JPWO2006059714A1 - 骨疾患の予防及び／又は治療用組成物、その組成物を含有する機能性食品もしくは健康食品、並びにその組成物を有効成分とする医薬製剤 - Google Patents

骨疾患の予防及び／又は治療用組成物、その組成物を含有する機能性食品もしくは健康食品、並びにその組成物を有効成分とする医薬製剤 Download PDF

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Abstract

天然物由来のフェニルプロパノイド二量体化合物を有効成分とする骨疾患の予防及び／又は治療作用を有する医薬品、機能性食品又は健康食品の提供を目的とする。少なくとも１種以上の下記式（Ｉ）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物を含有してなる上記医薬品等を提供する。（式中、Ｒ'1、Ｒ'2、及びＲ'3は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又は炭素数１〜３のアルコシキシ基を表す。Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数３〜５のアルケニル基を表す。）。

Description

本発明は、生薬成分由来のフェニルプロパノイド二量体化合物のうち、下記式（Ｉ）で表されるフェニルプロパノイド二量体化合物の用途に関する。より詳細には、下記式（II）又は（III）で表されるフェニルプロパノイド二量体化合物、又は生理学的に許容されるこれらの塩若しくは水和物を少なくとも１種以上含有してなる健康食品、機能性食品、骨疾患の予防及び／又は治療効果を有する医薬組成物、並びに前記医薬組成物を有効成分として含有する医薬製剤に関する。
（式中、Ｒ'1、Ｒ'2、及びＲ'3は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又は炭素数１〜３のアルコシキシ基を表す。Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数３〜５のアルケニル基を表す。）。
又は
（式中、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ8及びＲ10はそれぞれ水素原子、又は炭素数１〜３のアルキル基からなる群から選ばれる基を表す。また、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ9及びＲ11は、炭素数３〜５のアルケニル基を表す。）。
骨疾患は、外傷性骨折や疲労骨折等の外因性疾患と、骨多孔症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、高副甲状腺ホルモン（以下、「PTH」ということがある。）血症、骨ページェット病、関節炎、リウマチ、乳ガンの骨転移、骨軟化症、悪性腫瘍その他の疾病に起因する骨組織の脆弱化、及び栄養障害による骨組織の脆弱化に大別される。
ヒトの骨は、骨芽細胞と破骨細胞とによる再形成と吸収とを絶えず繰り返している。このため、骨芽細胞による骨形成を破骨細胞による骨吸収が上回ったときに、骨組織の脆弱化が生じて上記のような骨多孔症や骨粗鬆症をはじめとする内因性の骨疾患が生じるといわれている。
こうした内因性の骨疾患の中でも、骨多孔症や骨粗鬆症は高齢化社会の進展に伴って増加しつつある。また、食生活の変化と運動量の低下に伴って、カルシウムの摂取量の低下や骨組織への定着率の低下が生じ、骨組織の脆弱化が加速されている。
骨折は、骨組織のある部分の連絡が外力によって断たれた状態をいい、骨折部位に著明な疼痛を伴う。健常人の場合には、例えば、交通事故等によってかなり大きな外力がかからない限り骨折は起こらないが、骨量が低下して骨組織が弱くなると、歩いたり走ったりしている最中にころんだ等、さほど大きくない外力がかかっただけでも骨折が起こる。また、上記のような骨粗鬆症や骨多孔症等の内因性の疾患に起因して骨量が低下している場合には、階段で躓いたり、咳込んだりしたときにかかるわずかな外力によっても骨折が生じるようになる。
骨折が起こると、一般的には、ずれている骨の位置を牽引等によって修正し、ボルトやピンで固定できる場合には固定し、その後は患者の自然治癒力に委ねるという治療方法が採用されている。
一方、骨多孔症や骨粗鬆症の内因性の疾患では骨の石灰質と骨基質とがともに減少しているため自然治癒が遅れ、高齢者の場合にはその間に骨折部位以外の関節が固まって動かなくなり、寝たきりになるといったケースも少なくない。
したがって、骨折の治療において治癒に要する期間を短縮することについては、強い社会的な要請がある。そして、医薬品として使用するためには、治療効果が高いものであると同時に、副作用が少ない等の安全性の高いものでなければならない。
従来は、活性型ビタミンＤ3、カルシトニン及びその誘導体や、エストラジオールを初めとするホルモン剤、各種のカルシウム製剤等が臨床的に使用されてきた。
しかし、こうした薬剤は吸収や代謝の関係から経口投与ができない場合もあり、また、受容体レベルの個人差が大きいために効果の予見性に欠けるといった問題もあった。このため、これらに代わる新たな治療剤が求められていた。
一方、骨疾患の患者数を減少させる最も有効な手段は、骨疾患の予防である。一般的には、疾患の予防は、どの程度疾患の発症に近い段階にあるかによって、予防用医薬製剤の投与、機能性食品等の食品の摂取等が行われる。
骨疾患においても、上述したように発症した患者に対する治療手段ばかりでなく、未発症者又は健常人が罹患しないようにするための有効な予防手段に対する社会的な要請がある。
本発明は、上記のような状況の下で、完成されたものである。すなわち、本発明の発明者らは、安全性の高さに留意しつつ、古くから生薬として使用されてきた植物に含まれる成分を中心として、骨吸収抑制作用を有する化合物のスクリーニングを進めた結果、公知の化合物に従来全く知られていなかった活性があることを見出し、本発明を完成したものである。
こうしたスクリーニングの結果、生薬由来のフェニルプロパノイド二量体化合物に、新たな生理活性があることが明らかになった。こうした活性を有することが明らかになった化合物としては、ホオノキオール（Honokiol）、マグノロール（Magnolol）等が挙げられる。
これらの化合物の生理活性については、ＯＨラジカル活性阻害作用及び脂質過酸化抑制作用があることが知られている（特許文献１参照）。
また、コウボクのエタノール抽出物には、in vitroにおける酸性ホスファターゼ活性抑制作用があること、及びホウノキオール又はマグノロール自体にも、酸性ホスファターゼ活性抑制作用があることも知られている（特許文献２参照）。
さらに、ホオノキの樹皮、根皮、幹材及び葉の希エタノールエキス又は熱水抽出エキスには、コラゲナーゼ活性抑制作用があることが知られている（特許文献３参照）。
しかし、上記のようなフェニルプロパノイド二量体化合物が破骨細胞の活性を抑制することや骨吸収抑制効果を有することについては、これまで報告されたものはない。
特開平１１−２０９２７６ 特開平１０−３３８６３１ 特開平０５−５１３１６
本発明の発明者らは、以上のような状況の下で、破骨細胞による骨吸収を抑制する化合物のスクリーニングを進め、こうした作用を持ち、かつ安全性が高い、天然由来の化合物を見出し、本発明を完成したものである。
すなわち、本発明は、少なくとも１種以上の下記式（Ｉ）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物を含有してなる骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物である。
（式中、Ｒ'1、Ｒ'2、及びＲ'3は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又は炭素数１〜３のアルコシキシ基を表す。Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数３〜５のアルケニル基を表す。）。
ここで、上記式（Ｉ）で表される化合物は、下記式（II）又は（III）で表されるものであることが好ましい。
又は
（式中、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ8及びＲ10はそれぞれ水素原子、又は炭素数１〜３のアルキル基からなる群から選ばれる基を表す。また、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ9及びＲ11は、炭素数３〜５のアルケニル基を表す。）。
ここで、上記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物は、下記式（IV）又は（Ｖ）で表される化合物、
又は、
又はこれらの生理学的に許容される塩、もしくはこれらの生理学的に許容される水和物であることが好ましい。
さらに、上述した化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくは水和物を２種以上混合して組成物とする場合には、上記式（Ｉ）〜（III）のいずれかで表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくは水和物を含有するものとすることが好ましい。
本発明はまた、上述した化合物、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものを含んでなる、機能性食品である。本発明はさらにまた、マグノリア属に属する高木の幹又は枝の樹皮から抽出され、上記式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、若しくはこれらの生理学的に許容される水和物のいずれかを含む抽出物を含む、医薬組成物である。
ここで、上記マグノリア属（モクレン科）に属する高木は、Magnolia officinalis（マグノリア・オフィシナリス、和名：カラホウ）, Magnolia officinalis var. biloba（マグノリア・オフィシナリス・バル・ビロバ、和名：凹葉厚朴）, Magnolia hypoleuca（マグノリア・ヒポレウカ、英名：Japanese big-leaf magnolia）, Magnolia macrophylla（マグノリア・マクロフィラ）, Magnolia obovata（マグノリア・オボヴァタ、和名：ホウノキ、英名：Japanese big-leaf magnolia）, Magnolia salicifola（マグノリア・サリキフォリア、英名: Willow-leaved magnolia）, Magnolia stellata（マグノリア・ステラタ、英名: Star magnolia）, Magnolia virginiana（マグノリア・ヴァージニアナ、和名：ヒメタイサンボク、英名；Sweet bay）, Magnolia delavayi（マグノリア・ドラヴェゥーイー）, Magnolia kobus（マグノリア・コブス）, Magnolia sieboldii（マグノリア・シーボルディー、和名：オオバヤマレンゲ）, 及びMagnolia wilsonii（マグノリア・ウィルソニー）からなる群から選ばれるものであることが、上述した化合物が含有されているという点から、好ましい。
また、これらのマグノリア属（モクレン科）に属する高木のうち、Magnolia officinalis（マグノリア・オフィシナリス、和名：カラホウ）, Magnolia officinalis var. biloba（マグノリア・オフィシナリス・バル・ビロバ、和名：凹葉厚朴）, Magnolia hypoleuca（マグノリア・ヒポレウカ、英名：Japanese big-leaf magnolia）, Magnolia obovata（マグノリア・オボヴァタ、和名：ホウノキ、英名：Japanese big-leaf magnolia）, Magnolia salicifola（マグノリア・サリキフォリア、英名: Willow-leaved magnolia）, Magnolia stellata（マグノリア・ステラタ、英名: Star magnolia）, Magnolia virginiana（マグノリア・ヴァージニアナ、和名：ヒメタイサンボク、英名；Sweet bay）, 及びMagnolia sieboldii（マグノリア・シーボルディー、和名：オオバヤマレンゲ）からなる群から選ばれるものであることが、上述した化合物の含有量の面からさらに好ましい。
また、本発明は、上述した医薬組成物を有効成分とする骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤である。
ここで、前記骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤中における前記有効成分の含量は、製剤の１用量当たり０．１〜１００ｍｇであることが好ましく、０．１〜５０ｍｇであることがより好ましく、０．３〜１０ｍｇであることが特に好ましい。
また、前記骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤は、経口投与可能な剤形であることが好ましく、錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、トローチ剤、及び液剤からなる群から選ばれるものであることが好ましい。
ここで、前記骨疾患は、内因性骨疾患、外因性骨疾患、又は栄養障害のいずれに起因するものであってもよく、前記内因性骨疾患の場合には、骨多孔症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、高PTH血症、骨ページェット病、関節炎、リウマチ、乳癌の骨転移、骨軟化症、悪性腫瘍、及び栄養障害からなる群から選ばれる疾患に起因する骨組織の脆弱化に起因するものである場合に、本発明の骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤を好適に使用することができる。また、前記外因性骨疾患の場合には、外傷性骨折又は疲労骨折等の場合に好適に使用することができる。
本発明はまた、上述した化合物、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものを含んでなる、機能性食品である。
機能性食品に添加するものとしては、上述した式（Ｉ）〜式（III）で表される化合物、それらの生理学的に許容される塩、それらの水和物であることが好ましい。これらのうち、こうした化合物の生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものであることがさらに好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩及びこれらの一水和物又は二水和物からなる群から選ばれるものであることがさらに好ましい。
具体的には、下記式（IV）又は（Ｖ）
で表される化合部物、これらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものであることがさらに好ましく、これらのナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、及びこれらの一水和物又は二水和物からなる群から選ばれるものであることがさらに好ましい。
本発明はさらにまた、マグノリア属に属する高木の幹又は枝の樹皮から抽出され、上記式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、若しくはこれらの生理学的に許容される水和物のいずれかを含む抽出物を含む、機能性食品であることが好ましい。こうした化合物等を含む機能性食品を摂取することによって、骨疾患の予防が可能となることによる。ここで、上記マグノリア属（モクレン科）に属する高木は、上述した通りである。
本発明の機能性食品はまた、骨疾患の予防及び／又は治療を補助するために使用されるものであることが好ましい。ここで、前記化合物、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものの含有量は、１００ｇ当たり０．１〜５ｍｇであることが好ましく、０．１〜３ｍｇであることがより好ましい。これらの含有量を０．３〜１ｍｇとすると、骨疾患の予防及び／又は治療を補助する効果が最も高くなる。
本発明はまた、上述した式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものを含む組成物を含有してなる健康食品である。それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものについては、上記の機能性食品について説明したものと同様である。
本発明はさらにまた、マグノリア属に属する高木の幹又は枝の樹皮から抽出され、上記式（Ｉ）〜（Ｖ）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、若しくはこれらの生理学的に許容される水和物のいずれかを含む抽出物を含む、健康食品であることが好ましい。こうした化合物等を含む健康食品を摂取することによって、骨疾患の予防が可能となることによる。ここで、上記マグノリア属（モクレン科）に属する高木は、上述した通りである。
上記健康食品は、骨疾患の予防及び／又は治療を補助するために使用されるものであることが好ましい。前記化合物、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものの含有量は、１００ｇ当たり０．１〜５ｍｇであることが好ましく、０．１〜３ｍｇであることがより好ましい。これらの含有量を０．３〜１ｍｇとすると、骨疾患の予防及び／又は治療を補助する効果が最も高くなる。
本発明によれば、優れた破骨細胞形成抑制作用並びに骨吸収抑制作用を有する、機能性食品、健康食品、骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物、健康食品、骨疾患の予防及び／又は治療剤が提供される。
図１Ａは、50ng/mLの破骨細胞分化誘導因子（ODF/RANKL）で刺激したMφRAW264細胞株に対するホオノキオールの濃度依存的破骨細胞分化抑制効果を示す図である。 図１Ｂは、50ng/mLの破骨細胞分化誘導因子（ODF/RANKL）で刺激したMφRAW264細胞株に対するマグノロールの濃度依存的破骨細胞分化抑制効果を示す図である。 図２Ａは、50ng/mLのODF/RANKLで刺激したマウス骨髄由来M-CSF依存性細胞に対するホオノキオールの濃度依存的破骨細胞分化抑制効果を示す図である。 図２Ｂは、50ng/mLのODF/RANKLで刺激したマウス骨髄由来M-CSF依存性細胞に対するマグノロールの濃度依存的破骨細胞分化抑制効果を示す図である。 図３Ａは、MφRAW264細胞株から形成されたアクチンリングの維持に対するホオノキオールの抑制効果を示す図面代用写真（陰性コントロール）である。 図３Ｂは、MφRAW264細胞株から形成されたアクチンリングの維持に対するホオノキオールの抑制効果を示す図面代用写真（陽性コントロール）である。 図３Ｃは、MφRAW264細胞株から形成されたアクチンリングの維持に対するホオノキオールの抑制効果を示す図面代用写真である。 図４Ａは、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞から形成されたピット形成に対するホオノキオールの抑制効果を示す図面代用写真（陰性コントロール）である。 図４Ｂは、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞から形成されたピット形成に対するホオノキオールの抑制効果を示す図面代用写真（陽性コントロール）である。 図４Ｃは、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞から形成されたピット形成に対するホオノキオールの抑制効果の結果を示す図面代用写真である。 図５Ａは、MC3T3-E1細胞に対するホオノキオールの細胞生存率を示す図である。 図５Ｂは、MC3T3-E1細胞に対するホオノキオールのALP活性の増強効果を示す図である。 図６は、MC3T3-E1細胞に対するホオノキオールのオステオカルシン産生に対する増強効果を示す図である。
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。本発明の骨疾患の予防及び/又は治療用医薬組成物に含まれる化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物は、フェニルプロパノイド二量体化合物と呼ばれ、下記式（Ｉ）
で表される。
（式中、Ｒ'1、Ｒ'2、及びＲ'3は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又は炭素数１〜３のアルコシキシ基を表す。Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数３〜５のアルケニル基を表す。）。
より具体的には、下記式（II）又は（III）で表されるものである。
（式中、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ8及びＲ10はそれぞれ水素原子、又は炭素数１〜３のアルキル基からなる群から選ばれる基を表す。また、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ9及びＲ11は、炭素数３〜５のアルケニル基を表す。）。
フェニルプロパノイドは、アルケニル基を有するフェニル化合物の総称であり、フェニルプロパノイド２分子がβ炭素間で結合した化合物をフェニルプロパノイド二量体という。
「リグナン」の語は、教義には、フェニルプロパノイド二量体を指すが、本明細書においては、ネオリグナン、セスキリグナン、及びジリグナンを含むものとする。
リグナンは、上記のようにフェニル骨格に、アルケニル基、ヒドロキシ基等が結合した一群の化合物及びアルコキシ誘導体を含む物質群で構成される。リグナンは、高等植物に広く分布し、特に木部に多く含有される。
上記式（Ｉ）又は（II）で表される化合物としては、例えば、下記式（IV）で表されるホオノキオール（Honokiol）、
及び、下記式（Ｖ）で表されるマグノロール（Magnolol）、
等が挙げられる。ここで、ホオノキオールは、マグノリア属（モクレン科（Magnoliaceae））に属するホオノキの幹皮、枝皮に含まれるフェニルプロパノイド二量体化合物である。また、マグノロールは、Magnolia officinalis, Magnolia officinalis var. biloba, Magnolia obovata等に含まれるフェニルプロパノイド二量体化合物である。
これらの生理学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。水和物としては、例えば、一水和物、二水和物等を挙げることができる。
上述した各種のフェニルプロパノイド二量体化合物は、単独で本発明の医薬組成物の製造に使用することもでき、必要に応じて２種以上を適宜組み合わせて使用してもよい。また、これらの化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物を含有する生薬を、単独で又は２種以上を適宜組み合わせて使用することもできる。
こうした生薬としては、例えば、中国産又は日本産のMagnolia officinalis, Magnolia officinalis var. biloba, Magnolia hypoleuca, Magnolia obovataから得られる、唐厚朴又は和厚朴が挙げられる。
上述した、式（IV）で表されるホオノキオール、式（Ｖ）で表されるマグノロール等のフェニルプロパノイドに量体は、公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造し、入手してもよく、市販品を購入して使用してもよい。
また、上記のフェニルプロパノイド二量体化合物は、植物材料から抽出、単離することによって入手することもできる。例えば、植物材料からホオノキオールを単離する方法の１例を示す。
細切したモクレン（Magnoliaceae）科のホオノキ（Magnolia obotava）の幹皮、枝皮に含水メタノール又は含水エタノールを加えて抽出物を得る。得られた抽出物水に溶解したのち、石油エーテル、ベンゼン等の低極性溶媒を用いて脱脂する。ついで、ブタノールで抽出することにより、ブタノール相にホオノキオール及びその類縁化合物が抽出される。ここで、ホオノキオール及びその類縁化合物には、ホオノキオールの生理学的に許容される塩、若しくは水和物が含まれる。
以上のようにして抽出されたホオノキオール及びその類縁化合物は、粗精製物のまま使用することもできるが、必要に応じてさらに精製して精製標品を得ることもできる。この精製は常法によって行うことができる。例えば、シリカゲルを固定相とし、クロロホルム／メタノールを移動相とし、移動相中のメタノール含量を順次上げるステップグラジエントカラムクロマトグラフィーによって、ホオノキオール及びその類縁化合物をそれぞれ溶出させ、精製し、白色粉末等として得ることができる。
上述したマグノロールその他の上記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物、又は生理学的に許容される塩、若しくは水和物も同様にして抽出、精製することができる。
以上のようにして得られた上記式（Ｉ）〜（III）で表される化合物、又は生理学的に許容される塩、若しくは水和物は、以下のようにして医薬組成物とすることができる。
ホオノキオールを単独で医薬組成物とする場合には、上述したように得られた結晶を常法に従って処理し、後述する賦形剤等と混合し、医薬組成物とすればよい。
また、ホオノキオールとマグノロールとを組み合わせて使用する場合には、ホオノキオール１に対してマグノロールを０．１〜１０の割合として適宜混合し、この混合物をホオノキオール単独の場合と同様にして医薬組成物とすればよい。
これらの医薬組成物を有効成分とする医薬製剤としては、注射剤、坐剤、エアゾール剤、経皮吸収剤その他の非経口剤、錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、液剤その他の経口剤等を挙げることができる。ここで、上記の錠剤には、糖衣錠、コーティング錠、バッカル錠が含まれ、カプセル剤には、硬カプセル剤、軟カプセル剤の双方が含まれる。また、顆粒剤には、コーティングされた顆粒剤も含まれる。また、上記の液剤には、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等が含まれ、シロップ剤にはドライシロップも含まれる。
なお、上述した各製剤には、徐放化されていないものばかりでなく、徐放化されたものも含まれる。
こうした製剤は、公知の製剤学的製法に従い、製剤の製造に際して薬理学的に許容され得る日本薬局方に記載の担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等を用いて製造することができる。
こうした担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等を挙げることができる。
結合剤としては、例えば、デンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を挙げることができる。
崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど、滑沢剤としては例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール等を使用することができる。
着色剤、医薬品に添加することが許容されているものであれば使用することができ、特に限定されない。また、これら以外に、矯味剤、矯臭剤等も、必要に応じて適宜使用することができる。
錠剤又は顆粒剤とする場合には、必要に応じて、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体等を用いてコーティングしても良く、複数層でコーティングすることもできる。
さらに、顆粒剤や粉剤をエチルセルロースやゼラチンのようなカプセルに詰めてカプセル剤とすることもできる。
上記の化合物、又はそれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物を用いて、注射剤を調製する場合は、必要に応じて、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加することもできる。
上述したような骨疾患予防及び／又は治療剤を患者に投与する場合には、投与量は、患者の症状の重篤さ、年齢、体重、及び健康状態等の諸条件によって異なる。一般的には、成人１日当たり１mg/kg〜2,000mg/kg、好ましくは１mg/kg〜1,000mg/kg程度を、経口又は非経口的に、１日１回若しくはそれ以上の回数にわたって投与すればよい。上記のような諸条件に応じて、投与の回数及び量を適宜増減すればよい。
ホオノキオール単独、またはホオノキオールと他のフェニルプロパノイド二量体化合物、例えば、マグノロールとを含有する医薬組成物が有効成分として製剤中に含まれる場合には、当該組成物中におけるホオノキオールの含有量は、0.1〜100mgであることが好ましく、より好ましくは0.1〜50mg、さらに好ましくは0.3〜10mgである。
有効成分であるホオノキオールや他のフェニルプロパノイド二量体化合物の含有量が下限値未満では骨吸収抑制作用が十分に発揮されず、逆に上限値を越えて添加しても、添加量に見合う効果が発揮されない。また、上限値を越えると、投与時に細胞毒性が発揮されることがあり、生体に対して望ましくない副作用を惹起するおそれがあることによる。
上述した本発明の組成物を必要に応じて適宜添加することにより、骨疾患の予防及び/又は治療効果を有する機能性食品、若しくは健康食品を提供することができる。
本明細書において、「機能性食品」とは、その食品自体が本来含有している栄養素によって、その食品を摂取した者に供与できる以上の利益を与え得る成分を含有する食品をいう。
また、「健康食品」とは、健康の維持・増進に役立つ成分を抽出し、製造した粗生成物又は精製物を主成分とする粉末、顆粒剤、錠剤、カプセル剤をいい、日頃不足しがちな栄養成分の摂取を補助するサプリメントも含むものとする。
本発明の組成物は、例えば、パン、クッキー及びビスケット、米飯添加用麦及び雑穀、うどん、そば、パスタその他の麺類、チーズ、ヨーグルトその他の乳製品、ジャム、マヨネーズ、味噌、醤油その他の大豆製品、茶、コーヒー及びココア、清涼飲料、果実飲料その他の非アルコール性飲料、薬用酒その他のアルコール性飲料、キャンディー、チョコレートその他のスナック菓子、チューインガム、せんべい、羊羹その他の大豆を原料とする菓子等に添加して、機能性食品とすることができる。
なお、上記のヨーグルト、醤油、飲料等に添加する場合には、これらの中で本発明の組成物が結晶化して沈殿しないようにするために、溶解助剤や安定化剤を適宜加えることもできる。
また、本発明の組成物を単独で、又は２種以上を混合し、常法に従って粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤とすることにより、健康食品とすることができる。
ここで、本発明の組成物を粉末とするためには、生成過程で得られた抽出物を濃縮し、凍結乾燥、スプレードライ、真空乾燥等の方法を用いて乾燥させ、サンプルミル、ブレンダー、ミキサー等によって乾燥固体を粉砕すればよい。また、必要に応じて、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、デキストリン、シクロデキストリン、牡蠣殻粉末などを添加してもよい。
また、上記のようにして得た粉末に、適宜、上述した結合剤を加えて打錠し、錠剤とすることもできる。錠剤とした後に、上述した白糖又はゼラチン等のコーティング剤を用いて、糖衣錠としてもよく、他のコーティング剤を用いて腸溶剤等にすることもできる。
さらに、上述のようにして得た粉末を常法に従って顆粒とし、顆粒剤を製造することもできる。また、上記の粉末や顆粒を上述したカプセルに適当量充填することによって、カプセル剤とすることもできる。
以下に、本発明について、実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
（１−１）破骨細胞の初期分化阻害試験
破骨細胞の初期分化阻害試験には、破骨細胞様細胞に分化する、マクロファージＲＡＷ２６４細胞株（理化学研究所、cell番号RCB0535、以下、「MφRAW264」ということがある。）を使用した。MφRAW264の培養には、10％のウシ胎児血清（旭テクノグラス株式会社（IWAKI）、カタログ番号IWK-500）を含むα-MEM（INVITROGEN社製、カタログ番号11900-024）を使用した。また、破骨細胞分化誘導因子（ODF/RANKL）はPEPRO TECH INC社製、カタログ番号310-01を使用した。
ホオノキオールは、和光純薬工業社製、カタログ番号089-04951を使用した。また、96ウェルマイクロプレート及び100mmφディッシュは、INVITROGEN社製、カタログ番号161093及び172958をそれぞれ使用した。なお、マグノロールは、和光純薬工業社製、カタログ番号137-09081を使用した。
エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド、塩化ナトリウムは和光純薬工業より購入して使用した。
（１−２）破骨細胞の初期分化阻害試験Ｉ
骨吸収の抑制を評価するin vitro試験法として、MφRAW264細胞株からの破骨細胞の初期分化阻害試験を行った。破骨細胞試験の評価は、初期分化マーカーである酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）活性の測定とTRAP染色とによって行った。これら２つの指標を用いることにより、MφRAW264細胞の破骨細胞への分化に対するフラボン類の活性を定量的に評価することができる。
MφRAW264細胞株を10％のウシ胎児血清（FBS）を添加したα−MEM培地（以下、「10％FBS−MEM」ということがある。）に懸濁し、100mm径のディッシュに１×105 cells/10ｍLで接種し、５％CO2 存在下、37℃にて３日間培養し、ディッシュ内で当該細胞が集密的（confluent、コンフルエント）になっていることを確認して培養を終了した。ついで、その後、コンフレントになった細胞をディッシュから0.05%のトリプシン、0.53ｍMのEDTAを含むハンクスバッファー（0.05% Trypsin-0.53 mM EDTA/HBSS（INVITROGEN社製、カタログ番号25300-054）で処理してはがし、10％FBS-MEMに懸濁して、96ウェルマイクロプレートの各ウェルに0.4×104 cells/0.1ｍLで接種し、上記と同様の条件で１日間培養した。
破骨細胞分化誘導因子(ODF/RANKL)を10％FBS-MEMに溶解し、100ng/mLの溶液を調製した。また、ホオノキオールを10mMの濃度でメタノールに溶解したものを、ストック溶液として調製し、−20℃で保管した。ホオノキオールによる処理を行うに際して、ストック溶液を希釈し、処理濃度のそれぞれの100倍濃度（３mM、１mM、300μＭ）の溶液を調製し、溶媒の終濃度が１％未満になるように、各ウェルに（２μＬずつ）添加した。対照群には、等量のメタノールを添加した。以下の実験で使用したホオノキオールは、上記の各濃度の溶液を使用した。
ODF/RANKLを96ウェルすべてに0.1mLずつ添加（RANKLの終濃度50ng/mL）するとともに、ホオノキオール溶液をウェルに添加した（ホオノキオールの終濃度は、それぞれ、３μＭ、10μＭ及び30μＭ）。対照群となるウェルには、ホオノキオールを含まないメタノールを等量添加した。
５％CO2 存在下、37℃にて３日間培養した後に、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）活性を以下のようにして測定した。
96ウェルマイクロプレートの各ウェルの培養液を捨て、このプレートをリン酸緩衝生理食塩水溶液（PBS）で洗浄したのち、10％ホルムアルデヒドを含有するPBS（以下、「10％HCHO-PBS」ということがある。）を各ウェルに満たし、細胞を室温で15分間固定した。さらに、エタノール−アセトン溶液（１：１）を用いて室温で１分間固定した。固定終了後、固定液を捨て、室温で乾燥させた。乾燥後、各ウェル内における細胞の酒石酸耐性酸ホスファターゼ活性の測定（以下、「TRAPアッセイ」ということがある。）と、染色とを行った。
培養細胞内のTRAP活性の測定は、3.7ｍＭのｐ−ニトロフェノール−リン酸水素二ナトリウム及び10ｍＭの酒石酸を含有する50ｍＭのクエン酸緩衝液（pH4.6）を用いて行った。この緩衝液を各ウェル当たり、0.1mLずつ添加し、37℃で30分間反応させた。30分後に、0.1ＭのNaOHを0.1mLずつ添加することにより反応を停止させ、遊離したｐ−ニトロフェノールを分光光度計（大日本製薬（株）製）を用いて、測定波長405nmで測定した。
尚、破骨細胞の初期分化阻害試験の結果は、対照群（コントロール）のTRAP活性を100としたときの対照群に対する相対値（％）で表した。
さらに、細胞内の酒石酸耐性酸ホスファターゼの状態をTRAP染色法により確認した。TRAP染色液は基質としてNaphtol AS-MX phosphate(SIGMA社製、カタログ番号N-4875)5 mgを0.5 mlのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、さらに、色素としてFast red violet LB salt(SIGMA社製、カタログ番号F-1625)30 mgを50 mlの50 mM 酒石酸ナトリウム/0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)に溶解したものを合わせて使用した。すなわち、TRAPアッセイの場合と同様に、培養後、培地を除去した。PBSで細胞層を洗浄したのち、10％HCHO-PBSを用いて細胞を室温で15分間固定した。ついで、エタノール−アセトン溶液（１：１）を用いて室温でさらに１分間固定した。固定終了後、固定液を捨て、室温で乾燥させた。乾燥後、TRAP染色液を加え、室温にて20〜30分間染色した。染色後、染色液を捨て、流水により洗浄し、乾燥させた後、顕微鏡で観察した。結果を図１Ａに示す。なお、図１中、破骨細胞の初期分化阻害試験Ｉの結果で得られた細胞内のTRAP活性の測定結果を、黒い棒グラフとして示した（図１Ａ参照）。
図１Ａから明らかなように、ホオノキオールの添加によって濃度依存的にTRAP活性が抑制されることが示された。このことから、ホオノキオールによってMφRAW264細胞からの破骨細胞形成が抑制されることが明らかになった。
（１−３）破骨細胞の初期分化阻害試験Ｉ
上記（１−２）においてホオノキオールをマグノロールに代え、使用濃度を20〜60μＭとした他は同様にして、破骨細胞の初期分化阻害試験を行った。結果を図１Ｂに示す。
図１Ｂから明らかなように、マグノロールの添加によって濃度依存的にTRAP活性が抑制されることが示された。このことから、マグノロールによってMφRAW264細胞からの破骨細胞形成が抑制されることが明らかになった。
（実施例２）増殖細胞数測定試験
（２−１）材料等
細胞株、培地、血清、96ウェルマイクロプレート、100mmφディッシュ、ホオノキオールその他の試薬類は、実施例１で使用したのと同様のものを使用した。破骨細胞分化誘導因子(ODF/RANKL)の10％FBS-MEM溶液、及び、ホオノキオールのメタノール溶液も実施例１と同様に調整した。
（２−２）増殖細胞数測定実験Ｉ
細胞増殖および細胞の生存率を定量化するためのnon−RI法としてXTTによる呈色反応を用いた。MφRAW264細胞株を10％FBS-MEM培地に懸濁し、96ウェルマイクロプレートに0.4×104 cells/0.1mLで接種し１日間培養した。この後、破骨細胞分化誘導因子(ODF/RANKL)の10％FBS-MEM溶液（100ng/mL）を各ウェルに0.1mLずつ添加した（RANKLの終濃度50ng/mL）。これと同時に、ホオノキオールの各濃度の溶液をウェルに添加した。なお、対照群には、ホオノキオールを含有しないメタノールのみを等量添加した。
培養開始３日後に、市販のCell Proliferation Kit II（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、カタログ番号1 465 015）を用いて細胞増殖を定量し、細胞生存率を求めた。操作は、添付の取扱説明書に従って実施したが、その概要は以下の通りである。
キットに含まれているXTT標識試薬と電子カップリング試薬とを50：１で混ぜ、各ウェルに添加されている培地0.1mL当たり50μLずつを加えて、37℃にて４時間反応させた。反応終了後、ELISAプレートリーダー（大日本製薬（株）製）を用いて、690nmを対照波長として、波長492nmにおける吸光度を測定した。
測定結果は、各濃度のホオノキオール処理群の細胞生存率を、対照群の細胞生存率を100としたときの対照群に対する相対値（％）で表した。結果を図１Ａに示す。なお、図１Ａ中、増殖細胞数測定実験の結果得られた細胞生存率の測定結果を、白抜きの棒グラフとして示した。
図１Ａから明らかなように、ホオノキオールの濃度が10倍に増加しても細胞生存率は約70％までしか低下しなかった。このことから、ホオノキオールはMφRAW264細胞に対して非特異的な細胞毒性は示さないこと、及びMφRAW264細胞のRANKLによる破骨細胞への分化を濃度に依存して顕著に抑制することが明らかにされた（IC50＝１５μＭ）。
（２−３）増殖細胞数測定実験II
上記（２−２）におけるホオノキオールをマグノロールに代え、使用濃度を20〜60μＭとした他は同様にして、増殖細胞数測定実験を行った。結果を図１Ｂに示す。
図１Ｂから明らかなように、マグノロールの濃度が３倍に増加しても細胞生存率はほとんど低下していないことが示された。このことから、マグノロールは、MφRAW264細胞に対して非特異的な細胞毒性は示さないこと、及びMφRAW264細胞のRANKLによる破骨細胞への分化を、濃度依存的に、顕著に抑制することが明らかにされた（IC50＝30μＭ）。
（実施例３）破骨細胞の初期分化阻害試験II
（３−１）材料等
実施例３においては、実施例１及び２で使用したMφRAW264細胞に代えて、in vitroにおける骨吸収の抑制を評価するために、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞（BMM）を使用した。マウス骨髄由来細胞は、６〜９週齢のddYマウス（雄）（中部科学資材（株））から摘出した脛骨および大腿骨より採取した。
硫酸ストレプトマイシン及びペニシシンＧナトリウム（INVITROGEN社製、カタログ番号15140-122）、腫瘍増殖因子β（TGF-β、SIGMA社製、カタログ番号T-7039）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF、PEPRO TECH INC社製、カタログ番号300-25）以外は、実施例１と同様のものを使用した。実施例１と同様に細胞内のTRAP活性の測定とTRAP染色とを指標として、ホオノキオール及びマグノロールによる破骨細胞への分化に対する活性の評価を行った。
（３−２）破骨細胞の初期分化阻害試験II
６〜９週齢のddYマウスから脛骨及び大腿骨を摘出した。これらの脛骨及び大腿骨から、22Ｇ×1と1/4の注射針をつけた注射器で押し出すことにより、骨髄細胞を採取した。
得られた骨髄細胞を、100U/mLのペニシリンＧナトリウム塩、100μg/mLの硫酸ストレプトマイシン、50ng/mLのM-CSF、及び１ng/mLのTGF-βを含む10％FBS-MEMに懸濁し、96ウェルマイクロプレートに、１×106 cells/0.1mL/ウェルで播種し、５％CO2、37℃の条件下で培養した。
培養開始３日後、50ng/mLのM-CSF及び50ng/mLの破骨細胞分化誘導因子（ODF/RANKL）を含む培地に交換すると同時に、実施例１と同じ濃度に調整したホオノキオールを添加した。なお、対照群としては、M-CSF及びODF/RANKLは含有しているが、ホオノキオールを含有していない上記の培地に交換した。５％CO2、37℃の条件下でさらに培養した。
培地交換の後、1.5日後に、破骨細胞初期分化マーカーである酒石酸耐性酸ホスファターゼ活性を測定した。各ウェルの培養液を捨て、プレートをPBSで洗浄したのち、10％HCHO/PBSを用いて、ウェル内の細胞を室温で15分間固定した。さらに、エタノール−アセトン溶液（１：１）を用い、室温で１分間固定した。固定終了後、固定液を捨て、室温で乾燥させた。乾燥後、各ウェルの細胞の酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）活性の測定と染色とを、実施例１と同様に行った。結果を図２Ａに示す。
なお、図２中、ホオノキオールを添加した培地中で培養した骨髄細胞内のTRAP活性の測定結果を黒塗りの棒グラフとして示した。
また、マウスの骨髄細胞を用いた増殖細胞数測定実験も実施例２と同様に行い、細胞生存率を測定した。結果を図２Ａに示す。図２Ａ中、細胞の生存率を白抜きの棒グラフとして示した。TRAP活性及び増殖細胞数測定実験の結果は、いずれも、対照群のこれらを100としたときの対照群に対する相対値（％）で表した。
図２Ａから明らかなように、ホオノキオールの添加によって、濃度依存的にTRAP活性が抑制された。このことは、破骨細胞の形成がホオノキオールによって濃度依存的に阻害されることを示す。
また、XTTアッセイ（増殖細胞数測定実験）の結果から、ホオノキオールが非特異的な細胞毒性を示さないことも明らかになった。以上より、ホオノキオールは、非特異的な細胞毒性は示さず、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞のRANKLによる破骨細胞への分化を濃度に依存して顕著に抑制することが示された（IC50＝10μＭ）。
（３−３）破骨細胞の初期分化阻害試験II
上記（３−２）におけるホオノキオールをマグノロールに代え、濃度を20〜60μMとした他は同様にして、破骨細胞の初期分化阻害試験を行った。
結果を図２Ｂに示す。マグノロールの添加によって、濃度依存的にTRAP活性が抑制された。このことから、マグノロールは、非特異的な細胞毒性は示さず、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞のRANKLによる破骨細胞への分化を濃度に依存して顕著に抑制することが示された（IC50＝30μＭ）。
（実施例４）破骨細胞活性化構造体であるアクチンリングの形成試験Ｉ
（４−１）材料等
MφRAW264細胞、ウシ胎児血清、α―MEM、ODF/RANKL、96ウェルマイクロプレート、ホオノキオールは、実施例１と同様のものを使用し、同様に調製して使用した。PD98059は（CALBIOCHEM社製、カタログ番号153000）を使用した。
（４−２）アクチンリングの形成試験Ｉ
MφRAW264細胞株を、10％FBS-MEMに懸濁し、96ウェルマイクロプレートに0.8×105 cells/0.1mL/ウェルで接種し、５％CO2、37℃の条件で１日間培養した。この後、100ng/mLのODF/RANKLと20μＭのPD98059とを含む上記の培地0.1mLを添加し、さらに同じ条件で培養した（RANKLの終濃度50ng/mL、PD98059の終濃度10μＭ）。
活性化破骨細胞まで分化を進行させるため、ODF/RANKLとPD98059添加してから２日後に50ng/mLのODF/RANKLを含む上記の培地に交換して、破骨細胞活性化構造体であるアクチンリングの形成が確認されるまで、同様の条件で培養を続けた。アクチンリングが形成されたところで、実施例１と同様に調製したホオノキオール溶液を添加し、さらに１日間培養した。なお、対照群のウェルには化合物を含まないメタノールのみを加えて、さらに１日培養を続けた。
ホオノキオールを添加して１日培養した後に、各ウェルの細胞の酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）染色を実施例１と同様に行った。結果を図３に示す。
図３に示されるように、対照群（図３Ａ及び３Ｂ参照）ではアクチンリング形成が認められたが、ホオノキオール処理群では２０μＭの濃度で処理した場合には、アクチンリングが破壊されていることが示された（図３Ｃ参照）。
アクチンリングはODF/RANKL及びPD98059で処理したMφRAW264細胞株の培養によって形成された破骨細胞の活性化構造体であることから、ホオノキオールは、破骨細胞の分化だけでなく、活性化構造体の維持を阻害することによって骨吸収を抑制するものと考えられた。
（実施例５）成熟破骨細胞によるピットの形成試験
（５−１）材料等
硫酸ストレプトマイシン及びペニシシンＧナトリウム、TGF-β、M-CSF以外のものは実施例１と同様のものを使用し、これらについては実施例３と同様のものを使用した。
（５−２）ピットの形成試験
また、実施例３と同様にして、６〜９週齢のddYマウスの脛骨及び大腿骨から骨髄細胞を採取した。
得られた骨髄細胞を、100U/mLのペニシリンＧナトリウム塩、100μg/mLの硫酸ストレプトマイシン、50ng/mLのM-CSF、及び１ng/mLのTGF-βを含む10％FBS-MEMに懸濁し、カルシウムリン酸塩アパタイトがコーティングされてある16ウェルマルチスライドプレート（BioCoat Osteologic Bone Cell Culture System; BD Biosciences、カタログ番号354609）に、0.85×10６ cells/0.1mL/ウェルで播種し、５％CO2、37℃の条件下で培養した。
培養開始３日後、50ng/mLのM-CSF及び100ng/mLの破骨細胞分化誘導因子（ODF/RANKL）を含む培地に交換して、破骨細胞活性化構造体であるアクチンリングの形成が確認されるまで、同様の条件で培養を続けた。アクチンリングが形成されるところで、実施例１と同様に調製したホオノキオール溶液を添加し、さらに１日間培養した。なお、対照群としては、交換した上記の培地に溶媒だけを添加した。
ホオノキオール添加して１日培養した後に、各ウェルから培養液を捨て、このプレートをリン酸緩衝生理食塩水溶液（PBS）で洗浄したのち、0.1ＭのNaOHを0.1mLずつ添加することにより細胞を溶解させた。溶解終了後、NaOH溶液を捨て、流水により洗浄し、室温で乾燥させた後、顕微鏡で観察した。結果を図４に示す。
図４Ｃから明らかなように、ホオノキオール（10μＭ）を添加すると、対照群を示す図４Ａ及び４Ｂと比較して、有意なピット形成の減少が認められた。ピットは、アクチンリングを持つ成熟破骨細胞による骨吸収窩であり、アクチンリングは、M-CSF及びTGF-β又はODF/RANKLで処理したマウスの骨髄由来M-CSF依存性細胞の培養によって形成された破骨細胞の活性化構造体である。このため、ホオノキオールは、破骨細胞の分化だけでなく成熟破骨細胞の機能を阻害することによって骨吸収を抑制するものと考えられた。
以上より、ホオノキオール及びマグノロールは、マクロファージ由来の株化細胞を培養した場合、及びマウスの骨髄細胞を培養した場合のいずれにおいても、それ自身がこれらの細胞に対して非特異的な細胞毒性は示すことなく、濃度依存的にRANKLによる破骨細胞への分化を強く抑制することが証明された。また、ホオノキオールがアクチンリングの維持を阻害し、成熟破骨細胞によるピットの形成を抑制したことから、活性化された破骨細胞による骨吸収を顕著に抑制することも示された。
（実施例６）骨芽細胞分化実験
（６−１）材料等
骨芽細胞分化実験には、マウス由来前骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞（理化学研究所より購入）を使用した。MC3T3-E1細胞の培養には、10％ウシ胎児血清を含むα−MEMを使用した。ここで使用したウシ胎児血清及びα-MEMは、実施例１で使用したものと同じである。
なお、DMSO（ジメチルスルホキシド）及びMTT（3-(4,5-Dimethyl-2-thizaolyl)- 2,5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide）試薬は和光純薬工業（株）より購入し、p−ニトロフェニルリン酸、ナフトールAS-MXリン酸、及びファストブルーBB塩は、SIGMA社より購入した。オステオカルシン量を測定するためのEIAキットは、Biomedical Technologies Inc.より購入した。
（６−２）骨芽細胞分化誘導試験
骨芽細胞分化に対する作用を評価する方法として、MC3T3-E1細胞の骨芽細胞分化誘導法を用いた。この試験において、骨芽細胞の分化に対する影響を評価するために、骨芽細胞の初期分化のマーカー酵素であるアルカリホスファターゼ（ALP）の活性の測定とその活性を利用した染色（ALP染色）を行った。また、分化が進んだ骨芽細胞のマーカーとして知られるオステオカルシンの発現量を、上記のEIA測定キットを用いて測定した。さらに、添加した化合物の細胞毒性を調べるためにMTT法により細胞生存率を測定した。
（６−２−１）骨芽細胞の分化誘導
MC3T3-E1細胞を96ウェルマイクロプレートに４×103 cells/ウェルとなるように接種し、コンフルエントになるまで、37℃、５％CO2インキュベータ中にて、2日間培養した。
次いで、骨芽細胞の分化を誘導するために、50μg/mlのL−アスコルビン酸および10 mMのβ−グリセロリン酸と、図５及び図６に示すように、３〜30μMのホオノキオールを含むα−MEMで7日間または14日間培養した。その際、3日又は４日毎に培地交換をした。
（６−２−２）骨芽細胞分化を誘導後の細胞生存率
細胞生存率を測定するために、上記の条件にて、MC3T3-E1細胞を7日間培養した後、MTT試薬をウェル中の培養液量の10分の１量添加して、37℃にて1時間反応させた。この培養液を除去した後、生成したホルマザン色素をDMSOに溶解し、マイクロプレートリーダーにて570 nmの吸光度を測定した（参照波長630 nm）。
測定した吸光度を元に、対照群の細胞生存率を100としたときの対照群に対する相対値（％）を細胞生存率とした。結果を図５Ａに示す。
（６−２−３）骨芽細胞の分化誘導の評価
（１）ALP活性の測定
ALP活性の測定は以下のように行った。まず、MC3T3-E1細胞を上述したと同じ条件で7日間培養した後、培養液を除去し、PBSでウェルを洗浄後、メタノールで細胞を固定してディッシュを乾燥した。
次いで、6.7 mMのp−ニトロフェニルリン酸を基質として含み、2 mMの塩化マグネシウム及び100 mMのトリス−塩酸緩衝液（pH 8.5）を各ウェルに100μＬ加え、37℃にて30分間反応させた。
100μlの0.1 N水酸化ナトリウムを加えて反応を停止し、プレートリーダーにて405 nmの吸光度を測定して遊離したｐ−ニトロフェノールを測定し、ALP活性を求めた。
骨芽細胞分化試験の結果は対照群のALP活性を100としたときの対照群に対する相対値（％）で表した。結果を、図５Ｂに示す。
（２）ＡＬＰ染色
ALP染色には、0.1mg/mlのナフトールAS-MXリン酸、0.6 mg/mlファストブルーBB塩、２mMの塩化マグネシウム、及び100mMのトリス-塩酸を含有する緩衝液（pH 8.5）を染色液として用いた。
上述のようにしてALP活性を測定した後、各ウェルを蒸留水にて洗浄し、各ウェルに上記のALP染色液を100μＬ添加し、室温で30分から1時間反応させて染色した。
図５Ａから明らかなように、MC3T3-E1細胞の生存率は、添加されたホオノキオールの量が３０μＭになるとわずかに減少する。対照的に、図５Ｂから明らかなように、ALP活性は、ホオノキオールの添加に対して濃度依存的に上昇する。このことからホオノキオールはMC3T3-E1細胞の増殖をわずかに抑制するものの、初期の骨芽細胞分化を強く誘導することが明らかとなった。
（３）オステオカルシンの濃度
オステオカルシン濃度の測定には、上記の条件にて14日間培養して培養したMC3T3-E1細胞の培養上清を用いた。この培養上清中のオステオカルシンの量を、上述したEIAキットを用い、添付の取扱説明書の方法に従って測定した。
図６から明らかなように、オステオカルシンの発現は、ホオノキオールの添加に対して濃度依存的に亢進することが示された。このことから、ホオノキオールはMC3T3-E1細胞の骨芽細胞への分化を強く促進することが明らかとなった。
以上より、従来から生薬として使用されてきたフェニルプロパノイド二量体化合物の一種である、ホオノキオール及びマグノロールは、骨疾患の予防及び／又は抑制のための機能性食品、医薬組成物、及び医薬として有用であることが示された。
（製剤例）
次に、本発明の組成物を含有する製剤例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（製剤例１ 錠剤）
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後に圧縮打錠して重量300mgの錠剤を製造することができる。
（製剤例２ 硬カプセル剤）
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、硬カプセルに300mgずつ充填することにより、硬カプセル剤を製造することができる。ここで、組成物１は、ホオノキオールと乳糖とを１：１で混合したものである。なお、製剤例３〜６で使用する組成物１は上記と同じものである。
（製剤例３ 軟カプセル剤）
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、軟カプセルに100mgずつ充填することにより、軟カプセル剤を製造することができる。
（製剤例４ 顆粒剤）
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、常法に従って顆粒剤を製造することができる。
（製剤例５ シロップ剤）
上記の成分をそれぞれ秤量し、糖及びサッカリンを注射用蒸留水60ｍLに溶解した後、グリセリン及びエタノールに溶解された組成物２及び調味料の溶液を加える。この混合物に精製水を加えて、最終容量を100ｍLにすることにより、経口投与用のシロップ剤を製造することができる。
（製剤例６ 顆粒剤）
上記の成分をそれぞれ秤量し、組成物３を常法によって珪酸カルシウムに吸着させて微粒子とし、散剤を製造することができる。
式（Ｉ）の化合物を有効成分として含有する医薬組成物、医薬製剤、健康食品、機能性食品等の分野において有用である。

Claims (14)

  1. 少なくとも１種以上の下記式（Ｉ）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物を含有してなる骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物。

    （式中、Ｒ'1、Ｒ'2、及びＲ'3は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又は炭素数１〜３のアルコシキシ基を表す。Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数３〜５のアルケニル基を表す。）。
  2. 少なくとも１種以上の下記式（II）又は（III）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物を含有してなる、請求項１に記載の骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物。
    又は

    （式中、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ8及びＲ10はそれぞれ水素原子、又は炭素数１〜３のアルキル基からなる群から選ばれる基を表す。また、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ9及びＲ11は、炭素数３〜５のアルケニル基を表す。）。
  3. 下記式（IV）又は（Ｖ）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物を含有してなる、請求項１又は２に記載の骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物。
    又は
  4. マグノリア属に属する高木の幹又は枝の樹皮から抽出され、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物を含有する抽出物を含む、骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物。
  5. 前記マグノリア属に属する高木が、Magnolia officinalis, Magnolia officinalis var. biloba, Magnolia hypoleuca, Magnolia macrophylla, Magnolia obovata, Magnolia salicifola, Magnolia stellata, Magnolia salicifolia, Magnolia virginiana, delavayi, Magnolia kobus, sieboldii, 及びMagnolia wiilsoniiからなる群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項４に記載の骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物。
  6. 請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物を有効成分とする骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤。
  7. 請求項１〜３のいずれかに記載の化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、若しくはこれらの生理学的に許容される水和物を含有する、機能性食品。
  8. マグノリア属に属する高木の幹又は枝の樹皮から抽出され、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物を含有する抽出物を含む、機能性食品。
  9. 前記マグノリア属に属する高木が、Magnolia officinalis, Magnolia officinalis var. biloba, Magnolia hypoleuca, Magnolia macrophylla, Magnolia obovata, Magnolia salicifola, Magnolia stellata, Magnolia salicifolia, Magnolia virginiana, delavayi, Magnolia kobus, sieboldii, 及びMagnolia wiilsoniiからなる群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項８に記載の機能性食品。
  10. 骨疾患の予防及び／又は治療を補助するために使用されるものであることを特徴とする、請求項７〜９のいずれかに記載の機能性食品。
  11. 請求項１〜３のいずれかに記載の化合物、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものを含有してなる健康食品。
  12. マグノリア属に属する高木の幹又は枝の樹皮から抽出され、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、若しくは水和物を含有する抽出物を含む、健康食品。
  13. 前記マグノリア属に属する高木が、Magnolia officinalis, Magnolia officinalis var. biloba, Magnolia hypoleuca, Magnolia macrophylla, Magnolia obovata, Magnolia salicifola, Magnolia stellata, Magnolia salicifolia, Magnolia virginiana, delavayi, Magnolia kobus, sieboldii, 及びMagnolia wiilsoniiからなる群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１２に記載の機能性食品。
  14. 骨疾患の予防及び／又は治療を補助するために使用されるものであることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれかに記載の健康食品。

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