JPWO2011013700A1 - キャリアペプチドフラグメント及びその利用 - Google Patents

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Abstract

本発明によって提供される外来物質導入方法は、アミノ酸配列：ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）若しくは該アミノ酸配列のうちの１個又は２個又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列の何れかから成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質と、を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、前記外来物質導入用構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と、前記外来物質導入用構築物が供給された前記試料をインキュベートして、前記試料中の真核細胞内に前記構築物を導入する工程とを包含する。

Description

本発明は、真核細胞の外部から該細胞の内部に外来物質を導入（移送）する方法と該方法に用いられるキャリアペプチドフラグメントに関する。
なお、本出願は２００９年７月２９日に出願された日本国特許出願２００９−１７７１０３号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
ヒトやそれ以外の哺乳動物等の細胞（真核細胞）内にポリペプチド等の外来物質、とりわけ生理活性物質を導入し、当該細胞（さらには該細胞から成る組織や器官）の形質を転換したり或いは当該細胞の機能を改善・向上させることが行われている。
例えば、特許文献１には、ポリペプチド、ＤＮＡ等の外来物質を細胞内に導入するための細胞透過性キャリアペプチドが記載されている。この特許文献には、細胞透過性キャリアペプチドと異種ポリペプチド、ＤＮＡ等を連結したキャリアペプチドコンジュゲートを用いることによって、ポリペプチド、ＤＮＡ等の生理活性物質を高効率に細胞内に導入することができると記載されている。
また、導入したい外来物質（生理活性物質）として比較的分子量の大きいポリペプチド全体を特別な装置を用いることなく目的の細胞内に容易に導入して当該細胞の形質を転換したり機能を改善（若しくは向上）させたりする手法が求められている。
或いはまた、ポリペプチドやタンパク質全体を導入することに代えて、当該ポリペプチドの有するある特定の機能に着目し、その機能を発現させ得る最小単位であるアミノ酸配列部分、即ちペプチドモチーフ（ペプチド断片）を構成するアミノ酸配列（外来物質）を細胞内に効率よく導入する方法も求められている。
日本国特許第３８５４９９５号公報 国際公開第２００７／０１０９８９号
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY)、２８１巻３５号、２００６年、ｐｐ．２５２２３−２５２３０ ＰＮＡＳ、９５巻、１９９８年、ｐｐ．１１４−１１９
ところで、上記の特許文献１にも記載されているように、従来の広く知られた細胞透過性キャリアペプチド（例えばＨＩＶやショウジョウバエ由来の細胞透過性キャリアペプチド）は、ポリペプチド（タンパク質）やＤＮＡ等の比較的分子量の大きい外来物質を細胞内に導入することに関して十分な性能とはいえず、より効率よく細胞膜を通過して細胞質内に外来物質を導入することのできる細胞透過性キャリアペプチドが求められている。例えば、上記特許文献１に記載の技術では、かかる要求に応えるべく、従来の細胞透過性キャリアペプチドのＣ末端に特定のアミノ酸配列を付加することにより細胞膜透過性能の若干の向上に成功しているが未だ十分ではない。
そこで本発明は、かかる要望に対応すべく創出された発明であり、従来知られている細胞透過性キャリアペプチドとは異なるアミノ酸配列のキャリアペプチド（フラグメント）であって、比較的分子量の大きい外来物質を効率よく細胞内に導入し得る比較的短い鎖長のキャリアペプチドフラグメントを提供することを目的とする。また、本発明は、かかるキャリアペプチドフラグメントを使用して、種々の外来物質を細胞外から細胞膜を通過させて目的の細胞内に導入する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ここで開示されるキャリアペプチドフラグメントと外来物質とを含むように作製された当該外来物質を導入するための構築物を提供する。また、本発明は、ここで開示されるキャリアペプチドフラグメントと外来物質とを有する構築物が細胞質内（核内であることを含む）に導入された細胞、器官その他の生体組織を提供する。
本発明者は、細胞内において何らかの機能を有するペプチドとしてアミノ酸配列が既に同定されているペプチド（若しくはペプチドの一部（即ち機能が特定されているモチーフ）を構成するアミノ酸配列）を種々検討し、比較的短い鎖長であるにもかかわらず、上記キャリアペプチド（フラグメント）として好ましく使用し得るアミノ酸配列を見出し、本発明を完成するに至った。
本発明によって提供される方法の一つは、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部（即ち細胞膜の外側）から該細胞の少なくとも細胞質内（好ましくはさらに核内）に目的とする外来物質を導入する（移送する）方法である。
即ち、ここで開示される外来物質導入方法は、ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）からなるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列のうちの１個又は２個又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列の何れかから成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質と、を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、
上記外来物質導入用構築物を、目的とする真核細胞を含む試料（典型的には該細胞を含む培養物）中に供給する工程と、
上記外来物質導入用構築物が供給された上記試料をインキュベートして（即ち対象の細胞が生存可能な条件下に試料を一定期間保持して）、上記試料中の真核細胞内に上記構築物を導入する工程と、を包含する。
ここで「外来物質」は、上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側又はＣ末端側に直接的又は適当なリンカーを介して間接的に結合可能な無機化合物及び有機化合物であって、真核細胞内に導入可能な分子サイズ及び化学的性質を有するものをいう。
本発明者は、上記非特許文献１に記載されているように核小体局在シグナル（Nucleolar localization signal：以下「ＮｏＬＳ」という。）として知られる上記配列番号１に示すアミノ酸配列と、目的とする外来物質とを含む構築物を作製し、培養中の真核細胞に供給したところ、当該構築物が高効率に標的とする真核細胞の細胞膜を通過し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、上記構成の本発明の外来物質導入方法によると、目的とする外来物質（典型的にはポリペプチド、核酸、色素、薬剤等の有機化合物）を上記キャリアペプチド（フラグメント）のＮ末端側及び／又はＣ末端側に直接的又は適当なリンカーを介して間接的に結合させて構築した外来物質導入用構築物を、対象とする真核細胞を含む試料（典型的には該細胞を含む培養物）中に供給する（即ち生存する真核細胞に添加する）ことによって、当該目的の外来物質を真核細胞の外部（細胞膜の外側）から細胞膜を通過させて細胞質内（好ましくはさらに核膜を通過させて核内）に高効率に導入することができる。
ここで開示される外来物質導入方法の好ましい一態様では、上記外来物質がポリペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物であることを特徴とする。この種の有機化合物を含むように作製された構築物は、効率よく目的の細胞内に導入することができる。
ここで「ポリペプチド」は、複数のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造を有するポリマーをいい、ペプチド結合の数（即ちアミノ酸残基数）によって限定されない用語である。即ち、ポリペプチドには、アミノ酸残基数が１０以上３００未満程度の一般にペプチドと呼ばれるものや一般にタンパク質（典型的には３００以上のアミノ酸残基から成る高分子化合物）と呼ばれるものを包含する用語である。実際に当該分野においてもポリペプチドとタンパク質とは厳密に区分されておらず、本明細書においても複数のアミノ酸残基から成るポリマー（オリゴマーを包含する。）をポリペプチドと総称する。
また、ここで「核酸」は、ヌクレオチドの重合体をいい、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。塩基数によって限定されない。
また、ここで開示される外来物質導入方法の好ましい他の一態様では、上記外来物質はポリペプチドであり、比較的分子量（アミノ酸残基数）の大きいポリペプチドであり得る。例えばアミノ酸残基数が、１００以上（例えば１００〜１０００程度、典型的には１００〜６００程度、例えば２００〜５００程度）であるポリペプチドを外来物質として採用することができる。
好ましくは、外来物質は何れかの生物種由来の成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチド（即ち、成熟型のポリペプチドに対するプレ型ポリペプチドやプレプロ型ポリペプチドを包含する。）であり、前記外来物質導入用構築物は、該外来物質としての成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドに対応するアミノ酸配列と前記キャリアペプチドフラグメントのアミノ酸配列とを有する合成ポリペプチドとして提供される。ここで合成ポリペプチドとは、いわゆる遺伝子工学的手法によって生合成されたポリペプチドと、化学的な合成（例えば市販のペプチド合成機の利用）によって得られたポリペプチドの両方を包含する用語である。
本態様の方法によると、上記合成ポリペプチドの状態で、目的のポリペプチド（即ち該ポリペプチドを構成するアミノ酸配列）を標的とする細胞内に導入することができる。例えば、１００以上１０００以下のアミノ酸残基により構成されている成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドを標的とする細胞内に導入することができる。
ここで開示される外来物質導入方法の好ましい他の一態様では、上記外来物質導入用構築物を導入する対象の真核細胞がヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の細胞（例えば、種々の形態の体細胞や生殖細胞の他、人工多能性幹細胞（いわゆるｉＰＳ細胞）やＥＳ細胞を包含する幹細胞）であることを特徴とする。
本発明によると、ヒトその他哺乳類の細胞（例えば皮膚細胞や神経細胞等の体細胞、体性幹細胞、人工多能性幹細胞、ＥＳ細胞）に所定の機能を有する目的の外来物質を導入することができる。例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の幹細胞をターゲットとすることにより、導入する外来物質（ポリペプチド等）に応じて当該幹細胞の形質転換、例えば特定の細胞（神経細胞、骨細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、等）への分化を実現することができる。
また、本発明は、上記目的を実現するべく、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部から少なくとも細胞質内（好ましくはさらに核内）に目的とする外来物質を導入するために人為的に作製された構築物を提供する。
即ち、ここで開示される外来物質導入用構築物は、ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）からなるアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列のうちの１個又は２個又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列の何れかから成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質とを有する。
かかる構築物を利用して上述した本発明の外来物質導入方法を実施することにより、目的の細胞に目的の外来物質を効果的に導入することができる。また、該外来物質が導入された細胞並びに該外来物質を含む細胞を含む器官その他の生体組織を得ることができる。
好ましくは、上述のとおり、上記外来物質は、ポリペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物である。
また、特に好ましくは上記外来物質はポリペプチドであり、例えばアミノ酸残基数が１００以上（例えば１００〜１０００程度、典型的には１００〜６００程度）であるポリペプチドを外来物質として採用することができる。
また、外来物質導入用構築物の好ましい一態様は、前記外来物質が何れかの生物種由来の成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドであり、該外来物質としての成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドに対応するアミノ酸配列（例えば１００以上１０００以下のアミノ酸残基により構成される。）と前記キャリアペプチドフラグメントのアミノ酸配列とを有する合成ポリペプチドとして作製される構築物である。
図１は、ヒト新生児線維芽細胞の培養液に一実施例（サンプル１）のポリペプチドを培養液中の濃度が１．５μｇ／ｍＬとなるように添加して２時間培養した後、抗原抗体反応を利用した蛍光抗体法により、細胞中のサンプル１のポリペプチドの存在の有無を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。図１の写真を上下に２等分して上側がサンプル１のポリペプチドを添加していない対照区であり、下側がサンプル１のポリペプチドを添加した実験区である。また、左右に３等分して左側のエリアはＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）による核染色で生じたプロットを示し、中央のエリアは蛍光色素標識抗体（二次抗体）の存在による蛍光発色状況を示し、右側のエリアはＤＡＰＩによる核染色で生じたプロットと蛍光色素標識抗体の存在による蛍光発色状況を重ねて（Mergeして) 示している。図中のスケールバーは５０μｍを示す。 図２は、ヒト新生児線維芽細胞の培養液に一実施例（サンプル２）のポリペプチドを培養液中の濃度が３．５μｇ／ｍＬとなるように添加して２時間培養した後、抗原抗体反応を利用した蛍光抗体法により、細胞中のサンプル２のポリペプチドの存在の有無を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。図２の写真を上下に２等分して上側がサンプル２のポリペプチドを添加していない対照区であり、下側がサンプル２のポリペプチドを添加した実験区である。また、左右に３等分して左側のエリアはＤＡＰＩによる核染色で生じたプロットを示し、中央のエリアは蛍光色素標識抗体（二次抗体）の存在による蛍光発色状況を示し、右側のエリアはＤＡＰＩによる核染色で生じたプロットと蛍光色素標識抗体の存在による蛍光発色状況を重ねて（Mergeして) 示している。図中のスケールバーは１００μｍを示す。
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチド合成や細胞培養に関するような一般的事項）は、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、衛生学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。
また、本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。なお、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
ここで開示される「キャリアペプチドフラグメント」は、上記配列番号１のアミノ酸配列により規定（把握）される配列であって、真核細胞の細胞膜透過性（さらに好ましくは核移行性（核膜透過性））を発揮させるアミノ酸配列である。
ここで配列番号１に記載される具体的なアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの１種であるヒト内皮細胞に存在するＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2：上記非特許文献１参照）の第４９１番目のアミノ酸残基から第５０３番目のアミノ酸残基までの合計１３アミノ酸残基から成る配列部分（即ちモチーフ）に相当するＮｏＬＳであることに加え、本発明者によって新たに優れた細胞膜透過性を示すことが見出された配列である。即ち１３アミノ酸残基という短い鎖長のペプチドフラグメントであるにもかかわらず比較的高分子量（例えば分子量が１００〜２０万程度、典型的には１０００〜１０万程度）の外来物質を細胞外から細胞質内に導入することができる。
従って、ここで開示される「キャリアペプチドフラグメント」は、典型的には配列番号１に記載のアミノ酸配列と同一の配列であるが、当該同一配列の他に、細胞膜透過性を損なうことなく１個または数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列を包含する。即ち、そのような軽微な改変配列は、ここで開示される情報に基づいて当業者にとって容易に利用されるものであり、ここで開示される技術的思想としての「キャリアペプチドフラグメント」に包含されるからである。典型例として、配列番号１のアミノ酸配列のうち１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列が挙げられる。
ここで開示される外来物質導入用構築物は、上述のキャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に、所望する外来物質を直接的又は適当なリンカーを介して間接的に結合（連結）することによって設計・構築され得る構築物である。例えば、外来物質がポリペプチドである場合には、該ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、キャリアペプチドフラグメントを構成するアミノ酸配列とを含むようにペプチド鎖を設計し、該ペプチド鎖を生合成或いは化学合成することによって、目的の外来物質導入用構築物を作製することができる。また、種々のＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸、あるいは色素（例えばＦＩＴＣ等の蛍光色素化合物）や薬剤（例えば５−フルオロウラシル（５ＦＵ）等の核酸系抗ガン剤やアジドチミジン（ＡＺＴ）等の抗ウイルス剤）として機能する有機化合物を従来公知の種々の化学的手法により、上述のキャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に直接的若しくは間接的に結合させて外来物質導入用構築物を構築することができる。
なお、外来物質がポリペプチドの場合、採用するポリペプチド（アミノ酸配列）としては特に限定されない。比較的アミノ酸残基数が多い、例えばアミノ酸残基数が１００〜１０００程度のポリペプチド若しくはタンパク質も外来物質として採用し得る。
典型的には、外来物質導入用構築物として作製する合成ポリペプチドを構成する総アミノ酸残基数が数個乃至数十個（例えば１０個）以上であって１０００以下が適当であり、好ましくは６００以下であり、さらに好ましくは５００以下であり、特に３００以下（例えば１０〜３００）が好適である。このような長さのポリペプチドは合成（生合成、化学合成）が容易であり、使用しやすい。
採用する外来物質としては、種々の細胞や組織（器官）の発生、分化、増殖、ガン化、ホメオスタシス（恒常性）、代謝の調節、等の機能にかかわるポリペプチドの成熟型或いは前駆体（プロ型、プレプロ型を包含する。）が好ましい。また、機能が従来知られていないポリペプチドを細胞内に導入して当該ポリペプチドの細胞内（生体組織内）における機能の解明に本発明を実施することもできる。
例えば、導入対象の真核細胞がヒトその他哺乳動物の幹細胞（体性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells：以下ｉＰＳ細胞という。）を包含する。）である場合、当該幹細胞の分化誘導に関与する種々の生理活性を有するポリペプチドの成熟型又はその前駆体の利用が好ましい。また、導入対象の真核細胞が癌細胞（腫瘍細胞）である場合、当該癌細胞（腫瘍細胞）のアポトーシス誘導に関与する種々のポリペプチドの利用が好ましい。
或いはまた、従来、所定の細胞（例えばヒト又は他の哺乳動物の皮膚細胞その他の体細胞）に複数の遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８）を導入してｉＰＳ細胞を作製しているが、該手法に代えて、これら遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子の産物（ポリペプチド）を本発明の導入方法により導入してもよい。これにより、上記遺伝子の直接的な導入に代えて当該遺伝子の産物（即ちポリペプチド）を細胞内（好ましくは核内）に導入することによってｉＰＳ細胞を作製することが可能となる。
従って、本発明の好適な一実施形態として、ｉＰＳ細胞の作製に関与する複数の遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子（例えばＳｏｘ２）がコードするポリペプチド（例えばＳＯＸ２タンパク質）を外来物質として本発明に係る外来物質導入用構築物を作製し、該構築物を所定の真核細胞（ヒト皮膚線維芽細胞等）に導入することを特徴とするｉＰＳ細胞作製方法が挙げられる。
或いはまた、例えば、特許文献２には、エロンジンＡ（ＥｌｏｎｇｉｎＡ）と複合体を形成して転写調節因子として働くことが知られているエロンジンＢＣ（ＥｌｏｎｇｉｎＢＣ）コンプレックス（具体的にはＥｌｏｎｇｉｎＣの一部）に結合し得る領域（アミノ酸配列）であるＳＯＣＳ−ボックスを有する種々のＳＯＣＳタンパク質（サイトカイン情報伝達のサプレッサー）及びそれらのファミリータンパク質（以下総称して「ＳＯＣＳ系タンパク質」という。）を構成するアミノ酸配列の一部であって、ＥｌｏｎｇｉｎＢＣコンプレックスに結合すると考えられている特定領域「ＢＣ−ボックス」に包含されるアミノ酸配列が、体性幹細胞に対して高い神経分化誘導活性を有することが記載されている。
従って、本発明の好適な一実施形態として、神経分化誘導に関連するポリペプチドとして上記ＳＯＣＳ系タンパク質（非特許文献２参照）のいずれかを使用し、標的とする真核細胞（例えばヒトや哺乳動物由来の幹細胞）に導入する合成ポリペプチドを構築することができる。従って、上記説明から明らかなように、本発明によって、少なくとも一種の真核細胞を神経細胞に分化誘導する方法が提供される。即ち、本方法は、本発明に係る上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側又はＣ末端側に、上記ＳＯＣＳ系タンパク質その他の何らかの神経分化誘導に関与するポリペプチドを構成するアミノ酸配列を備えるペプチド鎖を合成すること、および、該合成ポリペプチド（即ち外来物質導入用構築物である人工ポリペプチド）を対象である真核細胞又は該細胞を有する組織を含有する試料（典型的には該細胞を含む培養物）に供給すること、を包含する。典型的には、さらに該合成ポリペプチドが供給された試料をインキュベートすること、即ち対象の細胞が生存可能な条件下（換言すれば外来物質導入用構築物が細胞内に導入可能な条件下）に試料を一定期間保持しておくこと、を包含する。
なお、上述した本発明に係るキャリアペプチドフラグメントの場合と同様、神経分化誘導に関するポリペプチドとしての機能を保持する限りにおいて、１個または数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成される改変アミノ酸配列もまた神経分化誘導に関するポリペプチド（外来物質）として使用し得ることは勿論である。
上記のような構成の外来物質導入用構築物は、神経分化誘導ポリペプチドとして少なくとも一種の細胞（典型的には幹細胞）に対して高い神経分化誘導活性を有し得る。このため、神経分化誘導剤の有効成分として好適に使用し得る。なお、神経分化誘導剤に含有される神経分化誘導ポリペプチドは、神経分化誘導活性を損なわない限りにおいて、塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ポリペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、神経分化誘導活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。
神経分化誘導剤は、有効成分である上記構成の神経分化誘導ポリペプチドの他、使用形態に応じて医薬（薬学）上許容され得る種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。神経分化誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、神経分化誘導剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
神経分化誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、神経分化誘導ポリペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。
本発明によって提供される神経分化誘導剤は、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者(即ち生体)に所望する量だけ投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。これにより、生体内で、典型的には患部又はその周辺に存在する体性幹細胞から、神経細胞を発生(生産)させることができる。このため、神経再生が有力な治療法となる種々の神経疾患を効果的に治療することが可能となる。例えば、パーキンソン病、脳梗塞、アルツハイマー病、脊髄損傷による身体の麻痺、脳挫傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳腫瘍、網膜変性症等の神経疾患を再生医療的アプローチによって治療することが実現される。
或いはまた、生体から一時的に又は永久的に摘出した細胞材料、即ち生組織や細胞塊(例えば体性幹細胞の培養物)に、適当量の神経分化誘導剤（神経分化誘導ポリペプチド）を供給することによって、効率よく目的のポリペプチドを細胞外から細胞質内（さらに好ましくは核体）に導入することができ、神経細胞を効率よく発生させることができる。このことは当該細胞材料中に所望する神経細胞を大量に生産し得ることを意味する。而して、大量に生産された神経細胞、或いは該生産された神経細胞を含む細胞材料（生組織や細胞塊）を再び生体内(典型的には神経再生が要求されている患部）に戻すことによっても、生体に直接神経分化誘導剤（神経分化誘導ポリペプチド）を投与する場合と同様の治療効果が得られ得る。
以上の説明から明らかなように、本発明は別の側面として、神経分化誘導ポリペプチドを細胞内に導入することによって、神経疾患治療に有用な、神経細胞に分化誘導された細胞、細胞塊又は生組織を提供することができる。
また、本発明の神経分化誘導ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いわゆる遺伝子治療に使用する素材として用い得る。例えば、神経分化誘導ポリペプチドをコードする遺伝子（典型的にはＤＮＡセグメント、或いはＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、目的とする部位に導入することにより、常時、生体（細胞）内で本発明に係る神経分化誘導ポリペプチドを発現させることが可能である。従って、本発明の神経分化誘導ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメント、ＲＮＡセグメント等）は、上述した患者等に対し、神経疾患を治療し又は予防する薬剤として有用である。
典型例として説明した上記神経分化誘導ポリペプチドのような、本発明によって提供される外来物質がポリペプチドである外来物質導入用構築物（即ち、人工的に合成されたポリペプチド）は、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されていてもよい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、当該ポリペプチドの細胞質内及び核内における構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させ得る。
人工ポリペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が数個（例えば１０個）以上で１０００以下程度（好適には６００以下、特に好ましくは３００以下、例えば５０〜３００又は５０以下でもよい）であるものが望ましい。このような鎖長のポリペプチドは合成によって容易に構築することができるため、目的とする真核細胞を含む試料に供給し易い。
なお、ポリペプチドのコンホメーション（立体構造）については特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はへリックス状のものが好ましい。
なお、人工ポリペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、内在するキャリアペプチドフラグメントならびにペプチドモチーフの所望する機能を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
また、内在するキャリアペプチドフラグメントならびに外来物質であるポリペプチドの所望する機能を失わない限りにおいて、これら配列に含まれ得ない付加的な配列を部分的に含み得る。例えばリンカーとして機能する数個のアミノ酸残基（例えばグリシン残基）をキャリアペプチドフラグメントと外来ペプチドモチーフとの間に配置した構成のアミノ酸配列を構築してもよい。
使用する人工ポリペプチド（外来物質導入用構築物）のうちペプチド鎖の比較的短いものは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。即ち、市販のペプチド合成機（例えば、PerSeptive Biosystems社、Applied Biosystems社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
或いは、遺伝子工学的手法に基づいて人工ポリペプチド（外来物質導入用構築物）を生合成してもよい。このアプローチは、ペプチド鎖の比較的長いポリペプチドを製造する場合に好適である。すなわち、所望する人工ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のＤＮＡを合成する。そして、このＤＮＡと該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞、動物（哺乳類）細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的のアミノ酸配列から成るポリペプチドを得ることができる。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的のポリペプチド（即ち外来物質導入用構築物）を得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズおよびアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（即ち設計した人工ポリペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、目的の外来物質導入用構築物（人工ポリペプチド）を製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち目的とする人工ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ポリペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の東洋紡績（株）から入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
従って、細胞質内（好ましくは核内）への導入対象であるポリペプチドに対応するアミノ酸配列を決定し、上記配列番号１に示す細胞膜透過性のキャリアペプチドフラグメントと合わせてペプチド鎖を設計しさえすれば、そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパク質合成システムによって目的の人工ポリペプチドを容易に合成・生産することができる。例えば、日本の（株）ポストゲノム研究所のピュアシステム（登録商標）に基づいてポリペプチドを容易に生産することができる。
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
＜実施例１：外来物質導入用構築物の作製＞
アミノ酸残基数が１００以上である比較的大きい分子量のポリペプチドを外来物質として有する外来物質導入用構築物を遺伝子工学的手法により計２種類（サンプル１及びサンプル２）作製した。
即ち、サンプル１は、外来ポリペプチドとして上記ｉＰＳ細胞の作製に用いられる遺伝子の一つであるＳｏｘ２の産物であるＳＯＸ２タンパク質（即ちＤＮＡ結合能を有するＨＭＧドメインおよび転写活性化ドメインを備える転写因子、以下「ＳＯＸ２」という。）を採用した。
また、サンプル２は、外来ポリペプチドとして蛍光タンパク質であるＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）を採用した。
なお、ＳＯＸ２のアミノ酸配列（アミノ酸残基数：３１７）は配列番号２に示しており、ＧＦＰのアミノ酸配列（アミノ酸残基数：２３８）は、配列番号３に示している。
即ち、外来ポリペプチド（即ちＳＯＸ２又はＧＦＰ）のＮ末端にＮｏＬＳを融合したポリペプチドをコードするように融合遺伝子（人工合成ＤＮＡ）を作製した。なお、ＮｏＬＳのＮ末端側には開始コドンであるメチオニン残基を一つ付加した。また、外来ポリペプチドのＣ末端側には、後述するヒスチジントラップカラムによる精製に供するためにポリヒスチジン領域を形成した。
ここで設計、合成した融合遺伝子の詳細なヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列はサンプル１（ｎｏｌｓ−ｓｏｘ２）については配列番号４及び５に示しており、サンプル２（ｎｏｌｓ−ｇｆｐ）については配列番号６及び７に示している。
これら合成遺伝子を用いて一般的な昆虫細胞を用いたバキュロウイルス発現システムによって、目的の融合ポリペプチド（サンプル１及びサンプル２）を生合成した。
制限酵素であるＢｇｌ−IIとＸｂａ−Ｉ（共にＴＡＫＡＲＡ社製品）により上記合成ＤＮＡ（遺伝子）の両端を切断し、同じ制限酵素で切断したｐＭ１５ベクター（片倉工業社製品）に組み込んでトランスファーベクターを作製した。
次いで、上記作製したトランスファーベクターを、バキュロウイルスＣＰｄ株のゲノムＤＮＡ（片倉工業社製品）とＢｍＮ細胞（片倉工業社製品）へ共感染させ、組換えウイルスを作製した。
得られた組換えウイルスを、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、片倉工業社製品）５頭に感染させた。そして感染したカイコを蛹になるまで飼育した後、蛹を磨砕用のバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０%のＧｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭのＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、１ｍＭのＰＭＳＦ、ならびに１ｍＭのＤＴＴを含む。）中で先端部がテフロン（登録商標）製のホモジナイザーを用いて破砕した。得られたカイコ磨砕液に界面活性剤（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０）を濃度１％となる様に添加し、４℃で１時間攪拌して可溶化を実施し、超遠心（１０００００ｇ×１時間）にて上清部（可溶性画分）と沈澱部（不溶性画分）とに分離した。
サンプル１の製造区については、次に、抗ＳＯＸ２抗体（マウスモノクローナル抗体、ＡＢＧＥＮＴ社製品）を用いたウェスタンブロット解析を行った。その結果、ＮｏＬＳ−ＳＯＸ２融合タンパク質（以下、サンプル１ポリペプチドという。）は不溶性画分に存在することが確認された。
而して、この不溶性画分は可溶化バッファーであるリン酸緩衝液（ｐＨ ７．５、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのイミダゾール、８Ｍのウレアを含む。）に懸濁し、その後、室温で１時間攪拌して可溶化した。
上記のとおり、得られた融合ポリペプチドのＣ末端部分にはポリヒスチジン配列部分（Ｈｉｓタグ）が付加されており、この配列部分を利用して融合ポリペプチドの精製（濃縮）を行った。具体的には、上記可溶化したポリペプチド溶液を市販のヒスチジントラップ（ＨｉｓＴｒａｐ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に添加することにより、サンプル１ポリペプチドを当該カラムに結合させた。次いで、可溶化バッファーでカラムをよく洗浄した後、リフォールディングバッファー（リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのイミダゾールを含む。）へとバッファー置換を行い、カラム内にてポリペプチドの巻き戻しを行った。
そして同バッファーにてカラムをよく洗浄した後、溶出バッファー（リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、０．５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのイミダゾールを含む。）によってタンパク質を溶出させた。こうして精製されたサンプル１ポリペプチドの溶液を得た。
一方、サンプル２の製造区においては、抗ＧＦＰ抗体（ウサギポリクローナル抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）を用いたウェスタンブロット解析を行った。その結果、ＮｏＬＳ−ＧＦＰ融合タンパク質（以下、サンプル２ポリペプチドという。）は可溶性画分に存在することがわかった。この可溶性画分をＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製品）を用いて、リフォールディングバッファーへとバッファー置換を行い、上記ＨｉｓＴｒａｐカラムに添加してサンプル２ポリペプチドを当該カラムに結合させた。次いで、同バッファーでカラムをよく洗浄した後、溶出バッファーによって結合したタンパク質を溶出させた。こうして精製されたサンプル２ポリペプチドの溶液を得た。
なお、得られた２種類の精製ポリペプチドをＰＤ−１０脱塩カラムを用いて、ダルベッコ−リン酸緩衝液（和光純薬社製品、以下「Ｄ−ＰＢＳ」と略称する。）へとバッファー置換をした後、０．４５μｍフィルターによって滅菌ろ過し、以下の試験に用いた。
＜実施例２：サンプル１およびサンプル２の細胞膜透過機能評価＞
真核細胞としてヒト新生児線維芽細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＤ−１０７９ｓｋ株）を使用し、上記実施例１で得られた２種のサンプル（外来物質導入用構築物）の細胞膜透過機能を調べた。
即ち、凡そ２×１０４個の上記細胞を１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製品）含有培養液（Ｅａｇｌｅ‘ｓＭＥＭ培地：０．１ｍＭのＮＥＡＡ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、Ｅａｒｌｅ’ｓＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ社製品）を含む。）を用いて、コラーゲンコートした８ウェルスライド中で３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩培養した。
この細胞培養液に、上記得られた精製ポリペプチドをサンプル１ポリペプチドについては１．５μｇ／ｍＬ、サンプル２ポリペプチドについては３．５μｇ／ｍＬとなるように添加し、更に２時間培養した。
その後、上清を除き、上記Ｄ−ＰＢＳを加えて氷上で３回洗浄した。次いで、氷冷したメタノールを添加して−２０℃で１０分間静置して細胞を固定した。その後、メタノールを除去し、５％のＮｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ（ＭＢＬ社製品）含有ＰＢＳ液を添加して室温で１時間のブロッキングを行った。そして、溶液を除去し、ＰＢＳにて１回洗浄した後、サンプル１ポリペプチド添加ウェルとコントロール（ＰＢＳのみ添加）ウェルについては、ＰＢＳにて２００倍希釈した抗ＳＯＸ２抗体を添加し、室温にて１時間静置した。一方、サンプル２ポリペプチド添加ウェルとコントロールウェルについては、ＰＢＳにて５００倍希釈した抗ＧＦＰ抗体を添加し、室温にて1時間静置した。
かかる抗原抗体反応時間の経過後、各ウェルから溶液を除去し、ＰＢＳにて３回洗浄した後、抗ＳＯＸ２抗体添加ウェルにはＰＢＳにて８００倍希釈した抗マウスＩｇＧ抗体−蛍光色素（Ａｌｅｘａ５５５）標識物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）を添加し室温にて１時間静置した。一方、抗ＧＦＰ抗体添加ウェルにはＰＢＳにて８００倍希釈した抗ウサギＩｇＧ抗体−蛍光色素（Ａｌｅｘａ５５５）標識物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）を添加し室温にて１時間静置した。
その後、溶液を除去し、ＰＢＳにて３回洗浄した後、ＤＡＰＩ含有封入液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）とカバーガラスを用いて封入を行い、共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った。
図１にサンプル１（ＮｏＬＳ−ＳＯＸ２）のポリペプチドを添加した実験区の結果を、図２にサンプル２（ＮｏＬＳ−ＧＦＰ）のポリペプチドを添加した実験区の結果をそれぞれ示す。
図１（顕微鏡写真）から明らかなように、ポリペプチド無添加の細胞では、ＤＡＰＩによる核染色のみ認められ、抗ＳＯＸ２抗体による染色は全く見られない一方、サンプル１ポリペプチドを添加した培養液からの細胞については、細胞内へのポリペプチド導入が認められた。さらに染色の位置から細胞質内に導入されたポリペプチドは核内に導入（移行）され局在していることが確認された。このことは、サンプル１ポリペプチドに含まれる本発明に係るキャリアペプチドフラグメントが、アミノ酸残基数３００以上のＳＯＸ２ポリペプチドを細胞の外部から細胞質内、さらに核内に導入することができることを示している。
同様に、図２（顕微鏡写真）から明らかなように、ポリペプチド無添加の細胞では、ＤＡＰＩによる核染色のみ認められ、抗ＧＦＰ抗体による染色は全く見られない一方、サンプル２ポリペプチドを添加した培養液からの細胞については、細胞内へのポリペプチド導入が認められた。さらに染色の位置から細胞質内に導入されたポリペプチドは核内に導入（移行）され局在していることが確認された。このことは、サンプル２ポリペプチドに含まれる本発明に係るキャリアペプチドフラグメントが、アミノ酸残基数２００以上であるＧＦＰポリペプチドを細胞の外部から細胞質内、さらに核内に導入することができることを示している。
上記実施例から明らかなように、本発明は、ここで開示される外来物質導入方法の特に好適な一態様として、ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の細胞の外部から該細胞の細胞質内（より好ましくは更に核内）に目的とする外来物質を導入する方法であって、上記キャリアペプチドフラグメントとして配列番号１のアミノ酸配列、若しくは該アミノ酸配列のうちの１個又は２個又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成された改変アミノ酸配列から成るキャリアペプチドフラグメントを使用することを特徴とする方法を提供する。配列番号１のアミノ酸配列から成るキャリアペプチドフラグメントは、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の幹細胞、或いは他の体細胞に比較的分子量の大きいポリペプチド（典型的にはアミノ酸残基数：１００〜１０００程度（例えば２００〜６００程度））を導入する目的に好適に使用することができる。
以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
本発明によると、ヒトその他哺乳類の細胞（例えば皮膚細胞や神経細胞等の体細胞、体性幹細胞、人工多能性幹細胞、ＥＳ細胞）に所定の機能を有する目的の外来物質を導入することができる。このことにより、導入する外来物質（ポリペプチド等）に応じて当該目的の細胞の形質転換、例えば特定の細胞（神経細胞、骨細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、等）への分化を実現することができる。
また、本発明によって、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部から少なくとも細胞質内（好ましくはさらに核内）に目的とする外来物質を導入するために人為的に作製された構築物が提供される。かかる構築物を利用することにより、目的の細胞に目的の外来物質を効果的に導入することができ、該外来物質が導入された細胞並びに該外来物質を含む細胞を含む器官その他の生体組織を得ることができる。
配列番号１ 合成ペプチド
配列番号４ 合成物
配列番号５ 合成物
配列番号６ 合成物
配列番号７ 合成物

Claims (9)

  1. 真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入する方法であって、
    以下のアミノ酸配列：
    ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
    若しくは該アミノ酸配列のうちの１個又は２個又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成された改変アミノ酸配列から成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質と、を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、
    前記外来物質導入用構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と、
    前記外来物質導入用構築物が供給された前記試料をインキュベートして、前記試料中の真核細胞内に前記構築物を導入する工程と、
    を包含する方法。
  2. 前記外来物質がポリペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記外来物質は何れかの生物種由来の成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドであり、前記外来物質導入用構築物は、該外来物質としての成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドに対応するアミノ酸配列と前記キャリアペプチドフラグメントのアミノ酸配列とを有する合成ポリペプチドである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記外来物質としての成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドは、１００以上１０００以下のアミノ酸残基により構成されている、請求項３に記載の方法。
  5. 前記外来物質導入用構築物を導入する対象の真核細胞がヒト又はヒト以外の哺乳動物の細胞である、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
  6. 真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入するために作製された外来物質導入用構築物であって、
    以下のアミノ酸配列：
    ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
    若しくは該アミノ酸配列のうちの１個又は２個又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成された改変アミノ酸配列から成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した目的の外来物質と、を有する外来物質導入用構築物。
  7. 前記外来物質は、ポリペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物である、請求項６に記載の構築物。
  8. 前記外来物質は何れかの生物種由来の成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドであり、該外来物質としての成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドに対応するアミノ酸配列と前記キャリアペプチドフラグメントのアミノ酸配列とを有する合成ポリペプチドである、請求項７に記載の構築物。
  9. 前記外来物質としての成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドは、１００以上１０００以下のアミノ酸残基により構成されている、請求項８に記載の構築物。
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