JPWO2007111282A1 - グリコヘモグロビン濃度測定方法および濃度測定装置 - Google Patents

Abstract

グリコヘモグロビン濃度を測定する場合に、測定波長として４００〜４５０ｎｍの波長範囲から複数の波長を選択する。好ましくは、液体クロマトグラフィを利用して、少なくとも４１５〜４３０ｎｍの波長範囲における異なるピーク波長の光を連続的または間欠的を受光して、波長と溶離時間と検出量とを変数とする３次元クロマトグラムを得、この３次元クロマトグラムに基づいて、グリコヘモグロビン濃度を演算する。

Description

本発明は、血液などの試料に含まれるグリコヘモグロビンの濃度を測定する技術に関する。

血液などの生体試料を用いて生体成分を分離分析する場合には、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を利用した高速液体クロマトグラフィ装置（ＨＰＬＣ装置）が広く用いられている（たとえば特許文献１参照）。

図１３に示したように、一般的なＨＰＬＣ装置９は、試料調製ユニット９０において生体成分を含んだ試料を調製した後にその試料を分析カラム９１に導入させ、生体成分を分析カラム９１の充填剤に吸着させるように構成されている。試料として全血を用いてグルコヘモグロビンを測定する場合には、分析カラム９１に対しては、全血から採取した赤血球を溶血させた後に、溶血液を希釈した状態の生体試料が導入される。その一方で、充填剤に吸着させた生体成分は、送液ポンプ９２によって溶離液ボトル９３から分析カラム９１に溶離液を供給することによって溶離させられる。分析カラム９１からの生体成分を含む溶離液は、測光機構９４に導入され、この測光機構９４において生体成分を含む溶離液の吸光度を連続的に測定することにより、生体成分の分析が行なわれる。

図１４に示したように、測光機構９４は、生体成分を含む溶離液が測光セル９５の流路９６を流通する間に、光源９７からの光を照射し、そのときの透過光を受光部９８において受光するものである。受光部９８において受光させる光の波長は、干渉フィルタ９９において選択される一方で、受光部９８からは受光量に応じた出力レベルの信号が出力される。測光機構９４における溶離液の測光は連続的に行なわれるため、溶離時間と受光量（吸光度）との関係は、図１５に示したようなクロマトグラムとして得られる。

ＨＰＬＣ装置９ではさらに、吸光度の経時的変化であるクロマトグラムに基づいて、ヘモグロビン総量を演算するとともに、このヘモグロビン総量におけるグリコヘモグロビンが占める割合（図１５においてクロスハッチングで示した部分）としてグリコヘモグロビン濃度が演算される。

しかしながら、溶離液への酸素などの気体の溶解量は、溶離液の温度によって異なるため、装置外部の温度（環境温度）が変動した場合、あるいは環境温度が異なる状態で生体成分の分析を行なった場合には、溶離液中の溶存気体の状態（溶解量）が異なったものとなる。そのため、溶離液中の溶存酸素濃度が環境温度の変動などに伴って変動した場合には、ヘモグロビン中のオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンとの比率が変動する。また、分析カラム９１に導入される生体試料においても、各回の測定ごとにヘモグロビン中のオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンとの比率が変動しうる。

その一方で、分析カラム９１に導入する生体試料として、溶血液を希釈して酸素が比較的多い状態のものを使用することから、測光機構９４においては、オキシヘモグロビンの最大吸収波長である４１５ｎｍを測定波長として採用している。そのため、環境温度の変化が大きな環境下などででは、オキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンとの比率が異なったものとなるため、それらを同一の波長において測定する場合には正確な測定が困難となる。

特開平７−１２０４４７号公報

本発明は、オキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンとの比率が異なる場合であっても、クリコヘモグロビンの濃度を適切に測定できるようにすることを課題としている。

本発明の第１の側面において提供されるグリコヘモグロビン濃度測定方法は、試料に対して光を照射したときに試料から進行してくる光に基づいてグリコヘモグロビン濃度を測定する方法であって、４００〜４５０ｎｍの波長範囲にピーク波長を有する複数の測定波長の光に基づいてグリコヘモグロビンの濃度を測定することを特徴としている。

好ましくは、試料から進行してくる光のうち、少なくとも４１５〜４３０ｎｍの波長範囲における異なるピーク波長の光を連続的または間欠的を受光してグリコヘモグロビン濃度を測定する。

本発明は、液体クロマトグラフィを利用したグリコヘモグロビン濃度の測定方法に適用することができる。その場合、グリコヘモグロビン濃度は、たとえば測定波長、溶離時間および検出量を変数とする３次元クロマトグラムに基づいて演算される。より具体的には、たとえば、グリコヘモグロビン濃度は、上記３次元クロマトグラムでのヘモグロビン総量に対応する体積または積算値おけるグリコヘモグロビンに対応する体積または積算値が占める割合として演算される。グリコヘモグロビン濃度は、各測定波長における溶離時間と検出量とを変数とするクロマトグラムからグルコヘモグロビンの割合を演算するとともに、各測定波長におけるグルコヘモグロビンの割合を平均することにより演算してもよい。

グリコヘモグロビン濃度は、各測定波長におけるヘモグロビンの検出量のピーク値と、溶離時間と、の２次元クロマトグラムにおいて、ヘモグロビン総量に対応する面積おけるグリコヘモグロビンに対応する面積が占める割合として演算さすることもできる。

グリコヘモグロビン濃度は、試料から進行してくる４００〜４２０ｎｍの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第１光量と、試料から進行してくる４２０〜４４０ｎｍの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第２光量と、に基づいて測定することもできる。この場合、グリコヘモグロビン濃度は、上記第１光量に基づいてオキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出する一方で、上記第２光量に基づいてデオキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出し、かつ、オキシヘモグロビン濃度とデオキシヘモグロビン濃度とを合算し、あるいはオキシヘモグロビン濃度に相関する値とデオキシヘモグロビン濃度に相関する値とを合算することで演算することができる。

本発明のグリコヘモグロビン濃度方法が液体クロマトグラフィを利用したものである場合において、上記第１光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すオキシヘモグロビンに対応した第１クロマトグラムと、第２光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すデオキシヘモグロビンに対応した第２クロマトグラムと、を重ね合わせたクロマトグラムに基づいて、クリコヘモグロビン濃度を演算するようにしてもよい。

上記試料は、たとえば血球を溶血させものである。

本発明の第２の側面では、光源からの光を試料に照射し、そのときに試料から進行してくる光を受光部において受光する測光機構を備えたグリコヘモグロビン濃度測定装置であって、上記測光機構は、４００〜４５０ｎｍの波長範囲にピーク波長を有する複数の波長の光を区別して、受光部において受光させることができるように構成されていることを特徴とする、グリコヘモグロビン濃度測定装置が提供される。

好ましくは、受光部は、少なくとも４１５〜４３０ｎｍの波長範囲における異なるピーク波長の光を連続的または間欠的を受光できるように構成される。

本発明は、液体クロマトグラフィを利用したグリコヘモグロビン濃度の測定装置に適用することができる。この場合のグリコヘモグロビン濃度測定装置は、波長と溶離時間と検出量とを変数とする３次元クロマトグラムに基づいて、グリコヘモグロビン濃度を演算するように構成された演算部をさらに備えたものとされる。

演算部は、たとえば上記３次元クロマトグラムでのヘモグロビン総量に対応する体積または積算値おけるグリコヘモグロビンに対応する体積または積算値が占める割合としてグリコヘモグロビン濃度を演算するように構成されている。より具体的には、演算部は、たとえば上記３次元クロマトグラムに基づいて得られる溶離時間と検出量のピーク値とを変数とする２次元クロマトグラムにおいて、ヘモグロビン総量に対応する面積おけるグリコヘモグロビンに対応する面積が占める割合としてグリコヘモグロビン濃度を演算するように構成される。演算部はまた、各ピーク波長における溶離時間と検出量とを変数とするクロマトグラムからグルコヘモグロビンの割合を演算するとともに、各ピーク波長におけるグルコヘモグロビンの割合を平均することによりグリコヘモグロビン濃度を演算するように構成してもよく、各ピーク波長におけるヘモグロビンの検出量のピーク値と、溶離時間と、の２次元クロマトグラムにおいて、ヘモグロビン総量に対応する面積おけるグリコヘモグロビンに対応する面積が占める割合として演算するように構成することもできる。

本発明のグリコヘモグロビン濃度測定装置は、試料から進行してくる４００〜４２０ｎｍの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第１光量と、試料から進行してくる４２０〜４４０ｎｍの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第２光量と、に基づいて、グリコヘモグロビン濃度を演算する演算部を備えたものとすることもできる。演算部は、たとえば上記第１光量に基づいてオキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出する一方で、上記第２光量に基づいてデオキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出し、かつ、上記オキシヘモグロビン濃度と上記デオキシヘモグロビン濃度とを合算し、あるいは上記オキシヘモグロビン濃度に相関する値と上記デオキシヘモグロビン濃度に相関する値とを合算してヘモグロビン濃度を演算するように構成される。

本発明のグリコヘモグロビン濃度装置が液体クロマトグラフィを利用したものである場合において、演算部は、上記第１光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すオキシヘモグロビンに対応した第１クロマトグラムと、上記第２光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すデオキシヘモグロビンに対応した第２クロマトグラムと、を重ね合わせたクロマトグラムに基づいて、クリコヘモグロビン濃度を演算するように構成してもよい。

上記試料は、たとえば血球を溶血させものである。

本発明の第１の実施の形態に係るグリコヘモグロビン測定装置の一例であるＨＰＬＣ装置を示す概略構成図である。 図１に示したＨＰＬＣ装置における測光機構を説明するための断面図である。 図1に示したＨＰＬＣ装置の要部を示すブロック図である。 図１に示したＨＰＬＣ装置の動作を説明するためのフローチャートである。 図1に示したＨＰＬＣ装置における演算回路での濃度測定処理を説明するためのフローチャートである。 演算回路において得られる３次元クロマトグラムの一例である。 本発明の第２の実施の形態における演算回路での濃度測定処理を説明するためのフローチャートである。 図８Ａは特定時間における測定波長と吸光度との関係を示すグラフであり、図８Ｂは特定時間における最大吸光度により作成した２次元クロマトグラムである。 本発明の第３の実施の形態における演算回路での濃度測定処理を説明するためのフローチャートである。 測定波長が４１５ｎｍの場合（１点鎖線、）、測定波長が４３０ｎｍの場合（鎖線）、および測定波長が４１５ｎｍのときの吸光度と４３０ｎｍのときの吸光度とを合算した場合（実線）の２次元クロマトグラムである。 実施例１における環境温度とグリコヘモグロビン濃度と関係を示すグラフである。 比較例１における環境温度とグリコヘモグロビン濃度と関係を示すグラフである。 従来のグリコヘモグロビン測定装置の一例であるＨＰＬＣ装置を示す概略構成図である。 図１３に示したＨＰＬＣ装置における測光機構を説明するための断面図である。 図１３に示したＨＰＬＣ装置において得られるクロマトグラムの一例である。

符号の説明

Ｘ ＨＰＬＣ装置（グルコヘモグロビン測定装置）
５ 測光機構
５１ （測光機構の）光源
５３Ｂ （測光機構の）受光素子（受光部）
６１ 演算部

以下においては、本発明の第１ないし第３の実施の形態について、図面を参照して具体的に説明する。

まず、本発明の第１の実施の形態について、図１ないし図６を参照して説明する。

図１に示したＨＰＬＣ装置Ｘは、本発明のグリコヘモグロビン濃度測定装置の一例に相当するものであり、全血を用いてグリコヘモグロビン濃度を測定するように構成されたものである。このＨＰＬＣ装置Ｘは、複数の溶離液ボトル１０，１１，１２（図面上は３つ）、脱気装置２、試料調製ユニット３、分析ユニット４、測光機構５および演算回路６を備えている。

各溶離液ボトル１０，１１，１２は、後述する分析カラム４０に供給すべき溶離液を保持したものである。溶離液としては、たとえばｐＨや塩濃度の異なるバッファが使用される。

脱気装置２は、分析ユニット４（分析カラム４０）に溶離液を供給する前に、溶離液から溶存気体を除去するためのものであり、配管７０Ａ，７０Ｂ，７０Ｃを介して溶離液ボトル１０，１１，１２に、配管７１Ａ，７１Ｂ，７１Ｃを介して分析ユニット４のマニホールド４１に連結されている。

図１に示したように、試料調製ユニット３は、採血管１３から採取した血球成分から、分析カラム４０に導入する試料を調製するためのものである。この試料調製ユニット３は、サンプリングノズル３０、調製液タンク３１および希釈槽３２を有している。

サンプリングノズル３０は、採血管１３の血液試料１４をはじめとする各種の液体を採取するためのものであり、液体の吸引・吐出が可能であるとともに、上下方向および水平方向に移動可能とされている。このサンプリングノズル３０の動作は、図外の制御手段によって制御されている。

調製液タンク３１は、血液試料１４をもとに、分析カラム４０に導入する導入用試料を調製するための調製液を保持したものである。この調製液タンク３１には、調製液として、赤血球の溶血させるための溶血液、溶血液を希釈するための希釈液などが保持されている。

希釈槽３２は、血液試料１４中の赤血球を溶血させ、かつ溶血液を希釈して導入用試料を調製する場を提供するためのものである。この希釈槽３２は、後述する分析ユニット４におけるインジェクションバルブ４３に配管７２を介して接続されており、希釈槽３２において調製された導入用試料がインジェクションバルブ４３を介して分析カラム４０に導入できるように構成されている。

分析ユニット４は、分析カラム４０の充填剤に対する生体成分の吸着・溶離をコントロールし、各種の生体成分を測光機構５に供するためのものであり、図外の温調機構により温度コントロールされている。分析ユニット４における設定温度は、たとえば４０℃程度とされる。分析カラム４０は、試料中のヘモグロビンを選択的に吸着させるための充填剤を保持させたものである。充填剤としては、たとえばメタクリル酸エステル共重合体が使用される。

分析ユニット４は、分析カラム４０の他に、マニホールド４１、送液ポンプ４２、およびインジェクションバルブ４３を有している。

マニホールド４１は、複数の溶離液ボトル１０，１１，１２のうちの特定の溶離液ボトル１０，１１，１２から、インジェクションバルブ４３に対して選択的に溶離液を供給させるためのものである。このマニホールド４１は、配管７１Ａ，７１Ｂ，７１Ｃを介して脱気装置２に接続され、配管７３を介してインジェクションバルブ４３に接続されている。

送液ポンプ４２は、インジェクションバルブ４３を介して溶離液を分析カラム４０に移動させるための動力を付与するためのものであり、配管７３の途中に設けられている。送液ポンプ４２は、たとえば溶離液の流量が１．０〜２．０ｍｌ／ｍｉｎとなるように動作させられる。

インジェクションバルブ４３は、一定量の導入用試料を採取するとともに、その導入用試料を分析カラム４０に導入可能とするものであり、複数の導入ポートおよび排出ポート（図示略）を備えている。このインジェクションバルブ４３には、インジェクションループ４４が接続されている。このインジェクションループ４４は、一定量（たとえば数μＬ）の液体を保持可能なものであり、インジェクションバルブ４３を適宜切り替えることにより、インジェクションループ４４が希釈槽３２と連通して希釈槽３２からインジェクションループ４４に導入用試料が供給される状態、インジェクションループ４４が配管７４を介して分析カラム４０と連通してインジェクションループ４４から導入用試料が分析カラム４０に導入される状態、あるいはインジェクションループ４４に図外の洗浄槽から洗浄液が供給される状態を選択することができる。このようなインジェクションバルブ４３としては、たとえば六方バルブを使用することができる。

図２に示したように、測光機構５は、分析カラム４０からの溶離液に含まれるヘモグロビンを光学的に検出するためのものであり、測光セル５０、光源５１、ビームスプリッタ５２、測定用受光系５３および参照用受光系５４を有している。

測光セル５０は、測光エリアを規定するためのものである。この測光セル５０は、導入流路５０Ａ、測光流路５０Ｂおよび排出流路５０Ｃを有しており、これらの流路５０Ａ，５０Ｂ，５０Ｃが一連に連通している。導入流路５０Ａは、分析カラム４０（図１参照）からの溶離液を測光流路５０Ｂに導入するためのものであり、分析カラム４０に配管７５を介して接続されている。測光流路５０Ｂは、測光対象となる溶離液を流通させ、かつ溶離液を測光するための場を提供するものであり、直線状に形成されている。この測光流路５０Ｂは、両端が開放しているとともに、両端部が透明カバー５５により塞がれている。排出流路５０Ｃは、測光流路５０Ｂの溶離液を排出するためのものであり、配管７６を介して廃液槽１５に接続されている（図１参照）。

光源５１は、測光流路５０Ｂを流通する溶離液に光を照射するためのものである。この光源５１は、光軸Ｌが測光流路５０Ｂの中心を通過するように、測光流路５０Ｂの端面５０Ｂａ（透明カバー５５）に対面した状態で配置されている。光源５１は、後述する演算部６１（図３参照）における濃度演算手法に応じて出射可能な波長範囲が選択されるものであってもよいが、通常は、４００〜５００ｎｍの波長範囲の光を出射可能なもの、たとえばハロゲンランプが使用されている。もちろん、光源５１としては、ハロゲンランプ以外のもの、たとえば１または複数のＬＥＤ素子を備えたものを使用することもできる。

ビームスプリッタ５２は、光源５１から出射された光のうち、測光流路５０Ｂを透過した光を分割して測定用受光系５３および参照用受光系５４に入射させるためのものであり、光軸Ｌ上において、４５度傾斜した状態で配置されている。ビームスプリッタ５２としては、ハーフミラーなどの公知の種々のものを使用することができる。

測定用受光系５３は、ビームスプリッタ５２を透過した光のうち、目的とする波長の光を選択的に受光するものであり、光軸Ｌ上に配置されている。この測定用受光系５３は、波長選択部５３Ａと、この波長選択部５３Ａを透過した光を受光するための受光素子５３Ｂと、を備えている。波長選択部５３Ａは、後述する演算部６１（図３参照）における濃度演算手法に応じて透過させるべき光の波長を選択するものである。この波長選択部５３Ａとしては、干渉フィルタ、シャープカットフィルタおよびクレーディングなどの公知の分光手段を採用することができる。受光素子５３Ｂとしては、フォトダイオードを使用することができる。

参照用受光系５４は、分析カラム４０（図１参照）からの溶離液の濁度や散乱の影響を抑制するためのデータを取得するためのものであり、ビームスプリッタ５２において反射して光路が変えられた光のうち、参照波長である５００ｎｍの光を選択的に受光するものである。この測定用受光系７４は、５００ｎｍの光を選択的に透過させる干渉フィルタ５４Ａと、干渉フィルタ５４Ａを透過した光を受光するための受光素子５４Ｂと、を備えている。受光素子５４Ｂとしては、フォトダイオードを使用することができる。

図３に示したように、演算回路６は、制御部６０および演算部６１を備えている。

制御部６０は、各部の動作を制御するためのものである。より具体的には、制御部６０は、光源５１の点灯・消灯を制御し、波長選択部５３Ａを制御して受光素子５３Ｂにおいて受光させる光の波長を選択し、あるいは演算部６１における濃度演算処理を制御する。

演算部６１は、受光素子５３Ｂ，５４Ｂでの受光結果に基づいて、全血中のグリコヘモグロビン濃度を演算するためのものである。この演算部６１は、演算に必要なプログラムを記憶したものであり、その動作は制御部６０によって制御される。

次に、ＨＰＬＣ装置Ｘの動作について、図１ないし図３に加えて、図４に示したフローチャートを参照しつつ説明する。

ＨＰＬＣ装置Ｘにおいては、測定開始の指示が確認された場合には（Ｓ１）、分析カラム４０に対して溶離液を供給する（Ｓ２）。溶離液は、送液ポンプ４２の動力により、溶離液ボトル１０，１１，１２から脱気装置２、マニホールド４１を介してインジェクションバルブ４３に供給され、また複数の溶離液ボトル１０，１１，１２のうちのいずれの溶離液ボトル１０，１１，１２の溶離液を供給するかは、マニホールド４１を制御することによって選択される。インジェクションバルブ４３に供給された溶離液は、配管７４を介して分析カラム４０に供給される。

ＨＰＬＣ装置Ｘにおいてはさらに、分析カラム４０に導入すべき導入用試料を調製する（Ｓ３）。導入用試料の調製に当たっては、まず採血管１３から血液試料１４を採取する。採血管１３からの血液試料１４の採取は、サンプリングノズル３０を動作させることにより行なわれる。サンプリングノズル３０によって採取された血液試料１４は、サンプリングノズル３０を動作させることによって希釈槽３２に供給される。希釈槽３２にはさらに、調製液タンク３１から溶血剤および希釈液が順次供給され、サンプリングノズル３０を利用したピペッティング操作によって希釈槽３２内の液体を混合することによって導入用試料が調製される。

導入用試料は、分析カラム４０に導入される（Ｓ４）。分析カラム４０に対する導入用試料の導入は、インジェクションバルブ４３の切替操作を行うことにより、インジェクションループ４４の導入用試料が溶離液とともに分析カラム４０に導入される。分析カラム４０においては、導入用試料が導入されることにより、充填剤にグリコヘモグロビンが吸着する。充填剤にグリコヘモグロビンを吸着させた後においては、マニホールド４１によって、分析カラム４０に供給する溶離液の種類を適宜切り替え、充填剤に吸着したグリコヘモグロビンを溶離させる。

一方、導入用試料の導入開始から一定時間経過した場合には、インジェクションバルブ４３の切替操作を行うことにより、分析カラム４０に対して引き続き溶離液を供給するとともに、インジェクションループ４４の洗浄を行なう（Ｓ５）。一方、インジェクションループ４４の洗浄と同時的に、先に説明したのと同様にして、先とは異なる採血管１３の血液試料１４から導入用試料を調製し（Ｓ３）、インジェクションループ４４の洗浄後においては、再び導入用試料をインジェクションループ４４に導入する（Ｓ４）。このような導入用試料の調製（Ｓ３）、導入（Ｓ４）、洗浄（Ｓ５）は、インジェクションバルブ４３を適宜切り替えつつ、測定対象となる採血管１３（血液試料１４）の数に応じて繰り返し行なわれる。

分析カラム４０から排出されるグリコヘモグロビンを含む溶離液は、配管７６を介して測光機構５の測光セル５０に供給され、測光される（Ｓ６）。測光セル５０に対しては、配管７５および導入流路５０Ａを介して溶離液が導入され、この溶離液は測光流路５０Ｂおよび排出流路５０Ｃを通過した後に、配管７６を介して廃液槽１５に導かれる。

測光機構５においては、分析カラム４０からの溶離液が測光流路５０Ｂを通過する際に、光源５１によって溶離液に対して連続的に光が照射される。その一方で、測光流路５０Ｂを透過した光は、ビームスプリッタ５２において分割された後、測定用受光系５３および参照用受光系５４において受光される。測定用受光系５３では、波長選択部５３Ａを透過した特定波長の光が受光素子５３Ｂにおいて選択的に受光される。一方、参照用受光系５４では、干渉フィルタ５４Ａを透過した参照波長である５００ｎｍの光が受光素子５４Ｂにおいて選択的に受光される。

受光素子５３Ｂ，５４Ｂでの受光結果は、演算回路６に出力され、この演算回路６においてグリコヘモグロビンの濃度が演算される（Ｓ７）。

演算回路６における濃度演算処理は、図５に示したフローチャートの手順にしたがって行なわれる。

まず、４００〜４５０ｎｍ、好ましくは４１５〜４３０ｎｍの波長範囲から選択された複数の波長について、各波長ごとに特定時間ごとに測光を行なう（Ｓ１０）。より具体的には、光源５１から連続的に光を出射する一方で、制御部６０によって波長選択部５３Ａを制御し、受光素子５３Ｂにおいて受光される光の波長を、上記波長範囲において経時的に変化させる。すなわち、受光素子５３Ｂにおいて受光される光の波長は、連続的または間欠的に変化させられる。なお、上記波長範囲で波長変化させた測光は繰り返し行なわれる。

図６には、波長を間欠的に変化させた場合の例を示したが、上記時間範囲を同一時間として取り扱った場合には、各測定波長ごとに２次元クロマトグラムが得られ、測定波長をも変数すれば、溶離時間、吸光度および測定波長を変数とする３次元クロマトグラムが得られる。なお、図６では、測定波長の間隔を比較的に大きく設定しているが、実際には、測定波長の間隔は、極めて小さく（たとえば０．１〜２ｎｍ）、波長を変数のとする場合のプロット点は離散的ではなく、もっと連続的なものとなる。

次いで、同一時間における各波長でのヘモグロビンに相当する吸光度を積算する（Ｓ１１）。すなわち、図６の３次元クロマトグラムにおけるヘモグロビンに相当する部分の体積を、各測定波長での２次元クロマトグラムにおけるヘモグロビンに相当する部分の面積の積算値として演算する。

次いで、同一時間における各波長でのグリコヘモグロビンに相当する吸光度を積算する（Ｓ１２）。すなわち、図６の３次元クロマトグラムにおけるグリコヘモグロビンに相当する部分の体積を、各測定波長での２次元クロマトグラムにおけるヘモグロビンに相当する部分の面積の積算値として演算する。

次いで、ヘモグロビン総量に対するグリコヘモグロビンの比率を演算する（Ｓ１３）。すなわち、図６における３次元ヘモグロビン総量に相当する体積（積算値）のうち、グリコヘモグロビンに相当する体積（積算値）の割合を演算し、それをグリコヘモグロビン濃度（％）とする。

Ｓ１３における演算が終了した場合には、図４におけるＳ７に戻る（Ｓ１４）。すなわち、演算回路６での演算結果は、図外の表示パネルに表示され、また自動的あるいは使用者のボタン操作によってプリントアウトされる（Ｓ８）。

本実施の形態では、オキシヘモグロビンの最大吸収波長である４１５ｎｍおよびデオキシヘモグロビンの最大吸収波長である４３０ｎｍを含む波長範囲において、連続的または間欠的に波長を変化させたときの吸光度変化に基づいて、グリコヘモグロビン濃度を演算している。すなわち、本発明は、オキシヘモグロビンに主体的に着目してグリコヘモグロビン濃度を演算するのではなく、デオキシヘモグロビンの影響をも勘案してグリコヘモグロビンの濃度を演算している。そのため、溶離液中の溶存気体の状態が変動してヘモグロビン中のオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンとの比率が変動し、あるいは分析カラム４０に導入する導入用試料におけるオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンとの比率が変動した場合であっても、その影響を受けることもない。その結果、本実施の形態では、ＨＰＬＣ装置Ｘの外部の温度（環境温度）が変動する環境下や環境温度が異なる状態でグリコヘモグロビン濃度を測定する場合、あるいは分析カラムに導入する試料における酸素濃度のバラツキが生じる場合であっても、溶離液におけるオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンとの比率に関係なく、安定したグリコヘモグロビン濃度の測定が可能となる。

なお、グリコヘモグロビン濃度の算出は、たとえば各測定波長での２次元クロマトグラムに基づいてヘモグロビン総量におけるグリコヘモグロビンが占める割合をそれぞれ演算するとともに、各測定波長でのグリコヘモグロビンの割合の平均値を算出し、その平均値をグリコヘモグロビン濃度としてもよい。

次に、本発明の第２の実施の形態について、図３、図７および図８を参照して説明する。

本実施の形態は、図７に示したように、演算回路６における濃度演算処理の手法が、先の実施の形態とは異なっている。

まず、４００〜４５０ｎｍ、好ましくは４１５〜４３０ｎｍの波長範囲から選択された複数の波長において、特定時間ごとに測光を行なう（Ｓ２０）。この点については、第１の実施に形態におけるＳ１０（図５参照）と同様である。測定波長を連続的あるいは間欠的に変化させた場合には、図８Ａに示したように各時間ごとに測定波長と吸光度との関係を示すグラフが得られる。

次いで、同一時間における最大吸光度（ｍａｘ）を選択し、図８Ｂに示すような溶離時間と最大吸光度との関係を示す２次元クロマトグラムを得る（Ｓ２１）。

次いで、図８Ｂに示した２次元クロマトグラムから、ヘモグロビン総量に相当する面積に対するグリコヘモグロビン量に対応する面積としてグリコヘモグロビン濃度（％）を演算する（Ｓ２２）。

Ｓ２２における処理が終了した場合には、図４におけるＳ７に戻り（Ｓ２３）、演算回路６での演算結果が、図外の表示パネルなどに出力される（Ｓ８）。

本実施の形態では、測定波長として、オキシヘモグロビンの最大吸収波長である４１５ｎｍおよびデオキシヘモグロビンの最大吸収波長である４３０ｎｍを含む波長範囲を利用しているとともに、それらの波長範囲において測定される最大吸光度によってグリコヘモグロビン濃度を演算している。そのため、本発明の第１の実施の形態の場合と同様に、分析カラム４０からの溶離液におけるオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンとの比率に関係なく、安定したグリコヘモグロビン濃度の測定が可能となる。

次に、本発明の第３の実施の形態について、図３、図９および図１０を参照して説明する。

本実施の形態は、図９に示したように、演算回路６における濃度演算処理の手法が、先の実施の形態とは異なっている。

まず、４１５ｎｍおよび４３０ｎｍにおいて特定時間ごとに測光を行なう（Ｓ３０）。より具体的には、光源５１から連続的に光を出射する一方で、制御部６０によって波長選択部５３Ａを制御し、受光素子５３Ｂにおいて受光される光の波長を、４１５ｎｍと４３０ｎｍとの間で交互に切り替える。このような測定波長の切り替えは、繰り返し行なわれる。その結果、図１０に示したように、測定波長を４１５ｎｍとしたときのオキシヘモグロビン基準の２次元クロマトグラム（図１０の一点鎖線）と、測定波長を４３０ｎｍとしたときのデオキシヘモグロビン基準の２次元クロマトグラム（図１０の鎖線）が、溶離時間と吸光度との関係として得られる。

次いで、測定波長を４１５ｎｍとしたときのオキシヘモグロビン基準の２次元クロマトグラム（図１０の一点鎖線）からグリコヘモグロビン濃度を演算する（Ｓ３１）。

次いで、測定波長を４３０ｎｍとしたときのデオキシヘモグロビン基準の２次元クロマトグラム（図１０の鎖線）からグリコヘモグロビン濃度を演算する（Ｓ３２）。

次いで、測定波長を４１５ｎｍとしたときの濃度演算結果と測定波長を４３０ｎｍとしたときの濃度演算結果とを合算し、それをグリコヘモグロビン濃度とする（Ｓ３３）。

Ｓ３３における処理が終了した場合には、図４におけるＳ７に戻り（Ｓ３４）、演算回路６での演算結果が、図外の表示パネルなどに出力される（Ｓ８）。

本実施の形態では、測定波長として、オキシヘモグロビンの最大吸収波長である４１５ｎｍの測定結果とデオキシヘモグロビンの最大吸収波長と４３０ｎｍの測定結果を合算してグリコヘモグロビン濃度を演算している。そのため、本発明の第１の実施の形態の場合と同様に、分析カラム４０からの溶離液におけるオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンとの比率に関係なく、安定したグリコヘモグロビン濃度の測定が可能となる。

本実施の形態では、グリコヘモグロビン濃度は、測定波長が４１５ｎｍのときのクロマトグラムと４３０ｎｍのときのクロマトグラムとを合算して得られるクロマトグラム（図１０の実線）に基づいて演算してもよい。

また、オキシヘモグロビン基準のクロマトグラムを得るときの測定波長は、４１５ｎｍに限らず、４００〜４２０ｎｍの波長範囲から選択すればよく、デオキシヘモグロビン基準のクロマトグラムを得るときの測定波長は、４３０ｎｍに限らず、４２０〜４４０ｎｍの範囲から選択すればよい。

本発明は、先に説明した実施の形態には限定されず、種々に変更可能である。たとえば、 先に説明した濃度演算処理においては、ヘモグロビン量が吸光度として取得されていたが、ヘモグロビン量は、必ずしも吸光度として取得する必要はなく、透過率として、あるいは単に受光量として取得してもよい。

また、測光機構５において複数の測定波長の光を区別して認識する方法としては、１つの受光素子５３Ｂによって行なう場合の他、測定波長の数に応じた受光素子を設け、あるいは受光エリアを有する発光素子を用いる方法であってもよい。

測光機構５における測定用受光系５３の受光素子５３Ｂに受光させる光の波長（測定波長）を選択する方法としては、測定用受光系５３において波長選択部５３Ａを設ける構成を採用していたが、波長選択部を光源５１と測光セル５０との間に配置した構成を採用することもできる。

本発明はさらに、血液中のグリコヘモグロビン濃度を測定するためのＨＰＬＣ装置に限らず、血液以外の検体を用いる場合、あるいはＨＰＬＣ装置以外の液体クロマトグラフィ装置その他のグリコヘモグロビン濃度測定装置に対しても適用することができる。

（実施例１）
本実施例では、測定波長を変化させてグリコヘモグロビン濃度を測定した場合に、環境温度が測定値に与える影響について検討した。

グリコヘモグロビンの濃度は、環境温度を１０℃、２０℃および３０℃とした場合について、グリコヘモグロビン測定装置（「ＡＤＡＭＳ Ａ１ｃ ＨＡ−８１６０」；アークレイ株式会社製）において、受光素子としてフォトダイオードアレイ（「紫外可視多波長検出器 ＭＤ−９１０」；日本分光株式会社製）を採用したものを用いて行った。グリコヘモグロビン濃度は、４１５〜４３０ｎｍの波長範囲において、１ｎｍ毎にヘモグロビン総量およびグリコヘモグロビン量をそれぞれ測定した上で、先の波長範囲におけるヘモグロビン総量の積算値に対するグリコヘモグロビンの積算値が占める割合として演算した。

検体としては、健常人から採取した血液（健常人検体）および糖尿病患者から採取した血液（糖尿患者血液）を用いた。グリコヘモグロビンの測定結果については下記表１および図１１に示した。

（比較例１）
本比較例では、測定波長をオキシヘモグロビンの最大吸収波長である４１５ｎｍに固定してグリコヘモグロビン濃度を測定した場合に、環境温度が測定値に与える影響について検討した。

グリコヘモグロビンの濃度は、測定波長を固定した以外は基本的には実施例１と同様な条件において測定し、グリコヘモグロビン総量におけるグリコヘモグロビン量が占める割合として演算した。グリコヘモグロビンの測定結果については下記表２および図１２に示した。

比較例１のように、測定波長をオキシヘモグロビンの最大吸収波長である４１５ｎｍに固定してグリコヘモグロビンを測定した場合には、表２および図１２から分かるように、環境温度が高くなるほど測定値が大きくなり、測定値が環境温度の影響を大きく受けていた。

これに対して、実施例１のように、測定波長をオキシヘモグロビンの最大吸収波長（４１５ｎｍ）からデオキシヘモグロビンの最大吸収波長（４３０ｎｍ）の間で変化させたときの積算値によりグリコヘモグロビン濃度を演算した場合には、表１および図１１から分かるように、環境温度が１０〜３０℃の範囲で変化したとしても、測定値が環境温度の影響をさほど受けておらず、略一定値となった。

このことから、測定波長をオキシヘモグロビンの最大吸収波長（４１５ｎｍ）からデオキシヘモグロビンの最大吸収波長（４３０ｎｍ）の間で変化させたときの積算値によりグリコヘモグロビン濃度を演算した場合には、環境温度（溶離液の溶存酸素濃度）や試料の溶存酸素濃度の影響を受けることなく、正確かつ安定したグリコヘモグロビン濃度の測定が可能であることが分かる。

Claims (20)

1. 試料に対して光を照射したときに試料から進行してくる光に基づいてグリコヘモグロビン濃度を測定する方法であって、
   ４００〜４５０ｎｍの波長範囲にピーク波長を有する複数の測定波長の光に基づいてグリコヘモグロビンの濃度を測定する、グリコヘモグロビン濃度測定方法。
2. 試料から進行してくる光のうち、少なくとも４１５〜４３０ｎｍの波長範囲における異なるピーク波長の光を連続的または間欠的に受光してグリコヘモグロビン濃度を測定する、請求項１に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。
3. 液体クロマトグラフィを利用したグリコヘモグロビン濃度の測定方法において、
   測定波長、溶離時間、および検出量を変数とする３次元クロマトグラムに基づいて、グリコヘモグロビン濃度を演算する、請求項１に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。
4. グリコヘモグロビン濃度は、上記３次元クロマトグラムでのヘモグロビン総量に対応する体積または積算値おけるグリコヘモグロビンに対応する体積または積算値が占める割合として演算される、請求項３に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。
5. グリコヘモグロビン濃度は、各測定波長における溶離時間と検出量とを変数とするクロマトグラムからグルコヘモグロビンの割合を演算するとともに、各測定波長におけるグルコヘモグロビンの割合を平均することにより演算される、請求項３に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。
6. グリコヘモグロビン濃度は、各測定波長におけるヘモグロビンの検出量のピーク値と、溶離時間と、の２次元クロマトグラムにおいて、ヘモグロビン総量に対応する面積おけるグリコヘモグロビンに対応する面積が占める割合として演算される、請求項３に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。
7. 試料から進行してくる４００〜４２０ｎｍの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第１光量と、試料から進行してくる４２０〜４４０ｎｍの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第２光量と、に基づいて、グリコヘモグロビン濃度を測定する、請求項１に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。
8. 上記第１光量に基づいてオキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出する一方で、上記第２光量に基づいてデオキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出し、かつ、
   上記オキシヘモグロビン濃度と上記デオキシヘモグロビン濃度とを合算し、あるいは上記オキシヘモグロビン濃度に相関する値と上記デオキシヘモグロビン濃度に相関する値とを合算して演算される値をヘモグロビン濃度とする、請求項７に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。
9. 液体クロマトグラフィを利用したグリコヘモグロビン濃度の測定方法において、
   上記第１光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すオキシヘモグロビンに対応した第１クロマトグラムと、上記第２光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すデオキシヘモグロビンに対応した第２クロマトグラムと、を重ね合わせたクロマトグラムに基づいて、クリコヘモグロビン濃度を演算する、請求項７に記載のクリコヘモグロビン濃度測定方法。
10. 上記試料は、血球を溶血させものである、請求項１に記載のグリコヘモグロビン濃度測定方法。
11. 光源からの光を試料に照射し、そのときに試料から進行してくる光を受光部において受光する測光機構を備えたグリコヘモグロビン濃度測定装置であって、
    上記測光機構は、４００〜４５０ｎｍの波長範囲にピーク波長を有する複数の測定波長の光を区別して、受光部において受光させることができるように構成されている、グリコヘモグロビン濃度測定装置。
12. 上記受光部は、少なくとも４１５〜４３０ｎｍの波長範囲における異なるピーク波長の光を連続的または間欠的を受光できるように構成されている、請求項１１に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。
13. 液体クロマトグラフィを利用したグリコヘモグロビン濃度の測定装置において、
    測定波長、溶離時間および検出量を変数とする３次元クロマトグラムに基づいて、グリコヘモグロビン濃度を演算するように構成された演算部をさらに備えている、請求項１１に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。
14. 上記演算部は、上記３次元クロマトグラムでのヘモグロビン総量に対応する体積または積算値おけるグリコヘモグロビンに対応する体積または積算値が占める割合としてグリコヘモグロビン濃度を演算するように構成されている、請求項１３に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。
15. 上記演算部は、各測定波長における溶離時間と検出量とを変数とするクロマトグラムからグルコヘモグロビンの割合を演算するとともに、各測定波長におけるグルコヘモグロビンの割合を平均することによりグリコヘモグロビン濃度を演算するように構成されている、請求項１３に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。
16. 上記演算部は、各ピーク波長におけるヘモグロビンの検出量のピーク値と、溶離時間と、の２次元クロマトグラムにおいて、ヘモグロビン総量に対応する面積おけるグリコヘモグロビンに対応する面積が占める割合として演算するように構成されている、請求項１３に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。
17. 試料から進行してくる４００〜４２０ｎｍの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第１光量と、試料から進行してくる４２０〜４４０ｎｍの波長範囲にピーク波長を有する光の量である第２光量と、に基づいて、グリコヘモグロビン濃度を演算する演算部をさらに備えている、請求項１１に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。
18. 上記演算部は、上記第１光量に基づいてオキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出する一方で、上記第２光量に基づいてデオキシヘモグロビン濃度またはこの濃度に相関する値を算出し、かつ、上記オキシヘモグロビン濃度と上記デオキシヘモグロビン濃度とを合算し、あるいは上記オキシヘモグロビン濃度に相関する値と上記デオキシヘモグロビン濃度に相関する値とを合算してヘモグロビン濃度を演算するように構成されている、請求項１７に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。
19. 液体クロマトグラフィを利用したグリコヘモグロビン濃度の測定装置において、
    上記演算部は、上記第１光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すオキシヘモグロビンに対応した第１クロマトグラムと、上記第２光量に基づいて得られる溶離時間と検出量との関係を示すデオキシヘモグロビンに対応した第２クロマトグラムと、を重ね合わせたクロマトグラムに基づいて、クリコヘモグロビン濃度を演算する、請求項１７に記載のクリコヘモグロビン濃度測定装置。
20. 上記試料は、血球を溶血させものである、請求項１１に記載のグリコヘモグロビン濃度測定装置。
    
    

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