SU1166751A1 - Способ получени сорбента дл хроматографического разделени биополимеров - Google Patents

Abstract

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕВИЯ БИОПОЛИМЕРОВ, включающий обработку кремнеземного носител  раствором , содержащим полимер N- винилпирролидона , отличающийс  тем, что, с целью повьшени  раздел ющей способности и стабильности .сорбента , в качестве носител  используют модифицированный у- аминопропилтриэтоксисиланом кремнезем и обработку ведут раствором сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида в органическом растворителе с последук цим контактированием с раствором этаноламина. 2. Способ по П.1 отличаю .щ и и с   тем, что используют 2-3%ный раствор сополимера м-винилпирролидона и акрилоилхлорида.

Description

О) СП

сд Изобретение относитс  к способам получени  сорбентов дл  разделени  и очистки биополимеров и может быть использовано дл  хроматографической очистки вирусных суспензий при приго товлении вакцин. Цель изобретени  - повышение раздел ющс|й способности и стабильности сорбента. Сущность способа заключаетс  в последовательной обработке кремнезема - АПТЭС, сополимером N - винилпирролидона и акрилоилхлорида и этаноламином . Согласно изобретению дл  получени  сорбента используют макропористый кремнезем, характеризующийс  средним размером пор 1100 А - 2000 А и удельной поверхностью 20-50 м/г. Обработку кремнезема раствором сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида осуществл ют при комнатной температуре, 1,5-2 ч. Используют 1-4% -ный (лучще 2-3% -ный) раствор сополимера в органическом растворите ле, выбранном из группы: диметилформамид , диоксан или их смесь. При использовании раствора сополи мера с концентрацией меньше 1% снижаетс  раздел юща  способность сорбента , при содержании сополимера больше 4% сополимер выпадает в ос.адок .Взаимодействие с этаноламином про вод т также при комнатной температуре 2-16 (лучше 10-15)4. Перед обработкой раствором сополи мера кремнезем модифицируют известным приемом 1-4% -ным раствором jАПТЭС в органическом растворителе при нагревании до 70-120с. В качест ве растворител  примен ют алифатические спирты Cj-C, алифатические углеводороды С., а также ароматические углеводороды Сд. Температура обработки раствором j--АПТЭС обычно определ етс  температурой кипени  соответствующего растворител , Продолжительность модификации уАПТЭС составл ет 2-4 ч дл  спиртовьис растворов и 20 - 36 ч в случае приме нени  углеводородных растворителей. Отделение непрореагировавшего уАПТЭС осуществл ют путем многократной экстрации органическим растворителем (эталоном, ацетоном, толуолом, диоксаном). Пример. 15г макропористог кремнезема с диаметром пор 1100 А обрабатывают кип щим 3% -ным раствором -j--АПТЭС в изопропаноле 3 ч, затем промывают 8 ч. изопропанолом в эстракторе Сокслета и сушат при 1 ч, а далее при 2 ч под вакуу мом. 15 г полученного материала обра батывают при перемешивании 3% -ным раствором сополимера N-винилпирроли дона и акрилоилхлорида (соотношение мономерных звеньев 1:1, характеристическа  в зкость 0,20-0,25 дл/г) в сухом диоксане 2 ч при 25с. После обработки раствором сополимера сорбент четырежды промывают порци ми по 100 мл сухого диоксана и добавл ют при перемешивании 5 г этаноламина . Через 10 ч после добавлени  этаноламина диоксановый раствор декантируют и сорбент промывают дистиллированной водой до нейтрального рН. Пример 2. 50 г макропористого кремнезема с диаметром пор 1600 А обрабатывают кип щим 4% -ным раствором в этаноле 3 ч, промывают 8 ч этанолом в экстракторе Сокслета и сушат при 20°С 1 ч, а затем при 2 ч под вакуумом 50 г полученного материала обрабатывают при перемешивании 3% -ным раствором сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида {соотношение мономерных звеньев 1:1, характеристическа  в зкость 0,20 - 0,25 дл/г) в сухом диметилфррмамиде 2 ч при . После обработки раствором сополимера сорбент четырежды промывают порци ми по 300 мл сухого диметилформамида. Добавл ют 5 г этаноламина и перемешивают. Через 2 ч после добавлени  этаноламина диметилформамидный раствор декантиру ,ют и сорбент промывают дистилированной водой до нейтрального рН. Примерз. 300 г макропористого кремнезема с диаметром пор 2000 А обрабатывают кип щим 2% -ным раствором у-АПТЭС в толуоле 30 ч, промывают свежими порци ми сухого толуола (Зх1л) и сухого диоксана (Зх1л). к полученной смеси кремнезема и органических растворителей прибавл ют при перемешивании 1 л 2% -ного раствора сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида (характеристики сополимера те же, что в примере 1) в сухом диоксане и перемешивают 2 ч при 25с. После обработки раствором сополимера сорбент четыре;кды промывают порци ми по 1 л сухого диоксаиа. Добавл ют 50 г этаноламина и перемешивают . Через 16 ч после прибавлени  этаноламина раствор декантируют и сорбент промывают дистиллированной водой до нейтрального рН. Пример4. 50 г макропористого кремнезема с диаметром пор 200оА обрабатывают 1% -ным раствором тАПТЭС в декане 20 ч при , промывают 8 ч этанолом в экстракторе Сокслета и сушат при 1 ч, а затем 2 ч под вакуумом при . 50 г полученного материала обрабатывают при перемешивании 2% -ным раствором сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида (характеристики сополимера те же, что в примере 1) в смеси сухих диоксана и диметилформамида (объемное соотношение 1:1) и перемешивают 2 ч при 25°С. После обработки раствором сополимера сорбент четырежды промывают порци ми по 300 мл сухого диоксана. Добавл ют 5 г этаноламина и перемешивают. Через 2 ч после прибавлени  этаноламина раствор декантируют и сорбент промывают днетиллированной водой до нейтрального рН.

Примерз. 50 г макропористого кремнезем 1 с диаметром пор 2000 А обрабатывают 2% -ным раствором у АПТЭС в толуоле в течение 20 ч при IIOC, промывают 8 ч ацетоном в аппарате Сокслета и сушат при 1 ч а затем 2 ч под вакуумом при . 50 гр полученного материала обрабатывают при перемешивании 1% -ным раствором сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида в диоксане (характеристики сопрлимера те же, что в примере 1) 2ч при 25С. После обработки раствором сополимера сорбент четырежды промывают порци ми по SCO мл сухого диоксана и прибавл ют, перемешива , 5 г этаноламина. Через 2 ч Параметры очистки вирусной суспензии на

после этого сорбент промывают дистиллированной водой до нейтрального рН.,

О р и м е р 6. Синтез сорбента проводитс  аналогично примеру 5, но вместо 1% -ного раствора сополимера в реакцию ввод т 0,5% -ный раствор того же сополимера.

Полученный по примерам 3-6 сорбен помещают в колонку размером 1х40см, :промывают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,1 М NaCt со скоростью 1 мл/мин и в тех же усло .ви х хроматографируют суспензию ви-руса гриппа (штамм А385) .Объем вводимо пробы 1 мЛу концентраци  гемагглютинина 250 мкг/мл, концентраци  белков 400 мг/мл.

Содержание гемагглютинина, характеризующего выход собственно вируса, примесных белков по Кумасси и реакци  гемагглютинирующей активности (РГА) во фракци х вирусного препарата, полученных на известных и предлагаемых сорбентах, приведено в таблице. различных сорбентах

При описанном способе синтеза макромолекулы модифицирующего полимера располагаютс  исключительно по поверхности кремнезема и не заполн ют внутренний объем пор сорбента. Это приводит к увеличению раздел ющей способности сорбента. Вымывание полимера , модифицирующего поверхность, отсутствует. В таблице приведены данные , характеризующие раздел ющую способность сорбентов, полученных по за вл емому и известному способу.

Как показывает таблица, вирусна  суспензи , полученна  на сорбенте, полученном по насто щему изобретению содержит меньше примесных белков при том же или даже большем выходе вируса . Это свидетельствует о повыпюнной раздел ющей способности сорбента , полученного по предлагаемому спо собу. В таблице приведены также значени  реакции гемагглютинирующей активности вируса (РГА), характеризующей сохранение его биологической функции. При использовании сорбента,

полученного по за вл емому способу, РГА не только не снижаетс , но становитс  выше, чем при использовании известного сорбента.

Аналогичные результаты получены дл  сорбента, приготовленного в соответствии с примером 5, тогда как сорбент по примеру 6 характеризуетс  пониженными значени ми выхода вируса и РГА.

Пример 7.Через колонку 1x40 см заполненную сорбентом полученным lib данному изобретению, пропускали 4 л фосфатного буферного раствора (0,01 М, рН 7,4), содержащего 0,1 М МаСг . Такое промывание соответствует 100 хроматографическим разделени м . При повторении хроматографии после такой промывки выход гемагглютинина не измен етс . Содержание примесных белков остаетс  ниже, чем при использовании сорбента, полученного по способу-прототипу.

Таким образом, предлагаемый способ получени  сорбента позвол ет по-,

j11667516

лучить стабильный хроматографическийрегенерации. Очистка вирусной суспеиматериал , пригодный дл  многократно-зии от вирусных белков при этом осго использовани  (не меньше 100 раз-таетс  вьше,чем при использовании сорделений против 5 дл  прототипа) безбента,полученного известным способом.

Claims (2)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ БИОПОЛИМЕРОВ, включающий обработку кремнеземного носителя раство- ром, содержащим полимер N- винилпирролидона, отличающийся тем, что, с целью повышения разделяющей способности и стабильности .сорбента, в качестве носителя используют модифицированный γ- аминопропил-: триэтоксисиланом кремнезем и обработку ведут раствором сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида в органическом растворителе с последующим контактированием с раствором этаноламина.

2. Способ по п.1 отличающийся тем, что используют 2-3%ный раствор сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида.

>