KR100867320B1 - 간보호, 또는 간섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료용조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유효성분으로서, 별갑(鱉甲, Trionycis Carapax), 나복자(蘿蔔子, Raphani Semen), 인진(茵蔯, Artemisia capillaris Herba), 백출(白朮, Atractylodis Macrocephalae Rhizoma), 백복령(白茯笭, Poria cocos), 택사(澤瀉, Alismatis Rhizoma), 창출(蒼朮, Atractylodis Rhizoma), 단삼(丹蔘, Salvia Miltiorrhizae Radix), 저령(猪령, Polyporus), 사인(砂仁, Amomi Fructus), 지실(枳實, Ponciri Fructus), 감초(甘草, Glycyrrhizae Radix) 및 목향(木香, Helenii Radix)을 포함하는 혼합물의 수추출물을 함유하는, 간보호, 또는 간섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

간섬유화, 간경화, 간경변, 간보호, 한약재, CGX

Description

간보호, 또는 간섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for protecting liver, or for preventing or treating liver fibrosis or cirrhosis}

도 1은 본 발명에 사용된 6가지 한약재의 지표성분을 이용한 지문을 보여주는 도면이고;

도 2는 랫트의 DMN(dimethylnitrosoamine)-유도 만성 간 손상 모델에서 본 발명의 조성물이 상대적 기관 무게에 미치는 영향을 나타낸 그래프이며;

도 3a는 랫트의 DMN-유도 만성 간 손상 모델에서 본 발명의 조성물 처리 시 간의 전체적인 외관을 보여주는 사진이고;

도 3b는 랫트의 DMN-유도 만성 간 손상 모델에서 본 발명의 조성물 처리 시 조직학적 검사결과를 보여주는 사진이며;

도 4는 랫트의 DMN-유도 만성 간 손상 모델에서 본 발명의 조성물이 혈청 총 단백질, 총 빌리루빈, ALP, AST 및 ALT 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고;

도 5는 랫트의 DMN-유도 만성 간 손상 모델에서 본 발명의 조성물이 간 조직 내 지질 과산화물 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이며;

도 6은 랫트의 DMN-유도 만성 간 손상 모델에서 본 발명의 조성물이 간 조직 내 하이드록시프롤린 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이며;

도 7은 랫트의 DMN-유도 만성 간 손상 모델에서 본 발명의 조성물이 간섬유화-관련 유전자의 발현에 미치는 영향을 보여주는 사진이다.

본 발명은 간보호, 또는 간섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료 효과를 갖는 한약재 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 유효성분으로서 13종의 특정 한약재를 포함하는 혼합물의 수추출물을 함유하여 간세포를 보호하고 간 손상에 의한 간섬유화의 발생과 간경화의 진행을 억제하고 치료하는 효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.

간장 질환의 다양한 패턴과 병의 진행에 있어서 임상적으로 환자의 경과에 가장 중요한 단계는 간섬유화(fibrosis)나 간경화 또는 경변(cirrhosis)의 발생을 억제하거나, 간경화가 이미 시작된 경우에는 그 진행을 억제하는 것이다. 따라서 간장 질환의 치료를 연구하는 대부분의 수많은 연구자들은 간경변의 예방 또는 치료제의 개발에 노력을 기울여 왔다. 그럼에도 불구하고, 아직까지 만족할만한 효과를 거둘 수 있는 치료법이나 치료약물이 없는 실정이다.

일반적으로, 과도한 알코올의 섭취나 독성 물질에 의한 간세포의 손상, 또는 만성 바이러스성 간염으로 지속적으로 간세포가 파괴되면 간조직을 구성하고 있는 간세포의 숫자는 점차 줄어들고, 지용성 비타민들을 저장하고 있는 이또세포(Ito cells)가 섬유질을 만드는 섬유아세포(fibroblasts)로 형질전환(transformation)되면서 간조직 내에 섬유질의 양이 증가하게 된다. 따라서 섬유아세포의 활성화나 섬유질 생성의 억제가 간경화의 억제 또는 치료나 이를 위한 약물의 개발에 중요한 수단이 되고 있다.

최근에, 이러한 간섬유화 과정을 촉발하고 진행시키는 기전으로 활성산소(reactive oxygen species, ROS)의 과도한 발생과 이를 제거하는 방어기전인 글루타티온 시스템(glutathione system), 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제(catalase)의 부족 등이 보고되어 있다. 이러한 상황은 세포막을 포함한 세포내 분자들을 산화시키고, 지질 과산화(lipid peroxidation)의 정도를 측정함으로써 조사될 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한 세포가 파괴되는 과정에서는 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α), 유도성 질산화물 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS), 형질전환 성장인자-베타(transforming growth factor-beta, TGF-β)와 같은 염증관련 유전자들이 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.

지금까지 실리마린(silymarin)과 같은 한약재에서 추출한 여러 가지 단일성분이나, 시호(柴胡), 황금, 인삼, 반하(半夏), 감초, 생강, 대추를 달여 만든 소시호탕(小柴胡湯)과 같은 복합처방이 간세포를 보호하고 상기한 지질 과산화나 염증관련 유전자들의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 실제 임상에서 널리 사용되고 있다. 그러나 이러한 약물들은 간의 염증 개선에서는 일정한 유효성을 보여주고 있으나, 간의 섬유화나 경화의 진행을 억제하는 것에는 크게 미치지 못하고 있는 실정이다. 또한 간경화는 매우 복잡한 과정으로 많은 병리학적 인자들이 관여할 것으로 믿어지기 때문에, 오랜 임상경험을 바탕으로 축적되어온 한의학적 복합처방을 현대 과학적인 실험을 통해 변형시킴으로써 보다 우수한 효능을 갖는 약물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

한국공개특허 제2005-100746호는 인진, 창출, 후박, 진피, 저령, 택사, 백출, 복령, 나복자, 생강, 반하, 대복피, 삼릉, 봉출, 청피 및 감초를 포함하는 혼합 생약재로부터 열탕 추출한 간섬유화 억제 추출물 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 개시하고 있다. 또한, 한국공개특허 제2005-116007호는 인진, 백출, 운지, 와송 및 저령 추출물을 필수적으로 함유하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 개시하고 있다. 또한, 한국공개특허 제2006-104405호는 위모 3 내지 5 중량부, 모려분 3 내지 5 중량부, 백렴 3 내지 5 중량부, 제조 3 내지 5 중량부, 인진 1 내지 3 중량부, 택사 1 내지 3 중량부, 섬수 1 내지 3 중량부, 사간 1 내지 3 중량부, 편축 0.5 내지 1.5 중량부, 나복자 0.5 내지 1.5 중량부, 울금 0.5 내지 1.5 중량부, 승마 0.5 내지 1.5 중량부, 백복령 0.5 내지 1.5 중량부, 비파엽 0.5 내지 1.5 중량부, 감초 0.5 내지 1.5 중량부, 정력자 0.1 내지 1 중량부 및 고백반 0.1 내지 1 중량부의 17종의 복합 생약 분말을 용매로 추출하여 제조되는 간섬유화의 예방 및 치료용 한약 추출물을 개시하고 있다. 그러나 이들 조성물은 본 발명과 같은 13종의 한약재를 사용한 것이 아니며, 제각기 간섬유화에 효과가 있다고 주장하고 있으나 그 효능 면에서 여전히 개선의 여지를 안고 있다.

본 발명자들은 간세포가 만성적으로 파괴되면서 간경화가 유발되는 동물모델을 이용하여 다양한 조성의 한약재 조성물에 대해 연구하고 실험한 결과, 13종의 특정 한약재의 혼합 수추출물이 간의 섬유화의 예방 및 치료에 탁월한 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 간보호, 또는 간섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료효과를 갖는 새로운 한약재 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 유효성분으로서, 별갑, 나복자, 인진, 백출, 백복령, 택사, 창출, 단삼, 저령, 사인, 지실, 감초 및 목향을 포함하는 혼합물의 수추출물을 함유하는, 간보호, 또는 간섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물에서, 상기 혼합물은 건조중량 기준으로 별갑 2.5~7.5 중량부, 나복자 2.5~7.5 중량부, 인진 2.5~7.5 중량부, 백출 1.5~4.5 중량부, 백복령 1.5~4.5 중량부, 택사 1.5~4.5 중량부, 창출 1.5~4.5 중량부, 단삼 1.5~4.5 중량부, 저령 1~3 중량부, 사인 1~3 중량부, 지실 1~3 중량부, 감초 0.5~1.5 중량부 및 목향 0.5~1.5 중량부를 포함하는 것이 바람직하고, 별갑 5 중량부, 나복자 5 중량부, 인진 5 중량부, 백출 3 중량부, 백복령 3 중량부, 택사 3 중량부, 창출 3 중량부, 단삼 3 중량부, 저령 2 중량부, 사인 2 중량부, 지실 2 중량부, 감초 1 중량부 및 목향 1 중량부를 포함하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적 또는 식품학적으로 허용되는 담체를 추가로 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 간보호, 또는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료용 의약, 건강식품 또는 건강보조식품으로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 사용되는 제1한약재인 별갑(鱉甲, Trionycis Carapax)은 자라의 등딱지를 한방에서 이르는 말로서, 해열제, 강장제로 쓰인다.

본 발명에 사용되는 제2한약재인 나복자(羅蔔子, Raphani Semen)는 기를 통하게 하고 체한 것을 내려가게 하는 효능이 있어서 복부창만, 트림, 위산과다, 설사 등에 사용한다. 기를 내리고 가래를 삭히며 해수, 천식, 변비에 효과가 있으며, 식욕부진을 치료하고, 오래된 담, 오래된 기침을 멈추게 하는 효과가 있다.

본 발명에서 사용되는 제3한약재인 인진(茵蔯, Artemisia capillaris Herba)은 습열(濕熱)로 인한 황달 즉 급성간염으로 발연, 전신황색, 소변이 붉고 적은 증상 등에 사용한다. 또한 만성간염, 간경변증, 간암, 담낭염, 담낭결석에도 사용하며, 습진, 옴, 버짐, 풍진 등의 피부 질환과 돌림병으로 열이 몹시 나고 발광하는 증상에도 사용한다.

본 발명에서 사용되는 제4한약재인 백출(白朮, Atractylodis Macrocephalae Rhizoma)은 비위(脾胃)의 기능이 허약해서 소식, 권태감이 생기고 얼굴빛이 황색이며 대변을 묽게 보거나 설사에 좋으며 수분이 정체되어 전신이 붓고 소화가 안 될 때 수분 배설을 돕는다. 비(脾)에 수(水)와 습(濕)이 쌓여 담음(痰飮)으로 인한 가슴 뜀, 기침, 맑은 가래 등에도 쓰며 비기(脾氣) 허약으로 피부에 땀이 저절로 날 때, 임신 구토에도 사용한다. 위장 장애가 있는 감기, 사지동통에도 쓴다.

본 발명에 사용되는 제5한약재인 백복령(白茯笭, Poria cocos)은 옛날부터 강장제로 사용되었으며, 폐경(肺經), 비경(脾經), 심경(心經), 신경(腎經), 방광경(膀胱經)에 작용하여 비장을 보하고 가래를 삭이며 정신을 안정시킨다.

본 발명에 사용되는 제6한약재인 택사(澤瀉, Alismatis Rhizoma)는 한방에서 이뇨제, 수종, 임질에 약으로 쓴다.

본 발명에서 사용되는 제7한약재인 창출(蒼朮, Atractylodis Rhizoma)은 발한, 이뇨, 진통, 건위 등에 효능이 있어 식욕부진, 소화불량, 위장염, 감기 등에 쓰인다.

본 발명에서 사용되는 제8한약재인 단삼(丹蔘, Salvia Miltiorrhizae Radix)은 부인의 생리불순, 생리통, 산후 복통에 쓰이고, 어혈성의 심복부동통과 타박상을 치료하며, 불면증, 피부 발진 등에 사용한다.

본 발명에서 사용되는 제9한약재인 저령(猪령, Polyporus)은 한방에서 이뇨제로 사용된다.

본 발명에서 사용되는 제10한약재인 사인(砂仁, Amomi Fructus)은 습이 비위를 침범하여 구역, 복통, 설사, 심와부 통증이 있을 때 사용하며, 기의 순행을 도와 위를 강하게 한다.

본 발명에서 사용되는 제11한약재인 지실(枳實, Ponciri Fructus)은 방향성 고미건위약으로 사용된다.

본 발명에서 사용되는 제12한약재인 감초(甘草, Glycyrrhizae Radix)는 쓴 약을 달게 하여 먹기 좋게 하는 것뿐만 아니라, 모든 약의 독성을 풀어 주고 기침과 담을 삭이며 모든 약을 중화하는 역할을 한다.

본 발명에서 사용되는 제13한약재인 목향(木香, Helenii Radix)은 발한, 이뇨, 거담제로 사용하며 구충성분이 있다.

본 조성물의 유효성분은 별갑, 나복자, 인진, 백출, 백복령, 택사, 창출, 단삼, 저령, 사인, 지실, 감초 및 목향, 바람직하게는 건조중량 기준으로 별갑 2.5~7.5 중량부, 나복자 2.5~7.5 중량부, 인진 2.5~7.5 중량부, 백출 1.5~4.5 중량부, 백복령 1.5~4.5 중량부, 택사 1.5~4.5 중량부, 창출 1.5~4.5 중량부, 단삼 1.5~4.5 중량부, 저령 1~3 중량부, 사인 1~3 중량부, 지실 1~3 중량부, 감초 0.5~1.5 중량부 및 목향 0.5~1.5 중량부, 가장 바람직하게는, 별갑 5 중량부, 나복자 5 중량부, 인진 5 중량부, 백출 3 중량부, 백복령 3 중량부, 택사 3 중량부, 창출 3 중량부, 단삼 3 중량부, 저령 2 중량부, 사인 2 중량부, 지실 2 중량부, 감초 1 중량부 및 목향 1 중량부를 포함하는 혼합물의 수추출물, 특히 열수 추출물이다.

본 발명에서는, 예를 들어, 별갑 5 중량부, 나복자 5 중량부, 인진 5 중량부, 백출 3 중량부, 백복령 3 중량부, 택사 3 중량부, 창출 3 중량부, 단삼 3 중량부, 저령 2 중량부, 사인 2 중량부, 지실 2 중량부, 감초 1 중량부, 목향 1 중량부로 이루어진 혼합물을 증류수에 전탕하고, 그 전탕액을 여과와 원심분리를 거친 후 동결건조하여 건조 추출물을 회수하여 사용할 수 있다.

상기한 한약재들의 조성비는 반복된 실험결과를 토대로 얻어진 것이며 그 하한치보다 낮을 경우에는 그 성분의 약리효과가 감소하며 그 상한치보다 높을 경우 에는 타성분의 약리효과가 감소될 수 있어 조성물의 상승작용 및 협동작용이 저하될 우려가 있으므로, 상기 조성비로 함유하는 것이 보다 바람직하다. 그러나 상기 조성비는 바람직한 예로서, 본 조성물의 약리효과에 부정적인 영향을 미치지 않는 범위 내에서 적당히 조정될 수 있는 바, 본 발명의 범위가 상기 조성비에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 간의 빌리루빈 대사능력과 간세포 손상을 유의성 있게 개선시키고, 간조직의 지질 과산화와 섬유화 및 경화를 효과적으로 억제하며, 간의 염증이나 섬유화와 관련된 유전자 발현을 억제하는 것으로 나타났다.

본 발명의 조성물을 약학적 제제의 형태로 제조하는 경우, 유효성분을 약제학적으로 허용되는 통상적인 담체와 함께 배합하여 투여 목적에 따라, 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 츄잉정, 분말제, 액제나 현탁제와 같은 경구 투여용 제제 또는 주사가능한 액제나 현탁제, 비강세척제 등과 같은 비경구 투여용 제제의 형태로 제형화할 수 있다.

경구 투여의 목적으로 본 발명의 유효성분을 정제, 캅셀제, 츄잉정, 분말제, 액제, 현탁제 등의 제제로 제형화하는 경우에는, 아라비아 고무, 옥수수 전분, 미세결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 인산이칼슘 또는 락토오즈와 같은 부형제, 알긴산, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 붕해제, 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 슈크로오즈 또는 사카린과 같은 감미제 및 페퍼민트, 메틸 살리실산염 또는 과일향과 같은 향미제가 포함될 수 있다. 단위 투여형이 캅셀제인 경우에는 상기 성분외에도 폴리에틸렌 글리콜 또는 지방유와 같은 액상 담체가 포 함될 수도 있다.

또한, 비경구 투여를 위한 용액 또는 현탁액 형태의 주사제는 비경구적으로, 예를 들면 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일반적으로, 주사가능한 용액 또는 현탁액은 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련된 설탕 용액제, 비휘발성 오일, 에탄올, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜류 등의 약제학적으로 허용되는 액상 담체 중에 유효량의 활성성분을 균질하게 혼합시켜 제조할 수 있다. 이외에도 필요에 따라 항세균제, 킬레이트제, 완충제, 보존제와 같은 보조제를 포함시킬 수도 있다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체로는 약제학적으로 순수하고, 실질적으로 무독성이며, 활성성분의 작용을 저해하지 않는 임의의 모든 보조제를 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기한 약학적 제제 외에도, 기존의 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품 또는 츄잉껌이나 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등에 적당량 배합하거나, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강식품이나 건강보조식품, 또는 식품 첨가제 등에 포함시켜 식품 또는 식품 보조제의 형태로 제조할 수도 있다.

본 발명에 따른 조성물은 통상 건조 추출물 기준으로 1 일 10~1,000 ㎎/㎏, 바람직하게는 100~500 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 100~200 ㎎/㎏의 용량으로 투여될 수 있지만, 이는 투여대상의 연령, 성별, 식이, 건강상태, 질환의 중증도, 투여방법, 투여시간, 약제혼합 등에 따라 적의 증감될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하지만 이들에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명에 따른 조성물 제조 및 성분 검증

생약 건조중량 기준으로 별갑 5 g, 나복자 5 g, 인진 5 g, 백출 3 g, 백복령 3 g, 택사 3 g, 창출 3 g, 단삼 3 g, 저령 2 g, 사인 2 g, 지실 2 g, 감초 1 g 및 목향 1 g을 혼합하여 증류수에 2 시간 전탕하였다. 얻어진 전탕액을 여과와 원심분리를 거친 후에 동결건조하여 최종적으로 전탕 전의 건조중량 대비 약 11%의 건조 추출물(이하, 'CGX'(Chunggan extract)라 칭함)을 회수하였다.

상기 추출물의 품질관리를 위해, 추출물 내 6종의 성분에 대해 지표성분(reference components)을 이용하여 HPTLC(High Performance Thin Layer Chromatography)에 의해 지문(fingerprint)을 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1의 A에서 ACH는 인진, DMC는 6,7-디메톡시쿠마린을; B에서 ARE는 백출, ATL은 아트락틸레놀라이드(atractylenolide) Ⅲ를; C에서 POC는 백복령, PCM은 파키만(pachyman)을; D에서 GLR은 감초, GAA는 글리시리진산 암모늄염(glycyrrhizinic acid ammonium salt)을; E에서 AUF는 지실, PNC는 폰시린(poncirin)을; F에서 SRE는 단삼, RMA는 로즈마린산(rosmarinic acid)을 각각 나타낸다.

실험예 1: 상대적 기관 무게 측정 및 간의 조직형태학적 검사

특정 병원체-결여 4 주령 웅성 위스타(Wistar) 랫트 40마리를 샘타코(한국)로부터 구입하여 3 주간 적응기간을 두고 22±2 ℃, 55±10% 상대습도 및 12 시간 명암주기에서 고형사료(샘타코)와 수돗물을 자유롭게 섭취하도록 하였다. 평균체중 210±15 g의 랫트를 무작위로 그룹당 8마리의 다섯 그룹(무투약: 무처리, DMN 4 주: 4 주간 DMN 처리 후 희생, 대조: 4 주간 DMN 처리 및 DMN 처리 제3주부터 4 주간 증류수 투여, 및 CGX 100 또는 CGX 200: 4 주간 DMN 처리 및 DMN 처리 제3주부터 4 주간 CGX 100 또는 200 ㎎/㎏ 투여)으로 나누었다. 식염수에 희석시킨 디메틸니트로소아민(dimethylnitrosoamine, DMN)을 DMN 4 주, 대조, CGX 100 및 CGX 200 그룹에 대해 매주 3 일간 연속하여 체중 ㎏당 10 ㎎/㎖로 복강내 주사하였다. DMN 4 주 그룹을 4 주 DMN 처리 끝에 희생시켰다. CGX 100, CGX 200 및 대조 그룹에게는 DMN 처리 제3주부터 시작하여 4 주간 매일 CGX(일일 100 또는 200 mg/kg) 또는 대조로서 증류수를 투여하였다.

모든 동물의 체중 변화를 실험기간 전체를 통해 매주 기록하고, 동물을 실험 마지막 날 또는 DMN 4 주 그룹의 경우 4 주 유도 후 희생시키고 간과 비장을 적출하여 칭량하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 4 주 DMN 처리는 대조군에 비해 상대적 간 무게를 감소시킨 반면, 상대적 비장 무게를 증가시켰다. 대조군에서 나타난 바와 같이 4 주 DMN 처리 후 2 주 DMN 중단은 이들 변화를 약간 회복시켰으며, 이러한 회복은 특히 비장 무게에서 CGX 투여에 의해 강화되었다.

조직형태학적 평가를 위해, 간조직의 일부를 보우인 용액(Bouin's solution)에 고정시켰다. 파라핀-포매된 간을 잘라내고(4 ㎛ 두께) 헤마톡실린 & 에오신 염색 및 메이슨 트리콤(Masson's trichome) 염색을 시행하였다. 괴사나 염증성 세포 침윤 및 섬유화와 같은 대표적인 조직병리학적 특징을 현미경 하에서 조사하였다.

도 3a에 육안으로 관찰한 간의 전체적인 외관을, 도 3b에 간의 조직학적 검사결과를 나타내었다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, DMN 처리는 간을 위축시키고 무디게 하며 울혈을 유발하는 것으로 나타난 반면, CGX 처리는 이들 변화를 반전시켰다. 또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 4 주간 DMN 처리는 심각한 국부 괴사, 염증성 세포 침윤, 출혈, 및 심각한 격막 섬유화를 유발하였으며, CGX 투여는 이들 현상에 대해 현저한 회복효과를 나타내었다(청색: 섬유질 부분).

실험예 2: 혈청 생화학적 분석

상기 랫트를 DMN 4 주 그룹의 경우 4 주 유도의 마지막 날 또는 다른 그룹의 경우 전체 실험의 마지막 날에 에테르로 마취한 후 복부 대동맥을 통해 채혈하였다. 혈액으로부터 혈청을 제조하고, 혈청 중 총 단백질, 알부민, 총 빌리루빈, 알칼라인 포스파타아제(ALP), 아스파테이트 트랜스아미나아제(AST), 및 알라닌 트랜스아미나아제(ALT)를 오토 케미스트리 애널라이저(Auto Chemistry Analyzer)(카이런사(Chiron Ltd.), USA)를 이용하여 측정하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, DMN으로의 4 주간 처리는 총 빌리루빈, ALP, AST 및 ALT의 상승과 함께 총 단백질 및 알부민의 감소 를 포함한, 간 기능부전을 유도하였다. 이들 생화학적 지수는 대조군에서 2 주간 중단 기간 후 부분적으로 회복되었으나 AST와 ALT 농도는 정상값과 여전히 유의하게 상이하였다. CGX 처리(100 ㎎/㎏)는 혈청 총 단백질 및 알부민 농도에 대해 유의한 회복 효과를 나타내었으며, 상승된 ALP 농도는 CGX 100 및 200 ㎎/㎏ 처리로 유의하게 감소하였다. 또한 AST의 농도를 거의 정상 수준으로 저하시켰으며 ALT 농도도 약간 감소시켰다.

실험예 3: 지질 과산화 및 하이드록시프롤린 측정

간 조직에서 지질 과산화를 티오바비튜르산 반응성 물질(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)의 방법을 이용하여 측정하였다. TBARS의 농도를 표준물질로서 1,1,3,3-테트라에톡시프로판(TEP)을 이용하여 조직 밀리그램 당 말론디알데히드(MDA)의 나노몰로 나타내었다. 간략하게, 0.2 g의 간 조직을 2 ㎖의 빙냉 11.5 g/ℓ KCl에서 균질화하고 0.13 ㎖의 균질물을 0.08 ㎖의 인산 및 0.26 ㎖의 0.67% 티오바비튜르산과 혼합하였다. 혼합물을 100 ℃에서 45 분간 가열한 후, 1.03 ㎖의 n-부탄올을 가한 후 격렬하게 혼합하고 3000 rpm에서 15 분간 원심분리하였다. 상부 유기층의 흡광도를 분광광도계로 535 및 520 ㎚에서 측정하고 표준물질로서 신선하게 제조된 TEP의 값과 비교하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 4 주 DMN 처리 동안 현저한 지질 과산화가 발생하였으며 2 주 중단 기간 동안에도 더 진행되었다. 이에 비해, 200 ㎎/㎏ CGX 투여는 이를 유의하게 저하시켰다.

또한, 하이드록시프롤린 어세이를 하기와 같이 수행하였다. 즉, -70 ℃에서 보관된 간 조직(0.2 g)을 2 ㎖의 6 mol/ℓ HCl에서 균질화하고 110 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 여과지를 이용하여 산 가수분해물을 여과한 후, 6 mol/ℓ HCl 중 50 ㎕의 샘플과 표준 하이드록시프롤린을 인큐베이션하여 HCl을 건조 제거하고, 50 ㎕의 메탄올, 1.2 ㎖의 500 ㎖/ℓ 이소프로판올, 및 200 ㎖의 클로라민 T 용액을 순차적으로 가한 후 실온에서 10 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 3 ㎖의 에를리히 용액(Ehrlich's solution)을 혼합물에 가하고 50 ℃에서 90 분간 더 인큐베이션하였다. 반응혼합물의 흡광도를 558 ㎚에서 측정하였다. 표준곡선을 0~1.0 ㎎/50 ㎕의 하이드록시프롤린 용액을 이용하여 제작하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, DMN 처리로 하이드록시프롤린은 급격하게 증가하였으며, CGX 투여는 이를 현저하게 억제하였다.

실험예 4: 섬유화-관련 유전자 발현 분석

총 RNA를 간 조직 샘플로부터 트리졸(인비트로젠(Invitrogen), USA), RNAlater(앰비온사(Ambion, Inc.), USA) 및 RNA 이지 칼럼(퀴아젠사(Qiagen, Inc.), USA)을 이용하여 추출하였다. 상보적 DNA(cDNA)를 10 pmol의 올리고 dT 및 10 pmol/ℓ의 랜덤 헥사머(바이오니아, 한국)를 이용하여 합성하고, 정량적 실시간 PCR을 SYBR 그린 슈퍼믹스 시약(바이오-래드(Bio-Rad), USA)을 이용하여 수행하였다. 사용된 프라이머는 각각 아래와 같았다.

① β-액틴

정방향: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'(서열번호 1)

역방향: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'(서열번호 2)

② 종양괴사인자-알파(TNF-α)

정방향: 5'-CTCCCAGGTTCTCTTCAAGG-3'(서열번호 3)

역방향: 5'-TGGAAGACTCCTCCCAGGTA-3'(서열번호 4)

③ 형질전환 성장인자-베타(TGF-β)

정방향: 5 '-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3'(서열번호 5)

역방향: 5'-TTCTCTGTGGAGCTGAAGCA-3'(서열번호 6)

④ 유도성 질산화물 합성효소(iNOS)

정방향: 5 '-TGGTGGTGACAAGCACATTT-3'(서열번호 7)

역방향: 5 '-CTGAGTTCGTCCCCTTCTCC-3'(서열번호 8)

⑤ Fas-리간드(Fas-L)

정방향: 5'-ACTCCGTGAGTTCACCAACC-3'(서열번호 9)

역방향: 5'-CAAGACTGACCCCGGAAGTA-3'(서열번호 10)

반응을 12.5 ㎕의 iQ SYBR 그린 슈퍼믹스, 1 ㎕의 10 pmol/ℓ 프라이머 쌍, 10.5 ㎕의 증류수, 및 1 ㎕의 cDNA를 이용하여 수행하였다. 각 PCR 런을 아래 조건 하에서 수행하였다: 95 ℃에서 5 분간 최초 변성, 95 ℃ 1 분 변성, 58 ℃ 40 초 어닐링, 및 72 ℃ 40 초 연장을 포함하는 40 증폭 주기 후 단일 형광 측정.

그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, CGX는 세포 파괴와 염증 및 간섬유화의 과정에서 중요한 역할을 담당하는 TNF-α, iNOS, TGF-β, Fas-L 유전자의 발현을 현저하게 억제하였다.

실험예 5: 독성시험

40마리의 비이글 도그(Beagle dogs)(수컷: 20마리, 암컷: 20마리)에게 각각 CGX의 임상-권유 용량(100 ㎎/㎏)의 50배(5 g/㎏; 급성 독성시험)와 4배(400 ㎎/㎏; 아급성 독성시험) 량을 투여하였다. 부정적인 영향을 임상적 징후, 부검, 조직병리학적 소견, 혈액학, 요검사 및 생화학적 분석을 이용하여 정상 및 약물-투여 군 간의 차이를 비교함으로써 조사하였다.

급성 시험에서, 체중, 설사, 사망률 및 주요 기관의 조직병리학에 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 조직병리학, 혈액학, 요검사 및 생화학적 분석에서 어떠한 약물-유도된 이상도 발견되지 않았다. 따라서 CGX는 광범위한 치료 지수로 임상적 적용에서 사용할 때 매우 안전한 것으로 여겨졌다.

본 발명의 조성물은 DMN-유도된 만성 간 손상 모델에서 간의 빌리루빈 대사능력과 간세포 손상을 유의성 있게 개선시키고, 간조직의 지질 과산화와 섬유화 및 경화를 효과적으로 억제하며, 간의 염증이나 섬유화와 관련된 유전자 발현을 현저하게 억제함으로써, 간보호, 또는 간섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료제로서 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 생체에 무독하여 매우 안전하다.

<110> SON, Chang Gue <120> Compositions for protecting liver, or for preventing or treating liver fibrosis or cirrhosis <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for beta-actin <400> 1 gtggggcgcc ccaggcacca 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for beta-actin <400> 2 ctccttaatg tcacgcacga tttc 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TNF-alpha <400> 3 ctcccaggtt ctcttcaagg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TNF-alpha <400> 4 tggaagactc ctcccaggta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TGF-beta <400> 5 tgagtggctg tcttttgacg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TGF-beta <400> 6 ttctctgtgg agctgaagca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for iNOS <400> 7 tggtggtgac aagcacattt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for iNOS <400> 8 ctgagttcgt ccccttctcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Fas-L <400> 9 actccgtgag ttcaccaacc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Fas-L <400> 10 caagactgac cccggaagta 20

Claims (8)

1. 유효성분으로서, 별갑(鱉甲, Trionycis Carapax), 나복자(羅蔔子, Raphani Semen), 인진(茵蔯, Artemisia capillaris Herba), 백출(白朮, Atractylodis Macrocephalae Rhizoma), 백복령(白茯笭, Poria cocos), 택사(澤瀉, Alismatis Rhizoma), 창출(蒼朮, Atractylodis Rhizoma), 단삼(丹蔘, Salvia Miltiorrhizae Radix), 저령(猪령, Polyporus), 사인(砂仁, Amomi Fructus), 지실(枳實, Ponciri Fructus), 감초(甘草, Glycyrrhizae Radix) 및 목향(木香, Helenii Radix)을 포함하는 혼합물의 수추출물을 함유하는, 간섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 혼합물이 건조중량 기준으로 별갑 2.5~7.5 중량부, 나복자 2.5~7.5 중량부, 인진 2.5~7.5 중량부, 백출 1.5~4.5 중량부, 백복령 1.5~4.5 중량부, 택사 1.5~4.5 중량부, 창출 1.5~4.5 중량부, 단삼 1.5~4.5 중량부, 저령 1~3 중량부, 사인 1~3 중량부, 지실 1~3 중량부, 감초 0.5~1.5 중량부 및 목향 0.5~1.5 중량부를 포함하는 것인 약학 조성물.
3. 제2항에 있어서, 혼합물이 건조중량 기준으로 별갑 5 중량부, 나복자 5 중량부, 인진 5 중량부, 백출 3 중량부, 백복령 3 중량부, 택사 3 중량부, 창출 3 중량부, 단삼 3 중량부, 저령 2 중량부, 사인 2 중량부, 지실 2 중량부, 감초 1 중량부 및 목향 1 중량부를 포함하는 것인 약학 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 함유하는 약학 조성물.
5. 유효성분으로서, 별갑(鱉甲, Trionycis Carapax), 나복자(羅蔔子, Raphani Semen), 인진(茵蔯, Artemisia capillaris Herba), 백출(白朮, Atractylodis Macrocephalae Rhizoma), 백복령(白茯笭, Poria cocos), 택사(澤瀉, Alismatis Rhizoma), 창출(蒼朮, Atractylodis Rhizoma), 단삼(丹蔘, Salvia Miltiorrhizae Radix), 저령(猪령, Polyporus), 사인(砂仁, Amomi Fructus), 지실(枳實, Ponciri Fructus), 감초(甘草, Glycyrrhizae Radix) 및 목향(木香, Helenii Radix)을 포함하는 혼합물의 수추출물을 함유하는, 간섬유화 또는 간경화의 예방 또는 개선용 건강식품 또는 건강보조식품.
6. 제5항에 있어서, 혼합물이 건조중량 기준으로 별갑 2.5~7.5 중량부, 나복자 2.5~7.5 중량부, 인진 2.5~7.5 중량부, 백출 1.5~4.5 중량부, 백복령 1.5~4.5 중량부, 택사 1.5~4.5 중량부, 창출 1.5~4.5 중량부, 단삼 1.5~4.5 중량부, 저령 1~3 중량부, 사인 1~3 중량부, 지실 1~3 중량부, 감초 0.5~1.5 중량부 및 목향 0.5~1.5 중량부를 포함하는 것인 건강식품 또는 건강보조식품.
7. 제6항에 있어서, 혼합물이 건조중량 기준으로 별갑 5 중량부, 나복자 5 중량부, 인진 5 중량부, 백출 3 중량부, 백복령 3 중량부, 택사 3 중량부, 창출 3 중량부, 단삼 3 중량부, 저령 2 중량부, 사인 2 중량부, 지실 2 중량부, 감초 1 중량부 및 목향 1 중량부를 포함하는 것인 건강식품 또는 건강보조식품.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 식품학적으로 허용되는 담체를 추가로 함유하는 건강식품 또는 건강보조식품.

Images