にて、HPV陽性の子宮頚癌細胞株であるHeLaとCaSki、p53に変異があるHPV陰性の子宮頚癌細胞株であるC33aの、３種の担癌マウスを作製した。それぞれに生理食塩水(control)、ＭＧ－１３２（1mg/kg/dose）、高分子ミセル（ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０）に内包されたＭＧ－１３２（以下、ミセルＭＧ－１３２という）を、週２回尾静脈より静注（ＭＧ－１３２として1mg/kg/dose、１回当たりの薬液量は０．２ｍｌ）した。治療効果は、腫瘍の体積（ｍｍ３）により判定した。体積の計測は、注射時に行った。結果を図１５－１７に示す。
　図１５、１６に示される結果から明らかなとおり、約1ヶ月の治療期間後、HeLa、CaSki共にcontrolでは腫瘍体積が最初の５－１０倍に増大し、ＭＧ－１３２単剤投与では約２倍に増大した。しかし、ミセルＭＧ－１３２投与では腫瘍体積の増大を認めなかった。
　また、図１７に示される結果から明らかなとおり、ＨＰＶ陰性のC33aにおいて、ＭＧ－１３２単剤投与では、controlとほぼ同様の腫瘍増大を認めたが、ミセルＭＧ－１３２投与では、腫瘍体積は増大したものの、ＭＧ－１３２単剤の５０％程度の増大であった。すなわち、ＭＧ－１３２単剤投与とミセルＭＧ－１３２投与とでは、治療経過に有意な差を認めた。これは、ＭＧ－１３２をミセル化し、腫瘍細胞内に効率よくプロテアソームインヒビターを到達させたことにより、ＭＧ－１３２単剤にはない効果が得られたことを示す。ＨＰＶ陰性のC33aのp53変異腫瘍に対する該効果は、子宮頸癌以外の他の多くの癌腫に対するミセルＭＧ－１３２の有用性を示すと、考えられる。
　治療後のHeLa、CaSki腫瘍組織について、それぞれ免疫染色した結果を、図１８に示す。かかる結果より、ミセルＭＧ－１３２投与において、p53をはじめとする複数のＨＰＶターゲット癌抑制蛋白質の発現増加を確認した。
試験例２
（副作用についての検討）
　副作用の検討は、試験例１のマウスの体重を測定することにより行った。結果を図１９、２０に示す。
　副作用は、いずれも容認可能範囲内であると考えられたが、図１９、２０に示される結果から明らかなとおり、ミセルＭＧ－１３２投与群では腫瘍が縮小しているにも関わらず、腫瘍を含めたマウス全体の体重が多い傾向にあった。これは、ＭＧ－１３２の副作用が、ミセル化により軽減されたことを示すと考えられる。controlの無治療マウス群とミセルＭＧ－１３２投与群との比較は、腫瘍の増大に伴う体重増加の寄与率を測定できないので有意差は得られなかったが、ミセルＭＧ－１３２投与群において、腫瘍の縮小による体重の減少を上回る体重の増加が観察され、このことからも、プロテアソームインヒビターによる体重減少の副作用が軽減していることが示唆される。
　なお、C33aでは、controlやＭＧ－１３２投与群の方が、ミセルＭＧ－１３２投与群より、体重が増加した。しかし、かかる体重増加は、主に腫瘍増大によるものと考えられる。
試験例３
（体内動態の検討）
　SCIDマウス皮下移植法にて、ヒストンH2BにGFPを恒常的に発現し核が光るHeLa細胞の担癌マウスを作製した。ＭＧ－１３２に蛍光物質（Bodipy-TR（登録商標））を結合させた後、当該蛍光ＭＧ－１３２および高分子ミセル（ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１２－４０）に内包された蛍光ＭＧ－１３２を、それぞれ前記担癌マウスに尾静脈より静注した（ＭＧ－１３２濃度０．５ｍｇ／ｍｌ、１回当たりの薬液量は０．２ｍｌ）。腫瘍および耳の皮膚（正常組織）において、血管と組織の蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定には共焦点顕微鏡を使用した。結果を図２１～２３に示す。尚、図２２は、図２１の一部を拡大表示したものである。また、図２３は血管を循環する最高蛍光強度を１に揃えて示した。
　図２１に示す結果から明らかなとおり、ＭＧ－１３２単体では投与後数十分で薬物が血管内から殆ど消失したのに対し、ミセル内包ＭＧ－１３２では血管内の循環を保ち続けた。更に、ミセル内包ＭＧ－１３２は、血管から組織への染み出しが殆どなく、血管内濃度と組織間の蛍光強度差が持続することが示された（図２２）。
　尚、本来、皮膚や腫瘍等の組織は（図２１及び２２では数値として２００前後の）自家蛍光を有する。
　図２３に示す結果から明らかなとおり、ＭＧ－１３２単体では１０分ほどで血管内の薬物が殆ど代謝されて消失したのに対し、ミセル内包ＭＧ－１３２では血管内の薬物が高濃度で循環し続け、腫瘍組織への取込みも高濃度であった。
　また、静注後２４時間における各組織（腫瘍、皮膚、脳、肺、筋、肝臓、脾臓および腎臓）の蛍光強度を測定することにより、各組織への薬物の取込量を比較した。結果を図２４に示す。
　図２４に示す結果から明らかなとおり、腫瘍組織では、ミセル内包ＭＧ－１３２は、静注後２４時間においても高濃度で滞留していた。これに対し、正常組織（皮膚、脳、肺、筋）では、ミセル内包ＭＧ－１３２の濃度は、ほぼ排泄しきっているＭＧ－１３２単体と殆ど変わらなかった。代謝臓器（肝臓および腎臓）で、ミセル内包ＭＧ－１３２が高濃度であるのは、ミセル内包ＭＧ－１３２が血管内にまだ多く循環していることを示す。
　これらの結果から、本発明の医薬組成物は癌に選択的かつ効果的に集積する傾向があることが示唆された。
　本出願は、日本で出願された特願２００９－０４６６５２（出願日：２００９年２月２７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (8)

  1. 　プロテアソームインヒビターを有効成分として含有し、該プロテアソームインヒビターが、ポリ（エチレングリコール）構造を有する親水性セグメント及び疎水性セグメントを有し、下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表されるブロック共重合体からなる高分子ミセルに内包されてなる医薬組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［上記各式中
    Ｒ１は水素原子又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１～Ｃ１２アルキル基を表し、
    Ｌ１、Ｌ２は連結基を表し、
    Ｒ２はメチレン基又はエチレン基を表し、
    Ｒ３は水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ１～Ｃ２９脂肪族カルボニル基又はアリールカルボニル基を表し、
    Ｒ４は水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ１～Ｃ３０脂肪族オキシ基又はアリール－低級アルキルオキシ基を表し、
    Ｒ５はそれぞれ独立して－ＯＲ６又は－ＮＨＲ６（Ｒ６は水素原子、アルキル基、ベンジル置換アルキル基又はアリール基を示す）を表し、
    ｍは４～２５００の整数、ｎは２～３００の整数、ｘは０～３００の整数をそれぞれ表すが、ｘはｎより大きくないとする］
  2. 　疎水性セグメントが、ポリ（β－アルキルアスパルテート）、ポリ（β－アルキルアスパルテート－コ－アスパラギン酸）、ポリ（β－アラルキルアスパルテート）、ポリ（β－アラルキルアスパルテート－コ－アスパラギン酸）、ポリ（γ－アルキルグルタメート）、ポリ（γ－アルキルグルタメート－コ－グルタミン酸）、ポリ（γ－アラルキルグルタメート）、ポリ（β－アルキルアスパルタミド）、ポリ（β－アルキルアスパルタミド－コ－アスパラギン酸）、ポリ（β－アラルキルアスパルタミド）、ポリ（β－アラルキルアスパルタミド－コ－アスパラギン酸）、ポリ（γ－アルキルグルタミド）、ポリ（γ－アルキルグルタミド－コ－グルタミン酸）、ポリ（γ－アラルキルグルタミド）、ポリ（γ－アラルキルグルタミド－コ－グルタミン酸）からなる群より選ばれる少なくとも１種からなる、請求項１記載の医薬組成物。
  3. 　癌の治療又は予防剤である、請求項１又は２記載の医薬組成物。
  4. 　癌が子宮頸癌である、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 　プロテアソームインヒビターを親水性セグメント及び疎水性セグメントを有するブロック共重合体からなる高分子ミセルに内包する工程を含む、生体内で安定化されるプロテアソームインヒビター製剤の製造方法。
  6. 　プロテアソームインヒビターを内包する、親水性セグメント及び疎水性セグメントを有するブロック共重合体からなる高分子ミセル。
  7. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、癌の治療又は予防方法。
  8. 　癌が子宮頸癌である、請求項７記載の治療又は予防方法。
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