JPWO2013190630A1 - 細胞培養容器、それを用いた細胞培養方法および自動細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

細胞培養容器のランニングコストの低減や産業廃棄物量の削減を図る。容器の筐体と底面支持体を備える細胞培養容器であって、前記筺体と前記底面支持体とで細胞培養空間を形成し、前記筺体は、前記底面支持体を着脱可能に固定するための固定手段を備え、前記底面支持体上に交換可能な培養面を設ける。

Description

本発明は、細胞培養容器およびそれを用いた細胞培養方法に関する。

従来、種々の細胞（浮遊系細胞、接着性細胞）の継代培養が行われている。特に、接着依存性細胞は、培養容器の底面（培養面）に接着して増殖するため、細胞密度が常に一定の範囲になるように配慮する必要がある。細胞密度が低すぎ、隣接する細胞間の距離が大きくなると、接着依存性細胞は、増殖速度が低下し死滅することがある。一方、細胞密度が高すぎ、隣接する細胞間の距離が小さくなると、接着依存性細胞は、細胞の増殖を停止し、そのまま死滅することがある。従って、接着依存性細胞を培養する場合には、順次培養容器へ植え継ぐ継代培養を行う必要がある。

細胞培養では、培養の初期に、培養面積の小さい培養容器で培養を行い、接着依存性細胞の密度が低くなりすぎないようにする。そこで、接着依存性細胞がある程度まで増殖したら、より培養面積の大きい培養容器、または同培養面積を有する複数の培養容器へ植え継ぐ。この作業を繰り返し、目的細胞数まで接着依存性細胞を増殖させる。細胞培養作業が終わると、培養容器を医療産業廃棄物として廃棄する。培養容器の再利用は、洗浄、滅菌、表面処理などが必要であるため、基本的に培養容器は使い捨てとなり、ランニングコストの増大や産業廃棄ゴミの増加が問題となる。特に、大面積培養容器の場合では、培養容器本体の作製が大変煩雑でコストもさらにかかる。

特許文献１には、合成樹脂シートを培養容器筺体に溶着する細胞培養容器が提案されている。また、特許文献２には、細胞パターンなどを所望の対象材料に転写する膜で形成する細胞培養基板が提案されている。

特開２００９−１３６１５６号公報 特開２００７−３１２７３６号公報

しかしながら、特許文献１と特許文献２に記載されている細胞培養容器では、培養面だけ交換可能な培養容器は報告されていない。

本発明の目的は、細胞培養面が交換可能な培養容器を提供することにより、細胞培養容器のランニングコストや産業廃棄物量の削減を促進するものである。

本発明の細胞培養容器の一例を挙げるならば、容器の筐体と底面支持体を備える細胞培養容器であって、前記筺体と前記底面支持体とで細胞培養空間を形成し、前記筺体は、前記底面支持体を着脱可能に固定するための固定手段を備え、前記底面支持体上に交換可能な培養面を設けることを特徴とするものである。

また、本発明の細胞培養容器の他の一例を挙げるならば、容器の筐体を備える細胞培養容器であって、前記筺体で底面、側面および上面を備える細胞培養空間を形成し、前記細胞培養空間の底面上に設けた培養面と、前記培養面上に設けた細胞剥離機構と、前記培養面の連続交換機構を備えることを特徴とするものである。

本発明の細胞培養方法は、前記の細胞培養容器を用いた細胞培養方法であって、前記細胞培養容器を用いて細胞培養するステップと、細胞培養後に、前記培養面を交換するステップと、培養面以外の構成部品を滅菌するステップを含むことを特徴とするものである。

また、本発明の自動細胞培養装置は、前記の細胞培養容器と、前記培養容器に培地を供給する培地供給機構と、前記培養容器に混合ガスを供給する混合ガス供給機構と、前記培養容器の培養面を観察する細胞観察機構と、を有することを特徴とするものである。

本発明によれば、細胞培養容器のランニングコストの低減や産業廃棄物量の削減を促進することが可能となる。

本発明の実施例１の細胞培養容器を示す組立図である。 本発明の実施例１の細胞培養容器を示す分解図である。 本発明の培養面のオーリング付きの構成例を示す図である。 フィルム培養面の吸着・脱着構造を示す図である。 フィルム培養面の吸着・脱着の方法を示す図である。 本発明の実施例２の閉鎖型構造の細胞培養容器を示す組立図である。 本発明の実施例２の閉鎖型構造の細胞培養容器を示す分解図である。 本発明の実施例２の連続培養面交換構造の細胞培養容器の他の構成例を示す組立図である。 本発明の実施例２の連続培養面交換構造の細胞培養容器の他の構成例を示す分解図である。 本発明の実施例３の連続培養面交換構造の細胞培養容器を示す断面図である。 本発明の実施例３の連続培養面交換構造の細胞培養容器を示す平面図である。 本発明の実施例３の連続培養面交換構造の細胞培養容器の培養の方法を示す図である。 本発明の実施例４の二層連続培養面交換構造の細胞培養容器を示す断面図である。

本発明を実施するための形態を、図面に基づいて説明する。なお、発明を実施するための形態を説明するための全図において、同一の機能を有する要素には同一の名称、符号を付して、その繰り返しの説明を省略する。

本発明の実施例１の細胞培養容器を、図１および図２に基づいて説明する。図１は、実施例１の細胞培養容器の組立図を示し、図２は、その分解図を示す。

図１および図２において、１は細胞培養空間の底面を構成する底面支持体、２は底面支持体に設けた突起部、３は培養面、４は筐体に設けたロック部、５は細胞培養空間の側面を構成する筒状の筐体、６は筐体を覆う蓋である。底面支持体１に培養面３をセットし、筐体５を載置する。筐体５と底面支持体１は、それぞれに設けられているロック部４と突起部２によって着脱可能に固定される。さらに、蓋６をかぶせて培養容器を構成する。培養面３は、交換可能であり、細胞吸着処理を実施したフィルム、シートまたはプレートで構成される。また、必要に応じて、筐体５と底面支持体１の間の密閉性を向上させるため、シール部材が配置される。シール部材としては、例えば図３に示すような、培養面３の外周に密閉性のよいオーリング３Ａ構造を設ける。オーリング３Ａは、培養面３と別体に構成してもよいし、培養面３に接着などで取り付けて、予め一体に構成してもよい。オーリングを予め培養面と一体に構成することにより、培養面の交換作業が容易になる。

以下、本実施例の細胞培養容器を用いた、細胞培養の流れを説明する。まず、目的細胞の培養は、培養容器内部に目的細胞の懸濁液を注入する。さらに、培養容器を細胞培養用のインキュベータに入れて細胞培養する。培養面における細胞増殖限界に到達する頃に、培養領域の培地を排出させ、ＰＢＳ（生理食塩水）で細胞を洗浄する。続いて初期培養領域にトリプシンを注入し、細胞を培養面から剥離させたあと、培地を注入し細胞を培地に浮遊させる。次に、細胞を含む細胞懸濁液を回収する。従来であれば、細胞培養作業が終わると、使用後の培養容器をオートクレーブで滅菌して産業廃棄物として廃棄する。これに対し、本発明の培養容器の場合では、細胞懸濁液回収後、ロック部４と突起部２を脱離させ、培養面３だけを新品に交換し、ほかの構成部品は滅菌して再利用することによって、細胞培養容器のランニングコストの低減や産業廃棄物量の削減を促進することが可能となる。

上述の交換可能な培養面３の部材は、ポリカーボン、ポリスチレンなど細胞培養に適する材料を使用することが望ましい。また、シール部材であるオーリング３Ａの部材は、シリコンなどのやわらかい材料を使用することが望ましい。

上述の培養面３は、筐体５と底面支持体１の間に挟んで固定すると説明したが、図４に示すような底面支持体１に設けた真空引き構造による培養面３の固定方法も可能である。図４において、７は真空引き口、８は真空引き穴である。培養面３を吸着・脱着する方法を図５に示す。図５（ａ）より、底面支持体１の真空引き口７から空気を排出することにより、真空引き穴８で培養面フィルム３を吸引し、培養面フィルム３を、気圧で底面支持体１の表面に密着して固定することができる。その反対に図５（ｂ）で、真空引き口７から空気を導入すると、真空引き穴８から空気を送出し、固定された培養面フィルム３を空気の作用で底面支持体１表面から脱着することができる。この方法によれば、特に接着剤などを使わず、フィルム型培養面を支持表面に均一の圧力でかつ密着性よく固定することができる。

上述の培養容器の蓋６および底面支持体１は、ガラス、シリコン、石英、またはプラスチック類およびポリマー類等の固体基板を基材として形成することが可能である。より望ましくは、光学顕微鏡等での観察が可能な程度の光透過性を有し、さらに培養面３は細胞を表面に付着させる前に、清浄化、前処理により基板の表面改質を行える材質を備えることが望ましい。

なお、培養容器の外枠の形状について、円形状や四角形などの多角形の形状でもよいことは言うまでもない。

本実施例によれば、細胞培養容器のランニングコストの低減や産業廃棄物量の削減を促進することができる。

本発明の実施例２の閉鎖型構造の細胞培養容器について、図６および図７を用いて説明する。図６は、実施例２の細胞培養容器の組立図を示し、図７は、その分解図を示す。

図６および図７において、培地入口出口９、混合ガス入口１０、混合ガス出口１１以外の部分については、実施例１と同様である。

本実施例の培養容器は、培養容器の筺体５と、底面支持体１とで細胞培養空間を形成し、培養空間に培養用混合ガスの入口１０および出口１１と、培養空間に培地交換用入口出口９と、前記筺体５と前記底面支持体１にロック部４と突起部２からなる固定手段を設ける構造と、底面支持体１上に交換可能な培養面３を設けるものである。なお、混合ガスとしては、５％ＣＯ_２、湿度９０％以上の空気が望ましい。

本実施例の培養面３の交換は、手作業で行うが、図８および図９に示すような構造にすれば、自動的に培養面を交換することができる。図８および図９において、のフィルム供給ロール１２Ａ、フィルム回収ロール１２Ｂ、昇降機構１３以外の部分は図６および図７と同様である。培養面３の交換時、図９に示すように、まず、昇降機構１３が上昇し、筐体５を底面支持体１から脱着させる。次に、フィルム回収ロール１２Ｂを巻き、フィルム供給ロール１２Ａから新しい培養面を培養容器内に送る。最後に図８に示すように、昇降機構１３が下降し、ロック部４と突起部２で筐体５を底面支持体１に固定させる。ここで、培養面３の自動交換が完了する。

上述した細胞培養用フィルムは、ロール式であるため、前処理が簡単で、大量処理に適している。また、フィルム上に細胞培養パターンを形成することも可能であり、さまざまな細胞組織、例えば細胞シートなどを培養することができる。

本実施例の培養容器は、直接混合ガスや培地を培養空間に供給することにより、閉鎖系の自動培養が可能となる。本実施例によれば、細胞培養容器のランニングコストの低減や産業廃棄物量の削減を促進することができる。

本発明の実施例３の連続培養面交換構造の細胞培養容器について、図１０および図１１を用いて説明する。図１０は、実施例３の細胞培養容器の断面図を示し、図１１は、その平面図を示す。

本実施例の培養容器は、培養容器の筺体５で細胞培養空間を形成し、培養空間に培養用混合ガスの入口１０および出口１１と、培養空間に培地の培地交換用入口出口９と、前記培養面３上に設ける細胞剥離機構１４と、培養面３の連続交換可能な構造を設けるものである。本実施例において、培養面３はフィルムで構成されている。フィルム供給ロール１２Ａから、培養面であるフィルムが培養容器に供給され、回転ロール１２Ｃにより培養容器の底面に配置され、フィルム交換時にはフィルムがフィルム回収ロールに巻き取られる。フィルム回収側の回転ロール１２Ｃの近くには、フィルムの表面側に細胞剥離機構１４が設けられている。培養容器の筐体５には、培養空間に培養用混合ガスの入口１０および出口１１と、培養空間に培地の交換用入口出口９が設けられている。

培養の流れについて図１２を用いて説明する。図中の１５は培地、１６は細胞である。まず、図１２（ａ）に示すように、培養容器内の培養面３に培地１５を導入して目的細胞１６を播種する。培養面における細胞増殖限界に到達する頃（図１２（ｂ））に、培養を停止する。そして、図１２（ｃ）に示すように、フィルム回収ロール１２Ｂを巻きながら、細胞剥離機構１４、例えばスクレーパー、を利用して培養面上の細胞１６を剥離し、培地１５中に懸濁させる。細胞懸濁液を回収した後、新しい培養面に再播種して継代培養が可能である。本実施例によれば、細胞培養容器のランニングコストの低減や産業廃棄物量の削減を促進することができる。

本実施例の培養容器は、ｉＰＳ（人工多能性幹細胞）の継代培養にも用いることができる。

また、例えば本実施例の細胞培養容器と、培養容器に培地を供給する培地供給機構と、培養容器に混合ガスを供給する混合ガス供給機構と、培養容器の培養面を観察する細胞観察機構により、自動細胞培養装置を構成することができる。

本発明の実施例４の二層連続培養面交換構造の細胞培養容器について、図１３を用いて説明する。

図１３において、２層培養面の構造以外の部分については実施例３と同様である。

本実施例の培養容器は、培養容器の筺体で細胞培養空間を形成し、培養空間に培養用混合ガスの入口１０および出口１１と、培養空間に培地の交換用入口出口９と、前記培養空間に２層連続交換可能な培養面３Ａ，３Ｂを設けるものである。培養面３Ａ，３Ｂはフィルムで構成されており、フィルム供給ロール１２Ａから培養容器に供給され、回転ロール１２Ｃにより培養容器の底面側に配置され、フィルム交換時にはフィルムがフィルム回収ロール１２Ｂに巻き取られる。

本実施例の培養容器は、上層の多孔質フィルムを利用すれば、インサート式培養容器のように、２種類あるいは２種類以上の細胞の共培養にも用いることができる。本実施例によれば、細胞培養容器のランニングコストの低減や産業廃棄物量の削減を促進することができる。

本発明の特徴を損なわない限り、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の形態についても、本発明の範囲内に含まれる。

１ 底面支持体
２ 突起部
３ 培養面
３Ａ オーリング
４ ロック部
５ 筺体
６ 蓋
７ 真空引き口
８ 真空引き穴
９ 培地入口出口
１０ 混合ガス入口
１１ 混合ガス出口
１２Ａ フィルム供給ロール
１２Ｂ フィルム回収ロール
１２Ｃ 回転ロール
１３ 昇降機構
１４ 細胞剥離機構
１５ 培地
１６ 細胞

Claims (15)

1. 容器の筐体と底面支持体を備える細胞培養容器であって、
   前記筺体と前記底面支持体とで細胞培養空間を形成し、
   前記筺体は、前記底面支持体を着脱可能に固定するための固定手段を備え、
   前記底面支持体上に交換可能な培養面を設けることを特徴とする細胞培養容器。
2. 請求項１に記載の細胞培養容器において、
   前記筐体は、細胞培養空間の筒状の側面部を形成するものであり、
   更に、前記筐体を覆う蓋を備えることを特徴とする細胞培養容器。
3. 請求項１に記載の細胞培養容器において、
   前記筐体は、細胞培養空間の筒状の側面部および蓋部を形成することを特徴とする細胞培養容器。
4. 請求項３に記載の細胞培養容器において、
   前記細胞培養空間に培養用混合ガスを導入する入口および排出する出口と、
   前記細胞培養空間に培地を導入または排出する培地交換用入口出口を備えることを特徴とする細胞培養容器。
5. 請求項１〜４の何れか1つに記載の細胞培養容器において、
   前記交換可能な培養面は、細胞吸着処理を実施したフィルム、シートまたはプレートからなることを特徴とする細胞培養容器。
6. 請求項１〜５の何れか1つに記載の細胞培養容器において、
   前記固定手段は、前記底面支持体と前記筐体との一方に設けた突起部と、他方に設けたロック部とからなることを特徴とする細胞培養容器。
7. 請求項１〜６の何れか1つに記載の細胞培養容器において、
   前記交換可能な培養面と前記筐体の間に、シール部材を有することを特徴とする細胞培養容器。
8. 請求項７に記載の細胞培養容器において、
   前記シール部材は、前記培養面と予め一体化されていることを特徴とする細胞培養容器。
9. 請求項１〜８の何れか1つに記載の細胞培養容器において、
   前記底面支持体には、前記培養面の吸着・脱着構造を有することを特徴とする細胞培養容器。
10. 請求項３に記載の細胞培養容器であって、
    前記筐体を昇降させる昇降機構と、
    前記底面支持体上に連続交換可能な培養面を設けることを特徴とする細胞培養容器。
11. 容器の筐体を備える細胞培養容器であって、
    前記筺体で底面、側面および上面を備える細胞培養空間を形成し、
    前記細胞培養空間の底面上に設けた培養面と、
    前記培養面上に設けた細胞剥離機構と、
    前記培養面の連続交換機構を備えることを特徴とする細胞培養容器。
12. 請求項１１に記載の細胞培養容器であって、
    前記培養面は、細胞吸着処理を実施した連続したフィルムまたはシートで形成されており、
    前記培養面の連続交換機構は、前記フィルムまたはシートを供給する供給ロールと、フィルムを回収する回収ロールを含むことを特徴とする細胞培養容器。
13. 請求項１１または請求項１２に記載の細胞培養容器であって、
    前記培養空間に２層連続交換可能な培養面を設けることを特徴とする細胞培養容器。
14. 請求項１〜１３の何れか1つに記載の細胞培養容器を用いた細胞培養方法であって、
    前記細胞培養容器を用いて細胞培養するステップと、
    細胞培養後に、前記培養面を交換するステップと、
    培養面以外の構成部品を滅菌するステップを含むことを特徴とする細胞培養方法。
15. 請求項１〜１３の何れか1つに記載の細胞培養容器と、
    前記培養容器に培地を供給する培地供給機構と、
    前記培養容器に混合ガスを供給する混合ガス供給機構と
    前記培養容器の培養面を観察する細胞観察機構と、を有することを特徴とする自動細胞培養装置。

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