KR20080104928A - 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 항암제 - Google Patents
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Abstract
사슬 말단 기능성화된 중합체, 산화철 등의 조영물질 및 독소루비신 또는 약제학적으로 허용되는 그 염 등의 화학요법제를 포함하는 항암제로서 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 것을 특징으로 하며, 독소루비신의 심장 독성 부작용이 현저히 감소되고 암 부위로의 타겟팅 기능이 우수하여 항암 효과를 현저히 향상시킬 수 있으며, 동시에 MRI 조영제로서 암의 진단 및 병기의 모니터링이 가능한 항암제가 제공된다. 특히 고형암 진단 및 치료에 우수하며 원발성 암 뿐만 아니라 전이성 암의 진단 및 치료를 동시에 효과적으로 수행할 수 있다.
폴리에틸렌 옥사이드, 메톡시 폴리에틸렌글리콜, 트리멜리틱 안히드라이드, 엽산, 독소루비신, 산화철, 항암, 표적, 타겟팅, 서방형, 독성, 고형암, 원발성암, 전이암
Description
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 고분자 마이셀형 항암제의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 PEO-TMA-FA 중합체의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 PEO-TMA-FA 중합체의 FT-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 PEO-TMA-FA 중합체의 GPC 곡선을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 개질된 mPEG의 NMR 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 mPEG-TMA의 NMR 스펙트럼이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 mPEG-TMA-FA의 NMR 스펙트럼이다.
도 8a 내지 도 8c는 본 발명의 일실시예들에 따라 제조된 고분자 마이셀형 조영제 및 항암제의 구조를 cryo-TEM (FEI Co. (USA)의 BIO-TEM (Biological Transmission Electron Microscopy: 생물전용 투과전자현미경, 모델명: Tecnai G2 Spirit))을 사용하여 측정한 결과를 나타내는 사진이다.
도 9a 내지 도 9d는 본 발명의 일실시예에 따른 고분자 마이셀형 조영제의 조영 효과를 나타내는 사진이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 고분자 마이셀형 항암제의 세포독성시험을 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 고분자 마이셀형 항암제의 세포유입실험을 나타내는 그래프이다.
도 12a 및 도 12b는 고분자 마이셀형 항암제 투여 후 시간에 따른 혈장농도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 13a 및 도 13b는 고분자 마이셀형 항암제 투여 후 각 장기에 약물이 분포되는 정도를 측정하는 바이오디스트리뷰션(Biodistribution) 실험 결과를 나타낸다.
도 14a는 독소루비신의 특성 피크를, 도 14b는 본 발명의 일실시예에 따른 고분자 마이셀형 항암제의 HPLC 피크를 나타낸다.
도 15는 용매로서 DMSO만을 사용한 경우와 DMSO+물의 혼합용매를 사용한 경우에 있어 봉입율의 차이를 나타내는 그래프이다.
도 16a 및 도 16b는 래트에 고분자 마이셀형 항암제를 투여한 후에 종양의 성장을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 16c 및 도 16d는 래트에 고분자 마이셀형 항암제를 투여한 후에 종양의 성장을 촬영한 사진이다.
본 발명은 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 조영제 및 항암제에 관한 것이다. 더 구체적으로 사슬 말단 기능성화된 중합체, 산화철 등의 조영물질 및 독소루비신 또는 약제학적으로 허용되는 그 염 등의 화학요법제를 포함하는 마이셀 형태의 나노입자인 항암제로서 암을 진단함과 동시에 효과적으로 암을 치료하면서도 부작용이 현저히 감소된 조영제 및 항암제에 관한 것이다.
일반적으로 생체내로 약물을 전달하기 위한 전달체로 사용되는 고분자는 생체적으로 합성되거나 생체분해성 성질이 요구된다. 예를 들어 PLGA와 같은 고분자는 생체내에서 분해되어 락트산과 글리콜산으로 분해되어 인체에 아무런 해가 없다. 그러므로 생체분해성 고분자를 이용하여 약물전달체를 만들게 되면 여러 가지 약물에 대해 지속적으로 방출효과를 기대할 수 있다. 특히 일정한 시간을 주기로 투약해야만 일정한 혈중농도를 유지하게 되어 약물의 효과가 나타나는 약물의 경우 생체분해성 고분자로 만든 약물전달체에 약물이 봉입되게 되면 고분자 담체의 분해에 따라 약물이 계속적으로 방출되므로 이러한 서방형 제제가 다양한 약물에 응용되고 있다. 이러한 방출기작을 가진 담체에는 미립구 (microsphere), 나노입자 (nanoparticle), 그리고 마이셀 (micelle) 등이 있다.
나노입자는 입자의 크기가 수 nm에서 수백 nm 크기의 넓은 표면적을 가진 콜로이드 상의 불균일 분산입자 일종으로 지금까지 수많은 연구에 의하여 나노입자의 제조, 특성규명, 약물봉입에 관한 연구가 이루어져 약물전달체로서의 가능성이 충 분히 입증되었다. 나노입자가 인체에 투입될 때는 주사, 경구, 피부 등 다양한 방법을 통해 전달되며 이때의 약물의 분포는 조금씩 다르게 나타난다. 그 중 하나는 콜로이드 분산입자인 나노입자를 이용한 약물전달체이다.
고분자 마이셀은 약물전달 시스템에 있어 촉망되는 전달체이다. 보통 양쪽성 블록공중합체 고분자로 구성된 블록공중합 고분자 마이셀은 화학요법제와 같은 소수성 약제들의 전달체로 사용되었다 (Y. Kakizawa and K. kataoka, Drug. Del. Rev., 54(2), 203-222 (2002)). 하나의 고분자 마이셀은 수백 개의 블록 고분자들로 구성되어 있으며 직경이 20~50 nm이다. 이들은 두 개의 원형 부분을 가졌는데 밀집하게 채워진 소수성 블록의 중심과 친수성의 껍질 부위이다.
현재까지 사용되고 있는 항암치료를 위한 화학요법제의 대표적인 예는 독소루비신 (Doxorubicin) 또는 아드리아마이신 (Adriamycin), 시스플라틴 (Cisplatin), 탁솔 (Taxol), 5-fluorouracil 등이 있으며 암치료를 위한 화학치료법으로 광범위하게 사용되고 있다. 하지만 치료 가능한 정도의 양만 투여해도 환자가 심한 고통을 느끼게 된다. 이러한 증상의 이유는 화학 요법제가 암세포에만 작용하는 것이 아니고 일반세포에도 작용하기 때문이다.
이러한 문제를 해결하기 위해 나노입자를 이용하여 화학요법제를 투여하면 수십에서 수백 nm에 이르는 특징적인 입자의 크기 때문에 상대적으로 혈관 내벽 세포 연접이 느슨한 암세포 조직에 특이적으로 전달되며, 세포 연접이 조밀한 일반 세포에는 잘 투과할 수 없게 된다. 따라서 이러한 원리를 이용하여 화학 요법제를 투여하면 화학 요법제의 비특이성을 물리적으로 극복할 수 있다.
한편 약물로서 화학요법제를 포함하는 기존의 많은 약물전달체의 문제점 중의 하나는 사용한 화학요법제가 지속적으로 방출되지 않는다는 점이다. 즉 종래의 약물전달체의 경우에 초기에는 담체의 표면에 있는 화학요법제가 확산의 형태로 방출되어 초기 방출량이 상당히 높은 반면, 시간이 지날수록 방출량이 점점 줄어들기 때문에 혈중농도를 일정하게 유지시키는데 문제가 발생하게 된다.
그 이외도 전달체 내에 다량의 화학요법제를 봉입해야 하는 바, 다량의 화학요법제가 사용됨으로써 이를 이용한 약물전달체의 제제화 과정이나 기타 조제 과정에서 소실율이 높기 때문에 전달체를 제조한 후 전달체 내에 존재하는 화학요법제의 양을 조사해보면 50% 이상 소실된 경우가 많다고 이미 보고되어 있다. 그러므로 많은 연구진들은 약물로서 사용한 화학요법제의 봉입율을 높이기 위한 노력에 심혈을 기울이고 있다.
본 발명의 일실시예는 상기와 같은 문제점을 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일실시예는 암을 진단함과 동시에 치료하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일실시예는 종래의 항암 화학요법제의 효과를 현저히 향상시키는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일실시예는 종래의 항암 화학요법제의 부작용을 현저히 감소시키는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 또 다른 일실시예는 특히, 독소루비신의 심장 독성의 부작용을 현저히 감소시키는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일실시예는 독소루비신을 암 부위에만 특이적으로 전달하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일실시예는 특히 고형암의 진단 및 치료를 동시에 수행하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일실시예는 원발성 암 뿐만 아니라 전이암까지도 진단 및 치료를 동시에 수행하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일실시예는 용해성이 우수하고 제형이 안정하며 환자들에게 투여시 부작용이 적은 항암제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일실시예는 항암제를 전달할 뿐만 아니라 이와 동시에 조영제로서도 기능하여 질병의 진단 및 병기의 추이를 모니터링 하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일실시예는 나노 크기 입자의 형태로 항암제를 제공함으로써 상대적으로 혈관 내벽 세포 연접이 느슨한 암세포 조직에 항암제가 특이적으로 전달되는 타겟팅 효과를 얻는 것을 목적으로 한다. 또한, 높은 타겟팅 효과로 인해 항암제 사용량을 줄이는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일실시예는 화학요법제가 서서히 방출되도록 하여 항암제의 효능을 유지하고 부작용을 예방하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 일실시예는 종래의 항암제 투여량과 동일하거나 더 적은 량으로도 우수한 항암 효과를 얻을 수 있고 부작용을 감소시키는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예에 따른 항암제는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 항암제로서, 하기 화학식1로 표시되는 사슬 말단 기능성화된 중합체:
[화학식 1]
상기 식에서, R은 메틸, 노말 부틸(n-butyl), 2급 부틸(sec-butyl), 3급 부틸(tert-butyl) 또는 메톡시이고,
n은 10 내지 500의 정수이며;
조영물질 및
화학요법제를 포함하며,
마이셀 구조를 갖는 나노입자의 형태인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일실시예에 따른 암의 진단을 수행하는 고분자 마이셀형 조 영제는,
하기 화학식 1로 표시되는 중합체:
(화학식 1)
상기 식에서, R은 메틸, 노말 부틸(n-butyl), 2급 부틸(sec-butyl), 3급 부틸(tert-butyl) 또는 메톡시이고,
n은 10 내지 500의 정수; 및
조영물질을 포함하며,
마이셀 구조를 갖는 나노입자의 형태인 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 일실시예에 따른 고분자 마이셀형 항암제의 제조방법은, 약물을 DMSO(디메틸설폭사이드)에 용해시켜 약물의 DMSO 용액을 제조하는 제1단계; 상기 얻어진 용액에 트리에틸아민을 첨가하는 제2단계; 사슬 말단 기능성화된 중합체를 DMSO에 용해시켜 중합체의 DMSO 용액을 제조하는 제3단계; 상기 얻어진 약물의 DMSO 용액과 중합체의 DMSO 용액을 혼합하는 제4단계; 상기 얻어진 용액에 조영 물질을 첨가하는 제5단계; 및 상기 얻어진 용액을 투석하고 동결건조시키는 제6단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 본 발명의 일실시예에 따른 고분자 마이셀형 조영제의 제조방법은, 사슬 말단 기능성화된 중합체를 DMSO에 용해시켜 중합체의 DMSO 용액을 제조하는 제1단계; 상기 얻어진 중합체 용액에 조영물질을 첨가하는 제2단계; 및 상기 얻어진 용액을 투석하고 동결건조시키는 제3단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 기술한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 1의 중합체는 사슬 말단 기능성화된 폴리에틸렌 옥사이드일 수 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 화학식 1의 중합체는 사슬 말단 기능성화된 메톡시 폴리에틸렌글리콜(m-PEG)일 수 있다. 구체적으로, 화학식 1에서 R이 메틸, 노말 부틸(n-butyl), 2급 부틸(sec-butyl) 또는 3급 부틸(tert-butyl)인 경우에는 상기 중합체는 사슬 말단 기능성화된 폴리에틸렌 옥사이드이다. 한편, 화학식 1에서 R이 메톡시인 경우에 상기 중합체는 사슬 말단 기능성화된 메톡시 폴리에틸렌글리콜(m-PEG)이다.
상기 화학식 1에서 n이 10 미만이면 고분자로서 마이셀을 형성하기가 어려워지고, 500을 초과하면 마이셀 입자의 크기가 너무 커져 원하는 암세포에만 표적 전 달하기가 어렵기 때문이다.
본 발명의 일실시예에서 상기 사슬 말단 기능성화된 중합체는 수평균 분자량이 1,100 내지 23,000인 것이 바람직하다. 1,100 미만이면 고분자로서 마이셀을 형성하기가 어려워지고, 23,000을 초과하면 마이셀 입자의 크기가 너무 커져 원하는 암세포에만 표적 전달하기가 어렵기 때문이다.
본 발명의 일실시예에 따른 항암제의 조성은 사슬 말단 기능성화된 중합체, 상기 산화철 및 상기 독소루비신 또는 약제학적으로 허용되는 그 염의 중량비가 5~50 : 2.5~20: 1~2 (중합체:산화철:독소루비신 또는 약제학적으로 허용되는 그 염)이다. 산화철이 상기 범위를 벗어나면 마이셀 나노입자가 만들어 지지 않는다. 또한 독소루비신의 양이 너무 적으면 봉입률이 낮고, 독소루비신의 양이 크면 마이셀 나노 입자가 만들어지지 않는다. 중합체의 양이 너무 적으면 마이셀 구조를 형성하기가 어려워지고, 중합체의 양이 너무 크면 독소루비신 또는 약제학적으로 허용되는 그 염과 산화철의 봉입률이 낮아진다. 상기 독소루비신 또는 약제학적으로 허용되는 그 염의 양은 본 발명에 따른 마이셀 나노 입자에 봉입될 수 있는 적정 비율을 의미한다.
상기한 마이셀 나노 입자의 크기는 30내지 200nm 이며, 바람직한 마이셀 입자크기는 50 내지 100nm인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에 따른 고분자 마이셀형 조영제 조성에 있어서 조영물질로는 산화철, 가돌리늄, 망간, 알루미늄, 실리콘, 바륨, 이트륨 및 희토류 원소 중 에서 선택될 수 있으며, 그 중에서 특히 산화철인 것이 바람직하다. 산화철(Fe3O4)은 세포들이 서로 부착되고 움직이고 성장하는 것을 돕는 작용을 하며, 특히 MRI 조영 효과 및 마이셀 형성에 주된 역할을 한다. 상기 산화철은 나노입자인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에 따른 고분자 마이셀형 항암제 조성에 있어서 약물로 봉입되는 화학요법제로는 독소루비신 (Doxorubicin) 또는 아드리아마이신 (Adriamycin), 시스플라틴 (Cisplatin), 탁솔 (Taxol), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 또는 약제학적으로 허용되는 그 염 등이 선택될 수 있으며, 그 중에서 특히 독소루비신인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에 따른 항암제에 사용될 수 있는 화학요법제인 독소루비신의 약제학적으로 허용되는 그 염은 산 부가염 또는 염기 부가염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염기 부가염의 예로는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노, 또는 마그네슘 염, 또는 유사한 염이 포함된다. 약제학적으로 허용되는 산 부가염의 예로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 일수소탄산, 인산, 일수소인산, 이수소인산, 황산, 일수소황산, 요오드화수소산 또는 아인산 등과 같은 무기산으로부터 유도된 것들뿐만 아니라, 아세트산, 아스코르브산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 락트산, 말산, 글루탐산, 벤조산, 석신산, 수베르산, 푸마르산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, p-톨릴설폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄설폰산, 락토비온산 등과 같은 비교적 비-독성 유기산으로부터 유도된 염이 포함된다. 또한, 아르기네이트 등과 같은 아미노산의 염, 및 글루쿠론산 또는 갈락투로르산 등과 같은 유기산의 염이 포함된다. 그 중에서 특히 염산염인 것이 바람직하다.
또 다른 본 발명의 일실시예에 따른 고분자 마이셀형 항암제에 있어서, 상기 암은 고형암인 것이 바람직하다.
또 다른 본 발명의 일실시예에 따른 고분자 마이셀형 항암제에 있어서, 상기 암은 원발성 암일 수도 있고, 전이 암일 수도 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 고분자 마이셀형 항암제의 구조를 나타낸 것이다. 여기서 조영물질은 산화철(Fe3O4)이고 약물은 화학요법제인 독소루비신 또는 약제학적으로 허용되는 그 염(Dox)이다. 사슬 말단에 엽산(folic acid, FA)이 결합된 폴리에틸렌 옥사이드(PEO) 또는 메톡시 폴리에틸렌글리콜(m-PEG)이 마이셀 구조를 형성하고 그 내부에 산화철과 독소루비신이 봉입된 것을 나타낸다.
독소루비신 또는 약제학적으로 허용되는 그 염은 고형암을 치료하기 위해 사용되는 정맥 주사 약물로, 유방, 폐, 난소, 혈액암 등 각종 암을 치료하기 위해 광범위하게 사용된다. 산화철은 세포들이 서로 부착하고 움직이고 성장하는 것을 돕는 작용을 한다. 세포들이 산화철에 붙게 되면 암세포들은 독소루비신을 먹게 되며, 항암제는 다른 정상 부위로는 가지 않고 암세포에만 가게 된다. 독소루비신의 항암 효과는 매우 높다. 그러나 독소루비신을 실제 환자에게 투여할 때에는 부작용 이 크므로 환자가 견딜 수 있는 투여량이 매우 제한적이다. 너무 많은 양의 독소루비신을 투여하게 되면 정상적인 심장 세포들에 큰 손상을 주어 심장 발작이 일어날 수 있다. 이러한 부작용은 약물의 표적 전달과 약물이 서서히 방출되도록 함으로써 줄일 수 있다.
본 발명에 따른 항암제는 수용액 상에서 자발적으로 마이셀 구조가 형성된다. 또한, 생분해성 고분자의 분해 속도에 의존하여 약물이 서서히 방출되는 특징을 갖는다.
한편, 본 발명에 의하여 제조된 고분자 마이셀형 항암제의 생체내 약동학 (pharmacokinetics)은 다음과 같다. 마이셀 구조는 신장배출 (renal exclusion)을 회피하게 할 뿐만 아니라, 수동확산 (passive diffusion)에 의하여 표적부위로 약물의 혈관투과성 (vascular permeability)을 높이게 된다. 더불어 세포내 이입 (endocytosis)의 증가 및 약제다제내성 (multi-drug resistance, MDR) 효과의 감소에 의하여 생체내에서 마이셀 구조의 약물 섭취가 증가하게 된다. 또한 약물에 접합된 PEO 골격 또는 mPEG가 화학적으로 분해되면서 약물-PEO 고분자 또는 약물-mPEG 고분자 분획상에서 약물이 서서히 방출하게 된다.
본 발명의 고분자 마이셀형 항암제는 약제학적 제형의 유효성분으로서 기능하여, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 약제학적 제형을 구성할 수 있다. 이 때 유효성분인 본 발명의 고분자 마이셀형 항암제의 함량은 전체 조성물에 0.001내지 99 wt%인 것이 좋다. 사용 가능한 담체, 부형제 또는 희 석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있다. 또한 항암 조성물이 약제로 제조되는 경우 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 고분자 마이셀형 항암제는 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있지만, 가장 바람직한 투여 경로는 정맥 내 투여이다.
또한, 본 발명에 따른 상기 고분자 마이셀형 항암제의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적으로 독소루비신 또는 약제학적으로 허용되는 그 염 투여량은 1.2-2.4mg/kg/일 범위이다. 본 발명에 따른 고분자 마이셀형 항암제는 표적 전달이 가능하므로 통상 투여되는 양의 수준을 투여하면 약효가 더욱 우수하다. 또한 통상 투여되는 양보다 적은 양을 투여하더라도, 표적 전달이 가능하므로 효과는 통상의 양으로 투여된 경우와 유사하다. 따라서, 본 발명에 따른 항암제의 경우 투여량을 현저히 줄일 수 있다.
이하 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되지 않는다는 사실은 당업계에 종사하는 상식적인 지식을 가진 자에게 있어서는 당연한 것이다.
실시예
<제조예 1: PEO-TMA-FA(폴리에틸렌 옥사이드-트리멜리틱안히드라이드-엽산) 중합체의 제조>
하기 화학식 2의 PEO-TMA-FA는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
(1) PEO의 중합
먼저, 하기 반응식 1과 같이 하여 PEO를 중합하였다.
상기 반응식 1에 나타난 바와 같이, 고진공 하에서 용량 1 L의 둥근 파이랙스 플라스크 내에 각종 반응물들을 넣은 후, 진공 라인에 부착시켜 공기를 완전히 제거하였다. 아르곤 기류 하에서 n-부틸리튬 (12 mmol)를 주사기를 이용하여 주입하고, 수조 (water bath) 대신 드라이 아이스/이소프로판올조 (dry ice/isopropanol bath)를 사용하여 반응기 온도를 -78℃로 낮춘 후, 반응기 내의 아르곤 가스를 진공 펌프로 완전히 제거하였다. 다시, 정제된 벤젠 300 mL를 증류시켜 반응기 내로 주입하였다. 반응기의 온도를 서서히 상온으로 승온시켜 반응기 내의 벤젠을 완전히 용해시키고 개시제를 포함한 용액으로 환원시켰다. 빙수조를 사용하여 0℃에서 주의를 기울이면서 정제된 30 mL (26.5 g)의 에틸렌옥사이드 (ethylene oxide; EO) (30 vol%, 희석 용액)를 브레이크실 (breakseal)을 깨어 반응기 내로 주입하였다. 약 1시간 후, t-BuOK (THF 20 mL 중의 12 mmol) 및 30 mL의 정제된 DMSO를 브레이크실 및 정지콕 (stopcock)을 통하여 반응기 내로 투입하였다. 수조를 사용하여 반응기의 온도를 35℃까지 올리고 5시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 다시 빙수조를 사용하여 온도를 5℃까지 낮추어 중합을 10분간 진행시키고, 이러한 과정을 수차례 반복하였다. 다시 상온에서 48시간 동안 반응시킨 후 앰플을 사용하여 반응물 일부를 주반응기로부터 취하여 감압증류하여 용매를 제거하였다. 이어서, 잔사를 THF에 용해시키고 디에틸에테르 (diethyl ether) 속에 침전시켜 폴리에틸렌옥사이드 (PEO)를 얻었다. 상온에서 48시간 동안 진공 오븐 속에서 건조시킨 후 1H-NMR 및 겔 투과크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC)로 분석한 결과 얻어진 고분자의 수평균 분자량은 4,400 g/mol이었다. EO의 고분자로의 전환율은 100 몰% 이상이었다.
(2) PEO-TMA 합성
하기 반응식 2에 따라, PEO-TMA를 합성한 후 다시 PEO-TMA-FA를 합성하였다.
상기 반응식 2에 나타나 있는 바와 같이, 상기 (1)에서 제조된 분자량 4,400 g/mol의 리빙 고분자 용액 ([ROLi] = 0.001 mol)에 고진공 하에서 트리멜리틱 안히드라이드 클로라이드 (98%) (Aldrich)를 정제하지 않은 상태로 0.005 몰을 앰플 속에 주입하였다. 다시 60 mL의 THF를 증류시킨 후 반응기에 부착시켜 브레이크실을 이용하여 반응기 내로 투입하였다. 이 반응물들은 5℃에서 1시간 35℃에서 15시간 반응시킨 후, 디메틸에테르에 침전시켜 용매를 제거하였다. 침전물을 THF에 용해시키고 에탄올에서 재결정시켜 사슬 말단 안히드라이드 폴리에틸렌옥사이드 (ω-anhydride poly(ethylene oxide))를 제조하였다. 기능성화 수율은 초기 사용된 고분자 용액 농도 기준으로 98 mol%이었으며, 수평균 분자량은 4,600 g/mol이었다.
(3) PEO-TMA-FA 합성
상기 (2)에서 에서 제조된 ω-안히드라이드-PEO (Mn = 4,600 g/mol, 1 g)와 엽산 (0.48 g, 5 eq.)을 20 mL의 DMSO에서 상온에서 약 24시간 반응시켰다. 이를 다시 디에틸에테르에 재침전시켜 고체를 얻은 후, 이를 다시 THF에 용해시키고, 에탄올에서 재결정시켜 노란색의 분말을 얻었다 (PEO-TMA-FA). 수평균 분자량은 5,000 g/mol이었으며, 반응 수율은 PEO를 기준으로 98 몰% 이상이었다. 합성된 PEO-TMA-FA 화합물의 분석 결과는 도 2 내지 4에 나타나 있다.
<제조예 2: mPEG-TMA-FA(메톡시폴리에틸렌 글리콜-트리멜리틱안히드라이드-엽산) 중합체의 제조>
하기 화학식 3의 mPEG-TMA-FA는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
(1) mPEG의 개질
하기 반응식 3에 따라 mPEG를 개질하였다.
용량 2 L의 둥근 파이랙스 플라스크 내에 메톡시-폴리에틸렌글리콜(분자량 5,000 g/mol, Aldrich;mPEG) 0.01몰을 넣고 진공 라인에 끼워 공기를 완전히 제거하고 건조 하였다. 벤젠 1L를 증류하여 mPEG를 용해시킨 후 빙수조를 사용하여 온도를 낮추며 아르곤 기류 하에서 n-부틸리튬 (30 mL)를 주사기를 이용하여 천천히 주입하고, 주입이 끝난 후 천천히 30 ℃까지 온도를 올렸다. 48시간 동안 반응하여 투명하던 색이 점점 노란색으로 변하는 것을 확인하고 메탄올 소량 증류하여 넣고 공기와 접촉시켜 반응을 종료하였다. 디에틸에테르 (diethyl ether) 속에 침전시켜 말단기가 리튬(Li)으로 치환된 리빙 메톡시 폴리에틸렌글리콜 (mPEG-Li)를 얻었다. 얻어진 고분자의 수평균 분자량은 5,000 g/mol이었다. 도 5는 위와 같이 얻어진 개질된 mPEG의 NMR 스펙트럼이다.
(2) mPEG-TMA의 합성
하기 반응식 4에 따라 mPEG-TMA-FA를 제조하였다.
상기 (1)에서와 같은 방법으로 제조된 분자량 5,000 g/mol인 리빙 고분자 용액 ([ROLi] = 0.01 mol)에 아르곤기류 하에서 트리멜리틱안히드라이드 클로라이드 (98%) (Aldrich)를 60 mL의 THF에 녹여 주사기로 반응기 내로 투입하였다. 이 반응물들은 5℃에서 1시간 35℃에서 15시간 반응시킨 후, 디메틸에테르에 침전시켜 용매를 제거하였다. 침전물을 THF에 용해시키고 에탄올에서 재결정시켜 사슬 말단 안히드라이드 폴리에틸렌옥사이드 (ω-anhydride poly(ethylene oxide))를 제조하였다. 기능성화 수율은 초기 사용된 고분자 용액 농도 기준으로 85 mol%이었으며, 수평균 분자량은 5,200 g/mol이었다.
(3) mPEG-TMA-FA의 합성
상기 (2)에서 제조된 ω-안히드라이드-mPEG (M n = 5,200 g/mol, 1 g)와 엽산 (0.42 g, 5 eq.)을 20 mL의 DMSO에서 상온에서 약 24시간 반응시켰다. 이를 다시 디에틸에테르에 재침전시켜 고체를 얻은 후, 이를 다시 THF에 용해시키고, 에탄올에서 재결정시켜 노란색의 분말을 얻었다 (mPEG-TMA-FA). 수평균 분자량은 5,600 g/mol이었으며, 반응 수율은 mPEG를 기준으로 80 몰% 이상이었다.
<실시예 1: PEO-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
100 ml 비이커에 상기 제조예 1에 따라 제조된 수평균 분자량 5,000 g/mol인 중합체 (PEO-TMA-FA) 300 mg을 넣고 DMSO 3.5 ml를 넣어 완전히 용해시켰다. 이 용액에 산화철(iron oxide)(Aldrich, Cat# 637106, 구형, 입자크기 20-30nm, 순도 >98+%) 250 mg을 넣고, 5% 만니톨 10 ml를 첨가하여 비이커 위를 호일로 쌓은 후 2시간 동안 소니케이션(sonication)을 실행하였다. 그리고 나서 이 용액을 50 ml 코니컬 튜브(conical tube)에 담고 2000 rpm에서 10분간 원심분리(centrifuge)하였다. 투석(Dialysis)을 위하여 우선 20 l DDW에 만니톨 1000 g을 녹여 5% 만니톨 용액을 제조하며, 이 때 pH는 NaOH를 사용하여 7.4로 조절하였다. 그리고 나서 미리 물에 불린 투석 멤브레인(dialysis membrane) (MWCO=3,500)에 원심분리가 끝난 샘플을 넣은 다음 홀더로 앞뒤를 묶어 용액이 담긴 투석용 용기에 담근 후 5% 만니톨 용액을 갈아주면서 24시간 동안 500 rpm으로 교반하며 투석을 진행하였다. 투석이 완료한 샘플을 딥 프리저(deep freezer)에 넣어 얼린 후 동결건조기를 사용하여 3일간 냉동건조시켜 최종적으로 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 2: PEO-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 1에 따라 제조된 수평균 분자량 5,000 g/mol인 중합체 (PEO-TMA-FA)를 500 mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 3: PEO-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 1에 따라 제조된 수평균 분자량 5,000 g/mol인 중합체 (PEO-TMA-FA)를 600 mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 4: PEO-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 1에 따라 제조된 수평균 분자량 5,000 g/mol인 중합체 (PEO-TMA-FA)를 750 mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 5: PEO-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 1에 따라 제조된 수평균 분자량 5,000 g/mol인 중합체 (PEO-TMA-FA)를 750 mg 및 산화철 50mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 6: PEO-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 1에 따라 제조된 수평균 분자량 5,000 g/mol인 중합체 (PEO-TMA-FA)를 750 mg 및 산화철 100mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 7: PEO-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 1에 따라 제조된 수평균 분자량 5,000 g/mol인 중합체 (PEO-TMA-FA)를 750 mg 및 산화철 150mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 8: PEO-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 1에 따라 제조된 수평균 분자량 5,000 g/mol인 중합체 (PEO-TMA-FA)를 750 mg 및 산화철 200mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 9: PEO-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 1에 따라 제조된 수평균 분자량 5,000 g/mol인 중합체 (PEO-TMA-FA)를 750 mg 및 산화철 225mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 10: PEO-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 1에 따라 제조된 수평균 분자량 5,000 g/mol인 중합체 (PEO-TMA-FA)를 750 mg 및 산화철 250mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 11: PEO-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 1에 따라 제조된 수평균 분자량 5,000 g/mol인 중합체 (PEO-TMA-FA)를 750 mg 및 산화철 275mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 12: mPEG-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
100 ml 비이커에 상기 제조예 2에 따라 제조된 수평균 분자량 5,600 g/mol인 중합체 (mPEG-TMA-FA) 300 mg을 넣고 DMSO 3.5 ml를 넣어 완전히 용해시켰다. 이 용액에 산화철(iron oxide) 250 mg을 넣고, 5% 만니톨 10 ml를 첨가하여 비이커 위를 호일로 쌓은 후 2시간 동안 소니케이션(sonication)을 실행하였다. 그리고 나서 이 용액을 50 ml 코니컬 튜브(conical tube)에 담고 2000 rpm에서 10분간 원심분리(centrifuge)한다. 투석(Dialysis)을 위하여 우선 20 l DDW에 만니톨 1000 g을 녹여 5% 만니톨 용액을 제조하며, 이 때 pH는 NaOH를 사용하여 7.4로 조절한다. 그리고 나서 미리 물에 불린 투석 멤브레인(dialysis membrane) (MWCO=3,500)에 원심분리가 끝난 샘플을 넣은 다음 홀더로 앞뒤를 묶어 용액이 담긴 투석용 용기에 담근 후 5% 만니톨 용액을 갈아주면서 24시간 동안 500 rpm으로 교반하며 투석을 진행한다. 투석이 완료한 샘플을 딥 프리저(deep freezer)에 넣어 얼린 후 동결건조기를 사용하여 3일간 냉동건조시켜 최종적으로 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 13: mPEG-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 2에 따라 제조된 수평균 분자량 5,600 g/mol인 중합체 (mPEG-TMA-FA) 500 mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 12와 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 14: mPEG-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 2에 따라 제조된 수평균 분자량 5,600 g/mol인 중합체 (mPEG-TMA-FA) 600 mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 12와 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 15: mPEG-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 2에 따라 제조된 수평균 분자량 5,600 g/mol인 중합체 (mPEG-TMA-FA) 750 mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 12와 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 16: mPEG-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 2에 따라 제조된 수평균 분자량 5,600 g/mol인 중합체 (mPEG-TMA-FA) 750 mg 및 산화철 50mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 12와 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 17: mPEG-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 2에 따라 제조된 수평균 분자량 5,600 g/mol인 중합체 (mPEG-TMA-FA) 750 mg 및 산화철 100mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 12와 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 18: mPEG-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 2에 따라 제조된 수평균 분자량 5,600 g/mol인 중합체 (mPEG-TMA-FA) 750 mg 및 산화철 150mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 12와 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 19: mPEG-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 2에 따라 제조된 수평균 분자량 5,600 g/mol인 중합체 (mPEG-TMA-FA) 750 mg 및 산화철 200mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일 하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 20: mPEG-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 2에 따라 제조된 수평균 분자량 5,600 g/mol인 중합체 (mPEG-TMA-FA) 750 mg 및 산화철 225mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 12와 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 21: mPEG-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 2에 따라 제조된 수평균 분자량 5,600 g/mol인 중합체 (mPEG-TMA-FA) 750 mg 및 산화철 250mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 12와 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 22: mPEG-TMA-FA를 포함한 고분자 마이셀형 조영제의 제조>
상기 제조예 2에 따라 제조된 수평균 분자량 5,600 g/mol인 중합체 (mPEG-TMA-FA) 750 mg 및 산화철 275mg을 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 12와 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 조영제를 제조하였다.
<실시예 23: PEO-TMA-FA에 조영물질과 약물이 봉입된 고분자 마이셀형 항암제 제조>
독소루비신 염산염 60 mg을 20 ml 바이알에 넣고 DMSO 1.5 ml를 첨가하여 용해한 다음 이 용액에 트리에틸아민 (2 eq)을 넣고 약 10분 동안 교반하였다. 100 ml 비이커에 상기 제조예 1에서 제조된 수평균 분자량 5,000 g/mol인 중합체 (PEO-TMA-FA) 750 mg을 넣고 DMSO 3.5 ml를 넣어 완전히 용해시켰다. 여기에 앞서 준비한 독소루비신을 함유한 용액을 넣은 후 산화철(iron oxide) (Aldrich, Cat# 637106, 구형, 입자크기 20-30nm, 순도 >98+%) 250 mg과 5% 만니톨 10 ml를 첨가하여 비이커 위를 호일로 쌓은 후 2시간 동안 소니케이션(sonication)을 실행하였다. 그리고 나서 이 용액을 50 ml 코니컬 튜브(conical tube)에 담고 2000 rpm에서 10분간 원심분리하여 샘플을 제조하였다. 투석을 위하여 우선 20 l DDW에 만니톨 1000 g을 녹여 5% 만니톨 용액을 제조하고, 이 때 pH는 NaOH를 사용하여 7.4로 조절하였다. 그리고 나서 미리 물에 불린 투석 멤브레인(dialysis membrane) (MWCO=3,500)에 원심분리가 끝난 샘플을 넣은 다음 홀더로 앞뒤를 묶어 용액이 담긴 투석용 용기에 담근 후 5% 만니톨 용액을 갈아주면서 24시간 동안 500 rpm으로 교반하며 투석을 진행하였다. 투석을 완료한 샘플을 딥 프리저(deep freezer)에 넣어 얼린 후 동결건조기를 사용하여 3일간 냉동건조시켜 최종적으로 독소루비신이 봉입된 고분자 마이셀형 항암제를 제조하였다.
<실시예 24: PEO-TMA-FA에 조영물질과 약물이 봉입된 고분자 마이셀형 항암제 제조>
독소루비신 염산염을 70 mg로 혼합한 것을 제외하고는, 상기 실시예 23와 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 항암제를 제조하였다.
<실시예 25: PEO-TMA-FA에 조영물질과 약물이 봉입된 고분자 마이셀형 항암제 제조>
독소루비신 염산염을 80 mg로 혼합한 것을 제외하고는, 상기 실시예 23과 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 항암제를 제조하였다.
<실시예 26: mPEG-TMA-FA에 조영물질과 약물이 봉입된 고분자 마이셀형 항암제 제조>
독소루비신 염산염 60 mg을 20 ml 바이알에 넣고 DMSO 1.5 ml를 첨가하여 용해한 다음 이 용액에 트리에틸아민 (2 eq)을 넣고 약 10분 동안 교반하였다. 100 ml 비이커에 상기 제조예 2에서 제조된 수평균 분자량 5,600 g/mol인 중합체 (mPEG-TMA-FA) 750 mg을 넣고 DMSO 3.5 ml를 넣어 완전히 용해시켰다. 여기에 앞서 준비한 독소루비신을 함유한 용액을 넣은 후 산화철(iron oxide) (Aldrich, Cat# 637106, 구형, 입자크기 20-30nm, 순도 >98+%) 250 mg과 5% 만니톨 10 ml를 첨가하여 비이커 위를 호일로 쌓은 후 2시간 동안 소니케이션(sonication)을 실행하였다. 그리고 나서 이 용액을 50 ml 코니컬 튜브(conical tube)에 담고 2000 rpm에서 10분간 원심분리하여 샘플을 제조하였다. 투석을 위하여 우선 20 l DDW에 만니톨 1000 g을 녹여 5% 만니톨 용액을 제조하고, 이 때 pH는 NaOH를 사용하여 7.4로 조절하였다. 그리고 나서 미리 물에 불린 투석 멤브레인(dialysis membrane) (MWCO=3,500)에 원심분리가 끝난 샘플을 넣은 다음 홀더로 앞뒤를 묶어 용액이 담긴 투석용 용기에 담근 후 5% 만니톨 용액을 갈아주면서 24시간 동안 500 rpm으로 교반하며 투석을 진행하였다. 투석을 완료한 샘플을 딥 프리저(deep freezer)에 넣어 얼린 후 동결건조기를 사용하여 3일간 냉동건조시켜 최종적으로 독소루비신이 봉입된 고분자 마이셀형 항암제를 제조하였다.
<실시예 27: mPEG-TMA-FA에 조영물질과 약물이 봉입된 고분자 마이셀형 항암제 제조>
독소루비신 염산염을 70 mg로 혼합한 것을 제외하고는, 상기 실시예 26과 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 항암제를 제조하였다.
<실시예 28: mPEG-TMA-FA에 조영물질과 약물이 봉입된 고분자 마이셀형 항암제 제조>
독소루비신 염산염을 80 mg로 혼합한 것을 제외하고는, 상기 실시예 26과 동일하게 수행하여 고분자 마이셀형 항암제를 제조하였다.
<비교예 1>
고분자 마이셀화하지 않은 표준 독소루비신(free doxorubicin)을 준비하였다.
<실험예 1: 마이셀 구조, 크기, 봉입율 등의 측정>
먼저, 상기 실시예 1 내지 28에 따라 제조된 제제의 고분자 마이셀의 크기, 산화철 및 약물의 봉입율은 하기 표 1에 나타난 바와 같다.
구분 | 입자 크기 [Diameter(Wt.)] (nm) | 산화철의 봉입율 (%) | 약물의 봉입율 (%) |
실시예 1 | 116.5(102.1) | 4.5 | - |
실시예 2 | 114.0(101.9) | 4.6 | - |
실시예 3 | 115.6(88.2) | 4.7 | - |
실시예 4 | 107.0(87.4) | 4.7 | - |
실시예 5 | 150.7(199.7) | 3.2 | - |
실시예 6 | 125.5(125.2) | 3.4 | - |
실시예 7 | 118.4(101.4) | 3.4 | - |
실시예 8 | 94.8(67.5) | 4.2 | - |
실시예 9 | 100.6(82.0) | 4.3 | - |
실시예 10 | 99.4(75.8) | 4.7 | - |
실시예 11 | 102.9(78.7) | 4.7 | - |
실시예 12 | 97.3(95.4) | 4.5 | - |
실시예 13 | 109.4(99.4) | 4.4 | - |
실시예 14 | 110.4(98.6) | 4.5 | - |
실시예 15 | 95.4(80.0) | 4.5 | - |
실시예 16 | 102.0(72.2) | 3.1 | - |
실시예 17 | 128.6(110.7) | 3.2 | - |
실시예 18 | 100.6(103.5) | 3.2 | - |
실시예 19 | 104.6(95.8) | 4.0 | - |
실시예 20 | 97.5(87.9) | 4.2 | - |
실시예 21 | 95.3(84.5) | 4.4 | - |
실시예 22 | 91.3(73.2) | 4.4 | - |
실시예 23 | 106.8(85.2) | - | 50.8 |
실시예 24 | 101.4(76.5) | - | 48.0 |
실시예 25 | 104.7(74.2) | - | 45.9 |
실시예 26 | 97.1(75.1) | - | 39.9 |
실시예 27 | 100.9(89.6) | - | 42.9 |
실시예 28 | 96.5(75.7) | - | 37.3 |
비교예 1 | 입자크기 측정불가 | - | - |
* Diameter : Size 측정시 light scattering에 의한 크기, 무게에 의한 크기, 수에 의한 크기 등 세 가지 측정값에 대한 평균화 size 값
* Wt. : 무게에 의한 크기
* 봉입율 (%) : 산화철 및 약물의 봉입율은 3회 측정한 평균값을 나타낸 것으로서 오차범위 ±0.2임.
상기 실시예 4와 23에 따라 제조된 고분자 마이셀형 조영제 및 항암제와 PEO-TMA-FA 중합체의 cryo-TEM은 FEI Co. (USA)의 BIO-TEM (Biological Transmission Electron Microscopy: 생물전용 투과전자현미경, 모델명: Tecnai G2 Spirit)을 사용하여 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 먼저 생리식염수에 젤라틴이 10%가 되도록 혼합하여 37℃에서 젤라틴을 액상으로 만든 후 이와 고분자 마이셀 시료와 잘 섞은 다음 상온에서 고형화시킨다. 그리고 나서 이 시료를 울트라 마이크로톰(ultra microtom)을 사용하여 70 nm 두께의 절편으로 만든 다음 카본 코팅된 그리드(carbon coated grid)에 올려놓고 TEM 측정을 실시하였다. 그 측정 결과는 도 8a 내지 도 8c에 나타나 있다. 도 8a는 고분자 PEO-TMA-FA의 구조를 측정한 것이고, 도 8b는 실시예 4, 도 8c는 실시예 23에 따라 각각 제조된 고분자 마이셀의 구조를 측정한 것이다. 도면에 나타나 있는 바와 같이, 상기 실시예들에 의해 제조된 조영제 및 항암제는 마이셀 형태를 가지며, 크기는 50 내지 100nm로서 나노 입자인 것을 알 수 있었다.
<실험예 2: 고분자 마이셀형 조영제의 조영 효과의 측정>
정상 쥐의 간 조영 효과
먼저 쥐의 간에서의 조영 효과를 보기 위해 수컷 SD-래트를 마취시킨 후 쥐의 꼬리정맥에 실시예 10 및 21에 따른 조영제를 각각 0.9CC씩 정주한 후 MR 영상을 얻었다. 그 중에서 실시예 10 및 21의 결과를 도 9 (a)와 9(b)에 각각 나타내었다. 왼쪽 사진이 T2 조영 전 영상이고, 오른쪽 사진이 T2 조영 후 영상이다. 그 결과로서 T2 강조 영상에서 MR 조영제 주입 후 간의 신호강도가 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 간의 MR 조영제로 적합함을 알 수 있다.
간암모델 쥐의 간암 조영
간암 모델을 만들기 위해 8주령의 SD 계통 수컷 쥐에 디에틸 니트로사민(diethyl nitrosamine)을 1:10,000으로 희석한 물을 종양(tumor)이 생기기 전까지 12주 동안 매일 공급하였다. 사육 10주 후 쥐의 간암 발생 확인 후 쥐의 꼬리 정맥에 실시예 10 및 21에 따라 제조된 MR 조영제를 2ml/kg을 정주한 후 T2 강조영상과 T2* 강조영에서 쥐의 간암의 조영효과를 볼 수 있었다. 그 중 실시예 10 및 21에 따른 조영제의 결과를 도 9(c)와 9(d)에 나타내었다. 도 9(c)와 도9(d)에 나타난 바와 같이, 간 실질이 낮은 신호 강도를 보이면서 간암이 상대적으로 높은 신호 강도를 보여 간암을 쉽게 발견 할 수 있으며 기존의 시장에서 사용 중인 Resovist와 같은 효과를 얻었다. 또한 조영제가 철을 함유한 나노입자이므로 이 입자가 간암에 선택적으로 섭취되어 간암의 신호강도 관심영역(ROI)가 감소됨을 기대 할 수 있는데 실제로 도 9(b)에 나타나 있듯이 간암에서 신호 강도의 ROI가 감소되었다.
<실험예 3: 고분자 마이셀형 항암제의 MTT 측정: 독성시험>
독성시험
생체 분해성 고분자 마이셀형 항암제의 독성을 KB (human epidermal carcinoma) cell과 A549 (human lung carcinoma) cells에서 측정하였다. 세포를 200uL RPMI1640에 5x104 cells/ml 로 희석하여 96-웰 세포 배양 플레이트에 시딩하고 24시간 후에 독소루비신 프리 용액(Doxorubicin free solution, FD)과 블랭크(blank) 마이셀, 상기 실시예 23에서 제조한 독소루비신이 봉합된 항암제 (Micelle doxorubicin, MD)를 여러 가지 농도로 세포 배지에 처리한 후 48시간동안 인큐베이션(37℃, 5% CO2)하였다. 인큐베이션 후 PBS로 세 번 씻어낸 후 20uL MTT (tetrazolium salts) 용액이 포함된 배지 100uL를 각 웰에 가하고 다시 4시간동안 인큐베이션하였다. 100uL DMSO를 각 웰에 가하고 세포를 녹이기 위해 플레이트를 격렬히 교반시켰다. ELISA reader를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하여 세포독성 (cytotoxicity) 정도를 확인한다. MTT 측정 결과를 도10에 나타내었다. 도 10에서 MD는 실시예 23에 따라 제조된 마이셀 용액을 나타낸다. 세포독성 정도를 확인한 결과 실험한 농도의 범위에서 MD가 FD (free doxorubicin)에 비해 암세포 사멸능이 컸음을 확인할 수 있었다.
메카니즘 연구
KB(human epidermal carcinoma) 세포와 A549(human lung carcinoma) 세포는 한국세포주은행에서 구입하였다. 각 세포주는 RPMI 1640배지(10% fetal bovine serum, 100 units/ml penicillin, 0.1mg/ml의 streptomycin)에 배양하고, 세포 배양 시 37℃, 5% CO2와 90% 습도의 조건을 항상 유지하였다. 엽산염 경쟁적 저해 실험(folate competitive inhibition 실험)시에는 엽산염(folate)을 추가하여 실험하였다.
엽산염 수용체(Folate receptor)가 많이 발현되어 있는 KB 세포(혹은 Caco-2, HepG2)과 엽산염 수용체(folate receptor)가 발현되어 있지 않은 A549에서 ㄷ독소루비신 프리 용액(FD)과 PEO-TMA-FA/Fe/Dox (실시예 23)의 세포내 유입량을 비교하였다. 프리 독소루비신(20uM)과 실시예 23에 따라 제조된 PEO-TMA-FA/Fe/Dox (20uM)를 엽산(folic acid) (2 mM)와 함께 3 시간 동안 인큐베이션한 후 PBS로 세 번 씻어주고 세포를 수확한 뒤 앞서 서술한 정량법으로 세포내에 들어가 있는 독소루비신 양을 측정하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다. 결과에서 알 수 있듯이 A549에 비해 KB 세포에 더 많이 업테이크(uptake)되었다. 즉, 엽산염(folate)기의 타겟팅 기능을 간접적으로 확인할 수 있었다.
<실험예 4: 고분자 마이셀형 항암제의 서방성 확인/ Pharmacokinetics 연구>
시간에 따른 혈장농도 변화
스프래그 다우리(SD) 웅성 래트를 케타민(ketamine)과 아세프로마진(acepromazine)으로 가볍게 마취한 후 대퇴 정맥에는 생리식염수를, 동맥에는 40 I.U./ml 농도의 헤파린 처리된 생리식염수를 채운 폴리에틸렌 터빙(polyethylene tubing) (PE-50, intramedic, Clay-Adams)을 케뉼레이션(cannulation)하였다. 적당한 회복시간이 지난 후 독소루비신 프리 용액과 상기 실시예 23에 따라 제조한 고분자 마이셀 제형의 독소루비신 각각을 10 mg/kg (독소루비신 기준)을 정맥으로 투여하였다. 투여 후 0(blank), 1, 5, 15, 30, 60, 120분이 되었을 때 혈액 0.3 ml씩을 채취한 후 원심분리(13000 rpm, 3분)하여 약 0.1 ml의 혈장을 분리한 후 제단백하여 HPLC로 분석하였다.
역상 C-18 column (Shim-pack CLS-ODS, 4.6 mm I.D. 250 mm L., 5 m particle diameter)을 이용한 HPLC법을 사용하였다. 채취한 혈장 0.1 ml에 내부표준물질 용액 50 ul (2 ug/ml daunomycin)과 메탄올 100 ul, 에틸아세테이트 1.0 ml를 가하고 3분간 보텍싱 후 3분간 원심분리(3000 rpm)하여 유기층 (1.0 ml)만을 취한 후 speed-vac으로 건조하였다. 남은 잔사를 300 ul의 이동상으로 재조성하여 그 중 100 ul를 직접 HPLC system으로 주입하였다. HPLC system의 이동상으로는 탈이온수(pH = 2.5 by 인산): 아세토니트릴 = 6: 4를 사용하였으며 유속은 1ml/min으로 하였다. HPLC 검출방법으로는 470 nm 여기 파장(excitation wavelength)와 565 nm 방출 파장(emission wavelength)에서 형광분석법을 이용하였다. 검량선 작성을 위한 독소루비신 표준액은 0.05, 0.1, 0.5, 1, 3 ug/ml이 되도록 메탄올에 녹여 제조하였다. 생체시료 검량선 작성시에는 0.05, 0.1, 0.5, 1, 3 ug/ml의 독소루비신 표준액 100 ul 을 메탄올100 ul 대신 넣어 전처리한 후 검량선을 작성하였고 이로부터 혈장 중 독소루비신을 구하였다. 그 결과를 도 12a와 12b에 나타내었다. 도 12a는 실시예 23의 결과이고, 도 12b는 실시예 26의 결과이다. 도 12a 및 12b에서 보는 바와 같이 본 실시예 23 및 26에 따라 제조된 고분자 마이셀형 항암제 투여시 혈중 독소루비신 농도는 FD(free doxorubicin) 투여한 경우에 비해 매 샘플링 시간마다 증가함을 알 수 있었다. 혈중농도-시간의 plot으로부터 area under the curve (AUC)를 구한 결과 고분자 마이셀형 항암제의 경우 AUC가 5배 이상 증가했음을 알 수 있었고, 그에 따라 투여 용량(Dose)을 AUC로 나누어 산출하는 값인 전신 클리어런스 (CL)도 감소하고 있음을 확인할 수 있었다 (표 2). 이는 고분자 마이셀형 항암제의 경우 FD(free doxorubicin)에 비해 체내에 오랫동안 노출된다고 볼 수 있다.
PK parameters | FD | MD(실시예 23) | MD(실시예 26) |
t1 /2 ( min ) | 51.58 ± 34 | 72.18 ± 38.8 | 69.95 ± 30.4 |
AUC ( min * ug / mL ) | 291 ± 98 | 1652 ± 63 | 1467 ± 25 |
CL ( mL / min / kg ) | 37.89 ± 15.8 | 6.06 ± 0.24 | 6.00 ± 0.54 |
Vss ( mL / kg ) | 965.9 ± 593.86 | 484.9 ± 230.84 | 512.4 ± 241.54 |
- t1 /2 : 반감기
- AUC : Plasma concentration time pilot에서 area under the curve
- Cl : 전신 클리어런스, 약물의 소실 클리어런스
- Vss : 분동용적, Volumn of distribution at steady state
<실험예 5: 바이오디스트리뷰션(Biodistribution) 실험>
SD 웅성 래트를 에테르로 가볍게 마취한 후 대퇴 정맥에 폴리에틸렌 터빙(polyethylene tubing) (PE-50, intramedic, Clay-Adams)을 케뉼레이션(cannulation)하였다. 약 30-60분 정도 안정화 시킨 후 상기 실시예 23 및 26에 따라 제조된 고분자 마이셀형 항암제(MD)와 free 독소루비신 (FD) 제형을 각각 10 mg/kg (독소루비신 기준)의 양으로 정맥으로 투여하고 약물투여 2시간 후에 래트를 디캡피테이션(decapitation)시키고 간(liver), 심장(heart), 신장(kidney), 폐(lung), 지라(spleen)을 적출하여 이들 조직 약 1g을 취하여 cold saline(0.9% NaCl)으로 씻어주고 각 조직의 무게를 잰 후 그 4배에 해당하는 cold saline(0.9% NaCl)를 가하고 조직 균질화기(tissue homogenizer) (Ultra-Turrax T25, Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik)를 사용하여 3분간 균질화시키고 원심분리 (3000 rpm, 10 min)하여 상청액 0.1 ml을 취하여 HPLC로 각 조직에서의 독소루비신 분포(Biodistribution) 농도를 측정한 결과를 도 13a 및 13b에 나타내었다. 도 13a는 실시예23의 결과이고, 도 13b는 실시예 26의 결과이다.
도 13a 및 도 13b에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 고분자 마이셀형 항암제의 경우 대부분의 조직에서 FD에 비해 조직 분포가 더 높았으나, 독소루비신의 부작용을 나타내는 심장의 경우 FD에 비해 조직 분포가 적어서 부작용이 더 적을 것으로 예상되었다. 또한 간(liver)이나 폐(lung)에서 MD의 경우가 정상 조직에 비해 암조직에 더 많이 분포했다.
<실험예 6: 본 발명에 따른 고분자 마이셀형 항암제 내의 독소루비신 함량 측정>
염산독소루비신(보령제약) 약 10 mg을 정밀하게 취하고(in 100 mL 용량플라스크) 디메칠설폭사이드(DMSO) 80 mL를 넣어 10분간 교반하여 녹이고 디메칠설폭사이드를 넣어 정확하게 100 mL로 한 다음, 이 액 10 mL를 정확하게 취하여 이동상을 넣어 정확하게 100 mL로 한 액을 표준액으로 하였다. 상기 실시예 23에서 제조한 고분자 마이셀 약 100 mg을 정밀하게 취하고(in 100 mL 용량플라스크) 디메칠설폭사이드(DMSO) 10 mL를 넣어 10분간 교반하여 녹이고 이동상을 넣어 정확하게 100 mL로 한 액을 검액으로 하였다. 분석은 검액 및 표준액을 가지고 다음 시험조건에서 액체크로마토그래피법에 따라 시험하여 독소루비신의 피크면적 At 및 As를 구하였다. (전처리 및 분석과정은 전체적으로 차광한 곳에서 신속하게 실험한다.)
독소루비신(C27H29NO11)의 양(mg)
= 염산독소루비신 표준품의 양(mg) = 0.9371 x (At/As) x 1/10
0.9371 : 독소루비신의 분자량(543.53)/염산독소루비신의 분자량(579.99)
SHIM-PACK VP-ODS 250x4.6 컬럼을 사용하고, 이동상으로는 H2O : ACN = 7:3을 사용하여 HPLC로 정량하였다. 이때, 유속은 1.0ml/min으로 하였고 온도는 상온 그리고 검출기는 형광 검출기 (Ex.:480 Em.:560nm)를 사용하였다. 도 14(a)에 독소루비신의 특성 피크와 도 14(b)에 고분자 마이셀형 항암제의 HPLC 피크를 나타내었다.
<실험예 7: 독소루비신 base 제조방법에 따른 봉입률 비교>
DMSO만 사용한 제조방법
염산 독소루비신 10, 20, 40, 60 mg을 20 ml 바이알에 넣고 DMSO 1ml를 첨가하여 용해한 다음 이 용액에 트리에틸아민 (2 eq)을 넣고 약 10분 동안 교반한다. 100 ml 비이커에 상기 제조예 1에서 제조된 중합체(PEO-TMA-FA) 750 mg, 산화철(iron oxide) 250 mg, 물 10 ml를 첨가한 후에 독소루비신을 넣고 비이커 위를 호일로 쌓은 후 2시간 동안 소니케이션을 실행한다. 그리고 나서 이 용액을 50 ml 코니컬 튜브에 담고 2000 rpm에서 10분간 원심분리하여 샘플을 제조하였다. 투석을 위하여 우선 20 l DDW에 만니톨 1000 g을 녹여 5% 만니톨 용액을 제조하고, 이 때 pH는 NaOH를 사용하여 7.4로 조절하였다. 그리고 나서 미리 물에 불린 투석 멤브레인(dialysis membrane) (MWCO=3,500)에 원심분리가 끝난 샘플을 넣은 다음 홀더로 앞뒤를 묶어 용액이 담긴 투석용 용기에 담근 후 5% 만니톨 용액을 갈아주면서 24시간 동안 500 rpm으로 교반하며 투석을 진행하였다. 투석을 완료한 샘플을 딥 프리저(deep freezer)에 넣어 얼린 후 동결건조기를 사용하여 3일간 냉동건조시켜 최종적으로 독소루비신이 봉입된 마이셀을 제조한다.
공동-용매(
Co
-
solvent
) 사용(
DMSO
+물)
염산 독소루비신 10, 20, 40, 60 mg을 20 ml 바이알에 넣고 DMSO 0.5ml를 첨가하여 용해한 다음 이 용액에 물 3ml을 넣고 트리에틸아민 (2 eq)을 넣고 약 10분 동안 교반한다. 100 ml 비이커에 상기 제조예 1에 따라 제조된 중합체 (PEO-TMA-FA) 750 mg, 산화철(iron oxide) 250 mg, 물 7 ml를 첨가한 후에 독소루비신을 넣고 비이커 위를 호일로 쌓은 후 2시간 동안 소니케이션을 실행하였다. 그리고 나서 이 용액을 50 ml 코니컬 튜브에 담고 2000 rpm에서 10분간 원심분리하여 샘플을 제조하였다. 투석(Dialysis)을 위하여 우선 20 l DDW에 만니톨 1000 g을 녹여 5% 만니톨 용액을 제조하고, 이 때 pH는 NaOH를 사용하여 7.4로 조절하였다. 그리고 나서 미리 물에 불린 투석 멤브레인(dialysis membrane) (MWCO=3,500)에 원심분리가 끝난 샘플을 넣은 다음 홀더(holder)로 앞뒤를 묶어 용액이 담긴 투석용 용기에 담근 후 5% 만니톨 용액을 갈아주면서 24시간 동안 500 rpm으로 교반하며 투석을 진행하였다. 투석이 완료한 샘플을 딥 프리저(deep freezer)에 넣어 얼린 후 동결건조기를 사용하여 3일간 냉동 건조시켜 최종적으로 독소루비신이 봉입된 마이셀을 제조한다. 고분자 마이셀형 항암제의 봉입률을 하기 표 3, 4 및 도 15에 나타내었다. 표 3은 DMSO만을 사용한 경우의 결과이고, 표 4는 DMSO와 물을 함께 사용한 경우의 결과를 나타낸다. 표 3 및 도 15에 나타난 바와 같이, DMSO만 사용한 경우에 봉입률이 훨씬 높았다.
독소루비신 무게 (mg) | 입자 크기 (nm) | 봉입률 (%) | 봉입량 (mg/ml) |
10 | 62.9 | 30.77 | 0.3 |
20 | 63 | 28.18 | 0.56 |
40 | 61.1 | 34.81 | 1.39 |
60 | 71.9 | 40.2 | 2.4 |
독소루비신 무게 (mg) | 입자 크기 (nm) | 봉입률 (%) | 봉입량 (mg/ml) |
10 | 62.4 | 29.98 | 0.3 |
20 | 69.2 | 16.41 | 0.33 |
40 | 64.7 | 5.23 | 0.21 |
60 | 49.2 | 6.67 | 0.4 |
<실험예 8: 래트의 고분자 마이셀형 항암제 투여 후의 종양성장 측정>
간암 모델을 만들기 위해 8주령의 SD 계통 수컷 쥐에 디에틸 니트로사민(diethyl nitrosamine)을 1:10,000으로 희석한 물을 종양이 생기기 전까지 12주 동안 매일 공급하였다. 간암 형성은 100% 이루어졌으며, 사육 10주 후 MRI로 종양의 유무를 확인하였다. 제일 큰 종양의 크기가 직경 5mm가 되었을 때 생리식염수(saline), 독소루비신(ADM), 상기 실시예 23 및 26에 따라 제조된 고분자 마이셀형 항암제 (YCC)를 2 mg/kg 용량으로 쥐의 꼬리에 정맥주사하고 다시 MRI 촬영을 하였다. 5일 간격으로 3번씩 정맥주사하고 마지막 정맥주사 1주일 후 MRI 촬영을 통해 종양의 크기를 비교하였다. 도16a는 실시예 23의 종양의 크기와 체중변화를, 도 16b는 실시예 26의 종양의 크기와 체중변화를 나타낸 것이다. 도 16c는 실시예 23의 MRI 사진이며, 도16d는 실시예 26의 MRI사진이다. 도 16a와 16b에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 고분자 마이셀형 항암제가 종양 성장이 가장 억제된 것을 알 수 있었다. 또한 본 발명에 따른 고분자 마이셀형 항암제는 체중 손실을 가져오지 않았다. 도 16c 및 도 16d에 나타난 바와 같이, 생리식염수와 독소루비신의 경우 오히려 종양의 크기가 커진 반면, 본 발명에 따른 고분자 마이셀 제제를 투여한 경우에는 종양의 크기가 매우 작아진 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 9: 종양 이식한 후 고분자 마이셀형 항암제 투여에 따른 래트의 체중변화 측정>
상기 실시예 23 및 26에 따라 제조된 고분자 마이셀형 항암제를 래트의 꼬리 정맥에 2mg/ml로 정주한 후 약물투여에 따른 래트의 체중변화를 측정하였다. 도 16a 및 16b에 나타나 있다. 도 16a는 실시예 23의 결과이며, 도 16b는 실시예 26의 결과이다. 도 16a와 16b에 나타난 바와 같이, 약물투여 후 죽은 쥐는 한 마리도 없이 생존율 100%였다.
본 발명에 따른 고분자 마이셀형 항암제는 암을 치료하는 것과 동시에 조영제로서도 기능하여 암의 진단 및 병기의 추이를 모니터링할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 고분자 마이셀형 항암제는 독소루비신의 심장 독성의 부작용을 현격히 감소시킬 수 있다. 본 발명은 나노 크기 입자 형태로 항암제를 제공함으로써 상대 적으로 혈관 내벽 세포 연접이 느슨한 암세포 조직에 항암제가 특이적으로 전달되는 타겟팅 효과를 낼 수 있다. 또한, 이와 같은 높은 타겟팅 효과로 인해 항암제의 사용량을 줄일 수 있고 이로써 부작용과 독성을 현저히 감소시킬 수 있다. 또한, 종래와 동등한 양을 사용하는 경우 타겟팅으로 인해 더욱 높은 항암 효과를 얻을 수 있다. 본 발명에 따른 고분자 마이셀형 항암제는 약물이 서서히 방출되도록 하여 약물의 효능을 장시간 유지하고 일시적인 대량 방출에 따른 부작용을 예방할 수도 있다. 또한, 본 발명에 따른 고분자 마이셀형 항암제는 용해성이 우수하고 제형이 안정하며 환자들에게 투여시 부작용이 적은 장점이 있다.
Claims (25)
- 제1항에 있어서,상기 사슬 말단 기능성화된 중합체는 상기 화학식1의 R이 노말 부틸인 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제.
- 제1항에 있어서,상기 사슬 말단 기능성화된 중합체는 화학식 1의 R이 메톡시인 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제.
- 제1항에 있어서, 상기 사슬 말단 기능성화된 중합체는 수평균 분자량이 1,100 내지 23,000인 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제.
- 제1항에 있어서, 상기 고분자 마이셀형 항암제의 입자 크기는 30 내지 200nm 인 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제.
- 제1항에 있어서, 상기 사슬 말단 기능성화된 중합체, 상기 조영물질 및 상기 화학요법제의 중량비는 5~50 : 2.5~20: 1~2 (중합체:조영물질:화학요법제)인 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제.
- 제1항에 있어서, 상기 조영물질은, 산화철, 가돌리늄, 망간, 알루미늄, 실리콘, 바륨, 이트륨 및 희토류 원소 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제.
- 제1항에 있어서, 상기 조영물질은 산화철인 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제.
- 제1항에 있어서, 상기 화학요법제는, 독소루비신 (Doxorubicin), 아드리아마이신 (Adriamycin), 시스플라틴 (Cisplatin), 탁솔 (Taxol), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 또는 약제학적으로 허용되는 그 염인 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제.
- 제1항에 있어서, 상기 화학요법제는 독소루비신 또는 약제학적으로 허용되는 그 염 인 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제.
- 제1항에 있어서, 상기 화학요법제는 독소루비신의 염산염인 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제.
- 제1항에 있어서, 상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제.
- 제1항에 있어서, 상기 암은 원발성암인 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제.
- 제1항에 있어서, 상기 암은 전이암인 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제.
- 제15항에 있어서,상기 사슬 말단 기능성화된 중합체는 상기 화학식 1의 R이 노말 부틸인 것을 특징으로 하는 암의 진단을 수행하는 고분자 마이셀형 조영제.
- 제15항에 있어서,상기 사슬 말단 기능성화된 중합체는 화학식 1의 R이 메톡시인 것을 특징으로 하는 암의 진단을 수행하는 고분자 마이셀형 조영제.
- 제15항에 있어서, 상기 사슬 말단 기능성화된 중합체는 수평균 분자량이 1,100 내지 23,000인 것을 특징으로 하는 암의 진단을 수행하는 고분자 마이셀형 조영제.
- 제15항에 있어서, 상기 고분자 마이셀형 조영제의 입자 크기는 30 내지 200nm 인 것을 특징으로 하는 암의 진단을 수행하는 고분자 마이셀형 조영제.
- 제15항에 있어서, 상기 사슬 말단 기능성화된 중합체 및 상기 조영물질의 중량비는 1~10 : 0.5~4 (중합체:조영물질)인 것을 특징으로 하는 암의 진단을 수행하는 고분자 마이셀형 조영제.
- 제15항에 있어서, 상기 조영물질은, 산화철, 가돌리늄, 망간, 알루미늄, 실리콘, 바륨, 이트륨 및 희토류 원소 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 암의 진단을 수행하는 고분자 마이셀형 조영제.
- 제15항에 있어서, 상기 조영물질은 산화철인 것을 특징으로 하는 암의 진단을 수행하는 고분자 마이셀형 조영제.
- 제1항에 따른 고분자 마이셀형 항암제의 제조방법으로서,약물을 DMSO(디메틸설폭사이드)에 용해시켜 약물의 DMSO 용액을 제조하는 제1단계;상기 얻어진 용액에 트리에틸아민을 첨가하는 제2단계;사슬 말단 기능성화된 중합체를 DMSO에 용해시켜 중합체의 DMSO 용액을 제조하는 제3단계;상기 얻어진 약물의 DMSO 용액과 중합체의 DMSO 용액을 혼합하는 제4단계;상기 얻어진 용액에 조영물질을 첨가하는 제5단계; 및상기 얻어진 용액을 투석하고 동결건조시키는 제6단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 고분자 마이셀형 항암제의 제조방법.
- 제23항에 있어서,상기 약물은 독소루비신 염산염이고,상기 조영물질은 산화철이며,상기 제1단계는 독소루비신 염산염을 DMSO에만 용해시키는 것을 특징으로 하는 고분자 마이셀형 항암제의 제조방법.
- 제15항에 따른 고분자 마이셀형 조영제의 제조방법으로서,사슬 말단 기능성화된 중합체를 DMSO에 용해시켜 중합체의 DMSO 용액을 제조하는 제1단계;상기 얻어진 중합체 용액에 조영물질을 첨가하는 제2단계;및상기 얻어진 용액을 투석하고 동결건조시키는 제3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 진단을 수행하는 고분자 마이셀형 조영제의 제조방법.
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