JPS6318960B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 組換えDNA法による蛋白質の製造、殊にこの
種の方法によるインスリンＡ鎖およびインスリン
Ｂ鎖の製造が可能となり〔Goeddel et al，Proc.
Nat′l.Acad.Sci.USA，76，106−110（1979）〕、Ａ
およびＢ鎖を結合させてインスリンを製造する効
率のよい方法の必要性が極めて大きくなつてきて
いる。 ＡおよびＢ鎖を結合してインスリンを製造する
代表的な先行技術方法は、原料として安定なＳ−
スルホネートの形態のＡ鎖およびＢ鎖を用いてい
る。一般に、ＡおよびＢ鎖のＳ−スルホネート体
は、別々にあるいは一緒にして、対応する−SH
化合物に、通常大過剰のチオール還元剤を用い
て、還元される。生成物は還元反応媒質から単離
されて、別々に還元したときはこれらを一緒にし
て、酸化媒体、例えば空気と接触させて、Ａおよ
びＢ鎖を結合し、インスリンを生成させる。この
方法の例としては、Du et al，Scientia Sinica，
10，84−104（1961）；Wilson et al，Biochim.
Biophys.Acta，62，483−489（1962）；Du et al，
Scientia Sinica，14，229−236（1965）；Kung
et al，Scientia Sinica，15，544−561（1966）；
Kexue Tongbao（Republic of China），17，241
〜277（1966）；およびMarkussen，J.Acta
Paediatrica Scandinavica，Suppl.，270，121−
126（1977）に記載されたものがある。 この方法の改良法として、Ａ鎖Ｓ−スルホネー
トを還元し、次いで還元されたＡ鎖をＢ鎖Ｓ−ス
ルホネートと酸化的雰囲気中で反応させるものが
ある。例えば、Katsoyannis et al，Proc.Nat.
Acad.Sci.（USA），55，1554−1561（1966），
Katsoyannis，Science，154，1509−1514
（1966）；Katsoyannis et al，Biochemistry，
６，2642−2655（1967）；U.S.Patent No.3420810
およびJentsch，Journal of Chromatography，
76，167−174（1973）参照。 もうひとつの改良法として、Ａ鎖の−SH化合
物を部分酸化してＡ−６およびＡ−11のシステイ
ン残基間にジスルフイドを形成させ、次いでこの
化合物をＢ鎖の−SH化合物またはＢ鎖のＳ−ス
ルホネートと共に酸化する方法がある。例えば、
Belgian Patent No.676069およびZahn et al，
Liebigs Ann.Chem.，691，225−231（1966）参
照。 上記先行技術の方法のそれぞれにおいて、ひと
つの共通点がある。それは、二つの独立した、序
列のある工程、すなわちＳ−スルホネートの−
SHへの環元と、それに続く−Ｓ−Ｓ−への酸化
によつてインスリンを製造していることである。 Dixon et al，Nature，188，721−724（1960）
には、チオール還元剤と空気酸化を用いて、Ａお
よびＢ鎖Ｓ−スルホネートを単一溶液中でインス
リンに変換することが示唆されている。その記載
は極めて不完全で、収率は、回収された生成物の
活性にだけ基いていて、しかも１−２％である。
しかし、Dixonは、Proc.Intern.Congr.
Endecrinol.2nd London1964，1207−1215（1965）
において若干説明を加え、特に1211頁の表で、
先の刊行物に報告した反応は環元と酸化を別個の
工程で実施したことを明らかにしている。 上記の先行技術方法とは異り、還元反応と酸化
反応の両方を単一工程、単一溶液で行つてＳ−ス
ルホネート化されたＡおよびＢ鎖からインスリン
またはインスリン類似体を、魅力ある収率で得る
ことが特定の反応条件下において可能であること
が見出された。本発明はかかる方法に関するもの
である。 すなわち、本発明はインスリンまたはインスリ
ン類似体のＡ鎖とインスリンまたはインスリン類
似体のＢ鎖とを結合してインスリンまたはインス
リン類似体を製造する方法に関し、その要旨は、
Ａ鎖のＳ−スルホネート体、Ｂ鎖のＳ−スルホネ
ート体およびチオール還元剤を水性媒質中に、(1)
PHが約８乃至約１２となり、(2)全蛋白質濃度が約
0.1乃至約50mg／mlとなりかつ(3)Ａ鎖およびＢ鎖
のＳ−スルホネート体に存在するすべての−
SSO^- ₃基のそれぞれに対し約0.4乃至約2.5個の−
SH基を提供し得る量のチオール還元剤が存在す
る条件で混合し、この混合物を酸素源が備えられ
ている雰囲気中、約０℃乃至約25℃の温度に保持
してインスリンまたはインスリン類似体を生成さ
せる点にある。 本発明は、対応するＳ−スルホネート化された
ＡおよびＢ鎖からインスリンまたはインスリン類
似体を製造する効果的な一段階単一溶液製法に関
する。 ここで“インスリン”とは、言うまでもなくヒ
ト、ウシ、ブタ、ヒツジ、魚、トリなどの天然イ
ンスリンおよびある種のＡ鎖と他の種のＢ鎖を結
合した混成型インスリンを意味する。 また、“インスリン類似体”とは、天然インス
リンと同じ配列で半シスチン残基を有するＡおよ
びＢの基本鎖からなる広範な蛋白質を意味する。
これらの類似体は、１個以上のアミノ酸残基が置
換され、付加され、省略されまたは修飾されてい
る点で天然インスリンと異るが、ジスルフイド結
合の並び方とインスリン様活性の少くとも一部を
保持しているものである。このような“インスリ
ン類似体”の例としては、〔Ｎ−フオルミル−
Gly¹−Ａ〕インスリン、デスアミノ−A¹−イン
スリン、〔サルコシン¹−Ａ〕インスリン、〔Ｌ−
アラニン¹−Ａ〕インスリン、〔Ｄ−アラニン¹−
Ａ〕インスリン、〔イソアスパラギン²¹−Ａ〕イ
ンスリン、〔Ｄ−アスパラギン²¹−Ａ〕インスリ
ン、〔アルギニン²¹−Ａ〕インスリン、〔アスパラ
ギンアミド²¹−Ａ〕インスリン、〔サルコシン¹−
Ａ−アスパラギン²¹−Ａ〕インスリン、〔ノルロ
イシン²−Ａ〕インスリン、〔トレオニン⁵−Ａ〕
インスリン、〔ロイシン⁵−Ａ〕インスリン、〔フ
エニルアラニン¹⁹−Ａ〕インスリン、〔Ｄ−チロ
シン¹⁹−Ａ〕インスリン、〔チロシン¹⁸−Ａ，ア
スパラギン¹⁹−Ａ，アルギニン²¹−Ａ〕インスリ
ン、デス〔B^28-30−トリペプチド〕インスリン、
デス〔B^27-30−テトラペプチド〕インスリン、デ
ス〔B^26-30−ペンタペプチド〕インスリン、デス
〔B^27-30−テトラペプチド、チロシンアミド²⁶−
Ｂ〕インスリン、デス〔B^26-30−ペンタペプチ
ド、フエニルアラニンアミド²⁵−Ｂ〕インスリ
ン、デス〔B^1-4−テトラペプチド〕インスリン、
デス〔B^1-5ペンタペプチド〕インスリン、〔リシ
ン²²−Ｂ〕インスリン，〔ロイシン⁹−Ｂ〕インス
リン、〔ロイシン¹⁰−Ｂ〕インスリン、デス〔フ
エニルアラニン¹−Ｂ〕インスリンなどがある。
これらおよび他のインスリン類似体が文献に記載
されている。例えば、Blundell，T.，et al，
Advances in Protein Chemistry，26，330−
362，Academic Press，N.Y.，N.Y.（1972）；
Katsoyannis，P.G.，Treatment of Early
Diabetes，319−327，Plenum Publishing Corp.
（1979）；Geiger，R.，Chemiker Zeitung
Reprint100，111−129，Dr.Hｕ¨thig，
Publisher，Heidelberg，W.Germany（1976）；
Brandenburg，D.et al.，Biochem.J.，125，51
−52（1971）参照。 本発明方法はインスリンおよびインスリン類似
体の製造に広く適用できるが、より好ましくは天
然インスリンの製造に使用され、さらに好ましく
はヒト、ウシまたはブタインスリンの製造に、最
も好ましくはヒトインスリンの製造に用いられ
る。 本発明方法を実施するに際して、ＡおよびＢ鎖
の結合によるインスリンもしくはインスリン類似
体の製造は、一方の鎖と他方の鎖との相対的比に
ついて言えば、極めて広い範囲で行うことができ
る。勿論、この結合反応は、AB両鎖のうち量的
により少く存在する方の鎖によつて必然的に制約
される。いずれにしても、Ａ鎖：Ｂ鎖の重量比は
必須条件ではないが、通常は約0.1：１乃至約
10：１である。本発明方法を実施するには、Ａ鎖
とＢ鎖の重量比を約１：１乃至約３：１とするの
が好ましい。さらに、この範囲内において、特定
の範囲が特定のインスリンを製造するのに特に有
利であることが見出されている。すなわち、ウシ
インスリンを製造するためにＡ鎖とＢ鎖を結合さ
せるときは、Ａ鎖：Ｂ鎖の比は約1.4：1.0乃至約
1.8：1.0であるのが好ましい。ブタインスリンの
ために好ましい範囲は約1.0：1.0乃至約1.4：1.0
である。ヒトインスリンの製造では、好ましい範
囲は約1.8：1.0乃至約2.2：1.0である。 本発明方法を最良の水準で実施するために有意
な他のパラメーターとしては、反応媒質中におけ
る蛋白質濃度がある。本方法は、広い範囲の蛋白
質濃度で首尾よく実施され得る。しかしながら、
反応媒質中における蛋白質濃度は、一般に約0.1
乃至50mg／mlである。好ましくは、蛋白質濃度は
約２乃至20mg／mlの範囲である。この後者の範囲
内で、至適蛋白質濃度は製造するインスリンの種
類に応じて変化する。すなわち、ブタインスリン
の場合は蛋白質濃度が約８乃至約16mg／mlである
のが好ましいが、ヒトまたはウシインスリンの製
造に好ましい範囲は約３乃至約８mg／mlである。 本発明方法は水性媒質中で実施される。室温で
測定した媒質のPHは一般に約８乃至約12の範囲に
ある。好ましくはそれは約9.5乃至約11.0であり、
最も好ましくは約10.4乃至約10.6の間に維持す
る。媒質のPHは、適当な緩衝剤を加えることによ
り所望の範囲に維持される。代表的なこの種の緩
衝剤には、例えば、グリシン、グリシルグリシ
ン、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）
グリシン、ピロリン酸塩、Ｎ−トリス（ヒドロキ
シメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン
酸および同様の物質があり、これらは前記範囲内
にPHを制御する効果を有する。一般的でかつ好ま
しい緩衝剤はグリシンである。 緩衝剤の濃度は、一般に約0.001M乃至約2Mで
ある。好ましい濃度は約0.01M乃至約1Mであり、
さらに好ましくは約0.01M乃至約0.1Mである。 チオール還元剤の存在下、適当な水性媒質中で
ＡおよびＢ鎖を混合する。“チオール還元剤”と
は、少くとも１個の−SH基を有し、ＡおよびＢ
鎖のＳ−スルホネート基を還元する能力を有する
化合物である。このような性質を有するものは何
でも使用できるが、より好ましいチオール還元剤
はその酸化された型において高度に安定な化合物
に環化されるものである。チオール還元剤は、Ａ
およびＢ鎖上に存在するすべての−SSO^- ₃基のそ
れぞれについて約0.4乃至約2.5個の、さらに好ま
しくは−SSO^- ₃基１個について約0.9乃至約1.3個
の−SH基を与える量だけ存在させる。 代表的なチオール還元剤の例としては、ジチオ
トレイトール（DTT）、ジチオエリトリトール
（DTE）、２−メルカプトエタノール、チオグリ
コール類メチル、３−メルカプト−１，２−プロ
パンジオール，メルカプト酢酸、３−メルカプト
プロピオン酸、２−アミノ−３−メルカプトプロ
ピオン酸（システイン）、チオグリコール酸およ
び他の同様なチオール化合物がある。好ましいチ
オール還元剤はジチオトレイトールおよびジチオ
エリトリトールであり、最も好ましいのはジチオ
トレイトールである。 本発明方法の必須条件のひとつは、それが酸素
源が備えられている雰囲気中で実施されなければ
ならない点である。この条件は、反応混液を空気
に対して開口させておくだけでも充足される。も
つと直接的な接触方法、例えば空気または酸素を
反応液中に導入する方法が採られてもよいが、必
須ではない。 従つて、一般に本発明方法は、Ａ鎖Ｓ−スルホ
ネート体、Ｂ鎖Ｓ−スルホネート体およびチオー
ル還元剤を、PH約８乃至約12の水質媒質中で所望
の濃度で混合することにより実施される。この混
合物は、空気に対して開口接触しており、鎖の結
合が充分に形成される間、一般には少くとも約30
分間穏かに撹拌する。この撹拌を行つている間、
混液を一般に約０℃乃至約25℃の温度に保持す
る。しかし、好ましくは、この混液をゆるやかに
冷却して上記範囲の低温端域、一般に約０℃乃至
約10℃に維持する。 反応時間が経過したら、インスリンまたはイン
スリン類似体を、インスリンの技術分野で知られ
ている各種の方法のいずれかを用いて単離する。
インスリンの精製に最も広く用いられているのは
クロマトグラフイー法である。これらの方法は、
本発明の方法からインスリンを回収する際にも容
易に適用し得る。これには、ゲル過およびイオ
ン交換クロマトグラフイーが含まれる。 さらに生成物の純度および活性は、既知方法、
例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動、アミノ
酸分析、インスリンラジオレセプターアツセイ、
インスリンラジオイムノアツセイ、高速液体クロ
マトグラフイー（HPLC）、紫外線スペクトル、
ダンシレイシヨン、ウサギ血中グリコースアツセ
イなどによつて検定され得る。 本発明方法で製造されるインスリンには、ある
種のインスリンＡ鎖と他の種のインスリンＢ鎖と
からなる混成体も含まれる。本発明方法の目的は
ＡおよびＢ鎖のＳ−スルホネートを適切に結合さ
せる点にあり、それら各鎖の構造は、インスリン
またはインスリン類似体のＡまたはＢ鎖であるこ
とに誤りがない限り、本発明方法にとつて重要で
はない。 インスリン類似体や混成インスリン（ある種の
Ａ鎖と他の種のＢ鎖からなる）も本発明方法によ
つて製造され得るが、言うまでもなく、天然イン
スリンと同一の構造を有するインスリンを、かか
るインスリンと同一のアミノ酸配列を有するＡ鎖
Ｓ−スルホネートとＢ鎖Ｓ−スルホネートを用い
て製造するのが好ましい。さらに好ましいのは、
本発明方法によつてブタ、ウシまたはヒトインス
リンを製造することであり、最も好ましいのはヒ
トインスリンを製造することである。 インスリンまたはインスリン類似体のＡ鎖およ
びＢ鎖は、前述したように、組換えDNA法によ
つて製造される。このものはまた、天然インスリ
ンから製造されるし、溶液法もしくは固相法を含
む古典的ペプチド合成法によつても製造される。 ＡおよびＢ鎖はＳ−スルホネートとして安定に
保存される。Ｓ−スルホネート原料は、酸化的亜
硫酸分解（oxidative sulfitolysis）、すなわちＡ
およびＢ鎖を緩和な酸化剤、例えばテトラチオン
酸ナトリウムの存在下に亜硫酸ナトリウムで処理
することによつて製造される。 本発明方法を説明するために以下に実施例を示
す。これらの実施例は説明のためにのみ示されて
いるのであつて、本発明の範囲を限定するためで
はない。 実施例 １ ブタＡ鎖Ｓ−スルホネート360mgを0.1Mグリシ
ン緩衝液（PH10.5）36mlに溶かし、5N NaOHで
混液のPHを10.5に調整した。ブタＢ鎖Ｓ−スルホ
ネート300mgを0.1Mグリシンン緩衝液（PH10.5）
30mlに溶かし、5NNaOHで混液のPHを10.5に調
整した、ジチオトレイトール（DTT）123.4mgを
0.1Mグリシン緩衝液（PH10.5）４mlに溶解し、
5NNaOH0.2mlを用いて混液のPHを10.5に調整し
た。 ＡおよびＢ鎖の溶液を、室温（〜25℃）下に
100mlのバイアル中で混合し、次いでDTTの溶液
1.91ml（−SH：−SSO^- ₃比、1.04）を加えた後、
この溶液を４−８℃で20時間、開放ビーカー中に
おいてマグネテイツクスターラーで穏かに撹拌し
た。高速液体クロマトグラフイー（HPLC）によ
る分析の結果、インスリン193.8mgが生成してお
り、全蛋白質中29％を占めた。 この最終溶液40mlを酢酸でPH3.15に調整し、平
衡化したセフアデツクスＧ−50（スーパーフアイ
ン）のカラム（５×200cm）を用いてゲル過を
行い、1M酢酸を用いて４−８℃で溶離した。イ
ンスリンのピーク（溶離容積、約2450−2700ml）
をプールし、凍結乾燥し、インスリン95mg（全蛋
白質の25％）を得た。このブタインスリンは、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動、アミノ酸分析、
インスリンラジオレセプターアツセイ、HPLCお
よびウサギの血中グリコース低下試験により高純
度であると認められた。 実施例 ２ 0.01Mグリシン緩衝液（PH10.5）を用い、濃度
５mg／mlのウシＡ鎖Ｓ−スルホネートおよびウシ
Ｂ鎖Ｓ−スルホネートの溶液を調製し、それぞれ
5NNaOHでPH10.5に調整した。0.1Mグリシン緩
衝液（PH10.5）4.0mlにDTT61.7mgを溶解し、
5NNaOH0.15mlでPH10.5に整えた。Ｂ鎖の溶液
0.5mlにＡ鎖の溶液0.8mlおよびDTTの溶液0.035
mlを室温（〜25℃）で加えた（−SH：−SSO^- ₃
比、0.91）。この溶液を３mlの開放バイヤル中、
４−８℃で20時間撹拌した。この混合物のHPLC
分析は、ウシインスリンの収量1.96mg（全蛋白質
の30％）を示した。 実施例 ３ 0.1Mグリシン緩衝液（PH10.5）を用いて、10
mg／mlの濃度のブタＡ鎖Ｓ−スルホネートおよび
ブタＢ鎖Ｓ−スルホネート溶液を調製し、それぞ
れの溶液を5NNaOHによりPH10.5とした。 DTT61.7mgを蒸留水（glass distilled）2.0mlに
溶解した。Ｂ鎖溶液0.5mlにＡ鎖溶液0.6mlおよび
DTT溶液29.25μを室温（〜25℃）で溶解した
（−SH：−SSO^- ₃比、1.00）。この混液を３mlの開
放バイアル中、４−８℃で20時間撹拌した。この
混液のHPLC分析は、ブタインスリンの収量3.81
mg（全蛋白質の35％）を示した。 実施例 ４ ヒトインスリンＢ鎖Ｓ−スルホネート（膵臓由
来）、ヒトインスリンＡ鎖Ｓ−スルホネート（膵
臓由来および大腸菌由来）およびブタインスリン
Ａ鎖Ｓ−スルホネート（膵臓由来）の各溶液を、
0.1Mグリシン緩衝液（PH10.5）に用いて５mg／
mlの濃度に調整した。各溶液は5NNaOHを用い
てPH10.5とした。DTT61.7mgを0.1Mグリシン緩
衝液（PH10.5）4.0mlに溶かし、5NNaOH0.16ml
でPH10.5に調整した。Ａ鎖Ｓ−スルホネート溶液
1.0mlにＢ鎖Ｓ−スルホネート溶液0.5mlおよび
DTT溶液0.05mlを室温で加えた（−SH：−
SSO^- ₃比、1.09）。すべての溶液は、冷室（４−８
℃）において開放バイアル中で20−22時間撹拌し
た。次いで、各溶液を膵臓由来ヒトインスリンを
収量計算の標準物質としてHPLCで分析した。そ
の結果を下表に示す。 【表】 実施例 ５ ヒトインスリンＡ鎖Ｓ−スルホネートおよびヒ
トインスリンＢ鎖Ｓ−スルホネートを0.1Mグリ
シン緩衝液（PH10.5）に５mg／mlの濃度に溶解
し、それぞれ5NNaOHでPH10.5に調整した。
DTT61.7mgを0.1Mグリシン緩衝液（PH10.5）4.0
mlに溶かし、5NNaOH0.16mlを加えてPH10.5に調
整した。Ｂ鎖溶液0.5mlに室温でＡ鎖溶液1.0mlを
加え、次いでDTT溶液50μを加えた（−SH：
−SSO^- ₃比、1.09）。この溶液を開放バイアル中４
−８℃で22時間撹拌し、次いでHPLCで分析した
ところ、ヒトインスリンの収量2.58mg（全蛋白質
の34％）を示した。 実施例 ６ ヒトインスリンＡ鎖Ｓ−スルホネート328mgを
0.1Mグリシン緩衝液（PH10.5）65.6mlに溶かし、
5NNaOH7.5μでPH10.5に調整した。ヒトイン
スリンＢ鎖Ｓ−スルホネート164mgを0.1Mグリシ
ン緩衝液（PH10.5）32.8mlに溶かし、
5NNaOH15μでPH10.5に調整した。DTT61.7mg
を0.1Mグリシン緩衝液（PH10.5）4.0mlに溶かし、
5NNaOH160μでPH10.5に調整した。 Ａ鎖溶液とＢ鎖溶液を室温（〜25℃）において
150mlのガラスビーカー中で混合し、DTT溶液
3.28mlを加えた（−SH：−SSO^- ₃比、1.09）。こ
の開放（蓋をしない）ビーカーを冷室で氷水浴に
入れ、30分間強撹拌した。この溶液を冷室（４−
８℃）でさらに24時間撹拌した。この時点での
HPLC分析は、ヒトインスリンの収量148mg（全
蛋白質の30％）を示した。 この溶液100mlに氷酢酸25ml加え、最終PH3.15
とした。この全量を、４−８℃において、1M酢
酸で平衡化したセフアデツクスＧ−50（スーパー
フアイン）のカラム５×200cmを用い、1M酢酸で
溶出するゲル過に付した。溶離した蛋白質の全
部を凍結乾燥した。インスリンのピーク（溶離容
積2465−2781ml）は125mgで、回収された蛋白質
の29.4％であつた。 上記インスリンピークの一部（95.5mg）を、
0.01Mトリス−0.001MEDTA−7.5M尿素−
0.03M塩化ナトリウム緩衝液（４℃においてPH
8.5）約９mlに溶かした。この混液を、同一緩衝
液で平衡化したDEAE（ジエチルアミノエチル）
セルローズイオン交換カラム2.5×90cmでクロマ
トグラフした。蛋白質の溶離は、４−８℃で、塩
化ナトリウム0.03M（１）および同0.09M（１
）（共に同一緩衝液中）を用いる濃度勾配で、
次いで塩化ナトリウム1M（１）（同一緩衝液中）
で溶離した。各ピークをセフアデツクスＧ−25
（コース）カラムと２％酢酸で脱塩した後凍結乾
燥した。インスリンピーク（溶離容積878−1008
ml）は55.73mgで、回収蛋白質の84％であつた。 インスリン（DEAE）ピーク11.90mgをサンプ
リングし、ガラス製遠心分離管中で0.1N塩酸
240μに溶かし、直ちに0.04％塩化亜鉛−0.05M
クエン酸ナトリウム−15％アセトン溶液2.16mlを
加えて亜鉛インスリン結晶を製造した。結晶化は
室温（〜25℃）で72時間行い、上澄を除き、結晶
を冷水（PH6.1）で２回洗浄した。洗浄に当つて
は、３℃、2000rpmで遠心分離した。この結晶を
0.01N塩酸に溶かして分析した。 得られたヒトインスリン製品は、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（単一帯）、アミノ酸分析、
インスリンラジオレセプターアツセイ、インスリ
ンラジオイムアツセイ、HPLC、ダンシレーシヨ
ンおよびUVスペクトルにより、充分純粋である
と判定された。米局方によるウサギを用いる検定
（144匹）において、力価26.3±1.8単位／mg（無
水物）を示した。 実施例 ７ ヒト（大腸菌）〔Ｎ−ホルミル−Gly¹〕Ａ鎖Ｓ
−スルホネートおよびヒト（膵臓）Ｂ鎖Ｓ−スル
ホネートの溶液を、0.1Mグリシン緩衝液（PH
10.5）を用い、５mg／mlの濃度に調製し、各溶液
を5NNaOHでPH10.5に調整した。他方、
DTT61.7mgを0.1Mグリシン緩衝液（PH10.5）4.0
mlに溶かし、5NNaOH0.16mlでPH10.5に調整し
た。Ｂ鎖Ｓ−スルホネート溶液0.5mlに〔Ｎ−ホ
ルミル−Gly¹〕Ａ鎖Ｓ−スルホネート溶液1.0ml
とDTT溶液0.05mlを室温（25℃）で加えた（−
SH：−SSO^- ₃比、1.10）。この溶液を３mlの開放
バイアルに入れ、冷室（４−８℃）で23時間撹拌
したところ、HPLC分析は〔Ｎ−ホルミル−Gly¹
−Ａ〕ヒトインスリン収量1.46mg（全蛋白質の
19.5％）を示した。 氷酢酸を用いてPH3.15に酸性化し、この溶液の
一部をゲル過した。ゲル過は、1.5×90cmの
カラムにセフアデツクスＧ−50（スーパーフアイ
ン）を充填し、1M酢酸で平衡化し、４乃至８℃
で溶離することによつて行つた。〔Ｎ−ホルミル
−Gly¹−Ａ〕ヒトインスリンピーク（溶離容積
87−95ml）をプールし、その一部を凍結乾燥し
た。この蛋白質は、HPLCおよびアミノ酸分析に
より充分に純粋であることが示された。ラジオレ
セプターアツセイによつて評価した〔Ｎ−ホルミ
ル−Gly¹−Ａ〕ヒトインスリンの生物活性は、
ヒトインスリンの標準品に対して17％であつた。 実施例 ８ ブタＡ鎖Ｓ−スルホネートおよびヒト（大腸
菌）Ｂ鎖Ｓ−スルホネートの溶液を、0.1Mグリ
シン緩衝液（PH10.5）を用いて10mg／mlの濃度に
調整した。Ｂ鎖溶液１mlに対してＡ鎖溶液２mlを
用いてＡ−Ｂ調製液を作り、5NNaOHを加えて
PH10.5に調製した。システイン121.2mgを0.1Mグ
リシン緩衝液（PH10.5）3.0mlに溶かし、
5NNaOH0.35mlでPH10.5に調整した。Ａ−Ｂ調整
液1.4mlにシステイン溶液52μを室温で加えた
（−SH：−SSO^- ₃比、0.95）。この溶液を３mlの開
放バイアルに入れ、４−８℃で20時間撹拌したと
ころ、HPLC分析はヒトインスリン収量3.25mg
（全蛋白質の23.2％）を示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ インスリンまたはインスリン類似体のＡ鎖と
   インスリンまたはインスリン類似体のＢ鎖とを結
   合させてインスリンまたはインスリン類似体を製
   造するにあたり、Ａ鎖のＳ−スルホネート体、Ｂ
   鎖のＳ−スルホネート体およびチオール還元剤を
   水性媒質中に、(a)PHが８乃至12となり、(b)全蛋白
   質濃度が0.1乃至50mg／mlとなりかつ(c)Ａ鎖およ
   びＢ鎖のＳ−スルホネート体に存在するすべての
   −SSO^- ₃基のそれぞれに対し0.4乃至2.5個の−SH
   基を提供し得る量のチオール還元剤が存在する条
   件で混合し、この混合物を酸素源が備えられてい
   る雰囲気中で、０℃乃至25℃の温度に保持してイ
   ンスリンまたはインスリン類似体を生成させるこ
   とを特徴とする製造法。 ２ Ａ鎖Ｓ−スルホネート体およびＢ鎖Ｓ−スル
   ホネート体が、それぞれ天然インスリンと同一の
   アミノ酸配列を有する特許請求の範囲１記載の方
   法。 ３ Ａ鎖Ｓ−スルホネート体：Ｂ鎖Ｓ−スルホネ
   ート体の重量比が0.1：１乃至10：１である特許
   請求の範囲２記載の方法。 ４ Ａ鎖Ｓ−スルホネート体：Ｂ鎖Ｓ−スルホネ
   ート体の重量比が１：１乃至３：１である特許請
   求の範囲３記載の方法。 ５ 蛋白質濃度が２乃至20mg／mlである特許請求
   の範囲１乃至４記載の方法。 ６ 反応混液のPHが9.5乃至11.0である特許請求
   の範囲１乃至５記載の方法。 ７ 反応混液のPHが10.4乃至10.6である特許請
   求の範囲６記載の方法。 ８ チオール還元剤が、Ａ鎖およびＢ鎖のＳ−ス
   ルホネート体に存在するすべての−SSO^- ₃基のそ
   れぞれについて0.9乃至1.3個の−SH基を提供し
   得る量だけ存在する特許請求の範囲１乃至７記載
   の方法。 ９ チオール還元剤がジチオトレイトールまたは
   ジチオエリトリトールである特許請求の範囲８記
   載の方法。 １０ 反応混液を０℃乃至10℃の温度に保持する
   特許請求の範囲１乃至４記載の方法。 １１ 製造されるインスリンがウシ、ブタまたは
   ヒトインスリンである特許請求の範囲１乃至１０
   記載の方法。 １２ 製造されるインスリンがウシインスリンで
   あり、Ａ鎖Ｓ−スルホネート体：Ｂ鎖Ｓ−スルホ
   ネート体の重量比が1.4：1.0乃至1.8：1.0であり、
   かつ蛋白質濃度が３乃至８mg／mlである特許請求
   の範囲１１記載の方法。 １３ 製造されるインスリンがブタインスリンで
   あり、Ａ鎖Ｓ−スルホネート体：Ｂ鎖Ｓ−スルホ
   ネート体の重量比が1.0：1.0乃至1.4：1.0であり、
   かつ蛋白質濃度が８乃至16mg／mlである特許請求
   の範囲１１記載の方法。 １４ 製造されるインスリンがヒトインスリンで
   あり、Ａ鎖Ｓ−スルホネート体：Ｂ鎖Ｓ−スルホ
   ネート体の重量比が1.8：1.0乃至2.2：1.0であり、
   かつ蛋白質濃度が３乃至８mg／mlである特許請求
   の範囲１１記載の方法。