JPS62296880A - 植物細胞における遺伝子発現のアンチ−センス調節 - Google Patents

植物細胞における遺伝子発現のアンチ−センス調節

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JPS62296880A JP62071918A JP7191887A JPS62296880A JP S62296880 A JPS62296880 A JP S62296880A JP 62071918 A JP62071918 A JP 62071918A JP 7191887 A JP7191887 A JP 7191887A JP S62296880 A JPS62296880 A JP S62296880A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 遺伝子工学による植物の変性は、単細胞生物及び哺乳類
細胞の分子生物学の理解及び利用に遅れをとって来た。
外来性ＤＮＡによる単細胞微生物又は哺乳類細胞の安定
した形質転換のために効果的だと立証された技法は、植
物細胞に関しても有用な類似法であるとは見出されては
いない。従って、単細胞微生物及び哺乳類細胞に関与す
る多くの業績にもかかわらず、植物細胞に関する業績の
数は、実質的に少なく、そして他のタイプの生物に関す
る経験内容を２植物細胞に関する好結果をもたらす実施
態様に容易に変えることはできない。
多（の場合、新しい形質を導入することよりもむしろ、
植物細胞の存在形質を変性することが好ましいであろう
。従って、他と比較して１つの対立遺伝子の優先的な発
現を提供する特定の酵素。
他と比較して１つのアイソザイム又は同様のものの活性
を変性することが望まれるであろう。多くの場合２発現
を完全に阻害するよりもむしろ、構造遺伝子の発現の量
を減じることが望まれる。従って、特定の植物細胞、植
物組織又は植物の表現型の指図された変性を可能にする
であろう技法を開発することが興味の対象である。
盟迷文献■説泗− Ｃｒｏｉｎｌｅｙなど、並ユ（１９８５）４３　：　　
６３３〜６４１は。
ディクチオスチリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌ、ｉｕｍ
）中にトランスフヱクトされたジスコイジン遺伝子のア
ンチ−センス構造体を使用して、内在性ジスコイジン遺
伝子の発現を抑制したことを記載する。またこの中に引
用された参考文献も参照のこと。アンチ−センス調節調
節がまた。　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇなど。
Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３　　：　　７０３〜７
０６　；　Ｐｒｅｉｓｓなど。
ＮａＬｕｒｅ（１９８５）３１３　　：　２７〜３２　
；　Ｍｅｌｔｏｎ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８５）　８２：
　　１４４〜１４８；　　Ｉｚａｎｔ及び−ｅｉｎｔｒ
ａｕｂ、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）２２９　：　
３４５〜３５２　；及びＫｊｍ及びＷｏｌｄ、　Ｃｅ１
ｌ　（１９８５）　４２　：　　１２９〜１３８によっ
て記載されて来た。また、　Ｉｚａｎｔ及びＷｅｉｎｔ
ｒａｕｂ、　Ｃｅ１ｌ　（１９８４）　３６　：　１０
０７〜１Ｏ１５；Ｐｅｓ　Ｌｋａなど、ｈ三工基態し」
９上」圏エユ鎖（１９８４）　８１　：　７５２５〜７
５２８　；旧ｚｕｎｏなど、前記３１１：　　４１０及
びＷｅｉｎｔｒａｕｂなど、　Ｔｒｅｎｄｓ　１ｎＧｅ
ｎｅｔｉｃｓ　（１９８５）上：２２〜２５も参照のこ
と。
Ｍ（Ｇａｒｒｙ及びＬｉｎｄｑｕｉｓｔ、　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８６）　８３：　　３９９〜４
０３は、熱誘発性アンチーセンスＲＮＡによる熱シヨツ
クタンパク質の阻害を報告する。
主恩Ω翌對 植物細胞における発現の調節は、転写されたＤＮＡ配列
が宿主によってすでに転写されたＤＮＡ配列に少なくと
も一部相補的である遺伝子を含有するＤＮＡ配列を植物
細胞宿主中に組込むことによって達成される。組込まれ
た外因性ＤＮＡは、植物細胞宿主によって認識された転
写開始領域の転写調節下にあるであろう、この組込まれ
た外因性ＤＮＡの転写は、宿主細胞の内因性ＲＮＡに相
補的であろうアンチ−・−センスＲＮＡのマルチコピー
をもたらすであろう。このアンチ−センスｍＲＮＡは、
天然に存在するＲＮＡの機能の減少をもたらすであろう
。
詩冗皇躬韮ΩＬ戴 ＲＮＡ利用の調節、特に植物宿主細胞の表現型特性の調
節のための方法及び組成物が提供される。
その組成物は、宿主に内在性のＲＮＡ、特にｍＲＮＡ上
に存在する配列に相補的である配列によって分離された
転写開始及び終結領域を有する転写構造体を含む。この
手段によって２植物宿主細胞に相補的な種々の方法が調
節され得、その結果２個々のタンパク質の産生が減じら
れ、多くの酵素工程が調節され、特定の代謝経路が１又
はそれよりも多くの他の代謝経路よりはむしろ調節され
又は阻害され、非タンパク質性生成物の産生が減じられ
。
細胞分化が変性され及び同様のものが生ぜしめられ得る
。
ｍＲＮＡの配列に相補的な配列は、普通少なくとも約１
５ヌクレオチド、より普通には少なくとも約２０ヌクレ
オチド、好ましくは約３０ヌクレオチド及びより好まし
くは約５０ヌクレオチドであり、そして１００ヌクレオ
チド又はそれ以上、９通約５０００ヌクレオチドよりも
少なく、より普通には２０００ヌクレオチドよりも少な
く、そして好ましくは１０００ヌクレオチドよりも少な
い。その配列は！ｌＲＮＡのいづれかの配列に相補的で
あり、すなわち。それは５′−末端又はキャッピング部
位に近く、該キャッピング部位から下流に存在し、該キ
ャッピング部位と開始コドンの間に存在し、そして非コ
ード領域のすべて又は一部のみを包含し。
非コード及びコード領域をブリッジし、該コード領域の
すべて又は一部に相補的であり、該コード領域のご一末
端に相補的であり又はｍＲＮＡのＪ−非翻訳領域に相補
的であることができる。
ｍＲＮＡに関し、ては、該ｍＲＮＡはプロセス又はプロ
セスされず、すなわちイントロンを含むことができる。
従って、非コード領域は、５′又はＪの非コードフラン
キング領域及びイントロンを含むことができろ。
特定の部位にアンチ−センス配列が結合し、そして該ア
ンチーセンス鎖の長さは、目的とする阻害度、配列のユ
ニークさ、アンチ−センス配列の安定性又は同様のもの
に依存して異なるであろう。
従って、これらの因子は、特定のアンチ−センス配列に
より観察された経験に基づいて多少決定されるであろう
。
配列は、単−配列又は複数の反復配列をタンデムに有す
る反復配列であり、ここで該単一配列は。
多くのｎ＋ＲＮＡに結合することができる。ある場合、
ホモ二重鎖を提供するよりはむしろ、ペテロ二重鎖が使
用され得、ここでその同じ配列は、異なったｍＲＮＡに
相補的な領域を有することによって、多くのｍＲＮＡの
阻害を提供することができる。
アンチ−センス配列は、結合の確率を高めるために、非
反復配列又は反復配列に相補的であることができる。従
って、そのアンチ−センス配列は。
非反復配列の１つのユニットの反復配列又は多くのユニ
ットの反復配列結合に関与され得る。そのアンチ−セン
ス配列は、単一の遺伝子又は多くの遺伝子の発現の調節
をもたらすことができる。
転写構造体は、転写に向かって、転写開始領域。
センス鎖上でアンチ−センスＲＮＡをコードする配列及
び転写終結領域から成るであろう。
その転写開始領域は、構成的な発現又は調節された発現
を提供することができる。植物において機能的である多
くの数のプロモーターを利用できる。これらのプロモー
ターは、Ｔｉ　−Ｒｉ　−プラスミド、植物細胞、植物
ウィルス又は他の宿主（ここで、プロモーターは、植物
中において機能的であるように思われる）から得られる
。例示的なプロモーターは、植物中で機能的な細菌起源
のプロモーターの例示として、オクトピンシンテターゼ
プロモーター、ツバリンシンテターゼプロモーター、ナ
トビンシンテターゼプロモーター、等を含む。ウィルス
プロモーターは、カリフラワーモザイクウィルスの完全
な長さく３５　Ｓ）及び領域■のプロモーター、等を含
む。内因性植物のプロモーターは、リブロース−１，６
−ビホスフエート（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブ
ユニット（ＳＳＵ）。
β−コングリシニンプロモーター、ファセオリンプロモ
ーター、ＡＤＨプロモーター、熱シヨ・ツクプロモータ
ー、組織特異性プロモーター、果実の成熟に関連するプ
ロモーター、等を含む。
転写開始領域は、天然に存在する領域、調節領域を欠＜
ＲＮＡポリマラーゼ結合領域又は１つの遺伝子からのＲ
ＮＡポリマラーゼ結合領域及び異なった遺伝子からの調
節領域の組み合せであることができる。その調節領域は
、物理的刺激、たとえば熱（熱シゴソク遺伝子に関する
）、光（ＲＵＢＰカルボキシラーゼＳＳＵに関する）又
は同様のものに反応することができる。他方、その調節
領域は２分化シグナル、たとえばβ−コングリシニン遺
伝子、ファセオリン遺伝子又は同様のものに敏感である
。第三タイプの調節領域は９代謝物に反応する。アンチ
−センス配列ＲＮＡの発現の時及びレベルは、産生され
た表現型に対して一定の効果を有する。従って１選択さ
れたプロモーターは。
アンチ−センスＲＮＡの効果を決定するであろう。
いづれか便利な終結領域、すなわちＲＮＡポリマラーゼ
結合領域の終結領域又は異なった終結領域が使用され得
る。種々の終結領域が利用でき。
そしてまず便利さからそれを選択し、ここで従来の構造
体又はＤ　Ｎ　Ａ配列が利用できる。便利には。
オピン終結領域又は内存性遺伝子、　（たとえば。
前に記載された遺伝子）からの終結領域を、使用するこ
とができる。
種々のフラグメントを、リンカ−、アダプター又は同様
のものによって、もしくは便利な制限部位が利用できる
場合、直接的に連結することができる。特に複製システ
ムに結合されるＤＮＡ配列は２段階的に連結され、ここ
で、該複製システム上に存在するマーカーは１選択のた
めに使用され得る。
本発明の構造体は１種々の方法で宿主細胞中に導入され
得る。プロトプラスト、傷つけられた葉又は体外培養組
織に関しては、Ａ、ツメファシエ７　Ｚ　（Ａ、　ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を特に使用する。使用され得る他
の技法は、プロトプラストによるエレクトロポレーショ
ン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）　、　　リポゾ
ーム融合、マイクロインジェクション又は同様のものを
含む。植物細胞を形質転換するための特定の方法は２本
発明で臨海的ではない。
いづれかの植物、たとえば被子植物、裸子植物。
単子葉植物及び双子葉植物が９本発明に従って使用され
得る。対象の植物は、穀類、たとえば小麦。
大麦、トウモロコシ、トリチカル（ｔｒＨｉｃａｌｅ）
　　；果物類、たとえばアプリコツト、オレンジ、グレ
ープフルーツ、リンゴ、ナシ、アボカド、等；堅果類、
たとえばクルミ、アーモンド、ムラザキハシバミ、ペカ
ン１等；野菜、たとえばニンジン。
レタス、トマト、セロリ、カブラ、ジャガイモ。
プロツコリイ、アスパラガス、等；木質種、たとえばポ
プラ、松、セコイア、杉、樫２等；装飾用花；又は他の
金になる収穫物、たとえばタバコ。
ホホバ、ナタネの種子、クツエア（Ｃｕｐｈｅａ）　、
大豆。
ヒマフリ。破糖ダイコン、ベニバナ、等を含む。
おのおのの種に関しては、宿主の表現型を変えるために
５ｍ節するための異なった遺伝子が一般的に存在するで
あろう。
細胞が形質転換された後、その細胞は、植物中に再生さ
れるそあろう。種々の技法が、細胞から植物を再生する
ために存在する。カルスはその細胞から発育され、そし
てそのカルスは、新芽を形成するように誘導され、そし
て次に植物を再生するために土壌中の適切な栄養培地に
移され得る。
次に、その植物は成長し、そして多くの世代にわたって
表現型の変化の安定性を確立するために。
他の植物と交差され得る。他の技法が、受粉又は受精な
しに植物を再生するために使用され得る。
培養物から再生され得るこれらの植物の遺伝子型は、収
穫物種類として直接的に適用できないので。
形質転換された植物は、適切な育種系に形質を転換する
ために、他の形質転換されていないジャームプラスマに
より交差され得る。
広範囲の種類の変性が多くの型の植物に行なわれ得る。
これらの変性は、脂肪酸源、たとえばナタネの種子、ク
ツエア又はホホバの脂肪酸分布を変え、果物及び野菜の
成熟を遅らせ、果実及び野菜の官能的な貯蔵、荷造、採
集及び／又は加工を変え、花束のために切られた花の開
花又は老化を遅らせ、植物中における１又はそれよりも
多くの物質、たとえばカフェイン、テオフィリン及びニ
コチンの量を滅じ、耐病性を増強し、又は植物における
耐ウィルス病を増強することを含むことができる。
脂肪酸分布を変えることに関しては、目的とする種はコ
コナツツ及びヤシの木、クツエア種、ナタネの種子又は
同様のものである。特定の対象の目的とする遺伝子は、
アセチルトランスアシラーゼ、アシルキャリヤータンパ
ク質、チオエステラーゼ、等である。
ニコチンの量を変えることに関しては、目的とする種は
タバコである。その目的とする遺伝子は。
Ｎ−メチルブトレッシンオキシターゼ又はプトレッシン
Ｎ−メチルトランスフェラーゼである。
果物の成熟を遅らせることに関しては５　目的とする種
は、トマト又はアボカドである。その目的とする遺伝子
は、ポリ力うクッロナーゼ又はセルラーゼである。
カフェインの量を変えることに関しては、目的とする種
はコーヒー〔コツエア　１壁 （Ｃｏｆｆｅａ　ａｒａｂｉｃａ）　）である。その目
的とする遺伝子は１−メチルキサンチン３−メチルトラ
ンスフェラーゼである。
テオフィリンの量を変えることに関しては。
その種は茶〔−左ノー史ヱ　シネンシス（Ｃａｍｅｌｌ
ａｓｉｎｅｎｓｉｓ）　）である。その目的とする遺伝
子はＩ−メチルキサンチン　３−メチルトランスフェラ
ーゼである。
花の色を変えることに関しては、目的とする種は、ペチ
ュニア、バラ、カーネーション又はキク等である。その
目的とする遺伝子は、カルコンシンテターゼ、フェニル
アラニンアンモニアリアーゼ又はデヒドロケンフェロー
ル（フラボン）ヒドロキシラーゼ等である。
リグニン含有量を変えることに関しては、目的とする種
は、タエダマツ、ドーグラスモミ、ポプラ等である。そ
の目的とする遺伝子は、シンナモイル＝Ｃｏへ：　ＮＡ
ＤＰｌｌ　レダクターゼ又はシンナモイルアルコールデ
ヒドロゲナーゼ等である。
植物における耐ウィルス病を増強することに関しては、
目的とするウィルス／植物の組み合せは。
タバコ又はトマトにおけるタバコモザイクウィルス、ビ
ート壊死イエローベインウィルス、テンサイにおけるリ
ゾマニアの原因物質、イチゴにおける種々のイチゴウィ
ルス又はいづれか他の組み合せである。植物細胞におけ
るアンチ−センスウィルスＲＮＡの発現は、ウィルス感
染を減じ又は増殖を阻害する。
転写構造体は普通、その構成の間、操作及びクローニン
グのために複製システム、特に細菌の複製システムに結
合されるであろう。その複製システムは９便利な複製シ
ステム、特に一旦エニジ」−（Ｅ、Ｃｏ１１）中で機能
的である複製システムであり１そして１又はそれよりも
多くのマーカーが、形質転換された細菌を検出するため
に存在することができる。
人、ｙノニ乙しン」じ公人又は人−ヨ１４立１！入（ム
ｒｈｉｚ■弘翌）がＤＮＡを転移するために用いられる
場合、その構造体はまた。少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ
ボーダーに結合されるであろう。従って、その構造体は
、１つのＴ−ＤＮＡボーダー。
特に右のＴ−ＤＮＡボーダーを含むであろうし。
又は左及び右のＴ−ＤＮＡボーダーの間にはさまれ得る
。
種々の技法が、転移のための手段としてＴｉ　−又はＲ
４−プラスミドを用いて、前記構造体を転移するために
存在する。Ｔ−ＤＮＡにおける構造体が組換えによって
Ｔｔ　−又はＲｉ−プラスミド中に組込まれるように成
る場合、これらの技法は。
アグロバクテリアム中で複製できるプラスミドを堤供す
ることを含む。他方、アグロバクテリアム中のＴｉ　−
又はＲｉ−プラスミドが、構造体のＴ−ＤＮＡと相同の
Ｔ　　ＤＮＡ１Ｉ域を有するが又は存しない場合、二成
分ベクターが使用され得る。
いづれにしても、　ν江遺伝子が内因性プラスミド上に
存在するかぎり、そのＴ−ＤＮＡは植物に好結果を持っ
て転移され得る。
発現構造体、特に耐抗生物質、たとえば耐カナマイシン
、耐ヒグロマイシン、耐ゲンタミシン。
耐ブレオマイシン、等の一部としてマーカーを有するこ
とによって２機能形で該構造体を保持しているこれらの
植物細胞について選択することができる。二成分ベクタ
ーが用いられ、そしてアグロバクテリアムのＴｉ　−又
はＲｉ　−プラスミド中のＴ−ＤＮＡが腫瘍遺伝子を保
持する場合、腫瘍遺伝子の発現を欠く、形態学的に正常
な細胞について選択することができるであろう。
エレクトロポレーション又はマイクロインジエクシッン
が使用される場合、臥瘤形成についての関心は存在せず
、そして得られた植物の形態（但し、変性された表現型
を除く）が正常であろうと思われる。
アンチ−センス鎖の使用の例は、トマトにおけるポリガ
ラクッロナーゼの発現の調節である。ポリガラクッロナ
ーゼの産生を減じる能力は、トマト植物の固形含有量に
対して陽性の効果を有し。
そしてトマトプロセシングを改良することができる。
トマト果実中にポリガラクッロナーゼの発現を調節する
ために、転写されたポリガラクッロナーゼ遺伝子のアン
チ−センス鎖を有する転写構造体が調製される。フラン
キング領域を含む完全な遺伝子は使用される必要はなく
９便利にはｃＤＮＡ又はそのフラグメントが使用され得
る。そのフラグメントは、約１００〜２０００ｎ　ｔ、
より９通には。
１５０〜１０００ｎ　ｔであろう。
転写開始調節領域は、好ましくは誘導的であり。
果実ブレーキング（成熟のすぐ前）の時で、構成的であ
るよりはむしろ特に活性的である。この目的のために、
ポリガラクツロナーゼ遺伝子の転写開始領域が用いられ
、又はもう１つの遺伝子の転写開始領域が成熟の間、果
実の成長に関連する。
転写力セントの構成方法は１本明細書においてはくり返
される必要はない。構造体が調製された後、それは、従
来の方法に従ってトマト植物の細胞中に導入され、そし
て植物がその細胞から再生される。
次の例は２例示的であって比的するものではない。
沃二廖９ 例１： Ｔ４リガーゼは、　ＰｒｏＭｅｇａ　Ｂｉｏｔａｃｈか
ら得た。
制限酵素、すなわちフレノウポリマラーゼフラグメント
及び１旦３１を、　Ｂａｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｏａｒｃ
ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）から得た。
オ　　ピンカセ・・　、　　　ＣＧ　Ｎ４５１亘構疲。
ｏｃｓ　５’　−ｏｃｓツカセットを、　　ｐＵ　Ｃ８
（Ｖｉｅｉｒａａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　、　Ｇｅｎｅ
　（１９８２）　１９　：　２５９〜２６８　’Ｊの誘
導体中に挿入し、ここで　Ｘｈｏｌリンカ−（ＣＣＴＣ
ＧＡＧＧ）が、ＤＮＡポリマラーゼのフレノウフラグメ
ントによりフィルインすることによって除去されたＨｊ
ｎｄＵ部位及び１匹Ｒ１部位で挿入された。切除された
旦ａｍＨＩ　（１３７７４）〜置皿Ｒ１（リンカ−）フ
ラグメントにＴ−ＤＮＡボーダーを含む、オクトピンＴ
ｉ−プラスミドρＴ　ｒ　Ａ　６（Ｃｕｒｒｉｅｒ　ａ
ｎｄ　Ｎｅ５ｔｅｒ　（１９７６）　　Ｊ、　　Ｂａｃ
ｔ、　１２６：１５７〜４６５　　；　Ｔｈｏｍａｓｈ
ｏｗなど、並置（１９８０）　１９　ニア２９〜７３９
　）’からのＸｈｏ　Ｉ　（１５２０８）　　−Ｂａｍ
Ｈｆ（１３７７４）フラグメントを連結することによっ
て。
オクトビンシンテターゼカセットを、調製した〔密接に
関連したＴｉ−プラスミドｐＴｉ１５９５５のための番
号は、　ＢａｒＲｅｒ、など、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．
旧ｏｆ。
（１９８３）　２−　：　３３５〜３５０によってであ
る）、Ｘｍｎ１（１３５１２）によりｐＴｉＡ６０Ｔ−
領域の置皿Ｒ１（１３３６２）　〜ＢａｍＨｒ　（１３
７７４）サブクローンを消化し１次にＢａ１３１エンド
ヌクレアーゼにより再切除することによって切除された
ＢａｍＨ−ＥｃｏＲフラグメントを得た。ＥｃｏＲＩリ
ンカ−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を添加り、　＋Ｌテおよそ
１３０ｂｐゲルのＥｃｏＲＩ〜且憇Ｈｒフラグメントを
、晴製し。
Ｍ１３ｍｐ９中にクローン化し、そして配列決定したＥ
ｃｏＲＩリンカ−が転写開始点と翻訳開始コドンとの間
の１３６４２で挿入されたクローンを、　ｄｅＧｒｅｖ
ｅなど、　　Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅ
ｔ、　（１９８２０：４９９〜５１２の配列と比較する
ことによって同定した。
−ＥｃｏＲＩ切断部位は、ｍＲＮＡ出発部位から下流の
位置１３６３９であった。１１２０７でのＳｍａ■部位
を、オリゴヌクレオチドリンカー（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）
を用いてＸｈｏ１部位に転換し、そして旦ｃｏＲＩ（１
２８２３）〜該転換された又回１部位のオクトビン遺伝
子のご末端をカセットに添加した。次に、オクトビンシ
ンテターゼの５′−領域（１５２０８〜１３６３９）及
び３’　　ｉｉｌ域（１２８２３〜１１２０７）を有す
る得られた発現カセットを、変性されたρＵＣ８のＸｈ
ｏ１部位に挿入し、　　ｐｃＧＮ４５１を提供した。
■ ｐＰＭＧ３８　　（Ｃｏａ＋ａｉなど、　Ｎａｔｕｒｅ
　　（１９８５）３１７：　　７４１〜７４４　）をＢ
ａ＋ｎＨＩ　ニよす消化シ。
ｅ　　　ａｒｏＡ遺伝子〔ヌクレオチド１３７７〜１２
７０４　　；５ｔａｌｋｅｒなど、Ｊ、旧ｏｆ　Ｃｈｅ
ｍ、　（１９８５）２６０　：４７２４〜４７２８）を
含むフラグメントを得、そして該フラグメントを、１型
プロモーターに関してアンチ−センス（マイナスの方向
）でｍａｓ　５’　〜ＯＣ３ご力セントすなわちｐＣＧ
Ｎ４６　　（Ｃｏｍａｉなど。
Ｎａｔｕｒｅ　（１９８５）　３１７　：　　７４１〜
７４４　）のＢａｍ８１部位に挿入し、　　ｐＣＧＮ９
６４６を得た。
ＥｃｏＲｒによるｐｃＧＮ４５１の消化によりプラスミ
ドｐＰＭＧ４５　（二速−拉Ａ）を得た後２上記と同じ
ａｒｏ　Ａ遺伝子を、　　ｐ、ＰＭＧ３８がらのＥｅｏ
Ｒ１フラグメントとして、オクトビンカセットのｐｃＧ
Ｎ４５１に挿入した。
ｐＡｃＹ１８０　　ＣＣｈａｎｇａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、
　　Ｊ、Ｂａｃｔ。
（１９７Ｂ）上３４　：　１１４１〜１１５６）の大Ｈ
ｉｎｄＩ［Ｉ−１憇ＨｒフラグメントとＴ　ｎ　５　　
（Ｊ　ｏｒｇｅｎｓｅｎなど。
Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１９７９）
　１７７　：　６５〜７２］からの耐カナマイシン細菌
遺伝子のＨｉｎｄ　Ｉ［Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントと
を組合せることがらｐＣＧＮ５２５を得た。ｐＰＭＧ４
５のＸｈｏＩフラグメントを、　　ＩＩＣＧ　Ｎ５２５
　（７）　Ｓａｌ　Ｔ部位に挿入し、　ｐＣＧＮ９６３
を得た。ｐＣＧＮ９６３のＨｉｎｄＩ［１部位を。
又匡■リンカ−（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）と交換し、そして
ｙす一アンチーセンスａｒｏＡ構造体を含む、ｐＣＧＮ
９６４からの止！フラグメントを、新しいＸｈｏ１部位
に挿入した。センス及びアンチ−センスａｒ。
Ａｉ！ｉ伝子の両者を含むこのプラスミドは、　ｐＣＧ
Ｎ９６５である。
二成分ベクター、　　ｐＣＧＮ９７８を、１烈■による
消化の後、ｐＣＧＮ９６５とｐＲＫ２９０　　（Ｄ　１
ｔｔａなど、　　Ｎｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　　Ｕ　Ｓ　Ａ　（１９８０）７７　：　７３
４７〜７３５１）とを連結することによって構成した。
ＰＭＧ５４．すなわちａｒｏＡセンスプラスミド少１戒
・ ｐＰＭＧ４５からのａ二Ａ遺伝子を、基胚Ｉフラグメン
トとして、５ａ１１により消化されたρＣＧＮ５１７に
挿入し、ｐＰＭＧ５４を得た。
ｐｃＧＮ５１１は、Ｐｓｔ１部位で挿入されたｐＵｃ５
Ｋ（ν１ｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎ
ｅ　（１９８２）１９：　　２５９〜２６８　）からの
、Ｔ＋＋９０３の耐カナマイシン遺伝子を有するｐＨＣ
７９（）Ｉｏｈｎ　ａｎｄＣｏｌ目ｎ３．　Ｇｅｎｅ　
（１９８０）　１１　：　　２９１〜２９８　Ｅがら調
製される。
ｐＣＧＮ９７８及びｐＰＭＧ５４を、Ａ、ツメフ工之ｘ
ｙｘ株に１２（菌株に１．２は、菌株Ａ　１１４（ＮＴ
Ｉ）（Ｓｃ＋ａｋｙなど、　Ｐｌａｓｍｉｄ　（１９７
Ｂ）土：２３８〜２５３）中にρＴｉＡ６を形質転換す
ることによって得られた）及びｐＲＫ２Ｏ７３ＣＬｅｏ
ｎｇなど、　　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。
プレート接合した。そのプレート接合法は。
ｃｏＩＩＩａｉなど、　Ｐｌａｓｍｉｄ　（１９８３）
１０　：　２１〜３０によって記載されている。ｐＣＧ
Ｎ９７８を担持するヱ久旦バｊｊソＬＬムを、２００ｇ
ｇ／　ｒｔｒ１ストレプトマイシン及び５０Ｍｇ／　ｍ
ｊ！カラマイシンを添加されたＡＢプレー）　（Ｃｈｉ
ｌｔｏｎなど、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ。
Ｕ　Ｓ　Ａ　（１９７４）　７１　：　３６７２〜３６
７６）上で選択し、そしてｐＣＧＮ９７８の存在をサザ
ン分析によって確かめた。Ｋ１２のＴ−ＤＮＡ中に組込
まれた。　ｐＧＭＧ５４を有する組換え体を、１００μ
ｇ／　ｍｌカナマイシンを添加されたＡＢプレート上で
選択し、そしてサザン分析によって確かめた。
ｐＣＧＮ９７８　ＸＫ　１２及びｐＰＭＢ５４　ＸＫ１
２の溶液（ＭＧ／Ｌブイヨン（Ｇａｒｆ　１ｎｋｅｌ及
びＮｅ５ｔｅｒ、　　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１
９８０）　１９４　：　７３２〜７４３　：１中、約１
０’細菌／ｍＪ）中に含浸されたツマヨウジにより葉を
傷つけることによって、４瘤を３〜４力月のカランチ＊
　（Ｋａｌａｎｃｈｏｅ）植物上に誘導した。４届材料
を、４週間後２それぞれの構造体のために４種の植物か
ら収穫し、そして使用まで一７０℃で冷凍した。その４
瘤材料をそれぞれの構造体のためにランダム化し、そし
てウェスターン分析によってａｒｏＡタンパク質につい
て分析した。
ウェスターン分析を１次のようにして行なった：２．３
ｇのｐＰＭＢ５４　ＸＫ１２及び３．０ｇのｐＣＧＮ９
７１３ＸＫ１２の遅丞！￥ａを、液体窒素中で錬磨した
。
ポリビニルピロリドン０．３ｇ当りｍ織１ｇを添加した
。その組織を、０．１Ｍクエン酸ナトリウム。
ｐＨ５，６，１０ｍＭのＥＤＴＡ、　０．１５ＭのＮａ
ｃｌ、　０．０５％　Ｎｏｒｉｄｅｔ　Ｐ　−４０＋　
２５ｓ＋ｇ／ｇｍ／ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１
　ｍＭジオトレイトール、１ａ＋Ｍフェニルメチルスル
ホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、　１０ＭＭロイペプチ
ン（Ｓｉｇｍａ）及び１０５Ｍチオ尿素を含む溶液１．
５ｍＪ当り１ｇの組織の割合で懸濁した。その均質物を
、４℃で１５分間、　１５，０００ｇで遠心分離した。
−ウサギ中に精製された３−エノールビルビルシキメ−
１・ホスフェート（ＥＰＳＰ）シンテターゼをウサギに
注射することによって調製された。抗血清２５μｌ及び
　−＄ユ、ヱ立之立久（Ｓ、ａｕｒｅｎｓ）　（Ｃａｌ
ｂｉｏｃｈｅｍ）の１０％ｃｗ／ｖ）懸濁液１２５μβ
を、それぞれの上滑液に添加し、そして室温で１時間攪
拌しながらインキエベートした。
次に、サンプルを遠心分離にかけ（５０００Ｘ　ｇ　。
５分）、そしてそのペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ（
ｐＨ７，５）、１　ｍＭの［１ＤＴＡ、　０．５ＭのＮ
ａｃｌ及び０．０５％１ｌｏｎｉｄｅｔ　Ｐ　　４０を
含む溶液により２度洗浄した。その得られたペレットを
、　　０．１２５　ＭのＴｒｉｓ、　　ｐＨ６，８，４
％ＳＤＳ、　２０％グリセロール及び１０％２−メルカ
プトエタノール溶液１００μｌ中に懸濁し、そして９０
℃で２分間、加熱した。
次に、完全なサンプルを１０％アクリルアミドゲル上で
電気泳動処理した。分解されたペプチドを。
Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ａｒａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
（１９８１）　１１２　　：　　１９５〜２０３によっ
て記載されているようなヒドロセルロース（ＢＡ　８５
５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌ＋）に。
Ｈｏｅｆｅｒ　　ＴＥ　４２　　トランスファーユニ・
ント中において１００■で３時間にわたって移した。次
に、ニトロセルロースフィルターを、　Ｂ１．０ＴＴＯ
（２０ｍＭのＴｒｉｓ、　　ｐＨ７，５＋脱水された５
％脱脂乳、０゜５ＭのＮａｃｌ＋　０．１％消泡剤Ａ、
１０ｍＭアシ化ナトリウム）中において室温で１時間イ
ンキュベートし。
次に、抗−ＥＰＳＰシンテターゼ血清の１：５０希釈液
を含むＢＬＯＴＴＯ中において４℃で１晩インキユベー
トした。フィルターを、　２０　ｍＭのＴｒｉｓ、　ｐ
Ｈ７，５及び１５０　ｍＭのＮａｃｌ　溶液中で１０分
間。
０．０５％ＴＷｅｅｎ　−２０を含む同じ緩衝液中で２
０分間及び界面活性剤を含まない緩衝液中でさらに１０
分間、洗浄した。次に　１２Ｊによりラベルされたプロ
ティンＡ　（９ｕ　Ｃ４／ｍｇ　；　Ｎ　Ｅ　Ｎ）の１
０ｈｃｐＩｌ／ｒａｌを含むＢＬＯＴＴＯを、フィルタ
ーに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。
そのフィルターを、　５０　ｍＭのＴｒｉｓ、　ｐＨ７
，５，ＬＭ（７）　Ｎａｃｌ及び０．４％ラウリルサル
コシン溶液中で１晩、室温で洗浄し、そして次に、５０
ｍＭのＴｒｉｓ＋ｐＨ７，５、５ｍＭのＥＤＴＡ　、　
　１５０　ｍＭのＮａｃｌ、　０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　
　Ｘ−１００及び０．１％ＳＯＳ溶液中で３時間、室温
で洗浄した。すすぎ、そして乾燥せしめた後、フィルタ
ーを、増強スクリーンを有するＤｕＰｏｎｔ　Ｌｉｇａ
ｔｎｉｎｇを用いて、−７０°ＣでＫｏｄａｋ　Ｘ−線
フィルムに照射した。
ｐＣＧＮ９７８を含む廓瘤は、対照のｐＰＭＧ５４４瘤
の１０〜２０％活性のみを示した。組込まれたシステム
対二成分システムにおけるａ匹Ａの発現の初期比較は、
二成分システムが組込まれたシステムの７０〜８０％の
み有効であることを示した。従って、アンチ−センス構
造体がまた。存在する場合。
６０％のａｒｏＡ活性の全減少が観察される。
アンチ−センス５’　ｍ旦−ａ７ｏ　Ａ−ご０組構造体
。
すなわちｐ　ＣＧ　Ｎ９６４ｂを、上記のようにして構
成した。センス５’　ｍａｓ　−ａ７ｏＡ−ご０■溝構
造、すなわちｐＣＧ　Ｎ９６４ａを、同じ結合から得、
そしてそのセンスの方向を選択した。
組立林料・ プロトプラスト供与体植物の三ユ±ヱ去　又バ旦ｃｖ、
キサンチ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｎ　　ｃ
ｖ。
Ｘａｎｔｈｉ）を、　　（Ｆａｃｃｊｏｔｉ　ａｎｄ　
Ｐｉｌｅｔ、　１９７９）に記載されているように、無
菌条件下でガラスジャーの中で増殖せしめた。頂端のシ
ュートを、０．７％Ｇｉｂｃｏ　Ｐｈｙｔａｇａｒ、　
３０ｇ／ｌスクロース、　１．０ｍｇ／ｊ！ＩＡＡ及び
０．１５ｍｇ／　Ｉ　Ｋｉｎｅｔｉｎを含む寒天培地（
Ｍｕｒａｓａｈｉｇｅ　ａｎｄ　ＳＫｏｏｇ（ＭＳ）培
地：１１００ｍ１中に置いた（オートクレーブする前に
ｐＨを５．５５に調節する）。その培養物を、暗／明し
ジム下で１２時間、２３±２℃で保持した。
次の段階を、消毒された溶液により無菌条件下で行なっ
た。
若葉を、光合成サイクルの暗反応を間に、４〜５週の植
物から除去した。主脈を捨て、そして残る葉Ｍｉ織を、
縦に１度切った。これらの葉断片を。
０．４％ペクチナーゼ（Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ　Ｙ−２
３，ＳｅｉｓｈｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃ
ｏ、　Ｌｔｄ、、日本）及び０．６％セルラーゼ（Ｏｎ
ｏｚｕｋａ　ＲＳ、　Ｙａｋｕｌｔ　Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌＴｎｄｕｓｔｒｙ　Ｃｏ、　Ｌｔｄ、、日
本）を含む６％ソルビトーノｖ２容液により浸透せしめ
た（２００ミリトルへ）。
２〜３時間のインキュベーションの後、その単離物を、
ピペットで静かに取り、プロトプラストを放し、そして
５２μのナイロンフィルターをｉ、Ｉ）Ｉ　した。その
プロトプラストを、５０ｘｇで遠心分離にかけることに
よってペレット化し、そして７％ソルビトール溶液によ
り２度洗浄した。プロトプラストの密度を、血球計数器
［１ｍｍ２区画のグリッドを用いて、計数された区画の
平均（ＸＩＯ’）は。
ｌ　ｒａｆｔ当りのプロトプラストの合計数の推定値を
与える〕の使用によって決定した。計算された密度に基
づいて、プロトプラストを、緩衝液（１０ｍＭのＩ（ｅ
ｐｅｓ、　　ｐ　Ｈ７，１、１４０ｍＭのＮａｃｌ、　
５　ｍＭのＣａｃｌ、及び６％ソルビトールを含む）中
、２．２〜３．０ミリオン／ｍ１の最終密度で懸濁した
。
エレクトロポレーション。
緩衝液中に懸濁されたプロトプラストを、　１ｍ７！ア
リコートに分けた。おのおののアリコートに。
キャリアーＤＮＡ　にシンの精子ＤＮＡの形で）１ｍｇ
を添加した。キャリアーＤＮＡの添加の後。
プラスミドＤＮＡを目的とする濃度で添加した。
そのプロトプラスト／　Ｄ　Ｎ　Ａ混合物を、エレクト
ロポレーションの前、５分間インキュベートし。
そして続いて、エレクトロポレーションのために。
アルミニウム箔によりライニングされた。１ｍｌのプラ
スチックキュベツトに移した。そのエレクトロポレーシ
ョンパルスは、１５０ボルトに荷電された！２５０１ｊ
Ｆコンデンサーによって得られた。パルス期間を、プロ
トプラストを欠いている緩衝溶液を通して測定し、そし
てそれは４０ｍ−秒であることが見出された。エレクト
ロポレーションの後。
プロトプラストを、室温で１０分間、キュヘット中でイ
ンキュベートし、そして続いて、　１．０　ｍｌのプロ
トプラスト培養培地（０，６ｍｇ／ｊ！のＮＡＡ、０．
２ｍｇ／ｌの２．４−　Ｄ、　　０．８ｍｇ／ｊ！のＫ
ｉｎｅｔｉｎ、　　５．５％ソルビトール及び３０ｇ／
（！のスクロースを含むＭＳ塩）により希釈されたペト
リ皿に移し、そして完全な暗の中で２３±２℃で培養し
た。４８〜５０時間後、プロトプラストを、静かに遠心
分離することによって収穫し、上清液を除去し、そして
プロトプラストを液体窒素により凍結し、そして＝７０
℃で保存した。その凍結されたプロトプラストペレット
を、ウェスターン分析のために抽出゛緩衝液（０，１Ｍ
のクエン酸ナトリウム、　　１０ｍＭのＥＤＴＡ、　１
５０　　ｍＭのＮａｃｌ、　　０．０５％　Ｎｏｎ１ｄ
ｅｔ。
２５ｍｇ／ｍ１のＢＳＡ、　１ｍＭのＰＭＳＦ、１０　
ｍＭのＤＴＴ。
１０　ｔａＭのチオ尿素及び１０μＭのロイペプチンを
含む）　　１　ｔａｌ中に懸濁した。０．０５ｇ／ｍｌ
のポリビニルピロリドン（Ｐｏｌｙ　Ｃ１ａｒＡＴ、　
ＢＤＩＩ）を添加し。
そしてその混合物を、　Ｐｏ１ｙｔｒｏｎホモナイザー
で３０秒間、錬磨した。その上清液を集め、そしてウェ
スターン分析を上記のようにして行なった。
失−基−３ 実験処理は、ｐＣＧＮ９６４ａ及びｐ　ＣＧ　Ｎ９６４
ｂ（詳しいそれぞれの構造体のためのプラスミド＋１．
）成に基づくセクションを参照のこと）を使用した。
それぞれの実験においては、　　９６４ａ及び９６４ｈ
の両者を含む処置を９６４８又は９６４ｂのみを含む処
置と比較した： ５０μ９６４ａ　　：　　　Ｏｐ　　９６４ｂ５０μ９
６４ａ　　：　　　１０μ９６４ｂ５０ｐ　　９６４ａ
　　：　　　２５１ｉ　　９６４ｂ５０μ９６４ａ　　
：　　　５０μ９６４ｂ５０μ９６４ａ　　：　　１０
０　ｐ　　９６４ｂＯｐ　　９６４ａ　　：　　　５０
μ９（ｉ４ｂすべての場合において、アンチ−センスＤ
ＮＡ（９６４ｂ）の添加が、ウェスターン分析によって
検出されたタンパク質レベルを減じた（９６４ａのみに
より得られたレベルと比較して）。平均５０％のレベル
の減少があった。タンパク譬は、予定通り。
９６４ｂのみにおいては検出されなかった。
劃−」」 ボｉガークツロ　−ゼ　アンチ−センス　“告二。
遺Ｉ［床・ 第１表、細菌株 影ユ悲皇五称１覗星　　上皿／皇考ス鼠７１１８　　　
　Δｌａｃ　　νｔｅｒａ　ａｒｉｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ
。
むＲμ（１９８２）　１９　：　２５９〜２６８Ｙ１０
８８　　ｈｓｄＲ−ｑｄＭ”　　Ｙｏｕｎｇ　ａｎｄ　
ＤａｖｉｓＹ１０’ｆＯΔＩｏｎ　　　ＰＮＡＳ　ＵＳ
Ａ　、（１９８３）主し：　１１９４〜１１９８ Ｃ２１１０ｐｏｌ　Ａ　　　　５ｔａｌｋｅｒなど。
ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　（１９８３） ８０　：５５００〜５５０４ ＭＺＪｌｕΣ放里性事［位一体 すべての酵素は、市販源から得られ、そして製造業者の
提案に従って使用された。放射性同位体は、ニューイン
グランド　ニュークリアーから得られた。
Ｐｏｌ　　（Ａ）　十ＲＮ　Ａの単一 ト７１−　ｅｖ、　Ｃａ１ｉＧｒａｎｄｅの成熟した果
実を収ＩＩし、そして液体窒素中で凍結した。凍結され
た組織を、ｉ体窒素中でモーター及びベス［・ルにより
粉砕し、そしてその得られた粉末を、　Ｆａｃｃｉｏｔ
ｔｉなど、　　Ｂｉｏ／違狙Ｗ９可Ｊヱ（１９８０）　
　３ノ　２４１〜２４６によって記載された。緩衝液中
Ｂｒｉｎｋｍａｎポリトロンにより均質化することによ
って抽出した。全ＲＮＡを、　Ｃｏ１ｂｅｒｔなど、　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、−３ｃｉ、　ＵＳ
Ａ　（１９８３）　８０　：　２２４８〜２２５２によ
って記載されているようにして調製した。
多才唐類を、４０ｍＭ酢酸ナトリウム及び０．５エタノ
ールにより全ＲＮＡ調製物から沈澱せしめた（Ｍａｎｓ
ｓｏｎなど、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、（１
９８５）２００　　：３５６〜３６１　〕　。　　Ｐｏ
１ｙ（八）＋ＲＮＡ　を、　　　（Ｍａｎｉａｔｉｓな
ど。（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａ−ｒ　ｆｉ３ｏｎｉ
ｎｇ　　：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ＋
　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ）によって記載されているようにして単離し
た。
−〇Σ凡込ｊ８を戊・ ｐｏｌｙ　（Ａ）　＋　ＲＮ　Ａからの合成を、　Ｇｕ
ｂｌｅｒ　ａｎｄＨｏｆｆ＋ｎａｎ、　Ｇｅｎｅ　（１
９８３）２５　：　　２６３〜２６９によって記載して
いるようにして１次の変法により行なった：第１鎖の合
成のための反応混合物は、　１ｍＭのｄＧＴＰ、１ｍＭ
のｄＡＴＰ、１ｎ＋ＭのＴ　’Ｔ’　Ｐ　。
０．５１１ＭのｄＣＴＰ、０．５ユニツト／μｌのＲＮ
ａｓｉｎ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）、　４　ｐｇのトマトｐ
ｏｌｙ　（Δ）＋ＲＮＡ、及び８０〜１００ユニツトの
逆転写酵素を含んだ（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）。
その反応を、５００ｍＭのＥＤＴＡ　２μβにより停止
し２次に、ｔＲＮＡ１０μｇ、１ｖｏｌの４　Ｍ　Ｎｌ
＋４０ＡＣ及び２．５ｖｏｌのエタノールによりドライ
アイス上で１晩沈殿せしめた。
第２鎖の合成を、およそ５００ｎｇの第１鎖反応生成物
から行なった。第１及び第２鎖反応混合物のアリコート
を、別々にそれぞれの反応をモニターするために、２０
μＣｉの５′−〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰによりそれぞれ
放射性ラベル化した。
λ　ｔｌｌに゛しる二　゛　ＣＤ−ＮＡのクローニング
。
二重鎖ｃＤＮＡを、製造業者（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）によって記載されているようにしてＥ
ｃｏＲｌによりメチル化した。エタノールによる沈殿の
後、そのｃＤＮＡ末端を２次の条件（６６ｍＭのＴｒｉ
ｓ　−Ｈｃｌ＋　ｐＨ７，５、２０ｍＭのＭｇｃｌ、。
１００　ｍＭのジチオトレイトール、１００μＭのｄＧ
ＴＰ、ｄＡＴＰ、、ＴＴＰ及びｄＣＴＰ、室温で１時間
）下でＤＮＡポリマラーゼＩのフレノウフラグメントの
３ユニツトを用いて、平滑化した。
次に、そのＤＮＡを、エタノールにより沈殿せしめた。
平滑化した後、旦ｃｏＲＴによりリン酸化されたリンカ
−２μｇを、リガーゼ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、　
ｐＨ７，５＋　１０　ｍＭのＭｇｃｌｚ、　２０　１１
Ｍのジオトレイトール、１ｍＭのＡＴＰ及び５ｍｇ／１
ｔｒｌのウシ血清アルブミン）　１０μｌ中、　　ｃＤ
ＮＡに添加した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１讐ｅｉｓｓユ
ニフト、　　Ｗｅｉｓｓ　　、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　　（１９６８）　　２４３　　：　４３４３゜
Ｐｒｏｍｅｇａ　）を添加し、そして１５℃で６時間、
インキュベートした。次に、リガーゼ緩衝液１０μｅ中
、’ｒ４ＤＮＡリガーゼ（さらに、　　ｌ　Ｗｅｉｓｓ
ユニット）を添加し、そして１５〜１９℃で２４時間。
インキュベートした。その反応を、フェノールにより抽
出し、エタノールにより沈殿せしめ、そして６〜８時間
にわたって１００ユニツトのＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化し、フェノー
ルにより抽出し、そしてエタノールにより沈殿せしめた
。過剰のリンカ−及び５００塩基対よりも少ないｃＤＮ
Ａを、　Ｂｉｏ−ｇｅｌ　Ａ　−５０ｍ　（１００〜２
００メツシュ）上でクロ゛７トグラフイー処理すること
によって除去し、そして分別されたｃＤＮＡを、　　）
（ｕｙｎｈなど（ＤＮＡクローニング：ＡＰｒａｃｔｉ
ｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ＋　Ｄ、Ｍ、　ＧＩｏｖｅｒ
＋　４９〜７８ページ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘ
４ｏｒｄ、　Ｅｎｇｌａｎｄ、　１９８５）によって記
載されそいるようにしてＥｃｏＲＩにより切断されたλ
ｇｔ１１ベクターＤ　Ｎ　Ａ　（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ）
に連結した。
！ｙ　　ｅ上旦でのバンキング反応を、　ｖｅｎｄｏｒ
によって記載されているようにしてＧｉｇａバ・ツク抽
出物（Ｓ　ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅ）と共に行なった。最
初の試験連結及びｉ上　旦上旦パフキングを１種々のｃ
ＤＮＡの希釈度を用いて行ない１組換え体ファージの調
製のためのｃＤＮＡ／ベクターの最適割合を実験的に決
定した。Ｈｕｙｎｈなと、藍（１９８５）によって記載
されているようにして、イソプロピル−１−チオーβ−
Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）及び５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ　−
ｇａｌ　）の存在下で、パ・ツクされたλｇｔｌｌファ
ージを、旦エユ１Ｙ１０８８上にプレートし２組換え体
の数を決定した。９０％の挿入割合で、５Ｘ１０’より
も多い組換え体を、λｇｔ１１中に得た。
ライブラリィのスクリーニング 増幅されていないλｇｔｌｌライブラリィからのおよそ
２００，０００フアージを、　ＩＩ　ｕ　ｙ　ｎ　ｈな
ど、　（１９８５）によって記載されているようにして
、宿主として一旦ユーｊし刃−Ｙ　１０９０を用いて、
９ｃＪプレート当り２０．０００のプラーク形成単位の
密度でスクリーンした。但し、ＮＺＹ培地〔１１当り、
　Ｎａｃｌ　５ｇ。
Ｍｇｃｌｚ　２　ｇ、　１０ｇのＮＺａｎｉｎｅタイプ
Ａ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）＋酵母抽
出物５ｇ及び兼天１５ｇ〕を使用した。プレートをイン
キュベートし。
そして１ｌｕｙｎｈなど、　（１９８５）、前記によっ
て記載されているようにして、　ＩＰＴＧを含むニトロ
セルロース　シートによりおおった。そのニトロセルロ
ース　シートは、０．５ＭのＴｒｉｓ　（ｐＨ８，０）
　、　　０．１５ＭのＮａｃｌ、　０．０２％ＮａＮｉ
、　０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００及び５％脱脂
粉乳溶液により飽和され１次に。
１　：　１．０００に希釈された抗−ポリガラクツロナ
ーゼ２抗体く下記参照のこと）を含む同じ緩衝液と共に
室温で３０分間、インキュベートされた。結合された抗
体を、　Ｖｅｎｄｏｒによって記載されるようにしてア
ルカリホスファターゼにより接合された第２抗体（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）により検出した。陽性のプラークを、連続
ブレーティングによって精製し、そしてファージＤＮＡ
を、　　Ｍａｒｉａｔｉｓなど（１９８２）によって記
載されているようにして調製した。
以下余白 −１と及へ１　　Ｐｌのサブクローニング　夏陽性のプ
ラークＰ１からのファージＤＮＡを。
１ＥｃｏＲｒにより消化し、そして得られたフラグメン
トを、不ノ　旦上旦での結合によって１並ＲＩにより消
化されたヘクターＭ１３　　Ｂｌｕｅ　ＳｃｒｉｂｅＭ
ｉｎｕｓ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローンし
た。初めのＤＮＡ配列決定を、製造業者によって記載し
ているようにして調製されたＢｌｕｅ　５ｃｔｂｅ構造
体からの一重鎖鋳型を用いて行なった。すべてのＤＮＡ
配列決定を、　Ｓａｎｇｅｒなど、、　　Ｐｒｏｃ、　
Ｎｕｔｌ、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９７７）　７４　：　５４６３
又はＭａｘａｍ　ａｎｄＧｉｌｂｅｒｔ、　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　（１９８０）６５　：　　４
９９〜５８０によって記載されているようにして行なっ
た。
Ｂｌｕｅ　５ｃｉｂｅ構造体からの旦ａｍＨＩ　−Ｅｃ
ｏＲＩ　。
二頭ｄ１１１−且匹Ｒ１及びＢａｍＨＩ−且旦ｄｌｌｌ
フラグメント（Ｍａｒｉａｔｉｓなど、、ｆＦＪｊ＆−
）を、　Ｍ１３　ｍｐ　１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒ
ｒｏｎなど、　Ｇｅｎｅ　（１９８５）　５３　：　１
０３〜１１９〕及びＭ１３　ｍｐ　１９　（Ｎｏｒ’ｒ
ａｎｄｅｒなど、銃匣（１９８３）　２６：　　１０１
〜１０６〕中にサブクローニングすることによって、オ
ーバラップ配列を得た。
細胞壁に結合された全タンパク質を、　Ｃｒｏｏｋｅｓ
ａｎｄ　Ｇｒｉｅｒｓｏｎ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ　５ｉ
ｏ１．　（１９８３）７２　：　１０８８〜１０９３に
よって記載しているようにして、　ｃｖ。
Ｃａ１ｉ　Ｇｒａｎｄｅの成熟果実がら調製した。その
抽出物を、　　０．０２５　Ｍのエタノールアミン溶液
（ｐＨ９，４）に対して透析し、そして０．０２５　Ｍ
のエタノールアミン溶液（ｐＨ９，４）により平衡化さ
れた。９Ｘ３００鶴カラムのクロマトフオーカシングエ
クスチェンジ＋　−ＰＢＥ　９４　（ＰｈａｒＩＩｌａ
ｃｉａ）にかけた。結合されたタンパク質を、　Ｐｏ１
ｙｂｕｆｆｅｒ　９６　　（ｐＨ８，０）（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）により？容離した。ポリガラクッロナーゼを
含む両分をプールし、そして硫酸アンモニウム（９０％
飽和）により沈殿せしめ、そしてさらに、ヒドロキシア
パタイト（ＩＩＡＰＴ）　ＩＩＰＬｃカラムを通してク
ロマトグラフィー処理することによって分別した。２１
の体積を、カラム上に入れ。
そして１０ｎ＋Ｍ〜３５０　ｍＭのリン酸ナトリウム溶
ｉ（［（ｐＨ６，８）の直線グラジェントを用いて１１
ＴＩＩ！／分の速度でクロマトグラフィー処理した。
サンプルを、　　Ａ２８０でモニターし、そして０．５
ｍｊｌ！の体積に分別した。ポリガラクツロナーゼを含
む多くの試験から集められた両分をプールし、そして６
％酢酸に対して透析し１次に凍結乾燥せしめた。
タ詠ヱ立色貫１１ζ札に足。
上記のようにして調製されたポリガラクツロナーゼを、
　Ｂｅｃｋｍａｎ　８９０　Ｍ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｐｈａ
ｓｅ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄＳｅｑｕｅｎｃｅｓにより
完全に配列決定した。次のＮ−末端配列二〇１ｙ−ｉ１
ｅ　−１ｙｓ　−ｖａｌ　−１１ｅ　−ａｓｎが得られ
た。
Ｊ叱のためのポｒガークツロ　−ゼの■。
トマトの細胞壁に結合されたタンパク質を。
Ｔｕｃｋｅｒ　ａｎｄ　Ｇｒｉｅｒｓｏｎ、　　Ｐｌａ
ｎｔａ　（１９８２）旦Ｌ：６４〜６７によって記載さ
れているようにして、Ｃν。
ｔｌｃ８２Ｂの成熟果実から調製した。硫酸アンモニウ
ム沈殿物からのベレットを、　１５０　ｍＭのＮａｃｌ
溶液に溶解し、そして同じ緩衝液に対して一晩、透析し
た。
次に、そのタンパク質溶液を、１０ｍＭのＮａｃｌ及び
１０ｍＭのＴｒｉｓ　（ｐＨ７，２）を含むイソクラチ
ック　グラジェントを用いるＴＳＫ３０００／２０００
　ＨＰＬＣサイズカラム上で、０．５ｍｌ／分の流速で
分別した。
ポリガラクッロナーゼ活性（Ｒｅｉｓｆｅｌｄなど。
Ｎａｔｕｒｅ　（１９６２）　１９５　　：　　２８１
〜２８３　）を含むＴＳＫ画分をプールし、そして１０
ｍＭ〜３５０　ｍＭのリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ６，
８）の直線グラジェントを用いるヒドロキシアパタイト
ＨＰＬＣカラムによりｌｌ１ｊ！／分の流速でさらに分
別した。ポリガラクツロナーゼ活性を含むピーク画分を
集め、そしてそれを用いて、抗体産生のためにウサギに
注射した。追加免疫注射のためのポリガラクッロナーゼ
が、細胞壁に結合されたタンパク賞調製物をＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル上で分離することによって調製され
た。硫酸アンモニウムにより沈殿せしめられた材料（上
記参照のこと）を、　１２．５％ポリアクリルアミドを
含む３龍の厚さ×１４寵園の幅のゲル上で電気泳動にか
け（Ｌａｅｍｍｌｉ。
Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）　２２７　　：　　６８０
〜６８５　）　、そしてタンパク質を、クーマシーブリ
リアントブルＲにより染色することによって可視化した
。ポリガラクツロナーゼ　バンドに対応する領域（およ
そ４０，０００〜４３，０００ドルトン）を、切断し、
凍結し、そして液体窒素により粉砕した。
亦体至ｍ裂・ 一匹のウサギに、１力月にわたって、ポリガラクツロナ
ーゼを４回注射した（１２５μｇの注入）。
次に、同じウサギに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルか
ら回収されたポリガラクツロナーゼ（およそ１５０μｇ
）により追加免疫した。同じ追加免疫注射を第１回目か
ら１週間後９行なった。そのウサギを、血清源として２
週間後、採血した。
粗血清６　ｍｌを、０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ７，０）６＋＋＋ｊ！により希釈し、そしてプロティ
ンＡ−セファロース（Ｓｉｇｍａ）の６ｍβカラムにか
けた。そのカラムを、０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液（
ｐＨ７，０）　８０　ｍｊ！により洗浄し、そして次に
。
０．１Ｍグリシン？容液（ｐ　Ｈ３，０）により？８離
した。
Ａ２８０での最とも高い活性を有する画分をプールし、
２０＋ｗＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，６）及び１５０
ｍＭのＮａｃｌ溶液に対して透析し９そしてＡｍ１ｃｏ
ｎ　ＸＭ　８０膜上でン；縮した。次に、グリセロール
を添加し、４０％の最終濃度にした。
アフィニティークロマトグラフィーにより精製された抗
血清を、νｅｎｄｏｒによって記載されたようにして、
　Ｔｒｅｓａｃｒｙｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アフィニ
ティークロマトグラフィーマトリックスに結合されたポ
リガラクツロナーゼと共に１８０画分をインキュベート
することによって調製した。タンパク質の配列決定のた
めに精製されたポリガラクツロナーゼを、製造業者によ
って記載されているようにしてＴｒｅｓａｃｒｙｌ樹脂
４　ｖａｌに連結した。上記のようにして調製されたＩ
ｇＧ５ａ＋ｊ！を、　　０．０１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７
，５）、　１５０　ｍＭのＮａｃｌ及び０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ　−２０（ＴＢＳＴ）溶液により希釈し、　５０　
ｍ！！にし、そして４℃で一晩、前記樹脂と共にインキ
ュベートした。次に、その樹脂をＴＢＳＴにより洗浄し
、そして０．２Ｍグリシン（ｐＨ２，７５）溶液により
溶離した。
Ａ２８０で高い活性を有する画分をプールし、そして１
０ｍＭのＴｒｉｓ　（ｐＨ８，０）及び１５０　ｍＭの
Ｎａｃｌ溶液に対して透析した。精製された抗体の最終
体積は２元の血清の１：２希釈度を示す１２ｍｐであっ
た。
１２個の指定ポリガラクツロナーゼ　クローンを、上記
抗体調製物との反応によってλｇｔｌｌライブラリィか
ら同定した。２個のクローンから精製された挿入体をプ
ローブとして用いてのノザシ法は、　　ｍＲＮＡをコー
ドした１つのクローン（Ｃ３）が、ポリガラクツロナー
ゼｍＲＮＡのために予期される方法及びサイズで、トマ
トの発育の間２発現されることを示した。
ポリガラクツロナーゼをコードする。さらに推定のｃＤ
ＮＡクローンを同定するために、ファージＤＮＡを残る
１０個のクローンから調製し。
旦ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ　ｍにより消化し、そしてプロ
ーブとしてクローンＣ３挿入体を用いて、サザン法（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓなど、、前記）にゆだねた。さらにｃＤ
ＮＡクローン（Ｐｌ）を０３にクロスハイブリダイズし
、そしてさらに、特徴化し、アンチ−センス発現のため
の配列を提供した。ポリガラクッロナーゼｃＤＮＡクロ
ーンとしてのＰｌの同定を、該ＤＮＡ配列から予測され
るアミノ酸配列と実際のポリガラクツロナーゼ　タンパ
ク質配列とを比較することによって確認した。そのクロ
ーンは、成熟したポリガラクツロナーゼ　ポリペプチド
のほぼＮ−末端で始まり、そしてご非翻訳領域を含むカ
ルボキシ末端に延長するポリガラクッロナーゼ遺伝子の
一部をコードする。
ファージＰ　Ｉ　ＤＮＡをＥｃｏ’Ｒ１により消化し。
そしてｃＤＮＡ挿人体をＥｃｏＲＩにより消化されたＭ
　１３　Ｂｌｎｅ　５ｃｒｉｂｅ　Ｍｉｎｕｓ　（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）に結合し、　ρＣＧ　Ｎ　１４０１
を得た。
ｐｃＧＮ１４０１をＢａｍＨｆ及びＥｃｏＲＩにより消
化し、１匹ＲＩリンカ−の７個の塩基（ＧＡＡＴＴＣＣ
）　。
ポリガラクツロナーゼ　リーダー配列（ＡＴ）の、２個
の塩基、成熟ポリガラクツロナーゼ　タンパク質のＮ−
末端アミノ酸をコードするトリプシン）　（ＧＧＧ）及
びＢａｍＨ１部位までのさらに２１０個の塩基を含む２
１９ｂｐのフラグメンｌ−（第１図）得た。
このフラグメントを、　　ｍａｓ５’　−ｏｃｓ３’カ
セット。
すなわちｐＣＧＮ４６　　（ＣｏＩｌａｉなど、　Ｎａ
ｔｕｒｅ（１９８３）肚＝７４１〜７４４〕のユニーク
１憇Ｈ１−ＥｃｏＲ［部位に挿入した。これは、　ｍａ
ｓプロモーターへのアンチ−センス（マイナスの方向）
のフラグメントの挿入をもたらし、ｐｃＧＮ４０２を得
た。
次に、　　ｐｃＧＮ１４０２を、制限酵素ＸαＩにより
消化し、そして左及び右のボーダーの間に耐植物カナマ
イシン　マーカーを含む二成分プラスミドｐＣＣ；Ｎ７
８３のユニーク５ａｌｒ部位にりｏ−７Ｌ。
た、Ｅ、コリＣ２１１０中のこのプラスミドを、ポリガ
ラクツロナーゼ　アンチ−゛センスカセント及び耐カナ
マイシン　カセットを植物宿主の遺伝子に転移すること
ができる非武装Ｔｉプラスミドを含むアグロバクテリア
ム　又ムスＬ２工ｌ中に接合した。
使用される　　゛ロバクーＩアム系は、Ａ、：ＬＬスニ
之孟ヱＰＣ２７６０ＣＧ　、　Ｏｏｓｓなど、　　Ｐ　
Ｉａｓｍｉｄ（１９Ｂ２）、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８３
）　３０３　：　　１７９〜１８１　；ヨーロッパ特許
出願第８４−２００２３９．６号、第２４２４１８３号
〕である。
ＣＧＮ７８３の　Ｊ ｐＣＧＮ７８３は、アグロバク″′１アム　ゴＬ人フー
アシエン　オクトピンＴｔ　−プラスミド。
ｐＴｉＡ　６　　（Ｃｕｒｒｉｅｒ　ａｎｄ　　Ｎｅ５
ｔｅｒ　（１９７６）前記〕の左及び右のＴ−ＤＮＡボ
ーダー；　ＩＩＰＨＩＪＩ（Ｈｉｒｓｃｈなど、　Ｐｌ
ａｓｍｉｄ　（１９８４）ユニ　１３９〜１４１）の耐
ゲンタマイシン遺伝子；カリフラワーモザイクウィルス
（ＣａＭＶ）の３５５プロモーター（［；ａｒｄｎｅｒ
など、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　（１９
８１）ｉ　：　１８７１〜１８８０）　　；Ｔｎ５　（
Ｊｏｒｇｅｒｓｅｎ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、（１９７９
）　１７７　：　６５）耐カナマイシン遺伝子；及びｐ
ＴｉＡ６　（Ｃｕｒｒｉｅｒ　ａｎｄＮｅｓ　ｔｅｒ　
（１９７６）前記〕の転写７からのご領域を含む二成分
プラスミドである。ｐＣＧＮ７８３の構成法は第２図に
概略されている。
−ｌン旦」口直り互構戒（二成分ベクター）。
耐ケンタマイシン性マーカー得るために、耐性遺伝子を
、　ｐＰＨＩＪ＋　［：ｌｌ１ｒｓｃｈなど、　１９８
４．　ｆＭｆｌｔＥの３．１ｋｂＥ並Ｒ１−ＰｓｔＩフ
ラグメントから単離し、そしてｐＵ　Ｃ９（Ｖｉｅｉｒ
ａなど、　Ｇｅｎｅ　（１９８２）１９　：　２５９〜
２６８〕中にクローン化し、ｐＣＧＮ５４９を得た。
耐力ゲンタマイシン遺伝子を含むｐＣＧＮ５４９のｌ１
ｉｎｄ−１１１一旦ａｍＨＩフラグメントを、　ｐＣＧ
Ｎ５８７（構成のためには前記を参照のこと）のＩ−ｆ
ｉｎｄｌＩＩ−Ｂｕｎフラグメントと交換し、　　ｐＣ
ＧＮ５９４を得た。
ＯＣＳ　−カナマイシン−０ＣＳフラグメントを含むｐ
ＣＧＮ５９４のＨｉｎｄ　ｍ　−ＢａｍＨＩ領域を。
ｐＵ　Ｃ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ　−Ｐｅｒｒｏｏｎ、　
１９８５＋ｌ）からの」月μＪｕｌ−ＢａｍＨＩポリリ
ンカー領域と交換し。
ｐＣＧＮ７３９を得た。
以下全白 ■６ｃ（７）構成（Ｉ　ＡＴＧ−カナマイシン−ご領域
）。
ｐＣＧＮ５６６は、　　ｐＵｃ１３−ｃｍ　（に、Ｂｕ
ｃｋｌｅｙ＋Ｐｈ、Ｄ、　Ｔｈｅｓｉｓ、　ＵＳ−Ｓａ
ｎ　Ｄｉｅｇｏ、　　１９８５）のＥｃｏＲＩＨｉｎｄ
Ｉ［［部位中に挿入された。ｐＵｃ１８（Ｙａｎｉｓｃ
ｈ　　−Ｐｅｒｒｏｎ＋　ｌ）　　の旦ｃｏＲＩ　−Ｈ
ｉｎｄ■リンカ−を含む。０ＲＦＩ及び２　　ＣＢａｒ
ｋｅｒなど。
（１９８３）　前記）を含むｐＮＷ３１ｃ　−８、２９
−１（Ｔｈｏａ＋ａｓｈｏ−など、　（１９８０）　ｃ
ｅ旦　１９ニア２９）のＨｊｎｄ　ｍ　−ｋＩｆフラグ
メントを、　　ｐＣＧＮ５６６のＨｉｎｄ　ｍ−Ｂａｍ
Ｈ１部位中にサブクローンし。
ρＣＧ　Ｎ７０３を得た。
ｐＴｉＡ６　　（ｐＴｉ１５９５５　　（Ｂａｒｋｅｒ
など、　（１９８３）前記〕の塩基２３９６〜２９２０
に対応する）からの、転写７の３′領域を含むｐｃＧＮ
７０３の一影憇３Ａフラグメントを、　　ｐＵｃ１８　
（Ｙａｎｉｓｃｈ　−Ｐｅｒｒｏｎなど。
（１９８５）　前記）のＢａｍＨＴ部位中にサブクロー
ンし、　　ｐｃＧＮ７０９を得た。
ｐｃＧＮ７０９の一乳並Ｒ１一旦胆Ｉポリリンカー領域
を、耐カナマイシン遺伝子ＣＡＰＨ３’Ｕ）を含む、ｐ
ＣＧＮ５８７　　（製造のためにはＭｊｌを参照のこと
）からのＥｃｏＲｒ　−Ｓｍａ、ｌフラグメントと交換
し、ｐＣＧＮ？２６を得た。
ｐＣＧＮ７２６の１匹Ｒ１−鉦■フラグメント＋　ｐＣ
ＧＮ７３４の几■一旦姐ＲＩフラグメントを、ｐＵｃ８
−　ｐＵｃ１３−ｃｍ　（耐クロラムフェニコール、　
　Ｋ　、　　Ｂ　ｕｃｋｌｅｙ、　ＰｈＤ、ユ１ｅｓｉ
ｓ　　Ｕ　Ｃ−３ａｍ　　Ｄ　ｉｅｇｏ、　１９８５）
のＢａｍＨＩ−５旦１部位中に挿入し、　　ｐＣＧＮ７
３Ｂを得た。ｐＣＧＮ７３４を構成するために、塩基３
３９０〜３２４１に対応する。
ｐＴｉＡ６のＨｉｎｄｍ−鉦１フラグメント（Ｂａｒｋ
ｅｒなど、（１９８３）　旦星〕を、　Ｍ１３　ｍｐ　
１９　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒなど、　（１９８３）　、
　前記）のＨｊｎｄ　ＩＩＩ　−五層ｕ部位中にクロー
ンした。塩！３２８７〜３３００に対応するオリゴヌク
レオチドを用いて、ＤＮＡ合成を、この鋳型から開始す
る。Ｓ１ヌクレアーゼ処理及び）（ｉｎｄ■による消化
の後、得られたフラグメントを。
ｐＵ　Ｃ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ　−Ｐｅｒｒｏｎなど、
　（１９８５）前記〕（７）Ｈｉｎｄ　ｍ　−Ｓｍａ　
Ｉ部位中にクローンした。塩基３２８７〜３３９０　（
Ｂａｒｋｅｒなど、（１９８３）　前記）に対応するそ
の得られたＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　０１フラグメント
を、　　ｐＴｉＡ６　（塩基３３９０〜４４９４に対応
する）のＥ　ｃｏ　ＲＩ−ｕｎＬＩＩ１７ラグメントと
共に、ｐｔＪｃ８（Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ　（１９８２）　前記）　　の旦ｃｏＲ１部位にク
ローンし、　　ｐＣＧＮ７３４を得た。
ｐＣＣ；Ｎ７２６ｃを、　９００ｂｐのＥｃｏＲＩ一旦
ｃｏＲＩフラグメントを欠失することによってｐＣＧＮ
７３８から得た。
ＣＧ　Ｎ７６６ｃの　　（３５ｓプロモーター−ご領域
）。
ＣａＭＶ−３５５プロモーター、ＩＡＴＧ−カナマイシ
ン遺伝子及びｐＴｉＡ６の３ａｍＨ＋フラグメント１９
を含む、　　ｐｃＧＮ１６７　　（構成のためには肚を
参照のこと）のＨｉｎｄ　ｍ　−ＢａｍＨｌフラグメン
トを、　　ｐＵ　Ｃ１９（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒなど、　
（１９８３）％　；　Ｙａｎｉｓｃｈ　−Ｐｅｒｒｏｎ
など、（１９８５）Ｍ３ｊ：Ｌ〕の旦ａｎ＋ＨＩ　−Ｈ
ｉｎｄ　Ｉ１１部位にクローンし、　ｐＣＧＮ９７６を
得た。
ｐＣＧＮ９７６　　（３５Ｓプロモーター）の０．７Ｋ
ｂ）（ｉｎｄＩｌｌ一旦ｃｏＲＩフラグメン・ト及びｐ
ＣＧＮ７０９（転写７　：　３’、構成のためには前記
を参照のこと）の０．５にｂＥｃｏＲＩ　−Ｓａｌ　ｌ
フラグメントをｐＣＧＮ５６６のＨｉｎｄＩＩ［−３旦
■部位に挿入することによって、転写７からの３５３プ
ロモーター及び３′領域を、成長せしめ、ｐ　ＣＧ　Ｎ
　７６６ｃを得た。
ＣＧＮ７８３の′、ハ。
ｐＣＧＮ７６６ｃ　（ＣａＭＶ−３５３プロモーター）
の０、７　ＫｂＨｉｎｄ　ＩＩＩ　−ＥｃｏＲｌフラグ
メントを。
ｐＵｃ１１９　（Ｊ、Ｖｉｅｉｒａ、　Ｒｕｔｇｅｒｓ
　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎ、Ｊ、）のＨｉｎｄ　ｍ　
−Ｓａｌ　ｒ部位中の、ｐＣＧＮ７２６ｃの１．５Ｋｂ
旦匹Ｒに影１１フラグメント（１−＾ＴＧ−ＫＡＮ−３
’領域）に連結し、ｐＣＧＮ７８Ｂを得た。
ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター（１−ＡＴＧ−ＫＡＮ−
３′領域）を含む、ｐＣＧＮ７８８のＨｉｎｄｌＩＩ−
狂■フラグメントの２．２Ｋｂ頒域を、　ｐＣＧＮ７３
９のｐＣＧＮ５８７を次のようにして調製した：Ａ　Ｐ
　Ｉ　３’　Ｕ　ＣＪｏｒｇｅｎｓｅｎなど、　Ｍｏ１
．Ｇｅｎ、（１９７９，）１７７　：　６５）のための
完全な構造遺伝子を含む。
Ｔｎ５のＨｉｎｄ　ＩＩ［−Ｓａｌ　ｌフラグメントは
、Ｓｍａ１部位にすぐ隣接してＥｃｏＲＩ部位が存在す
るので。
該フラグメントをＨｉｎｄ　ｍ−ＥｃｏＲＴフラグメン
ト中に転換しながら、　　ｐＵｃ８　（Ｖｉｅｉｒａ　
ａｎｄＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ（１９８２）１９　
：　２５９　）にクローンされた。次に、ＡＰＨ，３’
ｌｌ遺伝子のご一部分を含むＰｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲｌ
フラグメントを、ｐＵｃ？（ｐＣＧＮ５４６讐）の１匹
Ｒ１部位中に、１匹Ｒ１一旦堕Ｈ１−Σ旦Ｉ−ヱエロリ
ン力−と共に組合せた。この構造体は耐カナマイシンを
付与しないので、ＡＰＨ３’ＩＩ遺伝子の鉦ＩＩ　−Ｐ
　ｓ　Ｅ　ｌフラグメントをＢａｍＨＩ−Ｐ旦１部位（
ｐＣＧ　Ｎ５４６Ｘ）中に挿入することによって、耐カ
ナマイシンを得た。この方法は、ＡＰＨ３’Ｕ遺伝子を
再構成し。
その結果、ＥｃｏＲＩ部位がその遺伝子を端に有する。
ＡＴＧコドンは、ＡＰＨ？■のＡＴＧ開始コドンから上
流に存在し、そして該コドンと読み枠を整合していなか
った。目的とし、ないＡＴＣは。
所望としないＡＴＧが、ＡＰＨ’３’Ｕの５′−末端か
らの５ａｕ３Ａ−Ｐ二ｓｔＩフラグメント　（８亥フラ
グメントは余分なＡＴＧを欠く）を、　　ｐｃ　Ｇ　Ｎ
５Ｎ３４６ＷＢａ　Ｔ　−Ｐｓｔ　１部位に挿入するこ
とによって避けられ、プラスミドｐｃＧＮ５５０が得ら
れた０次に、ＡＰＲご■遺伝子を含む、ｐｃＧＮ５５０
の旦皿Ｒ１フラグメントを、ｐＵｃ８−　ｐＵｃ１３（
Ｋ、　　Ｂｕｃｋｌｅｙ　（１９８５）　前記）のＥｃ
ｏＲ１部位にクローンし、　　ｐｃＧＮ５５１を得た。
次に、ＡＰＩ３’ｌｌ遺伝子を含むＥｃｏＲＩフラグメ
ントのそれぞれを、ｐｃＯＮ’４５１のユニークＥｃｏ
Ｒ１部位発現のためのオクトピンシンテターゼを含む）
に例１に記載しているようにしてクローン化し、　　ｐ
ＣＧＮ５４８　　（２ＡＴＧ）及びｐＣＧＮ５５２　　
（Ｉ　ＡＴＧ）を得た。適切な聞方にｏｃｓ　５″及び
ｏｃｓ　３’を有するプラスミドｐｃＧＮ４５１を、Ｅ
Ｃ０ＲＩにより消化し、そして完全な耐カナマイシン遺
伝子を含むｐ　ＣＧ　Ｎ、５５１からのＥｃｏＲＩフラ
グメントを、ＥｃｏＲ１部位に挿入し、正しい方向に耐
カナマイシン遺伝子を有するｐｃＧＮ５５２を得た。
このｏｃｓ／ＫＡＮ遺伝子を用いて、トランス型の二成
分ベクターｐＣＧＮ５８７のために選択可能なマーカー
を得た。
構成されたオクトビンシンテターゼ　プロモーター　カ
セットの５′部分は、塩基対１５２０８〜１３６４４で
１肚■からのｐＴｉＡ６　Ｄ　Ｎ　Ａからなり（Ｂａｒ
ｋｅｒなど、　（１９８３）前記：’　、そしてまた、
Ｔ−ＤＮＡのトランスファーに関連されたＴ−ＤＮＡ境
界配列（ボーダー）を含む。プラスミドｐＣＧＮ５８７
においては、　　ｐｃＧＮ５５２からのｏｃｓ　／にＡ
Ｎ遺伝子は、右のオーダーもまた選択可能なマーカーを
提供する。初めに、左の境界６１域を、ＭＢｍｐ９中に
Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　−Ｓｍａ　ｒ断片（ｐｃＧＮ５０２
）（塩基対６０２〜２２１２）としてクローンし、そし
てｐＣＧＮ５６５中にニ■一旦並ＲＩフラグメントとし
て再クローンし、ｐｃＧＮ５８０を得た。
ｐＣＧＮ５６５は、　　ｐＵＣ８−Ｃｍに基づくクロー
ニング　ベクターであるが、しかしｐＵｃ、１８リンカ
−を含んでいる。ｐｃＧＮ５８０を、ｌ挫ＨＩにより直
線にし、そしてそれを用いて、ｐＶｃＫ１０２（Ｋｎａ
ｕｆ　ａｎｄ　Ｎｅ５ｔｅｒ、　？ｌａｓｍｉｄ　　（
１９８２）　　８　：　４５）の小さな旦■Ｉフラグメ
ントを交換し、　ｐｃＧＮ５８５を得た。ρＣＧＮ５８
５の小さな５刃」フラグメントとｏｃｓ／ＫＡＮ遺伝子
を含む、　　ｐＣＧＮ５５２からのＸｈｏＩフラグメン
トとを交換することによって。
ｐＣＧＮ５８７を得た。
ρＣＧＮ１６７を構成するために、　　ＣｕＭＶの乃Ｉ
フラグメント（ｂｐ７１４４〜７７３５）　　（Ｇａｒ
ｄｎｅｒなど。
Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８１）　９　
：　２８７１〜２８８８）をＡｌｕｌによる消化によっ
て得、そしてＭ１３　ｍｐ　７（Ｖｉｅｉｒａ、釦匹（
１９８２）　Ｈし２５９〕の…皿■部位にクローンし、
　　Ｃ６１４を得た。　Ｃ６１４の１皿Ｒ１消化物は、
３５Ｓプロモーターを含むＣ６１４からのＥｃｏＲＩフ
ラグメントを産生し、このフラグメントを、　　ｐＵ　
Ｃ８（Ｖｉｅｉｒａなど、　Ｇｅｎｅ　（１９８２）　
１９　：２５９〕中にクローンし、　　ｐｃＧＮ１４６
を得た。
プロモーター領域を切断するために、　且旺１１部位（
ｂｐ７６７０）を、几■及びＢａ１３１により処理し、
そして続いて、丸■リンカ−を、Ｂａ１３１により処理
されたＤＮＡに結合し、　　ｐｃＧＮ１４７を得た。
プロモーター領域、ｉ！沢可能なマーカー（２ＡＴＧを
有するＫＡＮ）及び３′領域を含むｐＣＧＮ１４８ａを
、旦ｄｎによりｐＣＧＮ５２８　　（下記参照のこと）
を消化し、そしてｐｃＧＮ１４７からのＢ　ａｍ　ＨＩ
　−旦■ＩＩプロモーターフラグメントを挿入すること
によって調製した。このフラグメントを、　　ｐＣＧＮ
５２８のｆｉｌＩ［部位にクローンし、その結果、該旦
ｎｕ部位が、ｐＣＧＮ５２８のカナマイシン遺伝子に隣
接した。
この構造体のために使用されたシャトルベクタ＋、ｐＣ
ＧＮ５２８を次のようにして製造した。カナマイシン遺
伝子を含むＴｎ５を含むプラスミド（Ｊｏｒｇｅｎｓｏ
ｎなど、　Ｍｏ１．　　Ｇｅｎ、（１９７９）１７７　
：　６５）をＨｉｎｄ　ｍ　−Ｂ’ａｍＨＩにより消化
し、そしてそのカナマイシン遺伝子を含むＨｉｎｄ　Ｉ
ＩＩ　−ＢａｍＨＩフラグメントを、　　ｐＡＣＹＣ１
８４（Ｃｈａｎｇ　＆　Ｃｏｈｅｎ。
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　（１９７８）　１３４　：
　１１４１〜１１５６）のテトラサイクリン遺伝子のＨ
ｉｎｄｎｌ一旦ａｍＨ１部位に挿入することによって、
ｐＣＧＮ５２５を製造した。
１９９ｆｐＴｉＡ　６　　ＣＴｈｏｍａｓｈｏｗなど、
如旦（１９８０）　１９　ニア２９〜７３９〕　の１憇
Ｈ［フラグメントをｐＣＧＮ５２５のＢａｍＨ１部位に
挿入することによって。
ｐＣＧＮ５２６を製造した。ｐＣＧＮ５２６から小さな
Ｘｈｏｌフラグメントを切断し、Ｘｈｏｌにより消化し
、そして再結合することによって、ρＣＧＮ５２Ｂを製
造した。
ｐＭＢ９Ｋａｎ　ＸＸＩからの旦憇Ｈｌカナマイシン遺
伝子をρＣＧＮ１４８ａのＢａｍＨ１部位にクローンす
ることによって、　　ｐｃＧＮ１４９ａを製造した。
ｐＭＢ９にａｎ　ＸＸＩは、ミッシングをるＸｈｏ１部
位を有するが、しかしアゲロバクー１アム中において効
果的な選択を可能にするために、　Ｔｎ９０３からの機
能的な遺伝子を含むｐＵＣ４に変異体（Ｖｉｅｉｒａ＆
　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ　（１９８２）１９　：
　　２５９　：　２６８　）である。
ｐｃＧＮ１４９ａを、旦■■及び１餅Ｉにより消化した
。このｐｃＧＮ１４９ａの小さな几■−−影吐■フラグ
メントを、ＢａｍＨＩ及び鉦Ｉによる消化によって単離
されたＭｌ　　（下記参照のこと）からのＢ　ａｍ　Ｈ
Ｉ　−鉛’　Ｉフラグメントと交換した。これは、完全
な長さのＣａＭＶプロモーター、ＩＡＴＧ−カナマイシ
ン遺伝子、３′末端及び細菌のＴｎ９０３型カナマイシ
ン遺伝子を含む鋳造体、すなわちｐｃＧＮＩ６７を産生
する。ＭＩは、　　ｐｃＧＮ５５０（ｐＣＧＮ５８７の
構成を参照のこと）からのＥｃｏＲＩフラグメントであ
り、そしてＩＡＴＧ−カナマイシン遺伝子におけるーＰ
ｓｔＩ部位がＭ１３■ｐ９のポリリンカー領域に隣接す
るように。
ＭＩ３　ｎａｐ　９のＥｃｏＲＩクローニング部位にク
ローンされた。
宿主中に発現される遺伝子のｍＲＮＡに相補的な配列の
転写を提供することによって、植物宿主のゲノムにおけ
る遺伝子の発現を調節することが可能であることが上記
結果から明らかである。この場合１種々の過程が変性又
は調節され、特定の生成物の産生の増強、細胞分化及び
発育の変化。
生成物の形成の阻害１表現型の変化又は同様のものが得
られる。アンチ−センス調節の使用は、特定の生成物の
発現の実質的な阻害又は種々の還元度を提供することが
できる。この場合、細胞の表現型は、異質タンパク質の
産生なしに及び特定の遺伝子に対する特別な目標でもっ
て変性され得る。
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的に
いくらか詳細に記載されているけれども。
特許請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる
。
ｐＣＧＮ９７８　ＸＫ　１２を、　１９８６年３月２５
日にＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，に寄託し、そして寄託番号第６７
０６４号を得、そしてｐｃＧＮ１４０１を、　１９８６
年１０月７日にＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，に寄託し、そして寄託
番号第６７２２７号を得た。
【図面の簡単な説明】
第１図は、　　ｐｃＧＮ１４０１からの１匹Ｒ１一旦ザ
ＨＩフラグメントを示す。このフラグメントは。 成熟したポリガラクツロナーゼ　タンパク質のＮ−末端
をコードする領域を含むＰｌの５′一部分に対応する。 下線を引かれたアミノ酸は、ＤＮＡ配列から予測され、
そして精製されたポリガラクツロナーゼから科学的配列
決定によって決定されたアミノ酸配列と一致し；そして 第２図は、二成分ベクターｐＣＧＮ７８３の構成におい
て使用される種々のプラスミドのフローチャートである
。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、植物細胞における遺伝子の発現を調節するための方
    法であって： 前記植物細胞中で機能的なプロモーター、前記細胞中に
    内在性のＲＮＡに相補的な転写された鎖を有する二重鎖
    ＤＮＡ配列及び前記細胞中で機能的な終結領域を含んで
    成る構造体を、前記植物細胞ゲノム中に組込み；そして 前記組込まれた構造体を含む前記植物細胞を増殖し、そ
    れによって、前記相補性鎖を転写し、そして前記細胞中
    において前記内在性ＲＮＡの機能を調節することを含ん
    で成る方法。 ２、前記内在性ＲＮＡがｍＲＮＡである特許請求の範囲
    第１項記載の方法。 ３、前記機能の調節が変えられた表現型特性をもたらす
    特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、植物細胞における遺伝子の発現を調節するための方
    法であって： 前記植物細胞中で機能的なプロモーター、ポリガラクツ
    ロナーゼ遺伝子の転写された部分の少なくとも２０００
    ｂｐを含有し、そして該ポリガラクツロナーゼｍＲＮＡ
    に相補的な転写された鎖を有する二重鎖ＤＮＡ及び前記
    細胞中で機能的な終結領域を含んで成る構造体を、前記
    植物細胞ゲノム中に組込み；そして 前記組込まれた構造体を含む前記植物細胞を増殖し、そ
    れによって、前記相補性鎖を転写し、そして前記植物細
    胞中において前記ポリガラクツロナーゼｍＲＮＡの発現
    を調節することを含んで成る方法。 ５、植物細胞中で機能的なプロモーター、前記細胞中に
    内在性のＲＮＡに相補的な転写された鎖を有する二重鎖
    ＤＮＡ配列及び前記細胞中で機能的な終結領域を含んで
    成る構造体を、前記植物細胞ゲノム中に組込み；そして 前記組込まれた構造体を含む前記植物細胞を増殖し、そ
    れによって、前記相補性鎖を転写し、そして前記細胞中
    において前記内在性ＲＮＡの機能を調節することを含ん
    で成る方法に従って調製された植物細胞。 ６、植物細胞において機能的な転写開始領域、植物細胞
    に内在性のＲＮＡ配列に相補的な配列を転写された鎖と
    して有する二重鎖ＤＮＡ配列及び転写終結領域を含んで
    成るＤＮＡ構造体。 ７、植物細胞中において選択可能なマーカーをコードす
    る配列を含む特許請求の範囲第６項記載のＤＮＡ構造体
    。 ８、原核宿主中において機能的な複製システム及び植物
    細胞において機能的な転写開始領域、植物細胞に内在性
    のＲＮＡ配列に相補的な配列を転写された鎖として有す
    る二重鎖ＤＮＡ配列及び転写終結領域を含んで成るＤＮ
    Ａ構造体を含んで成るプラスミド。 ９、アグロバクテリアム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
    ）中において機能的な複製システム及び少なくとも１つ
    のＴ−ＤＮＡボーダーを含むＤＮＡ構造体を含んで成る
    プラスミド。 １０、植物細胞中で機能的なプロモーター、前記細胞中
    に内在性のＲＮＡに相補的な転写された鎖を有する二重
    鎖ＤＮＡ配列及び前記細胞中で機能的な終結領域を含ん
    で成る構造体を、前記植物細胞ゲノム中に組込み；そし
    て 前記組込まれた構造体を含む前記植物細胞を増殖し、そ
    れによって、前記相補性鎖を転写し、そして前記細胞中
    において前記内在性ＲＮＡの機能を調節することを含ん
    で成る方法に従って調製された細胞に由来された植物。
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