JP2010081823A - 細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】培養した細胞を該細胞培養担体から自動的に剥離させ、また培養した細胞を自動的に取り出すことのできる細胞培養装置を提供する。
【解決手段】細胞を培養する凹部が設けられた細胞培養担体を内部空間に密閉可能に保持する密閉系部材１０と、細胞培養担体の凹部が設けられた第１面に対向する第２面に対して水圧あるいは空圧を供給する圧力供給部２０と、前記細胞培養担体の凹部における細胞の培養状態を撮像するカメラ４１と、前記カメラによって撮像された画像から培養している細胞の大きさを判定し、所定の大きさに培養されているか否かを検出する培養状態検出回路を有する画像処理動作制御部４０とを備え、細胞が所定の大きさに培養されている場合に、前記画像処理動作制御部４０の動作信号により、圧力供給部２０が第２面に対して水圧あるいは空圧を供給し、細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１に培養された細胞を剥離する。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞培養装置に関する。

近年、ヒト骨髄液からの幹細胞の分離、目的とする組織細胞への分化・誘導、３次元培養技術、足場材料の開発等の進歩に伴い、細胞培養によって幹細胞から皮膚、骨、軟骨、血管、心臓弁、靭帯等の組織を作製することが可能となり、一部では、既に臨床応用が開始されている。
このような細胞の培養にあっては、基板表面上にアレイ状やハニカム状等に規則配列され、種細胞を凝集させて保持する細胞培養セルを備えた細胞培養チップを用いる技術が知られている（例えば、特許文献１）。
また、細胞培養担体と細胞とを含む培養液を収納する培養容器と、培養液中で細胞培養担体を移動させるための磁場を発生する磁場発生装置とを備える細胞培養装置が知られている（例えば、特許文献２）。
特開２００５−２７５９８号公報 特開２００４−３１３００７号公報

上述した特許文献１、２に示すような細胞培養技術は、細胞を培養させた後、前記細胞培養チップや前記細胞培養担体からの剥離作業が必要となる。この剥離作業は、通常、トリプシン処理等の酵素処理を用いて行う。
しかしながら、このような酵素処理を長時間行うと培養した細胞はある程度劣化してしまい、最悪、細胞自体が死滅する場合がある。また、トリプシン処理等の酵素処理は、非常に作業が煩雑という問題もある。
かかる問題を解決するために、本出願人は、特願２００８−１７２９４９号において、トリプシン処理等の酵素処理を行う事無く、細胞培養担体で培養した細胞を、該細胞培養担体から容易に剥離させることができる細胞培養モジュールを提案している。

この本出願人が提案した細胞培養モジュールは、細胞を培養する凹部が設けられた多孔体からなる細胞培養担体を内部空間に密閉可能に保持する密閉系部材と、前記内部空間に培養液が充填された状態で、前記内部空間に保持された細胞培養担体の前記凹部が設けられた第１面（培養面）に対向する第２面（培養面の背面）に対して水圧を供給する水圧供給部と、前記第２面に対する水圧により前記凹部から剥離された細胞を前記内部空間から回収する細胞回収部とを備えている。

そして、この細胞培養モジュールにあっては、前記細胞培養担体の凹部が設けられた第１面（培養面）に対向する第２面（培養面の背面）に対して水圧を供給し、前記水圧により、細胞培養担体で培養した細胞を、該細胞培養担体から剥離させるため、トリプシン処理等の酵素処理を行うことなく、細胞培養担体で培養した細胞を、該細胞培養担体から容易に取り出すことができる。

ところで、前記細胞培養モジュールに対して水圧を作用させ、培養した細胞を該細胞培養担体から取り出すには、作業者が培養した細胞を観察し、所定の大きさに培養されたと認められた場合に、水圧供給部の弁を開放し、第２面（培養面の背面）に対して水圧を供給し、この水圧によって培養した細胞を細胞培養担体から剥離させる必要がある。
そのため、培養した細胞の大きさにばらつきが生じるのみならず、弁の開放等の水圧供給動作を手動で行わなければならず、作業上、人手がかかり好ましいものではなかった。

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、一定の大きさを有する細胞を培養することができ、また培養した細胞を該細胞培養担体から自動的に剥離させることができ、更に培養した細胞を取り出すことのできる細胞培養装置を提供することを目的とする。

本発明は上記目的を達成するためになされたものであり、本発明にかかる細胞培養装置は、細胞を培養する凹部が設けられた多孔体からなる細胞培養担体を内部空間に密閉可能に保持する密閉系部材と、前記内部空間に培養液が充填された状態で、細胞培養担体の凹部が設けられた第１面に対向する第２面に対して水圧あるいは空圧を供給する圧力供給部と、前記細胞培養担体の凹部における細胞の培養状態を撮像する撮像装置と、前記撮像装置によって撮像された画像から培養している細胞の大きさを判定し、所定の大きさに培養されているか否かを検出する培養状態検出回路を有する画像処理動作制御部と、を備え、細胞が所定の大きさに培養されている場合に、前記画像処理動作制御部の動作信号により、圧力供給部が細胞培養担体の第２面に対して水圧あるいは空圧を供給し、細胞培養担体の凹部に培養された細胞を剥離することを特徴としている。

このように、細胞培養担体の凹部における細胞の培養状態を撮像装置によって撮像し、培養している細胞の大きさを判定し、所定の大きさに培養されている場合には、画像処理動作制御部の動作信号により、圧力供給部が水圧あるいは空圧を供給し、細胞培養担体の凹部で培養された細胞を自動的に剥離する。そのため、所定の大きさに培養されている細胞を得ることができると共に、省力化することができ、能率的に細胞を培養することができる。

ここで、更に、前記第２面に対する水圧あるいは空圧によって前記凹部から剥離された細胞を、前記内部空間から回収する細胞回収部を備えていることが望ましい。

また、前記密閉系部材と前記圧力供給部とを接続する培養液供給管と、前記培養液供給管に設けられた培養液の供給量を制御する供給制御電磁弁と、前記供給制御電磁弁の動作を制御するバルブコントローラとを備え、前記バルブコントローラが、前記画像処理動作制御部からの動作信号を受け、供給制御電磁弁の動作を制御し、細胞培養担体の凹部に培養された細胞を剥離することが望ましい。

更に、前記密閉系部材と前記圧力供給部とを接続する培養液供給管と、前記密閉系部材と前記細胞回収部とを接続する排出管と、前記培養液供給管に設けられた培養液の供給量を制御する供給制御電磁弁と、前記排出管に設けられた培養液の排出量を制御する排出制御電磁弁と、前記供給制御電磁弁と排出制御電磁弁の動作を制御するバルブコントローラとを備え、前記バルブコントローラが、前記画像処理動作制御部からの動作信号を受け、供給制御電磁弁及び排出制御電磁弁の動作を制御し、細胞培養担体の凹部に培養された細胞を剥離する共に、剥離した細胞を前記細胞回収部により回収することが望ましい。
このように剥離した細胞を回収する場合には省力化することができ、しかも効率的に細胞を回収することができるため、好ましい。

また、本発明にかかる細胞培養装置は、細胞を培養する凹部が設けられた多孔体からなる第１の細胞培養担体を内部空間に密閉可能に保持する密閉系部材と、前記内部空間に培養液が充填された状態で、細胞培養担体の凹部が設けられた第１面に対向する第２面に対して水圧あるいは空圧を供給する圧力供給部とを備えた第１の細胞培養モジュールと、前記第１の細胞培養担体の凹部における細胞の培養状態を撮像する第１の撮像装置と、前記第１の撮像装置によって撮像された画像から培養している細胞の大きさを判定し、所定の大きさに培養されているか否かを検出する培養状態検出回路を有する第１の画像処理動作制御部と、細胞を培養する凹部が設けられた多孔体からなる第２の細胞培養担体を内部空間に密閉可能に保持する密閉系部材と、前記内部空間に培養液が充填された状態で、細胞培養担体の凹部が設けられた第１面に対向する第２面に対して水圧あるいは空圧を供給する圧力供給部と、前記第２面に対する水圧あるいは空圧によって前記凹部から剥離された細胞を、前記内部空間から回収する細胞回収部とを備えた第２の細胞培養モジュールと、前記第２の細胞培養担体の凹部における細胞の培養状態を撮像する第２の撮像装置と、前記第２の撮像装置によって撮像された画像から培養している細胞の大きさを判定し、所定の大きさに培養されているか否かを検出する培養状態検出回路を有する第２の画像処理動作制御部と、前記第１の細胞培養モジュールの内部空間と第２の細胞培養モジュールとを接続する細胞搬送管と、を備えている。
そして、前記第１の画像処理動作制御部により、第１の細胞培養担体内で細胞が所定の大きさに培養されている場合には、前記第１の画像処理動作制御部の動作信号により、圧力供給部が第２面に対して水圧あるいは空圧を供給し、細胞培養担体の凹部に培養された細胞を剥離する共に、剥離した細胞を前記細胞搬送管を介して第２の細胞培養モジュールに搬送し、更に、第２の細胞培養モジュールにおける第２の細胞培養担体内で細胞が所定の大きさに培養されている場合には、前記第２の画像処理動作制御部の動作信号により、圧力供給部が第２面に対して水圧あるいは空圧を供給し、第２の細胞培養担体の凹部に培養された細胞を剥離する共に、剥離した細胞を細胞回収部により回収することを特徴としている。

このように、第１、２の細胞培養モジュールを用いて、細胞を段階的に培養することができため、球状の細胞を培養することができる。特に、培養状態を撮像装置で撮像し、細胞培養担体からの剥離、搬送、回収を自動的に行うため、所定の大きさの球状の細胞を得ることができ、しかも省力化することができ、能率的に細胞を培養することができる。

また、前記第１の細胞培養モジュールの密閉系部材と前記圧力供給部とを接続する培養液供給管に設けられた、培養液の供給量を制御する第１の供給制御電磁弁と、前記細胞搬送管に設けられた電磁弁と、前記第１の供給制御電磁弁と細胞搬送管の電磁弁の動作を制御する第１のバルブコントローラと、前記第２の細胞培養モジュールの密閉系部材と前記圧力供給部とを接続する培養液供給管に設けられた、培養液の供給量を制御する第２の供給制御電磁弁と、前記第２の細胞培養モジュールの密閉系部材と前記細胞回収部とを接続する排出管に設けられた、培養液の排出量を制御する排出制御電磁弁と、前記第２の供給制御電磁弁と排出制御電磁弁の動作を制御する第２のバルブコントローラと、を備え、前記第１のバルブコントローラが、第１の供給制御電磁弁と細胞搬送管の電磁弁の動作を制御することにより、第１の細胞培養モジュールで培養された細胞を第２の細胞培養モジュールへ搬送し、前記第２のバルブコントローラが、第１の供給制御電磁弁と排出制御電磁弁の動作を制御することにより、第２の細胞培養モジュールで培養された回収することが望ましい。

本発明によれば、一定の大きさを有する細胞を培養することができ、また培養した細胞を該細胞培養担体から自動的に剥離させることができ、更に培養した細胞を取り出すことのできる細胞培養装置を得ることができる。

以下、本発明について、図面を参照して、詳細に説明する。
（第１の実施形態）
図１は、第１の実施形態に係る細胞培養装置Ａの概略構成図である。
この細胞培養装置Ａに係る細胞培養モジュール１は、図１に示すように、密閉系部材１０と、培養液水圧供給部２０と、細胞回収部３０とで構成されている。また、この細胞培養装置Ａには、細胞の培養状態をカメラ４１で撮像し、画像処理を行い所定の制御を行う画像処理動作制御部４０とを備えている。

前記密閉系部材１０は、例えば、図１に示すように、下蓋１０Ａと、下蓋１０Ａ上に設けられた上蓋１０Ｂと、下蓋１０Ａと上蓋１０Ｂとを固定する固定部材１５とで構成されている。
前記下蓋１０Ａは、図１に示すように、細胞培養担体Ｓを保持し、かつ、培養液を収容するための凹部１０Ａａを備える凹形状で構成されている。
一方、上蓋１０Ｂは、図１に示すように、下蓋１０Ａ上に設けられ、下蓋１０Ａと内部空間１２を形成し、該内部空間１２を密閉可能に保持するために、該下蓋１０Ａの凹部１０Ａａに密閉可能に嵌合する凸部１０Ｂａを備えている。

細胞培養担体Ｓの保持は、例えば、図１に示すように、下蓋１０Ａの凹部１０Ａａの底部１０Ａａ１にＯ−リング１７ａを配置し、Ｏ−リング１７ａ上に細胞培養担体Ｓを配置し、細胞培養担体Ｓ上にＯ−リング１７ｂを配置し、Ｏ−リング１７ａ、細胞培養担体Ｓ及びＯ−リング１７ｂを、下蓋１０Ａと上蓋１０Ｂとを一体に固定する際に、上蓋１０Ｂの凸部１０Ｂａで、Ｏ−リング１７ｂを加圧することで、下蓋１０Ａの凹部１０Ａａ内に細胞培養担体Ｓを保持する。
なお、下蓋１０Ａの凹部１０Ａａに、上蓋１０Ｂの凸部１０Ｂａを嵌合させる際には、内部空間１２が密閉可能に保持されるように、上蓋１０Ｂの凸部１０Ｂａに設けられた窪みにＯ−リング１７ｃを取り付けてから行う。

下蓋１０Ａ及び上蓋１０Ｂは、例えば、アクリル樹脂で構成されている。固定部材１５は、例えば、ＳＵＳ３０４で構成されている。Ｏ−リング１７ａ、１７ｂ、１７ｃは、例えば、フッ素系ゴムで構成されている。
なお、前記密閉系部材１０は、本実施形態では、前述したように、下蓋１０Ａと上蓋１０Ｂとが固定部材１５により一体に固定された構成で説明しているが、本発明は、細胞培養担体Ｓを内部空間１２に密閉可能に保持することができれば、上述した構成に限定されない。

内部空間１２に密閉可能に保持される細胞培養担体Ｓは、その表面（第１面）Ｓａに細胞を培養するための凹部Ｓ１が設けられた多孔体で構成されている。
前記細胞培養担体Ｓは、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、ハイドロキシアパタイトおよび竈−リン酸三カルシウムのうちの少なくともいずれか１種のセラミックスまたはガラスにより構成される。これらのセラミックスまたはガラスは、生体安定性が高いため、好適である。

培養液水圧供給部２０は、下蓋１０Ａの底部１０Ａａ１に一体に又は着脱可能に設けられ、該内部空間１２に培養液を供給する。
培養液水圧供給部２０は、例えば、図１に示すように、培養液を収容する培養液収容部２２と、一端が該底部１０Ａａ１に他端が該収容部２２に取り付けられ、該収容部２２に収容された培養液を該内部空間１２に供給する培養液供給管２４と、該供給管２４に取り付けられ、該内部空間１２に供給する培養液の供給量を制御する供給量制御部２６と、該収容部２２に取り付けられ培養液供給の際の供給圧を制御する供給圧制御部２８とを備える。

培養液収容部２２は、例えば、樹脂性の収容容器で構成されている。培養液供給管２４は、例えば、樹脂性のチューブで構成されている。供給量制御部２６は、例えば、該培養液の供給量を制御する電磁弁（供給制御電磁弁）で構成されている。この供給制御電磁弁２６は、後述するバルブコントローラ４２により、その開閉動作及び開閉量が制御され、その開閉量によって、該培養液の供給量が制御される。供給圧制御部２８は、例えば、培養液収容部２２から培養液供給管２４に対して高圧ガスを供給する高圧ガス供給装置で構成されている。

更に、培養液水圧供給部２０は、該内部空間１２に保持された細胞培養担体Ｓの裏面側Ｓｂ（細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１が設けられた面（第１面）Ｓａに対向する面（第２面））方向に液圧を与えることで、前記第２面Ｓｂに水圧を供給する。
水圧（液圧）を与える方法は、密閉された内部空間１２に培養液が充填された状態で、該内部空間１２に培養液を供給するように供給量制御部２６及び供給圧制御部２８を制御することで行う。即ち、内部空間１２に培養液が充填された状態で、供給量制御部２６を開状態として、供給圧制御部２８により培養液の供給圧を大きくすることで大きい水圧が、また供給圧を小さくすることで小さい水圧が細胞培養担体Ｓの第２面Ｓｂに供給される。

前記水圧を細胞培養担体Ｓの第２面Ｓｂに与えることにより、細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１で培養された細胞は、細胞培養担体Ｓから剥離され、内部空間１２に充填された培養液内に浮遊する。
なお、細胞培養担体Ｓの第２面Ｓｂに供給した水圧を、該細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１の表面まで伝達させるためには、該細胞培養担体Ｓは多孔質体（多孔体）で構成されていることが必要である。

より好ましくは、前記細胞培養担体Ｓを構成する多孔体の気孔の平均気孔径が１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、前記気孔は前記細胞培養担体Ｓの前記凹部Ｓ１の表面から、前記第２面Ｓｂまで連通して設けられていることが好ましい。
このような構成とすることで、細胞培養担体Ｓの第２面Ｓｂに供給した水圧を、該細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１の表面まで伝達することができるため、細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１で培養した細胞を、細胞培養担体Ｓから容易に剥離させることができる。

細胞回収部３０は、上蓋１０Ｂの上部１０Ｂａ１に一体に又は着脱可能に設けられ、細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１で培養され、細胞培養担体Ｓの第２面Ｓｂに供給した水圧により、細胞培養担体Ｓから剥離された細胞を培養液ごと密閉系部材１０の内部空間１２から回収する。
細胞回収部３０は、例えば、図１に示すように、培養した細胞を培養液ごと収容する細胞収容部３２と、一端が該上部１０Ｂａ１に、他端が該収容部３２に取り付けられ、該内部空間１２内で培養された細胞を培養液ごと該内部空間１２から排出する細胞排出管３４と、該排出管３４に取り付けられ、該内部空間１２から排出される培養液の排出量を制御する排出量制御部３６とで構成されている。

細胞収容部３２は、例えば、樹脂性の収容容器で構成されている。細胞排出管３４は、例えば、樹脂性のチューブで構成されている。排出量制御部３６は、例えば、該排出量を制御する電磁弁（排出制御電磁弁）で構成されている。この排出制御電磁弁は、後述するバルブコントローラ４２により、その開閉動作及び開閉量が制御され、その開閉量によって、該排出量を制御する。

次に、細胞の培養状態を撮像装置４１で撮像し、画像処理を行い、所定の動作制御を行う画像処理動作制御部４０ついて説明する。
前記密閉系部材１０の上蓋１０Ｂの上方には、ＣＣＤカメラのような撮像装置４１が設けられている。そして、前記撮像装置４１からの画像デ−タに基づいて細胞の培養状態を検出し、バルブコントローラ４２に対して、動作信号を送出する画像処理動作制御部４０が設けられている。尚、図２中、符号４３は撮像装置４１からの画像を表示する表示装置である。

前記撮像装置４１としては、ＣＣＤカメラを例にとって説明するが、特にこれに限定されるものではなく、細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１で培養されている細胞の像を画像デ−タに変換できるものであれば良く、例えば、ラインセンサーカメラ、遠赤外線検出素子等を用いることもできる。
前記画像処理動作制御部４０は、図２に示すように、撮像装置４１からの映像アナログ信号が入力される入力インタ−フェイス部４０ａと、入力インタ−フェイス部４０ａからのアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換回路４０ｂと、前記Ａ／Ｄ変換回路４０ｂからの信号を２値化する２値化処理回路４０ｃと、２値化処理回路４０ｃからの信号に基づいて、培養状態を検出する培養状態検出回路４０ｄと、前記培養状態検出回路４０ｄからの信号に基づいて、バルブコントローラ４２を制御するバルブ動作制御回路４０ｅと、前記２値化処理回路４０ｃ、培養状態検出回路４０ｄ、バルブ動作制御回路４０ｅの動作を制御管理するコンピュ−タ４０ｆとから構成されている。

前記２値化処理回路４０ｃは、Ａ／Ｄ変換回路からのデジタル信号が一定の値（しきい値）より大きいかあるいは小さいかによって、すなわち所定の明度を基準として、細胞が存在しない場合には「０」、存在する場合は「１」として「０、１」の画像デ−タに変換するものである。
ここで、しきい値は、透明色だけが「０」、透明色以外の色、例えば茶色、クリ−ム色等のものは黒色「１」と判断されるように、あらかじめ設定する。

また、培養状態検出回路４０ｄは、前記２値化処理回路４０ｃからの「１」のデ−タをカウントすることによって、培養している細胞の大きさ（面積）を検出し、培養の終了状態にある細胞か否かを検出するものである。
ここで、例えば、撮像装置における撮像素子の分解能が８μｍ（１画素の大きさ）の場合、４×４画素（１６画素、１辺３２μｍの大きさ）を基準として、１６個の画素における全てデ−タが「１」である場合に、径が３０μｍ以上（面積が１０２４μｍ²）以上の細胞が存在していると認識される。
一方、１６個の画素中、一群の４画素のデ−タが「１」である場合に、径が１６μｍ以上（面積が２５６μｍ²）の細胞が存在していると認識される。
このように、細胞が存在すると認められる画素数を求めることにより、培養している細胞の大きさ（面積）を検出することができる。

なお、図中のコンピュ−タ４０ｆは、２値化処理回路４０ｃのしきい値を変えたり、培養状態検出回路４０ｄにおける培養終了時の細胞の大きさ（径）を変えたり、あるいはまたバルブ動作制御回路４０ｅからのバルブコントローラ４２への信号の送出タイミング等の管理調整のために用いられる。

次に、図１に示す細胞培養装置を用いた細胞培養方法の一例を、図２乃至図４に基づいて説明する。
最初に、図３に示すように、細胞培養担体Ｓの第２面Ｓｂに、フィーダー細胞（Ｆｅｅｄｅｒ細胞）を設置する。次に、凹形状の下蓋１０Ａを用意し、下蓋１０Ａの底部１０Ａａ１にＯ−リング１７ａ、フィーダー細胞（Ｆｅｅｄｅｒ細胞）が設置された細胞培養担体Ｓ及びＯ−リング１７ｂをこの順で積層して下蓋１０Ａの凹部１０Ａａ内に設置する。その後、下蓋１０Ａの凹部１０Ａａ内に設置した細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１に培養する細胞を設置する。なお、培養する細胞が細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１に設置されると、前記設置した細胞は、細胞培養担体Ｓの表面に付着され、保持される。

その後、上蓋１０Ｂの凸部１０Ｂａの窪みにＯ−リング１７ｃを挿入し、下蓋１０Ａの凹部１０Ａａと、上蓋１０Ｂの凸部１０Ｂａとをそれぞれ嵌め合わせ、固定部材１５により下蓋１０Ａと上蓋１０Ｂとを一体に固定して、内部空間１２が形成された本実施形態に係る密閉系部材１０を構成する。
その後、下蓋１０Ａの底部１０Ａａ１に培養液水圧供給部２０の培養液供給管２４を取り付けると共に、上蓋１０Ｂの上部１０Ｂａ１に細胞回収部３０の細胞排出管３４を取り付けることで、本実施形態に係る細胞培養モジュール１を構成する。

次に、細胞回収部３０の排出量制御部３６を「開」状態とし（本実施形態では排出制御電磁弁を「開」状態として）、培養液水圧供給部２０の供給量制御部２６を「開」状態とし（本実施形態では供給制御電磁弁を「開」状態として）、更に、供給圧制御部２８から供給圧を与えることで該内部空間１２内に培養液が完全に満たされるまで、培養液収容部２２から培養液を供給する。
内部空間１２に培養液が完全に満たされた時点で供給圧制御部２８からの供給圧を止めて、供給量制御部２６を「閉」状態とし（本実施形態では供給制御電磁弁を「閉」状態とし）、同時に、細胞回収部３０の排出量制御部３６を「閉」状態（本実施形態では排出制御電磁弁を「閉」状態）とする。これによって、細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１に保持された細胞が培養される環境が整う（図３）。

そして、上蓋１０Ｂの上方から撮像装置４１で観察し、撮像装置４１によって撮影された一定の範囲の画像のアナログ信号は、入力インタ−フェ−ス４０ａに入力され、Ａ／Ｄ変換回路４０ｂに供給される。このＡ／Ｄ変換回路にあっては、前記アナログ信号をデジタル信号に変換し、２値化処理回路４０ｃに前記デジタル信号を供給する。
また、２値化処理回路４０ｃにおいて、画像が２値化処理される。
すなわち、画素毎に明度によって、細胞が存在しない場合は「０」、存在する場合は「１」として「０、１」の画像デ−タに変換される。
この２値化処理回路４０ｃからの２値化信号は、培養状態検出回路４０ｄに供給され、「０、１」デ−タがカウントされ、その「１」のデ−タが所定の数（画素数）に到達した際には、培養された細胞が所定に大きさ（面積）を有するまでに培養されたとして検出する。そして、この培養状態検出回路４０ｄからの検出信号は、バルブ動作制御回路４０ｅに入力され、バルブ動作制御回路４０ｅから供給量制御部２６、排出量制御部３６を開閉制御するバルブコントローラ４２に対して、動作信号を送出する。

即ち、培養状態検出回路４０ｄによって培養された細胞が所定に大きさ（面積）を有するまでに培養されたとして検出された際には、図４に示すように、バルブコントローラ４２は、細胞回収部３０の排出量制御部（排出制御電磁弁）３６を「開」状態として内部空間１２内の培養液の排出を開始すると共に、培養液水圧供給部２０の供給量制御部（供給制御電磁弁）２６を「開」状態とする。
更に、供給圧制御部２８から供給圧を与えて内部空間１２に新たに培養液の供給を開始する。この操作により、細胞培養担体Ｓの第２面Ｓｂ方向に、培養液水圧供給部２０から液圧（水圧）Ｐ₁が供給される。
この液圧（水圧）Ｐ₁により、細胞培養担体Ｓの第２面Ｓｂには水圧が供給されるため、細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１で培養された細胞Ｃは、細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１の表面から剥離され、内部空間１２内の培養液内に浮遊し、そのまま、培養液と共に、細胞回収部３０の細胞排出管３４を経て、細胞収容部３２に回収される（図４）。

このように、細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１における細胞Ｃの培養状態を撮像装置４１によって撮像し、培養している細胞Ｃの大きさを判定する。そして、細胞Ｃが所定の大きさに培養されている場合には、画像処理動作制御部４０の動作信号により、圧力供給部２０が水圧（液圧）を供給し、細胞培養担体Ｓの凹部Ｓ１で培養された細胞Ｃを自動的に剥離させる。そのため、所定の大きさ（面積）に培養された細胞Ｃを得ることができる。また細胞の培養作業を省力化することができ、能率的に細胞を培養することができる。

次に、本発明にかかる第２の実施形態について説明する。この第２の実施形態にかかる細胞培養装置は、細胞培養モジュールを２つ備えている点において、第１の実施形態と相違している。
即ち、一の細胞培養モジュールで一定の大きさまで細胞を培養し、この培養した細胞を、他の細胞培養モジュールに移送し、更に大きな細胞に培養するように構成されている点において相違している。

このように、２つの細胞培養モジュールを用いて細胞を培養するのは、球状の細胞を培養する場合、単離した細胞を細胞培養担体の大きな凹部（細胞培養セル）で培養すると、培養される細胞は、前記凹部底部を球と認識せず、平面と認識してしまうため、培養する細胞が前記底部に付着し、球状の細胞を培養することができない。
そのため、球状の細胞を所望の大きさまで培養するには、最初は細胞培養担体の小さな凹部（小さい空間）で所望の大きさまで細胞を培養した後、細胞培養担体の大きな凹部（大きい空間）で段階的に培養していく必要がある。
即ち、一の細胞培養モジュールで一定の大きさまで細胞を培養し、その後、この培養した細胞を、他の細胞培養モジュールに移送し、更に大きな細胞に段階的に培養することにより、球状の細胞を培養する必要がある。

したがって、この第２の実施形態にあっては、細胞培養担体の凹部（細胞培養セル）の大きさの異なる２つの細胞培養モジュールを用いて細胞を培養する装置であり、基本的に第１の実施形態と同様な構成を備えている。そのため、第１の実施形態と同一の構成については、同一符号を付することにより、その詳細な説明は省略する。

この第２の実施形態にかかる細胞培養装置Ａは、前記したように、二つの第１、第２の細胞培養モジュール１、２を備えている。
また、この第１、第２の細胞培養モジュール１、２の内部空間を連結する細胞搬送管６０と、この細胞搬送管６０に設けられた電磁弁６２を備えている。

また、第１、第２の細胞培養モジュール１、２の内部空間に密閉可能に保持される細胞培養担体ＳＡ、ＳＢは、第１の実施形態に示された細胞培養担体Ｓと同一の構成であるが、表面（第１面）ＳＡａ，ＳＢａに形成された細胞を培養するための凹部ＳＡ１，ＳＢ１の大きさが異なる。前記したように凹部ＳＡ１は，凹部ＳＢ１よりも小さな寸法形状を有している。
更に、細胞回収部３０は、第２の細胞培養モジュール２側に設けられ、第１の細胞培養モジュール１側には設けられていない。即ち、第１の実施形態と同一の細胞回収部３０を第２の細胞培養モジュール２側に設けることにより、第２の細胞培養モジュール２によって培養された細胞を第２の細胞培養モジュール２から回収できるように構成されている。

また、この細胞培養装置Ａの細胞培養モジュール１、２の夫々に、細胞の培養状態をカメラ４１、５１で撮像し、その画像の処理を行う画像処理動作制御部４０、５０を備えている。また、夫々の細胞培養モジュール１、２側には、表示装置４３，５３が設けられている。
第１の細胞培養モジュール１側のカメラ４１、画像処理動作制御部４０、バルブコントローラ４２の構成は第１の実施形態と同一であり、また第２の細胞培養モジュール２側のカメラ５１、画像処理動作制御部５０、バルブコントローラ５２の構成も第１の実施形態と同一である。
しかし、前記バルブコントローラ４２は、第１の細胞培養モジュール１側の供給量制御部（供給制御電磁弁）２６と、細胞搬送管６０に設けられた電磁弁６２を制御するものである。また、前記バルブコントローラ５２は、第２の細胞培養モジュール２側の供給量制御部（供給制御電磁弁）２６と、細胞回収部３０の排出量制御部（排出制御電磁弁）３６を制御するものである。

次に、図５に示す細胞培養装置を用いた細胞培養方法について説明する。
まず、第１の細胞培養モジュール１側の細胞培養担体ＳＡの第２面ＳＡｂに、フィーダー細胞（図示せず）を設置する。次に、下蓋１０Ａの凹部１０Ａａ内に設置した細胞培養担体ＳＡの凹部ＳＡ１に培養する細胞を設置し、細胞培養モジュール１を組み立てる。
その後、下蓋１０Ａの底部１０Ａａ１に培養液水圧供給部２０の培養液供給管２４を取り付けると共に、上蓋１０Ｂの上部１０Ｂａ１に、電磁弁６２が設けられた細胞搬送管６０一端を取り付ける。
そしてまた、前記細胞搬送管６０の他端には、細胞培養モジュール２が取り付けられる。この細胞培養モジュール２には、培養液水圧供給部２０の培養液供給管２４を取り付けると共に、細胞回収部３０の細胞排出管３４が取り付ける。
更にまた、前記カメラ４１，５１、表示装置４３，５３を細胞培養モジュール１、２の所定の位置に設置する。

そして、細胞搬送管６０の電磁弁６２を「開」状態とし、第１の細胞培養モジュール１の培養液水圧供給部２０の供給量制御部２６を「開」状態とし（本実施形態では供給制御電磁弁２６を「開」状態として）、更に、供給圧制御部２８から供給圧を与えることで該内部空間１２内に培養液が完全に満たされるまで、培養液収容部２２から培養液を細胞培養モジュール１の内部空間に供給する。
内部空間１２に培養液が完全に満たされた時点で供給圧制御部２８からの供給圧を止めて、供給量制御部２６を「閉」状態とすると共に、細胞搬送管６０の電磁弁６２を「閉」状態とする。これによって、細胞培養担体ＳＡの凹部ＳＡ１に保持された細胞が培養される環境が整う。

そして、第１の細胞培養モジュール１の上方から撮像装置４１で観察し、撮像装置４１によって撮影された一定の範囲の画像のアナログ信号は、入力インタ−フェ−ス４０ａに入力され、Ａ／Ｄ変換回路４０ｂに供給される。このＡ／Ｄ変換回路にあっては、前記アナログ信号をデジタル信号に変換し、２値化処理回路４０ｃに前記デジタル信号を供給する。
また、２値化処理回路４０ｃにおいて、画像が２値化処理される。即ち、画素毎に明度によって、細胞が存在しない場合は「０」、存在する場合は「１」として「０、１」の画像デ−タに変換される。
この２値化処理回路４０ｃからの２値化信号は、培養状態検出回路４０ｄに供給され、「０、１」デ−タがカウントされ、その「１」のデ−タが所定の数（画素数）に到達した際には、培養された細胞が所定に大きさ（面積）を有するまでに培養されたとして検出する。そして、この培養状態検出回路４０ｄからの検出信号は、バルブ動作制御回路４０ｅに入力され、バルブ動作制御回路４０ｅから供給量制御部２６、電磁弁６２を開閉制御するバルブコントローラ４２に対して、動作信号を送出する。

即ち、培養状態検出回路４０ｄによって培養された細胞が所定に大きさ（面積）を有するまでに培養されたとして検出された際には、バルブコントローラ４２は、細胞搬送管６０の電磁弁６２を「開」状態として、内部空間１２内の培養液を第２の細胞培養モジュール２へ移送可能な状態となし、更に培養液水圧供給部２０の供給量制御部２６を「開」状態とする。
そして、供給圧制御部２８から供給圧を与えて内部空間１２に新たに培養液の供給を開始する。この操作により、細胞培養担体ＳＡの第２面ＳＡｂ方向に、培養液水圧供給部２０から液圧（水圧）が供給される。
この液圧（水圧）により、細胞培養担体Ｓの第２面ＳＡｂには水圧が供給されるため、細胞培養担体ＳＡの凹部ＳＡ１で培養された細胞は、細胞培養担体ＳＡの凹部ＳＡ１の表面から剥離され、内部空間１２内の培養液内に浮遊し、そのまま、培養液と共に、細胞搬送管６２を経て、第２の細胞培養モジュール２の内部空間に搬送される。
そして、前記培養された細胞は細胞培養担体ＳＢの凹部ＳＢ１に捕捉され、保持され、第２の細胞培養モジュール２において、再び培養される。

そして、細胞培養モジュール２の上方から撮像装置５１で観察し、撮像装置５１によって撮影された一定の範囲の画像のアナログ信号は、細胞培養モジュール１側の画像処理装置と同様に、入力インタ−フェ−スに入力され、Ａ／Ｄ変換回路に供給される。このＡ／Ｄ変換回路にあっては、前記アナログ信号をデジタル信号に変換し、２値化処理回路に前記デジタル信号を供給する。
また、２値化処理回路において、画像が２値化処理される。この２値化処理回路からの２値化信号は、培養状態検出回路に供給され、「０、１」デ−タがカウントされ、その「１」のデ−タが所定の数（画素数）に到達した場合には、培養された細胞が所定に大きさ（面積）を有するたとして検出する。
そして、この培養状態検出回路からの検出信号は、バルブ動作制御回路に入力され、バルブ動作制御回路から供給量制御部（供給制御電磁弁）２６、細胞回収部３０の排出量制御部（排出制御電磁弁）３６を開閉制御するバルブコントローラ５２に対して、動作信号を送出する。

即ち、培養状態検出回路によって培養された細胞が所定に大きさ（面積）を有するまでに培養されたとして検出された際には、バルブコントローラ５２は、細胞回収部３０の排出制御電磁弁３６を「開」状態として内部空間１２内の培養液の排出を可能な状態になすと共に、細胞培養モジュール２の培養液水圧供給部２０の供給制御電磁弁２６を「開」状態とする。
そして、第２の細胞培養モジュール２の供給圧制御部２８から供給圧を与えて、第２の細胞培養モジュール２の内部空間に新たに培養液の供給を開始する。
この操作により、細胞培養担体ＳＢの第２面ＳＢｂ方向に、培養液水圧供給部２０から液圧が供給される。この液圧により、所定の大きさに培養された細胞は、細胞収容部３２に回収される。

以上のように、トリプシン処理等の酵素処理を行う事無く、細胞培養担体で培養した細胞を、該細胞培養担体から容易に剥離させることができる。
しかも、細胞培養担体の凹部における細胞の培養状態を撮像装置によって撮像し、培養している細胞の大きさを判定するため、所定の大きさに培養されている細胞を得ることができる。また、細胞培養担体の凹部で培養された細胞を自動的に剥離するため、細胞の培養作業の省力化を図ることができ、能率的に細胞を培養することができる。
更に、２つの細胞培養モジュールを用いて段階的に細胞を培養することができるため、球状の細胞を培養することができる。

尚、上記第１、第２の実施形態にあっては、上記したように供給圧制御部から供給圧を与えて内部空間に新たに培養液の供給を開始し、この操作により、細胞培養担体の第２面方向に、培養液水圧供給部から液圧が供給される場合を示した。
しかし、これに限らず、下蓋の底部に一体に又は着脱可能に空気圧供給部を設け、該内部空間に充填された培養液に空気圧を供給することで、細胞培養担体の第２面に空圧を供給するように構成しても良い。
この場合においても、前記空気圧供給部の開閉を行う弁を前記バルブコントローラ４２によって制御することが好ましい。

第１の実施形態に係る細胞培養装置の概略構成図である。 第１の実施形態に係る細胞培養装置に用いられた画像処理動作制御部を示すブロック図である。 第１の実施形態に係る細胞培養装置を用いた細胞培養手順を説明するための図である。 図３に続く細胞培養手順を説明するための図である。 第２の実施形態に係る細胞培養装置を示す概略構成図である。

符号の説明

Ａ 細胞培養装置
Ｃ 細胞
Ｓ 細胞培養担体
ＳＡ （第１の）細胞培養担体
ＳＢ （第２の）細胞培養担体
Ｆ フィーダー細胞（Ｆｅｅｄｅｒ細胞）
１ （第１の）細胞培養モジュール
２ （第２の）細胞培養モジュール
１０ 密閉系部材
２０ 培養液水圧供給部
２６ 供給量制御部（供給制御電磁弁）
３０ 細胞回収部
３６ 排出量制御部（排出制御電磁弁）
４０ 画像処理動作制御部
４１ 撮像装置（カメラ）
４２ バルブコントローラ
４３ 表示装置
６０ 細胞搬送管
６２ 電磁弁

Claims (6)

1. 細胞を培養する凹部が設けられた多孔体からなる細胞培養担体を内部空間に密閉可能に保持する密閉系部材と、
   前記内部空間に培養液が充填された状態で、細胞培養担体の凹部が設けられた第１面に対向する第２面に対して水圧あるいは空圧を供給する圧力供給部と、
   前記細胞培養担体の凹部における細胞の培養状態を撮像する撮像装置と、
   前記撮像装置によって撮像された画像から培養している細胞の大きさを判定し、所定の大きさに培養されているか否かを検出する培養状態検出回路を有する画像処理動作制御部と、を備え、
   細胞が所定の大きさに培養されている場合に、前記画像処理動作制御部の動作信号により、圧力供給部が細胞培養担体の第２面に対して水圧あるいは空圧を供給し、細胞培養担体の凹部に培養された細胞を剥離することを特徴とする細胞培養装置。
2. 更に、前記第２面に対する水圧あるいは空圧によって前記凹部から剥離された細胞を、前記内部空間から回収する細胞回収部を備えていることを特徴とする請求項１記載の細胞培養装置。
3. 前記密閉系部材と前記圧力供給部とを接続する培養液供給管と、前記培養液供給管に設けられた培養液の供給量を制御する供給制御電磁弁と、前記供給制御電磁弁の動作を制御するバルブコントローラと、を備え、
   前記バルブコントローラが、前記画像処理動作制御部からの動作信号を受け、供給制御電磁弁の動作を制御し、細胞培養担体の凹部に培養された細胞を剥離することを特徴とする請求項１記載の細胞培養装置。
4. 前記密閉系部材と前記圧力供給部とを接続する培養液供給管と、前記密閉系部材と前記細胞回収部とを接続する排出管と、前記培養液供給管に設けられた培養液の供給量を制御する供給制御電磁弁と、前記排出管に設けられた培養液の排出量を制御する排出制御電磁弁と、前記供給制御電磁弁と排出制御電磁弁の動作を制御するバルブコントローラとを備え、
   前記バルブコントローラが、前記画像処理動作制御部からの動作信号を受け、供給制御電磁弁及び排出制御電磁弁の動作を制御し、細胞培養担体の凹部に培養された細胞を剥離する共に、剥離した細胞を前記細胞回収部により回収することを特徴とする請求項２記載の細胞培養装置。
5. 細胞を培養する凹部が設けられた多孔体からなる第１の細胞培養担体を内部空間に密閉可能に保持する密閉系部材と、前記内部空間に培養液が充填された状態で、細胞培養担体の凹部が設けられた第１面に対向する第２面に対して水圧あるいは空圧を供給する圧力供給部とを備えた第１の細胞培養モジュールと、
   前記第１の細胞培養担体の凹部における細胞の培養状態を撮像する第１の撮像装置と、
   前記第１の撮像装置によって撮像された画像から培養している細胞の大きさを判定し、所定の大きさに培養されているか否かを検出する培養状態検出回路を有する第１の画像処理動作制御部と、
   細胞を培養する凹部が設けられた多孔体からなる第２の細胞培養担体を内部空間に密閉可能に保持する密閉系部材と、前記内部空間に培養液が充填された状態で、細胞培養担体の凹部が設けられた第１面に対向する第２面に対して水圧あるいは空圧を供給する圧力供給部と、前記第２面に対する水圧あるいは空圧によって前記凹部から剥離された細胞を、前記内部空間から回収する細胞回収部とを備えた第２の細胞培養モジュールと、
   前記第２の細胞培養担体の凹部における細胞の培養状態を撮像する第２の撮像装置と、
   前記第２の撮像装置によって撮像された画像から培養している細胞の大きさを判定し、所定の大きさに培養されているか否かを検出する培養状態検出回路を有する第２の画像処理動作制御部と、
   前記第１の細胞培養モジュールの内部空間と第２の細胞培養モジュールとを接続する細胞搬送管と、を備え、
   第１の画像処理動作制御部により、第１の細胞培養担体内で細胞が所定の大きさに培養されている場合には、前記第１の画像処理動作制御部の動作信号により、圧力供給部が第２面に対して水圧あるいは空圧を供給し、細胞培養担体の凹部に培養された細胞を剥離する共に、剥離した細胞を前記細胞搬送管を介して第２の細胞培養モジュールに搬送し、
   更に、第２の細胞培養モジュールにおける第２の細胞培養担体内で細胞が所定の大きさに培養されている場合には、前記第２の画像処理動作制御部の動作信号により、圧力供給部が第２面に対して水圧あるいは空圧を供給し、第２の細胞培養担体の凹部に培養された細胞を剥離する共に、剥離した細胞を細胞回収部により回収することを特徴とする細胞培養装置。
6. 前記第１の細胞培養モジュールの密閉系部材と前記圧力供給部とを接続する培養液供給管に設けられた、培養液の供給量を制御する第１の供給制御電磁弁と、
   前記細胞搬送管に設けられた電磁弁と、
   前記第１の供給制御電磁弁と細胞搬送管の電磁弁の動作を制御する第１のバルブコントローラと、
   前記第２の細胞培養モジュールの密閉系部材と前記圧力供給部とを接続する培養液供給管に設けられた、培養液の供給量を制御する第２の供給制御電磁弁と、
   前記第２の細胞培養モジュールの密閉系部材と前記細胞回収部とを接続する排出管に設けられた、培養液の排出量を制御する排出制御電磁弁と、
   前記第２の供給制御電磁弁と排出制御電磁弁の動作を制御する第２のバルブコントローラと、を備え、
   前記第１のバルブコントローラが、第１の供給制御電磁弁と細胞搬送管の電磁弁の動作を制御することにより、第１の細胞培養モジュールで培養された細胞を第２の細胞培養モジュールへ搬送し、
   前記第２のバルブコントローラが、第１の供給制御電磁弁と排出制御電磁弁の動作を制御することにより、第２の細胞培養モジュールで培養された回収することを特徴とする請求項５記載の細胞培養装置。

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