KR20220170522A

KR20220170522A - 로리올라이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물

Info

Publication number: KR20220170522A
Application number: KR1020210081467A
Authority: KR
Inventors: 김현수; 이대성; 이정민; 임미진; 고석천; 신정민; 김지율
Original assignee: 국립해양생물자원관
Priority date: 2021-06-23
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2022-12-30

Abstract

본 발명은 로리올라이드(loliolide)를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것으로, 항염증용 조성물로서, 괭생이모자반(Sargassum horneri)에서 분리된 로리올라이드(loliolide)가 전 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α 및 PGE2)의 발현을 억제하고, 염증 매개 단백질 발현을 억제하는 것을 확인함으로써, 괭생이모자반(Sargassum horneri)에서 분리된 로리올라이드(loliolide)를 포함하는 조성물을 항염증 제제로 제공한다.

Description

로리올라이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물{Anti-inflammatory composition comprising loliolide as an active ingredient}

본 발명은 로리올라이드(loliolide)를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.

염증반응은 조직 또는 세포가 손상되거나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개 인자 및 면역세포가 관련되어 나타나는 효소 활성화, 염증매개 물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상이다. 구체적으로, 외부 세균이 특정 조직에 침입하여 증식을 하게 되면 생체의 백혈구가 이를 인지하여 증식된 외부 세균을 활발히 공격하게 되는데, 이 과정 중 발생하는 백혈구의 사해가 균에 의하여 침입받은 조직에 축적됨과 동시에 백혈구에 의하여 사멸된 침입균의 세포 파괴물이 침입받은 조직 내로 융해되어 농양이 형성된다.

정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 인체의 생명을 위협하는 질환으로서 급성염증, 류마티스 관절염과 같은 관절 내에서의 질환, 건선 등의 형태로 나타나는 피부질환 및 기관지 천식 등의 알레르기성 염증질환 등이 나타나게 되며 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.

TNF-α(tumor necrosis factor-α)는 세균 감염 및 종양 질환에 대한 숙주 면역 반응 중에 활성화된 대식세포

및 여러 다양한 세포에 의해 생성된다. 이 사이토카인은 염증 반응의 중요한 매개체로도 알려져 있는데, 류마티스성관절염(RA), 건선성 관절염, 크론병, 건선, 강직성척수염(AS)과 같은 염증성 질환에 중요한 역할을 담당하고 있는 염증성 사이토카인이다. 예를 들면, 류마티스성관절염에서 TNF-α는 활액 염증을 지속시키고 뼈와 연골을 지속적으로 파괴시킨다. 따라서, TNF-α의 특이적 생물 활성을 억제하는 것이 요구되므로, TNF-α가 매개되는 세포 반응을 막고 염증 전 사이토카인의 활성과 TNF-α에 의해 조절되는 과정을 조정하고자 하는 목적으로 TNF-α를 억제하는 다양한 생물학적 제제가 개발되고 있다

한국공개특허공보 제10-2017-0076967호 (2017. 07. 05. 공고)

본 발명의 목적은 항염증용 조성물로서, 괭생이모자반(Sargassum horneri)에서 분리된 로리올라이드(loliolide)가 전 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α 및 PGE2)의 발현을 억제하고, 염증 매개 단백질 발현을 억제하는 것을 확인함으로써, 괭생이모자반(Sargassum horneri)에서 분리된 로리올라이드(loliolide)를 포함하는 조성물을 항염증 제제로 제공하는 것이다.

본 발명은 로리올라이드(loliolide)를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항염증용 조성물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 항염증용 조성물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 항염증용 조성물로서, 괭생이모자반(Sargassum horneri)에서 분리된 로리올라이드(loliolide)가 전 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α 및 PGE2)의 발현을 억제하고, 염증 매개 단백질 발현을 억제하는 것을 확인함으로써, 괭생이모자반(Sargassum horneri)에서 분리된 로리올라이드(loliolide)를 포함하는 조성물을 항염증 제제로 제공될 수 있다.

도 1은 괭생이 모자반(Sargassum horneri)에서 분리된 로리올라이드(loliolide)의 화학 구조(a) 및 염증 경로(b)를 나타내는 그림이다.
도 2는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 로리올라이드(loliolide)가 전 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α 및 PGE2)의 발현에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 3은 LPS로 자극된 대식 세포에서 로리올라이드(loliolide)가 염증 매개 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블로팅(a) 및 mRNA 분석(b, c)으로 평가한 결과이다.
도 4는 로리올라이드(loliolide)가 전 염증성 사이토카인 및 toll-유사 수용체의 발현 수준에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 5는 로리올라이드(loliolide)가 NF-κB (a, b) 및 MAPK (c) 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 평가한 결과이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상기 로리올라이드(loliolide)는 하기 화학식 1로 표시되는 물질이며, 구체적으로 6-하이드록시-4,4,7a-트리메틸-5,6,7,7a-테트라하이드로벤조퓨란-2(4H)-원(6-hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7a-tetrahydrobenzofuran-2(4H)-one)이다.

[화학식 1]

상기 로리올라이드(loliolide)는 괭생이모자반(Sargassum horneri)에서 분리된 것이며, IL-1β, IL-6, TNF-α 및 PGE2의 발현을 억제하고, IκBα의 인산화를 억제하며, p38, ERK 및 JNK의 발현을 억제하여 항염증 활성을 나타낸다.

상기 괭생이모자반(Sargassum Horneri)은 모자반목 모자반과에 속하는 갈조류로 우리나라 동남해안 및 일본의 전 연안에서 서식하고 있으며 주로 사료로 사용되고 있다.

상기 염증성 질환은 건선, 접촉성 피부염, 알레르기 피부질환 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 경구 투여일 경우, 정제, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여일 경우, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등으로 제형화 될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000 mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여되거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하 내, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 항염증용 조성물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능 식품"이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 본 발명에 따른 조성물의 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 "개선"이란 본 발명의 조성물을 개체에 투여하거나 섭취시켜 질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예> 실험 재료 및 방법

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 시약 및 재료

사용된 시약은 특별히 명시되지 않는 이상 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 세포 성장 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium -DMEM)는 GIBCO Inc. (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입한 RAW 264.7 대식세포를 사용하였다. 성장 배지에는 GIBCO Inc.에서 구입한 혈청(fetal bovine serum - FBS) 및 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)가 추가로 보충되었다. 웨스턴 블로팅에 필요한 1차 및 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 사이토카인 키트는 eBioscience (San Diego, CA, USA), R&D Systems (Minneapolis, MN, USA), BD Opteia (San Diego, CA, USA), 및 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)을 포함한 여러 공급 업체에서 구입하였다.

2. 괭생이모자반( Sargassum horneri ) 추출물 제조 및 화합물 분리

괭생이 모자반(Sargassum horneri)은 2015년 3월에 대한민국 제주도에서 수집되었다. 이물질을 제거하고 샘플을 저온 보관하였다. 추출, 정제 및 분리 과정에 사용되는 모든 용매는 분석 등급을 사용하였으며, Daejung Chemicals & Metals Co. (Seoul, Korea)에서 구입하였다. DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium), FBS(fetal bovine serum) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)은 Gibco BRL (Burlington, ON, Canada)에서 구입하였다. DMSO(Dimethyl sulfoxide), 및 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoium bromide)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다.

괭생이 모자반(Sargassum horneri) 분말 50g을 500 mL의 80% MeOH로 37℃에서 10회 반복 추출하고, 회전 증발기를 사용하여 용매를 증발시켰다. 조 추출물을 물에서 균질화하고, 괭생이 모자반(Sargassum horneri)은 2015년 3월에 대한민국 제주도에서 수집되었다. 이물질을 제거하고 샘플을 저온 보관하였다. 추출, 정제 및 분리 과정에 사용되는 모든 용매는 분석 등급을 사용하였으며, Daejung Chemicals & Metals Co. (Seoul, Korea)에서 구입하였다. DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium), FBS(fetal bovine serum) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)은 Gibco BRL (Burlington, ON, Canada)에서 구입하였다. DMSO(Dimethyl sulfoxide), 및 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoium bromide)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다.

로리올라이드(loliolide)은 괭생이모자반(Sargassum horneri)으로부터 추출/정제하여 준비하였다. 구체적으로 도 1에 나타난 바와 같이, 괭생이모자반(Sargassum horneri)을 80% 메탄올로 추출한 후, 클로로포름으로 분획 추출하였다. 클로로포름 분획물은 n-헥산:에틸아세테이트:메탄올:DW 비율이 5:5:5:5(v/v) 비율인 용매 시스템에 적용하여 HPCPC(high-performance centrifugal partition chromatography)를 이용하여 분리하였다.

분리된 로리올라이드(loliolide)는 PDA 검출기가 장착된 HPLC(high-performance liquid chromatography) 시스템(Waters Corporation, Milford, MA, USA)을 사용하여 단일 화합물인지 분석하였다. 로리올라이드(loliolide)의 구조는 JEOL DELTA-400 (400 MHz) 분광계(Peabody, MA, USA)에서 1H, 13C, DEPT, COSY, 및 HMBC NMR 스펙트럼 기록으로 확인하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 백색 결정의 화합물을 얻었다; m/z 196.11; 1H-NMR (CD3OD, 400MHz) δ : 5.65 (1H, S, H-2), 1.30 (3H, S, H-9), 1.11 (3H, S, H-8); 13C-NMR (CD3OD, 100MHz) δ : 185.84 (C-1), 174.60 (C-3), 113.49 (C-2), 89.12 (C-4), 67.41 (C-6), 37.34 (C-8), 31.16 (C-10), 27.57 (C-11), 26.98 (C-9).

3. 세포주 배양

뮤린 대식세포(RAW 264.7)를 배양하고, 10% 열 불활성화 FBS 및 100 IU/mL 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)로 DMEM 배지에 계대 배양하였다. 배양은 Sanyo 인큐베이터 (Sanyo MCO - 18AIC; Moriguchi, Japan)에서 진행되었다. 주기적인 계대 배양 후, 세포의 기하 급수적 성장기를 사용하였다. 스톡 샘플은 DMSO에 용해시켜 초기에 준비하였다. 세포 성장 배지를 사용하여 샘플 용액을 연속적으로 희선하였다.

4. 전 염증성 사이토카인 수준 평가

전 염증성 사이토카인 수준은 세포를 로리올라이드(loliolide)에 1 시간 동안 노출시키고 LPS(1 μg/mL)로 자극하여 평가하였다. 세포의 파종으로부터 48 시간 완전히 배양한 후, 세포 배양 상등액을 개별적으로 회수하였다. 제조사의 지침에 따라 구입한 상업용 ELISA 키트로 PGE2를 포함한 사이토카인의 수준을 정량화하였다.

5. 웨스턴 블롯

특정 방법에는 유사한 세포 파종(2 X 10⁵ cells mL^-1) 및 처리를 포함하였다. 세포를 수확하고 용해시키고 단백질을 정량화하였다. 관련 단백질 수준을 측정하기 위해 염증 경로에 포함되는 NF-κB (IκB-α, p65), MAPKs’ (ERK, p38, 및 JNK), iNOS, 및 COX-2 등의 특정 경로 단백질이 선택되었다. 전기 영동에는 Sulfate-polyacrylamide gel (12%)이 사용되었다. 이를 니트로 셀룰로오스 막으로 옮기고 탈지유로 차단하고 관련 1차 항체와 함께 밤새 배양하였다. HRP-접합된 2차 항체는 배양 후 추가되었다. 화학 발광 기질 (Cyanagen Srl, Bologna, Italy)을 사용하여 밴드를 발현하였다. 밴드는 FUSION SOLO Vilber Lourmat 시스템으로 사진을 찍고 ImageJ 프로그램으로 정량화하였다.

6. 추출된 RNA에서 cDNA 준비

세포를 수확하고 RNA를 Tri-Reagent™ 추출 키트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 추출하였다. 추출된 총 RNA의 순도를 μDrop plate (Thermo Scientific)로 측정하였다. prime Script™ (TaKaRa BIO INC, Japan) cDNA 키트를 사용하여 cDNA를 합성하고 -80℃에 보관하였다.

7. 실시간 정량 PCR 분석

전 염증성 사이토카인 및 염증 매개체의 상대적 유전자 발현 수준을 분석하기 위해, SYBR Green 보조 qPCR 기술이 수행되었다. 증폭 과정에는 Thermal Cycler Dice-Real Time System (TaKaRa, Japan)이 사용되었다. 관련 프라이머는 하기 표 1과 같으며 Bioneer에서 구입하였다.

유전자		염기서열 (5’ - 3’)	서열번호
GAPDH	F	AAGGGTCATCATCTCTGCCC	1
	R	GTGATGGCATGGACTGTGGT	2
TLR2	F	CAGCTGGAGAACTCTGACCC	3
	R	CAAAGAGCCTGAAGTGGGAG	4
TLR4	F	CAACATCATCCAGGAAGGC	5
	R	GAAGGCGATACAATTCCACC	6
IL-1β	F	CAGGATGAGGACATGAGCACC	7
	R	CTCTGCAGACTCAAACTCCAC	8
IL-6	F	GTACTCCAGAAGACCAGAGG	9
	R	TGCTGGTGACAACCACGGCC	10
TNF-α	F	TTGACCTCAGCGCTGAGTTG	11
	R	CCTGTAGCCCACGTCGTAGC	12
iNOS	F	ATGTCCGAAGCAAACATCAC	13
	R	TAATGTCCAGGAAGTAGGTG	14
COX2	F	CAGCAAATCCTTGCTGTTCC	15
	R	TGGGCAAAGAATGCAAACATC	16

8. 통계 분석

최종 데이터를 얻기 위해 최소 3회의 반복 실험을 수행하였다. 표현된 데이터는 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 일원 분산 분석을 지원하는 IBM SPSS 프로그램이 통계 분석에 사용되었다. 유의 수준은 0.05 미만의 P 값(P < 0.05)으로 간주되었다.

실시예 1. 전 염증성 사이토카인 및 초기 염증 매개체의 변화

LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 로리올라이드(loliolide)의 항염증 효과를 평가하기 위해, 세포 독성, 세포 생존력 및 NO 생산을 분석하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, PGE2를 포함하는 사이토카인 분석(IL-1β, IL-6, 및 TNF-α)은 LPS 처리로 인한 상향 조절을 보여주었다. 로리올라이드(loliolide)의 처리는 용량 의존적으로 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α 및 PGE2)의 수준을 낮춰주는 것으로 나타났다.

또한, PGE2 생산은 효소 COX-2를 통해 영향을 받으며, 로리올라이드(loliolide)의 처리가 COX-2 및 염증 매개체인 iNOS의 발현에 영향을 미치는지 웨스턴 블롯 및 RT-qPCR을 통해 분석하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 로리올라이드(loliolide)의 처리가 증가할수록 COX-2 및 iNOS의 발현 수준이 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. PGE2 생산은 효소 COX-2를 통해 영향을 받으며, 로리올라이드(loliolide)의 처리가 COX-2 발현을 억제함으로써 PGE2 생산을 억제시킴을 확인하였다. 또한, 염증 매개체 iNOS의 발현도 로리올라이드(loliolide)의 처리로 감소하는 것으로 나타났다.

또한, 로리올라이드(loliolide)의 처리가 염증 매개체(TNF-α, iNOS, COX-2), TLR2 및 TLR4에 미치는 영향을 평가하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 로리올라이드(loliolide)의 처리가 증가함에 따라 염증 매개체(TNF-α, iNOS, COX-2), TLR2 및 TLR4의 발현이 감소하는 것으로 나타났다.

실시예 2. NF-κB 활성화 및 전위의 변화

NF-κB 이량체는 억제 단백질 IκB와 상호작용하여 세포질에 상주한다. 주로 염증성 사이토카인으로 인한 자극으로 IκB 키나아제(IKK)가 활성화되고 인산화가 시작된다. NF-κB 단백질은 특정 DNA 부위와 결합하여 수많은 유전자를 전사하는 핵으로 전이할 수 있다. 로리올라이드(loliolide)의 처리가 NF-κB 활성화에 미치는 영향을 평가하였다. 도 5a 및 b에 나타난 바와 같이, LPS 자극에 의해 상향 조절된 IκBα의 인산화가 로리올라이드(loliolide)의 처리로 인해 하향 조절되었다. 유사하게 p65 수준의 인산화는 로리올라이드(loliolide)의 처리가 증가함에 따라 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 로리올라이드(loliolide)가 NF-κB 신호의 핵으로의 핵 전좌를 억제하고, 염증을 하향 조절하는 것을 입증한다.

실시예 3. MAPK 인산화의 변화

MAPK는 전 염증성 사이토카인과 케모카인을 활성화하여 염증의 중요한 역할을 한다. 로리올라이드(loliolide)의 처리가 MAPK 인산화에 미치는 영향을 평가하였다. 도 5c에 나타난 바와 같이, 로리올라이드(loliolide)의 처리가 증가함에 따라 MAPK 경로 단백질(p38, ERK 및 JNK)의 수준이 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 로리올라이드(loliolide)가 MAPK 인산활르 억제하여 대식세포에서 LPS로 유도된 염증을 감소시킨다는 것을 입증한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

<110> National Marine Biodiversity Institute ok Korea <120> Anti-inflammatory composition comprising loliolide as an active ingredient <130> ADP-2021-0264 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-f <400> 1 aagggtcatc atctctgccc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-r <400> 2 gtgatggcat ggactgtggt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR2-f <400> 3 cagctggaga actctgaccc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR2-r <400> 4 caaagagcct gaagtgggag 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR4-f <400> 5 caacatcatc caggaaggc 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR4-r <400> 6 gaaggcgata caattccacc 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b-f <400> 7 caggatgagg acatgagcac c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b-r <400> 8 ctctgcagac tcaaactcca c 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6-f <400> 9 gtactccaga agaccagagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6-r <400> 10 tgctggtgac aaccacggcc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a-f <400> 11 ttgacctcag cgctgagttg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a-r <400> 12 cctgtagccc acgtcgtagc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS-f <400> 13 atgtccgaag caaacatcac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS-r <400> 14 taatgtccag gaagtaggtg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX2-f <400> 15 cagcaaatcc ttgctgttcc 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX2-r <400> 16 tgggcaaaga atgcaaacat c 21

Claims

로리올라이드(loliolide)를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 로리올라이드(loliolide)는 하기 화학식 1로 표시되는 물질인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 로리올라이드(loliolide)는 괭생이모자반(Sargassum horneri)에서 분리된 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 로리올라이드(loliolide)는 IL-1β, IL-6, TNF-α 및 PGE2의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 로리올라이드(loliolide)는 IκBα의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 로리올라이드(loliolide)는 p38, ERK 및 JNK의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항염증용 조성물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 염증성 질환은 건선, 접촉성 피부염, 알레르기 피부질환 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항염증용 조성물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물.