KR0162495B1 - 알파-글리코실-l-아스코르브산 및 그 제조방법 - Google Patents

알파-글리코실-l-아스코르브산 및 그 제조방법

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노리오 무도오
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하야시바라 겐
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Abstract

내용없음

Description

α-글리코실-L-아스코르브산 및 그 제조방법
제1도는 본 발명에 의한 α-D-글루코실-L-아스코르브산의 적외선 흡수 스펙트럼.
본 발명은 직접 환원성(direct reducing activity)을 나타내지 않는 α-글리코실-L-아스코르브산과 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 직접 환원성을 나타내지 않는 신규물질인 α-글리코실-L-아스코르브산에 관한 것이다.
또한 본 발명은 이러한 신규물질의 생화학적인 제조방법에 관한 것이기도 하다. 더욱이, 본 발명은 α-글리코실-L-아스코르브산을 함유하는 음료, 가공 식품, 기호물 등의 음식물, 감수성 질환용 예방제 및 치료제 등의 감수성 질환용 의약, 피부 정화제 및 피부 색백제 등의 화장품에 관한 것이다.
하기 구조식(I) 화학구조를 가지는 L-아스코르브산은 인간, 원숭이 및 기니아 피그 등의 생체내에서는 합성이 되지 않기 때문에 필수 영양소의 하나인 비타민 C로 기록되고 있다.
Figure kpo00002
L-아스코르브산은 생체내에서의 몇가지 생리학적인 활성, 예를 들자면 생체 결합조직의 주성분인 콜라겐 합성에 필요한 리신과 프롤린의 히드록실화 반응, 시토크롬 C의 Fe+++를 환원하여 Fe++로 하는 산화 환원 반응 및 백혈구 증가에 따른 면역 증강 작용 등에 관여하고 있는데, 그 이유는 비타민 C가 생체의 건강유지 및 증진에 중요한 역할을 하고 있기 때문이다. L-아스코르브산 결핍증에 의한 증상인 괴혈병에 관하여 오래전부터 알려져 있는데, 이것은 피부 허약화, 점상 출혈, 반상 출혈 및 잇몸과 골수의 출혈 등으로 나타난다.
건강유지를 위하여 괴혈병을 예방하기 위해 L-아스코르브산의 일일 권장투여량(recommended daily administration : RDA)을 정해두고 있는데, 특히 성인 남자의 경우는 60mg 이고 성인 여성의 경우는 50mg 이다.
현재 L-아스코르브산의 용도는 필수 영양소인 비타민 C 강화제에만 한정되어 있는 것이 아니고 여러 가지 분야에까지 확대되고 있다. 더욱 상세하게는 L-아스코르브산은 그 화학구조와 생리학적인 활성으로 인하여 각종 화공 시약, 음식물에 있어서 산미제, 환원제, 산화 방지제, 표백제 및 안정제로 사용되고, 의약 분야에 있어서는 바이러스성 질환, 세균성 질환 및 악성 종양 등과 같은 감수성 질환의 예방제 및 치료제로 사용되며, 더욱이 피부 정화제 및 피부 색백제 등의 화장품에 있어서 환원제, 자외선(UV) 흡수제 및 멜라닌 생성 억제제로 상용된다.
L-아스코르브산의 주요한 결점은 직접 환원성, 안정성 불량 및 고도의 산화 분해성으로 인하여 생리학적인 활성을 쉽사리 상실하게 된다는 것이다.
L-아스코르브산을 안정화하기 위해 L-아스코르브산의 몇가지 당 유도체가 제안되고 있다. 예를 들자면 본 발명인들은 문헌 [Vitamin, Vol. 43, pp.205-209(1971) 및 Vol. 47, pp.259-267(1973)]과 일본국 특허 공보 제38,158/73호에 L-아스코르브산 글루코시드의 생화학적 합성법에 관하여 발표한 바 있다.
이러한 글루코시드는 어느 것이나 유사한 방법으로 제조된다는 사실과, L-아스코르브산의 6번 탄소 원자에 있는 1차 알코올 그룹에 대한 에테르 결합에 의해 글루코시드를 생성시키는 것은 위의 일본국 특허 공보의 두 번째란의 제14행 내지 제16행에 기재되어 있고, 말토오스로부터 α-글루코실 그룹으로의 당 전이 반응(saccharide-transfer reaction)에 의해 글루코시드가 생성된다는 사실 및 글루코시드는 직접 환원성을 나타낸다는 사실로부터 이들의 화학구조는 하기 구조식(II)으로 나타낼 수 있는 것이다.
Figure kpo00003
위의 일본국 특허 공보의 실시예 1의 표에 나온 결과로부터 명백히 알 수 있다 싶이 글로크코시드의 안정성은 L-아스코르브산보다 우수하지만 상업화하기에는 충분하지 못하다는 점이다.
Ishio 등은 일본국 특허 공보 제5,920/83호에서 L-아스코르브산의 당유도체의 유기화학적인 합성법을 개시하고 있는데, 그러나 이들 유도체는 상기 일본국 특허 공보 제7란의 제6행 내지 제8란의 제11행에서 2,3-디-0-(β-D-글루코피라노실)-L-아스코르브산을 비롯한 L-아스코르브산의 21가지 β-D-글루코피라노실형 유도체에 대해 설명하고 있는 바로부터 명백한 바와 같이 모든 D-글루코오스가 β형식으로 결합되어 있는 L-아스코르브산 당 유도체이다.
Masamoto 등은 일본국 특허 공보 제198,498/83호에서 β-글루코실형의 것이기도 한 L-아스코르브산의 당 유도체의 유기화학적인 합성법을 개시하고 있다.
β-D-글루코피라노실형 L-아스코르브산의 유도체에 관한 연구 결과 확인된 것은 생체, 특히 인체내에서 이들은 소요의 생리 활성을 거의 발휘하지 못하고 있다는 점이다.
더욱이 종래의 유기화학적인 합성방법은 반응이 극히 복잡하고 그 수율이 낮기 때문에 경제적인 효율성이 나쁘고 또한 생성된 유도체에 대한 무독성과 안전성 확립이 극히 어렵다는 등의 결점을 가지고 있다.
앞에서 나온 바와 같이 종래의 L-아스코르브산의 당 유도체들은 안정성, 안전성, 생리 활성 및 경제적인 효율성의 관점에서 만족스럽지 못한 것임이 밝혀졌기 때문에 아직까지 실용화된 바 없다.
따라서 종래의 당 유도체의 결점을 가지지 아니한 안정성이 우수하고 독성의 염려 없이 사용할 수 있으며 생체내에서 L-아스코르브산의 생리학적인 활성을 나타낼 수 있는 L-아스코르브산의 당 유도체를 실현하는 것이 크게 요구되고 있는 것이다.
본 발명에서는 종래의 L-아스코르브산 당 유도체의 결점을 해소한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명인들은 당 전이 반응을 이용한 생화학적인 방법으로 제조할 수 있는 신규의 L-아스코르브산 당 유도체에 관하여 연구를 수행하였다. 결과, 본 발명인들은 안정성이 우수하고 생체내에서 쉽사리 가수분해되며 생리 활성이 극히 큰 신규의 L-아스코르브산 당 유도체를 발견하여 그 제조방법과 음식물, 화장품 및 감수성 질환용 의약 등의 분야에 대한 용도를 개발함으로서 본 발명을 완성하게 된 것이다.
L-아스코르브산을 α-글리코실 당 화합물과 더불어 섭식할 경우 α-글리코실-L-아스코르브산이 쉽게 합성된 다음 대사가 되기 때문에 이것은 생체 물질로 볼수 있고 그 안전성에 있어서 이상적으로 편리한 것이다. 유기화학적인 방버으로 제조할 수 있는 α-D-글리코실형 유도체는 생체내에서는 합성이 되지 않으므로 생체에 대해서는 이물질로 생각되는 것이다.
본 발명은 생화학적인 방법과 유기화학적인 방법 등과 같은 제조방법과는 관계없이 어떠한 α-글리코실-L-아스코르브산에 대해서도 적용된다. 안전성과 경제적인 효율성을 고려하여 바람직한 것은 L-아스코르브산과 α-글루코실 당 화합물을 함유한 용액에다 당 전이 효소를 작용시키는 생화학적인 방법으로 α-글리코실-L-아스코르브산을 제조하는 것이다.
본 명세서에서 직접 환원성을 전혀 나타내지 않는다라는 것은 L-아스코르브산과는 달리 이들의 당 유도체가 2,6-디클로로페놀인도페놀을 환원시키지도 못하고 탈색하지도 못한다는 뜻이다.
본 명세서에서 L-아스코르브산이란 용어는 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염 및 이들의 혼합물 등으로 된 L-아스코르브산염을 뜻하는데 본 발명이 적용되는 한 유리 L-아스코르브산에만 국한되는 것은 아니다. 따라서, 필요한 경우에는 L-아스코르브산 나트륨과 L-아스코르브산 칼슘 등과 같은 것들을 유리 L-아스코르브산과 더불어 당 전이 반응에 적절히 사용할 수 있다.
α-글리코실-L-아스코르브산 및 2-O-α-글리코실-L-아스코르브산이란 용어는 본 발명에서 사용할 수 있는 한 유리산 형태의 것 외에 염 형태의 것들까지 포함한다.
본 발명에서 사용하는 α-글리코실 당 화합물은 당 전이 효소에 의하여 L-아스코르브산으로부터 직접 환원성이 없는 α-글리코실-L-아스코르브산을 생성시키는 것들이다. 예를 들자면 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스 등과 같은 말토올리고 당류와, 덱스트린, 시클로덱스트린 및 아밀로오스 등과 같은 전분 부분 가수분해물과, 액화 전분, 젤라틴화 전분 및 가용성 전분 등을 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
따라서 α-글리코실-L-아스코르브산을 용이하게 생성시키자면 당 전이 효소에 민감함 α-글리코실 당 화합물을 선택해야 한다. 예를 들자면 α-글루코시다아제(EC 3. 2. 1. 20)를 당 전이 효소로 사용할 경우에는 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스 등과 같은 말토올리고 당류와, DE(Dextrose Equivalent)가 약 5-60인 덱스트린 및 전분 부분 가수분해물이 적당하다. 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제 (EC 2. 4. 1. 19)를 당 전이 효소로 사용할 경우에는 DE가 1이하인 젤라틴화 전분에서 부터 DE가 60인 덱스트린까지의 전분 부분 가수분해물이 적당하다.
α-아밀라아제(EC 3. 2. 1. 1)를 당 전이 효소로 사용할 경우에는 DE 가 1이하인 젤라틴화 전분에서 부터 DE가 약 30인 덱스트린까지의 전분 부분 가수분해물이 적당하다.
반응 도중의 L-아스코르브산의 농도는 일반적으로 1 w/v % 이상, 바람직하게는 약 2-30 w/v %이고, α-글루코실 당 화합물의 농도는 일반적으로 L-아스코르브산의 경우보다 약 0.5-30배 정도 크다.
본 발명에서 사용되는 당 전이 효소는 적당한 효소 감수성을 가진 α-글루코실 당 화합물과 L-아스코르브산을 함유하는 용액에 작용시켰을 경우 분해되는 일이 없이 α-글루코실 그룹 하나 또는 몇 개를 L-아스코르브산의 적어도 2번째 탄소원자에 전이시켜 주는 것이다.
예를 들자면, 동물, 식물 및 미생물 유래의 α-글루코시다아제, 예컨대 마우스(mouse)의 신장, 쥐(rat)의 장점막, 개의 소장, 돼지의 소장 등의 유래의 α-글루코시다아제, 벼종자, 옥수수 종자 등의 식물 유래의 α-글루코시다아제, 모코르(Mucor), 페니실륨(Penicillium) 및 사카로미세스(Saccharomyces) 등의 속(屬)에 속하는 박테리아와 효모를 영양배지에서 배양하여 수득되는 배양액 유래의 α-글루코시다아제, 바실루스(Bacillus) 및 클렙시엘라(Klebsiella) 등의 속에 속하는 박테리아 배양액 유래의 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제 및 바실루스 속에 속하는 박테리아 배양액 유래의 α-아밀라아제를 적절히 선택하여 사용한다.
이러한 당 전이 효소는 위에 나온 조건을 충족하는 한 정제할 필요 없이 사용할 수 있다. 일반적으로 본 발명은 조효소(crude enzyme)에 의해서 본 발명의 목적을 달성할 수 있다. 필요에 따라서는 종래방법으로 당 전이효소를 정제한 후 사용하는데, 시판되고 있는 당 전이 효소를 사용해도 된다.
당 전이 효소의 량과 반응시간은 서로간에 밀접한 관계가 있다. 경제적인 관점에서 당 전이 효소를 3-80시간 이내에 반응이 완결될 수 있는 양으로 사용한다. 고정화 당 전이 효소를 불연속식(batchwise)으로나 연속식으로 사용한다.
본 발명에 의한 반응방법은 위에 나온 L-아스코르브산과 α-글루코실 당 화합물을 함유한 용액에다 당 전이 효소를 가하고, 이 혼합물을 효소가 충분히 활성을 가지게 되는 약 3-9의 pH 범위와 약 30-80℃의 온도범위에서 유지함으로서 실시하는 것이 보통이다. 반응 도중 L-아스코르브산이 산화 분해되는 경향이 있기 때문에 될 수 잇는 한 통기되지 않게 하고 일광을 차단한 조건하에서 혼합물을 유지하여 L-아스코르브산이 환원형태로 있도록 하는 것이 바람직하다. 필요에 따라서는 티오우레아와 황화 수소 존재하에 반응시키는 것이 좋다.
당 전이 효소를 생성시킬 수 있는 성장중인 미생물의 배양물에 L-아스코르브산과 α-글루코실 당 화합물을 가하여 주어 필요로 하는 물질을 얻는다.
다음에는 직접 환원성이 없는 α-글리코실-L-아스코르브산에 대하여 설명한다. 이러한 α-글리코실-L-아스코르브산은 α-1,4 결합 형식을 통해 결합된 1-7개의 글루코실 그룹으로 된 α--D-글루코실 그룹을 가지고 있고 이러한 α-D-글루코실 그룹은 2번째 탄소원자에 있는 최소한 1차 알코올 그룹에 결합되어 있다. 이러한 특수한 물질의 예로서는 2-O-α-글리코실-L-아스코르브산, 2-O-α-D-말토실-L-아스코르브산, 2-O-α-D-말토트리오실-L-아스코르브산, 2-O-α-D-말토테트라오실-L-아스코르브산, 2-O-α-D-말토펜타오실-L-아스코르브산, 2-O-α-D-말토헥사오실-L-아스코르브산 및 2-O-α-D-말토헵타오실-L-아스코르브산이 있다. α-글루코시다아제가 일반적으로 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산만을 생성한다 하더라도 필요에 따라서는 2-O-α-D-말토실-L-아스코르브산과 2-O-α-D-말토트리오실-L-아스코르브산을 혼합물로 얻을수도 있다.
시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제 또는 α-아밀라아제를 사용할 경우에 있어서는 α-D-글루코실 그룹의 결합수가 많은 α-글리코실-L-아스코르브산이 혼합물로 생성된다.
α-글루코실 당 화합물에 따라 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제는 중합도 분포범위가 1-7인 α-D-글루코실 그룹을 생성하는 반면, α-아밀라아제에 의하여는 중합도 분포 범위의 폭이 좁은 것을 얻게 된다. 필요에 따라서는 이러한 혼합물을 α-아밀라아제(EC 3. 2. 1. 1), β-아밀라아제(EC 3. 2. 1. 2) 또는 글루코아밀라아제(EC 3. 2. 1. 3)으로 부분 가수분해시켜 α-D-글루코실 그룹의 중합도를 감소시킬 수 있다. 예를 들자면 글루코아밀라아제를 작용시킬 경우 2-O-α-D-말토실-L-아스코르브산 이상의 고분자물이 가수분해되어 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산을 축적하게 된다.
β-아밀라아제는 주로 2-O-α-D-말토테트라오실-L-아스코르브산 이상의 고분자물을 가수분해하여 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산, 2-O-α-D-말토실-L-아스코르브산 및 2-O-α-D-말토트리오실-L-아스코르브산의 혼합물을 축적 생성시키게 된다.
위에 나온 방법중 한가지 방법으로 제조된 반응 혼합물에 직접 환원성을 나타내지 않는 α-글리코실-L-아스코르브산과 더불어 미반응의 L-아스코르브산과 α-글루코실 당 화합물을 함유한다 하더라도 그 이상 더 특수한 처리를 하지 않고서도 그대로 최종 제품으로 할수 있다. 보통 이러한 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과 및 농축하여 시럽상 제품을 얻은 다음, 이것을 더욱 건조시켜 분말상 제품을 얻는다.
정제된 α-글리코실-L-아스코르브산 제품을 필요로 할 경우 분자량 및/ 또는 친화성 차이를 이용하는 정제방법, 예컨대 멤브레인 분리법, 겔 여과 크로마토 그래피법, 칼럼 크로마토그래피법, 고속 액체 크로마토그래피법(HPLC) 및 이온 교환 크로마토그래피법중에서 한가지 이상의 방법으로 미반응의 L-아스코르브산, α-글루코오스 및 α-글루코실 당 화합물 등과 같은 협잡물로부터 α-글리코실-L-아스코르브산을 가장 순수한 형태로 분리한다.
이 경우에 있어서 분리된 L-아스코르브산과 α-글루코실 당 화합물을 당 전이 반응에서 원료로 재사용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 필요에 따라서는 당 전이 반응 후 크로마토그래피법과 같은 방법으로 분리하기 전에 반응 혼합물을 한가지 이상의 방법으로 처리하는데, 그 예로서는 반응 혼합물을 가열하고 불용성 물질을 여과해서 제거하는 방법이 있고, 또 다른 방법으로는 반응 혼합물을 예컨대 활성탄으로 처리하여 단백성 물질 및 착색 물질을 제거하는 방법이 있으며, 또한 반응 혼합물을 양이온 교환수지 (H+형)로 탈염하고 음이온 교환수지 (OH-형)로 처리하여 음이온과 염을 흡착시켜 제거하는 방법이 있다. 이렇게 하여 제조한 α-글리코실-L-아스코르브산의 특징은 다음과 같다.
(1) 직접 환원성이 없고 극히 안정성이 있다. L-아스코르브산과는 달리 메일라아드(Maillard) 반응을 거의 하지 않는다. 이런 성질이 있기 때문에 단백질, 지질, 당 및 생리 활성 물질과 혼합할 경우, 불필요한 반응을 일으키지 않고 이들 물질을 안정화시킨다.
(2) 용이하게 가수분해하여 L-아스코르브산을 생성하므로 L-아스코르브산과 동일한 환원 작용을 나타낸다.
(3) 체내의 효소계에 의해 쉽게 가수분해하여 D-글루코오스와 L-아스코르브산을 생성하므로 L-아스코르브산 본래의 생리 활성을 나타낸다.
(4) L-아스코르브산을 α-글루코실 당 화합물과 함께 섭취할 경우 생체내에서 합성되어 대사가 되므로 극히 안전하다.
(5) α-글리코실-L-아스코르브산중에 추가로 α-글루코실 당 화합물이 함유되면 α-글리코실-L-아스코르브산이 고유의 활성을 나타내는 반면, α-글루코실 당 화합물은 형상부여 효과, 증량 효과 및 감미 효과를 나타낸다. 그리고, α-글루코실 당 화합물을 함유하지 아니한 제품은 형상부여 효과와 증량 효과가 낮다 하더라도 이 제품을 약간만 사용해도 고유한 효과가 나타난다.
이러한 특성으로 인하여 직접 환원성이 없는 α-글리코실-L-아스코르브산을 안정성과 높은 천연의 비타민 C 강화제로서 뿐만 아니라 음식물과, 바이러스성 질환, 세균성 질환 및 악성 종양 등이 감수성 질환용 예방제 및 치료제 및 화장품(예: 피부 미용제, 피부 색백제) 등에 있어서, 바람직하게는 0.001 w/v % 이상을 배합하여 안정제, 품질 개선제 및 자외선 흡수제로 유리하게 사용할 수 있다.
α-글리코실-L-아스코르브산은 내산성, 내광성 및 내열성이 극히 크고, 신맛, 짠맛, 쓴맛, 단맛 및 떫은 맛을 가진 각종 물질과 조화가 잘 되기 때문에 일반 음식물, 예를 들자면 간장, 분말 간장, 된장, 분말 된장, 거르지 않은 간장, 히시오(hishio), 후리카케(furikake), 마요네즈, 드레싱, 식초, 산바이주(sanbai-zu), 훈맛쯔수시수(funmadsu-sushi-su), 추카노모토(chuka-no-moto), 튀김용 수우프, 일본식 국수용 수우프, 우스터 소오스(worcester sauce), 켓찹, 불고기용 수우프, 커리 루우(curry roux), 스튜 프리믹스, 수우프 프리믹스, 다시노 모토(dashi-no-moto), 복합 조미료, 미린(mirin), 신미린(shin-mirin) (합성미린), 식탁용 설탕 및 커어피용 설탕 등과 같은 조미료 ; 전병, 아라레(arare : 펠릿형 전병), 오코시(기장과 쌀로 된 크래커), 카린토(karinto), 규우히(gyuhi : 전분풀), 쌀풀, 만두, 우이로(uiro : 단맛 나는 쌀젤리), 콩잼, 단맛 나는 콩젤리, 연질의 아드쯔키(adzuki) 팥젤리, 킹교쿠(kingyoku), 젤리, 카스텔라 및 일본식 토피(toffee)등과 같은 일본식 과자류; 건포도를 넣은 단빵, 비스켓, 크래커, 쿠우키, 파이, 푸딩, 크리임 퍼프(cream puff), 웨플, 스폰지 케익, 도우넛, 쵸콜릿, 츄잉껌, 카라멜 및 캔디 등과 같은 서양식 과자류; 아이스크리임 및 셔어벗(sherbet) 등과 같은 빙과류; 과일 절임용 및 빙수용 시럽; 버어터크리임, 커스타드크리임, 밀가루 풀 및 과일 페이스트 등과 같은 스프레드 및 페이스트류; 잼, 마아멀레이드, 시럽 절임 과일 및 과당화된 과일 등과 같은 가공된 과일; 과일 및 야채 등의 가공 식품류; 빵, 국수, 버어미셀리, 밥 및 인조육 등과 곡류 가공식품; 살라드 기름 및 마아가린 등과 같은 지방질 식품; 썰은 야채의 간장 절임, 무 절임, 센마이 주케(senmi-zuke) 및 양파 절임 등과 같은 절임 식품;' 단무지 및 김치 등과 같은 피클 제품용 프리믹스; 햄 및 소오세지 등과 같은 축육 제품; 생선육 햄, 생선육 소오세지, 생선묵, 치쿠와(chikuwa) 및 한펜(hanpen) 등과 같은 어육 제품; 성게내장젓, 꼴뚜기젓, 수콘부(su-konbu, 사키-수루메(sak-surume) 및 후구노미린널시(fugu-no-mirinboshi) 등과 같은 반찬류; 말린 미역, 산나물, 말린 오징어, 멸치 및 패류 등과 같은 간장 졸임 식품; 조리된 콩, 감자 샐러드, 다시마 말이 및 튀김 등과 같은 일상적인 요리; 킨시타마고(kinshi-tamago), 우유 음료, 버어터 및 치이즈 등과 같은 계란 및 우유 제품; 고기, 생선, 과일 및 야채 등의 병조림 식품 및 통조림 식품; 합성주, 조요슈(zojo-shu), 소주, 포도주 및 위스키 등과 같은 주류; 커피, 코코아, 쥬우스, 탄산 음료, 젖산 음료 및 젖산균 음료 등과 같은 청량 음료; 및 푸딩 프리믹스, 핫케이크 프리믹스, 인스탄트 쥬우스, 인스탄트 커피, 소쿠세키-시루코(sokuseki-shiruko: 떡을 넣은 아즈키 팥 수우프의 프리믹스) 및 인스탄트 수우프 등과 같은 프리믹스류 등에 있어서 비타민 C 강화제, 맛 개선제, 산화 방지제, 안정제 및 품질개선제 등으로 사용할 수 있다.
또한, 꿀벌, 누에 및 애완용 물고기를 비롯한 가축 등의 사료와 먹이에 α-글리코실-L-아스코르브산을 비타민 C 강화제, 맛 개선제, 산화 방지제 등의 목적으로 첨가할 수 있다. 또한, 특수한 음식물과, 피부 미용제와 피부 색백제를 비롯한 화장품과, 감수성 질환용 예방제 및 치료제, 예를 들자면 담배, 트로키제, 대구 간유 드롭, 비타민 화합물, 경구용 청정제, 구중약(口中藥), 가아글, 경관영양제(intubation nutrient), 내복약, 주사약, 치약, 립 스틱, 아이 쉐도우, 밀크 로우션, 보습액, 향장용크리임, 파운데이션, 일광 차단제, 클렌싱 비누, 샴푸와 린스 등에 α-글리코실-L-아스코르브산을 첨가하는 외에 플라스틱의 자외선 흡수제 및 열화 방지제로, 그리고 글리코시드 가수분해 효소의 검정분석용 기질로서 사용되기도 한다.
본 발명에서 말하는 감수성 질환이란 α-글리코실-L-아스코르브산으로 예방 및/또는 치료되는 질환들을 뜻하는데, 그 예로서는 바이러스성 질환, 세균성 질환, 외상성 질환, 면역병, 알레르기, 당뇨병, 백내장, 순환기 질환 및 악성 종양 등이 있다. 감수성 질환용 약제의 형상을 최종 용도에 따라 임의로 선택할 수 있는데, 그 예로는 분무제, 점안액, 세비액, 세구액 및 주사액 등과 같은 액상의 약제와, 연고, 찜질약 및 크리임 등과 같은 페이스트상 약제 및 분말, 과립, 캡슐 및 정제 등과 같은 고체상 약제가 있다.
이러한 약제를 제조할때는 필요에 따라서는 한가지 이상의 첨가 성분, 예컨대 치료제, 생리 활성 물질, 항생 물질, 보조제, 증량제, 안정제, 색소 및 향료 등의 한가지 이상을 병용하여 적절히 사용할 수 있다.
투여량은 α-글리코실-L-아스코르브산 함량, 투여 경료 및 투여 회수에 따라 적절히 달리할 수 있는데, 통상적으로 α-글리코실-L-아스코르브산으로 하여 성인 1일당 약 0.001-100g의 범위로 한다. 화장품도 약제의 경우와 마찬가지로 제조한다.
종래의 방법, 예컨대 혼합, 반죽, 용해, 침지, 스프레딩, 도포, 분무 및 주입 등의 방법으로 α-글리코실-L-아스코르브산을 제품에 첨가하여 가공처리를 끝낸다.
본 발명의 α-글리코실-L-아스코르브산 및 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산이 유리산 형태인 경우에는 필요에 따라 금속의 수산화물과 금속의 탄산염 등의 수용액과 반응시켜 나트륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 철염, 구리염 및 아연염으로 전환시킴으로써 생성된 물질은 pH를 적절히 조절할 수 있고 미네랄과 비타민 C의 활성을 나타낼 수 있게 된다. 따라서, 이러한 물질을 영양 강화제와 화학약품 등으로 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 직접 환원성이 없는 대표적인 α-글리코실-L-아스코르브산을 다음의 실험에서 구체적으로 설명한다.
[실험 1]
(α-글루코시다아제 제조)
신선한 쥐(rat)의 소장을 0.1M 인산염 완충액(pH 0.7) 중에 20 wt.% 되게 가하고 균질화기에 넣어 균질화하고, 4,000×g에서 10분간 원심분리한 다음 상청액에다 시판품인 트립신(미국의 Merck Co. Inc 제)을 가하여 최종농도를 0.1 g/ℓ로 하여 주위온도에서 4시간 방치한 후 냉각된 에탄올을 2배 체적이 되게 가하고 원심분리하였다.
침강물을 0.01M 인산염 완충액(pH 7.0) 중에 용해시키고 이 용액을 반투과막 튜우브속에 넣고 갖 제조한 동일한 완충액에 대하여 15시간 동안 투석하였다. 이어서 튜우브속에 있는 액체를 통상적인 방법으로 DEAE-셀룰로오스 칼럼과 히드록시 아파타이트(hydroxy apatite) 칼럼에서 연속적으로 크로마토그래피 처리하여 α-글루코시다아제 활성 분획물을 회수하고 이것을 동결 건조시켜 α-글루코시다아제 시료를 얻었다. 이 시료의 비활성(specific acitivity)는 40.7 단위/단백질 mg 이었고 정제도와 활성 수득율은 각각 357배 및 약 47% 이었다.
α-글루코시다아제 1단위는 다음과 같은 조건, 즉, 1.35mM EDTA를 함유한 0.1M 아세테이트 완충액(pH 6.0) 750㎕와 4 w/v% 말토오스 250㎕로 된 혼합용액에다 적당히 희석한 효소용액 100㎕를 가하고 이 혼합물을 37℃에서 30분간 반응시킨 후 끓는 물속에서 3분간 항온 처리하여 반응을 정지시키고 나서 원심분리한다. 이어서 상청액 20㎕를 채취하고 여기에 글루코오스 옥시다아제법의 발색시약인 시판품 GLUCOSE B TEST (일본국의 Wako Pure Chemical Industries 사제) 1㎖를 가한 후 37℃에서 20분간 항온처리하여 발색시켜 505㎚에서 흡광도를 측정하는 조건하에서 분석했을 경우 37℃에서 1분 동안 글루코오스 1마이크몰(μmole)을 유리하는 효소의 량으로 정의된다.
[실험 2]
(α-D-글루코실-L-아스코르브산)
[실험 2(1)]
(당 전이 반응)
0.2M 아세테이트 완충액(pH 5.3) 100 중량부에 L-아스코르브산 7.04중량부, 말토오스 12.8 중량부 및 티오우레아 0.2 중량부를 용해시키고, 이 용액에다 실험 1의 방법으로 제조한 부분적으로 정제된 부분적으로 정제된 α-글루코시다아제 시료를 말토오스 1g 당 0.5 단위 가하고 광차단 조건하에서 50℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 이어서, 1.06 w/v % 메타인산 4배 체적을 이 반응 혼합물에 가하여 효소를 실활함으로서 반응을 정지시켰다. 이 반응 혼합물을 HPLC 분석한 결과 출발물질인 L-아스코르브산의 약 30%가 당 유도체로 전환되었음을 확인하였다.
[실험 2(2)]
(정제)
물을 용출액으로 사용하고 Bio-Gel P-2 (미국의 Bio-Rad 사의 겔 제품)로 된 칼럼에서 위에서 얻은 반응 혼합물을 겔 여과 크로마토그래피 처리함으로써 α-D-글루코실-L-아스코르브산 고함유 분획물을 회수하고, 0.3% 아세트산을 용출액으로 사용하여 Shim-Pack ODS (일본국의 Shimadzu Seisakusho 사제의 칼럼 제품)에서 HPLC 처리하여 용출시켰다.
α-D-글루코실-L-아스코르브산 고함유 분획물을 회수하여 감압 농축한 후 동결 건조하여 분말화함으로써 순도가 99.9%인 고순도의 α-D-글루코실-L-아스코르브산 시료를 반응 혼합물 중의 α-D-글루코실-L-아스코르브산에 대하여 약 80%의 수율로 얻었다.
[실험 2(3)]
(물리화학적인 성질)
실험 2 (2)의 방법으로 제조한 대표적인 α-글루코실-L-아스코르브산 시료의 다음과 같은 물리화학적인 성질을 조사하였다. 실시예 A-1의 방법으로 제조한 α-D-글루코실 그룹의 수가 많은 또 다른 대표적인 α-글루코실-L-아스코르브산의 특성을 조사할 수 있는데까지 조사하여 괄호 속에 나타내었다.
(1) 원소분석 (화학식 C12H18O11)
실측치 : C = 42.6% H = 5.36%
이론치 : C = 42.3% H = 5.38% N 0.01%
(2) 분자량
M-80B (일본국의 Hitachi 사제의 질량 분광분석 장치)로 FD 질량분석을 한 결과 339에서 (M+H)+피이크가 나타났다(화학식 C12H18O11의 분자량은 338임).
(3) 자외선 (UV) 흡수 스펙트럼
pH 7일 때 260㎚에서 흡수 피이크가 나타난 반면 pH 2.0일 때 238㎚에서 흡수피이크가 나타났다[실질적으로 동일한 성질을 나타냄].
(4) 적외선(IR) 흡수 스펙트럼
KBr 정제법(KBr tablet method)을 사용하였고, 그 결과는 제1도에 나와 있다[실질적으로 동일한 성질을 나타냄].
(5) NMR 스펙트럼
JNM GX400 (일본국의 Japan Electron Optics Laboratory 사제의 NMR 분광분석 장치)로 NMR 스펙트럼을 측정하였다. 사용된 용매는 D2O 이었고 측정시의 pH는 2.8이었다. 내부표준으로 TSP(소디움 3-트리메실-실릴프로피오네이트-2,2,3,3-d4)을 사용하였다.
1H-NMR σ ppm (D2O 중에서)
Figure kpo00004
이들 데이타로 부터 알 수 있는 것은 2번 탄소원자에 있는 알코올 그룹은 D-글루코오스와 더불어 에테르 결합을 통해 글루코시드를 생성하고 있다는 점이다.
(6) 해리상수
pHa 는 3.0이다. 이 값과 각종 L-아스코르브산 유도체의 해리 상수의 값 [J. Jernow et al., Tetrahedron, Vol. 35, pp. 1483-1486 (1979)의 표 1 및 Pao-Wen Lu et al., Journal of Agricultural Food Chemistry, Vol. 32, pp. 21-28 (1984)의 표 2]과의 비교결과로 부터 알수 있는 것은 본 발명의 물질에서는 L-아스코르브산의 2번 탄소원자에 있는 알코올 그룹이 α-D-글루코실 결합에 관여하고 있는데 반하여 3번 탄소원자에 있는 알코올 그룹은 유리상태라는 점이다.
(7) 메틸화 반응 분석
L-아스코르브산을 디아조메탄으로 메틸화하여 3-O-메틸-L-아스코르브산을 주로 생성시키는 공지 방법 [Pao-Wen Lu et al., Journal of Agricultural Food Chemistry, Vol. 32, pp. 21-28 (1984)]에 따라 본 발명의 물질을 메틸화한 다음, 생성물을 가수분해하여 주생성물로서 3-O-메틸-L-아스코르브산과 D-글루코오스를 생성시켰다. NMR 스펙트럼, 해리상수 및 메틸화 반응 분석 데이타에 의하여 2번 탄소원자에 있는 알코올 그룹은 에테르 결합을 통해 D-글루코오스와 더불어, α-글루코시드 결합을 형성함을 알수 있다.
(8) 용매에 대한 용해도
물 0.1N 수산화 나트륨 및 0.1N 아세트산에는 쉽사리 용해하고 메탄올과 에탄올에는 용해하나 에테르, 벤젠 및 클로로포름에는 용해하지 않음[실질적으로 동일한 성질을 나타냄].
(9) 색 반응
직접 환원성은 전혀 나타나지 않으며 2,6-디클로로페놀인도페놀을 환원시키지도 않았고 탈색하지도 않았다. 2,4-디니트로페닐히드라진 반응에 대해서는 음성, 안트론-황산 반응에서는 녹색으로 착색[실질적으로 동일한 성질을 나타냄].
(10) 안정성
(가) 100℃에서 5분간 1N 염산으로 처리하거나 α-글루코시다아제에 의하여 가수분해되어 L-아스코르브산과 D-글루코오스를 1:1몰비로 생성 [글루코아밀라아제에 의하여 가수분해되어 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산과 D-글루코오스를 생성].
(나) β-글루코시다아제에 의해서는 가수분해 않음 [실질적으로 동일한 성질을 나타냄].
(다) 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산을 L-아스코르브산 및 일본 특허 공보 제 38,158/73호에 기재된 6-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산과 각각 수용액중에서의 안정성을 비교하였다. 즉, 각 시료를 농도 70 마이크로몰 및 pH 7.0 도는 pH 2.0으로 조절한 후 흡광광도게용 셀에 넣고 용액의 온도를 20℃로 유지하면서 260㎚ 및 pH 7.0에서, 또는 245㎚ 및 pH 2.0에서 흡광도를 측정하였다. 그 잔존율(%)을 흡광도로 계산하였다. 그 결과는 표 1에 나와 있다. 표 1의 결과로 부터 명백히 알 수 있는 것은 6-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산 및 L-아스코르브산과는 달리 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산은 수용액중에서 안정성이 극히 우수하다는 점이다 [2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산의 경우와 같이 실질적으로 동일한 성질을 나타냄].
Figure kpo00005
(11) 생리 활성
(가) 시토크롬 C에 대한 환원성
2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산, 6-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산 및 L-아스코르브산을 사용하여 시토크롬 C에 대한 이들의 환원활성을 비교하였다.
즉, 0.1nM 시토크롬 C 0.1㎖와 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.8)중의 0.2mM EDTA 0.5㎖로 된 혼합물에다 일정량의 물을 가하여 최종체적이 1㎖ 되게 하고, 여기에 두가지 시료(각각 10mM)를 함유하는 10㎕을 가한 다음 주위온도에서 분광 광도계로 550㎚에서의 흡광도 변화를 측정하였다. 초기 반응 속도로 흡광도 차이(△A/min, /10㎕)를 측정하였고, 이 차이를 이용하여 환원 활성을 계산하였다.
그 결과, 6-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산 및 L-아스코르브산과는 달리 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산은 전혀 환원 활성을 나타내지 않았음이 판명되었다.
또한 실험 1의 방법으로 제조한 α-글루코시다아제 시료로 가수분해 시켰을 때 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산은 환원 활성을 나타내었음이 판명되었다.
(나) 콜라겐 합성 활성
2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산, 6-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산 및 L-아스코르브산을 사용하여 이들의 콜라겐 합성 활성을 시험하였다. 즉, 인간의 섬유아세포(세포밀도 : 7×10 세포/플레이트)를 10% FCS가 첨가된 이이들 (Eagle) 최소필수 배지(MEM)중에서 1주일간 배양한 후 여기에 3H-프롤린을 4μ Ci/㎖, β-아미노프로피오니트릴을 20μ g/㎖ 및 각각의 시료를 0.25mM 가하고 다시 24시간 배양하였다.
수득한 배양물에다 10 w/v% 트리클로로아세트산을 가하여 배양물중의 콜라겐 성분을 회수한 다음 동결 건조시켰다.
수득한 시료를 용해시킨 용액을 적당한 pH로 조절하고 37℃에서 90분가 콜라게나아제(Type III)로 처리한 후 원심분리하고, 상청액 중의 방사능을 측정함으로써 콜라겐 합성 활성을 구하였다.
그 결과, 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산은 L-아스코르브산의 경우와 동일한 콜라겐 합성 활성을 나타내었음이 판명되었다.
또한 6-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산은 콜라겐 합성 활성이 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산에 비해 다소 떨어짐을 확인할 수 있었다. 위에 나온 여러 가지 물리화학적인 성질로 부터 확인할 수 있는 것은 이 실험에서 제조한 직접 환원성이 전혀 없는 α-글리코실-L-아스코르브산은 하기 화학식구조식(III)을 가지고 있다는 점이다.
Figure kpo00006
위의 식에서는 0 내지 6의 정수이다.
대표적인 α-글루코실-L-아스코르브산인 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산의 화학구조는 하기구조식 (IV)과 같다.
Figure kpo00007
[실험 3]
(생체내 합성)
쥐(rat)에게 L-아스코르브산 1과 말토오스 500mg(10 w/v % 용액 5㎖)을 경구 투여하고, 이들의 혈액을 간헐적으로 채취하여 원심분리하였다.
상청액 또는 혈장을 사용하여 HPLC로 확인한 결과, α-D-글루코실-L-아스코르브산과 소량의 α-D-말토실-L-아스코르브산의 각 피이크가 투여한지 약 30분 후에 나타났고, 180분이 되었을 때 최고에 도달하였으며, 그 이후에는 갑자기 감소하여 360분에서는 혈액으로 부터는 나타나지 않았음을 확인하였다.
이들 피이크중 하나를 나타내는 주성분인 α-D-글루코실-L-아스코르브산에 상응한 물질을 분리하여 구체적으로 조사해 본 결과, 이것의 물리화학적인 성질은 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산과 동일함을 확인하였다.
따라서, 여기서 결론지을 수 있는 것은 α-D-글루코실-L-아스코르브산은 생체내에서 합성되어 대사되고 없어지는 생체 물질(biosubstance) 이기 때문에 안전성이 크다는 점이다.
[실험 4]
(급성독성)
실험 2(2)의 방법으로 제조한 고순도의 α-D-글루코실-L-아스코르브산 시료를 7주 되는 dd계 마우스(mouse) 에게 경구 투여하여 급성독성 시험을 하였다. 그 결과는 시료를 5g 까지 투여했을 때는 사망예가 전혀 없었고, 그 이상의 투여는 곤란하였다.
이들 사실로 부터 이 시료는 독성이 극히 낮다는 것을 알수 있었다.
그리고 실시예 A-1의 방법으로 제조한 α-글루코실-L-아스코르브산을 위와 같이 마찬가지로 시험하여 동일한 결과를 얻었는데, 즉, 이 시료의 독성은 극히 낮았다는 것을 확인한 것이다.
다음에 나오는 실시예 A 및 실시예 B는 직접 환원성을 전혀 나타내지 않는 α-글루코실-L-아스코르브산과 그 용도를 각각 설명한 것이다.
[실시예 A-1]
(α-글리코실-L-아스코르브산)
α-시클로덱스트린 9 중량부를 물 20중량부에 가열하여 용해시키고, 이 용액에 환원조건하에서 L-아스코르브산 3중량부를 가한 다음 pH 5.5 및 60℃로 유지하면서 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제(일본국의 Hayashibara Biochemical Laboratories 사제)를 α-시클로덱스트린 1g 당 150단위 가하고 40시간 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 LC-6 칼럼(일본국의 Shimadzu Seisakusho 사제) 이 장치된 AQ-303 ODS HPLC 시스템(일본국의 Yamamura Chemical Laboratories 사제)에 공급하고, MULT-340 검출장치(일본국의 Japan Spectroscopic Co., Ltd. 제)로 모니터링하면서 0.5㎖/min의 유속으로 0.1M KH2PO4-H3PO4완충액 (pH 2.0)으로 용리하였다. 그 결과, α-아스코르브산은 체류시간 9.5분에서 나타난 반면 새로 생성된 α-D-글루코실-L-아스코르브산, α-D-말토실-L-아스코르브산, α-D-말토트리오실-L-아스코르브산, α-D-말토테트라오실-L-아스코르브산, α-D-말토펜타오실-L-아스코르브산, α-D-말토헥사오일-L-아스코르브산 및 α-D-말토헥타오실-L-아스코르브산은 각각 체류시간 11.2분, 15.7분, 20.6분, 24.9분, 28.1분, 32.1분 및 38.6분에서 나타났다. 약 50% 정도의 L-아스코르브산이 α-글리코실-L-아스코르브산으로 전환되었다.
그 다음에는 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하여 여과하고, 여액을 실험 2(2)의 방법을 약간 개량한 방법에 따라 정제하여 각각의 특정한 α-글리코실-L-아스코르브산 성분들을 분리하였다. 이들을 혼합하고 감암 농축한 후 분말화하여 분말상의 α-글리코실-L-아스코르브산을 출발물질인 아스코르브산에 대하여 건조 고형분 기준으로 약 90%의 수율로 얻었다.
이 생성물은 직접 환원성을 전혀 나타내지 않으며, 안정성과 생리 활성이 크다. 따라서, 이 제품은 비타민 C 강화제로서 뿐만 아니라 안정제, 품질개선제, 생리 활성제 및 자외선 흡수제 등으로서 음식물, 감수성 질환용 의약 및 화장품 등에 유리하게 사용할 수 있다.
[실시예 A-2]
(α-글리코실-L-아스코르브산)
덱스트린(DE : 약 6) 40 중량부를 물 50 중량부에 가열 용해시키고, 이 용액에 환원조건하에 L-아스코르브산 13 중량부를 가한 다음, 용액을 pH 5.6 및 65℃로 유지하면서 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제를 덱스트린 1g 당 270 단위 가한 후, 40 시간 반응시켰다. 실시예 A-1에서와 마찬가지로 반응 혼합물을 HPLC 분석한 결과, 실시예 A-1에서와 마찬가지로 L-아스코르브산의 약 65%가 α-D-글루코실-L-아스코르브산, α-D-말토실-L-아스코르브산, α-D-말토트리오실-L-아스코르브산, α-D-말토테트라오실-L-아스코르브산, α-D-말토펜타오실-L-아스코르브산, α-D-말토헥사오일-L-아스코르브산 등과 같은 α-글리코실-L-아스코르브산으로 전환되었음을 확인하였다.
이어서 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 α-글루코실당 화합물을 추가로 함유하는 시럽상의 α-글리코실-L-아스코르브산 제품을 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 90%의 수율로 얻었다.
이 제품에 함유되어 있는 α-글리코실-L-아스코르브산은 직접 환원성을 나타내지 않으며, 안정성과 생리 활성이 만족스러울 정도로 크다. 따라서, 이 제품을 비타민 C 강화제로서 뿐만 아니라 조미료, 보습제, 품질 개선제, 생리 활성제 및 자외선 흡수제 등으로서 음식물, 감수성 질환용 의약 및 화장품 등에 유리하게 사용할 수 있다.
[실시예 A-3]
(2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산)
α-글루코실 당 화합물을 추가로 함유하는 시럽상의 α-글리코실-L-아스코르브산 제품(실시예 A-2의 방법을 약간 변경한 제조) 1중량부를 물 4 중량부에 용해시키고, 이 용액에 글루코아밀라아제(EC 3. 2. 1. 3, 일본국의 Toyobo 사제)를 시럽고형분 1g 당 100단위 가한 후 50℃에서 50시간 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 HPLC 분석한 결과, 각각의 특정한 α-글리코실-L-아스코르브산 성분들은 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산으로 전환 되었음을 확인하였다.
이어서 이 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하여 여과하고 여액을 실험 2(2)의 방법을 약간 변경한 방법으로 정제하여 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산 고함유 분획물을 회수하고, 이것을 감압 농축한 후 분말화하여 순도가 99% 이상인 고순도의 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산을 출발물질인 L-아스코르브산에 대하여 건조고형분 기준으로 약 80% 수율로 얻었다.
이 제품의 특징을 조사한 결과, 물리화학적인 성질은 실험 2(3)의 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산의 경우와 실질적으로 동일하였다.
본 발명의 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산은 직접 환원성을 나타내지 않으며 안정성과 생리 활성도 충분히 높으므로 비타민 C 강화제로서 뿐만 아니라 안정제, 품질 개선제, 생리 활성제, 자외선 흡수제, 화공 약품 및 의약 원료 등으로서 음식물, 감수성 질환용 의약, 화장품 및 시약 등에 유리하게 사용할 수 있다.
[실시예 A-4]
(α-글리코실-L-아스코르브산)
덱스트린(DE 18) 20 중량부를 물 70 중량부에 가열 용해시키고, 이 용액에 환원조건하에 L-아스코르브산 10 중량부를 첨가하고, 실험 1의 방법으로 제조한 부분정제된 α-글루코시다아제를 덱스트린 1g 당 4단위 가한 후, 광차단 조건하에 pH 5.0 및 50℃에서 8시간 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 실시예 A-2의 방법을 약간 개량한 방법에 따라 정제, 농축 및 분말화하여 분말 제품을 약 90℃ 수율로 얻었다. 이 제품은 10 w/w%의 α-글리코실-L-아스코르브산을 함유하였다.
α-글리코실-L-아스코르브산은 직접 환원성은 없고, 안정성과 생리 활성이 크다. 따라서, 이 제품을 비타민 C 강화제로서 뿐만 아니라 감미료, 조미료, 보습제, 품질 개선제, 생리 활성제 및 자외선 흡수제 등으로서 음식물, 감수성 질환용 의약 및 화장품 등에 유리하에 사용할 수 있다.
[실시예 A-5]
(α-글리코실-L-아스코르브산)
말토오스 10 중량부를 물 80 중량부에 가열 용해시키고, 이 용액에 L-아스코르브산 10 중량부와 벼종자 유래의 α-글루코시다아제(미국의 Sigma Chemical 사제)를 말토오스 1g 당 4단위 가한 다음, pH 6.0 및 45℃에서 광차단 조건하에 6시간 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 실시예 A-2의 방법을 약간 개량한 방법에 따라 정제, 농축 및 분말화하여 분말상 제품을 약 90%의 수율로 얻었다. 이 제품은 α-글리코실-L-아스코르브산을 약 15% 함유하였다.
이 제품중의 α-글리코실-L-아스코르브산은 직접 환원성은 없고, 안정성과 생리 활성은 만족스러울 만치 크다. 따라서, 이 제품을 비타민 C 강화제로서 뿐만 아니라 감미제, 조미료, 보습제, 품질 개선제, 생리 활성제 및 자외선 흡수제 등으로서 음식물, 감수성 질환용 의약 및 화장품 등에 유리하게 사용할 수 있다.
[실시예 A-6]
(α-글리코실-L-아스코르브산)
[실시예 A-6(1)]
(α-글루코시다아제 제조)
말토오스 4.0 w/v %, 일염기성 인산칼륨 0.1 w/v %, 질산 암모늄 0.1 w/v %, 황산 마그네슘 0.05 w/v %, 염화 칼륨 0.05 w/v %, 폴리펩톤 0.2 w/v %, 탄산 칼슘 1 w/v %(별도로 가열하여 멸균시킨 후 접종 직전에 물에 무균적으로 첨가) 및 물로 된 액체 배치 500 중량부에 무코르 자바니커스(Mucor javanicus) IFO 4570을 접종하고 통기 교반 조건하에 30℃에서 44시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 균사체를 회수하여 통상적인 방법으로 고정화 하였다.
[실시예 A-6(2)]
(α-글리코실-L-아스코르브산 제조)
결정질 말토오스 SUNMALT
Figure kpo00008
(일본국의 Hayashibara 사제) 40 중량부를 물 70 중량부에 가열, 용해시키고, 이 용액에 L-아스코르브산 10 중량부와 실시예 A-6(1)의 방법으로 제조한 조정화된 α-글루코시다아제를 말토오스 1g 당 10 단위 가하여 광차단 조건하에서 pH 5.5 및 50℃에서 3시간 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 여과하여 고정화된 α-글루코시다아제를 분리한 후 이것을 또 다른 반응 배치(batch)에 재사용하였다. 여액을 가열하고 나서 실시예 A-2의 방법을 약간 개량한 방법에 따라 정제, 농축 및 분말화하여 분말 제품을 약 95% 수율로 얻었다. 이 제품에는 약 7 w/w %의 α-글리코실-L-아스코르브산이 함유되어 있었다.
이 제품중의 α-글리코실-L-아스코르브산은 직접 환원성이 없고, 안정성과 생리 활성이 만족스러울 만치 크다. 따라서, 이 제품을 비타민 C 강화제로서 뿐만 아니라 감미제, 조미료, 보습제, 품질 개선제, 생리 활성제 및 자외선 흡수제 등으로서 음식물, 감수성 질환용 의약 및 화장 등에 유리하게 사용할 수 있다.
[실시예 B-1]
(츄잉 껌)
껌 베이스 25 중량부와 실시예 A-6의 방법으로 제조한 α-글리코실-L-아스코르브산 분말 20 중량부를 혼합기에서 60℃로 반죽한 것에다 무수결정질 말티톨 MABIT
Figure kpo00009
(일본국의 Hayashibara Shoji Inc. 제) 50 중량부, 인산칼슘 1.5중량부 및 β-시클로덱스트린을 함유한 L-멘톨 0.1 중량부를 가하고, 다시 소량의 조미료를 가하여 혼합한 후 로울링하고, 절단하여 표제의 제품을 얻었다. 이 제품은 비타민 C가 강화된 치아에 대한 저부식성이며 저칼로리 츄잉껌이다.
[실시예 B-2]
(규우히(Gyuhi : 전분 페이스트))
찹쌀 전분 1 중량부와 물 1.2 중량부를 혼합한 것을 수크로오스 1.5 중량부, 결정질 β-말토오스 SUNMALT
Figure kpo00010
(일본국의 Hayashibara Co. 제) 0.7 중량부, 실시예 A-2의 방법으로 제조한 시럽상 α-글리코실-L-아스코르브산 0.5 중량부와 더불어 가열하여 호화(糊化) 하면서 균질히 혼합한 다음 통상적인 방법으로 성형하고 포장하여 규우히를 얻었다. 이 제품은 비타민 C가 강화된 것으로 풍미가 우수하고 씹기가 좋은 일본식 과자로서 노화가 효과적으로 억제되기 때문에 저장기간이 길다.
[실시예 B-3]
(혼합감미제)
꿀 100 중량부, 이성화당 50 중량부, 흑설탕 2 중량부 및 실시에 A-3의 방법으로 제조한 고순도의 2-O-α-D-글리코실-L-아스코르브산 분말 1 중량부를 혼합하여 혼합감미제를 제조하였다. 이 제품은 비타민 C가 강화된 감미제로서 건강식으로 적합하다.
[실시예 B-4]
(쵸콜릿)
카카오 페이스트 40 중량부, 카카오 버터 10 중량부, 무수 결정질 말티톨 50 중량부 및 실시예 A-1의 방법으로 제조한 α-글리코실-L-아스코르브산 1 중량부를 균질히 혼합한 것을 리파이너(refiner)에서 미분쇄한 후 콘체(conche)에 옮겨 50℃에서 2일간 반죽했다. 반족 단계에서 레시틴 0.5 중량부를 가한 후 균일하게 분산시킨 다음 내용물을 온도조절기로 31℃로 조절하고 모울드에 넣은 즉시 버어트를 고화시키고 바이브레이터로 탈기시킨 다음 10℃의 냉각 터널속을 20여분간 통과시켜 고화시켰다. 모울드에서 탈형시킨 후 포장하여 표제의 제품을 얻었다. 이 제품은 흡습성이 없고 색상, 광택 및 결이 우수하며, 입속에서 원만하게 녹기 때문에 적절하고도 온화한 단맛과 풍미를 나타낸다. 이 제품은 비타민 C가 강화된 치아에 대한 저부식성 및 저칼로리 쵸콜릿이다.
[실시예 B-5]
(크리임 필링(Cream Filling))
결정질 α-말토오스 FINETOSE (일본국의 Hayashibara Co. 제 1,200부, 쇼오트닝 1,000부, 실시예 A-2의 방법으로 제조한 α-글리코실-L-아스코르브산 분말 10 중량부, 레시틴 1 중량부, 레몬 오일 1 중량부 및 바닐라 오일 1 중량부를 통상적인 방법으로 균질 혼합하여 크리임 필링을 제조하였다. 이 제품은 비타민 C가 강화된 크리임 필링으로서 맛, 풍미, 용융성, 씹기 등의 특성이 우수한 것이며, 지방 물질의 산화가 효과적으로 억제된다.
[실시예 B-6]
(정제(Tablet))
실시예 A-3의 방법으로 제조한 고순도의 2-O-α-D-글리코실-L-아스코르브산 20 중량부와 결정질 β-말토오스 13 중량부, 옥수수 전분 4 중량부, 루틴 1 중량부 및 리보플라빈 0.5 중량부를 균질 혼합한 것을 타정하여 한 개의 중량이 150mg 되는 표제의 제품을 제조하였다. 이 제품은 비타민 C, 비타민 P 및 비타민 B2의 복합 비타민제로서 안정성 있고 쉽사리 삼킬 수 있는 정제이다.
[실시예 B-7]
(캡슐제)
칼슘아세테이트 1 수화물 10 중량부, 마그네슘 L-락테이트 3 수화물 50 중량부, 말토오스 57 중량부, 실시예 A-2의 방법으로 제조한 α-글리코실-L-아스코르브산 분말 20 중량부 및 에이코사펜타엔오산 20% 함유 γ-시클로덱스트린 포접화합물 12 중량부를 균질 혼합한 것을 과립기에서 과립으로 만든 후, 젤라틴으로 캡슐화에서 한 개가 150mg 되는 캡슐제를 제조하였다.
이 제품은 감수성 질환용 예방제 및 치료제와 건강유지 및 증진용 식품에 있어서 고품위의 혈중 콜레스테롤 저하제, 면역 강화제 및 피부 미용제로 사용된다.
[실시예 B-8]
(연고)
소디움 아세테이트 3 수화물 1 중량부, DL-칼슘 락테이트 4 중량부 및 글리세린 10 중량부를 균질 혼합한 것을 바셀린 50 중량부, 식물성 왁스 10 중량부, 라놀린 10 중량부, 참기름 14.5 중량부, 실시예 A-4의 방법으로 제조한 α-글리코실-L-아스코르브산 1 중량부 및 페퍼민트 오일 0.5 중량부로 된 또 다른 혼합물에 가하고 균질 혼합하여 연고를 제조하였다.
이 제품은 고품질의 일광 차단제, 피부 미용제, 피부 색백제 및 외상과 화상 치료 촉진제로 사용된다.
[실시예 B-9]
(주사액)
실험 2(2)의 방법으로 제조한 고순도의 α-D-글루코실-L-아스코르브산을 물에 용해시키고 중화한 후, 통상의 방법으로 멸균 여과하여 발열성 물질이 없는 용액을 얻고 이것을 20㎖ 유리 바이알에 α-D-글루코실-L-아스코르브산 함량이 500mg 되게 나누어 넣은 다음 감압 건조시켜 표제의 제품을 얻었다.
이 제품을 비타민 및 무기질과 더불어 또는 단독으로 근육내 및 정맥투여한다. 이 제품은 차가운 곳에 저장할 필요가 없고 사용할 때에는 우수한 용해도를 나타낸다. 이 제품은 L-아스코르브산보다 체내 체류시간이 약 2∼10배 정도나 더 길며, 서서히 가수분해되어, L-아스코르브산을 방출하여, L-아스코르브산 고유의 생리 활성을 나타내게 된다.
또한 이 제품은 비타민 C를 보충하는 외에도 가수분해되면 산화방지제로 작용하여 활성 산소 제거 효과와 과산화 지방질 생성억제 효과를 나타낸다. 따라서, 이 제품은 바이러스성 질환, 세균성 질환, 외상성 질환, 류마티즘, 면역병, 알레르기, 당뇨병, 백내장, 순환기 질환 및 악성 종양 등과 같은 각종 감수성 질환용 예방제 및 치료제에 사용된다.
[실시예 B-10]
(주사액)
염화나트륨 60 중량부, 염화 칼륨 0.3 중량부, 염화 칼슘 0.2 중량부, 락트산 나트륨 3.1 중량부, 말토오스 48 중량부 및 실시예 A-3의 방법으로 제조한 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산 2 중량부를 물 1,000 중량부에 용해시킨 것을 통상적인 방법으로 멸균 여과하여 발열성 물질이 없는 용액으로 하고, 이 용액중 250㎖을 취하여 멸균된 플라스틱제 용기에 넣어 표제의 제품을 얻었다.
이 제품은 비타민 C, 칼로리 및 미네랄을 보충하는데 사용되고, 가수분해될 경우 산화 방지제로 작용하여 활성 산소제거 효과와 과산화 지방질 생성억제 효과를 나타낸다. 따라서, 이 제품은 각종 질환을 앓기 전과 앓는 도중 건강회복과 바이러스성 질환, 세균성 질환, 외상성 질환, 류마티즘, 면역병, 알레르기, 당뇨병, 백내장, 순환기 질환 및 악성 종양 등과 같은 감수성 질환용 예방제 및 치료제에 사용된다.
[실시예 B-11]
(경관 영양제(Intubation nutrient))
결정질 α-말토오스 20 중량부, 글리신 1.1 중량부, 글루탐산나트륨 0.18 중량부, 염화나트륨 1.2중량부, 시트르산 1 중량부, 락트산 칼슘 0.4 중량부, 탄산 마그네슘 0.1중량부, 실시예 A-5의 방법으로 제조한 α-글리코실-L-아스코르브산 분말 0.1 중량부, 티아민 0.01 중량부 및 리보플라빈 0.01 중량부로 된 배합물을 제조하고, 이중의 24g 씩을 취하여 적층 알루미늄백(bag) 속에 충전하고 가열 밀봉하여 표제의 제품을 얻었다.
사용할 때에 이 제품의 백 하나를 물 약 300-500㎖ 중에 용해하여 비강(nasal cavity), 위 및 장애 경구 및 비경구 투여할 때 경관 영양제로 사용한다.
[실시예 B-12]
(목욕액)
DL-락트산나트륨 21 중량부, 피루브산 나트륨 8 중량부, 실시예 A-1의 방법으로 제조한 α-글리코실-L-아스코르브산 분말 5중량부 및 에탄올 40 중량부와 정제수 26 중량부 및 적당량의 색소와 향료를 혼합하여 목욕액을 제조하였다.
이 제품은 사용할 때에 목욕물중에 100-10,000 배로 희석하여 피부 미용제 및 피부 색백제로 사용하기 적합하다. 이 경우에 있어서 목욕물 대신에 클렌징액, 수렴액 및 보습액을 사용할 수 있다.
[실시예 B-13]
(밀크 로우션)
폴리옥시에틸렌 베헤닐에테르 0.5 중량부, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 테트라올레에이트 1 중량부, 유용성(oil-soluble) 글리세틸 모노 스테아레이트 1 중량부, 피루브산 0.5 중량부, 베헤닐 알코올 0.5 중량부, 아보카도 오일 1 중량부, 실시예 A-3의 방법으로 제조한 고순도의 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르브산 분말 1 중량부 및 적당량의 비타민 E와 방부제를 통상의 방법으로 가열 용해시키고 이 용액에다 L-락트산나트륨 1 중량부, 1,3-부틸렌 글리콜5중량부, 카르복시비닐 폴리머 0.1 중량부 및 정제수 85.3 중량부를 가한 후 균질화기에서 유화시키고 나서 적당량의 향료를 가하고 다시 교반 혼합하여 표제의 제품을 얻었다. 이 제품은 고품질의 일광 차단제, 피부 미용제 및 피부 색백제로 사용된다.
[실시예 B-14]
(화장용 크리임)
폴리옥시에틸렌글리콜 모노스테아레이트 2 중량부, 자체 유화성 글리세린 모노스테아레이트 5 중량부, 실시예 A-3의 방법으로 제조한 고순도의 2-O-α-D-글리코실-L-아스코르브산 2 중량부, 유동 파라핀 1 중량부, 글리세릴 트리옥타네이트 10 중량부 및 적당량의 방부제를 통상의 방법으로 가열하여 용해시키고 이 혼합물에 L-락트산 2 중량부, 1,3-부틸렌 클리콜 5 중량부 및 정제수 66 중량부를 가하고 균질화기에서 유화시킨 후 여기에 향료 적당량을 가하여 다시 교반 혼합해서 표제의 제품을 얻었다. 이 제품은 고품질의 일광차단용 크리임, 피부 미용제 및 피부 색백제로 사용할 수 있다.
위에서 나온 바와 같이 본 발명에 의한 신규물질인 α-글리코실-L-아스코르브산은 직접 환원성이 없고 안전성이 우수하며 체내에서 쉽사리 가수분해하여 L-아스코르브산 본래의 산화 방지성과 생리 활성을 나타낸다.
더욱이 α-글리코실-L-아스코르브산은 체내에서 합성되어 대사되기 때문에 안전성이 뛰어나다. 당 전이 효소를 L-아스코르브산과 α-글루코실 당 화합물을 함유한 용액에 작용시키는 생화학적인 방법으로 α-글리코실-L-아스코르브산을 쉽게 제조할 수 있다. 따라서, α-글리코실-L-아스코르브산은 경제적인 효율성과 상업화가 용이하다는 점에서 우수성을 가진다.
직접 환원성을 나타내지 않는 α-글리코실-L-아스코르브산은 안정성과 생리 활성이 크기 때문에 음료와 가공식품을 비롯한 식품 분야, 감수성 질환용 예방제 및 치료제 분야 및 피부 미용제와 피부 색백제를 포함한 화장품 분야에 있어서 비타민 C 강화제로서 뿐만 아니라 안정제, 품질 개선제, 산화 방지제, 생리 활성제 및 자외선 흡수제로 유리하게 사용된다.
따라서 본 발명의 α-글리코실-L-아스코르브산은 그 용도가 광범위하고 이들 적용 분야에서 극히 중요한 것이다.

Claims (11)

  1. 직접 환원성을 나타내지 않는 α-글리코실-L-아스코르브산.
  2. 제1항에 의한 2-O-α-글리코실-L-아스코르브산.
  3. 당 전이 효소를 L-아스코르브산 α-글루코실 당 화합물을 함유한 용액에 작용시켜 직접 환원성을 나타내지 않는 α-글리코실-L-아스코르브산을 생성시키고, 이 α-글리코실-L-아스코르브산을 회수하는 것을 특징으로 하는 직접 환원성을 나타내지 않는 α-글리코실-L-아스코르브산 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 당 전이 효소가 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제(EC 2. 4. 1. 19)와 α-글루코시다아제로 된 군으로부터 선택되는 1 종인 제조방법.
  5. 제3항에 있어서, α-글루코실 당 화합물이 말토올리고당, 전분 부분 가수 분해물, 액화 전분, 젤라틴화 전분, 가용화 전분 및 이들의 혼합물로 된 군으로부터 선택되는 1종인 제조방법.
  6. 제3항에 있어서, 당 전이 효소를 3-80 시간 이내에 반응을 완결시키는 양으로 사용하는 제조방법.
  7. 제3항에 있어서, 당 전이 효소를 pH 3-9 및 온도 30-80℃의 용액에다 작용시키는 제조방법.
  8. 제3항에 있어서, L-아스코르브산의 농도가 최소한 1 w/w %인 제조방법.
  9. 제3항에 있어서, α-글루코실 당 화합물 농도가 L-아스코르브산의 농도보다 0.5배-30배 큰 제조방법.
  10. 제3항에 있어서, α-글리코실-L-아스코르브산 2-O-α-D-글리코실-L-아스코르브산인 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 글루코아밀라아제(EC 3. 2. 1. 3)를 당 전이 효소와 더불어 용액에 작용시키는 제조방법.
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