JPWO2008072365A1 - 蛍光検出装置及び蛍光観察システム - Google Patents

Abstract

蛍光検出装置は、被観察物上の照明領域で生じた蛍光の光路に配置される光検出素子と、前記光検出素子へ向かう光路に配置され、波長帯域の離れた複数の蛍光の各々に透過性を示すバリアフィルタとを備えたことを特徴とする。

Description

本発明は、共焦点レーザ蛍光顕微鏡システムなどの蛍光観察システムに適用される蛍光検出装置、及びその蛍光検出システムに関する。

一般に、共焦点レーザ蛍光顕微鏡の蛍光検出ユニットには光電子倍増管（フォトマルチプライヤ、以下「ＰＭＴ」と称す。）が用いられる。ＰＭＴの入射側には、特定の波長帯域の蛍光のみを透過するバリアフィルタが配置される。多くの蛍光検出ユニットには、検出対象となる波長帯域（検出チャンネル）を複数化するために、ＰＭＴ及びバリアフィルタが複数セット搭載される（特許文献１などを参照）。検出チャンネルを増設する場合は、ＰＭＴ及びバリアフィルタのセット数を増やせばよい。

但し、ＰＭＴの個数が増えると、蛍光検出ユニットのコストが大幅に増大する。そこで、複数のバリアフィルタを装着したターレットを使用し、１つのＰＭＴへ入射可能な蛍光の波長帯域を切り替える方法が考えられる（特許文献２などを参照）。このようにしてＰＭＴの検出チャンネルを切り替え可能にすれば、ＰＭＴの個数を抑えつつ検出チャンネルの数を増やすことができる。
特開２００６−２２０９５４号公報 特開２００３−２９５０６４号公報

しかしながらＰＭＴの検出チャンネルを切り替えながら複数の蛍光画像を取得すると、個々の蛍光画像の取得タイミングにタイムラグが生じる。

そこで本発明は、検出チャンネルの切り替えを高速化することが容易な蛍光検出装置を提供することを目的とする。また、本発明は、波長帯域の異なる複数の蛍光画像を低コストでなるべく高速に取得することのできる蛍光観察システムを提供することを目的とする。

本発明の蛍光検出装置は、被観察物上の照明領域で生じた蛍光の光路に配置される光検出素子と、前記光路に配置され、波長帯域の異なる複数の蛍光のうち、少なくとも２つの蛍光に対して透過性を示すバリアフィルタとを備えたことを特徴とする。

共焦点レーザ蛍光顕微鏡システムの構成図である。 （Ａ）は各レーザ光源の発光波長特性、（Ｂ）は各蛍光物質の蛍光波長特性、（Ｃ）は第１ダイクロイックミラーの反射波長特性、（Ｄ）は第１バリアフィルタ２１１の反射波長特性である。 （Ａ）は第２ダイクロイックミラー２２に到達しうる蛍光（第２蛍光と第３蛍光）の蛍光波長特性、（Ｂ）は第２ダイクロイックミラー２２の反射波長特性、（Ｃ）は第２バリアフィルタ２１２の透過波長特性、（Ｄ）は第３バリアフィルタ２１３の透過波長特性である。 コンピュータの構成図である。 コンピュータ４のＣＰＵ４３の動作フローチャートである。 第１画像取得シーケンスに関するパスの入力画面である。 パスが指定されたときの入力画面である。 第２画像取得シーケンスに関するパスの入力画面である。 コントロールユニット３のＣＰＵ３７の動作フローチャートである。 本システムの変形例の構成図である。

以下、本発明を適用した共焦点レーザ蛍光顕微鏡システムについて説明する。

先ず、本システムの構成を説明する。

図１は、共焦点レーザ蛍光顕微鏡システムの構成図である。図１に示すとおり、本システムには、顕微鏡本体１と、顕微鏡本体１に光ファイバ１３で接続されたレーザユニット１２と、顕微鏡本体１に光ファイバ２０で接続された蛍光検出ユニット２とが備えられる。また、本システムには、顕微鏡本体１とレーザユニット１２と蛍光検出ユニット２との各々に電気的に接続されたコントロールユニット３と、コントロールユニット３に通信ケーブルで接続された不図示のコンピュータとが備えられる。

レーザユニット１２には、互いに異なる波長のレーザ光を発光する第１レーザ光源１２１、第２レーザ光源１２２、第３レーザ光源１２３、第４レーザ光源１２４が備えられる。このレーザユニット１２には、ＡＯＴＦ等の波長可変フィルタ１２Ａとシャッタ１００とが備えられる。レーザユニット１２は、これら波長可変フィルタ１２Ａ及びシャッタ１００の動作を組み合わせることにより、使用レーザ光源を変更したり、レーザユニット１２から射出するレーザ光のオン／オフ制御を行ったりすることができる。

顕微鏡本体１には、コリメートレンズ１４と、ダイクロイックミラー１５と、スキャナ１６と、対物レンズ１７と、結像レンズ１８と、共焦点絞り１９と、ステージ１１とが備えられる。ステージ１１には、標本１０Ａが支持される。標本１０Ａは、多重染色された標本であり、その中には励起波長の異なる複数種類の蛍光物質が混在している。ここでは、複数種類の蛍光物質を第１蛍光物質、第２蛍光物質、第３蛍光物質、第４蛍光物質の４種類とする。前述した第１レーザ光源１２１の発光波長は、第１蛍光物質の励起波長と同じであり、第２レーザ光源１２２の発光波長は、第２蛍光物質の励起波長と同じであり、第３レーザ光源１２３の発光波長は、第３蛍光物質の励起波長と同じであり、第４レーザ光源１２４の発光波長は、第４蛍光物質の励起波長と同じである。これら発光波長の具体例は後述する。

蛍光検出ユニット２には、第１ダイクロイックミラー２１と、第２ダイクロイックミラー２２と、第１バリアフィルタ２１１と、第２バリアフィルタ２１２と、第３バリアフィルタ２１３と、第１ＰＭＴ２０１と、第２ＰＭＴ２０２と、第３ＰＭＴ２０３とが備えられる。第１ＰＭＴ２０１，第２ＰＭＴ２０２，第３ＰＭＴ２０３は、何れも同じ特性のＰＭＴであり、検出波長帯域は可視光帯域（例えば、４００ｎｍ〜７５０ｎｍ）である。因みに、蛍光検出ユニット２に備えられるＰＭＴの個数（ここでは３）は、レーザユニット１２に備えられるレーザ光源の個数（ここでは４）よりも少ない。

コントロールユニット３には、ＣＰＵ３７と、制御回路３８と、第１Ａ／Ｄ変換器３０１と、第２Ａ／Ｄ変換器３０２と、第３Ａ／Ｄ変換器３０３と、第１フレームメモリ３１１と、第２フレームメモリ３１２と、第３フレームメモリ３１３と、インタフェース回路３９とが備えられる。

レーザユニット１２から射出したレーザ光は、光ファイバ１３を介して顕微鏡本体１へ導光される。そのレーザ光はコリメートレンズ１４、ダイクロイックミラー１５、スキャナ１６、対物レンズ１７を順に介して標本１０Ａ上の１点へ集光し、その集光点に存在する蛍光物質を励起する。例えば、レーザユニット１２の使用レーザ光源が第１レーザ光源１２１のみであった場合は第１蛍光物質のみが励起され、第１蛍光物質のみが蛍光を発する。また、レーザユニット１２の使用レーザ光源が第２レーザ光源１２２のみであった場合、第２蛍光物質のみが励起され、第２蛍光物質のみが蛍光を発する。また、レーザユニット１２の使用レーザ光源が第３レーザ光源１２３のみであった場合、第３蛍光物質のみが励起され、第３蛍光物質のみが蛍光を発する。また、使用レーザ光源が第４レーザ光源１２４のみであった場合、第４蛍光物質のみが励起され、第４蛍光物質のみが蛍光を発する。以下、第１蛍光物質が発する蛍光、第２蛍光物質が発する蛍光、第３蛍光物質が発する蛍光、第４蛍光物質が発する蛍光を、それぞれ「第１蛍光」、「第２蛍光」、「第３蛍光」、「第４蛍光」と称す。

集光点で発生した蛍光（第１蛍光〜第４蛍光の少なくとも１つ）は、対物レンズ１７、スキャナ１６、ダイクロイックミラー１５、結像レンズ１８を順に介して共焦点絞り１９の開口近傍へ集光する。このうち、共焦点絞り１９の開口を通過した蛍光は、光ファイバ２０を介して蛍光検出ユニット２へ導かれる。なお、スキャナ１６が駆動されると、レーザ光の集光点が標本１０Ａ上を移動する。また、集光点で発生した第１蛍光〜第４蛍光の顕微鏡本体における振る舞いは、互いに同じである。但し、第１蛍光〜第４蛍光は、蛍光検出ユニット２において互いに異なる振る舞いをする。

蛍光検出ユニット２へ入射した第１蛍光は、第１ダイクロイックミラー２１にて反射し、第１バリアフィルタ２１１を透過し、第１ＰＭＴ２０１へ向かう。蛍光検出ユニット２へ入射した第２蛍光は、第１ダイクロイックミラー２１を透過し、第２ダイクロイックミラー２２を反射し、第２バリアフィルタ２１２を透過し、第２ＰＭＴ２０２へ向かう。蛍光検出ユニット２へ入射した第３蛍光は、第１ダイクロイックミラー２１、第２ダイクロイックミラー２２を順に透過し、第３バリアフィルタ２１３を透過して第３ＰＭＴ２０３へ向かう。蛍光検出ユニット２へ入射した第４蛍光は、第１ダイクロイックミラー２１を反射し、第１バリアフィルタ２１１を透過し、第１ＰＭＴ２０１へ向かう。

すなわち、第１ダイクロイックミラー２１は、第１蛍光及び第４蛍光の波長帯域の光に反射性を示し、第２蛍光及び第３蛍光の波長帯域の光に透過性を示す。また、第１バリアフィルタ２１１は、第１蛍光及び第４蛍光の波長帯域の光に透過性を示し、それ以外の波長帯域の光に吸収性を示す。詳細は後述するが、第１蛍光の波長帯域と第４蛍光の波長帯域とは互いに離散しているので、第１バリアフィルタ２１１には、互いに離れた複数の波長帯域の光を透過するデュアルパスバリアフィルタが使用される。

第１ＰＭＴ２０１、第２ＰＭＴ２０２、第３ＰＭＴ２０３の各々は、入射光の強度を示す信号を生成する。第１ＰＭＴ２０１が生成する信号と、第２ＰＭＴ２０２が生成する信号と、第３ＰＭＴ２０３が生成する信号とは、コントロールユニット３へ入力される。

このうち第１ＰＭＴ２０１が生成する信号は、第１Ａ／Ｄ変換器３０１を介して第１フレームメモリ３１１へ蓄積され、第２ＰＭＴ２０２が生成する信号は、第２Ａ／Ｄ変換器３０２を介して第２フレームメモリ３１２へ蓄積され、第３ＰＭＴ２０３が生成する信号は、第３Ａ／Ｄ変換器３０３を介して第３フレームメモリ３１３へ蓄積される。

つまり、「第１ＰＭＴ２０１→第１Ａ／Ｄ変換器３０１→第１フレームメモリ３１１」という信号路は、第１蛍光の信号と第４蛍光の信号とに兼用される。また、「第２ＰＭＴ２０２→第２Ａ／Ｄ変換器３０２→第２フレームメモリ３１２」という信号路は、第２蛍光の信号に専用の信号路であり、「第３ＰＭＴ２０３→第３Ａ／Ｄ変換器３０３→第３フレームメモリ３１３」という信号路は、第３蛍光の信号に専用の信号路である。

コントロールユニット３の制御回路３８は、スキャナ１６及びレーザユニット１２を同期制御し、レーザ光の集光点で標本１０Ａ上の観察領域を走査する。１フレーム分の走査期間に、第１フレームメモリ３１１，第２フレームメモリ３１２，第３フレームメモリ３１３の少なくとも１つには、１フレーム分の信号（蛍光画像信号）が蓄積される。ＣＰＵ３７はこの蛍光画像信号を読み出し、それをインタフェース回路３９を介してコンピュータへ送信する。以上のコントロールユニット３の動作手順を、以下では「画像取得シーケンス」と称す。

この画像取得シーケンスの実行に当たり、制御回路３８がレーザユニット１２の使用レーザ光源を、第１レーザ光源１２１と第４レーザ光源１２４とのうち前者のみに設定すると、集光点では第４蛍光は発生せずに第１蛍光が発生する。このときには、第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルが第１蛍光の波長帯域に設定されたことになり、第１フレームメモリ３１１に第１蛍光の蛍光画像信号が蓄積される。

一方、制御回路３８がレーザユニット１２の使用レーザ光源を、第１レーザ光源１２１と第４レーザ光源１２４とのうち後者のみに設定すると、集光点では第１蛍光は発生せずに第４蛍光が発生する。このときには、第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルが第４蛍光の波長帯域に設定されたことになり、第１フレームメモリ３１１に第４蛍光の蛍光画像信号が蓄積される。

したがって、本システムでは、制御回路３８がレーザユニット１２の使用レーザ光源を第１レーザ光源１２１と第４レーザ光源１２４との間で切り替えるだけで、第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルが第１蛍光の波長帯域と第４蛍光の波長帯域との間で切り替わる。前述したとおりレーザユニット１２には波長可変フィルタ１２Ａが使用されているので、この切り替えは極めて高速に行われる。

次に、本システムの各部の特性の具体例を示す。

・第１レーザ光源１２１の発光波長（＝第１蛍光物質の励起波長）：４０８ｎｍ，
・第２レーザ光源１２２の発光波長（＝第２蛍光物質の励起波長）：４８８ｎｍ，
・第３レーザ光源１２３の発光波長（＝第３蛍光物質の励起波長）：５４３ｎｍ，
・第４レーザ光源１２４の発光波長（＝第４蛍光物質の励起波長）：６３３ｎｍ，
・第１蛍光物質のストークシフト：２５ｎｍ，
・第２蛍光物質のストークシフト：２５ｎｍ，
・第３蛍光物質のストークシフト：２５ｎｍ，
・第４蛍光物質のストークシフト：２５ｎｍ，
・第１蛍光物質の蛍光（第１蛍光）の波長幅：３０ｎｍ（±１５ｎｍ）
・第２蛍光物質の蛍光（第２蛍光）の波長幅：３０ｎｍ（±１５ｎｍ）
・第３蛍光物質の蛍光（第３蛍光）の波長幅：３０ｎｍ（±１５ｎｍ）
・第４蛍光物質の蛍光（第４蛍光）の波長幅：３０ｎｍ（±１５ｎｍ）
・第１ダイクロイックミラー２１の反射波長帯域：〜４４９ｎｍ，６４３ｎｍ〜（４４９ｎｍ〜６４３ｎｍは透過波長帯域）
・第１バリアフィルタ２１１の透過波長帯域：４１８ｎｍ〜４４８ｎｍ，６４３ｎｍ〜６７３ｎｍ（〜４１８ｎｍ，４４８ｎｍ〜６４３ｎｍ，６７３ｎｍ〜は吸収波長帯域）
・第２ダイクロイックミラー２２の反射波長帯域：〜５２９ｎｍ（５２９ｎｍ〜は透過波長帯域）
・第２バリアフィルタ２１２の透過波長帯域：４９８ｎｍ〜５２８ｎｍ（〜４９８ｎｍ，５２８ｎｍ〜は吸収波長帯域）
・第３バリアフィルタ２１３の透過波長帯域：５５３ｎｍ〜（〜５５３ｎｍは吸収波長帯域）
以上の具体例における各レーザ光源の発光波長特性を同一グラフ上に描くと、図２（Ａ）に示すとおりになる。

また、各蛍光物質の蛍光波長特性を同一グラフ上に描くと、図２（Ｂ）に示すとおりになる。

また、第１ダイクロイックミラー２１の反射波長特性をグラフ上に描くと、図２（Ｃ）に示すとおりとなり、第１バリアフィルタ２１１の透過波長特性をグラフ上に描くと、図２（Ｄ）に示すとおりとなる。

したがって、使用レーザ光源が第１レーザ光源１２１と第４レーザ光源１２４との間で切り替わると、第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルが第１蛍光の波長帯域と第４蛍光の波長帯域との間で切り替わることは明らかである。

因みに、この具体例では、切り替え前後の検出チャンネル同士が十分に離れているので、切り替え直前に発生していた蛍光が、切り替えの直後の蛍光画像信号へノイズを与える現象（クロストーク）は発生しにくい。

また、以上の具体例における第２ダイクロイックミラー２２の反射波長特性をグラフ上に描くと、図３（Ｂ）に示すとおりとなり、第２バリアフィルタ２１２の透過波長特性をグラフ上に描くと、図３（Ｃ）に示すとおりとなる。なお、図３（Ａ）には、第２ダイクロイックミラー２２に到達しうる蛍光（第２蛍光と第３蛍光）を示した。したがって、第２ＰＭＴ２０２の検出チャンネルが第２蛍光の波長帯域に略一致していることは明らかである。

また、以上の具体例における第３バリアフィルタ２１３の透過波長特性をグラフ上に描くと、図３（Ｄ）に示すとおりである。したがって、第３ＰＭＴ２０３の検出チャンネルが第３蛍光の波長帯域に略一致していることは明らかである。

次に、本システムのコンピュータを簡単に説明する。

図４は、コンピュータの構成図である。コンピュータ４には、ＲＡＭ４０、インタフェース回路４１、ＲＯＭ４２、ＣＰＵ４３、ハードディスクドライブ４４、インタフェース回路４５、インタフェース回路４６が備えられる。コンピュータ４は、インタフェース回路４１を介してコントロールユニット３へ接続され、インタフェース回路４５及びインタフェース回路４６を介してモニタ５及び入力器６へ接続される。

ハードディスクドライブ４４には、コンピュータ４を本システムの情報処理装置として機能させるためのアプリケーションソフトウエアのプログラムが格納される。このプログラムは、必要に応じてＲＡＭ４０上に読み出され、ＣＰＵ４３によって実行される。以下に説明するＣＰＵ４３の動作は、このプログラムに従うものとする。

ＣＰＵ４３は、インタフェース回路４５を介してモニタ５へＧＵＩ画面を表示すると共に、インタフェース回路４６を介して入力器６の操作内容を認識する。また、ＣＰＵ４３は、インタフェース回路４１を介してコントロールユニット３のＣＰＵ３７と通信を行い、各種の情報を送受信する。

また、ＣＰＵ４３は、コントロールユニット３から受信した蛍光画像信号を格納する記憶エリアとして、ＲＡＭ４０上に４つの記憶エリア、すなわち第１記憶エリア４０１、第２記憶エリア４０２、第３記憶エリア４０３、第４記憶エリア４０４を割り当てている。個々の記憶エリアは、１フレーム分の蛍光画像信号を格納することができる。

次に、本システム全体の動作の流れを説明する。ここでは、第１蛍光試薬及び第３蛍光試薬による「２励起−２蛍光の画像取得」と、第２蛍光試薬及び第４蛍光試薬による「２励起−２蛍光の画像取得」とを連続して行うことを想定する。

図５は、コンピュータ４のＣＰＵ４３の動作フローチャートである。

先ず、ＣＰＵ４３は、画像取得シーケンスの回数ｍをユーザに指定させる（ステップＳ１１）。ここでは回数ｍとして「２」が指定される。以下、この回数を「指定回数」と称す。

続いて、ＣＰＵ４３は、第１画像取得シーケンスに関するパスの入力画面５１（図６）をモニタ５へ表示する（ステップＳ１３）。

図６に示すとおり、入力画面５１には本システムの各要素、すなわち第１レーザ光源〜第４レーザ光源、第１ＰＭＴ〜第３ＰＭＴ、第１フレームメモリ〜第３フレームメモリ、第１記憶エリア〜第４記憶エリアの各々のマークが配置される。また、入力画面５１には、入力済みの情報を示す設定リスト５１Ｂと、切り替えボタン５１Ａと、開始ボタン５１Ｃとが配置される。

ユーザはこの入力画面５１上で、第１画像取得シーケンスの実行時に本システムに設定すべきパスを、最大３系統まで指定することができる。

ユーザは、図７に示すとおり、第１レーザ光源のマーク５１ａと、第１ＰＭＴ又は第１フレームメモリのマーク５１ｂと、第１記憶エリアのマーク５１ｃとを連続して選択する。このとき、入力画面５１上には、「第１レーザ光源→第１ＰＭＴ→第１フレームメモリ→第１記憶エリア」というパスが矢印線等で描かれる。このパスの情報は、設定リスト５１Ｂにも反映される。

また、ユーザは、同じ入力画面５１上で、第３レーザ光源のマーク５１ｄと、第３ＰＭＴ又は第３フレームメモリのマーク５１ｅと、第３記憶エリアのマーク５１ｆとを連続して選択する。このとき、入力画面５１上には、「第３レーザ光源→第３ＰＭＴ→第３フレームメモリ→第３記憶エリア」というパスが矢印線等で描かれる。このパスの情報は、設定リスト５１Ｂにも反映される。

なお、第１ＰＭＴと第１フレームメモリとは共通のパスに配置される要素なので、入力画面５１上で第１ＰＭＴのマークと第１フレームメモリのマークとのうち一方が選択されると、他方も自動的に選択されるものとする。

また、第２ＰＭＴと第２フレームメモリとは共通のパスに配置される要素なので、入力画面５１上で第２ＰＭＴのマークと第２フレームメモリのマークとの一方が選択されると、他方も自動的に選択されるものとする。

また、第３ＰＭＴと第３フレームメモリとは共通のパスに配置される要素なので、入力画面５１上で第３ＰＭＴのマークと第３フレームメモリのマークと一方が選択されると、他方も自動的に選択されるものとする。

ユーザは、入力画面５１を目視し、表示中のパス（ここでは２系統のパス）に満足すると、切り替えボタン５１Ａを操作する。

切り替えボタン５１Ａが操作されると（ステップＳ１４ＹＥＳ）、ＣＰＵ４３は、第１画像取得シーケンスに関するパスの入力画面５１（図７）に代えて、第２画像取得シーケンスに関するパスの入力画面５２（図８）をモニタ５へ表示する（ステップＳ１３）。

図８に示すとおり、この入力画面５２にも入力画面５１（図６）と同様、本システムの各要素のマークと、設定リスト５１Ｂと、切り替えボタン５１Ａと、開始ボタン５１Ｃとが配置される。ユーザはこの入力画面５２上で、第２画像取得シーケンスの実行時に本システムに設定すべきパスを、最大３系統まで指定することができる。

ユーザは、図８に示すとおり、第２レーザ光源のマーク５１ｇと、第２ＰＭＴ又は第２フレームメモリのマーク５１ｈと、第２記憶エリアのマーク５１ｉとを連続して選択する。このとき、入力画面５２上には、「第２レーザ光源→第２ＰＭＴ→第２フレームメモリ→第２記憶エリア」というパスが矢印線等で描かれる。このパスの情報は、設定リスト５１Ｂにも反映される。

また、ユーザは、同じ入力画面５２上で、第４レーザ光源のマーク５１ｊと、第１ＰＭＴ又は第１フレームメモリのマーク５１ｋと、第４記憶エリアのマーク５１ｍとを連続して選択する。このとき、入力画面５２上には、「第４レーザ光源→第１ＰＭＴ→第１フレームメモリ→第４記憶エリア」というパスが矢印線等で描かれる。このパスの情報は、設定リスト５１Ｂにも反映される。

なお、入力画面５２上でも、第１ＰＭＴのマークと第１フレームメモリのマークとのうち一方が選択されると他方も自動的に選択され、第２ＰＭＴのマークと第２フレームメモリのマークとの一方が選択されると他方も自動的に選択され、第３ＰＭＴのマークと第３フレームメモリのマークとの一方が選択されると他方も自動的に選択されるものとする。

ユーザは、入力画面５２を目視し、表示中のパス（ここでは２系統のパス）に満足すると、開始ボタン５１Ｃを選択する。

以下、入力画面５１，５２上でユーザが指定したパスを「指定パス」と称し、特に、入力画面５１（図７）上で指定された２系統のパス（第１画像シーケンスで設定すべきパス）を「第１指定パス」と称し、入力画面５２（図８）上で指定された２系統のパス（第２画像シーケンスで設定すべきパス）を「第２指定パス」と称す。

開始ボタン５１Ｃが選択されると（ステップＳ１５ＹＥＳ）、ＣＰＵ４３は設定リスト５１Ｂに反映されている指定回数と指定パスとを認識し、指定回数の情報と、指定パスの情報と、開始指示とをコントロールユニット３へ送信する（ステップＳ１７）。

図９は、コントロールユニット３のＣＰＵ３７の動作フローチャートである。

ＣＰＵ３７は、指定回数の情報と、指定パスの情報と、開始指示とを受信すると（ステップＳ３１ＹＥＳ）、レーザユニット１２からコントロールユニット３までのパスを第１指定パス（図７参照）に設定し（ステップＳ３３）、その設定下で第１画像取得シーケンスを実行する（ステップＳ３４）。

具体的に、ＣＰＵ３７は、制御回路３８へ指示を与えてレーザユニット１２の使用レーザ光源を第１レーザ光源１２１と第３レーザ光源１２３との２つに設定してから、前述した走査を開始し、１フレーム分の走査期間に第１フレームメモリ３１１及び第３フレームメモリ３１３へ個別に蓄積される２種類の蛍光画像信号（第１蛍光の蛍光画像信号と第３蛍光の蛍光画像信号）を逐次読み出し、それらの蛍光画像信号を互いに区別してコンピュータ４へ送信する。

第１画像取得シーケンスの終了直後、ＣＰＵ３７は、レーザユニット１２からコントロールユニット３までのパスを第２指定パスに設定し（ステップＳ３３）、その設定下で第２画像取得シーケンスを実行する（ステップＳ３４）。

具体的に、ＣＰＵ３７は、制御回路３８へ指示を与えてレーザユニット１２の使用レーザ光源を第２レーザ光源１２２と第４レーザ光源１２４との２つに設定してから、前述した走査を開始し、１フレーム分の走査期間に第１フレームメモリ３１１及び第２フレームメモリ３１２へ個別に蓄積される２種類の蛍光画像信号（第４蛍光の蛍光画像信号と第２蛍光の蛍光画像信号）を逐次読み出し、それらの蛍光画像信号を互いに区別してコンピュータ４へ送信する。

一方、コンピュータ４のＣＰＵ４３は、図５のステップＳ１９に示すとおり、第１画像取得シーケンスの実行中に第１蛍光の蛍光画像信号と第３蛍光の蛍光画像信号とを受信すると、それらの蛍光画像信号を、第１指定パス（図７参照）に従ってＲＡＭ４０へ格納する（ステップＳ１９）。具体的に、ＣＰＵ４３は、第１蛍光の蛍光画像信号を第１記憶エリア４０１へ格納し、第３蛍光の蛍光画像信号を第３記憶エリア４０３へ格納する。

それと同時に、ＣＰＵ４３は、第１記憶エリア４０１に格納される第１蛍光の蛍光画像信号と、第３記憶エリア４０３に格納される第３蛍光の蛍光画像信号とを、それぞれインタフェース回路４５を介してモニタ５へ送出する（ステップＳ２０）。

続いて、コンピュータ４のＣＰＵ４３は、第２画像取得シーケンスの実行中に第４蛍光の蛍光画像信号と第２蛍光の蛍光画像信号とを受信すると、それらの蛍光画像信号を、第２指定パス（図８参照）に従ってＲＡＭ４０へ格納する（ステップＳ１９）
具体的に、ＣＰＵ４３は、第４蛍光の蛍光画像信号を第４記憶エリア４０４へ格納し、第２蛍光の蛍光画像信号を第２記憶エリア４０２へ格納する。

それと同時に、ＣＰＵ４３は、第４記憶エリア４０４に格納される第４蛍光の蛍光画像信号と、第２記憶エリア４０２に格納される第２蛍光の蛍光画像信号とを、それぞれインタフェース回路４５を介してモニタ５へ送出する（ステップＳ２０）。

なお、互いに異なる記憶エリアから読み出された第１蛍光の蛍光画像信号、第２蛍光の蛍光画像信号、第３蛍光の蛍光画像信号、第４蛍光の蛍光画像信号は、モニタ５上の互いに異なる領域へ送出される。

以上の結果、本システムでは、第１蛍光試薬及び第３蛍光試薬による「２励起−２蛍光の画像取得」と、第２蛍光試薬及び第４蛍光試薬による「２励起−２蛍光の画像取得」とが連続して行われ、合計４種類の蛍光画像が取得される。

このうち、先の画像取得と後の画像取得との間には、本システムのパスが第１指定パス（図７参照）から第２指定パス（図８参照）へと変更される。このときには、第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルが第１蛍光の波長帯域から第４蛍光の波長帯域へと切り替わる。しかし、第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルの切り替えは前述したとおり高速に行われるので、先の画像取得と後の画像取得との間のタイムラグは極めて短時間に抑えられる。

なお、以上の説明では、第１蛍光試薬及び第３蛍光試薬による「２励起−２蛍光の画像取得」と、第２蛍光試薬及び第４蛍光試薬による「２励起−２蛍光の画像取得」とを連続して行うことを想定したが、本システムを利用すれば、例えば、第１蛍光試薬及び第２蛍光試薬及び第３蛍光試薬による「３励起−３蛍光の画像取得」と、第２蛍光試薬及び第３蛍光試薬及び第４蛍光試薬による「３励起−３蛍光の画像取得」とを連続して行うなど、他の多様な使用形態を採ることが可能である。何れの使用形態が採用されたとしても、先の画像取得と後の画像取得との間のタイムラグは極めて短時間に抑えられる。

また、本システムでは、画像取得シーケンスで設定されるべきパスの全区間をユーザに選択させたが、パスの一部の区間をコンピュータ４に自動で選択させてもよい。

例えば、入力画面５１，５２上で第１レーザ光源のマークをユーザが選択しただけで「第１レーザ光源→第１ＰＭＴ→第１フレームメモリ→第１記憶エリア」というパスが自動的に選択され、第２レーザ光源のマークをユーザが選択しただけで「第２レーザ光源→第２ＰＭＴ→第２フレームメモリ→第２記憶エリア」というパスが自動的に選択され、第３レーザ光源のマークをユーザが選択しただけで「第３レーザ光源→第３ＰＭＴ→第３フレームメモリ→第３記憶エリア」というパスが自動的に選択され、第４レーザ光源のマークをユーザが選択しただけで「第４レーザ光源→第１ＰＭＴ→第１フレームメモリ→第４記憶エリア」というパスが自動的に選択されてもよい。

また、本システムに採用された画像取得方法は、複数の蛍光画像をフレーム単位で取得するフレームシーケンシャルな取得方法であったが、複数の蛍光画像をライン単位で取得するラインシーケンシャルな取得方法としてもよい。

前述したとおり、本システムでは第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルの切り替えが高速に行われるので、波長帯域の異なる複数の蛍光画像を第１ＰＭＴで取得する場合にも、ラインシーケンシャルな取得方法を採用することができる。但し、その場合は、本システムを図１０に示すとおりに変形することが望ましい。

図１０に示すシステムでは、コントロールユニット３にフレームメモリが１つ追加されている。図１０において、追加フレームメモリに符号３１０を付与した。また、第１Ａ／Ｄ変換器３０１と第１フレームメモリ３１１との間には、スイッチング素子３Ａが設けられる。追加フレームメモリ３１０はそのスイッチング素子３Ａに接続される。

スイッチング素子３Ａは、第１Ａ／Ｄ変換器３０１の接続先を、第１フレームメモリ３１１と追加フレームメモリ３１０との間で高速に切り替えることが可能である。

図１０に示すシステムの制御回路３８は、画像取得に当たり、スキャナ１６と、レーザユニット１２と、スイッチング素子３Ａとの３者を同期制御し、観察領域の同一ラインを２回ずつ集光点で走査する。しかも、制御回路３８は、同一ラインの１回目の走査期間と２回目の走査期間との間に、レーザユニット１２の使用レーザ光源を切り替えると共に、第１Ａ／Ｄ変換器３０１の接続先を切り替える。

例えば、レーザユニット１２の使用レーザ光源と第１Ａ／Ｄ変換器３０１の接続先との組み合わせが、同一ラインの１回目の走査期間には第１レーザ光源１２１と第１フレームメモリ３１１との組み合わせに設定され、同一ラインの２回目の走査期間には第４レーザ光源１２４と追加フレームメモリ３１０との組み合わせに設定されたとする。

その場合、観察領域全体の走査が終了するまでに、第１フレームメモリ３１１には第１蛍光の蛍光画像信号が、追加フレームメモリ３１０には第４蛍光の蛍光画像信号がそれぞれ蓄積される。

このように、ラインシーケンシャルな取得方法を採用すれば、第１ＰＭＴ２０１を使用した第１蛍光の蛍光画像の取得タイミングと、第１ＰＭＴ２０１を使用した第４蛍光の蛍光画像の取得タイミングとを略一致させることができる。

本発明は、共焦点レーザ蛍光顕微鏡システムなどの蛍光観察システムに適用される蛍光検出装置、及びその蛍光検出システムに関する。

一般に、共焦点レーザ蛍光顕微鏡の蛍光検出ユニットには光電子倍増管（フォトマルチプライヤ、以下「ＰＭＴ」と称す。）が用いられる。ＰＭＴの入射側には、特定の波長帯域の蛍光のみを透過するバリアフィルタが配置される。多くの蛍光検出ユニットには、検出対象となる波長帯域（検出チャンネル）を複数化するために、ＰＭＴ及びバリアフィルタが複数セット搭載される（特許文献１などを参照）。検出チャンネルを増設する場合は、ＰＭＴ及びバリアフィルタのセット数を増やせばよい。

但し、ＰＭＴの個数が増えると、蛍光検出ユニットのコストが大幅に増大する。そこで、複数のバリアフィルタを装着したターレットを使用し、１つのＰＭＴへ入射可能な蛍光の波長帯域を切り替える方法が考えられる（特許文献２などを参照）。このようにしてＰＭＴの検出チャンネルを切り替え可能にすれば、ＰＭＴの個数を抑えつつ検出チャンネルの数を増やすことができる。
特開２００６−２２０９５４号公報 特開２００３−２９５０６４号公報

しかしながらＰＭＴの検出チャンネルを切り替えながら複数の蛍光画像を取得すると、個々の蛍光画像の取得タイミングにタイムラグが生じる。

そこで本発明は、検出チャンネルの切り替えを高速化することが容易な蛍光検出装置を提供することを目的とする。また、本発明は、波長帯域の異なる複数の蛍光画像を低コストでなるべく高速に取得することのできる蛍光観察システムを提供することを目的とする。

本発明の蛍光検出装置は、被観察物上の照明領域で生じた蛍光の光路に配置される光検出素子と、前記光路に配置され、検出すべき被観察物上の照明領域で生じた、波長帯域の異なる複数の蛍光のうち、少なくとも２つの蛍光に対して透過性を示すバリアフィルタとを備えたことを特徴とする。

以下、本発明を適用した共焦点レーザ蛍光顕微鏡システムについて説明する。

先ず、本システムの構成を説明する。

図１は、共焦点レーザ蛍光顕微鏡システムの構成図である。図１に示すとおり、本システムには、顕微鏡本体１と、顕微鏡本体１に光ファイバ１３で接続されたレーザユニット１２と、顕微鏡本体１に光ファイバ２０で接続された蛍光検出ユニット２とが備えられる。また、本システムには、顕微鏡本体１とレーザユニット１２と蛍光検出ユニット２との各々に電気的に接続されたコントロールユニット３と、コントロールユニット３に通信ケーブルで接続された不図示のコンピュータとが備えられる。

レーザユニット１２には、互いに異なる波長のレーザ光を発光する第１レーザ光源１２１、第２レーザ光源１２２、第３レーザ光源１２３、第４レーザ光源１２４が備えられる。このレーザユニット１２には、ＡＯＴＦ等の波長可変フィルタ１２Ａとシャッタ１００とが備えられる。レーザユニット１２は、これら波長可変フィルタ１２Ａ及びシャッタ１００の動作を組み合わせることにより、使用レーザ光源を変更したり、レーザユニット１２から射出するレーザ光のオン／オフ制御を行ったりすることができる。

顕微鏡本体１には、コリメートレンズ１４と、ダイクロイックミラー１５と、スキャナ１６と、対物レンズ１７と、結像レンズ１８と、共焦点絞り１９と、ステージ１１とが備えられる。ステージ１１には、標本１０Ａが支持される。標本１０Ａは、多重染色された標本であり、その中には励起波長の異なる複数種類の蛍光物質が混在している。ここでは、複数種類の蛍光物質を第１蛍光物質、第２蛍光物質、第３蛍光物質、第４蛍光物質の４種類とする。前述した第１レーザ光源１２１の発光波長は、第１蛍光物質の励起波長と同じであり、第２レーザ光源１２２の発光波長は、第２蛍光物質の励起波長と同じであり、第３レーザ光源１２３の発光波長は、第３蛍光物質の励起波長と同じであり、第４レーザ光源１２４の発光波長は、第４蛍光物質の励起波長と同じである。これら発光波長の具体例は後述する。

蛍光検出ユニット２には、第１ダイクロイックミラー２１と、第２ダイクロイックミラー２２と、第１バリアフィルタ２１１と、第２バリアフィルタ２１２と、第３バリアフィルタ２１３と、第１ＰＭＴ２０１と、第２ＰＭＴ２０２と、第３ＰＭＴ２０３とが備えられる。第１ＰＭＴ２０１，第２ＰＭＴ２０２，第３ＰＭＴ２０３は、何れも同じ特性のＰＭＴであり、検出波長帯域は可視光帯域（例えば、４００ｎｍ〜７５０ｎｍ）である。因みに、蛍光検出ユニット２に備えられるＰＭＴの個数（ここでは３）は、レーザユニット１２に備えられるレーザ光源の個数（ここでは４）よりも少ない。

コントロールユニット３には、ＣＰＵ３７と、制御回路３８と、第１Ａ／Ｄ変換器３０１と、第２Ａ／Ｄ変換器３０２と、第３Ａ／Ｄ変換器３０３と、第１フレームメモリ３１１と、第２フレームメモリ３１２と、第３フレームメモリ３１３と、インタフェース回路３９とが備えられる。

レーザユニット１２から射出したレーザ光は、光ファイバ１３を介して顕微鏡本体１へ導光される。そのレーザ光はコリメートレンズ１４、ダイクロイックミラー１５、スキャナ１６、対物レンズ１７を順に介して標本１０Ａ上の１点へ集光し、その集光点に存在する蛍光物質を励起する。例えば、レーザユニット１２の使用レーザ光源が第１レーザ光源１２１のみであった場合は第１蛍光物質のみが励起され、第１蛍光物質のみが蛍光を発する。また、レーザユニット１２の使用レーザ光源が第２レーザ光源１２２のみであった場合、第２蛍光物質のみが励起され、第２蛍光物質のみが蛍光を発する。また、レーザユニット１２の使用レーザ光源が第３レーザ光源１２３のみであった場合、第３蛍光物質のみが励起され、第３蛍光物質のみが蛍光を発する。また、使用レーザ光源が第４レーザ光源１２４のみであった場合、第４蛍光物質のみが励起され、第４蛍光物質のみが蛍光を発する。以下、第１蛍光物質が発する蛍光、第２蛍光物質が発する蛍光、第３蛍光物質が発する蛍光、第４蛍光物質が発する蛍光を、それぞれ「第１蛍光」、「第２蛍光」、「第３蛍光」、「第４蛍光」と称す。

集光点で発生した蛍光（第１蛍光〜第４蛍光の少なくとも１つ）は、対物レンズ１７、スキャナ１６、ダイクロイックミラー１５、結像レンズ１８を順に介して共焦点絞り１９の開口近傍へ集光する。このうち、共焦点絞り１９の開口を通過した蛍光は、光ファイバ２０を介して蛍光検出ユニット２へ導かれる。なお、スキャナ１６が駆動されると、レーザ光の集光点が標本１０Ａ上を移動する。また、集光点で発生した第１蛍光〜第４蛍光の顕微鏡本体における振る舞いは、互いに同じである。但し、第１蛍光〜第４蛍光は、蛍光検出ユニット２において互いに異なる振る舞いをする。

蛍光検出ユニット２へ入射した第１蛍光は、第１ダイクロイックミラー２１にて反射し、第１バリアフィルタ２１１を透過し、第１ＰＭＴ２０１へ向かう。蛍光検出ユニット２へ入射した第２蛍光は、第１ダイクロイックミラー２１を透過し、第２ダイクロイックミラー２２を反射し、第２バリアフィルタ２１２を透過し、第２ＰＭＴ２０２へ向かう。蛍光検出ユニット２へ入射した第３蛍光は、第１ダイクロイックミラー２１、第２ダイクロイックミラー２２を順に透過し、第３バリアフィルタ２１３を透過して第３ＰＭＴ２０３へ向かう。蛍光検出ユニット２へ入射した第４蛍光は、第１ダイクロイックミラー２１を反射し、第１バリアフィルタ２１１を透過し、第１ＰＭＴ２０１へ向かう。

すなわち、第１ダイクロイックミラー２１は、第１蛍光及び第４蛍光の波長帯域の光に反射性を示し、第２蛍光及び第３蛍光の波長帯域の光に透過性を示す。また、第１バリアフィルタ２１１は、第１蛍光及び第４蛍光の波長帯域の光に透過性を示し、それ以外の波長帯域の光に吸収性を示す。詳細は後述するが、第１蛍光の波長帯域と第４蛍光の波長帯域とは互いに離散しているので、第１バリアフィルタ２１１には、互いに離れた複数の波長帯域の光を透過するデュアルパスバリアフィルタが使用される。

第１ＰＭＴ２０１、第２ＰＭＴ２０２、第３ＰＭＴ２０３の各々は、入射光の強度を示す信号を生成する。第１ＰＭＴ２０１が生成する信号と、第２ＰＭＴ２０２が生成する信号と、第３ＰＭＴ２０３が生成する信号とは、コントロールユニット３へ入力される。

このうち第１ＰＭＴ２０１が生成する信号は、第１Ａ／Ｄ変換器３０１を介して第１フレームメモリ３１１へ蓄積され、第２ＰＭＴ２０２が生成する信号は、第２Ａ／Ｄ変換器３０２を介して第２フレームメモリ３１２へ蓄積され、第３ＰＭＴ２０３が生成する信号は、第３Ａ／Ｄ変換器３０３を介して第３フレームメモリ３１３へ蓄積される。

つまり、「第１ＰＭＴ２０１→第１Ａ／Ｄ変換器３０１→第１フレームメモリ３１１」という信号路は、第１蛍光の信号と第４蛍光の信号とに兼用される。また、「第２ＰＭＴ２０２→第２Ａ／Ｄ変換器３０２→第２フレームメモリ３１２」という信号路は、第２蛍光の信号に専用の信号路であり、「第３ＰＭＴ２０３→第３Ａ／Ｄ変換器３０３→第３フレームメモリ３１３」という信号路は、第３蛍光の信号に専用の信号路である。

コントロールユニット３の制御回路３８は、スキャナ１６及びレーザユニット１２を同期制御し、レーザ光の集光点で標本１０Ａ上の観察領域を走査する。１フレーム分の走査期間に、第１フレームメモリ３１１，第２フレームメモリ３１２，第３フレームメモリ３１３の少なくとも１つには、１フレーム分の信号（蛍光画像信号）が蓄積される。ＣＰＵ３７はこの蛍光画像信号を読み出し、それをインタフェース回路３９を介してコンピュータへ送信する。以上のコントロールユニット３の動作手順を、以下では「画像取得シーケンス」と称す。

この画像取得シーケンスの実行に当たり、制御回路３８がレーザユニット１２の使用レーザ光源を、第１レーザ光源１２１と第４レーザ光源１２４とのうち前者のみに設定すると、集光点では第４蛍光は発生せずに第１蛍光が発生する。このときには、第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルが第１蛍光の波長帯域に設定されたことになり、第１フレームメモリ３１１に第１蛍光の蛍光画像信号が蓄積される。

一方、制御回路３８がレーザユニット１２の使用レーザ光源を、第１レーザ光源１２１と第４レーザ光源１２４とのうち後者のみに設定すると、集光点では第１蛍光は発生せずに第４蛍光が発生する。このときには、第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルが第４蛍光の波長帯域に設定されたことになり、第１フレームメモリ３１１に第４蛍光の蛍光画像信号が蓄積される。

したがって、本システムでは、制御回路３８がレーザユニット１２の使用レーザ光源を第１レーザ光源１２１と第４レーザ光源１２４との間で切り替えるだけで、第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルが第１蛍光の波長帯域と第４蛍光の波長帯域との間で切り替わる。前述したとおりレーザユニット１２には波長可変フィルタ１２Ａが使用されているので、この切り替えは極めて高速に行われる。

次に、本システムの各部の特性の具体例を示す。

・第１レーザ光源１２１の発光波長（＝第１蛍光物質の励起波長）：４０８ｎｍ，
・第２レーザ光源１２２の発光波長（＝第２蛍光物質の励起波長）：４８８ｎｍ，
・第３レーザ光源１２３の発光波長（＝第３蛍光物質の励起波長）：５４３ｎｍ，
・第４レーザ光源１２４の発光波長（＝第４蛍光物質の励起波長）：６３３ｎｍ，
・第１蛍光物質のストークシフト：２５ｎｍ，
・第２蛍光物質のストークシフト：２５ｎｍ，
・第３蛍光物質のストークシフト：２５ｎｍ，
・第４蛍光物質のストークシフト：２５ｎｍ，
・第１蛍光物質の蛍光（第１蛍光）の波長幅：３０ｎｍ（±１５ｎｍ）
・第２蛍光物質の蛍光（第２蛍光）の波長幅：３０ｎｍ（±１５ｎｍ）
・第３蛍光物質の蛍光（第３蛍光）の波長幅：３０ｎｍ（±１５ｎｍ）
・第４蛍光物質の蛍光（第４蛍光）の波長幅：３０ｎｍ（±１５ｎｍ）
・第１ダイクロイックミラー２１の反射波長帯域：〜４４９ｎｍ，６４３ｎｍ〜（４４９ｎｍ〜６４３ｎｍは透過波長帯域）
・第１バリアフィルタ２１１の透過波長帯域：４１８ｎｍ〜４４８ｎｍ，６４３ｎｍ〜６７３ｎｍ（〜４１８ｎｍ，４４８ｎｍ〜６４３ｎｍ，６７３ｎｍ〜は吸収波長帯域）
・第２ダイクロイックミラー２２の反射波長帯域：〜５２９ｎｍ（５２９ｎｍ〜は透過波長帯域）
・第２バリアフィルタ２１２の透過波長帯域：４９８ｎｍ〜５２８ｎｍ（〜４９８ｎｍ，５２８ｎｍ〜は吸収波長帯域）
・第３バリアフィルタ２１３の透過波長帯域：５５３ｎｍ〜（〜５５３ｎｍは吸収波長帯域）
以上の具体例における各レーザ光源の発光波長特性を同一グラフ上に描くと、図２（Ａ）に示すとおりになる。

また、各蛍光物質の蛍光波長特性を同一グラフ上に描くと、図２（Ｂ）に示すとおりになる。

また、第１ダイクロイックミラー２１の反射波長特性をグラフ上に描くと、図２（Ｃ）に示すとおりとなり、第１バリアフィルタ２１１の透過波長特性をグラフ上に描くと、図２（Ｄ）に示すとおりとなる。

したがって、使用レーザ光源が第１レーザ光源１２１と第４レーザ光源１２４との間で切り替わると、第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルが第１蛍光の波長帯域と第４蛍光の波長帯域との間で切り替わることは明らかである。

因みに、この具体例では、切り替え前後の検出チャンネル同士が十分に離れているので、切り替え直前に発生していた蛍光が、切り替えの直後の蛍光画像信号へノイズを与える現象（クロストーク）は発生しにくい。

また、以上の具体例における第２ダイクロイックミラー２２の反射波長特性をグラフ上に描くと、図３（Ｂ）に示すとおりとなり、第２バリアフィルタ２１２の透過波長特性をグラフ上に描くと、図３（Ｃ）に示すとおりとなる。なお、図３（Ａ）には、第２ダイクロイックミラー２２に到達しうる蛍光（第２蛍光と第３蛍光）を示した。したがって、第２ＰＭＴ２０２の検出チャンネルが第２蛍光の波長帯域に略一致していることは明らかである。

また、以上の具体例における第３バリアフィルタ２１３の透過波長特性をグラフ上に描くと、図３（Ｄ）に示すとおりである。したがって、第３ＰＭＴ２０３の検出チャンネルが第３蛍光の波長帯域に略一致していることは明らかである。

次に、本システムのコンピュータを簡単に説明する。

図４は、コンピュータの構成図である。コンピュータ４には、ＲＡＭ４０、インタフェース回路４１、ＲＯＭ４２、ＣＰＵ４３、ハードディスクドライブ４４、インタフェース回路４５、インタフェース回路４６が備えられる。コンピュータ４は、インタフェース回路４１を介してコントロールユニット３へ接続され、インタフェース回路４５及びインタフェース回路４６を介してモニタ５及び入力器６へ接続される。

ハードディスクドライブ４４には、コンピュータ４を本システムの情報処理装置として機能させるためのアプリケーションソフトウエアのプログラムが格納される。このプログラムは、必要に応じてＲＡＭ４０上に読み出され、ＣＰＵ４３によって実行される。以下に説明するＣＰＵ４３の動作は、このプログラムに従うものとする。

ＣＰＵ４３は、インタフェース回路４５を介してモニタ５へＧＵＩ画面を表示すると共に、インタフェース回路４６を介して入力器６の操作内容を認識する。また、ＣＰＵ４３は、インタフェース回路４１を介してコントロールユニット３のＣＰＵ３７と通信を行い、各種の情報を送受信する。

また、ＣＰＵ４３は、コントロールユニット３から受信した蛍光画像信号を格納する記憶エリアとして、ＲＡＭ４０上に４つの記憶エリア、すなわち第１記憶エリア４０１、第２記憶エリア４０２、第３記憶エリア４０３、第４記憶エリア４０４を割り当てている。個々の記憶エリアは、１フレーム分の蛍光画像信号を格納することができる。

次に、本システム全体の動作の流れを説明する。ここでは、第１蛍光試薬及び第３蛍光試薬による「２励起−２蛍光の画像取得」と、第２蛍光試薬及び第４蛍光試薬による「２励起−２蛍光の画像取得」とを連続して行うことを想定する。

図５は、コンピュータ４のＣＰＵ４３の動作フローチャートである。

先ず、ＣＰＵ４３は、画像取得シーケンスの回数ｍをユーザに指定させる（ステップＳ１１）。ここでは回数ｍとして「２」が指定される。以下、この回数を「指定回数」と称す。

続いて、ＣＰＵ４３は、第１画像取得シーケンスに関するパスの入力画面５１（図６）をモニタ５へ表示する（ステップＳ１３）。

図６に示すとおり、入力画面５１には本システムの各要素、すなわち第１レーザ光源〜第４レーザ光源、第１ＰＭＴ〜第３ＰＭＴ、第１フレームメモリ〜第３フレームメモリ、第１記憶エリア〜第４記憶エリアの各々のマークが配置される。また、入力画面５１には、入力済みの情報を示す設定リスト５１Ｂと、切り替えボタン５１Ａと、開始ボタン５１Ｃとが配置される。

ユーザはこの入力画面５１上で、第１画像取得シーケンスの実行時に本システムに設定すべきパスを、最大３系統まで指定することができる。

ユーザは、図７に示すとおり、第１レーザ光源のマーク５１ａと、第１ＰＭＴ又は第１フレームメモリのマーク５１ｂと、第１記憶エリアのマーク５１ｃとを連続して選択する。このとき、入力画面５１上には、「第１レーザ光源→第１ＰＭＴ→第１フレームメモリ→第１記憶エリア」というパスが矢印線等で描かれる。このパスの情報は、設定リスト５１Ｂにも反映される。

また、ユーザは、同じ入力画面５１上で、第３レーザ光源のマーク５１ｄと、第３ＰＭＴ又は第３フレームメモリのマーク５１ｅと、第３記憶エリアのマーク５１ｆとを連続して選択する。このとき、入力画面５１上には、「第３レーザ光源→第３ＰＭＴ→第３フレームメモリ→第３記憶エリア」というパスが矢印線等で描かれる。このパスの情報は、設定リスト５１Ｂにも反映される。

なお、第１ＰＭＴと第１フレームメモリとは共通のパスに配置される要素なので、入力画面５１上で第１ＰＭＴのマークと第１フレームメモリのマークとのうち一方が選択されると、他方も自動的に選択されるものとする。

また、第２ＰＭＴと第２フレームメモリとは共通のパスに配置される要素なので、入力画面５１上で第２ＰＭＴのマークと第２フレームメモリのマークとの一方が選択されると、他方も自動的に選択されるものとする。

また、第３ＰＭＴと第３フレームメモリとは共通のパスに配置される要素なので、入力画面５１上で第３ＰＭＴのマークと第３フレームメモリのマークと一方が選択されると、他方も自動的に選択されるものとする。

ユーザは、入力画面５１を目視し、表示中のパス（ここでは２系統のパス）に満足すると、切り替えボタン５１Ａを操作する。

切り替えボタン５１Ａが操作されると（ステップＳ１４ＹＥＳ）、ＣＰＵ４３は、第１画像取得シーケンスに関するパスの入力画面５１（図７）に代えて、第２画像取得シーケンスに関するパスの入力画面５２（図８）をモニタ５へ表示する（ステップＳ１３）。

図８に示すとおり、この入力画面５２にも入力画面５１（図６）と同様、本システムの各要素のマークと、設定リスト５１Ｂと、切り替えボタン５１Ａと、開始ボタン５１Ｃとが配置される。ユーザはこの入力画面５２上で、第２画像取得シーケンスの実行時に本システムに設定すべきパスを、最大３系統まで指定することができる。

ユーザは、図８に示すとおり、第２レーザ光源のマーク５１ｇと、第２ＰＭＴ又は第２フレームメモリのマーク５１ｈと、第２記憶エリアのマーク５１ｉとを連続して選択する。このとき、入力画面５２上には、「第２レーザ光源→第２ＰＭＴ→第２フレームメモリ→第２記憶エリア」というパスが矢印線等で描かれる。このパスの情報は、設定リスト５１Ｂにも反映される。

また、ユーザは、同じ入力画面５２上で、第４レーザ光源のマーク５１ｊと、第１ＰＭＴ又は第１フレームメモリのマーク５１ｋと、第４記憶エリアのマーク５１ｍとを連続して選択する。このとき、入力画面５２上には、「第４レーザ光源→第１ＰＭＴ→第１フレームメモリ→第４記憶エリア」というパスが矢印線等で描かれる。このパスの情報は、設定リスト５１Ｂにも反映される。

なお、入力画面５２上でも、第１ＰＭＴのマークと第１フレームメモリのマークとのうち一方が選択されると他方も自動的に選択され、第２ＰＭＴのマークと第２フレームメモリのマークとの一方が選択されると他方も自動的に選択され、第３ＰＭＴのマークと第３フレームメモリのマークとの一方が選択されると他方も自動的に選択されるものとする。

ユーザは、入力画面５２を目視し、表示中のパス（ここでは２系統のパス）に満足すると、開始ボタン５１Ｃを選択する。

以下、入力画面５１，５２上でユーザが指定したパスを「指定パス」と称し、特に、入力画面５１（図７）上で指定された２系統のパス（第１画像シーケンスで設定すべきパス）を「第１指定パス」と称し、入力画面５２（図８）上で指定された２系統のパス（第２画像シーケンスで設定すべきパス）を「第２指定パス」と称す。

開始ボタン５１Ｃが選択されると（ステップＳ１５ＹＥＳ）、ＣＰＵ４３は設定リスト５１Ｂに反映されている指定回数と指定パスとを認識し、指定回数の情報と、指定パスの情報と、開始指示とをコントロールユニット３へ送信する（ステップＳ１７）。

図９は、コントロールユニット３のＣＰＵ３７の動作フローチャートである。

ＣＰＵ３７は、指定回数の情報と、指定パスの情報と、開始指示とを受信すると（ステップＳ３１ＹＥＳ）、レーザユニット１２からコントロールユニット３までのパスを第１指定パス（図７参照）に設定し（ステップＳ３３）、その設定下で第１画像取得シーケンスを実行する（ステップＳ３４）。

具体的に、ＣＰＵ３７は、制御回路３８へ指示を与えてレーザユニット１２の使用レーザ光源を第１レーザ光源１２１と第３レーザ光源１２３との２つに設定してから、前述した走査を開始し、１フレーム分の走査期間に第１フレームメモリ３１１及び第３フレームメモリ３１３へ個別に蓄積される２種類の蛍光画像信号（第１蛍光の蛍光画像信号と第３蛍光の蛍光画像信号）を逐次読み出し、それらの蛍光画像信号を互いに区別してコンピュータ４へ送信する。

第１画像取得シーケンスの終了直後、ＣＰＵ３７は、レーザユニット１２からコントロールユニット３までのパスを第２指定パスに設定し（ステップＳ３３）、その設定下で第２画像取得シーケンスを実行する（ステップＳ３４）。

具体的に、ＣＰＵ３７は、制御回路３８へ指示を与えてレーザユニット１２の使用レーザ光源を第２レーザ光源１２２と第４レーザ光源１２４との２つに設定してから、前述した走査を開始し、１フレーム分の走査期間に第１フレームメモリ３１１及び第２フレームメモリ３１２へ個別に蓄積される２種類の蛍光画像信号（第４蛍光の蛍光画像信号と第２蛍光の蛍光画像信号）を逐次読み出し、それらの蛍光画像信号を互いに区別してコンピュータ４へ送信する。

一方、コンピュータ４のＣＰＵ４３は、図５のステップＳ１９に示すとおり、第１画像取得シーケンスの実行中に第１蛍光の蛍光画像信号と第３蛍光の蛍光画像信号とを受信すると、それらの蛍光画像信号を、第１指定パス（図７参照）に従ってＲＡＭ４０へ格納する（ステップＳ１９）。具体的に、ＣＰＵ４３は、第１蛍光の蛍光画像信号を第１記憶エリア４０１へ格納し、第３蛍光の蛍光画像信号を第３記憶エリア４０３へ格納する。

それと同時に、ＣＰＵ４３は、第１記憶エリア４０１に格納される第１蛍光の蛍光画像信号と、第３記憶エリア４０３に格納される第３蛍光の蛍光画像信号とを、それぞれインタフェース回路４５を介してモニタ５へ送出する（ステップＳ２０）。

続いて、コンピュータ４のＣＰＵ４３は、第２画像取得シーケンスの実行中に第４蛍光の蛍光画像信号と第２蛍光の蛍光画像信号とを受信すると、それらの蛍光画像信号を、第２指定パス（図８参照）に従ってＲＡＭ４０へ格納する（ステップＳ１９）
具体的に、ＣＰＵ４３は、第４蛍光の蛍光画像信号を第４記憶エリア４０４へ格納し、第２蛍光の蛍光画像信号を第２記憶エリア４０２へ格納する。

それと同時に、ＣＰＵ４３は、第４記憶エリア４０４に格納される第４蛍光の蛍光画像信号と、第２記憶エリア４０２に格納される第２蛍光の蛍光画像信号とを、それぞれインタフェース回路４５を介してモニタ５へ送出する（ステップＳ２０）。

なお、互いに異なる記憶エリアから読み出された第１蛍光の蛍光画像信号、第２蛍光の蛍光画像信号、第３蛍光の蛍光画像信号、第４蛍光の蛍光画像信号は、モニタ５上の互いに異なる領域へ送出される。

以上の結果、本システムでは、第１蛍光試薬及び第３蛍光試薬による「２励起−２蛍光の画像取得」と、第２蛍光試薬及び第４蛍光試薬による「２励起−２蛍光の画像取得」とが連続して行われ、合計４種類の蛍光画像が取得される。

このうち、先の画像取得と後の画像取得との間には、本システムのパスが第１指定パス（図７参照）から第２指定パス（図８参照）へと変更される。このときには、第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルが第１蛍光の波長帯域から第４蛍光の波長帯域へと切り替わる。しかし、第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルの切り替えは前述したとおり高速に行われるので、先の画像取得と後の画像取得との間のタイムラグは極めて短時間に抑えられる。

なお、以上の説明では、第１蛍光試薬及び第３蛍光試薬による「２励起−２蛍光の画像取得」と、第２蛍光試薬及び第４蛍光試薬による「２励起−２蛍光の画像取得」とを連続して行うことを想定したが、本システムを利用すれば、例えば、第１蛍光試薬及び第２蛍光試薬及び第３蛍光試薬による「３励起−３蛍光の画像取得」と、第２蛍光試薬及び第３蛍光試薬及び第４蛍光試薬による「３励起−３蛍光の画像取得」とを連続して行うなど、他の多様な使用形態を採ることが可能である。何れの使用形態が採用されたとしても、先の画像取得と後の画像取得との間のタイムラグは極めて短時間に抑えられる。

また、本システムでは、画像取得シーケンスで設定されるべきパスの全区間をユーザに選択させたが、パスの一部の区間をコンピュータ４に自動で選択させてもよい。

例えば、入力画面５１，５２上で第１レーザ光源のマークをユーザが選択しただけで「第１レーザ光源→第１ＰＭＴ→第１フレームメモリ→第１記憶エリア」というパスが自動的に選択され、第２レーザ光源のマークをユーザが選択しただけで「第２レーザ光源→第２ＰＭＴ→第２フレームメモリ→第２記憶エリア」というパスが自動的に選択され、第３レーザ光源のマークをユーザが選択しただけで「第３レーザ光源→第３ＰＭＴ→第３フレームメモリ→第３記憶エリア」というパスが自動的に選択され、第４レーザ光源のマークをユーザが選択しただけで「第４レーザ光源→第１ＰＭＴ→第１フレームメモリ→第４記憶エリア」というパスが自動的に選択されてもよい。

また、本システムに採用された画像取得方法は、複数の蛍光画像をフレーム単位で取得するフレームシーケンシャルな取得方法であったが、複数の蛍光画像をライン単位で取得するラインシーケンシャルな取得方法としてもよい。

前述したとおり、本システムでは第１ＰＭＴ２０１の検出チャンネルの切り替えが高速に行われるので、波長帯域の異なる複数の蛍光画像を第１ＰＭＴで取得する場合にも、ラインシーケンシャルな取得方法を採用することができる。但し、その場合は、本システムを図１０に示すとおりに変形することが望ましい。

図１０に示すシステムでは、コントロールユニット３にフレームメモリが１つ追加されている。図１０において、追加フレームメモリに符号３１０を付与した。また、第１Ａ／Ｄ変換器３０１と第１フレームメモリ３１１との間には、スイッチング素子３Ａが設けられる。追加フレームメモリ３１０はそのスイッチング素子３Ａに接続される。

スイッチング素子３Ａは、第１Ａ／Ｄ変換器３０１の接続先を、第１フレームメモリ３１１と追加フレームメモリ３１０との間で高速に切り替えることが可能である。

図１０に示すシステムの制御回路３８は、画像取得に当たり、スキャナ１６と、レーザユニット１２と、スイッチング素子３Ａとの３者を同期制御し、観察領域の同一ラインを２回ずつ集光点で走査する。しかも、制御回路３８は、同一ラインの１回目の走査期間と２回目の走査期間との間に、レーザユニット１２の使用レーザ光源を切り替えると共に、第１Ａ／Ｄ変換器３０１の接続先を切り替える。

例えば、レーザユニット１２の使用レーザ光源と第１Ａ／Ｄ変換器３０１の接続先との組み合わせが、同一ラインの１回目の走査期間には第１レーザ光源１２１と第１フレームメモリ３１１との組み合わせに設定され、同一ラインの２回目の走査期間には第４レーザ光源１２４と追加フレームメモリ３１０との組み合わせに設定されたとする。

その場合、観察領域全体の走査が終了するまでに、第１フレームメモリ３１１には第１蛍光の蛍光画像信号が、追加フレームメモリ３１０には第４蛍光の蛍光画像信号がそれぞれ蓄積される。

このように、ラインシーケンシャルな取得方法を採用すれば、第１ＰＭＴ２０１を使用した第１蛍光の蛍光画像の取得タイミングと、第１ＰＭＴ２０１を使用した第４蛍光の蛍光画像の取得タイミングとを略一致させることができる。

共焦点レーザ蛍光顕微鏡システムの構成図である。 （Ａ）は各レーザ光源の発光波長特性、（Ｂ）は各蛍光物質の蛍光波長特性、（Ｃ）は第１ダイクロイックミラーの反射波長特性、（Ｄ）は第１バリアフィルタ２１１の反射波長特性である。 （Ａ）は第２ダイクロイックミラー２２に到達しうる蛍光（第２蛍光と第３蛍光）の蛍光波長特性、（Ｂ）は第２ダイクロイックミラー２２の反射波長特性、（Ｃ）は第２バリアフィルタ２１２の透過波長特性、（Ｄ）は第３バリアフィルタ２１３の透過波長特性である。 コンピュータの構成図である。 コンピュータ４のＣＰＵ４３の動作フローチャートである。 第１画像取得シーケンスに関するパスの入力画面である。 パスが指定されたときの入力画面である。 第２画像取得シーケンスに関するパスの入力画面である。 コントロールユニット３のＣＰＵ３７の動作フローチャートである。 本システムの変形例の構成図である。

Claims (17)

1. 被観察物上の照明領域で生じた蛍光の光路に配置される光検出素子と、
   前記光路に配置され、波長帯域の異なる複数の蛍光のうち、少なくとも２つの蛍光に対して透過性を示すバリアフィルタと、
   を備えたことを特徴とする蛍光検出装置。
2. 請求項１記載の蛍光検出装置において、
   前記バリアフィルタは、前記光検出素子の蛍光入射側の直前に設けられる
   ことを特徴とする蛍光検出装置。
3. 請求項１記載の蛍光検出装置において、
   前記バリアフィルタは、前記光検出素子と対になるように配置されている
   ことを特徴とする蛍光検出装置。
4. 請求項１記載の蛍光検出装置において、
   前記バリアフィルタの蛍光入射側に設けられ、前記波長帯域が異なる複数の蛍光のうち少なくとも２つの異なる波長帯域の蛍光を反射させ、残りの波長帯域の蛍光のうち少なくとも１つの波長帯域の蛍光を透過させるダイクロイックミラーを備えている
   ことを特徴とする蛍光検出装置。
5. 請求項４記載の蛍光検出装置において、
   前記ダイクロイックミラーは、照明領域で生じた蛍光のうち少なくとも２つの異なる波長帯域の蛍光を反射させ、残りの蛍光のうち少なくとも１つの波長帯域の蛍光を透過させる第１のダイクロイックミラーと、該第１のダイクロイックミラーを透過した前記少なくとも１つの波長帯域の蛍光を反射させる第２のダイクロイックミラーとを少なくとも有し、
   前記バリアフィルタは、前記第１のダイクロイックミラーを反射した少なくとも２つの異なる波長帯域の蛍光を透過させる第１のバリアフィルタと、前記第２のダイクロイックミラーを反射した少なくとも１つの波長帯域の蛍光を透過させる第２のバリアフィルタとを少なくとも有し、
   前記光検出素子は、第１のバリアフィルタを透過した前記少なくとも２つの異なる波長帯域の蛍光が入射される第１の光検出素子と、前記第２のダイクロイックミラーを反射した少なくとも１つの波長帯域の蛍光が入射される第２の光検出素子とを少なくとも有している
   ことを特徴とする蛍光検出装置。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光検出装置と、
   前記照明領域へ入射する照明光の波長を、前記複数の蛍光のいずれかを発生させるのに必要な複数の励起波長の少なくとも１つに設定し、それによって前記光検出素子の検出チャンネルの設定を行う制御装置と、
   を備えたことを特徴とする蛍光観察システム。
7. 請求項６に記載の蛍光観察システムにおいて、
   前記制御装置は、
   前記検出チャンネルを切り替えながら、波長帯域の異なる複数の蛍光画像信号を前記光検出素子から互いに異なるタイミングで取得する
   ことを特徴とする蛍光観察システム。
8. 請求項７に記載の蛍光観察システムにおいて、
   前記制御装置は、
   前記検出チャンネルの切り替えをフレーム単位で行う
   ことを特徴とする蛍光観察システム。
9. 請求項７に記載の蛍光観察システムにおいて、
   前記蛍光観察装置は、
   前記照明領域で前記被観察物を走査する光走査装置を備え、
   前記制御装置は、
   前記検出チャンネルの切り替えをライン単位で行う
   ことを特徴とする蛍光観察システム。
10. 請求項７〜９のいずれか１項に記載の蛍光観察システムにおいて、
    前記制御装置が取得する複数の蛍光画像信号を取り込み、それらを互いに異なるメモリ空間へ個別に格納する情報処理装置を更に備えた
    ことを特徴とする蛍光観察システム。
11. 請求項４又は５記載の蛍光検出装置と、
    前記少なくとも２つの異なる波長帯域の蛍光が前記光検出素子に入射されたときに得られる信号を、各々異なる２つの信号として処理するＡ／Ｄ変換器と、を備えている
    ことを特徴とする蛍光観察システム。
12. 請求項１１記載の蛍光観察システムにおいて、
    前記Ａ／Ｄ変換器で変換された異なる２つの信号は、それぞれ異なる情報として同一の記憶装置に記憶されることを特徴とする蛍光観察システム。
13. 請求項１１又は１２に記載の蛍光観察システムにおいて、
    異なる波長の光をそれぞれ発する少なくとも２つの光源と、
    前記光源からの光を１つの光路にする光学系と、
    前記１つの光路に設置される波長可変フィルタと、
    を備えている
    ことを特徴とする蛍光観察システム。
14. 請求項１３に記載の蛍光観察システムにおいて、
    前記少なくとも２つの光源と前記光学系との間に、該少なくとも２つの光源のそれぞれに対応したシャッタが設けられていることを特徴とする蛍光観察システム。
15. 請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の蛍光観察システムにおいて、
    前記被観察物からの蛍光は共焦点絞りを通過した後、前記光検出素子に導かれることを特徴とする蛍光観察システム。
16. 請求項６記載の蛍光観察システムにおいて、
    複数の光源のそれぞれに対応するマーク、複数の光検出素子のそれぞれに対応するマーク及び複数の記憶部のそれぞれに対応するマークを少なくとも表示するモニタを備え、
    前記制御装置は、前記光源、光検出素子及び記憶部の各項目からマークがそれぞれ選択されたときに、選択された各項目のマークを線で繋ぐことでパスを表示することを特徴とする蛍光観察システム。
17. 請求項１５記載の蛍光観察システムにおいて、
    前記マークは同一の項目から複数選択可能であり、
    前記マークが同一の項目から複数選択されたときには、選択されたマークのそれぞれを含むパスを複数同時に表示する
    ことを特徴とする蛍光観察システム。

Images