JPH11209276A - ガン転移抑制剤及びコラゲナーゼ活性抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ガン細胞の転移を抑制しうるガン転移抑制剤及
びコラゲナーゼ活性抑制剤を提供する。 【解決手段】 ホオノキ樹皮の熱水抽出液を試料濃度
０．１、１、１０、１００、１０００（μｇ／ｍｌ）に
した場合、ホオノキ樹脂の熱水抽出液の試料濃度を上げ
ると、HT-1080 細胞の浸潤率が低下していることが認め
られた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、ガン転移抑制剤
及びコラゲナーゼ活性抑制剤に係り、詳しくは漢方薬、
ホウ葉寿司やホウ葉味噌等に広く使用されているホオノ
キ（Magnoliabark）の葉、樹皮（厚朴）、幹材、根皮な
どの部位及びこれらに含まれる成分を含むガン転移抑制
剤及びコラゲナーゼ活性抑制剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】原発性のガンを治療する方法としては、
ガン病巣の外科的切除、コバルト照射等の放射線治療、
薬物療法なとが主流である。又、薬物療法による薬剤に
はその作用機序から分類すると、下記のように分類され
る。

【０００３】１） 細胞の染色体のＤＮＡ或いはタンパ
ク質をアルキル化して変化させ、分裂を阻止して増殖を
抑えるアルキル化剤（ナイトロジェンマスタード、シク
ロホスファミドやニトロソ尿素形化合物、チオテパ、シ
スプラチン等） ２） 核酸の塩基配列に作用しＤＮＡ或いは（ＲＮＡ）
合成阻害を起こす代謝拮抗剤（葉酸拮抗薬であるメトト
レキセート、メルカプトプリン、シトシンアラビノシ
ド、５−フルオロウラシル等） ３） 抗生物質の中でＤＮＡにインターカレートしＤＮ
Ａと反応する、或いはＤＮＡ鎖を切断する作用によって
ＤＮＡ合成を阻害し細胞の増殖阻止活性を持つ抗ガン性
物質（アクチノマイシンＤ、アントラテトラサイクリン
系化合物のダウノマイシン、アドリアマイシン、マイト
マイシンＣ、ブレオマイシン、ネオカルノスタチン） ４） ガン細胞の有糸分裂を阻害するビンクリスチン、
ビンブラスチン（ニチニチソウ中のアルカロイド化合
物）、エトポシド（喜樹中のポドフィロトキシン化合
物）、タキソール（西洋イチイ中のタキサン化合物）等
の植物成分 ５） ホルモン依存により増殖するガン細胞に対し競合
的に作用するホルモン剤 ６） 患者の免疫力一般を高める免疫賦活剤のピシバニ
ール、クレスチン、レンチナン、シゾフィラン、ベスタ
チン

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】以上のようなこれまで
の抗ガン剤は、原発性のガン細胞の増殖を阻害すること
を目標にして開発されたものが多いが、原発の病巣から
ガン細胞が転移して起こる再発性の転移ガンに対して有
効な抗ガン剤はない。

【０００５】ガン転移は、ガン細胞が原発巣を離れて遊
離し、血管内或いはリンパ管に侵入し、さらに血流或い
はリンパ液に運ばれて他の遠隔組織の血管壁或いはリン
パ管壁に着床することから起こる。着床したガン細胞
は、血管壁、或いはリンパ管を抜けて脱出し、組織内で
毛細血管を新生して栄養分を補給しながら急激に増殖す
る。

【０００６】ガン細胞が転移するためには、原発巣から
の離脱、浸潤、脈管内への移行、他臓器の内皮細胞への
接着、脈管外侵出、血管新生能の獲得等、それぞれ異な
る分子が関与するさらに複数のステップを経なければな
らない。このような考え方の基本形を提示したのが、リ
オッタ（Ｌiotta ）の浸潤の３段階説である。彼はガン
細胞による基底膜の浸潤は、ガン細胞の基底膜への接
着、基底膜の分解、溶解した間隙の移動のステップによ
って遂行されると提唱された。転移が成立するための分
子的な基盤が明らかになれば、その分子の機能を抑制す
ることで転移を抑制できる。このような過程を制御する
タイプの薬剤は、これまでの化学療法剤の主たる作用で
あるガン細胞の増殖阻害や殺傷、又、免疫賦活作用とは
作用機序が異なり、新しいタイプの抗ガン剤となりう
る。

【０００７】又、術後の再発防止を目的としたガン転移
抑制剤はこれまでにない新しいタイプの抗ガン剤であ
り、開発が強く望まれている。この発明は、ガン細胞の
転移を抑制しうるガン転移抑制剤及びコラゲナーゼ活性
抑制剤を提供することを目的としている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】以上の目的を達成するた
めに、請求項１の発明は、マグノロール、ホオノキオー
ルのうち少なくとも一種を有効成分とするガン転移抑制
剤を要旨としている。

【０００９】請求項２の発明は、ホオノキもしくはホオ
ノキの同効物又はこれらの抽出物を有効成分とするガン
転移抑制剤をその要旨としている。請求項３の発明は、
請求項２において、抽出物がマグノロール、ホオノキオ
ールのうち少なくとも一種であるガン転移抑制剤を要旨
としている。

【００１０】請求項４の発明は、マグノロール、ホオノ
キオールのうち少なくとも一種を有効成分とするコラゲ
ナーゼ活性抑制剤を要旨としている。請求項５の発明
は、ホオノキもしくはホオノキの同効物又はこれらの抽
出物を有効成分とするコラゲナーゼ活性抑制剤を要旨と
するものである。

【００１１】請求項６の発明は、抽出物がマグノロー
ル、ホオノキオールのうち少なくとも一種である請求項
２に記載のコラゲナーゼ活性抑制剤を要旨とするもので
ある。本発明に使用されるマグノロール（化１）、ホオ
ノキオール（化２）はビフェニルフェニルプロパノイド
骨格を有する。

【００１２】

【化１】

【００１３】

【化２】 マグノロール、ホオノキオールに関しては、う蝕予防剤
（特開昭５７−８５３１９号）、抗酸化剤（特開昭６０
−１７８８１８号公報）に挙げられているように生物活
性の面での提案がなされている。しかし、この発明にお
いては、上述した生物活性とは異なる知見を得て成され
たものである。

【００１４】本発明の有効成分であるマグノロール、ホ
オノキオールは、それぞれ有機合成的に製造することも
可能であるが、最も効率的に得られるのは、ホオノキか
らの抽出である。ホオノキ（Magnolia bark）の葉、樹
皮（厚朴）、幹材、根皮などの部位から、マグノロー
ル、ホオノキオールを得ることができる。

【００１５】特にホオノキの樹皮は生薬の厚朴として知
られており、主としてホオノキ（Magnolia obovata、和
厚朴）、カラホオ（Magnolia officinalis、唐厚朴）及
びその変種（Magnolia officinalis var. biloba、同
上）の樹皮を用いる。

【００１６】ガン転移抑制剤は、具体的には、再発性ガ
ン予防剤、遊離ガン細胞着床阻害剤、ガン細胞浸潤阻害
剤、ガン組織摘出術後の滋養剤等がある。ガン転移抑制
剤に関するもので、ホオノキの部位を利用調製したも
の、又はこれを加工した製剤等、このような薬剤は新し
いタイプの抗ガン剤としてガン予防、特に転移ガンに対
して有用である。

【００１７】ホオノキの各部位を原料に調製したガン転
移抑制剤は、経口又は非経口に投与され、ガンの転移抑
制、再発予防、又は治療に用いることができる。又、ホ
オノキの全部或いは一部を利用した医療用医薬品の他、
ガン予防を目的とした医薬品、化粧品、医薬部外品、薬
草（薬膳）料理素材、健康食品として用いることができ
る。これらは、いずれも、ホオノキの成分であるマグノ
ロール、ホオノキオールの少なくともいずれか一種を有
効成分としている。

【００１８】なお、この発明でいう、「同効物」には、
ホオノキの同属植物であって、同様の成分を含むもの及
び同一用途の代替品として取り引きされているものを含
む趣旨である。

【００１９】又、この発明でいう「抽出物」とは、水、
親水性有機溶媒（メタノール、エタノール、ケトン等）
又はこれらの混合物による抽出エキス、及び水蒸気蒸留
による留出物が含まれる。

【００２０】本発明における医薬品としては、カプセル
剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の内服薬、軟膏剤、ク
リーム剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤、ハップ剤、挫剤、
プラスター剤等の外用薬、又は、注射薬等に応用でき、
日本薬局方製剤総則に記載された方法で製剤化できる。

【００２１】例えば、外用剤として使用する場合、基剤
としてはワセリン、パラフィン、シリコーン、及びプラ
スチックベース等の鉱物性基剤、植物油、豚油、ろう
類、単軟膏、単鉛軟膏等の動植物性基剤、親水軟膏等の
Ｏ／Ｗ型乳剤性基剤、親水ワセリン、精製ラノリン、ア
クアホール、オイセリン、ネオセリン、吸水軟膏、加水
ラノリン、親水プラスチベース（コールドクリーム）等
のＯ／Ｗ型乳剤基剤、マクロゴール類、及びソルベース
等の水溶性基剤、ベーシックローション、グリースレス
ローション等の懸濁性基剤、又、オレイン酸トリエタノ
ールアミン等の石鹸類、ジオクチルスルホコハク酸ナト
リウム等の硫酸化物等を挙げることができる。

【００２２】又、化粧品としては、スキンローション、
クリーム、乳液等に応用でき、適量を皮膚に塗布し、皮
膚ガン等の転移抑制を目的とし、健康的な皮膚、皮膚色
を保持する。

【００２３】さらに、ガン治療後の滋養やガン転移防止
を目的として使用する健康食品としても応用できる。ガ
ン転移は、ガン細胞が原発巣を離れて遊離し、血管内、
或いはリンパ管内に侵入し、さらに血流、或いはリンパ
液に運ばれて他の遠隔組織の血管壁或いはリンパ管に着
床することから起こる。着床したガン細胞は、血管壁或
いはリンパ管を抜けて脱出し、組織内で毛細血管を新生
して栄養分を補給しながら急激に増殖する。このガン転
移は複雑な過程を経て成立するため、その実験系も複雑
であるが、新しいタイプの抗ガン活性スクリーニング技
術としては、基底膜浸潤実験による活性で効果が確認で
きる。

【００２４】そこで、本明細書では、ガン細胞の接着性
や浸潤性を調べるために基底膜浸潤法のモデルとしてケ
モインベージョン法を用いた。この方法はＥＨＳ（Enge
lbleth−HOLM−Swarm ）腫瘍細胞が産生する細胞外マト
リックスを８ミクロンの穴の開いたフィルター上にコー
トして基底膜に見立てる。ガン細胞をその上に撒いて一
定時間培養すると細胞が基底膜に接着し伸展するのが観
察できる。ガン細胞が分泌する酵素で細胞外マトリック
ス層を分解すればガン細胞はフィルターの穴を通過でき
るようになり、下面に移動することができる。フィルタ
ーの下層に移動した細胞数を調べることにより細胞外マ
トリックスを浸潤する細胞数を調べることができる。ガ
ン組織での浸潤性の強さとケモインベージョン法による
細胞外マトリックス浸潤能とは相関性が見られることか
ら、本実験結果はガン転移抑制効果を検出できる。

【００２５】又、本発明はガン転移の抑制を行なうこと
ができるコラーゲン活性抑制剤としても利用できる。

【００２６】

【実施例】以下に、実施例を説明するが、実施例に先立
ち、マグノロール及びホオノキオールの抽出法、及び調
製法の例を示す。

【００２７】（抽出及び調製）以下にホオノキの樹皮、
根皮及び葉から抽出し加工したものの抽出例を示すが、
これらを利用するための調製加工法を限定するものでは
ない。又、ホオノキから得た試料中のマグノロール、ホ
オノキオール含量を示すが、産地、採取樹齢、又は樹木
部位ごとに含量が異なるため、この結果に限定されるも
のではない。

【００２８】１．ホオノキの樹皮、根皮、幹材及び葉の
調製 ホオノキから樹皮及び根皮をはぎ取り（５月から９月頃
なら容易にはぎ取れる）乾燥し、ミキサーなどで粉砕し
た。幹材は、黄緑色に心材部と白色の辺材部があり、そ
れぞれ別個に削り取り乾燥し、ミキサーなどで粉砕す
る。葉は５月から８月に採取し、生葉、日陰で乾燥し
た。以下、調製用または加工用にこれらを使用した場合
は、単に原料という。

【００２９】２．調製及び加工材中のマグノロール及び
ホオノキオール含量の測定 それぞれの原料約５０ｇづつを３００ｍｌのナス型フラ
スコに秤量し、エーテル２００ｍｌを加え還流冷却器を
取り付けた後、５０℃以下の水浴で１時間加熱した。冷
後ろ紙（定量用ろ紙）でろ過し、残渣にさらにエーテル
２００ｍｌを加え同様に操作した。エーテル層は合わ
せ、エバポレーターで減圧留去した。残留物にメタノー
ルを加えて溶解し、メタノールで正確に２０ｍｌとし試
料溶液とした。また、これらから抽出した希エタノール
エキス及び熱水抽出エキスはメタノール50mLに溶解し試
料溶液とした。

【００３０】ホオノキオール標準品（和光純薬工業，Lo
t.No.LEN7980）、マグノロール標準品（和光純薬工業，
Lot.No.LEP7742）各１０ｍｇを秤取し、メタノールに溶
解し正確に２０ｍｌとし標準溶液とした。ＨＰＬＣ条件
は、オクタデシルシラノール基を修飾したシリカゲル
（粒子径５μｍ、TSKgelトソー社）を４ｍｍ径長さ１５
ｃｍのカラムに充填したものを用い、移動相に水：アセ
トニトリル：酢酸混液（40:60:1 ）を毎分１．０ｍｌで
流し、紫外線吸光光度計（２９４ｎｍ）でマグノロール
及びホオノキオールを検出した。両成分の標準品を用い
含量を算出す

【００３１】る。その結果を表１に示した。 （以下、余白）

【００３２】

【表１】 ３． 熱水抽出エキスの調製法 原料をミキサーなどで粉末にし、その約５００ｇを秤取
し、２リットルのビーカーに入れる。これに蒸留水５０
０ｍｌを加え約３０分間浸積する。さらに、蒸留水５０
０ｍｌを追加しホットプレート上或はバーナーで約３時
間煮する。冷後、ガーゼをろ布とした広口のロートでろ
過する。残渣に、蒸留水１リットルを加え約１時間煮沸
する。冷後、同様にろ過する。ろ液は合わせ、定性用ろ
紙を用いて再度ろ過する。２００ｍｌのビーカーに分注
し、凍結する。凍結乾燥機を用い乾燥する。乾燥粉末を
合わせ収量を測定する。

【００３３】４． 希エタノールエキスの調製法 原料を前項３．と同様に粉末とする。この約５００ｇを
秤取し、２リットルのビーカーに入れる。希エタノール
を５００ｍｌに約３０分間浸積する。さらに希エタノー
ルを５００ｍｌ追加しよくかき混ぜ、約２４時間放置す
る。定性用ろ紙を通し口のロートでろ過する。抽出液の
保存は冷蔵室で行い、残留物にはさらに希エタノールを
１リットル追加し約２４時間放置する。同様にろ過し適
量ずつナス型フラスコに分注し、エバポレータで留去す
る。希エタノールエキスを合わせ収量を測定する。

【００３４】マグノロール及びホオノキオールの測定法
は前項と同様であり、その含量は表２に示す。

【００３５】

【表２】 ５．マグノロール及びホオノキオール精製法 次に、マグノロール及びホオノキオール精製法の例を示
し、本発明での抽出成分例を具体的に説明する。ただ
し、精製法はこれに限定されるものではない。

【００３６】５．１．ホオノキの樹皮又は根皮を材料に
したマグノロール及びホオノキオールの精製法 乾燥した原料（ホオノキの樹皮又は根皮）約３ｋｇを粉
末とし、エーテルを加えて一昼夜浸漬した。ブフナーロ
ートで吸引ろ過（定性用ろ紙）してエーテル層を集め、
これを３回繰り返して抽出した。エーテル層を濃縮後、
これにメタノールを同量徐々に加え、恒温水槽中（水温
約３０℃）で換気を行ないながら、エーテルを留去し
た。低温（約４℃）で一昼夜放置した上清部分をミリポ
アフィルター（膜孔サイズ５０μｍ）でろ過し、分取液
体クロマトグラフ装置（分取ＨＰＬＣ）用の試料とし
た。

【００３７】分取ＨＰＬＣ条件は、逆相単体シリカゲル
（Prep Nova-PackHRC18、４０mm×３００cm、粒子径６
μｍ、日本ウォーターズ社製）を充填したカラムを用い
た。移動相に水：メタノール：酢酸混液（３０：７０：
１）を毎分５．０ｍｌで流し、紫外線吸光光度計（２９
４nm）でマグノロール、及びホオノキオールを常法によ
り分取した。分取成分は文献値（藤田路一ら、薬学雑
誌．９３，４２２，１９７３）のマグノロール、及びホ
オノキオールと一致した。収率はおよそ８７％及び９２
％であった。

【００３８】５．２． ホオノキの葉を材料にしたマグ
ノロール及びホオノキオールの精製法 乾燥した原料（ホオノキの葉）約１０ｋｇをミキサー等
で粉末とする。この約１ｋｇを５リットルのビーカーに
取り、エーテル３リットルを加え、一昼夜浸漬する。ブ
フナーロート（径１５ｃｍ）に定性用ろ紙（アドバンテ
ック、Ｎｏ．２，１２．５ｃｍ）を置き、吸引ろ過して
エーテル層を集める。これを１０回繰り返し、エーテル
層を集めて約２リットルになるまで濃縮する。この５０
０ｍｌを２リットルの分液ロート入れ、水５００ｍｌを
加え振とう器で約３分振とうした後放置し、必要なら食
塩を加えて分離を早めてエーテル層を分離した。さらに
水５００ｍｌで３回同様に抽出した（クロロフィルの除
去のため）。残りのエーテル層についても同様に操作し
た。集めたエーテル層にメタノールを同量徐々に加え、
以下、前述の５．１．と同様に処理しマグノロール及び
ホオノキオールを得た。マグノロールの収率は約２４
％、ホオノキオールの収率は１５％であった。

【００３９】（実施例）以下に、上記３．、４．のよう
に調製した熱水抽出エキス（熱水抽出液）及び希エタノ
ールエキス（希エタノール抽出液）のガン転移抑制作用
を示す実施例を説明する。

【００４０】（実施例１）本実施例１は、ホオノキ樹皮
（厚朴）の熱水抽出液及び希エタノール抽出液のガン転
移抑制作用を示す実施例である。

【００４１】以下に、本実施例１及び後記する他の各実
施例において、使用するガン細胞、試料及び試料の調製
について、説明する。 （１．１） 細胞及び試料の調製 （１．１．１） 使用するガン細胞 使用するＨＴ−１０８０細胞は、ガン治療を受けていな
い３５歳の白人男性の繊維芽肉腫から確立された株であ
り、試験管外（in vivo）及び試験管内（in vitro ）
の転移実験に広く用いられている。本細胞の重要な特徴
の１つとしてin vivo及びin vitro での高い転移、浸
潤能力をもつことが挙げられ、分子量７２ｋＤａ及び９
２ｋＤａのIV型コラゲナーゼ（ＭＭＰ２，ＭＭＰ９）の
双方を分泌することが知られている。

【００４２】前記ＭＭＰ９は、血管或いはリンパ管の基
底膜の成分であるコラーゲンを分解する酵素として知ら
れており、前記ＨＴ−１０８０細胞は、上記酵素によっ
て、血管等の基底膜へ浸潤する。

【００４３】本細胞は以下に示す１０％Fetal Bovine
Serum （FBS ）-EMEM 中にて培養し継代、維持した。 ＜無血清（SF)-EMEMの調製法＞ ・Eagle,s Minimum Essential Medium （ＥＭＥＭ）（Gibco ，Lot.No.72P 1063） ９．５３ｇ ・炭酸水素ナトリウム ２．２ｇ ・5000単位/ml ペニシリン−5000μg/mlストレプトマイシン（Gibco ， Lot.No.18P5366） ０．５ｍｌ ・MEM 非必須アミノ酸溶液（Gibco ，Lot.No.24K9164） １０ｍｌ ・MEM ビタミン溶液（Gibco ，Lot.No.24K0260） ２０ｍｌ ・200mM L- グルタミン溶液（Gibco ，Lot.No.18K9164） １０ｍｌ ・100mM ピルビン酸ナトリウム（Gibco ，Lot.No.22N9561） １０ｍｌ 以上を特級水１リットルに溶解し、メンブランフィルタ
ー（0.20μm ）にてろ過滅菌後、４℃で保存した。

【００４４】＜１０％FBS-EMEMの調製法＞SF-EMEM ５０
０ｍｌに対しFBS （ウシ胎児血清）５０ｍｌを無菌的に
加え、４℃で保存した。

【００４５】（１．１．２） 酵素活性測定における培
養上清精製試料の調製 酵素活性測定における培養上清精製試料の調製には、ヒ
ト急性単球性白血病細胞THP-1 を使用した。THP-1 はゼ
ラチンを基質とする92kDa のMMP9(gelatinase B)のみを
特異的に分泌することが知られている。本細胞は以下に
示す10%FBS-RPMI 中にて培養し継代、維持した。

【００４６】なお、ＨＴ−１０８０細胞から直接ＭＭＰ
９を抽出する方法も考えられるが、ＭＭＰ２との分離が
必要となり、又、量的にＭＭＰ９を多く得られないた
め、ここでは、上記THP-1 から分泌したＭＭＰ９を使用
した。

【００４７】 ＜SF-RPMI の調製法＞ ・RPMI 1640 （Gibco ，Lot.No.72P8553） １０．３９ｇ ・炭酸水素ナトリウム ２．０ｇ 以上を特級水１リットルに溶解し、メンブランフィルタ
ー（０．２０μm ）にてろ過滅菌後、４℃で保存した。

【００４８】＜10%FBS-RPMI の調製法＞SF-RPMI ５００
ｍｌに対しFBS ５０ｍｌを無菌的に加え、４℃で保存し
た。 （１．２） PBS およびEDTAの調製法 ＜PBS （りん酸緩衝溶液）の調製＞ ・NaCl ８．５０ｇ ・Na₂HPO₄ １．４８ｇ ・KH₂PO₄ ０．３５ｇ 以上を特級水１．０リットルに溶解後、高圧蒸気滅菌
（１２１℃、２０分間）した。非無菌的に使用するもの
についてはそのまま用いた。

【００４９】＜1mM EDTA-PBSの調製＞1mM のEDTA（
０．３７２２４ｇ）をPBS １．０リットルに溶解後、高
圧蒸気滅菌（１２１℃、２０分間）した。

【００５０】（１．３） HT-1080細胞懸濁液の調製法 HT-1080 細胞は細胞懸濁液として実験に用いた。すなわ
ち、細胞を培養しているカルチャーフラスコから培養上
清を除き、フラスコにPBS を１０ｍｌ入れて細胞を洗っ
た後、取り除く。フラスコに１ｍＭ EDTA-PBS を５ｍｌ
入れて１分ほど放置した後、取り除く。フラスコをたた
いて細胞をはがす。フラスコにSF-EMEMを適量加えてピ
ペット操作により細胞を撹拌した後、その一部を遠沈管
に移し、残りには適量の１０％FBS-EMEMを加えて再び培
養を続けた。遠沈管を遠心分離（１０００回転，５分
間）にかけ、上清を捨てる。遠心管の細胞の溜った底の
部分をタッピングした後、SF-EMEM を適量加えミキサ−
にかけて撹拌した。以後、遠沈管は氷中に置く。細胞数
の計測を行い、活性試験に必要な細胞数が得られるよう
に適量のSF-EMEM を加えて希釈した。

【００５１】（１．４） 試料 前項で得たホオノキ樹皮（厚朴）びホオノキの葉から抽
出した、希エタノールエキス及び熱水抽出エキスを使用
した。各試料とも１００％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキ
シド）に溶解して２０ｍｌ溶液とし、凍結保存する。こ
れを用時PBS で希釈したものをサンプルとした。

【００５２】（２） ガン転移抑制試験方法（基底膜浸
潤試験） 次に、ガン転移抑制試験方法を、各試料毎に下記（２．
１）の「器具および試薬」を使用して、（２．２）の
「操作」に従って行った。

【００５３】（２．１） 器具および試薬 ・1mg/mlマトリジェル（MG）溶液 マトリジェル（Collaborative Biomedical Products ）
を無菌PBS にて１mg/ml に希釈して用いた。

【００５４】・24穴マルチプレート ・トランスウェルチャンバー（Coastar 社） ・ポリビニルピロリドンフリー・ポリカーボネートフィ
ルター（8 μm ，13mm，Coastar 社） ・オイキット（EUKITT：製造元 Ｏ，KINDLER ，発売元
高橋技研硝子（株） ・ヘマトキシリン/ エオシン < ヘマトキシリン溶液の調製> ・ヘマトキシリン結晶（ナカライテスク、Lot.No.M3B7508） ２．５ｇ ・95％エタノ−ル ２５ｍｌ ・硫酸アルミニウムカリウム ５０ｇ ・過マンガン酸カリウム ０．５ｇ ・蒸留水 ヘマトキシリン- ９５％エタノ−ル溶液２５ｍｌと硫酸
アルミニウムカリウム溶液５００ｍｌ、過マンガン酸カ
リウム溶液４７ｍｌを大型の蒸発皿にいれ、ガラス棒で
攪拌しながら加熱する。沸騰したら３０秒後に加熱を止
め、放冷した後濾過する。５００ｍｌのバイアルビンに
て常温で保存する。尚、使用時には褐色小バイアルビン
に小分けする。

【００５５】 ＜エオシン溶液の調製＞ ・エオシン Ｙ（林純薬工業，Lot.No. IHL-08436 ） ０．５ｇ ・蒸留水 １００ｍｌ エオシンＹを蒸留水１００mLに溶解させ、褐色バイアル
ビンにて常温で保存する。使用時に褐色小バイアルビン
に小分けする。

【００５６】（２．２） 操作 （２．２．１） トランスウェルチャンバーの組立 チャンバー底面に薄くマニキュア（接着剤）を塗布す
る。ポリビニルピロリドンフリー・ポリカーボネートフ
ィルターの光沢面を上にして、上に接着剤のついたウェ
ルを押し付ける。フィルターとプラッテの間には付属の
シートが存在する。フィルターが完全に接着されたかど
うか確認する。チャンバーを逆さにして乾燥させる。

【００５７】（２．２．２） フィルターコーティング チャンバーを24穴プレートに入れ、チャンバーの内側か
らフィルターにマイクロピペッターでマトリジェル（ P
BS中）を５μg/５０μｌのせる。室温で風乾させる。

【００５８】（２．２．３） インキュベ−ション 24穴マルチプレートの各穴に１０％FBS-EMEMを６００μ
ｌずつ入れる。マイクロチューブに細胞懸濁液１００μ
ｌ（1.0 ×105 細胞数）及びサンプル（２５μｌ）（ま
たはコントロールとしてPBS ）を合わせ、ミキサーにか
けて撹拌する。チャンバーをプレートに入れる。チャン
バー上室に前記攪拌した液を１２５μｌずつ加える。プ
レートにふたをして３７℃でインキュベートする（ＣＯ
₂ インキュベ−ター）。

【００５９】（２．２．４） 細胞の染色 インキュベート終了後チャンバーを横向きにして（フィ
ルター面を下にしないようにすること）メタノールに１
分間程度浸す。チャンバーをキムワイプに横向きに取
り、メタノールをきる。チャンバーごとにヘマトキシリ
ン液に３分間浸した後、水浴にいれてヘマトキシリンを
洗い流す。チャンバーをキムワイプに横向きに取り、水
をきる。チャンバーごとエオシン液に20秒間浸した後、
水洗する。次にチャンバーの水を切った後、押しつぶし
た綿棒でチャンバーの内側からフィルターを拭く。

【００６０】（２．２．５） プレパラ−トの作成 スライドグラスにガラス棒でEUKITTを適量のせる。フィ
ルタ−をキシレンで湿らせて、フィルタ−下層面を上に
してスライドグラスのEUKITT上に静かにのせる。カバ−
ガラスの一端にキシレンをつけて気泡が入らないようス
ライドグラスにのせ、その上をピンセットで軽く押さえ
つけてEUKITTをはみ出させる。

【００６１】（２．２．６）カウント １００倍で観察し細胞が均一に出ている部分を選択し、
４００倍に切り替える。４００倍下でランダムに５視野
を選択し、カウントする。５視野の平均値をそのフィル
タ−についてのデ−タとする。

【００６２】（２．２．７） 結果 本実施例において、ホオノキ樹皮（熱水抽出液及び希エ
タノール抽出液）の抽出液を試料濃度０．１、１、１
０、１００、１０００（μｇ／ｍｌ）にした場合の結果
を図１及び図２に示す。

【００６３】なお、図１及び図２では、縦軸は浸潤率
（％）、横軸は試料（サンプル）濃度（μｇ／ｍｌ）を
表す。浸潤率とは、試料を入れないで同様に上記操作で
行なった場合に浸潤した細胞数との割合である。

【００６４】上記図１及び図２に示されているように、
ホオノキ樹脂の熱水抽出液、希エタノール抽出液のいず
れもが、その試料濃度を上げると、HT-1080 細胞の浸潤
率が低下していることが認められ、これらのガン転移抑
制作用は極めて高いことが確認できた。

【００６５】（実施例２）本実験例では、ホオノキ葉の
熱水抽出液及び希エタノール抽出液のガン転移抑制作用
を示す。

【００６６】本実施例では、実施例１の操作、試料のう
ち、前項実施例１の1-4 の試料において、ホオノキ樹皮
（厚朴）やホオノキ葉抽出エキスを用いたところを、こ
の実施例２ではホオノキ葉の熱水抽出液及び希エタノー
ル抽出液を使用した。各試料とも１００％ＤＭＳＯに溶
解して２０ｍＭ溶液とし、凍結保存する。これを用時Ｐ
ＢＳで希釈したものをサンプル（試料）とした。上記の
試料が異なるのみで、他については、実施例１と同様に
測定した。その結果を図３及び図４に示す。

【００６７】上記図３及び図４に示されているように、
ホオノキ葉の熱水抽出液、希エタノール抽出液のいずれ
もが、その試料濃度を上げると、HT-1080 細胞の浸潤率
が低下していることが認められ、これらのガン転移抑制
作用は極めて高いことが確認できた。

【００６８】（実施例３）本実施例では、マグノロール
及びホオノキオールのガン転移抑制作用を示す。前記実
施例１の１−４の試料に、ホオノキ樹皮（厚朴）やホオ
ノキ葉抽出エキスを用いたところを、ホオノキオール及
びマグノロールを使用した。各試料とも１００％ＤＭＳ
Ｏに溶解して２０ｍＭ溶液とし、凍結保存する。これを
用時ＰＢＳで希釈したものをサンプル（試料）とした。
上記の試料が異なるのみで、他については、実施例１と
同様に測定した。試料濃度は、それぞれ０．０１、０．
１１、１０、１００（μＭ）にした場合である。その結
果を図５及び図６に示す。

【００６９】なお、図５及び図６において、縦軸は浸潤
率（％）、横軸は試料（サンプル）濃度（μＭ）を表
す。上記図５及び図６に示されているように、マグノロ
ール、ホオノキオールのいずれもが、その試料濃度を上
げると、HT-1080 細胞の浸潤率が低下していることが認
められ、これらのガン転移抑制作用は極めて高いことが
確認できた。

【００７０】又、実施例３においては、マグノロール及
びホオノキオールを試料（サンプル）としてIV型コラゲ
ナーゼ活性測定を行なった。以下に、IV型コラゲナーゼ
活性測定を説明する。

【００７１】（３） IV 型コラゲナーゼ活性測定 次に、IV型コラゲナーゼ活性測定を下記（３．１）「器
具および試薬」、（３．２）「操作」によって行なっ
た。

【００７２】（３．１） 器具および試薬 ・A 緩衝液 Tris-HCl １．２ｇ NaCl ５８．４４ｇ 以上を特級水１リットルに溶解し、pH７．５に調製す
る。

【００７３】・B 緩衝液 Tris-HCl １．２ｇ DMSO １００ｇ 以上を特級水１リットルに溶解し、pH７．５に調製す
る。

【００７４】・TNC 緩衝液 Tris-HCl ６．０ｇ NaCl ８．８ｇ CaCl₂ １．４７ｇ Brij-35 （ブリジ系界面活性剤）０．５ｇ 以上を特級水1 リットルに溶解し、pH７．５に調製す
る。

【００７５】・５０μg/ｌ TPA-RPMI SF−EMEM（無血清EMEM）培地に12-O-tetradecanoylphor
bol 13-acetate(TPA）を５０μg/ｌとなるように添加す
る。

【００７６】・ゼラチンセファロースアフィニティーカ
ラム ・IV型コラゲナーゼ測定キット（ヤガイ） ・4-アミノフェニール水銀酢酸（APMA） （３．２） 操作 （３．２．１） THP-1 培養上清試料の精製 １０％FBS-RPMI培地で培養しているTHP-1 を遠心分離
（１０００回転，５分間）後、SF-RPMI に再懸濁させて
回収し、５０μg/ｌ TPA-RPMIで２日間培養する。細胞
培養液を遠心分離（１０００回転，５分間）し、上清を
回収する。あらかじめＡ緩衝液を流しておいたゼラチン
セファロースアフィニティーカラムに培養上清をとお
す。Ｂ緩衝液で洗い流す。この画分は回収する。回収し
た画分をイオン交換水に対して１晩透析する。これを凍
結乾燥により１０００倍濃縮する。これを TNC緩衝液で
希釈して用いる。

【００７７】（３．２．２） インキュベーション IV型コラゲナーゼ測定キット中のfluorecein isothiocy
anate (FITC)標IV型コラーゲン（25μg ）に中和反応液（25μ
l ）、培養上清試料 （25μl ）、APMA（25μl ）およびサンプル（25μl ）
を氷中にて加え、室温で２０分放置後、４２℃、４時間
インキュベートする。また別にサンプル、培養上清試料
を加えず、TNC 緩衝液とPBS （各25μl ）を入れ１分間
煮沸したものを総量とする。なお、サンプル（試料）と
は、ホオノキオール、及びマグノロールの各種濃度のも
のである。

【００７８】（３．２．３） 蛍光測定 インキュベート終了後、５分間氷冷し、総量を含むすべ
てに蛍光測定調製液を３００μｌ加えて撹拌、３０分間
氷冷する。その後、総量以外は遠心にかけ( １５０００
回転，１０分間）、上清の蛍光強度を測定する（Ex=495
nm，Em=520nm）。

【００７９】（３．２．４） コラゲナーゼ活性阻害率
の計算 コラゲナーゼ活性阻害率（％）の計算を下記式にて行な
った。

【００８０】

【数１】 上記式において、Ａはサンプル（試料）の蛍光強度、Ｂ
は総量の蛍光強度、Ｃはブランクの蛍光強度である。

【００８１】なお、上記式中、ブランクは、培養上清試
料の代わりにTNC 緩衝液をくわえたものを反応温度４２
℃、反応時間４時間、使用した基質量２５μｇ、酵素量
２５μｌで使用した。

【００８２】（３．２．５） 結果 本試験で得られた結果を図７に示す。図７において、縦
軸はコラゲナーゼ活性阻害率（％）、横軸は試料（サン
プル）濃度（μＭ）を表す。

【００８３】図７に示されているように、マグノロー
ル、ホオノキオールのいずれもが、その試料濃度を上げ
ると、コラゲナーゼ活性阻害率が高まっていることが認
められた。すなわち、マグノロール、ホオノキオールの
いずれもが、ガン細胞による血管等の基底膜を分解する
コラゲナーゼ（酵素）の活性を抑制し、その結果、ガン
転移抑制作用は極めて高いことが確認できた。

【００８４】（実施例４）次に、製剤化した実施例を説
明する。この実施例は、内服用錠剤（１錠 ３７０ｍ
ｇ）の実施例であって、下記の成分及び分量を使用す
る。

【００８５】 （成分及び分量又は本質） 規格 成分名 分量 1-1 ホオノキオール ５０ｍｇ 又は 1-2 マグノロール ５０ｍｇ 2 賦形剤 日本薬局方 トウモロコシデンプン １００ｍｇ 3 賦形剤 日本薬局方 結晶セルロース １５０ｍｇ 4 賦形剤 日本薬局方 ヒドロキシプロピルセルロース ３０ｍｇ 5 崩壊剤 カルメロース ５ｍｇ 6 賦形剤 日本薬局方 無水ケイ酸 ３０ｍｇ 7 賦形剤 乳糖 ５ｍｇ 合計 ３７０ｍｇ 上記の分量比に従い、日本薬局方製剤総則錠剤の項に準
じて調製し、径約１５ｍｍの錠剤とする。ただし、ホオ
ノキオール及びマグノロールを同時に配合する場合は、
トウモロコシデンプンの量を加減して調製する。

【００８６】（実施例５）この実施例は、ガン転移抑制
剤としてスキンローション（１本 １００ｍｌ）に具体
化した実施例であって、スキンローションは下記の成分
及び分量からなる。

【００８７】 （成分及び分量又は本質） 規格 成分名 分量(w/v%) 1-1 ホオノキ樹皮エキス ５．０％ 又は 1-2 ホオノキオール ０．５％ 又は 1-3 マグノロール ０．５％ 2 粧原基 １，３ブチレングリコール ４．０％ 3 粧原基 ソルビット液 １．０％ 4 薬審295 変性アルコール ４．０％ 5 香料 ０．３％ 6 粧原基 パラオキシ安息香酸メチル ０．０５％ 7 粧原基 クエン酸 ０．３％ 8 法定色素 青色１号 微量 9 粧原基 精製水 上記各成分を混合したとき総量が１００％ となる分量 合計 １００％ 製造法は、上記成分のうち、香料を変性アルコールに溶
かし、別に１（ホオノキ樹皮エキス、ホオノキオール、
マグノロールのうちのいずれか一つ、或いは二つ又は三
つ併せて）〜３，５〜８を精製水に溶かし、両者を今後
した後、ろ過する。検査後、容器に充填して製品とす
る。

【００８８】なお、上記１の成分（ホオノキ樹皮エキ
ス、ホオノキオール、マグノロール）のうち、二つ又は
三つの成分を合わせる場合は、精製水の量を加減する。 （実施例６）次に、ガン治療後のガン転移防止を目的に
使用する健康食品滋養剤（１錠 ４１０ｍｇ）の実施例
について説明する。同滋養剤は下記の成分及び分量から
なる。

【００８９】 （成分及び分量又は本質） 規格 成分名 分量 1-1 ホオノキオール ５０ｍｇ 又は 1-2 マグノロール ５０ｍｇ 2 賦形剤 コムギデンプン ２００ｍｇ 3 賦形剤 結晶セルロース １００ｍｇ 4 崩壊剤 カルメロース ５ｍｇ 5 賦形剤 ヒドロキシメチルセルロース ５０ｍｇ 7 賦形剤 ショ糖 ５ｍｇ 合計 ４１０ｍｇ 上記の分量比に従い、秤取して均一になるまで混合す
る。錠剤製造に準じて打錠し、径約１０ｍｍの錠剤とす
る。ただし、ホオノキオール及び マグノロールを同時
に配合する場合は、コムギデンプンの量を加減して調製
する。

【００９０】（実施例７）次に、ガン転移防止を目的に
使用する健康食品として、ホオノキ入り粥に具体化した
実施例について説明する。同健康食品は下記の成分及び
分量からなる。

【００９１】 製造法は、上記白米を水でといた後、ホオノ葉エキス，
クコ，オタネニンジンと水３００ｍｌ入れて炊き上げ、
レトルト容器に充填して製品とする。

【００９２】ただし、ホオノキ葉エキスの代わりに、ホ
オノキオール又はマグノロールを配合してもよい。な
お、上記実施例１で示された、ホオノキ樹皮の熱水抽出
液、ホオノキ樹皮の希エタノール抽出液はそれぞれコラ
ーゲナーゼ活性抑制剤にもなる。

【００９３】又、実施例２で示されたホオノキ葉の熱水
抽出液、ホオノキ葉の希エタノール抽出液はそれぞれコ
ラーゲナーゼ活性抑制剤にもなる。実施例３で示された
マグノロール、ホオノキオールはそれぞれコラーゲナー
ゼ活性抑制剤にもなる。

【００９４】実施例４、実施例５、実施例６及び実施例
７で説明した内服用錠剤、スキンローション、健康食品
滋養剤、健康食品はコラーゲナーゼ活性抑制剤ともな
る。

【００９５】

【発明の効果】以上詳述したように、請求項１乃至請求
項３の発明によれば、血管、リンパ管の基底膜を分解し
て浸潤するガン細胞の転移を抑制することができる。こ
のため、このガン転移抑制剤を医療用薬品、医療用医薬
品の他、ガン転移予防を目的とした医薬品、化粧品、医
薬部外品、薬草（薬膳）料理素材、健康食品の有効成分
として利用することができる。

【００９６】又、請求項４乃至請求項６の発明によれ
ば、血管、リンパ管の基底膜の成分であるコラーゲンを
分解する酵素の活性を抑制することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１のホオノキ樹皮の熱水抽出液を使用し
たときのガン細胞の浸潤率を示すグラフ。

【図２】実施例１のホオノキ樹皮の希エタノール抽出液
を使用したときのガン細胞の浸潤率を示すグラフ。

【図３】実施例２のホオノキ葉の熱水抽出液を使用した
ときのガン細胞の浸潤率を示すグラフ。

【図４】実施例２のホオノキ葉の希エタノール抽出液を
使用したときのガン細胞の浸潤率を示すグラフ。

【図５】実施例３のマグノロールを使用したときのガン
細胞の浸潤率を示すグラフ。

【図６】実施例３のホオノキオールを使用したときのガ
ン細胞の浸潤率を示すグラフ。

【図７】実施例３のマグノロール及びホオノキオールの
コラゲナーゼ活性阻害率を示すグラフ。

【手続補正書】

【提出日】平成１０年１１月１３日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００８】

【課題を解決するための手段】以上の目的を達成するた
めに、請求項１の発明は、ホオノキオールを有効成分と
するガン転移抑制剤を要旨としている。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００９】請求項２の発明は、ホオノキもしくはホオ
ノキの同効物又はこれらの抽出物であるホオノキオール
を有効成分とするガン転移抑制剤をその要旨としてい
る。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１０】請求項３の発明は、マグノロール、ホオノ
キオールのうち少なくとも一種を有効成分とするコラゲ
ナーゼ活性抑制剤を要旨としている。請求項４の発明
は、ホオノキもしくはホオノキの同効物又はこれらの抽
出物を有効成分とするコラゲナーゼ活性抑制剤を要旨と
するものである。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１１】請求項５の発明は、抽出物がマグノロー
ル、ホオノキオールのうち少なくとも一種である請求項
４に記載のコラゲナーゼ活性抑制剤を要旨とするもので
ある。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１７】ホオノキの各部位を原料に調製したガン転
移抑制剤は、経口又は非経口に投与され、ガンの転移抑
制、再発予防、又は治療に用いることができる。又、ホ
オノキの全部或いは一部を利用した医療用医薬品の他、
ガン予防を目的とした医薬品、化粧品、医薬部外品、薬
草（薬膳）料理素材、健康食品として用いることができ
る。これらは、いずれも、ホオノキの成分であるホオノ
キオールを有効成分としている。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９５】

【発明の効果】以上詳述したように、請求項１及び請求
項２の発明によれば、血管、リンパ管の基底膜を分解し
て浸潤するガン細胞の転移を抑制することができる。こ
のため、このガン転移抑制剤を医療用薬品、医療用医薬
品の他、ガン転移予防を目的とした医薬品、化粧品、医
薬部外品、薬草（薬膳）料理素材、健康食品の有効成分
として利用することができる。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９６】又、請求項３乃至請求項５の発明によれ
ば、血管、リンパ管の基底膜の成分であるコラーゲンを
分解する酵素の活性を抑制することができる。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マグノロール、ホオノキオールのうち少
   なくとも一種を有効成分とするガン転移抑制剤。
2. 【請求項２】 ホオノキもしくはホオノキの同効物又は
   これらの抽出物を有効成分とするガン転移抑制剤。
3. 【請求項３】 抽出物がマグノロール、ホオノキオール
   のうち少なくとも一種である請求項２に記載のガン転移
   抑制剤。
4. 【請求項４】 マグノロール、ホオノキオールのうち少
   なくとも一種を有効成分とするコラゲナーゼ活性抑制
   剤。
5. 【請求項５】 ホオノキもしくはホオノキの同効物又は
   これらの抽出物を有効成分とするコラゲナーゼ活性抑制
   剤。
6. 【請求項６】 抽出物がマグノロール、ホオノキオール
   のうち少なくとも一種である請求項２に記載のコラゲナ
   ーゼ活性抑制剤。