JP2004033035A - 胚の培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】胚の左右非対称性を制御できる培養装置を提供する。
【解決手段】培養容器１内に、胚の一部を保持するための保持部６を設ける。培養容器１内において、保持部６上の胚に対し培養液を順次供給するように上記培養液を流すためのポンプ部２を設ける。培養容器１内を流れる培養液流８の方向を制御する制御部５を設ける。
【選択図】　図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マウス等の脊椎動物、哺乳動物の胚（胎児）の培養に好適な胚の培養装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、胚の培養には、胚の表面が常に新鮮な培養液と接することが必要なことから、胚と培養液とを入れて、封をした試験管を、横倒しにして回転させ、試験管内で胚が自由に転がるように設定して、胚を培養していた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記従来では、胚表面において、培養液の流れ方向を制御することは困難であり、また、胚を顕微鏡にて観察することも不可能であるという問題を生じている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明の培養装置は、以上の課題を解決するために、培養容器内に設けられた、胚の一部を保持するための保持部と、培養容器内において保持部上の胚に対し培養液を順次供給するように上記培養液を流すためのポンプ部と、培養容器内を流れる培養液流の方向を制御する制御部とを有していることを特徴としている。
【０００５】
上記培養装置では、保持部は、胚の一部が嵌入する凹部を備えていることが好ましい。上記培養装置においては、保持部は有底筒状に形成されていてもよい。
【０００６】
上記構成によれば、保持部（その凹部や有底筒状）に一部が保持されて固定された胚に対して、ポンプ部によって、常時、新鮮な培養液を供給できて、胚の培養が可能となり、また、胚が固定されているので、上記胚を顕微鏡にて観察し易くなっている。
【０００７】
また、上記構成では、培養容器内を流れる培養液流の方向を制御するから、左右の非対称性の決定に関与している、胚のノード上での流れ方向を制御できて、上記非対称性を制御できる。これにより、上記構成は、左右の非対称性を制御できることにより、実験動物の生育や、発生実験に好適に用いることができる。
【０００８】
上記培養装置では、保持部は、凹部開口内周部に切り欠き部を備えていることが望ましい。上記構成によれば、胚を、例えば先端部が緩く曲がったタングステン針にて保持部に入れたり、取り出したりする場合に、切り欠き部によって、上記操作を円滑化できる。
【０００９】
上記培養装置においては、保持部における凹部内面には、胚における、胚体外円錐およびライヘルト膜の少なくとも一方と付着性を有する付着部材が形成されていることが好ましい。上記培養装置では、付着部材は、アクリル系樹脂を含んでいてもよい。
【００１０】
上記構成によれば、アクリル系樹脂などからなる付着部材により、胚の一部を保持部に固定できるので、上記胚を動かさずに培養できる。
【００１１】
上記培養装置においては、培養容器内での培養液流に乱流が発生することを抑制するために、層状の流れを形成する多孔質部が、培養容器内における培養液の吐出部に設けられていることが望ましい。
【００１２】
上記構成によれば、胚上の培養液流の向きや速度が種々に変化して制御が困難な乱流の発生を多孔質部によって抑制できるから、胚上での培養液流の制御を簡素化できる。
【００１３】
上記培養装置では、培養容器における保持部を備えた基体部が光透過性部材からなっていることが好ましい。上記培養装置においては、培養容器における、保持部と対面するフタ部が光透過性部材からなっていることが望ましい。
【００１４】
上記構成によれば、基体部およびフタ部の少なくとも一方が光透過性部材からなっていることにより、保持部上の胚を外部から顕微鏡にて容易に観察することが可能となる。
【００１５】
上記培養装置では、制御部は、胚に形成されるノードの向きに応じて培養液流の方向を制御するようになっていてもよい。上記構成によれば、胚に形成されるノードの向きに応じて培養液流の方向を制御するので、上記胚の左右非対称性を、より確実に制御できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態に係る胚の培養装置について図１ないし図５に基づいて説明すれば、以下の通りである。
【００１７】
胚の培養装置は、図１に示すように、培養容器１と、ペリスタティックポンプ２と、シリコンチューブ３と、デパルセーター４と、制御部５とを有している。
【００１８】
培養容器１には、容器本体１ａが略長方形板状に設けられている。容器本体１ａでは、培養するために培養液が流れる培養空間１ｂが容器本体１ａの長手方向に沿うように形成されている。容器本体１ａの素材としては、光透過性を有していることが好ましく、例えばアクリル系樹脂が挙げられる。
【００１９】
また、容器本体１ａの長手方向の両端部に、培養液の導入口１ｃと排出口１ｄとがそれぞれ容器本体１ａの長手方向に沿うように形成されている。さらに、容器本体１ａには、培養液流８において乱流の発生を抑制できるように、導入口１ｃと面した位置に、導入口１ｃから培養空間１ｂの内方に向かって、幅（上記長手方向に直交する方向の長さ）が順次大きくなるテーパー部１ｅが形成されている一方、排出口１ｄと面した位置に、培養空間１ｂの内方から排出口１ｄに向かって、幅が順次小さくなるテーパー部１ｆが形成されている。
【００２０】
その上、培養空間１ｂ内の、導入口（吐出口）１ｃ側のテーパー部１ｅには、培養液流８を層流状にして吐出するためのフィルター１ｇがアクリル系樹脂からなる繊維等の集合体である多孔質部により設けられている。上記フィルター１ｇにより、培養空間１ｂ内の培養液流８の流速を上げても、上記培養液流８における乱流発生を抑制することができる。
【００２１】
また、培養空間１ｂを密閉するためのフタ部１ｈが、ガスケット１ｉを介し容器本体１ａに対して着脱自在に設けられている。フタ部１ｈは、ガラスなどの光透過性を有する部材からなっていることが好ましい。ガスケット１ｉの素材としては、密封性を確保できるものであればよいが、例えば０．５ｍｍ厚のシリコンゴムが挙げられる。
【００２２】
前記のペリスタティックポンプ２は、培養液を輸送して、循環させるものであればよく、特にペリスタティックに限定されるものではない。前記シリコンチューブ３は、培養容器１およびペリスタティックポンプ２を互いに連結して、培養液を輸送して、循環させ、培養液に対して不活性なものであればよく、特にシリコン等の素材に限定されるものではない。
【００２３】
前記デパルセーター４は、上部に空間を有するようになっており、その空間の空気層の弾性的伸縮によって、ペリスタティックポンプ２の脈流を平滑化するためのものである。前記制御部５は、ペリスタティックポンプ２を制御して、胚の設置位置や向きに応じて培養液流８の流れる方向や、培養液流８の輸送速度を制御できるようになっている。なお、上記制御部５は、ペリスタティックポンプ２を一定方向、かつ一定速度に固定して動作させるもの（例えば電源）であってもよい。
【００２４】
そして、上記胚の培養装置では、図２および図３にも示すように、マウスやラットのような脊椎動物や哺乳動物の胚（胎児）を保持するための保持部６が、培養容器１ａと一体的（つまりアクリル系樹脂からなる）に、複数、培養容器１ａの平面状の内底部１ｊ上に立設するようにそれぞれ設けられている。
【００２５】
上記各保持部６の配列は、培養液流８の流れる方向に沿って各保持部６が互いに等間隔（例えば６ｍｍ間隔）に並ぶ列が、複数、互いに平行に、かつ等間隔（２ｍｍ間隔）に並び、互いに隣り合う列同士が培養液流８の方向に沿って、列の各保持部６間隔の約半分（３ｍｍ）ずれるようになっている。この配列によって、培養液流８に対し乱流の発生を抑制できると共に、より多くの保持部６を培養容器１ａ内に形成できる。
【００２６】
保持部６の素材としては、光透過性を有していることが好ましく、また、胚の一部（例えば胚体外円錐、ライヘルト膜の一部）に対して親和性つまり付着力を備えている（言い換えると、表面に極性基を有する）ことが望ましく、例えば前述したアクリル系樹脂が挙げられる。上記極性基としては、水酸基、スルホン酸基、リン酸基等が挙げられる。保持部６の素材としてシリコンゴムを用いた場合、胚７は保持部６に付着しなかった。
【００２７】
上記保持部６は、胚の一部を保持できる凹部形状である、有底円筒状（外径１〜２ｍｍ、内径は胚の直径に合わせ０．５ｍｍ程度）に形成され、図２にも示すように、複数、互いに隣り合う保持部６同士の間隔が略同一となるように配列されている。上記では、円筒状の例を挙げたが、胚の一部を保持できる凹部形状であればよく、例えば四角形筒状などの多角形筒状であってもよい。
【００２８】
また、保持部６の内底面部６ａは、培養容器１ａの平面状の内底部１ｊより高い位置（つまり、培養容器１ａの外底面１ｋと内底部１ｊとの間隔より、上記外底面１ｋと内底面部６ａとの間隔が大きい）に形成されている。その理由は、壁面のそばでは、培養液の流速が落ちることから、胚のノードが内底部１ｊから離れた、チャンバー（培養空間１ｂ）のほぼ真ん中の高さに位置するように設計したからである。つまり、内底面部６ａの高さは、流体力学的な効果をねらって設計されている。
【００２９】
さらに、保持部６の開口内周部には、先端が鈍く曲がったタングステン針を用いて胚を保持部６内に効率よく入れたり出したりするための切り欠き部６ｂが内方から外方に向かって順次径が大きくなるテーパー形状に形成されている。
【００３０】
次に、上記培養装置を用い、胚のノードに対する培養液の流れる方向を変えて、胚の培養を行う方法について説明する。用いた胚は、Ｐｉｔｘ２−ｌａｃＺ導入遺伝子（Ｐｉｔｘ２の非対称性を再現した導入遺伝子、１７−Ｐ１）を含む雄マウスをＩＣＲ雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）と交配して得られ、培養液中での、胎生７．７日の培養時点にて詳細に観察された。上記培養液としては、ダルベッコ改訂イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ，　ＤＭＥＭ）に、１０％の牛胎児血清と、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）を加えたものを用いた。
【００３１】
胚の生長段階は、その形態により判断された。レイトバッド（ｌａｔｅ−ｂｕｄ）期と、レイトヘッドフォールド（ｌａｔｅ−ｈｅａｄｆｏｌｄ）期との間の生長段階のものが、本培養容器によるフロー培養に用いられた。上記フロー培養により培養された胚は、１４時間培養されると、４体節（ｓｏｍｉｔｅ）から７体節の段階まで生長した。なお、上記培養により、４体節未満の生長不良の胚については、分析せずに廃棄された。
【００３２】
上記胚は、脊索の一部であるノードにおいて、多くの繊毛を一方向にノード流が形成されるように有している。上記胚においては、そのノード流の方向によって左右の非対称性の少なくとも一部が発現することが分かった。
【００３３】
続いて、培養した胚は、通常の回転培養にてさらに３２時間培養された。上記の培養によって、得られた胚は、通常の（母体内の）成長における９．５日胚の段階にまで成長した。その後、胚は、通常の方法を用いてＸ−ｇａｌにて染色された。導入遺伝子の存在は、第一鰓弓（ｆｉｒｓｔ　ｂｒａｎｃｈｉａｌ　ａｒｃｈ）の位置にて染色するＸ−ｇａｌにより、およびポリメレースチェーン反応（ＰＣＲ）に基づく遺伝子型決定法（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）にて決定された。上記各培養段階を通して、胚は、５％の炭酸ガスおよび２０％の酸素ガスの存在下で、標準的な培養液にて培養された。上記培養液は、５０％のラット血清、５０％のＤＭＥＭ　ｗｉｔｈ　４４ｍＭＮａＨＣＯ_３（ｐＨ７．２）、ペニシリン（５０Ｕｍｌ^−１）、およびストレプトマイシン（５０ｍｇｍｌ^−１）を含む。
【００３４】
胚のノードでの流れを視覚化するために、培養溶液に対して、直径１μｍの赤蛍光ポリスチレンビーズ２％溶液を、１／５００の容量比にて、胚の培養液に添加した。上記培養溶液は、５０％のラット血清、５０％のＤＭＥＭ　ｗｉｔｈ　４４ｍＭＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．２）である。ノード上の流れは、ノードでの通常の（自然な）流れが最も顕著に現れる、ノード表面から約５μｍの高さ位置に存在する上記ビーズにより視覚化される。蛍光像は、ＣＣＤカメラにて撮影され、通常のパソコンによる画像処理にて処理されて得られた。
【００３５】
次に、本発明の培養装置を用いた培養例を図４（ａ）および図４（ｂ）に基づいて説明する。まず、上記の略円柱状の胚７を、ピンセット等を用いて子宮および脱落膜から取り出した。このとき、上記胚７は、胚体外円錐、ライヘルト膜の一部である付着部７ａをノード７ｂの軸方向の反対側に有する状態となっている。上記胚７の方向は、Ａ（ａｎｔｅｒｉｏｒ、頭側）Ｐ（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ、尾側）Ｌ（ｌｅｆｔ、左側）Ｒ（ｒｉｇｈｔ、右側）の略号で表わされる。
【００３６】
続いて、上記タングステン針にて取り出した胚７を、その付着部７ａが保持部６の内底部に当接すると共に、次のように方向を合わせて保持部６内に導入した。このとき、図４（ａ）に示すように、胚の、左向きの流れであるノード流７ｃに培養液流８の流れる方向を合わせる場合（左向き（ｌｅｆｔｗａｒｄ）の流れ）と、逆に、図４（ｂ）に示すように、胚のノード流７ｃに対して培養液流８の方向を逆方向にて合わせる場合（右向き（ｒｉｇｈｔｗａｒｄ）の流れ）とをそれぞれ設定し、また、培養液流の速度をノード流７ｃの速度より遅い、速いの２段階（平均速度、５．７μｍｓ^−１、１１０μｍｓ^−１）にてそれぞれ設定した。
【００３７】
それらの結果を、図５にそれぞれ示した。図５に記載の、ＡＳＥは、トランスジェニックとして導入したＰｉｔＸ２に由来する左側特異的エンハンサーの発現を示し、ＣＡＣは、原始心房（ｃｏｍｍｏｎ　ａｔｒｉｕｍｃｈａｍｂｅｒ）を示し、ＴＡは、動脈幹（ｔｒｕｎｃｕｓ　ａｒｔｅｒｉｏｓｕｓ）を示す。図５の結果から明らかなように、培養液流方向８を逆方向にて合わせ、特に、流速を速めた場合、左右の非対称性の逆転（図５では、斜線のハッチングで示した暗部分）が増加していることにより分かる。
【００３８】
このように本発明の培養装置は、胚における、左右の非対称性を制御できることから、マウスなどの実験動物の生産や、生物の発生に関する実験器具として有用であることが分かる。上記実験としては、胚の左右非対称性を操作したり、胚に対して一定方向の流れをかけ続けたり、初期胚のタイムラスプ（微速度）の観察や、局所的な遺伝子導入など胚を動かさずに生育させたりする場合が挙げられる。
【００３９】
また、本発明の培養装置は、胚（胎児）を多数培養する際に、各胚（胎児）のノード（ｎｏｄｅ）７ｂに対する培養液流８の層流を一定方向に発生させるための還流機構であるペリスタティックポンプ２を設けたことにより。多数の胚（胎児）の非対称性を精度よく、同時に制御することが可能となっている。
【００４０】
これによって、本発明の培養装置は、非対称性の研究をはじめとする種々の研究に利用できるほか、この培養装置を使用することで、マウス等の実験動物の胚を、より均一な条件で培養し、形質の揃った胚の作成およびそれを用いたより均質な実験動物の作成も可能となる。
【００４１】
【発明の効果】
本発明の培養装置は、以上のように、培養容器内に設けられた、胚の一部を保持するための保持部と、培養容器内において、保持部上の胚に対し培養液を順次供給するように上記培養液を流すためのポンプ部と、培養容器内を流れる培養液流の方向を制御する制御部とを有している構成である。
【００４２】
それゆえ、上記構成は、上記制御部による培養液流の方向の制御によって、培養する胚における、左右の非対称性を制御できるから、実験動物の生育や、発生実験に好適に用いることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の培養装置を示し、（ａ）は構成図、（ｂ）は上記培養装置の培養容器の断面図である。
【図２】上記培養容器内の保持部を示す平面図である。
【図３】上記培養容器内の保持部を示す断面図である。
【図４】上記培養容器内の保持部内に導入される胚の向きを示し、（ａ）はノード流と培養液流の向きとを互いに合わせた場合、（ｂ）はノード流と培養液流の向きとを互いに逆にした場合を示す。
【図５】上記培養容器内の保持部内に導入される胚の向きと、培養容器内の培養液の流速とによって、胚の左右非対称性が変化する結果を示すグラフであって、（ａ）は培養液流の向きが左向きで、流速が速い場合、（ｂ）は培養液流の向きが左向きで、流速が遅い場合、（ｃ）培養液流の向きが右向きで、流速が遅い場合、（ｄ）培養液流の向きが右向きで、流速が速い場合を示す。
【符号の説明】
１　　培養容器
２　　ポンプ部
５　　制御部
６　　保持部
８　　培養液流

Claims (10)

1. 培養容器内に設けられた、胚の一部を保持するための保持部と、
   培養容器内において、保持部上の胚に対し培養液を順次供給するように上記培養液を流すためのポンプ部と、
   培養容器内を流れる培養液流の方向を制御する制御部とを有していることを特徴とする胚の培養装置。
2. 保持部は、胚の一部が嵌入する凹部を備えていることを特徴とする請求項１記載の胚の培養装置。
3. 保持部は、有底筒状に形成されていることを特徴とする請求項２記載の胚の培養装置。
4. 保持部は、凹部開口内周部に切り欠き部を備えていることを特徴とする請求項２または３記載の胚の培養装置。
5. 保持部における凹部内面には、胚における、胚体外円錐およびライヘルト膜の少なくとも一方と付着性を有する付着部材が形成されていることを特徴とする請求項２、３または４記載の胚の培養装置。
6. 付着部材は、アクリル系樹脂を含んでいることを特徴とする請求項５記載の胚の培養装置。
7. 培養容器内での培養液流に乱流が発生することを抑制するために、層状の流れを形成する多孔質部が、培養容器内における培養液の吐出部に設けられていることを特徴とする請求項１ないし６の何れか１項に記載の胚の培養装置。
8. 培養容器における保持部を備えた基体部が光透過性部材からなっていることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載の胚の培養装置。
9. 培養容器における、保持部と対面するフタ部が光透過性部材からなっていることを特徴とする請求項１ないし８の何れか１項に記載の胚の培養装置。
10. 制御部は、胚に形成されるノードの向きに応じて培養液流の方向を制御するようになっていることを特徴とする請求項１ないし９の何れか１項に記載の胚の培養装置。

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