JPS633872B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグリコシド水解酵素阻害作用を有する
新規弱塩基性含窒素化合物アミロスタチンＹに関
する。

グリコシド水解酵素阻害物質は肥満症や糖尿病
などの病気の予防、治療薬、又は〓炎の診断薬と
して有用な物質であることが知られており、その
興味深い生理活性ゆえに今後益々医薬として期待
される物質である。グリコシド水解酵素阻害物質
としてはアミノ糖であるノジリマイシン
（Niwa：Agr.Biol.Chem.，37.2025，（1973））、
アミラーゼ阻害剤であるアミロスタチンＡ（特公
昭52−21596）及びバイエル社のグリコシド水解
酵素阻害剤（特開昭52−122342号）等が知られて
いる。本発明者らは更に新しい有用なグリコシド
水解酵素阻害物質を開発すべく鋭意研究を重ねた
結果、ストレプトミセス属に属する放線菌の生産
するアミラーゼ阻害物質を酸で加水分解すること
により新規なグリコシド水解酵素阻害物質アミロ
スタチンＹが生産されることを発見し、本発明を
完成するに至つた。次に本発明のアミロスタチン
Ｙの生産方法を述べる。

本発明のアミロスタチンＹの原料であるアミラ
ーゼ阻害物質としては例えばストレプトミセス・
ジアスタテイカス・バル・アミロスタテイクス
（Streptomyces diastaticus var amylostaticus）
FERM−Ｐ 2499の生産するアミラーゼ阻害物
質が用いられる。このアミラーゼ阻害物質は上記
菌株を炭素数、窒素源及び無機イオンを含む通常
の栄養培地で好気的に培養することにより主とし
て培養液中に生産される。上記炭素源としては澱
粉、澱粉加水分解物（可溶性澱粉、デキストリ
ン）が望ましく、特にアミロペクチン含量の多い
ワキシーコーンスターチ等が望ましい。窒素源と
してはペプトン、肉エキス、脱脂大豆抽出物、大
豆蛋白分解物等の有機窒素源が望ましいが、アン
モニウム塩等の無機窒素源を併用することも有効
である。無機イオンとしてはMg，Fe，Ca，Cu，
Zn，Mn等の２価の陽イオン、Na，Ｋ、等の１
価の陽イオン及びPO₄，SO₄等の２価の陰イオン
が用いられ、必要に応じて酵母エキス、核酸物
質、ビタミン等の有機微量栄養素も使用される。
これら炭素源、窒素源及び無機イオンを含む栄養
培地のPHを中性付近に調整し、15〜40℃で好気的
に振盪あるいは通気撹拌培養することにより前記
放線菌は良好に生育し、主として培養液中にアミ
ラーゼ阻害物質が蓄積される。本菌株を培養する
とアミラーゼ阻害物質の他に中性多糖、オリゴ糖
が多量生産されているため、酸で加水分解する前
にあらかじめアミラーゼ阻害物質を培養液から分
離することが望ましい。アミラーゼ阻害物質の分
離法としては、まず培養液から微生物菌体を除去
した後、活性炭吸着、水−有機溶媒溶離、強酸性
イオン交換樹脂によるイオン・交換クロマトグラ
フイー、ゲル濾過法等によつて分離される。

アミロスタチンＹは、このようにして培養濾液
から分離したアミラーゼ阻害物質を1.0〜6.0Nの
鉱酸で100〜120℃、1.0〜6.0時間加水分解するこ
とによつて得られる。この酸加水分解物中にはア
ミロスタチン以外の不純物が含まれているが、ア
ミロスタチンＹは弱塩基性物質であるから、強酸
性イオン交換樹脂によるイオン交換クロマトグラ
フイー、分取ペーパークロマトグラフイー、シリ
カゲルカラム・クロマトグラフイー、分取高速液
体クロマトグラフイー等の精製手段を適宜組合せ
ることによつて、アミロスタチンＹは加水分解物
から単離することができる。このようにして得ら
れるアミロスタチンＹの理化学的性質は次のとお
りである。

(1) 元素分析値：Ｃ：51.4％、Ｈ：7.0％、Ｎ：
4.6％ (2) IRスペクトル：第１図に示す通り (3) UVスペクトル：特異な吸収は認められな
い。

(4) NMR：第２図に示す通り (5) Rf値：0.7〜0.8（シリカゲルプレート、ブタ
ノール：ピリジン：水＝６：４：
３） (6) 溶解性：水、ピリジン、酢酸に可溶、ベンゼ
ン、クロロホルムに不溶 (7) 酸性、中性、塩基性の区別：弱塩性 (8) 呈色反応 ソモギーネルソン反応：陽性 (9) 物質の色：白色粉末 なお、本発明のアミロスタチンＹを水素化ホウ
素ナトリウムを用いて還元すれば、アミロスタチ
ンＹは還元されアミロスタチンYHとなる。

この還元物アミロスタチンYHを箱守法により
メチル化を行い、高分解能マススペクトルを測定
したところ、分子量（ｍ／ｅ）は、403.2598であ
つた（第３図参照）。また、重水素化したヨウ化
メチルを用いて重メチル化を行い、マススペクト
ルを測定したところ、分子量（ｍ／ｅ）は424で
あつた。

アミロスタチンYHを過ヨウ素酸酸化し、次い
で水素化ホウ素ナトリウム還元及び箱守法による
メチル化を行つた後、マススペクトルを測定した
ところ、分子量（ｍ／ｅ）は361であつた。（第４
図参照）。

以上の結果より、アミロスタチンYHは、分子
式C₁₃H₂₃NO₇、分子量305で下に示す構造を有し
ていることが判る。

アミロスタチンYHが上記の構造を有すること
は本発明のアミロスタチンＹの構造から見て、当
然である。

本発明のアミロスタチンＹはインベルターゼ等
のグリコシド水解酵素に対して強い阻害活性を示
すものである。以下、実施例にて詳細に説明す
る。

実施例 １ 第１表 アミラーゼ阻害物質生産用培地の組成成 分 含 量（％） コーンスターチ 4.0 脱脂大豆フレークの抽出液 2.0 食 塩 0.3 K₂HPO₄ 0.1 MgSO₄・7H₂O 0.05 FeSO₄・7H₂O 0.001 CuSO₄・5H₂O 0.0001 ZnSO₄・7H₂O 0.0001 MnSO₄・nH₂O 0.0001 PH 7.0 上記第１表に示す液体培地16を20容
Jarfermentorに張込み、120℃で10分間滅菌後同
培地でフラスコ振盪培養（30℃、20時間）して得
られたStreptomyces diastaticus var.
amylostaticus FERM−Ｐ 2499の種培養液400
mlを接種し、30℃で80時間通気撹拌培養（通気量
16liter／min、撹拌数400rpm）を行つた。

培養液を遠心分離し菌体を除去して上清液12.5
を得た。これを塩酸でPH3.0に調整し、室温の
一夜放置して生ずる沈澱物（不純蛋白）を濾別し
濾液に活性炭（和光純薬）375ｇを加えてかきま
でアミラーゼ阻害物質を吸着させ、次いで濾過し
た。この活性炭を5.0の純水に懸濁させ、2N−
NaOHでPH10.5に調整後、80℃で30分間加熱し濾
別した。

紙上の活性炭を充分量の純水で濾液の色がな
くなるまで洗浄した。この加熱洗浄操作を２回行
つた後、PH3.0で同様の加熱・洗浄操作を行つた。
十分洗浄した活性炭に60％エタノール水溶液5.0
を加えて２時間かきまぜ、アミラーゼ阻害物質
を溶出した。この溶出操作をもう１度行い、得ら
れたエタノール溶液を減圧下で濃縮・乾固し、純
水に溶解して540mlの水溶液を得た。この水溶液
をあらかじめ水で平衡化したDowe×50w×２（Ｈ
型）のカラム（2.5×30cm）に通し、カラムを水
で十分洗浄した後、0.5Mピリジン緩衝液（PH
5.5）で溶出した。

BSAに対して活性を有する区分を集め、減圧
下で濃縮・乾固した（収量10ｇ）。この操作によ
り、培養液中に存在していたコーンスターチの分
解物則ち中性オリゴ糖を除去した。次に、この内
4.5ｇを2N−HCl100mlに溶解し、100℃にて４時
間加水分解を行い、濃縮乾固した後、水100mlに
溶解し、Dowe×50×２（H⁺型）の２×10cmのカ
ラムに注いだ。カラムを十分水洗した後、10％ピ
リジン150mlにてアミロスタチンＹを溶出し、溶
出液を濃縮乾固し、クロロホルム：メタノール：
水（140：50：４、Ｖ／Ｖ）の混液に溶解又は懸
濁し、予め、この混液で平衡化したシリカゲルの
カラム（２×10cm）に注ぎ、この混液にて溶出し
た。溶出液をフラクシヨンコレクターにて分画
し、TLCにてアミロスタチンＹを含有する画分
を調べた後、アミロスタチンＹを含有する画分を
合し、減圧にて濃縮乾固し、白色粉末30mgを得
た。この粉末のIRスペクトルを第１図に、NMR
スペクトルを第２図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のアミロスタチンＹのIRスペ
クトル、第２図はNMRスペクトルを示す図面で
ある。又第３図及び第４図はアミロスタチンＹの
還元物アミロスタチンYHのマススペクトル図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 で示される弱塩基性含窒素化合物アミロスタチン
   Ｙ