JPWO2005108571A1 - 検査用マイクロリアクタおよび検査装置ならびに検査方法 - Google Patents
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Abstract
Description
上記目的は次の構成によって達成できる。
(1)板状のチップと、
(2)複数の試薬を個別に収容するための収容室を有す複数の試薬収容部と、
(3)前記複数の試薬収容部の出口から送出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部と、
(4)外部から試料を注入するための注入口を有す試料受容部と、
(5)前記試薬混合部から送出される混合試薬と試料受容部から送出される試料とを混合して反応させる反応部とを有し、
前記複数の試薬収容部、試薬混合部、試料受容部および反応部は前記チップ内に組み込まれていて流路により連通されていて、
前記試薬混合部は初期混合試薬を反応部に送出すのを防止する送出防止機構を有す。
(1)板状のチップと、
(2)複数の試薬を個別に収容するための収容室を有す複数の試薬収容部と、
(3)前記複数の試薬収容部の出口から送出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部と、
(4)外部から試料を注入するための注入口を有す試料受容部と、
(5)前記試薬混合部から送出される混合試薬と試料受容部から送出される試料とを混合して反応させる反応部とを有し、
前記複数の試薬収容部、試薬混合部、試料受容部および反応部は前記チップ内に組み込まれていて流路により連通されていて、
前記各試薬収容部は駆動液を収容室に注入するための注入口と注入された試薬により収容室から試薬を押し出すためえの出口とを有し、前記注入口は外部ポンプと接続可能なポンプ接続部と連接されていて、外部ポンプにより駆動液が注入口から収容室に注入され、前記注入口と前記ポンプ接続部の連接部には末端が開放された空気抜き流路が設けてある。
一つのチップ内に、
検体もしくは検体から抽出したDNAが注入される検体収容部と、
遺伝子増幅反応に用いる試薬が収容される試薬収容部と、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
遺伝子増幅反応により増幅された検出対象の遺伝子にハイブリダイゼーションするプローブDNAが収容されるプローブDNA収容部と、
これらの各収容部に連通する流路と、
前記各収容部および流路内の液体を送液する別途のマイクロポンプに接続可能なポンプ接続部とが設けられ、
前記チップにポンプ接続部を介してマイクロポンプを接続し、検体収容部に収容された検体もしくは検体から抽出したDNAと、試薬収容部に収容された試薬とを流路へ送液し、流路内で混合して増幅反応させた後、その下流側の流路へ、この反応液を処理した処理液と、プローブDNA収容部に収容されたプローブDNAとを送液し、流路内で混合してハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基いて増幅反応の検出を行い、
ポジティブコントロール収容部に収容されたポジティブコントロールおよびネガティブコントロール収容部に収容されたネガティブコントロールについても同様に、試薬収容部に収容された試薬と流路内で増幅反応させた後、プローブDNA収容部に収容されたプローブDNAと流路内でハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基いて増幅反応の検出を行うように構成されていることを特徴としている。
前記検体収容部に検体もしくは検体から抽出したRNAを注入するとともに、これに含まれるRNAから逆転写反応によりcDNAを合成するための逆転写酵素が収容される逆転写酵素収容部が設けられ、
検体収容部に収容された検体もしくは検体から抽出したRNAと、逆転写酵素収容部に収容された逆転写酵素とを流路へ送液し、流路内で混合してcDNAを合成した後、前記増幅反応およびその検出を行うように構成されていてもよい。
前記流路に、
正方向への送液圧力が予め設定された圧に達するまで液体の通過を遮断し、予め設定された圧以上の送液圧力を加えることにより液体の通過を許容する、前記マイクロポンプのポンプ圧により液体の通過を制御可能な送液制御部と、
流路内の液体の逆流を防止する逆流防止部とが設けられ、
前記マイクロポンプ、送液制御部および逆流防止部によって、流路内における液体の送液、定量および各液体の混合を制御することを特徴としている。
前記送液制御部が、両側に隣接する流路を直列に連結するようにこれらの流路の間に形成された、これらの隣接流路の断面積よりも小さい断面積を有する細流路からなることを特徴とするマイクロリアクタである。
前記逆流防止部が、逆流圧により弁体が流路開口部を閉止する逆止弁、または弁体変形手段により弁体を流路開口部に押圧して該開口部を閉止する能動弁であることを特徴としている。
前記逆流防止部と送液制御部との間の流路で構成され、所定量の試薬を充填可能な試薬充填流路と、
この試薬充填流路から分岐し、駆動液を送液するマイクロポンプと接続されるポンプ接続部に連通する分岐流路とが設けられ、
前記逆流防止部側から、前記送液制御部から先へ試薬が通過しない送液圧力で試薬充填流路に試薬を供給することにより試薬を充填した後、前記送液制御部から先へ試薬が通過することを許容する送液圧力で、前記マイクロポンプにより分岐流路から試薬充填流路に向かう方向へ駆動液を送液することにより、試薬充填流路内に充填された試薬を前記送液制御部から先へ押し出し、これにより試薬を定量的に送液するように構成された試薬定量部が設けられている。
各試薬が送液される複数の流路と、
これらの複数の流路に接続され、これらの流路からの各試薬が混合される混合流路と、
該混合流路から分岐し、試薬混合液を次工程へ送液する分岐流路と、
混合流路における分岐流路との分岐点よりも先の位置に配置された第1の送液制御部と、
分岐流路における混合流路との分岐点の近傍位置に配置され、試薬混合液が通過可能な送液圧力が第1の送液制御部よりも小さい第2の送液制御部とが設けられ、
混合流路内へ送液された試薬混合液の先端部が第1の送液制御部に達するまで試薬混合液を送液した後、第1の送液制御部を試薬混合液が通過しない送液圧力で第2の送液制御部から分岐流路へ試薬混合液を通過させ、試薬混合液を次工程へ送液するように構成されている。
第1の送液制御部における前記細流路の断面積が、第2の送液制御部における前記細流路の断面積よりも小さいことを特徴としている。
遺伝子増幅反応に用いる試薬、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールが前記収容部に収容されていることが好ましい。
遺伝子増幅反応に用いる試薬が、検出対象である遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションするキメラプライマー、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、およびエンドヌクレアーゼを含むことを特徴としている。
上記のいずれかに記載のマイクロリアクタを用い、
検体もしくは検体から抽出したDNA、または検体もしくは検体から抽出したRNAから逆転写反応により合成したcDNAと、ビオチン修飾したプライマーとをこれらの収容部から流路へ送液し、流路内で遺伝子増幅反応を行う工程と、
増幅された遺伝子を含む反応液と変性液とを混合し、増幅された遺伝子を一本鎖に変性処理する工程と、
増幅された遺伝子を一本鎖に変性処理した処理液を、ストレプトアビジンを吸着させた流路に送液し、増幅された遺伝子を固定化する工程と、
増幅された遺伝子を固定化した流路に、末端をFITCで修飾したプローブDNAを送液し、固定化した遺伝子にプローブDNAをハイブリダイゼーションする工程と、
前記流路にFITC抗体で表面を修飾した金コロイドを送液し、固定化した遺伝子にハイブリダイズしたプローブに金コロイドを吸着する工程と、
前記流路における金コロイドの濃度を光学的に測定する工程とを含むことを特徴としている。
前記マイクロポンプが、流路抵抗が差圧に応じて変化する第1流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第1流路よりも小さい第2流路と、
第1流路および第2流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、
該アクチュエータを駆動する駆動装置とを備えている。
試薬が収容された各試薬収容部の上流側にポンプ接続部が設けられ、これらのポンプ接続部にマイクロポンプを接続し、各マイクロポンプから駆動液を供給することにより試薬収容部から試薬を流路へ押し出して遺伝子増幅反応を開始するように構成されていることを特徴としている。
前記マイクロポンプの駆動装置からの駆動信号で前記アクチュエータの作動を制御することにより所望の比率で各試薬を混合するように構成されている。
図面を参照しながら本発明のマイクロリアクタ、遺伝子検査装置について説明する。図1は、本発明の一実施形態における遺伝子検査用マイクロリアクタの概略図、図2は、本発明の一実施形態における前記マイクロリアクタと装置本体とからなる遺伝子検査装置の概略図である。
本発明の測定対象となる検体は、遺伝子検査の場合、増幅反応の鋳型となる核酸として遺伝子、DNAまたはRNAである。このような核酸を含む可能性のある試料から調製または単離したものであってよい。そのような試料から遺伝子、DNAまたはRNAを調製する方法は、特に限定されず、従来技術を使用することができる。最近、DNA増幅のために生体試料から遺伝子、DNAまたはRNAを調製する技術が開発され、キットなどの形態でも利用可能である。
・増幅法
本発明のマイクロリアクタでは、増幅方法を限定されない。例えばDNA増幅技術は、多方面で盛んに利用されているPCR増幅法を使用することができる。その増幅技術を実施するための諸条件が詳細に検討され、改良点も含めて各種文献などに記載されている。PCR増幅においては、3つの温度間で昇降させる温度管理が必要になるが、マイクロチップに好適な温度制御を可能とする流路デバイスが、すでに本発明者らにより提案されている(特開2004−108285号)。このデバイスシステムを本発明のチップの増幅用流路に適用すればよい。これにより、熱サイクルが高速に切り替えられ、微細流路を熱容量の小さいマイクロ反応セルとしているため、DNA増幅は、手作業によりマイクロチューブ、マイクロバイアルなどで行なう従来の方式よりはるかに短時間で行うことができる。
・試薬類
(i) プライマー
PCRプライマーは、増幅したい特定部位のDNA鎖の両端に相補的な2種のオリゴヌクレオチドである。その設計は、すでに専用のアプリケーションが開発されており、当業者であればDNAシンセザイザー、化学合成などにより容易に作成できる。ICAN法用のプライマーは、DNAおよびRNAのキメラプライマーであるが、このものの調製法もすでに技術的に確立されている(特許第3433929号)。プライマーの設計、選択は、増幅反応の成否、効率を左右するため最も適切なものを使用することが重要である。
(ii) 増幅反応用試薬類
増幅反応に使用する酵素をはじめとする試薬類は、PCR用、ICAN法のいずれも容易に入手できる。
(iii) コントロール
インターナルコントロールは、標的核酸(DNA,RNA)について、増幅のモニタリング、あるいは定量の際の内部標準物質として使用される。インターナルコントロールの配列は、検体とは異なる配列の両側に、検体用プライマーと同じプライマーがハイブリダイズできる配列を有するために検体と同様に増幅できるものである。ポジティブコントロールの配列は、検体を検出する特異的な配列で、プライマーがハイブリダイズする部分とその間の配列が検体と同じものである。コントロールに使用する核酸(DNA,RNA)は、公知技術文献に記載されているものを使用すればよい。ネガティブコントロールは、核酸(DNA,RNA)以外の試薬などをすべて含み、コンタミネーションの有無のチェック、バックグラウンド補正用に用いる。
(iv) 逆転写用試薬
RNAの試料の場合、RNAからcDNAを合成するための逆転写酵素、逆転写プライマーなどであり、これらも市販され容易に入手できる。
本発明において増幅された目的遺伝子のDNAを検出する方法は、特に限定されず、必要に応じて好適な方法が使用される。そうした方法には、可視分光側光法、蛍光測定法、発光ルミネッセンス法といった検出方法が主流である。さらに、電気化学的方法、表面プラズモン共鳴、水晶発振子マイクロバランスなどの手法も挙げられる。
増幅反応に使用するプライマーとして、ある特定の遺伝子に特異的な配列を有するプライマーを用いることにより、増幅の有無または増幅効率を測定することにより、試料中の遺伝子由来のDNAが、その特別の遺伝子と同一か、異なるかの判定に利用することができる。特に、感染病の原因ウィルス、細菌を遺伝子から迅速に同定するのに有効である。
マイクロリアクタには、各試薬を収容するための複数の試薬収容部が設けられ、遺伝子増幅反応に用いる試薬、増幅された遺伝子を変性する変性液、増幅された遺伝子とハイブリダイゼーションさせるプローブDNAなどが収容される。
本実施形態では、検体収容部、試薬収容部、ポジティブコントロール収容部、およびネガティブコントロール収容部のそれぞれについて、これらの収容部の内容液を送液するマイクロポンプが設けられている。マイクロポンプは、マイクロリアクタとは別途の装置本体に組み込まれており、マイクロリアクタを装置本体に装着することによって、ポンプ接続部からマイクロリアクタに接続されるようになっている。
本実施形態のマイクロリアクタには、その流路に、図9(a)に示したような送液制御部が多数設けられている。この送液制御部は、正方向への送液圧力が所定圧に達するまで液体の通過を遮断し、所定圧以上の送液圧力を加えることにより液体の通過を許容する。
本実施形態のマイクロリアクタには、その流路に、液体の逆流を防止する逆流防止部が多数設けられている。この逆流防止部は、逆流圧により弁体が流路開口部を閉止する逆止弁か、あるいは弁体変形手段により弁体を流路開口部へ押圧して該開口部を閉止する能動弁からなる。
上記した送液制御部および逆流防止部を用いて、試薬を定量的に送液することができる。図12は、このような試薬定量部の構成を示した図であり、逆流防止部16と、送液制御部13aとの間の流路(試薬充填流路15a)には、所定量の試薬が充填される。また、この試薬充填流路15aから分岐し、駆動液を送液するマイクロポンプ11に連通する分岐流路15bが設けられている。
2つの試薬をY字流路により混合する場合、各試薬を同時に送液したとしても、液の先頭部分では混合比率が安定しない。図13は、この先頭部分を切り捨てて、混合比率が安定してから混合液を次工程へ送液するようにした流路構成を示した図である。同図において、混合する試薬31aおよび31bは、それぞれ流路15a、15bから混合流路15cへ送液される。
Claims (26)
- 試料検査用マイクロリアクタが、
(1)板状のチップと、
(2)複数の試薬を個別に収容するための収容室を有す複数の試薬収容部と、
(3)前記複数の試薬収容部の出口から送出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部と、
(4)外部から試料を注入するための注入口を有す試料受容部と、
(5)前記試薬混合部から送出される混合試薬と試料受容部から送出される試料とを混合して反応させる反応部とを有し、
前記複数の試薬収容部、試薬混合部、試料受容部および反応部は前記チップ内に組み込まれていて流路により連通されていて、
前記試薬混合部は初期混合試薬を反応部に送出すのを防止する送出防止機構を有す。 - 請求の範囲第1項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記試薬混合部は混合流路を形成し、混合流路の中間部に反応部へ混合試薬を送出する送出流路が分岐されていて、初期混合試薬は該混合流路の中間部と下流末端の間に収容されて送出流路から反応部に送出されるのを防止される。 - 請求の範囲第2項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記試薬混合部は、前記混合流路と前記送出流路の接続部に、前記混合流路内の圧力が所定圧以上になった時に前記送出流路へ混合試薬を送出する送液制御部を有す。 - 請求の範囲第3項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記送液制御部は前記分岐流路の断面積より小さい断面積の細流路である。 - 請求の範囲第1項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記各試薬収容部は駆動液を収容室に注入するための注入口と注入された試薬により収容室から試薬を押し出すためえの出口とを有している。 - 請求の範囲第5項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記注入口は外部ポンプと接続可能なポンプ接続部と連接されていて、外部ポンプにより駆動液が注入口から収容室に注入される。 - 請求の範囲第6項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記注入口と前記ポンプ接続部の連接部には末端が開放された空気抜き流路が設けてある。 - 請求の範囲第7項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記空気抜き流路は流路径が10μm以下であり、且つ流路内面の水との接触角が30°以上である。 - 請求の範囲第5項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記各試薬収容部の出口には試薬が流出するのを防止する封止剤が充填してある。 - 請求の範囲第9項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記封止剤は所定温度以下では固化し、室温では溶解し流動状態となる。 - 請求の範囲第9項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記封止剤の融点は8℃〜25℃である。 - 請求の範囲第9項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記封止剤は油脂あるいはゼラチンの水溶液である。 - 請求の範囲第1項に記載のマイクロリアクタにおいて、
更に、前記試薬混合部と前記反応部との間に混合試薬を充填して、所定量の混合試薬を送液する試薬充填部を有す。 - 請求の範囲第13項に記載の検査用マイクロリアクタにおいて、
前記試薬充填部は混合試薬を充填する充填流路と該充填流路の入口に設けられた逆流防止部と、該充填流路の出口に設けられた送液制御部と、該充填流路の入口近傍に設けられた分岐流路とを有し、前記分岐流路は外部ポンプと接続可能なポンプ接続部に連接されていて、充填流路に混合試薬が充填された後、外部ポンプにより分岐流路を介して、駆動液にて充填流路内の液圧が所定以上になるよう加圧して充填された混合試薬の所定量を送液制御部より送液する。 - 請求の範囲第14項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記逆流防止部は逆流圧により弁体が流路開口部を閉止する逆止弁、または弁体変形手段により弁体を流路開口部に押圧して該開口部を閉止する能動弁である。 - 請求の範囲第1項に記載のマイクロリアクタにおいて、前記マイクロリアクタは遺伝子検査用マイクロリアクタである。
- 請求の範囲第16項に記載のマイクロリアクタにおいて、前記複数の試薬収容部は遺伝子増幅反応に用いる試薬を収容し、前記試料受容部には検体もしくは検体から抽出したDNAが注入される。
- 請求の範囲第16項に記載のマイクロリアクタにおいて、さらに、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
遺伝子増幅反応により増幅された検出対象の遺伝子にハイブリダイゼーションするプローブDNAが収容されるプローブDNA収容部とを有す。 - 請求の範囲第17項に記載のマイクロリアクタにおいて、 前記チップにポンプ接続部を介してマイクロポンプを接続し、検体収容部に収容された検体もしくは検体から抽出したDNAと、試薬収容部に収容された試薬とを流路へ送液し、流路内で混合して増幅反応させた後、その下流側の流路へ、この反応液を処理した処理液と、プローブDNA収容部に収容されたプローブDNAとを送液し、流路内で混合してハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基いて増幅反応の検出を行い、
ポジティブコントロール収容部に収容されたポジティブコントロールおよびネガティブコントロール収容部に収容されたネガティブコントロールについても同様に、試薬収容部に収容された試薬と流路内で増幅反応させた後、プローブDNA収容部に収容されたプローブDNAと流路内でハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基いて増幅反応の検出を行うように構成されている。 - 請求の範囲第17項に記載のマイクロリアクタにおいて、 前記検体収容部に検体もしくは検体から抽出したRNAを注入するとともに、これに含まれるRNAから逆転写反応によりcDNAを合成するための逆転写酵素が収容される逆転写酵素収容部が設けられ、
検体収容部に収容された検体もしくは検体から抽出したRNAと、逆転写酵素収容部に収容された逆転写酵素とを流路へ送液し、流路内で混合してcDNAを合成した後、前記増幅反応およびその検出を行うように構成されている。 - 試料検査用マイクロリアクタが、
(1)板状のチップと、
(2)複数の試薬を個別に収容するための収容室を有す複数の試薬収容部と、
(3)前記複数の試薬収容部の出口から送出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部と、
(4)外部から試料を注入するための注入口を有す試料受容部と、
(5)前記試薬混合部から送出される混合試薬と試料受容部から送出される試料とを混合して反応させる反応部とを有し、
前記複数の試薬収容部、試薬混合部、試料受容部および反応部は前記チップ内に組み込まれていて流路により連通されていて、
前記各試薬収容部は駆動液を収容室に注入するための注入口と注入された試薬により収容室から試薬を押し出すためえの出口とを有し、前記注入口は外部ポンプと接続可能なポンプ接続部と連接されていて、外部ポンプにより駆動液が注入口から収容室に注入され、前記注入口と前記ポンプ接続部の連接部には末端が開放された空気抜き流路が設けてある。 - 請求の範囲第21項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記空気抜き流路は流路径が10μm以下であり、且つ流路内面の水との接触角が30°以上である。 - 請求の範囲第21項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記試薬混合部は初期混合試薬を反応部に送出すのを防止する送出防止機構を有す。 - 請求の範囲第23項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記試薬混合部は混合流路を形成し、混合流路の中間部に反応部へ混合試薬を送出する送出流路が分岐されていて、初期混合試薬は該混合流路の中間部と下流末端の間に収容されて送出流路から反応部に送出されるのを防止される。 - 請求の範囲第24項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記試薬混合部は、前記混合流路と前記送出流路の接続部に、前記混合流路内の圧力が所定圧以上になった時に前記送出流路へ混合試薬を送出する送液制御部を有す。 - 請求の範囲第25項に記載のマイクロリアクタにおいて、
前記送液制御部は前記分岐流路の断面積より小さい断面積の細流路である。
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