JPH04126068A

JPH04126068A - 細胞の培養方法及びその装置

Info

Publication number: JPH04126068A
Application number: JP2246638A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Kon; 昆　正浩; Yukio Fukushima; 幸生福島; Shigemi Suzuki; 茂美鈴木; Shigeru Yamano; 繁山野; Nobuyuki Maehashi; 信之前橋
Original assignee: Toto Ltd; Hitachi Plant Technologies Ltd
Current assignee: Toto Ltd; Hitachi Plant Technologies Ltd
Priority date: 1990-09-17
Filing date: 1990-09-17
Publication date: 1992-04-27
Anticipated expiration: 2015-04-24
Also published as: JP3036032B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は接着性の細胞を高密度且つ大量に培養する方法
及び装置に係り、特に細胞が代謝した老廃物を取り出す
濾過設備を備えた細胞の培養方法及びその装置に関する
。

〔従来の技術〕近年、生体外で細胞を大量に培養してインターフェロン
等の生物薬品を生産する技術はとみにその重要性を増し
ている。特に接着性の細胞は多くの生理活性物質を生産
するので、その大量且つ高密度培養技術の確立は生産の
効率向上や生産コスト低減のだｔに必須である。

ところで、一般に接着性の細胞を大量で高密度に培養す
る方法として、マイクロキャリア法とホロファイバー法
が知られている。マイクロキャリア法は直径数百μｍの
マイクロキャリア上ニ細胞を付着させ、通気撹拌槽内で
浮遊培養する方法であり、この方法はスケールアップが
容易で大量培養に適する。

一方、ホロファイバー法はホロファイバー膜を東ねた容
器内で細胞を膜に付着させて培養するもので、膜を介し
て栄養分と酸素を含む新鮮な培養液を細胞に供給でき、
部分的には１０８個／献の高濃度まで細胞を培養するこ
とができる（例えば特開昭６２−１６３６８７号公報参
照）。このホロファイバー法は培養液の供給及び取り出
しを、ホロファイバー内に培養液を流して供給口と液出
口の圧損を利用して行っている。

〔発明が解決しようとする課題：しかしながら、マイクロキャリア法は撹拌槽内で培養す
るため、撹拌翼によって物理的な損傷を受ける二とが避
けられず、高密度に培養することが困難であるという問
題がある。また、培養開始前にマイクロキャリア上に種
細胞を付着させるために、マイクロキャリアを約１０時
間細胞懸濁液中に浸漬する必要があるので、マイクロキ
ャリアに付着せず鼾濁液中に残留する細胞が多く、この
間に細胞が死滅するという問題がある。更に、細胞培養
中に酸素の供給をするときに、培養液が発泡したり、マ
イクロキャリアからの細胞の分離が困難であるという問
題がある。

一方、ホロファイバー法はホロファイバー内の圧力が高
く液供給口付近では容器内との差圧が大きいので膜を介
して培養液を容器内に供給し、液出口付近ではホロファ
イバー内の圧力が容器内より低くなるので膜を介して培
養液を取り出している。このため、ホロファイバーの中
央付近では、ホロファイバー内と容器の差圧が少ないの
で膜を透過する培養液の量が少なくなる。従って、培養
液の供給が不均一になるため、部分的にしが高濃度の培
養を行えないという問題がある。また、束状のホロファ
イバー膜かみ細胞を剥離させることが困難なので、細胞
の収率が低くなると共にホロファイバーの再利用が不可
能になり、ランニングコストが高価になるという問題が
ある。

本発明はこのような事情に鑑みて成されたもので、細胞
に培養や酸素を均一に供給して、大量の細胞を高密度に
培養できる細胞の培養方法及びその装置を提供すること
を目的とする。

〔課題を解決する為の手段〕

本発明は、前記目的を達成する為に、表面に細胞が付着
する複数枚の多孔板と、該複数枚の多孔板が所定間隔で
並設されるとともに多孔板の表面と連通ずる貫通孔を有
する回転自在な支軸とから成る濾過体と、前記濾過体を
収納するとともに該濾過体の支軸を支持する密閉容器と
、培養液を含む１乃至複数の流体を前記密閉容器に加圧
状態で供給する手段と、を備えたことを特徴としている
。

また、本発明は、前記目的を達成する為に、貫通孔を有
する支軸にｍ抱を付着させる複数の多孔板を、支軸内の
貫通孔に連通ずるように装着して成る濾過体を、密閉容
器内に設置した培養装置を用い、培養液を加圧状態にし
て密閉容器に供給すると共に、支軸内の貫通孔を大気圧
又は減圧状態にし老廃物を含む培養液を多孔板及び貫通
孔を介して取り出すことを特徴としている。

〔作用〕

本発明によれば、貫通孔が形成されている支軸に、貫通
孔に連通するように濾過体の多孔板を複数板並設して支
軸を゛密閉容器内に設け、更に培養液等を供給する供給
手段を密閉容器に連通した。

従って、この供給手段を操作すると新鮮な培養液を密閉
容器内に供給して濾過体の多孔板に付着した細胞に栄養
分と酸素とを与え、同時に細胞に付着している老廃物を
除去して培養液と共に多孔板を透過して細胞から分離す
ことができる。

〔実施例〕

以下添付図面に従って本発明に係る細胞の培養方法及び
その装置の好ましい実施例を詳説する。

第１図は本発明による培ｆ装萱の一実施例を示す全体図
である。培養装置１０は円筒型の密閉容器１２を備え、
密閉容器１２には多孔板ユニット１３が設けられている
。この多孔板ユニッ）１３の回転軸１４は、第２図に示
すように密閉容器１２の中心に回転自在に支持され、回
転軸１４には軸線上に貫通孔１６が形成されている。貫
通孔１６は第２図上で回転軸１４の左端部に開口して流
入口１６Ａを形成している。回転軸１４にはドーナツ状
の多孔板２０．２０・・・が装着され、この多孔板２０
は連通孔１８を介して貫通孔１６に連通している。

また、密閉容器１２には流入口２２と流出口２４とが設
けられている。密閉容器１２は内径３３Ｑｍ、長さ７０
０Ｍの円筒状に形成され、その中に多孔板２０．２０が
設けられているので、密封容器１２の有効容積は４２１
である。また、密閉容器１２の外周面には温度調節のた
めに外周面に沿って温水を流すことができるようにジャ
ケット２５が取付けられている。

第３図は多孔板２０の詳細と、その回転軸１４への取付
は状態とを示したもので多孔板２０はセラミック製の円
板で、その内周面は回転軸Ｉ４の貫通孔１６と連通する
連通孔１８に当接して設けろれている。多孔板２０は孔
径１０μｍ〜１００μｍと粗く透過抵抗が小さい多孔質
の支持体２６Ａ上に孔径０．０１μｍ〜５μｍと細かく
透過抵抗が大きい多孔質の１ｉ２６Ｂを設けた多層構造
の多孔質層２６で形成されている。このため、液が透過
するときには多孔板２００表面での圧損が律速となって
、多孔板２０上のいずれの個所においても貫通孔１６ま
で液が流れるときの圧損がほぼ等しくなる。従って、貫
通孔１６に近い個所だけから液がショートバスすること
がなく、いずれの場所からも均一に培養液の供給及び取
り出しが行なえるので、多孔板ユニット１３は培養液の
供給用及び細胞の老廃物取り出し用の両方に用いるとが
できる。また、多孔板２０は細胞の付着を容易にするた
めに、表面の粗さを約２０μｍに研磨している。この多
孔板２０は、その直径が３００ｕ。

厚さが５　ｍに形成され、密閉容器１２の回転軸１４に
８酎間隔で各々５０枚配設されている。

多孔板２０上）１３が収納されている密封容器１２は第
１図に示すように培養液などを貯留する各種（３４，３
６，３８，３９，４０，４２，４４，４６）、及び送液
のための圧力源となるコンプレッサ３０、真空ポンプ３
２等に接続されている。

以下第１図に基づいてこれらの関係を説明する。

密封容器１２の流入口２２には、種細胞貯槽３４、洗浄
などに使用される緩衝液の貯槽３６、多孔板２０を洗浄
するアルカリ液の貯槽３８、及び培養液貯槽３９が連通
されている。これらの各貯槽３４．３６．３８及び３９
はコンプレッサ３ｏと接続されており、コンプレッサ３
ｏからの無菌圧縮空気で液を加圧し、密閉容器１２に送
れるようになっている。また、流入口２２には滅菌用の
蒸気を発生するボイラ４０も連通されている。

流出口２４には、密閉容器１２の液を排出する管３３Ａ
１及び培養完了後多孔板２ｏから剥離された細胞を種細
胞貯槽３４に送るための管３３Ｂが接続されている。

多孔板ユニット１３の回転軸１４の流出入口１６Ａには
、培養完了後多孔板２０から細胞を剥離させるためのト
リプシンを供給するためのトリプシン貯槽４２が連通さ
れている。このトリプシン貯槽４２もコンプレッサ３０
と接続されており、コンプレッサ３０からの無菌圧縮空
気で液を加圧し、密閉容器１２に送れるようになってい
る。また、この流出入口１６Ａには、細胞の生産物を回
収する生産物貯槽４４、細胞の老廃物を回収する老廃物
貯槽４６が連通されている。これらの貯槽４４．４６は
真空ポンプ３２と接続されており、多孔板２０を介して
密閉容器１２から液を回収できるようになっている。

尚、第１図上で４８は無菌フィルタ、５０は培養液供給
用及び細胞の老廃物取出し用の切換弁、第２図上で５２
はジャケット２５への温水供給口、５４はジャケット２
５からの温水排出口、５６はモータ、５８．６０はプー
リ、６２はベルトである。

次に、発明の細胞の培養装置による培養の一例として、
人繊維芽細胞によるインターフェロン（ＩＦＮ）の生産
例を示す。

まず、密閉容器１２の流入口２２から１２１℃以上の蒸
気を密閉容器１２内に送り、密閉容器１２内を２０分間
以上１２１ｔに保つことにより空滅菌を行う。次に、操
作は温水併給口５２から温水を供給して密閉容器１２の
ジャケット２５に温水を循環させて密閉容器１２を３７
℃に保存する。

二の状態で細胞を多孔板２０．２０・・・の表面に付着
させる。表面への付着は、コンプレッサ３０及び真空ポ
ンプ３２を作動して細胞を種細胞槽３４から密閉容器１
２内に満たすと共に、濃度ｌＯ５個／献に懸濁した培養
液（仔つシ血ａ５％を加えたＭＥＳ培地）を培養液貯留
槽３９から密閉容器１２内に漬だした後、滅菌し溶存酸
素を飽和させた緩衝液（ＰＢＳ液）を０．５ｋｇｆ／ｃ
Ｉ１１に加圧して緩衝液貯留槽３６から流入口２２を介
して密閉容器１２内に送り、多孔板２０．２０・・・を
介して培養液を回転軸１４の貫通孔１６から取り出すこ
とによって行う。

これにより、細胞は液とともに多孔板２０．２０・・・
の方向に流されるが、多孔板２０．２０・・・を透過す
ることができないので、強制的に多孔板２０．２０・・
・の表面に付着させられる。通常行われている浸漬のみ
による細胞の付着時間が４〜１４時間を要するのに対し
、本願発明のろ過を伴う方法では約３０分で付着が完了
する。このだと１雑菌汚染の可能性を少なくすることが
できると共に細菌の付着率及び生存率をほぼ１００％に
できる。

次いで、栄養分と酸素を含む新鮮な培養液を供給し、老
廃物を含む培養液を取り出して多孔板２０．２０・・・
に付着した細胞を大量に増殖させる。

この増殖は、密閉容器１２の流入口２２から、０゜０１
〜１．Ｏｋｇｆ／ｃｌＩに加圧した新鮮な培養液を圧入
し、貫通孔１６を大気圧または−０，０５ｋｇｆ／　ｃ
ｄ径程度減圧状態にして流出入口１６Ａを経て培養液を
取り出すことによって行う。この時、加圧された新鮮な
培養液は多孔板２０の表面に付着した細胞に栄養分と酸
素とを与えると共に、細胞が代謝した老廃物を含んで多
孔板２０の内面を通り貫通孔１６から取り出される。こ
のような老廃物の除去を伴う培養方法で、数日後には多
孔板２０．２０・・上に高密度の細胞が付着する。

続いて、供給する培養液中にＩＦＮ誘導剤を加え、ＩＦ
Ｈの生産を開始させる。ｒＦＮは、貫通孔１６の流出入
口１６Ａから培養液とともに取り出される。

次に、ＩＦＮの生産が完了した細胞を多孔板２０．２０
・・・から剥離して、多孔板２０．２０・・・を再使用
する。これは、密閉容器１２内の培養液を緩衝液と交換
した後、貫通孔１６を通じてトリプシン液を多孔板２０
．２０・・・の内面から滲出させて行うことができる。

この方法によると、多孔板２０．２０・・・に付着して
いる細胞の付着面をトリプシンで直接処理できるので、
２分間で剥離が終了する。この時間はトリプシン液中で
攪拌するだけの従来の方法の約１ノＩＯに相当する。

また、この時モータ５６を駆動して多孔板２０．２０・
・・を回転すると、さらに短時間で細胞を剥離すること
ができる。剥離された細胞は、密閉容器１２内を緩衝液
で洗浄する時緩衝液とともに取り出し、一部は次回の培
養の種細胞として利用するため種細胞貯槽３４に貯留す
る。

細胞の排出後、多孔板２０．２０・・・を洗浄するため
に、密閉容器１２をアルカリ液（界面活性剤を含む０．
５　％の水酸化ナトリウム溶液）で満たし、多孔板２０
．２０・・・を１１００ｒｐで約１時間回転させる。こ
の操作によって、多孔板２０．２０・・・は、その表面
上の付着物や残留物を除去することができるので、繰り
返し培養に使用できる。

前記実施例では、培養中の酸素の供給方法として、酸素
を含む新鮮な培地を密閉容器１２に供給したが、酸素を
大量に要求する細胞の場合には、次の方法で酸素を供給
することができる。まず、培養液の量を密閉容器１２の
約１７２とし、多孔板２０．２０・・・の半分が液面か
らでるようにしてから多孔板２０．２０・・・を３θ〜
５Ｑｒｐｍで回転させる。この状態で流入口２２から酸
素を含む気体（５％炭酸ガスと無菌空気など）を送ると
、細胞への酸素の供給効率が大幅に向上する。

また、前記実施例では生産物の回収方法として、新鮮な
培養液を送って細胞が代謝した生産物を回収したが、培
養液に代えて安価な緩衝液を用いてもよい。

更に、前記実施例では、多孔板ユニット１３の回転軸１
４が一軸の場合について説明したが、これに限らず、培
養容量を大きくする場合には、第４図に示すように回転
軸を二軸使用して多孔板ユニットを二セット使用しても
よい。この場合の細胞の培養装置の全体図を第５図に示
す。尚、第５図上で６０は密閉容器であり、第４図、第
５図において前記実施例と同一部材については同一符号
を付して説明を省略する。

第４図に示す実施例では、二セットの多孔板ユニットの
多孔板を隣接していないで設けたが、二セットの多孔板
同士がかみ合うように設けてもよい。尚、多孔板ユニッ
トは二セットに限らず複数セット設けてもよい。

〔発明の効果］本発明に係る培養方法及びその装置によれば、の濾過体
の多孔板の全域で細胞と培養液を均一に分離できるので
、多孔板に付着した細胞に培養液に含まれている栄養分
及び酸素を均一に供給することができる。従って、大量
の細胞を高密度に培養できるので効率のよい生産を行う
ことができる。

また、細胞懸濁液を濾過することによって、培養開始前
に濾過体の多孔板に細胞を短時間でかつ確実に付着させ
られることができる。

更に、培養終了後に容易に細胞を濾過体の多孔板から剥
離させることができるので多孔板の再生が可能である。

また、濾過体の多孔板を孔径の大きな多孔質の支持体の
外周上に孔径の小さな多孔質の層を設けた多層構造にす
ることによって、多孔板の表面のいずれの場所からも均
一に培養液の供給及び取り出して行うことができ、更に
、細胞を容易に付着することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る細胞の培養装置を示す全体図、第
２図は多孔板ユニットの構造を示す断面図、第３図は多
孔板の拡大図、第４図は本発明に係る細胞の培養装置の
他の実施例に使用される多孔板ユニットの断面図、第５
図は第４図の多孔板ユニットが使用された細胞の培養装
置。ｌＯ・・・細胞の培養装置、　　１２．６ｏ・・・密閉
容器、１４・・・回転軸、　　　　　１６・・・貫通孔
、２２・・・流入口、　　　　　３ｏ・・・圧縮器、３
２・・・真空ポンプ、　　　３４・・・種細胞貯送、３
９・・・培養液貯槽。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）表面に細胞が付着する複数枚の多孔板と、該複数
枚の多孔板が所定間隔で並設されるとともに多孔板の表
面と連通する貫通孔を有する回転自在な支軸とから成る
濾過体と、前記濾過体を収納するとともに該濾過体の支
軸を支持する密閉容器と、培養液を含む１乃至複数の流体を前記密閉容器に加圧状
態で供給する手段と、を備えたことを特徴とする細胞の培養装置。
（２）前記濾過体の支軸の貫通孔に、前記多孔板から細
胞を剥離させるための流体を加圧状態で供給する手段を
備えたことを特徴とする請求項（１）記載の細胞の培養
装置。
（３）濾過体の多孔板を、孔径１０μｍ〜１００μｍの
多孔質の支持体の外周上に、孔径０．０１μｍ〜５μｍ
の多孔質の層を設けて多層構造としたことを特徴とする
請求項（１）又は（２）記載の細胞の培養装置。
（４）貫通孔を有する支軸に細胞を付着させる複数の多
孔板を、支軸内の貫通孔に連通するように装着して成る
濾過体を、密閉容器内に設置した培養装置を用い、培養
液を加圧状態にして密閉容器に供給すると共に、支軸内
の貫通孔を大気圧又は減圧状態にし老廃物を含む培養液
を多孔板及び貫通孔を介して取り出すことを特徴とする
細胞の培養方法。
（５）密閉容器内に種細胞懸濁液を供給して多孔板の半
分又は全体を種細胞懸濁液中に浸漬した後、密閉容器内
を加圧して種細胞懸濁液を多孔板で濾過して多孔板に細
胞を付着させることを特徴とする請求項（４）記載の細
胞の培養方法。
（６）密閉容器内に培養液を供給して多孔板の一部を培
養液に浸漬し、密閉容器内に圧縮空気を供給して多孔板
を酸素を含む無菌の気体に接触させ、多孔板を回転させ
て細胞に酸素を供給することを特徴とする請求項（４）
又は（５）記載の細胞の培養方法。
（７）新鮮な培養液又は緩衝液を加圧して密閉容器内に
供給した後、誘導剤を加圧して密閉容器内に供給し、生
産された生産物を含む培養液を多孔板及び貫通孔を介し
て取り出すことを特徴とする請求項（４）、（５）又は
（６）記載の細胞の培養方法。
（８）貫通孔を介して多孔板から剥離用の液体を滲出さ
せて多孔板に付着した細胞を多孔板から剥離することを
特徴とする請求項（４）、（５）、（６）又は（７）記
載の細胞の培養方法。