일반적으로 피부색은 멜라닌의 함량, 분포 등에 따라 색이 결정된다. 세포내 멜라노사이트(melanocyte)에서 생성된 후 세포 외부로 방출되는 멜라노좀(melanosome)의 수와 분포에 연관되어 있다. 멜라닌은 태양광선 중 유해한 자외선으로부터 생체를 보호하는 중요한 방어 수단으로 동물, 식물 및 미생물에 널리 존재한다. 그러나 피부의 과색소 침착은 피부의 염증 반응 이후의 체내 호르몬 이상, 유전질환 및 자외선 조사 등 여러 요인에 의해 발생될 수 있는데, 주된 요인은 멜라닌 색소 합성 이상 및 분포 이상에 의한 것이다.
멜라닌 생성 과정은 비교적 안정한 물질인 티로신(tyrosine)에서 출발하는 일련의 산화 중합 반응이다. 이 과정에서 티로시나아제가 가장 중요한 역할을 하며, 이 효소의 작용으로 생성되는 중간체인 도파퀴논(dopa quinone)은 불안정하여 도파크롬(dopa chrome)을 거쳐 멜라닌 색소로 산화 중합되게 된다.
최근 미백 물질의 탐색 방법으로 기존의 티로시나아제 활성을 억제하는 물질, 알파-멜라노사이트 자극 호르몬(α-melanocyte stimulating hormone) 길항제, N-글리코실레이션 억제와 같은 멜라닌 생합성 기전을 방해하여 미백 효과를 나타내는 물질 연구도 많은 진행이 되고 있다(The Biochemical Journal, 344(3), 659-665, 1999).
멜라닌 생합성에 중요한 역할을 하는 티로시나아제는 당단백질로서, 생체 내 당단백질 합성 과정인 글리코실레이션 과정을 통해 만들어진다. 글리코실레이션 과정에 문제가 생겨 티로시나아제의 당 부분에 이상이 생기면 티로시나아제는 세포내 멜라닌 생합성 장소인 멜라노좀으로 이동하지 못하거나 이동을 하더라도 티로시나아제의 활성을 나타내지 못하게 되고 따라서 멜라닌 생성이 이루어질 수 없게 된다. 글리코실레이션 과정에는 많은 효소가 관여하는데 그 중 중요한 효소가 알파-글루코시다아제이다(The Journal of Biological Chemistry, 272(25), 15796-15803, 1997). 이 효소의 활성을 억제할 수 있다면 티로시나아제의 글리코실레이션 과정이 억제되어 멜라닌 생성이 이루어지지 않게 되어 미백 효과가 있을 수 있을 것이다.
귀전우에 대하여 대한민국 등록특허 10-0973195호 (복합 한약재 추출물을 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 조성물), 대한민국 등록특허 10-0395619호 (당뇨병 치료용 조성물), 대한민국 등록특허 10-0956278호 (복합생약 추출물을 유효성분으로 하는 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 치료 또는 예방용 조성물)가 알려져 있고, 적양에 대해서는 대한민국 특허출원 10-1999-0014126호 (구강구취제거, 숙취해독 및 피로 회복을 위한 기능성 음료 및 그 제조 방법), 대한민국 특허출원 10-1999-0023365호(숙취해소용 중탕의 제조방법)가 알려져 있으며, 청심연자음에 대하여는 10-2004-0100718호 (동의보감에 수록된 청심연자음(淸心蓮子飮)의 생약성분을 함유한 쌀의 제조방법)이 알려져 있으나, 귀전우, 적양, 청심연자음의 피부 미백 효과에 대하여는 아직 알려진 바가 없다.
본 발명에서는 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고, 보다 우수한 미백제 원료를 찾고자 하는 연구의 일환으로, 여러 생약재로부터 알파-글루코시다아제 효소 활성을 억제하는 생약재를 찾는 연구를 통하여 티로시나아제 활성 저해 효과가 우수한 미백용 생약재 추출물을 밝히고, 이와 함께 이들의 제조방법 및 이들을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 피부 미백용 귀전우 추출물, 적양 추출물, 청심연자음 추출물, 이들의 제조 방법 및 이들을 함유하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 미백용 화장료 조성물에 대해 보다 상세히 설명한다.
귀전우(鬼箭羽)는 우리나라에서는 노박덩굴과(Celastraceae)의 화살나무(Euonymus alatus Siebold)의 코르크질의 날개 또는 그 부속물이다. 연중 코르크질의 날개가 달린 가지를 끊어서 말린다. 귀전우는 생긴 모양이 화살의 날개처럼 생겼고 특이한 모양을 하고 있어서 귀신을 쫓는다고 하여 붙여진 이름이다. 잎에는 epifriedelanol, friedelin, quercetin, dulcitol이 함유되어 있다. 종자유는 포화지방산(20%), 올레인산, 리놀렌산, 카프릭산, 초산과 안식향산 등이 함유되어 있다. 또한 옥살초산도 함유되어 있다. 파혈(破血), 통경(通經), 구충의 효능이 있으며, 폐경(閉經), 징하, 산후어혈(産後瘀血), 정체복병(停滯腹病), 충적복통(蟲積腹痛)을 치료한다.
적양(赤陽, 오리나무, Alnus japonica Steud)은 자작나무과(Fagales)에 딸린 낙엽이 지는 큰키나무로 유리목(楡里木)이라 하며, 중국에서는 다조(茶條)라고 한다. 오리나무가 어릴 때의 부드러운 가지와 나무껍질을 약으로 쓴다. 맛은 떫고 매우며, 성질은 서늘하고 열을 내리고 독을 푸는 작용이 있다. Lupenone, β-amylin, glutenol, taraxerol, betulinic acid 등 다종의 triterpenoid 외에 β-sitosterol, heptacosane, 지방족 알코올, pyrocatechol 계 tannin 등이 함유되어 있다. 청열(淸熱), 강화(降火)의 효능이 있고, 육혈(血), 혈변, 장염, 설사, 외상출혈을 치료한다.
청심연자음(淸心蓮子飮)은 동의보감에 수록된 소갈 처방단으로 연자육(蓮子肉, Nelumbinis Semen), 적복령(赤茯, Poria), 인삼(人蔘, Ginseng Radix), 황기(黃, Astragali Radix), 황금(黃芩, Scutellariae Radix), 차전자(車前子, Plantaginis Semen), 맥문동(麥門冬, Ophiopogonis Radix), 지골피(地骨皮, Lycii Radicis Cortex), 감초(甘草, Glycyrrhizae Radix)로 구성되어 있다. 연자육, 인삼, 황기, 맥문동, 적복령은 세포에 영양을 공급하여 대사능을 활성화하고 강장작용을 한다. 맥문동, 차전자, 연자육, 지골피는 항균작용을 하며, 연자육, 인삼, 황금은 소화기관의 운동능을 강화한다. 황금, 지골피, 맥문동은 소염작용을 하고, 맥문동과 연자육은 진해작용을 한다.
본 발명은 피부 미백용 생약재 추출물은 하기와 같은 방법으로 제조된다.
귀전우, 적양, 청심연자음 각각의 일정량에 대하여 정제수; 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올인 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올; 다가알코올인 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜; 또는 이들은 혼합 용매를 1 내지 20배 부피량을 가하여 추출한 후, 선택적으로 농축 또는 분획 과정을 거쳐 제조할 수 있다. 보다 바람직하게, (a) 냉각 콘덴서가 장치되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 50 내지 95℃의 온도조건에서 4 내지 20시간 가열하여 추출한 후, 회전식 증발 건조기로 감압농축하거나, (b) (a) 항에 물과 에탄올의 혼합용매를 가하여 용해한 후, 동량의 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올로 분획하고 감압농축하여 유효성분을 추출하는 것이 바람직하다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어 유효성분인 상기 생약재 추출물은 화장료 조성물 전체 중량 대비 0.01 내지 50중량%가 포함되면 바람직하다. 추출물의 함량이 0.01중량% 미만인 경우에는 본래 목적하는 유용한 효과를 충분하게 달성할 수 없어 바람직하지 못하며, 상기 유효성분인 추출물의 함량이 전체 화장료 중량 대비 50중량%를 초과하는 경우에는 화장료의 안정성에 문제를 발생시킬 수 있으며, 이로 인하여 화장료의 외관이나 사용 시 충분한 화장효과를 발현시킬 수 없는 우려가 있다.
상기 생약재 추출물을 함유하여 제조된 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 화장수류, 에센스류, 로션류, 크림류, 팩류, 파운데이션류 및 메이크업베이스류와 같은 기초제품, 색조제품의 다양한 제형으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 생약재 추출물과 함께 당업계에서 통상적으로 사용되는 부형제 및 첨가제가 통상적인 양으로 화장료 조성물에 포함될 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 추출 용매를 이용하여 귀전우, 적양, 청심연자음으로부터 얻어진 추출물 및 이를 함유하는 화장료 조성물이 알파-글루코시다아제와 티로시나아제의 활성을 억제함으로써 피부 색소 침착을 개선하는 효과에 기인한 미백효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 자세하게 설명한다. 그러나 이러한 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하려는 것이지, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 권리범위가 제한되는 것이 아니다.
실시예
1 내지 4
귀전우, 적양, 청심연자음(연자육 9.4 g, 적복령 4.7 g, 인삼 4.7 g, 황기 4.7 g, 황금 3.3 g, 차전자 3.3 g, 맥문동 3.3 g, 지골피 3.3 g, 감초 3.3 g) 각각 40 g를 추출기에 넣은 후, 추출용매(25%, 75% 에탄올 수용액) 400 mL을 가하고, 4시간씩 2회 반복 환류 냉각 추출하였다. 추출여액을 와트만 2번 여과지로 여과하고 회전식 증발 건조기로 감압농축하여 실시예 1 내지 4를 얻었다(표 1).
구분 |
추출방법 |
실시예 1 |
귀전우 25% 에탄올수용액 |
실시예 2 |
귀전우 75% 에탄올수용액 |
실시예 3 |
적양 75% 에탄올수용액 |
실시예 4 |
청심연자음 75% 에탄올수용액 |
실시예
5 내지 20
실시예 1 내지 4 각각에 10% 에탄올 수용액 1 L을 가하여 용해한 후, 동량의 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올 용매를 순차적으로 가하여 실시예 5 내지 20을 얻었다(표 2).
구분 |
추출방법 |
실시예 5 |
실시예 1 디클로로메탄 분획층 |
실시예 6 |
실시예 1 에틸아세테이트 분획층 |
실시예 7 |
실시예 1 부탄올 분획층 |
실시예 8 |
실시예 1 물 분획층 |
실시예 9 |
실시예 2 디클로로메탄 분획층 |
실시예 10 |
실시예 2 에틸아세테이트 분획층 |
실시예 11 |
실시예 2 부탄올 분획층 |
실시예 12 |
실시예 2 물 분획층 |
실시예 13 |
실시예 3 디클로로메탄 분획층 |
실시예 14 |
실시예 3 에틸아세테이트 분획층 |
실시예 15 |
실시예 3 부탄올 분획층 |
실시예 16 |
실시예 3 물 분획층 |
실시예 17 |
실시예 4 디클로로메탄 분획층 |
실시예 18 |
실시예 4 에틸아세테이트 분획층 |
실시예 19 |
실시예 4 부탄올 분획층 |
실시예 20 |
실시예 4 물 분획층 |
시험예
1. 알파-
글루코시다아제
활성 저해 효능 실험
알파-글루코시다아제(Megazyme사)를 1 U/mL의 효소액 10 μL에 0.1 M 포스페이트 버퍼 용액 100 μL, 실시예 1 내지 20에서의 수득물, 아카보스 또는 데옥시노지리마이신 200 μL을 가하여 5분간 37℃에 방치하였다. 여기에 기질 2 mM ρ-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드(4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside) 100 μL을 가하여 37℃에서 10분간 효소반응을 시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 아카보스와 데옥시노리지리마이신은 양성 대조군으로 사용하였다.
하기 수학식 1을 이용하여 효소 활성 저해율을 수치로 계산하여 하기 표 3에 나타내었으며 실험은 각각 3회씩 수행하여 평균값 ± 표준편차로 나타내었다. 하기 표에서 IC50은 알파-글루코시다아제 활성을 50% 저해하기 위해 소요되는 시료의 농도로서 상대적으로 비교할 때 사용되는 수치로서 값이 작을수록 활성 저해율이 양호하다.
시험물질 |
IC50 (μg/mL) |
실시예 1 |
1.849 ± 0.156 |
실시예 2 |
1.764 ± 0.153 |
실시예 3 |
2.712 ± 0.071 |
실시예 4 |
121.012 ± 5.253 |
실시예 5 |
45.581 ± 10.352 |
실시예 6 |
1.277 ± 0.069 |
실시예 7 |
5.226 ± 0.310 |
실시예 8 |
2.655 ± 0.146 |
실시예 9 |
46.204 ± 4.960 |
실시예 10 |
0.986 ± 0.061 |
실시예 11 |
1.228 ± 0.131 |
실시예 12 |
6.785 ± 0.291 |
실시예 13 |
26.641 ± 0.988 |
실시예 14 |
1.763 ± 0.119 |
실시예 15 |
1.536 ± 0.213 |
실시예 16 |
5.814 ± 1.497 |
실시예 17 |
4.457 ± 1.049 |
실시예 18 |
5.269 ± 0.469 |
실시예 19 |
4.907 ± 0.392 |
실시예 20 |
500 이상 |
아카보스 |
447.731 ± 18.904 |
데옥시노지리마이신 |
569.799 ± 15.605 |
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 20을 제외한 실시예 1 내지 19의 수득물은 양성대조군인 아카보스와 데옥시노지리마이신에 비해 월등한 알파-글루코시다아제 활성 억제 효과를 보였다. 특히, 청심연자음은 75% 에탄올수용액 추출물인 실시예 4의 수득물에서 보다 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 분획층인 실시예 17 내지 19의 수득물에서 알파-글루코시다아제 활성 억제 효과가 약 20배 이상 증가하였다.
시험예
2 : 티로시나아제 활성 저해 효능 실험
티로시나아제 활성 억제 효과는 실시예 1 내지 20의 수득물 0.9 mL, 0.1 M 인산완충액(pH 6.8) 1.0 mL, 1.5 mM L-티로신 용액 1.0 mL을 넣은 후, 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.
하기 수학식 2를 이용하여 효소 활성 저해율을 수치로 계산하여 하기 표 4에 나타내었으며 실험은 각각 3회씩 수행하여 평균값 ± 표준편차로 나타내었다. 하기 표에 나타난 값은 실시예 1 내지 20의 1 mg/mL 농도에서 티로시나아제 활성 저해율로 나타내었다.
시험물질 |
티로시나아제 활성 저해율 (%) |
실시예 1 |
9.472 ± 0.423 |
실시예 2 |
- |
실시예 3 |
15.504 ± 1.349 |
실시예 4 |
9.915 ± 2.348 |
실시예 5 |
15.348 ± 0.767 |
실시예 6 |
- |
실시예 7 |
42.586 ± 1.051 |
실시예 8 |
10.066 ± 0.899 |
실시예 9 |
21.753 ± 2.249 |
실시예 10 |
- |
실시예 11 |
- |
실시예 12 |
8.009 ± 3.405 |
실시예 13 |
12.984 ± 2.249 |
실시예 14 |
33.854 ± 3.064 |
실시예 15 |
14.799 ± 0.915 |
실시예 16 |
10.505 ± 3.567 |
실시예 17 |
71.902 ± 2.308 |
실시예 18 |
43.020 ± 1.567 |
실시예 19 |
12.803 ± 2.065 |
실시예 20 |
10.468 ± 1.190 |
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1의 추출물은 부탄올 분획층, 실시예 2의 추출물은 디클로로메탄 분획층, 실시예 3의 추출물은 에틸아세테이트, 그리고 실시예 4의 추출물은 디클로로메탄 및 에틸아세테이트 분획층에서 양호한 티로시나아제 활성 억제 효과가 나타났다. 특히, 청심연자음의 디클로로메탄 분획층인 실시예 17은 75% 에탄올수용액 추출물인 실시예 4에 비해 티로시나아제 활성 억제 효과가 약 7배 증가하였다.
본 발명의 실시예 20의 수득물을 제외한, 귀전우, 적양, 청심연자음 추출물 및 분획층들은 알파-글루코시다아제 활성 억제 효과를 나타내는 양성 대조군인 아카보스와 데옥시노지리마이신에 비해 매우 우수한 효과를 보였다. 본 발명에 있어서 적양 에틸아세테이트 분획층인 실시예 14는 75% 에탄올수용액 추출물인 실시예 3보다 알파-글루코시다아제 및 티로시나아제 활성 저해 효과가 양호하였다. 또한 청심연자음은 75% 에탄올수용액 추출물인 실시예 4와 비교할 때, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 분획층인 실시예 17 내지 19에서 우수한 알파-글루코시다아제 및 티로시나아제 활성 저해 효과를 보였다. 특히, 청심연자음 클로로메탄 분획층인 실시예 17은 양성대조군인 아카보스와 데옥시노지리마이신에 비해 약 100배 이상의 알파-글루코시다아제 활성 억제 효과를 나타내었으며, 우수한 티로시나아제 활성 억제 효과로 보아 피부 미백 효과가 기대된다.
제형예
1 및
비교제형예
1
상기 실시예 17에 따른 청심연자음 추출물을 함유한 미백 스킨의 성분구성을 하기 표 5와 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다. 한편, 하기 표 5의 각 성분 번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1(정제수)에 성분 2와 3을 교반 분산시킨 후, 성분 4 내지 6을 가하고, 성분 7 내지 9를 차례로 가하여 혼합하는 방식으로 제조하였다. 비교제형예로서는 성분 9를 제외한 나머지 성분 구성이나 그 제조방법은 동일하게 진행하여 제조하였다.
번호 |
성 분 |
제형예 1 |
비교제형예1 |
1 |
정제수 |
잔량 |
잔량 |
2 |
부틸렌글라이콜 |
2.0 |
2.0 |
3 |
글리세린 |
1.0 |
1.0 |
4 |
피이지-1500 |
0.5 |
0.5 |
5 |
에탄올 |
4.0 |
4.0 |
6 |
폴리소르베이트 80 |
0.2 |
0.2 |
7 |
향 |
0.1 |
0.1 |
8 |
방부제 |
미량 |
미량 |
9 |
실시예 17에 따른 청심연자음 추출물 |
1.0 |
- |
제형예
2 및
비교제형제
3
상기 실시예 17에 따른 청심연자음 추출물을 함유한 미백크림의 성분구성을 하기 표 6과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다. 한편, 하기 표 6의 각 성분 번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1 내지 7을 70℃의 온도에서 가열 용해시킨 다음, 성분 9 내지 12를 성분 13에 용해 분산시켜 70℃로 가열한 것에 유화한다. 이후, 상기 유화한 것을 56℃의 온도로 냉각한 후, 성분 14를 가하여 교반하고 실온으로 냉각하여 제조하였다.
번호 |
성 분 |
제형예 3 |
비교제형예 3 |
1 |
세테아릴알코올 |
1.0 |
1.0 |
2 |
글리세릴스테아레이트/피이지-100스테아레이트 |
1.0 |
1.0 |
3 |
폴리소르베이트 60 |
1.0 |
1.0 |
4 |
소르비탄세스퀴올리에이트 |
0.3 |
0.3 |
5 |
세틸옥타노에이트 |
6.0 |
6.0 |
6 |
스쿠알란 |
8.0 |
4.0 |
7 |
아프리코드커넬오일 |
4.0 |
4.0 |
8 |
디메치콘 |
2.0 |
2.0 |
9 |
글리세린 |
5.0 |
5.0 |
10 |
마그네슘알루미늄실리케이트 |
0.4 |
0.4 |
11 |
산탄검 |
0.03 |
0.03 |
12 |
방부제 |
미량 |
미량 |
13 |
정제수 |
잔량 |
잔량 |
14 |
실시예 17에 따른 청심연자음 추출물 |
5.0 |
- |
시험예
3.
피부미백
효과 및 피부자극 관능시험
본 발명에 따른 피부 미백용 화장료 조성물의 피부미백 개선효과 및 피부자극을 평가하기 위하여, 상기 제형예 2와 비교제형예 2에서 제조된 미백크림을 이용하여 관능시험을 실시하였다. 구체적으로, 제형예 1과 비교 제형예 1의 미백크림을 피부에 각각 도포했을 때 피부의 미백효과를 측정하기 위하여 20세 이상의 여성 10명에게 수시로 1일 2회 이상 4주간 지속적으로 사용하게 하였다.
관능시험에서 피부의 미백효과 항목에 대하여는 비교제형예 1의 미백크림을 기준으로 제형예 1의 미백크림이 나타내는 피부미백 효과를 상대적으로 평가하게 하였고, 피부자극에 대한 관능평가는 피부의 가려움, 따가움 및 홍반 등의 현상을 평가하게 하였다. 평가는 매우 우수(5점), 우수(4점), 보통(3점), 나쁨(2점), 매우 나쁨(1점)의 오점법 기준에 의거하여 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 표 7에서 피부자극은 피부자극이 없는 정도를 나타낸다.
번호 |
피부자극 |
피부미백 효과 |
제형예 1 |
비교제형예 1 |
1 |
5 |
5 |
5 |
2 |
5 |
5 |
5 |
3 |
4 |
5 |
5 |
4 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
6 |
5 |
4 |
5 |
7 |
5 |
5 |
5 |
8 |
5 |
5 |
4 |
9 |
4 |
4 |
5 |
10 |
4 |
5 |
5 |
평균 |
4.7 |
4.8 |
4.9 |
표 7에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 제형예 1의 화장료 조성물에 대한 피부자극 평가점수는 4.7점으로 매우 양호하게 평가되어, 비교제형예 1과 마찬가지로 피부자극 정도가 낮아 피부 안전성이 우수함을 확인할 수 있었다.
또한, 비교 제형예 1 대비 제형예 1의 화장료 조성물이 가진 상대적인 피부의 미백효과는 평가점수 4.9점으로 매우 만족스럽고 우수함을 알 수 있었다.