CN1258602C

CN1258602C - 一种侦测基因序列的装置和方法

Info

Publication number: CN1258602C
Application number: CN 01140901
Authority: CN
Inventors: 于常海; 王荣; 彭亮; 刘乐庭; 杨于文琴
Original assignee: HONGKANG GENE WAFER DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: Hai Kang Life Corp Ltd
Priority date: 2001-09-22
Filing date: 2001-09-22
Publication date: 2006-06-07
Anticipated expiration: 2021-09-22
Also published as: CN1408884A

Abstract

本发明提供了一种侦测基因序列的装置，它结合了以纳米粒子原理为基础的探测系统和用电场来控制并加快微矩阵的侦测过程的装置，并能分析芯片上的纳米粒子探针的反馈信号而自动控制这些过程。本发明还涉及根据上述装置侦测基因序列的方法。本发明还提供了关于微矩阵基因芯片在杂交和去杂交的过程中拥有自动反馈和自动调整系统的装置和方法。根据本发明的利用电子生物基因芯片来侦测基因序列的装置和方法，用电场控制纳米粒子探针微矩阵去加快侦测基因序列的过程，检测速度显著提高，比使用萤光探针的检测方法有更高的敏感度，降低了成本。

Description

一种侦测基因序列的装置和方法

发明领域

本发明涉及侦测基因序列的装置和方法，更具体地，涉及利用电子生物基因芯片来侦测基因序列的装置和方法。

发明背景

DNA基因芯片是将数百、数千或数万点单股的DNA作为探针。所使用的DNA主要有两种：核苷酸和已经存在与基因库中的互补核苷酸(cDNA)。它们以高密度的点阵形成在芯片上。

微矩阵DNA基因芯片被应用于诊断不同类型的疾病和目前医学上和药理学的基因后期研究。只要用一块芯片上的微矩阵生物探针，就可处理大量基因及分子科学上的资料，特别是关于遗传基因突变和表达。这样便能加快了诊断遗传病和促进下一代药物的研究及开发过程。这还能帮助找出在分子层次上疾病和药物反应的机制。

现时，用于微矩阵芯片及其它基因芯片的侦测探针是萤光标识的。探针上有萤光分子Cy3和Cy5，所以可以利用其发出的萤光而被侦测。萤光探测系统是颇昂贵的。这限制了这科技的广泛应用，特别在临床诊断方法。在一些情况下，样本需要预先经过聚合酶链锁反应的放大，才能利用萤光探针去检测。

数年前，Nanogen，Inc.(SanDiego，CA，USA)提出了运用一些已公开的技术知识来制造出以萤光探针和用电化力量来控制基因芯片原型。他们的仪器利用了探测萤光信号去控制杂交和去杂交的过程。这种仪器(NanoChip^TMMolecular Biology Workstation)的原理是用探测萤光发光来控制上述杂交和去杂交过程。NanoChip^TM芯片是商业上唯一存在的电子加速微矩阵芯片。芯片的容量是每片一百个基因探针。所述那工作站容许利用电化力量去加快杂交和去杂交的过程。电化力量是用来引导被检测样本中的脱氧核糖核酸到个别的电极，以此改变杂交和去杂交的过程。在当时的萤光探测器中，这系统有其技术上的好处。

但是，它的坏处也很明显。首先，由于检测样本的基因含量必须要在电化引导和之后的杂交程序之前预先利用萤光聚合酶链锁反应扩增，并需要在扩增物上加上生物素。这样，检测结果便有可能出现假阳性或假阴性。因为在放大过程中，会有根本的误差。这些误差是源于扩增过程中的校对误差和置入不正确的核苷酸。再加上聚合酶链锁反应检测仪器的价格也限制了这技术的应用。其次是聚合酶链锁反应预先放大样本需要较长的时间，而且不适合现场(on-site)使用，例如诊所、食物、环境或其它需要敏感度极高的测试。第三，萤光探测器的成本远超过其它类型的基因芯片探测器。第四，电化力量引导的过程是十分费时。在电化力量引导下，一个反应大概需要一分钟，而预备一个样本以供NanoChip^TM芯片使用的总时间会更加长。因为芯片上的每一点都必需要重复将脱氧核糖核酸探针溶液加入芯片，电化力量引导每个脱氧核糖核酸探针和每个电化力量引导反应后冲洗掉个别探针的过程。这个例子中，基因芯片上的一百点便必需重复同一程序一百次。由于这样复杂的探测系统，工作量是非常大的，亦因此在目前短期内是没有可能进化成便携的。

在数年前，Motorola，Inc.(USA)示范了利用电导探针和电化力量去控制一个基因芯片原型的方法。利用这方法，成本相对于NanoChip^TM系统便减少了许多。它亦提供了快捷的检测程序而无需把样本聚合酶链锁反应作预先的放大。另外，Motorola系统亦能够实时探测。不幸地，制造电导缺氧核苷酸的步骤是非常复杂，所用物质的特性更有可能对操作员和环境有害。此制造过程需要用的电导极比传统的更昂贵，所以成本亦随即增加。

因此，高成本仪器、密集应用技术人员和过程，大大减低了以上系统在商业上的吸引力。因此，在本领域的技术中，希望发展出更快、更便宜和更高敏感度的微矩阵列芯片和相关的仪器。

发明目的

因此本发明的目的是提供一种能快速可靠地检测基因序列片段的侦测装置和方法。

我们的另一个发明目的是提供更快捷、更便宜、更高敏感度、容易应用的生物芯片的自动检测仪器。芯片的价格将会显著降低，因此自动侦测和控制仪器的价格也将会显著降低。

基因芯片具有广泛的用途，本申请的具有芯片侦测装置的方法为不同的用途提供了一个优异的、灵活的平台。

发明概述

因此综上所述，本发明提供了一种侦测基因序列的装置，它结合了以纳米粒子原理为基础的探测系统和用电场来控制并加快微矩阵的侦测过程的装置，并能分析芯片上的纳米粒子探针的反馈信号而自动控制这些过程。本发明还涉及根据上述装置侦测基因序列的方法。本发明是关于微矩阵基因芯片在杂交和去杂交的过程中拥有自动反馈和自动调整系统的装置和方法。

大多数的生物分子自然带有正电荷或负电荷，在电场的作用下会出现定向运动。因此在基因芯片的各个反应点(即，各单股DNA片段)加上电场，会加速待测DNA片段向基因芯片的移动和加快DNA结合(杂交)的速度。在本发明的装置的控制下，DNA片段的杂交速度比常规的自然方法的杂交速度快1000倍。

利用纳米粒子探针去探测生物信号曾用于在原位杂交研究中去探测基因及脱氧核糖核酸。现在，它被本申请人用作基因芯片上的侦测探针。

利用纳米粒子探针技术能够降低购置探测仪器的成本和增加微矩阵芯片的应用范围，容许医学诊断在一间普通的诊所进行，而无需交到拥有特定设备的实验室。以纳米粒子原理为基础的探测系统提供了比萤光探针高以百倍计的敏感度。另外，这系统亦能用一些较简单的侦测仪器，如黑白扫描仪。这些扫描仪能以一范围的黑白颜色(灰度比例)的形式去侦测信号。因此，纳米粒子探测系统提供了以上的好处，而现存的萤光探针是所不能提供的。

在本申请的方案中，利用一段单股DNA片段，设计其序列与目标序列互补，可以进行杂交，即，使标定的DNA与目标DNA互相结合，再借助纳米粒子探针的测定来侦测出目标DNA是否存在。

因此，根据本发明的用于侦测基因序列的装置，包括：

1.反应室，提供使基因芯片与待测基因序列反应的场所；

2.基因芯片，含有与待测基因序列对应的基因探针和电极数组，基因芯片的基底可以由玻璃、硅及/或塑料制成；

3.电场施加装置，将电流施加到基因芯片，以加速待测DNA片段向基因芯片的移动和加快DNA结合(杂交)的速度；

4.基因序列(即样本)添加装置，向反应室加入待测基因序列；

5.纳米粒子探针添加装置，添加含纳米粒子探针的容液到反应室；

6.稳定光源，红外线、紫外线、激光及可见光皆可为光源。此光源亦可作强弱之调较，但在检测时，光源需能发出稳定强度之光线；

7.检测器，检测反应室中的颜色信号变化；检测器可以由CCD摄影机所组成。摄影机拍摄所得的影像传送至放大器，然后送到控制器；检测器也可以由其它适当的光敏检测器形成。

8.控制器，根据检测器来的信号，控制施加的电场强度和反应室的温度从而控制反应的速度，并处理各项资料之输入及制定各项程序之次序输出。它可以由计算机形成，用面向对象语言程序软件来控制。

根据本发明的用于侦测基因序列的装置，还可以包括：信号放大液添加装置，用于添加信号放大液，以加强纳米粒子的检测信号，使检测结果更明显；本发明的反应室可以含有加热装置使其温度可调节，包括：温度探测器，用于检测芯片上之温度把资料传送到接口系统；和加热器，用于使各反应液在进入芯片反应室前，把液体提升至适当的反应温度。

下面简单描述基因芯片的构造及其工作原理。本发明使用的基因芯片，包括一块由玻璃、硅或塑料制的基底，在基底上有电子线路及电极排列。在电极上则附有脱氧核糖核酸、互补脱氧核糖核酸或其它寡聚核苷酸探针。在基因芯片上还含有一个条形码区，存储与其结构和其上的基因片段有关的信息。

将芯片置于由反馈探测系统改装的电子夹钳电路所产生的电场中，在特定的实验条件下，可以引发杂交和去杂交的过程，从而产生特选性信号。纳米粒子探测系统便可以侦测到这些信号。所述系统是由5’尾极或3’尾极检查以及由多样的寡聚核苷酸探针对靶基因进行特异性测试和核糖核酸序列测试。本发明的装置将基因芯片结合了利用电化力量去加速杂交和去杂交的过程及利用纳米粒子探针标记。

在本发明的方案中，根据基因芯片上装载的基因探针的不同，可以用于识别各种基因序列，从而可以检测各种疾病，例如：乙型肝炎病毒、癌细胞、转基因细胞的基因序列、组织配型等，以及基因序列分析等。

本发明还涉及到利用纳米粒子探针去施行核酸序检查分析。这分析应用了电场加速纳米粒子探针标记自动调节系统。另外，在这芯片上也能够施行双聚合物合成、抗体/抗原反应和其它临床诊断功能。

本发明还可应用于转基因食品检测、环境污染检测、水质检测、动物疾病检测等非临床应用。

本发明还涉及一种利用视像纳米粒子探测系统和电子生物基因芯片侦测基因序列的方法，它包括以下步骤：

1.形成含有与待测基因序列对应的DNA片段的基因芯片，它含有基底、DNA片段和电极数组和存储与其结构和其上的基因片段有关的信息的一个条形码区。

2.使上述基因芯片与受测试的试剂混合以使上述基因芯片上的DNA片段与待测基因序列反应，在反应过程种施加电场使反应加速。

3.在反应时加入含有纳米粒子探针的溶液。

4.观察芯片表面所表达的颜色变化，判定受测试的试剂是否含有待测基因序列。

5.根据上述颜色变化，控制反应的电场和其它参数如温度、光源等以控制反应的速度。

下面描述本发明的基因芯片检测方法的工作过程及原理。

首先，把适当配有条形码资料之基因芯片加载在系统内，计算机随即读取条形码的资料，以便加载相关检测程序之软件及命令仪器进行清洗及起动程序。与此同时，计算机显示操作人员输入有关质料及确认测试项目(如姓名、年龄、性别、编号等资料)，以便稍后编印结果。

操作者把测试样本以针管或螺口离心管置于仪器内，之后便以全自动操作。清洗基因芯片，然后放进适量之缓冲液，稍后作杂交反应。把已预载之测试样本注入芯片内，随即输入固定电流作电化加速杂交作用。

由于DNA是带负电荷，在电场的作用下，DNA片段便由电化力量的作用下推向预先放在电极上之探针以作杂交作用。数十秒至数分钟后，杂交过程完毕，便冲洗剩余而并未杂交之样本，然后再加进纳米粒子探针溶液，同样地输入固定电流，由电化力量加速杂交作用，使刚才已有杂交之位置，以纳米粒子探针作标记，使杂交的结果能被探测。

数分钟后，冲洗芯片，作用是把其它并未进行化学过程之纳米粒子探针清洗干净。再加入纳米粒子信号放大液，使纳米粒子体积增大，使信号更明显，更容易被检测器材探测。整个信号放大过程需时几分钟，需在黑暗中进行，这是由于放大信号溶液是对光敏感的。反应完毕后，再清洗芯片。用CCD影像采集系统检查杂交过程是否正常，然后进入反杂交过程。

输入固定电流但带相反的电荷(即负电荷)于芯片及控制温度，由于此过程是把不正确杂交的DNA片段除走，温度是主要控制的变量。而负极的电流供应只是加速此过程的进行。将芯片作定时清洗，好使CCD摄影机作实时监察，以确定是否需要更改反应温度。经过了实时反馈检测程序后，整个检测过程告结束。可以印刷出报告，记录整个反应过程。

本发明的利用电子生物基因芯片来侦测基因序列的装置和方法，其优点在于：

第一方面是用电场控制纳米粒子探针微矩阵去加快侦测基因序列的过程，检测速度显著提高。

第二方面是比使用萤光探针的检测方法有更高的敏感度。

第三方面是比传统的使用萤光探针的探测系统的成本低。

第四方面是与使用萤光探针的检测系统相比能够省略一些聚合酶链锁反应放大的步骤，这同时能简化实验室里的器材操作，并能够减少在传统的聚合酶链锁反应放大的程序所产生的假阳性结果。

通过参照本发明的详细的实施例和附图将能更好地理解本发明的技术方案和优点。

附图简述

图1是本发明的侦测基因序列的装置的结构框图；

图2是本发明的基因芯片的结构示意图；

优选实施方案描述

下面参照附图描述本发明的优选实施例。

参照附图1，描述了一个根据本发明的侦测基因序列的装置，其中基因芯片放置在反应室内。图中未画出反应室，以及反应室中的电场施加装置、基因序列(即样本)添加装置和纳米粒子探针添加装置。实际上电场可以通过将电压施加在基因芯片的电极上来施加，或者通过一个静电场或电磁场来施加，其大小是足以使添加的基因序列(即样本)发生明显的定向移动就可以了。纳米粒子探针是以溶液的形式，在基因芯片和待测的基因序列(即样本)杂交反应之后加入到反应室中。这里用灯作为光源照射基因芯片，用CCD检测基因芯片的颜色变化，或者说灰度变化。图中的步进电机是用来控制CCD检测器的聚焦的。CCD检测器前有滤光片，作用是滤除杂散光和不需要的光线，提高检测器的精确度。CCD的信号经过一个放大器放大，再通过接口电路送到控制器。

在反应室内还含有加热器和温度检测器，用于控制基因芯片上的基因片段和待测的基因片段之间杂交反应的速度，以及纳米粒子探针和基因芯片的结合速度。它们也由控制器通过接口电路控制。

图1下方的缓冲液1和2通过泵施加到反应室中，它们是一种信号放大液，用于加强纳米粒子探针的信号强度，使得反应的结果更易于被检测。

图2是一种基因芯片的表面视图。中间部分是基因序列片段，周围部分是电极阵列。将电压施加到电极阵列上时，中间的基因序列片段也因此具有电势，会吸引待测的基因片段向基因芯片定向移动，从而加快杂交速度。

如前所述，基因芯片上的基因序列片段和电极阵列的形式和种类，都可以随着待测的基因片段的不同而变化。

根据本发明的侦测基因序列的装置和方法，可以显著加快杂交反应和检测的速度，同时减低了成本。

本领域的普通技术人员可以在上述方案的技术和精神内作出各种改动和改进，这些改动和改进都应被视为落入本申请的权利要求的范围之内。

Claims

1.一种侦测基因序列的装置，包括：

一个反应室，提供使基因芯片与待测基因序列反应的场所；

一个基因芯片，含有与待测基因序列对应的基因探针和电极数组，和一个存储与基因芯片的结构和其上的基因片段有关的信息的一个条形码区；

一个电场施加装置，将电场施加到基因芯片，以加速待测基因片段向基因芯片的移动和加快基因片段杂交的速度；

一个基因序列样本添加装置，向反应室加入待测基因序列；

一个纳米粒子探针添加装置，添加含纳米粒子探针的溶液到反应室；

一个稳定光源，可发出稳定强度的红外线、紫外线、激光或可见光；

一个检测器，检测反应室中的颜色信号变化；

一个控制器，根据检测器来的信号，控制施加的电场强度和反应室的反应速度。

2.根据权利要求1的侦测基因序列的装置，其特征在于还包括：信号放大液添加装置，用于添加信号放大液，以加强纳米粒子的检测信号，使检测结果更明显。

3.根据权利要求1的侦测基因序列的装置，其特征在于所述反应室含有加热装置使其温度可调节，并包括：温度探测器，用于检测芯片上的温度并将所检测的温度信号传送到控制器；和加热器，用于使各反应液在进入芯片反应室前，把液体提升至适当的反应温度。

4.根据权利要求1的侦测基因序列的装置，其特征在于所述电场施加装置直接与所述基因芯片连接或者电磁耦合或者电容耦合，以将电场施加到基因芯片。

5.根据权利要求1-4之一的侦测基因序列的装置，其特征在于所述控制器是装有由面向对象语言编写的程序的计算机。

6.根据权利要求1-4之一的侦测基因序列的装置，其特征在于随着要探测的基因片段的不同，所述基因芯片上的基因片段是与要探测的基因片段对应的不同的基因片段。

7.根据权利要求1-4之一的侦测基因序列的装置，其特征在于随着要探测的基因片段的不同，所述纳米粒子探针是与要探测的基因片段对应的不同的纳米粒子探针。

8.根据权利要求1-4之一的侦测基因序列的装置，其特征在于所述检测器是CCD摄像采集系统，它观察反应液的颜色变化，判定受测试的试剂是否含有待测基因序列。

9.根据权利要求8的侦测基因序列的装置，其特征在于所述控制器根据以下参数控制反应的速度：上述颜色变化、控制反应的电场和温度、光源。

10.一种侦测基因序列的方法，它包括以下步骤：

形成含有与待测基因序列对应的DNA片段的基因芯片，它含有基底、DNA片段和电极组和存储与其结构和其上的基因片段有关的信息的一个条形码区；

使上述基因芯片与受测试的试剂混合以使上述基因芯片上的DNA片段与待测基因序列反应，在反应过程中施加电场使反应加速；

在反应时加入含有纳米粒子探针的溶液；

观察芯片表面所表达的颜色变化，判定受测试的试剂是否含有待测基因序列；

根据上述颜色变化，作反馈控制或对去杂交过程进行控制。

11.根据权利要求10的侦测基因序列的方法，其特征在于还包括：在加入含有纳米粒子的溶液作为纳米粒子探针的步骤之后还包括信号放大液添加步骤，用于添加信号放大液，以加强纳米粒子的检测信号，使检测结果更明显。

12.根据权利要求10的侦测基因序列的方法，其特征在于在所述反应过程中使其温度可调节，并检测芯片上的温度并传送到控制器，和使各反应液在进入芯片反应室前，把液体提升至适当的反应温度的步骤。

13.根据权利要求10的侦测基因序列的方法，其特征在于所述在反应过程中施加电场使反应加速的步骤中利用将电场施加装置与所述基因芯片直接连接或者电磁耦合或者电容耦合，以将电场施加到基因芯片。

14.根据权利要求10-13之一的侦测基因序列的方法，特征在于随着要探测的基因片段的不同，所述基因芯片上的基因片段是与要探测的基因片段对应的不同的基因片段。

15.根据权利要求10-13之一的侦测基因序列的方法，特征在于随着要探测的基因片段的不同，所述纳米粒子探针是与要探测的基因片段对应的不同的纳米粒子探针。

16.根据权利要求10-13之一的侦测基因序列的方法，特征在于使用CCD摄像采集系统来观察反应液的颜色变化，判定受测试的试剂是否含有待测基因序列。

17.根据权利要求16的侦测基因序列的方法，其特征在于所述在所述控制反应的速度的步骤中根据以下参数控制反应的速度：上述颜色变化、控制反应的电场和温度、光源。