JPS58172400A - 新規なアミノオリゴ糖誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は糖質分解酵素を特異的に阻害する新規なアミノ
オリゴ糖誘導体に関し、更に詳しくは下記一般式（Ｉ）
で示されるアミノオリゴ糖誘導体に関する。

Ｃ式中用はＯ〜１２の整数を、ｎは１〜１３の整数を表
わし、且つｍ＋ｎが１〜１３の整数であることを表わす
。） 従来、糖質分解酵素を阻害するアミノオリゴ糖誘導体と
しては、アクチノプラネス属に属する菌株が生産する物
質（特公昭５４−３９４７４号及び特開昭５２−１２２
３４２号）、ストレプトマイセス・ニス・ビー・Ａ２３
９６菌株（微工研菌寄第４２７５号）が生産する物質（
特開昭５４−９２９０９号）、アミロスタチン（特公昭
５２−２１５９６号、特開昭５１−５４９９０号及び特
ＩＪ昭５ｓ−６８６９４号）、ストレプトマイセス・カ
ルプス・バリエタス・ＴＭ−５２１菌株（微工研菌寄第
４２８３号）が生産する物質（特開昭５６−１２３９８
６号及び特開昭５６−１２５３９８号）及びオリゴスタ
チン（ＴｈｅＪＯｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔ’１ｂｉＯ
−ｔｉｃｓ　　３４巻１１号１４２９頁　１９８１年）
等が知られている。本発明はこれらの公知物質とは化学
構造にお緊て顕著に相違し、しかも有用な糖質分解酵素
阻害作用を具備する前記一般式〔１〕で示されるアミノ
オリゴ糖誘導体を提供するものである。

本発明ｉ導体ＣＩ）は２．０〜４．０規定希塩酸を用い
て加熱すると、血小板凝集抑制作用を持つ下記構造式〔
１ｌ） ０耳 で示される化合物（以下ＮＳ○と仮称する）及びグルコ
ース等に加水分解されるという特徴を有する。

本発明誘導体ＣＩ）に包含される代表的な化合物を以下
に例示する。各例示化合物の冒頭に付した名称は本明細
書においてそれら化合物の仮称基を表わし、ｍ、ｎ及び
ｍ−１−ｎは前記一般式ＣＩ）で表わしたものを意味す
る。

Ｎ　Ｓ　１　；　Ｏ−（４，６−ピスデスオキシー４−
（２，３−エポキシ−３−ヒドロキシメチル−４，５，
６−トリヒドロキシンクロヘキサン＝１−イルアミノ）
−α−Ｄ−グルコピラノシル〕−（１→４）−α−Ｄ−
グルコビラノース（ｍが０１．ｎが１の化合物） ＮＳ２；０−（４，６−ピスデスオキシー４−（２，３
−エポキシ−３−ヒドロキシメチル−４，５，６゜−ト
リヒドロキシンクロヘキサン−１−イルアミノ）−α−
Ｄ−グルコピラノシル〕−（１→４）−〇−α−Ｄ−グ
ルコピラノシルー（１→４）−α−Ｄ−グルコビラノー
ス（ｍがＱ、　　ｎが２の化合物） Ｎ・ｓ３；ｏ−（４，６−ピスデスオキシー４−〔５，
６−ジヒドｂキシー２，３−エポキシ−４−（〇−α−
Ｄ−グルコピラノシルー〔１−・→４））−３＝ヒドロ
キシメチルシクロヘキサン−１−イルアミノ〕−α−Ｄ
−グルコピラノシル）−（１→４）−α−Ｄ−グルコビ
ラノース（ｍがｌ、ｎが１の化合物） ＮＳ４；Ｏ−［４，６−ピスデスオキシー４−（２，３
−エポキシ−３−ヒドロキシメチル−４，５，６−トリ
ヒドロキシンクロヘキサンー１−イルアミノ）−α−Ｄ
−グルコピラノシル〕−（１→４）−〇−α−Ｄ−グル
コピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノ
シルー（１→４）−α−Ｄ−グルコビラノース（ｍが（
１，ｎが３の化合物） ＮＳ５；０−（４，６−ピスデスオキシー４−〔５，６
−シヒドロキシー２，３−エポキシ−４−（Ｏ−α−Ｄ
−グルコピラノシル−（１→４））−３−ヒドロキシメ
チルシクロヘキサン−１−イルアミノ〕−α−Ｄ−グル
コピラノシル）−（ｉ→４）−ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコビラノース（ｍが
ｌ、　　ｎが２の化合物） ＮＳ６；０−（４，６−ピスデスオキシー４−（２，３
−エポキシ−３−ヒドロキシメチル−４，５，６−トリ
ヒドロキシンクロヘキサン−１−イルアミノ）−α−Ｄ
−グルコピラノシル〕−（１→４）−〇−α−Ｄ−グル
コピラノシル＝（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノ
シルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコビラノンルー（
１→４）−α−Ｄ−グルコビラノース（ｍがＱ、ｎが４
の化合物）ＮＳ７；０−（４，６−ピスデスオキシー４
−〔５，６−シヒドロキシー２．３−エポキシ−４−（
０−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４　）　）−３
−ヒドロキシメチルシクロヘキサン−１−イルアミノ〕
−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−α−
Ｄ−グルコピラノシルーｃ１→４）−〇−α−Ｄ−グル
コピラノシルー（１→４）−α−Ｄ−グルコビラノース
（ｍがｌ、ｎが３の化合物） ＮＳ８；Ｏ−〔４，６−ピスデスオキシー４−（２，３
−エポキシ−３−ヒドロキシメチル−４，５，６−トリ
ヒドロキシンクロヘキサンー１−イルアミノ）−α−Ｄ
−グルコピラノシル〕−（ｌ→４）−〇−α−Ｄ−グル
コピラノシルー（１→４）−〇冒−グルコピラノシルー
（１→４）−０−α−Ｄ−グルコピラノンルー（１→４
）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−α−
Ｄ−グルコビラノース（ｍがＯ，ｎが５の化合物）ＮＳ
９；０−（４，６−ピスデスオキシー４−〔５，６−シ
ヒドロキシー２．３−エポキシ−４−（〇？■１ニ ーα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４））−３−ヒド
ロキンメチルシクロヘキサン−１−イルアミノ〕−α−
Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−〇−α−Ｄ−グ
ルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラ
ノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ〜グルコヒラノシル〜
（１→４）−α−Ｄ−グルコビラノース（ｍが１．ｎが
４の化合物）ＮＳＩＯ；ｍ＋ｎが６の化合物 Ｎ５ＩＩ；ｍ＋ｎが７の化合物 Ｎ５１２；ｍ＋ｎが８の化合物 Ｎ　Ｓ’ｌ　３　；　ｍ＋ｎが９の化合物Ｎ５１４；ｍ
＋ｎが１０の化合物 Ｎ５１５；ｍ＋ｎが１１の化合物 Ｎ５１６；ｍ＋ｎが１２の化合物 Ｎ５１７；ｍ＋ｎが１３の化合物 本発明誘導体〔■〕の具体的な製造法を以下に詳述する
。

ｉ）　本発明誘導体〔■〕を含有する粗粉末の製造法。

ストレプトマイセス・フラポクロモゲネス種に属する菌
株を培地に接種して２〜５日間種培養し。

ついで得られた培養物を生産用培地に移植して３〜８日
間本培養する。ストレプトマイセス・フラボクロモゲネ
ス種に属する代表的な菌株としては特公昭５１−１１，
１９７号公報に記載されているストレプトマイセス・フ
ラボクロモゲネスＮ［１２８０（微工研菌寄第９３４号
）があげられる。種培養及び本培養に使用する培地にお
いて、炭素源としてはブドウ糖、シヨ糖、乳糖、麦芽糖
、オートミール、澱粉、糖蜜もしくはグリセリン又はこ
れらの２種以上からなる混合物が、窒素源としてはアミ
ノ酸、コーンステイープリカー、肉エキス、小麦グルテ
ン、ペプトン、カゼイン加水分解物、酵母エキス、大豆
粉もしくは無機のアンモニウム塩もしくは硝酸塩又はこ
れらの２種以上からなる混合物が適当である。また必要
に応じてマグネシラ類を培地に添加してもよい。培養は
液体培養が適当であシ、培地の組成は上述の炭素源を０
．１〜１０，０％　（Ｗ／Ｖ）に、窒素源を０．１〜５
．０　（ｗ／ｖ）に設定するのが適当である。種培養及
び本培養ともに、培養開始時の培地のＰＨ値を６．５〜
８．５に調整し、２５〜４０Ｃの温度で好気的条件下に
実施する。培養方法は通気攪拌培養、往復振盪栢養又は
回転振盪培養が適当である。

上述の本培養で得られた培養物を遠心分離し。

上澄液を採取する。この遠心分離によシ菌体及び不要な
固形物を容易に除去できる。

ここで得られた上澄液を塩酸、硫酸スは硝酸等の鉱酸を
用いてｐＨ１，５〜３．０に調整し、これに活性炭を添
加して３０分〜２時間攪拌したのち減圧ν過又は加圧濾
過しｐ液を得る。添加する活性炭量は上澄液１ｚに対し
１〜１０７が適当である。

ここでの処理は吸着による不純物の除去及び脱色を目的
とするものである。

つぎに上述のＰ液を中和したのち、これに再度活性炭を
添加して攪拌する。１〜２４時間放置後活性炭を遠心分
離によＹ）Ｆ取する。中和は水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、炭酸ナトリウム又はアンモニア等の塩基を用
いて行う。活性炭量はν液１１！に対し２０〜５０ｙが
適当である。本発明誘導体ＣＩ）の大部分は活性炭に吸
着される。

ν取した活性炭を水洗し、ついで有機溶媒を１０〜６０
％の割合で含有する含水有機溶媒を用いて吸着した本発
明誘導体ＣＩ）を溶出する。有機溶媒としてはメタノー
ル、エタノール、インプロパツール、ノルマルプロパツ
ール又はアセトン等が適当である。なお２本明細書にお
いて、使用する含水有機溶媒の水と有機溶媒との混合比
率は、特に断わらない限シ含水有機溶媒の全容量に対す
る有機溶媒容量の百分率で表示す゛［る。

つぎに上述の工程で得られた溶出液をそのまま又は濃縮
したのち強酸性陽イオン交換樹脂に接触させる。接触方
法はパッチ法又はカラム法のいずれも採用できるがカラ
ム法が好適である。強酸性陽イオン交換樹脂としてはア
ンバーライトＩ　Ｒ，Ｑ１１８、同ＩＲ−１２０Ｂ、同
ＣＧ−１２０（以上ローム・アンド・ハース社製）又は
ダウエックス５０　Ｗ　−Ｘ　２　（’Ｆつ・ケミカル
社製）が適当である。ついで樹脂を水洗し、吸着した本
発明誘導体ＣＩ）を鉱酸、有機酸又は塩基等を、好適に
は鉱酸を含有する水溶液を用いて溶出し、溶出液を採取
する。鉱酸としては塩酸、硫酸又は硝酸等が。

有機酸としては酢酸等が、塩基としては水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム又はアンモニア水
等が適当である。。

得られた溶出液を中和し、脱塩したのち減圧乾固し、残
留物を凍結乾燥して粗粉末を得る。脱塩は活性炭を用い
た吸脱着処理によシ行う。このようにして得られた粗粉
末の比旋光度：〔α〕罫は＋１５０〜＋１７５°　（０
＝１．’０．水）であシ、また該粉末の総重量に対する
構成糖含量はフェノール硫酸法（生化学実験横座４糖質
の化学（下）３７０頁　１９７６年５月１０日東京化学
同人発行）では５８．３〜８１．６％（ｗ、’ｗ）であ
った。そのほか該粉末の糖質分解酵素２例えば細菌液化
型α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼに対する阻害活
性はそれぞれ４８〜４３８単位ｉｒｑ及び３１５〜４，
５００単位／巧であった。

ｉｉ）　　粗粉末からの本発明誘導体ＣＩ）の単離精製
法。

粗粉末からｍ−１−ｎが１〜５の化合物１例えばＮＳ１
〜９０単離精製は１強塩基性陰イオン交換樹脂カラム又
は逆相分配カラムを使用する高速液体クロマトグラフ法
によシ実施できる（以下液クロ法と略す）。強塩基性陰
イオン交換樹脂カラムとしては日立ゲル＃３０１１−Ｎ
（日立製作所■社製）を固定相とするカラムが、逆相分
配カラムとしてはマイクロボンダバックＣＨ（ウォータ
ーズ社製）が適当である。溶出溶媒としてはｐＨ７，０
のリン酸緩衝液１に対してアセトニトリル０，６〜２，
５（容量比）からなる混合液又は６５〜８０チ含水アセ
トニトリルが適当である。溶出液の分画は検出器の記録
紙上に抽出される各ピークの保持時間（以下Ｒｔ値と略
す）を指標として行うと有利である。

またＮＳＩ、２及び４については　粗粉末をゲルｐ過す
る方法（以下ゲル濾過法と略す）又は該粉末をアセチル
化処理したのちシリカゲルカラムクロマトグラフ法で分
離し、得られる各アセチル化物を脱アセチル化する方法
（以下アセチル化法と略す）によっても単離精製するこ
とができる。

ゲル濾過法で使用するゲルとしてはノ（イオゲルＰ−２
（バイオランド社製）が、溶出溶媒としては水が適当で
ある。アセチル化法において、粗粉末のアセチル化はピ
リジン中で無水酢酸又はアセチルクロライド等のアセチ
ル化剤を用いて行うのが適当である。シリカゲルに吸着
したアセチル化物の溶出は酢酸エチルエステルとベンゼ
ンとの混合液で、それらの混合比率を段階的に調整した
ものを順次使用して行う。具体的には、まずＮＳＩのア
セチル化物を酢酸エチルエステルとベンゼンとの混合比
率が１：３．Ｏ〜３．５（容量比；以下同様）の混合液
で溶出し、ついでＮＳ２のアセチル化物を混合比率がｌ
：２．０〜２．２の混□合液で、ＮＳ４のアセチル化物
を１：１．５〜１．８の混合液でそれぞれ順次溶出する
。分離溶出したアセチル化物の脱アセチル化はアンモニ
アを飽和させたメタノール又はエタノール等を用いて行
う。脱アセチル化して得られる各化合物はそれぞれ別個
に強酸性陽イオン交換樹脂を使用するカラムクロマトグ
ラフ法で精製する。

そのほか、ＮＳＩ及び２につ：いては、活性炭カラムク
ロマトグラフ法によっても粗粉末から有利に単離精製す
ることができる（以下活性炭法と略す）。活性炭に吸着
したＮＳＩ及び２の溶出は。

含水ノルマルブタノールを用い、その混合比率が３％を
上限とす名直線濃度勾配溶出法（ＬｉｎｅａｒＧｒａｄ
ｉｅｎｔ　ＥｌｕｔｉＯｎ　Ｍｅｔｈｏｄ）によシ実施
する。

なお上述の液クロ法、ゲル濾過法、アセチル化法及び活
性炭法において、粗粉末を予め０５〜１．５規定希塩酸
又は１．０〜４．０規定のトリフルオロ酢酸水溶液で処
理し、粗粉末中のｍ＋ｎが６〜１３の化合物をｍ−１−
ｎが１〜５の化合物及びグルコース又はマルトース等の
中性糖に加水分解し、ついでこれを強酸性陽イオン交換
樹脂に吸脱着させて精製し精製粉末としたのち、それら
の方法を実施すると目的化合物の単離精製は更に有利に
進行する。

つぎに、ｍ＋ｎが６〜１３の化合物、即ちＮ５ｌＯ〜１
７の単離精製は、粗粉末を活性炭に吸着させ該活性炭を
５〜２０％含水エタノールで十分洗浄したのち、吸着物
質を３５〜５５％含水インプロパツール又は４０〜６０
％含水エタノールで溶出し、ついで溶出された物質を逆
相分配カラムを使用する高速液体クロマトグラフ法で処
理することによシ実施することができる。活性炭を５〜
２０チ含水エタノールで洗浄することによ９１次工程の
高速液体クロマトグラフ法での処理において不都合な物
質１例えばｍ−１−ｎが１〜５の化合物及び若干の夾雑
物を除去することができ、目的物の単離精製が有利に達
成できる。高速液体クロマトグラフ法で使用する逆相分
配カラムとしてはマイクロボンダバックＣＨカラムが、
また溶出溶媒としては５５〜７０チ含水アセトニトリル
が適当である。゛逆相分配カラムからの溶出液の分画は
各目的化合物のＲｔ値を指標として行う。

上述の製造法によシ得られた各化合物の理化学的性質は
第１表に示す通りであった。各化合物の分子量、Ｒｔ値
及び糖−質分解酵素阻害活性の測定並びに各化合物の構
造確認試験は以下のようにして行った。

ｊ）　分子量の測定法 各化合物の分子量は以下のｆａｌ〜（Ｃ１に示す方法の
いずれか又は２種以上を組合わせ、得られた結果を総合
的に判断して決定した。

ｔａ＋　　質量スペクトル法 被検化合物又はそのメチル化物のＦＤ又はＥＩマススペ
クトルを測定し、検出した分子イオンビークから分子量
を算出した。被検化合物のメチル化物は箱守法（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５５巻２
０５頁　１９６７年）を用いて調製した。

ｆｂｌ　　重合度法 原田らの方法ＣＢｉｏｃｈｊｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓｉｃａ　Ａｃ−ｔａ　２３７巻４２２頁　１９７
１年）によシ被検化合物の重合度（Ａｖｅｒａｇｅ　Ｄ
ｅｇｒｅｅ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａ−ｔｉｏｎ　
）を測定し１重合度から分子量を求めた。

ｆｃｌ　　ガスクロマトグラフ分析法 被検化合物５．０　ｍｌを正確に秤量し、これに２規定
希塩酸２　ｍｌを添加して１．０〜３．０時間加熱還流
し、被検化合物をＮＳＯとグルコースに力日水分解する
。加水分解後の反応液を水で希釈してｐＨ１，５に調整
し、これをダウエックス５０Ｗ−Ｘ２（Ｈ”型）のカラ
ム（直径０．６　ｘ　８　ｃｍ　）に通し、ＮＳＯは固
定相に吸着させグルコースはそのまま流出させる。グル
コースの流出は水１００ｍ／を用いて行う。

固定相に吸着したＮ　Ｓ　’Ｏは３規定アンモニア水溶
液で完全に溶出する。得られる溶出液中のＮＳＯのモル
数はガスクロマトグラフ法で定量する。定量は絶対検量
線法で行う。一方、流出液中のグルコースのモル数も同
様にガスクロマトグラフ法で定量する。グルコースの定
量値は、予め被検化合物に相応するマルトオリゴ糖を上
述の加水分解条件及びカラム条件で処理した場合におけ
る生成グルコースの損失率を同条件のガスクロマトグラ
フ法で測定し、その損失率を基に修正を行う。ガスクロ
マトグラフ法での条件は以下のように設定する。

試薬：Ｊ″ＭＳ−Ｐ　７．　（東京化成工業■社製、ト
リメチルシリル化剤） カラム：３％Ｓ　Ｆ　−３０，り０モソルブＷ　−ＨＰ
（６０／８０　）　（直径３．０Ｘ１０００削、ガスク
ロ工業■社製） カラム温度：１３０〜２３０ｔｌ’（ＩＯＣ／分の昇温
法による。） 注入剤温度：２６０ｔ：’ キャリヤーガス：ヘリウム 流速：４０ｍ１１分 上述のようにして得られたＮＳＯ及びグルコースのモル
数からそれらのモル比を算出し、このモル比から被検化
合物の分子量を求めた。なおここで得られたモル比は被
検化合物の構造確認のためのデータｊの一部として使用
した。

！り　　ａｔ値測測定 法（１値は高速液体クロマトグラフ法により以下の条件
Ａ又はＢのうち少なくとも一方を採用して測定した。高
速液体クロマトグラフとしては日＼ｒ６３８−５０型（
日立製作所■社製）を、検出器としては５ｈｏｄｅｘ　
　ＲＩ　Ｓ　Ｅ　−１１型高感度示差屈折計（昭和電工
■社製）を用いた。なお、後述の製造例において単離精
製手段として高速液体クロマトグラフ法を採用した際の
機器もこれらと同一のものを採用した。

＋ａ＋　　条件Ａ カラム：日立＃３０１１−Ｎ（直径２．６Ｘ５００聴） カラム温度＝５０Ｃ 溶出溶媒ニアセトニ）　ＩＪシル−，０２モルリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）混合液（容量比３：２）流速：　１
＜ｍｌ１分 子ｂｌ　　条件■３ カラム二マイクロボンダパツクＯＴｌ　（ｉ径３．９　
Ｘ３００酎） カラム温度、２０Ｃ 溶出溶媒：６５係含水アセトニトリル 流速：２．０ｍ１１分 ｉｉｉ　）　　構造確認試験法 （ａｌＮ３１〜９の構造確認法 メチル化分析法（化学の領域増刊１３２号２９Ｌ１１９
８１年）に従って、被検化合物を１．２．３゜５．６−
ベンターＯ−メチルー４−モノ−０−アセチルグルシト
ール、２，３，４．６−テトラ−０−メチル−１，５−
ジー○−アセチルグルシトールもしくは　２，３．６−
）　　　リ　　−０−メ　チ　ル　−１，４，５−ト　
　リ　−〇−アセチルグルシトール又はこれらの混合物
に変換し、それらを定量することにより構造確認を行っ
た。

（ｂｌ　　Ｎ５１ｏ〜１７の構造確認法被検化合物３０
ｍ１を４０ミリモル酢酸緩衝液（ｐＨ４，９）　１　ｍ
ｌに溶解し、これに同種緩衝液＆２ｍｅに１０’ａ、Ｐ
のβ−アミラーゼ（／グツ社製）を溶解した溶液を添加
し、３７Ｃで６時間反応させる。反応後湯浴上で５分間
煮沸しβ−アミラーゼを失活させ、ついで反応液を遠心
分離して上澄液を採取する。この上澄液に希塩酸を加え
ｐＨ１，５に調整し。

これをダウエックス５０Ｗ−Ｘ２のカラム（直径１．０
Ｘ１５Ｃｒｎ）に通す。カラムの固定相を十分に水洗し
たのち該固定相に吸着した塩基性物質を２規定アンモニ
ア水溶液で溶出する。得られる溶出液を活性炭処理によ
シ脱塩し、ついで減圧乾固して残留物を得る。この残留
物を２　ｍｌの６５％含水アセトニトリルに溶解し、こ
れを上述のＲｔ値測定法条件Ｂで分析し、β−アミラー
ゼによって分解生成された各塩基性物質のＲｔ値及びそ
れらの物質の相対的重量比を測定及び定量する。このＲ
ｔ値及び相対的重量比から被検化合物の構造確認を行っ
た。

ｉＶ）　　糖質分解酵素阻害活、性１測定法ｔａｒ　　
α−アミラーゼ阻害活性の測定法可溶性澱粉を０．４％
（Ｗ／Ｖ　）含有する０、　２モル酢酸緩衝液（ｐＨ５
，５）２ｍｌ！に、水又は被検化合物の水溶液１　ｍｌ
を加え３７ｔｌ’で１５分間放置した後。

細菌液化型α−アミラーゼ（結晶標品、シグマ社製）を
０．０００４　％　（Ｗ／Ｖ）含望奢２　（：　ル酢酸
緩衝Ｈ（ｐＨ５，５）　１ｍｌを加え、３７Ｃで７．５
分間反応させる。ついで１規定希塩酸５　ｍｌを加え室
温で１０分間放置する。この反応液よＦ）　ｉ　ｍｌを
取出し、０゜０００５規定ヨウ素水溶液１０ｍ１を加え
、６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。被検化合物を
含まない反応系において９反応初期の１分間に可溶性澱
分のヨウ素による発色を１０％減少させる酵素量を１単
位として表わし、１単位のα−アミラーゼ活性を５０チ
阻害する被検化合物の活性を０．５単位（単位は以下Ａ
ＩＵと略す）と定義した。

（ｂｌ　　グルコアミラーゼ阻害活性の測定法グルコア
ミラーゼ（リゾープス・ニベウス由来の結晶標品、生化
学工業■社製）をｏ、　ｏ　ｏ　ｉ％（Ｗ／Ｖ　）含有
する０、２モル酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）　０．４ｍｌ
に水又は被検化合物の水溶液Ｑ、　ｌ　ｍｌを加え、４
０Ｃで１０分間反応させた後、可溶性澱粉２５チ（ｗ／
ｖ）　ｔ　含有ｆ　ル０．２規定酢酸緩衝液（ｐＨ５，
０）０、５ｍｌを加え、４０ｔｌ’で１５分間反応させ
る。ついでこれに３．５−ジニトロサリチル酸試薬（Ｗ
。

１（ｉｃｋ　＆　Ｈ，Ｐ、Ｓｅｇｂａｕｅｒ、　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎ−ａｌｙｓ
ｉｓ　８８５頁　１９７５年　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍ
ｉｅ。

Ｗｅｉｎｈｅｉｍ　＆　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　Ｌｏｎｄｏｎ　）ｌ　ｍｌを加
えて反応を停止する。該反応液を１０分間沸騰湯浴上で
加熱した後、冷却し、ＩＱｍｅの水を加えて５４０　ｎ
ｍで吸光度を測定する。阻害物質を含まない反応におい
て、１分間にｏ、　ｉ　ｒｎｆｊのグルコースを遊離す
る酵素量を１単位として表わし。

１単位のグルコアミラーゼ活性を５０％阻害する被検化
合物の活性を０．５単位（単位は以下ＯＩＵと略す）と
定義した。

なお１本発明誘導体〔■〕を含有する粗粉末の糖質分解
酵素阻害活性の測定もここで述べた方法で行った。

−８３’ｔ つぎに本発明誘導体（Ｉ）の糖質分解酵素阻害活性に基
づく薬理効果をＮｓ２の試験例をもって示す。

１）　血糖低下作用 ２４時間絶食させたウィスター系ラット１２匹を用いて
澱粉投与後のラットの血糖上昇に対するＮＳ２の抑制作
用を試験した。ラットを６匹ずつ２群に分け、一方には
澱粉２９７ｋｇを、他方には澱粉２９／に９とＮ　Ｓ　
２５　ｏｍｔ／＃ｔを経口投与し。

２時間経過後に採血して血液中のグルコース量をオルト
トルイジンホウ酸洗（臨床病理１２巻４３４頁　１９６
４年）によシ測定した。結果は第２表に示す通９であっ
た。

第　　２　　表 ｉｉ）　　脂質低下作用 ２４時間絶食させたウィスター系ラット１２匹を用いて
ＮＳ２の脂質低下作用を試験した。ラットを６匹ずつ２
群に分け、一方にはトライトンＷＲ−１３３９（シグマ
社製）ｎｏｏｒｒ＃ｇ／に９を皮下投与し、他方にはト
ライトンｗＲ−１３３９４００曙／　ｉｃ９を皮下投与
したのち１時間後にＮＳ２　１０ｍｙ　／　ｋｇを経口
投与し、ついで２４時間経過後に同量のＮＳ２を再度経
口投与した。トライトンＷＲ−１３３９投与後３６時間
経過したのちに採血し。

血液中の総コレステロール量をザック・ヘンＩＪ　−法
（Ｚａｋ−Ｈｅｎ１７法；　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１ｆ’ｎ１＝ｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌ
ｏｇｙ　　２７巻５８３頁　１９５７年）に準じた方法
で測定した。結果は第３表に示す通りであった。

（以下余白） 第　　３　　表 以上の試験例から明らかなように９本発明誘導体ＣＩ）
は糖尿病、高脂血症又は肥満等の治療薬又は予防薬とし
て有用な化合物である。

本発明を製造例及び参考例をもって更に説明する。

製造例　１ １）　粗粉末の製造 オートミール３．０％（ｗ／／Ｖ）、ヘプトン１．０％
（Ｗ／Ｖ　）及び塩化ナトリウム０５％（Ｗ／’Ｖ）を
含有するＰＨ７，４に調整された無菌の液体培地にスト
レプトマイセス・フラボクロモゲネスｌ’４２８０菌を
接種し、約３０Ｃで２日間回転振盪培養し種培養物１゜
６３０ｍ／を得た。この種培養物を予め無菌処理された
上述の液体培地と同様な組成を有する生産用培地１５０
１に移植し、３００Ｊ容量のジャーファーメンタ−を用
いて約３００で６日間本培養した。本培養開始時のＰＨ
は７．４９通気量は１５０１／分１回転速度は２５　Ｏ
ｒ、　ｐ、　ｍ、で行った。

つぎに２本培養して得られた培養物を遠心分離し、上澄
液１３３１を得た。この上澄液を１２規定希硫酸を用−
てｐ８２．５に調整し、これに６７０２の活性炭を添加
して１時間攪拌したのち加圧ν過し、Ｐ液１３１１を得
た。

このＰ液を１０規定水酸化ナトリウム水溶液で中和し、
これに４．６０　Ｏｆの活性炭を添加して攪拌し、１２
時間放置した。放置後活性炭を遠心分離により戸数した
。

戸数した活性炭を水洗し、ついで吸着物質を５０チ含水
イソプロパツールで溶出し、溶出液１０４１を採取した
。この溶出液をダウエックス５０Ｗ−Ｘ２（Ｈ＋型）の
カラム（直径８．０×１００ｃｒｎ）に通し、固定相を
十分水洗いしたのち吸着した物質を２規定希塩酸で溶出
し、溶出液２１１！を採取した。

この溶出液を１０規定水酸化ナトリウム水溶液を用いて
中和し、活性炭処理して脱塩したのち減圧乾固し、つい
で凍結乾燥して本発明化合物〔Ｉ〕を含有する淡黄色の
粗粉末１４８２を得た。粗粉末の理化学的性質は以下の
通シであった。

比旋光度；〔α〕郭＝＋１６３°（０＝１．０．水）総
重量に対する構成糖含量ｉ７２．６％糖質分解酵素阻害
活性ｉ　３０９Ａ　Ｉ　Ｕ／ｒ１９１．４１２　Ｇ　Ｉ
　Ｕ／ｍ１ ｉｉ）ＮＳＩ〜９の単離精製（液クロ法）上述の粗粉末
２００２を１規定希塩酸２００ｍ１に溶解し、約１２８
Ｃで１０．分、間攪拌し加水分解を行った。得られた反
応液を水で希釈し、ＰＨ１，５に調整し、これをダウエ
ックス５０　ｗ　−ｘ　２　（Ｈ＋型）のカラム（直径
４．０Ｘ２５Ｃｒｎ）に通したのち十分に水洗いした。

カラムの固定相に吸着し次物質を１規定アンモニア水溶
液で溶出し、これを減圧乾固したところ精製粉末７．２
２を得た。この精製粉末を約２００　ｍｌの水に溶解し
、これを活性炭カラム（直径６．０ｘ５０ｃ１ｎ）に通
した。固定相を５％含水エタノールで洗浄し、ついで固
定相に吸着した物質を４０％含水エタノールで溶出した
。

得られた溶出液を減圧乾固し、白色粉末３．８２を得た
。この粉末を７０％含水アセトニトリル５５ｍ１　Ｋ　
ｍ解し、これをマイクロボンダバックｃＨカラム（直径
３．９Ｘ３００ｇ）を使用する高速液体クロマトグラフ
法（流速２、Ｑ　ｍｌ　／分、溶出溶媒７０％　含水７
セトニトリル）によ、ｊ）　Ｒｔ値を指標として分画し
た。指標としたＲｔ値はそれぞれ４．８分、５．９分、
６．９分、７．７分、８９分、９９分、１１．２分。

１２．２分及び１４５分であった。得られた各分画液を
各々約５　ｍｌ容量になるまで減圧濃縮し、ついで遠心
分離して上澄液を採取した。この各上澄液を減圧乾固し
、得られた残留物をそれぞれ一昼夜真空乾燥したところ
、　　４５０ｒｒｕＪｅ−Ｎ　Ｓ　１．　２７５ｍｇの
ＮＳ２，１４０ｍＰのＮＳ３，３６０ｗＪのＮＳ４．２
１６■のＮ８５，２０４曙のＮ８６，１２８ｍｇのＮ８
７，１５０−ｍＩのＮＳ８及び６６ｍＰのＮＳ９をそれ
ぞれ白色粉末として得た。

製造例　２ 製造例１の１）の工程で得られた粗粉末７００ｍ１を２
規定トリフルオロ酢酸水溶液７　ｍｌに溶解し。

約１２０Ｃで２０分間攪拌下に加水分解した。得られた
反応液を水で希釈しｐＨ１，７に調整した。この調整液
をダウエックス５０Ｗ−Ｘ２（Ｈ＋型）のカラム（直径
２０×１０ｃｍ）に通し、固定相を十分水で洗浄したの
ち、該固定相に吸着した物質を１規定アンモニア水溶液
で溶出した。得られた溶出液を減圧乾固したところ精製
粉末３６０曙を得た。この精製粉末を２ｍｌの水に溶解
し、これを・くィオゲルＰ−２（４００メツシユ）のカ
ラム（直径１．６ｘｉ００ｍ）を用いてゲル濾過を行っ
た。

溶出溶媒は水を使用し、流速は２．０　ｍｌ　／時、カ
ラム温度は５５Ｃになるように設定した。ついで前述の
Ｒｔ値測定法条件Ｂで測定したＲｔ値がそれぞれ３，３
分、３．９分及び４．６分であった分画液を採集した。

採集した各分画液を減圧乾固し、−昼夜真空下で乾燥し
たところ４０■のＮＳＩ、１９■のＮＳ２及び１０ツの
ＮＳ４をそれぞれ白色粉末として得た。

製造例　３ ＮＳＩ、２及び４の単離精製（アセチル化法）製造例１
のｉ）の工程で得られた粗粉末２．０２を２規定のトリ
フルオロ酢酸水溶液４０ｍ１中で２時間、約９５０に加
熱して加水分解した。得られた反応液を水でＰＨ１，１
まで希釈し、これをアンバーライトＩＲ−１１８のカラ
ム（直径２．　ＯＸ　２０ｃｒｎ）に付し、十分水洗後
、固定相に吸着した物質を１規定のアンモニア水溶液で
溶出した。この溶出液を減圧乾固したところ精製粉末０
，８ｔを得た。

との粉末を４９ｍ１の無水酢酸−ビリジン混合液（容量
比１：１）に溶解し、室温で一昼夜放置してアセチル化
した。この反応液に氷水４　’ＯＯｍｌを注入し３０分
間攪拌したのち、これにクロロホルム１５（ｌｌを添加
した。ついでクロロホルム層を分取し、該層を水３　Ｃ
）Ｏｍｌ、　　０．０５規定希塩酸３００ｍ１及び水３
ＱＱｍｌで順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した
。このようにして得られたクロロホルム溶液を減圧乾固
したところ、精製粉末のアセチル化物１．４２を得た。

このアセチル化物をベンゼンＩＱｍｌに溶解し、これを
固定相として１００７のシリカゲル（２３０〜４００メ
ツシユ）を用いたカラムに通した。固定相に吸着した物
質を酢酸エチルエステル−ベンゼン混合液（容量比１：
３０）で溶出し、得られ念溶出液を減圧乾固したところ
ＮＳＩのアセチル化物３　’１０　ＩＱを得た。ついで
同様にして該固定相に残存する吸着物質を順次、混合溶
量比を１：２．０及び１：１．８に調製した酢酸エチル
エステル−ベンゼン混合液で溶出し。

ＮＳ２及び４のアセチル化物をそれぞれ１１３〜及び７
３ｍ１得た。各化合物のアセチル化物をそれぞれ過剰量
のアンモニア飽和メタノール溶液中で。

室温下１２時間攪拌することによシ脱アセチル化した。

この反応液を減圧乾固し、得られた各残留物を０．０５
規定希塩酸３　ｍｌにそれぞれ溶解した。

得られた各溶液を別個にダウエックス５０Ｗ−Ｘ２（Ｈ
＋型）のカラム（直径２０×２０ｃｒｎ）に通し。

固定相を十分に水洗したのち吸着物質を１規定アンモニ
ア水溶液で溶出した。各溶出液を減圧乾固し、真空下で
一昼夜乾燥したところ、１６５”ＰのＮＳＩ、６０ツの
ＮＳ２及び３８曙のＮＳ４をそれぞれ白色粉末として得
た。

製造例　４ 製造例１の１）の工程で得られた粗粉末１００７を２規
定のトリフルオロ酢酸水溶液５００ｍ６に溶解し、攪拌
下に２．５時間約９５Ｃに加熱して加水分解した。得ら
れた反応液を水でＰＨ２，０になるよう希釈し、これを
アンバーライトＩＲ−１１８０カラム（直径４．０×２
５Ｃｒｎ）に通し、固定相を十分に水洗したのち吸着物
質を１規定アンモニア水溶液で溶出した。この溶出液を
減圧乾固し、得られた精製粉末を水２００ｍ１に溶解し
、ついでこれを活性炭カラム（直径４５×４５ｃｒｎ）
に通した。

このカラム固定相に吸着した物質を、混合比率３チを上
限とする含水ノルマルフリノールで直線濃度勾配溶出法
により溶出した。ついで前述のＲｔ値測定法条件Ｂでの
Ｒｔ値が３．３分及び３９分を示した分画液−を各々採
集した。採集した両分両液を別個に減圧乾固し、真空下
に一昼夜乾燥したところ、５１０ｍ！ｊのＮＳＩ及び３
２０■の１ｊＳ２の白色粉末を得た。

製造例　５ 製造例１のｉ）の工程で得られた粗粉末５０２を水７Ｑ
ｍｌに溶解し、これを活性炭カラム（直径４、ｏｘ６ｏ
Ｃｒｎ）に通した。固定相を゛１０チ含水エタノールで
士４分に洗浄し、該層に吸着した物質を５０％含水イソ
グロパノールで浴出し、これを減圧乾固したところ白色
粉末４．１２を得た。この粉末を６５％含水アセトニト
リル８２ｍ１に溶解し。

これをマイクロボンダパックＯＨカラム（直径３．９Ｘ
３００＋１１１１１）を使用する高速液体クロマ、トゲ
ラフ法（流速２．０　ｍｌ　／分、溶出溶媒６５係含水
アセトニトリル）によｐ　Ｒｔ値を指標として分画した
。

指標としたＲｔ値はそれぞれ７．５〜８．８分、９．２
〜１０６分、１０．９〜１２．６分、１３．０〜１５．
１分、１５．７〜１８．０分、１８．６〜２１．３分、
２１．７〜２５．５分及び２６．２〜３０６分であった
。得られた各分画液を各々約５　ｍｌ容量になるまで濃
縮し。

ついで遠心分離して各上澄液を採取した。この各上澄液
を減圧乾固し、真空下に一昼夜乾燥したところ。

２４５哩のＮ５Ｉ０，２７１■のＮ　Ｓ　１１．２８２
ｆｆのＮ５１２，３１（１，ＦのＮ５１３，１７４ｍ、
ＰのＮ８１４．６９ｍ、ＶのＮ５１５．４２ｍＰのＮＳ
Ｉ　６及び２１曙のＮ５１７をそれぞれ白色粉末として
得た。

参考例 Ｎ　Ｓ○の製造 製造例１の１）の工程で得られた粗粉末５．０２を２．
５規定希塩酸３５ｍ１φ中で１．５時間加熱還流し加水
分解した。この反応液を水で希釈しＰＨ１，５に調整し
、これをダウエックス５０　Ｗ　−Ｘ　２　（Ｈ”型）
のカラム（直径３．０Ｘ３０（７Ｆ＋）に通した。カラ
ムの固定相を十分に水洗したの、ち吸着した物質を、、
・　′：・ ３規定アンモニア水溶液で溶出した。この溶出液を減圧
乾固し、得られた残留物を水５０ｍ１に溶解した。この
溶液をダウエックス１−Ｘ２（ＯＨ−型；ダウ・ケミカ
ル社製）のカラム（直径３．０Ｘ２０ｃｒｎ）に通し、
流出液を採取した。カラムの固定相を水８００ｍ１で洗
浄し、洗浄液と該流出液とを一つにまとめて減圧乾固し
、白色粉末０．６？を得た。

、この粉末を４Ｑｍｌの無水酢酸−ピリジン混合液（容
量比１，１）に浴解し、室温で１２時間攪拌した。この
反応液を氷水４００　ｍｌに注入し３０分間攪拌したの
ちこれにクロロホルム１５０ｍ１を添加した。ついでク
ロロホルム層を分取し、該層を水９００ｍｌ、　　０．
０５規定希塩酸９ｏｏｍｌ及び水９００ｍ１で順次洗浄
したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。得られたク
ロロホルム溶液を減圧乾固したところ残留物１，１２を
得た。この残留物をトルエン１０ｍ１Ｋ溶解し、これを
固定相として１２０２の７す力ゲル（７０〜２３０メツ
／コ）を用いたカラムに通し、固定相に吸着した物質を
トルエン−酢酸エチルエステル混合液（容量比２：１）
で溶出した。得られた溶出液を減圧乾固し、ＮＳＯのヘ
キサアセテート４９０Ｔｎ：ｉを得た。この化合物を過
剰量のアンモニア飽和メタノール溶液に溶解し、３０分
間攪拌することにより脱アセチル化した。この反応液を
減圧乾固し、得られた残留物を００５規定希塩酸１０ｍ
１に溶解し、これをダウエックス５０Ｗ−Ｘ２（Ｈ＋型
）のカラム（直径２０×２０ｃｍ）に通し、固定相を十
分水洗したのち吸着物質を１規定アンモニア水溶液で溶
出した。この溶出液を減圧乾固し、真空下で一昼夜乾燥
したところ２５０ｍ１のＮＳＯを白色粉末として得た。

元素分析（Ｃ□３■ち□ＮＯ８として）：理論値部）　
　ｃ、　　４８．９０　　Ｈ，６，６３Ｎ、　　４．３
９実測値（彌　　　４８．８８　　　６，７８　　　４
．３８分子量；３１９ Ｅエマススベクトル ｍ／２　　３１９　　Ｍ” Ｆ　Ｄマススペクトル ｍ／ｚ　　３２０　　（Ｍ　＋　１．（）”Ｒｔ値（Ｒ
ｔ値測定法条件Ｂ）、２．６公比旋光度：〔α〕罫−十
６２°（Ｃ＝０．５．水）紫外線吸収スペクトル（水溶
液）； 末端吸収を示す。

赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠、ν　　ｃｒｎ−’　
）　ｉａＸ ３４００、　２９３０．　１０８０ 溶剤に対する溶解性 水、メタノールに易溶、エタノール、ジメチルスルホキ
ンドに可！、ベンゼン、ノルマルヘキサンに不溶 塩基性、酸性、中性の区別 塩基性 ＮＳＯのヘキサアセテートの融点： ２０４５〜２０６Ｃ Ｎ　Ｓ　Ｏのヘキサアセテートの核磁気共鳴スペクト　
ル　（２００λ４Ｈｚ、　　　ＣＤＣｌ３．　　　ｐｐ
ｍ　　）　　　；１．３９　３Ｈ，ａ　　、ｒ＝６．３
４２０３〜２．１０　１８Ｈ ３．３３　　ＬＨ，ａ、ａ　　Ｊ、＝８．３０．Ｊ２＝
４．６４３．５０　　１Ｈ，ｄ　　Ｊ＝２．４４３．７
４　１Ｈ，ｄ、ｄ　　Ｊ、＝８．０５．Ｊ２＝２．４４
３．８４　１Ｈ，ｄ　　Ｊ＝１１．９６４．３３　１Ｈ
，ｄ、　　ｄ　　Ｊ□＝８．０５．　　Ｊ２＝７，３２
４．４３　１Ｈ，ｄ　　Ｊ＝１１．９６４．９４　１Ｈ
，ｄ、　　ｄ　　Ｊ、＝６．３４．　　Ｊ２＝４．６４
５．０２　　ＬＨ，ｄ　　Ｊ＝３．９１５．３０　１Ｈ
，ｄ、　　ｄ　　Ｊ、＝６．８４．　　Ｊ２＝３．９１
５．３２　１）（、ｄ、ｄ　　Ｊ、＝９．７７、Ｊ２＝
７．３２５．５７　１Ｈ，ｄ、ｄ　　Ｊ、＝８．３０．
Ｊ２＝６．８４出願人　東京田辺製薬株式会社 代理人　久高将信（外−名） 手　続　補　正　書（方式） 昭オロ５７年８月２６日 特許庁長官　若　杉　和　夫　　　殿 １、事件の表示 特　願　　昭、７−　５５，４８７号 ２発明の名称 新規なアミノオリゴ糖誘導体 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 東京田辺製薬株式会社 ４代理人 ６、補正の対象　願書及び明細書全文 ７、補正の内容　別紙のように願書及び明細書の浄書（
内容に変更なし）を提出します。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （式中ｍは０−１２の整数を、ｎは１〜１３の整数を表
   わし、且つｍ−）ｎが１〜１３の整数である仁とを表わ
   す。）で示されるアミノオリゴ糖誘導体。