JPS6352053B2 - - Google Patents

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JPS6352053B2
JPS6352053B2 JP53008200A JP820078A JPS6352053B2 JP S6352053 B2 JPS6352053 B2 JP S6352053B2 JP 53008200 A JP53008200 A JP 53008200A JP 820078 A JP820078 A JP 820078A JP S6352053 B2 JPS6352053 B2 JP S6352053B2
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JP
Japan
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gel
acrylamide
copolymer
aqueous
gels
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JP53008200A
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English (en)
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JPS5396090A (en
Inventor
Buron Eritsuku
Boshutei Ejisuto
Korugieeru Moniiku
Toe Joeru
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Echuudo E Dekusupurowatashion Do Maruke Marufua SA Soc
Original Assignee
Echuudo E Dekusupurowatashion Do Maruke Marufua SA Soc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Echuudo E Dekusupurowatashion Do Maruke Marufua SA Soc filed Critical Echuudo E Dekusupurowatashion Do Maruke Marufua SA Soc
Publication of JPS5396090A publication Critical patent/JPS5396090A/ja
Publication of JPS6352053B2 publication Critical patent/JPS6352053B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
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    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S526/00—Synthetic resins or natural rubbers -- part of the class 520 series
    • Y10S526/909—Polymerization characterized by particle size of product
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な親水性コポリマーを含む水性
ゲルに関する。 ゲルパーミエーシヨン クロマトグラフイは分
子をそれらの大きさによつて分別並びに分離する
現用の方法である。このゲルの最大細孔より大き
い寸法の分子は移動する液相によつて移動させら
れ、より小さい寸法の分子は多かれ少かれ、定常
相を構成するゲルの細孔の中に深く浸透し、そし
て多少とも保持される。各種の寸法の分子を含む
試料を注入した液相をこのゲルで充填したカラム
上に循環させる場合には、これら分子のカラム底
部へ向つての移動速度は分子相互で異なり、分子
は次いで分離される。 上述の技法に於て担体として現在使用されてい
る主要ヒドロゲルは一方では恐らく交差結合した
天然産多糖類のゲル（アガロース ゲル。商標名
セフアデツクスとして知られるデキストラン ゲ
ル）であり、一方では例えばポリアクリルアミド
のゲルまたはポリアクリルアミド−アガロース混
合ゲルのような合成または半合成ポリマーのゲル
である。これらの担体は欠点がないわけではな
い。ポリアクリルアミドまたはポリアクリルアミ
ド−アガロースのゲルは塩基性媒体中ではアミド
基のカルボン酸基への加水分解のために化学的に
不安定であり、これが用途分野を制限する。いく
つかのデキストラン ゲルは中程度の機械的性質
をもち、従つて比較的高速で一定割合の流速をも
つそれらのカラムをつくることは不可能である。
最後に、アガロース ゲルは耐熱性が小さくかつ
水素結合を弱める薬剤（尿素、グアニジン、な
ど）に対する抵抗性が小さく、さらに、天然源の
すべてのゲルと同様に、バクテリアまたはある種
の酵素による攻撃に対してきわめて敏感である。 上述の欠点のために、前記のゲルを Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕メ
タクリルアミドとＮ，N′−エチレン−ビス−メ
タクリルアミドあるいはＮ，N′−メチレン−ビ
ス−アクリルアミド（交差結合剤）との親水性コ
ポリマーのゲルによつて置換することが提案され
た（Tetrahedron LettersNo.６ 357〜358頁、
1975年、を参照されたい）。しかし、この種のコ
ポリマーの均質な、従つて透明な、ゲルを得るこ
とは困難であり、何故ならば重合中に、特に交差
結合剤の高濃度に於て、Ｎ，N′−エチレン−ビ
ス−メタクリルアミドあるいはＮ，N′−メチレ
ン−ビス−アクリルアミドのホモポリマーが形成
され、ゲル中に白い沈殿を形成するからである。 本発明のゲルは、 (a) 式： （式中、ＲはＨ、CH3でありまたアルコール基
は場合によつてはシアノーゲンブルマイド、グ
ルタルアルデヒド、エピクロルヒドリン、１，
４−ブタンジオールジグリシジルエーテルまた
は１，３，５−トリクロロ−２，４，６−トリ
アジシの誘導体のような二官能性または多官能
性化合物で活性化されている）、 （これらの式中で、Ｒは水素原子またはメチル
基であり、R′は水素原子またはヒドロキシメ
チル基であり、Ｘは水素原子またはOH基であ
り、ｎおよびｍは０から６の整数であるが、た
だしＸおよびR′は同時には水素原子であつて
はならない）、 のポリマー単位を含む水不溶性の三次元的に交
叉結合されている不規則コポリマーであつて、
（）の重合単位25〜98重量％、（）および
（または）（）の単位２〜50重量％、（）お
よび（または）（）の重合単位０〜50重量％
からなる前記不規則コポリマー２〜60重量％、 (b) 場合によつては、アガロース、寒天またはゼ
ラチンのようなゲル化可能な天然の巨大分子生
成物 を含む水性ゲルであつて、ゲル中のゲル化可能天
然巨大分子／コポリマーの重量比が２又はそれ以
下である水性ゲルである。 式（）のモノマー成分は既知生成物である。
これらはその製造方法とともに各種刊行物（例え
ばJEDLINSKI及びPAPROTNYのRoczniki
Chemii、Ann.Soc.Chim.Polonorum、1966、40、
pp.1487−1493；Tetrahedron LettersNo.６、
1975、pp.357〜358）に記載されている。 式（）及び（または）（）のモノマー成分
は、交差結合剤である。 これらのモノマー成分の例は特に、Ｎ，N′−
ジアリル−酒石酸ジアミド Ｎ，N′−メチレン−ビス−ヒドロキシメチル
アクリルアミド、及び グリオキザル−ビス−アクリルアミド（Ｎ，
N′−ジヒドロキシエチレン−ビス−アクリルア
ミドともよばれる）である。 式（）及び（または）（）のモノマー成分
の例は、なかでも、 Ｎ−〔（Ｎ−アクリロイル）−グリシル〕−グリシ
ン、Ｎ−〔（Ｎ−メタクリロイル）−グリシル〕グ
リシン、Ｎ−アクリロイル−ε−アミノカプロン
酸である。 本発明による交差結合した親水性コポリマー
は、既知の方法により、水性溶液中での各種モノ
マーの遊離基重合によつてつくることができる。
重合は０℃乃至100℃、好ましくは40℃乃至60℃
の温度に於て、かつ遊離基重合に於て使用される
通常の開始剤の存在下で実施される。この種の開
始剤の例はＮ，Ｎ，N′，N′−テトラメチル−エ
チレンジアミン（TEMED）＋アルカリ金属過硫
酸塩またはエチレンジアミンプロピオニトル＋ア
ルカリ金属過硫酸塩のようなレドツクス系、ベン
ゾイルパーオキサイドのような有機過酸化物、及
び２，2′−アゾ−ビス−イソブチロニトリルであ
る。 重合にかけられる水性溶液中のモノマー全濃度
は一般には20ｇ／乃至300ｇ／であり、全モ
ノマー(b)の重量％は２乃至50％である。 重合はブロツク重合または乳化重合であつてよ
い。ブロツク重合の場合には各種モノマーと開始
剤を含む水性溶液は均質相として重合にかけられ
る。得られる水性ゲルのブロツクを次に粒状に細
分し、例えば篩の網目を通過させる。 乳化重合は、決められた寸法の球形粒の形で水
性ゲルを直接的に提供するものであるが故に好ま
しい方法であるが、次のようにして実施されてよ
い： 各種モノマーを含む水性溶液を、水と混合しな
い、撹拌状態に保ちかつ恐らくは乳化剤を含む有
機液相の中にゆつくりと注入する。撹拌速度を所
望寸法の小滴をもつ、有機相中に水性相が存在す
るエマルジヨンを得るよう調節する。この寸法の
調節、従つて撹拌の調節、はエマルジヨンから採
取した試料の顕微鏡検査によつて行なう。撹拌速
度を調節すると、開始剤をエマルジヨン中に導入
し、これが重合を開始させる。重合は撹拌条件を
同じに保ちながら終りまで実施する。このように
して得られた水性ゲルのビードは有機相の痕跡を
除くよう溶剤または表面活性剤で以て洗滌し、次
いで水洗する。 使用される液状有機相としては、植物油（大豆
油、落花生油、ヒマワリ種油、など）、あるいは
鉱油（パラフイン油、シリコーン油）、石油分溜
製品（ベンゼン、トルエン、など）、塩素化炭化
水素（四塩化炭素、塩化メチレン、など）、及び
これら各種化合物の混合物、が使用されてよい。
液状有機相は恐らくは商業的には「スパン」また
は「ツイーン」として知られている製品のような
乳化剤を容積で0.1乃至0.4％の濃度で含んでよ
い。 乳化重合法によつて得られる水性ゲルのビード
は、操作条件により10μｍ乃至600μｍで変動する
粒子径をもつている。 上述の方法の一つによつて得られる水性ゲル
は、制菌性物質例えばナトリウムアジドの痕跡の
存在下に於て、水中または水性緩衝溶液中での懸
濁体として保持されてよい。0.02％の濃度のナト
リウムアジドで保存を保証するのに十分である。 水性ゲルは慣用的方法（リオフイリゼーシヨ
ン、水とまざり合う有機溶媒での処理、など）に
よつて乾燥されてよい。コポリマーがかくして、
白色粉末の形で、使用時に再水和できるものとし
て得られる。この再水和は水または水性の緩衝溶
液と単に接触させるだけで実施される。コポリマ
ー粉末は占める容積がきわめて小さいので貯蔵に
大変便利な形であり、保存剤及び制菌剤などを添
加せずに無限に保存することができる。 水性ゲルは本発明によるコポリマーを２乃至60
重量％含有してよく、残りは水和水で以て形成さ
れる。 本発明によるコポリマーは熱的に安定であり
（120℃乃至130℃に達する温度に耐える）かつバ
クテリアまたは酵素の攻撃に対して敏感でない。
さらに、明確な酸性（PH２）または塩基性（PH
13）の水性溶液の存在下に於て化学的に安定であ
り、このことはきわめて広い範囲のPHに於ての使
用を可能とするものである。 本発明によるコポリマーは水性媒体あるいは
H2O＋有機溶媒混合媒体に於けるゲルパーミエ
ーシヨン クロマトグラフイ技術に於て、担体と
して、水性ゲルの形で有利に使用することができ
る。これらコポリマーは巨大分子物質混合物の構
成成分特にプロテイン混合物の成分をそれらの寸
法に応じて分離することを可能とする。ゲルの性
質（剛性、分別域）は重合にかけられる水性溶液
中のモノマー全濃度、交差結合剤の性質及び全モ
ノマー中でのそのパーセンテージ、並びに重合条
件、に依存する。これらの各種変数を変えること
により、広汎な特性を有する全領域のゲルが得ら
れる。これらのゲルは分子量が500ダルトンから
数百万ダルトンに至る巨大分子の分離を可能とす
る。 本発明によるコポリマーはまた、例えばプロテ
イン、具体的には酵素、のような生物学的巨大分
子の固定化あるいはクロマトグラフイに対する担
体として、水性ゲルの形態で使用することができ
る。この目的に対して、コポリマーは予め活性化
される。すなわち、コポリマーの一級アルコール
基は二官能性または多官能性化合物との化学反応
により担体上に生物学的巨大分子の付着をおこさ
せることができる基（例えば、イミドカルボネー
ト基）へ転化される。本発明によるコポリマーは
既知の方法によつて活性化される（英国特許第
1183257及び1343703号、及びDOS2061008を参照
されたい）。使用できる活性化剤の例としては、
アルカリ媒体中のシアノ−ゲンブロマイド、グル
タルアルデヒド、エピクロルヒドリンあるいは
１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルの
ようなエポキサイド誘導体、及び１，３，５−ト
リクロロ−２，４，６−トリアジンの誘導体があ
る。本発明によるコポリマーはシアノ−ゲンブロ
マイドによる活性化に対して特によく適合してい
る。 活性化コポリマーの水性ゲル上へのプロテイン
の固定化すなわち固着は慣用的方法により、例え
ば、固定されるべきプロテインを含む水性緩衝媒
体中に於て活性化ゲルのビードを数時間撹拌する
ことによつて、実施される。この操作の終りに於
て、少くとも部分的にプロテインを固定化したゲ
ルのビードを分離し、適切な緩衝媒体中で保存す
る。 本発明によるコポリマーの活性化ゲルとの組合
せに於いてかくして固定化することができるプロ
テインの例として、アルギナーゼ、インバーター
ゼ、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、アル
カリ性ホスフアターゼ、チロシン及びチモトリプ
シンが挙げることができる。 本発明によるコポリマーは、特定的な特性をも
つ混合ゲルを得るよう、例えば、寒天、アガロー
スあるいはゼラチンのような天然産の水溶性でか
つゲル化可能な巨大分子生成物と結合させてよ
い。かくして、特に硬いゲルを得るために、本発
明によるコポリマーはアガロースと結合される。
これらの混合ゲルに於て ゲル化可能な天然の巨大分子生成物／本発明によ
るコポリマー の重量比は２である。 このように混合ゲルをつくるためには、前述の
ように操作するが、ただし、ゲル化可能な天然巨
大分子生成物の所望量をモノマーの水性溶液中に
はじめに導入し、この量は一般には水性溶液中で
0.5乃至６重量％の濃度に相当する。天然巨大分
子生成物は反応媒体が重合後に冷却されるとき、
コポリマーの網目の中へゲル化される。 以下の実施例は本発明を解説するものであり、
制限するものではない。 実施例 １ 水性ゲルの形態のコポリマー、Ｎ−〔トリス
（ヒドロキシメチル）メチル〕−アクリルアミ
ド／Ｎ，N′−ジアリル−酒石酸ジアミド、の
ブロツク重合による製造。 10ｇのＮ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ル〕アクリルアミドと１ｇのＮ，N′−ジアリル
−酒石酸ジアマイドとを50℃の水浴上に置いた容
器の中に入れた脱塩水100mlの中に溶解する。こ
の溶液を次に過し、真空で脱気し、50℃の水浴
上に置く。溶液を磁気撹拌機によりゆるやかに撹
拌し、150mgの過硫酸アンモニウムと0.16mlの
TEMEDを導入する。数分後に、反応媒体を僅か
に加熱し、続いて溶液のゲル化が観察された。剛
性で透明の水性ゲルのブロツクがかくして得られ
る。このブロツクを100μｍの網目をもつ篩の上
に通すことにより粒子に分割する。粒を洗滌し、
選ばれた緩衝溶液中で保存する。 このようにして得た均質ゲルはゲルパーミエー
シヨン クロマトグラフイに於ける担体として使
用してよい。分別のその領域は2500ダルトン乃至
300000ダルトンに及ぶ。 ゲルはまた生物学的巨大分子を固定化するため
に、活性化後に於て使用されてよい。 実施例 ２乃至４ 操作は実施例１と同じであるが、ただし、脱塩
水100mlに対して、次の量のモノマーを使用する。
【表】 均質透明ゲルが得られ、各種の特性をもつてい
る。実施例２のゲルはさほど密なものではなく、
実施例３のゲルは密であり、実施例４のゲルはき
わめて硬い。 これらのゲルはゲル パーミエーシヨン クロ
マトグラフイあるいは生物学的巨大分子の固定化
のための担体として使用することができる。実施
例３及び４のゲルの分別の領域はそれぞれ 2500ダルトン乃至300000ダルトン（実施例３） 1000ダルトン乃至100000ダルトン（実施例４） である。 実施例 ５ 水性ゲルのビードの形態のコポリマー、Ｎ−
〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕アクリ
ルアミド／グリオキザル−ビス−アクリルアミ
ド、の製造。 350mlのパラフイン油と２mlの「スパン−85」
として商業的に知られている乳化剤とを700mlの
反応器の中に導入する。混合物を機械的に撹拌
し、55℃へ加熱する、さらに、40ｇのＮ−〔トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル〕アクリルアミド
と４ｇのグリオキザル−ビス−アクリルアミドと
を55℃へ加熱した200mlの水に溶解し、300mgの過
硫酸アンモニウムをこの溶液へ添加する。このよ
うにして得た溶液を撹拌パラフイン油中に注入す
る。撹拌速度を滴が約100μｍの直径をもつ安定
エマルジヨンを得るよう調節する。撹拌10分後に
於て、0.32mlのTEMEDをエマルジヨン中に導入
し、撹拌をさらに約30分間続ける。 反応媒体を次に氷水添加によつて冷却し、撹拌
を止め、混合物を数時間放置する。上澄油相を吸
引により除き、直径約100μｍの得られたゲルの
ビードを傾斜によつて回収する。これらのビード
を、油の残留を除くためにトライトンＸ−100の
0.1％水性溶液により洗滌し、次いで洗剤が全部
除去されるまで脱塩水で以て洗滌する。ビードを
水中または適当な緩衝溶液の中で保存する。 このようにして得られた均質透明水性ゲルはき
わめて硬い。これは1500乃至50000ダルトンに及
ぶ分別域をもつている。これは特に、カラム上で
プロテイン溶液の塩を除く操作に対して適してい
る。 実施例 ６乃至８ 操作は実施例５と同であるが、ただし、200ml
の水に対して次の量のモノマーを用いる：
【表】 ゲル パーミエーシヨン クロマトグラフイに
於ける担体または生物学的巨大分子の固定化のた
めの担体として使用できる均質透明ゲルが得られ
る。実施例７のゲルの分別域は 2500ダルトン乃至300000ダルトン である。 実施例 ９ 本実施例は比較のためのものである。前記実施
例１、２、５、６及び７に於て、Ｎ，Ｎ−ジアリ
ル−酒石酸ジアミドとグリオキザル−ビス−アク
リルアミドとをＮ，N′−メチレン−ビス−アク
リルアミドによつて置換すると、透明でなく従つ
て不均質な水性ゲルが得られる。 実施例 10 アガロースとコポリマー Ｎ−〔トリス（ヒド
ロキシ）メチル〕アクリルアミド／グリオキザ
ル−ビス−アクリルアミドとを含む混合ゲルの
製造。 重合を実施例５と同様に行なうが、ただし、パ
ラフイン油を大豆油によつて置換し、７mlの「ス
パン−85」を２mlの代りに使用し、油中に注入さ
れる水性溶液は、200mlの水に対して、30ｇのＮ
−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕アクリ
ルアミド、３ｇのグリオキザル−ビス−アクリル
アミド、４ｇのアガロース、及び300mgの過硫酸
アンモニウムを含んでいる。 重合が終了すると、エマルジヨンの温度を40℃
へ漸次的に下げ、次にエマルジヨンを氷水添加に
よつて急速に冷却する。上澄油状相を吸引により
除き、得られる混合ゲルビードを分離し、ラウリ
ル硫酸ナトリウムの0.2％水性溶液によつて洗滌
し、次いで脱塩水で以て洗滌する。ビードをナト
リウムアジドのような殺菌剤の痕跡を含む４℃の
水の中で懸濁液として保存する。このようにして
得た水性ゲルは特に硬く、高流速の場合のクロマ
トグラフイに対してきわめて適している。このゲ
ルは熱的に安定でなく37℃以下の温度で使用せね
ばならない。 実施例 11 乾燥形態のコポリマー、Ｎ−〔トリス（ヒドロ
キシメチル）メチル〕アクリルアミド／グリオ
キザル−ビス−アクリルアミド、の製造。 実施例５乃至８で得られた水性ゲルのビード
を、底部に出口がありこれへ過器を適用してあ
る容器の中に水と一緒に入れる。ビードを連続的
磁気撹拌によつて懸濁状に保持する。エチルアル
コールをこの容器の上部へ連続的に導入し、導入
速度を容器底部の水の出口からの流れに等しくな
るように調節する。懸濁状のビードは次にエタノ
ール分がますます多くなる媒体と接触してゆく。
水を次にビード内部から漸次的に駆除しエタノー
ルによつて置換する。この操作が終了すると、エ
タノールをこんどはアセトンによつて置換し、次
にアセトンを同じ方法に従つてエチルエーテルに
よつて置換する。最後に、エーテルで浸漬したゲ
ルが得られ、これを空気流下で数分間で乾燥す
る。出発ゲル100mlに対して約５乃至20ｇのコポ
リマーが小球から成る微粉末の形態で、かくして
得られる。この粉末は水と単に接触させるだけで
直ちに再水和し、粒子はその最初の形を再びと
る。再水和した乾燥ゲルのクロマトグラフイに於
ける挙動ははじめの水性ゲルのそれと異なること
がない。 実施例 12 酵素固定化への応用。 実施例７で得られた水性ゲルのビード５mlと脱
塩水15mlとを20mlの円錐フラスコの中に入れる。
混合物を撹拌し、１mlあたり50mgのシアノ−ゲン
ブロマイドを含むシアノ−ゲン ブロマイド水
性溶液４mlを添加する。苛性ソーダのＮ−溶液の
添加によりPHを11に保ちながら撹拌をつづける。
PHを安定化したのち、撹拌をさらに30分間続け、
ビードを過し、重炭酸ナトリウムの0.1M水性
溶液100mlで以て迅速に洗滌し、次いで塩化ナト
リウムのＭ−溶液で以て洗滌する。このようにし
て得られた活性化ゲルのビードを次にアルギナー
ゼの固定化に対して使用する。 活性化ゲルを、15単位／mgのアルギナーゼ10mg
を含有する、PH7.2で５×10-2Mのマレイン酸
塩／MnCl2緩衝媒体の10mlの中に入れる。この懸
濁液を４℃で24時間バランセル（balancelle）上
で撹拌する。次にビードを過し、塩化ナトリウ
ムのＭ−溶液25mlと脱塩水25mlとで洗滌する。こ
のようにして得られた活性化ゲル−アルギナーゼ
誘導体をPH7.2で５×10-2Mのマレイン酸塩／
MnCl2緩衝液中で懸濁体として保存する。 活性化ゲル上で固定される酵素の量はFOLIN
の試薬で以て慣用的方法により液中に残留する
酵素を測定することによつて間接的に測定する
（ロウリーら：J.Biol.Chem.、1951、193、265を
参照のこと）。活性化ゲル−アルギナーゼ誘導体
の酵素活性はアルギニンの加水分解の方法によつ
て測定する（J.J.ヘイガン及びR.D.ダラム：
Anal.Biochem.1968、22、518）。 二つの類似の実験で得た結果を次表に示す。
【表】 誘導体の酵素活性を表わす残留活性のパーセン
テージは式100M1／M2によつて定義されるが、M3は 固定された酵素の質量を示し、M1は固定化酵素
の質量と同じ活性をもつ天然酵素の質量である。 実施例 13 水性ゲルのビードの形態のコポリマー、Ｎ−
〔トリス（ヒドロキシ−メチル）メチル〕アク
リルアミド／Ｎ，N′−ジヒドロキシエチレン
−ビス−アクリルアミド／６−アクリルアミド
ヘキサン酸（あるいはＮ−アクリロイル−ε
−アミノカプロン酸）、の製造。 操作は実施例５と同じであるが、ただし、水性
溶液中に於て40ｇのＮ−〔トリス（ヒドロキシメ
チル）メチル〕アクリルアミドと４ｇのグリオキ
ザル−ビス−アクリルアミドを35.6ｇのＮ−〔ト
リス（ヒドロキシメチル）−メチル〕アクリルア
ミド、4.0ｇのＮ，N′−ジヒドロキシエチレン−
ビス−アクリルアマイド及び0.4ｇの６−アクリ
ルアミド ヘキサン酸によつて置換する。水性溶
液をPH６とし、実施例５と同じ操作を行なう。 かくして、直径が30乃至250ｍμのビードの形
で、ゲル１mlあたり６乃至20ミリ当量（μeq）の
COOHを含む水性ゲルが得られる。 実施例 14 水性ゲルのビードの形のコポリマー、Ｎ−〔ト
リス（ヒドロキシメチル）メチル〕メククリル
アミド／Ｎ，N′−ジヒドロキシエチレン−ビ
ス−アクリルアミド／Ｎ−〔（Ｎ−メタクリロイ
ル）グリシル〕グリシン、の製造。 操作は実施例１と同じであるが、ただし、水性
溶液中に於て、40ｇのＮ−〔トリス（ヒドロキシ
メチル）メチル〕アクリルアミドと４ｇのグリオ
キザル−ビス−アクリルアミドとを10.5ｇのＮ−
〔トリス（ヒドロキシメチル〕−メタクリルアミ
ド、1.2ｇのＮ，N′−ジヒドロキシエチレン−ビ
ス−アクリルアミド及び0.2ｇのＮ−〔（Ｎ−メタ
クリロイル）グリシル〕グリシンによつて置換す
る。 かくして、直径30乃至250μｍのビードの形態
で、ゲル１mlあたり６乃至20μeqのCOOHを含む
水性ゲルが得られる。 例１から11、13および14のゲルの特性 百分率分析値
【表】
【表】 赤外線スペクトル 例１から11、13および14のゲルは870、1030、
1110、1530、1630、2060、2300、2900および3440
cm-1に吸収ピークを示す。 イオン化可能陰イオン基 例１から11のゲルはイオン化可能陰イオン基を
４〜8μ当量／ml含有する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 式： （式中、ＲはＨ、CH3でありまたアルコール基
    は場合によつてはシアノーゲンブルマイド、グ
    ルタルアルデヒド、エピクロルヒドリン、１，
    ４−ブタンジオールジグリシジルエーテルまた
    は１，３，５−トリクロロ−２，４，６−トリ
    アジンの誘導体のような二官能性または多官能
    性化合物で活性化されている）、 （これらの式中で、Ｒは水素原子またはメチル
    基であり、R′は水素原子またはヒドロキシメ
    チル基であり、Ｘは水素原子またはOH基であ
    り、ｎおよびｍは０から６の整数であるが、た
    だしＸおよびR′は同時には水素原子であつて
    はならない）、 のポリマー単位を含む水不溶性の三次元的に交
    叉結合されている不規則コポリマーであつて、
    （）の重合単位25〜98重量％、（）および
    （または）（）の重合単位２〜50重量％、（）
    および（または）（）の重合単位０〜50重量
    ％からなる前記不規則コポリマー２〜60重量
    ％、 (b) 場合によつては、アガロース、寒天またはゼ
    ラチンのようなゲル化可能な天然の巨大分子生
    成物 を含む水性ゲルであつて、ゲル中のゲル化可能天
    然巨大分子／コポリマーの重量比が２又はそれ以
    下である水性ゲル。
JP820078A 1977-01-28 1978-01-27 Novel hydrophilic copolymer Granted JPS5396090A (en)

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