JPH044877A - エンドヌクレアーゼおよびアンチセンス活性を有するｒｎａ、その製造およびその使用 - Google Patents

エンドヌクレアーゼおよびアンチセンス活性を有するｒｎａ、その製造およびその使用

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JPH044877A
JPH044877A JP2288280A JP28828090A JPH044877A JP H044877 A JPH044877 A JP H044877A JP 2288280 A JP2288280 A JP 2288280A JP 28828090 A JP28828090 A JP 28828090A JP H044877 A JPH044877 A JP H044877A
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ヒューベルト、ミュルナー
Rudolf Schneider
ルドルフ、シュナイダー
Eugen Dr Uhlmann
オイゲン、ウールマン
Bernadus Uijtewaal
ベルナドゥス、ウィジテワール
Peter Eckes
ペーター、エッケス
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Hoechst AG
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景コ 適当な条件下で、ＲＮＡ分子は、タンパク質の関与なし
で他のＲＮＡ分子上の反応を触媒することまたは自触媒
作用的にそれら自身の分子からフラグメントを切断する
ことができる。したがって、４１３個のヌクレオチドを
有するイントロンは、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔ
ｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　Ｉａ）の２
３Ｓ　　ｒＲＮＡの３９末端から自触媒作用的に除去さ
れ、環型へ変換される。これは、グアノシン補因子が関
与する多くのフォスフオニステル転移反応によって起き
る（Ｃｅｃｈ、　Ｔ。
Ｒ，：　Ｎａｔａｕｒｅ　３Ｄ、５７Ｂ−５８３，１９
８３）。ＲＮＡ基質または選択される反応条件によって
、イントロンは特異的リボヌクレアーゼ、ターミナルト
ランスフェラーゼ、フォスフオドランスフェラーゼまた
は酸フォスファターゼとして機能することができる。
これに関連して、ＲＮＡ分子はそれ自身を変化させるこ
となくいくつかの反応を行うことができ、この点で、酵
素のように挙動する。この理由のために、これらの性質
を有するＲＮＡ分子にリボザイム（ｒ　ｉ　ｂｏｚｙｍ
ｅ）という用語が付された。
タンパク質の関与しない同様の反応は、いくつかのウィ
ロイドＲＮＡおよびサテライトＲＮＡて示すことも可能
である。したがって、自己プロセシング（ｓｅｌｆ−ｐ
ｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）は、アボカド日シミ（５ｕｎｂｌ
ｏｔｃｈ）ウィロイド（ＡＳ　Ｂ　Ｖ）（Ｈｕｔｃｈｉ
ｎｓ、　Ｃ，Ｊ、ら：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、　１１゜３６２７−３６４０．１９８６）、タ
バコ輪斑（ｒ　ｉ　ｎｇｓｐｏ　ｔ）ウイルスノサテラ
イトＲＮＡ　（ｓＴｏｂＲＶ）（Ｐｒｏｄｙ、　Ｇ、Ａ
、ら：　５ｃｉｅｎｃｅΣ■、１５７７−１５８０．１
９８６）およびルセルネー時線条ウィルス（Ｉｕｃｅｒ
ｎｅｔｒａｎｓｉｅｎｔ　５ｔｒｅａｋ　Ｖｉｒｕｓ）
のサテライトＲＮＡ（ｓ　Ｌ　Ｔ　Ｓ　Ｖ　）　（Ｆｏ
ｒｓｔｅｒ、　Ａ、Ｃ，ら：　Ｃｅｌ＋　［，２１１−
２２０，１９８７）の増殖のために必須の反応のよって
ある。これらＲＮＡの複製中に、鋳型として延長部分を
有するＲＮＡの合成を導く環型がおそらく形成される。
これら転写物は、自触媒作用的なエンドヌクレアーゼ的
（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）反応によって正し
いゲノムの長さに切断される。
これらの反応のためとおそらく考えられるＲＮＡの構造
はハンマー頭（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄｓ）（Ｆｏｒｓｔ
ｅｒ、　Ａ、Ｃ，ら：　Ｃｅ１ｌ　１１５１．２＋１−
２２０．１９８７、Ｈａｓｅｌｏｆｆ、Ｊ、ら：　Ｎａ
ｔｕｒｅ　３ｉ１．５８５−５９１、＋９８８）と記述
されている。
プロセシングが起こり得るために、これらＲＮＡ酵素の
切断部位は特異的で、ある構造的特徴を有していなけれ
はならない。
アンチセンスＲＮＡに連結されたりボサイムをコードす
るＤＮＡを含むヘクターを用いて所望の任意の生物の宿
主細胞を形質転換することが可能で、それによって該Ｒ
ＮＡを発現することができることが、いま見出された。
アンチセンスＲＮＡが、多くの原核および真核細胞、と
りわけ植物細胞、においても遺伝子発現を阻害すること
が知られている（Ｇｒｅｅｎ、　Ｐ、ら：Ａｎｎ、　Ｒ
ｅｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５５．５６９．１９８６）
。阻害の機序のほとんどはまだ明かではない。真核生物
系ではｍ　ＲＮ　Ａの細胞質への輸送を妨げる二本鎖Ｒ
ＮＡが形成されることが考えられる。
Ｒｅｚａｉａｎら（Ｒｅｚａｉａｎ、　Ｍ、　　ら：　
Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　　Ｂ＋ｏｌ。
■、４６３．１９８Ｂ）は、例えは、アンチセンスＲＮ
Ａのキュウリモザイクウィルス（ＣＭＶ）に対する抗ウ
ィルス剤としての使用の可能性を調べた。しかし、著者
らは、アンチセンスＲＮＡの抗ウィルス活性は不十分で
あったことを観察した。
［発明の概要］ しかしながら、ループ（後記の図式を参照されたい）中
の適当なりボザイムＲＮＡの適当なアンチセンスＲＮＡ
との連結は、いま、Ｒｅｚａｉａｎが示し得たよりもよ
り効果的なウィルス抵抗性をもたらす。ＲＮＡ分子のそ
のような連結は、したがって、形質転換された生物にお
いて、基質に向けられた高められた活性を植物における
抗ウィルス剤としての活性に関してだけてなく一般にも
もたらす。
したがって、本発明は次のことに関する。
１、　アンチセンスＲＮＡ配列と連結させたループ中の
リボザイムＲＮＡ配列をコートする遺伝子。
２、　１で定義した遺伝子を含む宿主細胞。
３、　宿主細胞における、基質に向けられた作用物とし
ての、１て定義した遺伝子によってコートされるＲＮＡ
の使用。
［発明の詳細な説明コ 本発明は、特にその好ましい態様において、以下に詳細
に記述される。本発明はまた特許請求の範囲に定義され
る通りである。
リボザイム／アンチセンスＲＮＡは、基質、例えば、選
択可能マーカー遺伝子（抗生物質耐性）をコードするＲ
ＮＡまたは所望の任意の細胞機能、例えばジヒドロフオ
レートレダクターゼ、チミシンキナーセ、成熟酵素ポリ
力うクツロナーゼ、ペクチンエステラーゼ等、分化およ
び発達に関与するタンパク質またはホルモン受容体なと
を、コー卜するＲＮＡのような基質に対して向けること
ができる。特に、植物に有害な型のウィルスに対して、
本発明による系によって有利に抵抗することができる。
この目的のために、例えは、次に記述するような方法が
用いられる。他の基質に向けられたリボザイム／アンチ
センスＲＮＡもまた同様の方法で構築され得る。
リボザイム部分を、阻害されるべき基質のＲＮＡ配列を
基にして合成することができる。基質がウィルスである
場合には、このＲＮＡ配列はＲＮＡウィルスのゲノムか
ＤＮＡウィルスのＤＮＡ配列に由来するＲＮＡ配列であ
る。したがって、基本として、植物に有害ないかなるウ
ィルスをも用いることができる。好ましい型のウィルス
としては、病原性ウィルス、特に、キュウリモザイクウ
ィルス、ブロウム（ｂｒｏｍｅ）モザイクウィルス、ア
ルファルファモザイクウィルス、タバコモザイクウィル
ス、ポテトウィルスＸまたはＹ、トマト軸回ウィルス、
トマトアスペルミ（ａｓｐｅｒｍｙ）ウィルスまたはタ
バコラドル（ｒａｔｔｌｅ）ウィルスがあけられる。特
に、Ｒｅｚａｉａｎら（Ｒｅｚａｉａｎ、門、ら：　　
Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｃ）＋ｅｍ、　１卸、３３
１１９８５、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１３
．２７７．１９８４）およびＧｏｕ　Ｉ　ｄら（Ｇｏｕ
ｌｄ、　Ｊ、ら：　Ｅｕｒ、　Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１２ｆｉ、２１７．１’　９８２　
）によって公表されている配列に対応する、キュウリモ
ザイクウィルスのＲＮＡ配列ＲＮＡＩ、ＲＮＡ２および
／またはＲＮＡ３またはそれらの一部を鋳型として用い
る。
合成のためには、少なくとも１０個の連続したヌクレオ
チド、特に１４〜２０個のヌクレオチド、有利には適当
なウィルスのＲＮＡ配列の中間部から選択したものが好
ましい。
リホザイムをコートするオリゴヌクレオチドは、各々少
なくとも５ヌクレオチド、有利には７〜１０個のヌクレ
オチＦからなる最初のおよび末端の配列が、阻害される
べきウィルスのＲＮＡに相補的になるように合成される
。中間配列は、一部はりボザイムの機能性のために予め
決定した特定のヌクレオチドからなり、また一部は可変
的ヌクレオチドからなる。
対応する方法は、アンチセンスＲＮＡの調整に用いられ
るが、オリゴヌクレオチドは適当なアンチセンスの位置
方向においてＲＮＡをコートするように合成される。
リボザイムオリゴヌクレオチドは、ループ中の適当なリ
ンカ−とともに提供される。この種のリンカ−は、例え
ば、ＥｃｏＲＩ、５ａｉｌ、ＢａｍＨＬ　Ｈｉ　ｎｄｍ
、ＥｃｏＲＶ、Ｓｍａｌ。
Ｘｈｏ　Ｉ、Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ、好ましくはＸｂａｌまた
はＰｓｔＩ、の切断部位を有する。次いで、合成された
りボザイムオリゴヌクレオチドを、これらリンカ−を介
してリボザイムルーブ中のアンチセンスＲＮＡをコード
するオリゴヌクレオチドに連結させる。
基質ＲＮＡとハイブリダイズさせたりホブイム／アンチ
センスＲＮＡ系は、次のように図式的に示すことができ
る。
基質ＲＮＡ ここで、 Ｎは、基質ＲＮＡのヌクレオチド、Ａ、Ｃ，ＣまたはＴ
てあり、 Ｋは、リボザイム中のＮに相補的なヌクレオチドであり
、 ■は、リボザイム中の可変的なヌクレオチドであり、 ■Ｌは、リボザイムのループ中の可変的なヌクレオチド
である。ｖＬヌクレオチドの数は、０〜５５０でよい。
ｖＬヌクレオチドは、その配列を挿入し得る切断部位が
ＤＮＡレベルで生産されるように選択される。
組み立てられたオリゴヌクレオチドを、ベクタ−ｐ　Ｕ
Ｃ１９、ｐＵｃ１８またはｐ　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　）ｌｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、　
Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いてク
ローニングしてから、配列決定をする。
確認されたオリゴヌクレオチドを、植物プロモーターを
有する介在ベクターにクローニングする。
このタイプのベクターの例としては、プラスミド゛ｐ　
Ｐ　ＣＶ　７０１　（Ｖｅｌｔｅｎ、　Ｊ−ら：　ＥＭ
ＢＯｊ、　３．２７２３−２７３０．１９８４）、ｐ　
Ｎ　ＣＮ　（Ｆｒｏｍｍ、　Ｈ，ｌ”ｌ　：ＰＮＡＳ　
ａ２．５８２４−５８２６．１９８５）マタはｐＮＯｓ
（Ａｎ、　Ｇ、　ら：　ＥＭＢＯ、Ｊ、　４．２７７−
２７６．１９８５）なと力Ｓあげられる。３５Ｓプロモ
ーターを有するベクタ−ｐ　Ｄ　Ｈ５１（Ｐｉｅｔｒｚ
ａｋ、　Ｍ、ら：　ＮＡＲ１４，５８５７，１９８６）
が好ましく用いられる。
続いての、例えば大腸菌ＭＣ１０６１、ＤＨＩ、ＤＫＩ
、０Ｍ４８またハＸ　Ｌ　−１すどの、大腸菌の形質転
換の後、陽性のクローンを、プラスミドミニ調製および
適当な制限酵素による切断なとの既知の方法（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら：　Ｌａｂ、　Ｍａｎｕａｌ）によって同定
する。
これら陽性クローンを、次いて、バイナリ−植物ベクタ
ーにサブクローニングする。植物ベクターとして、ｐ　
Ｇ　Ｖ　３８５０　（Ｚａｍｂｒｙｓｋ、　Ｐ、　　ら
：ＥＭＢＯＪ、　２．２１４３−２１５０．１９８３）
またはｐ　０ＣＡ１　Ｂ　（Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ、Ｎ、
：　’ＪＡＲｌｆｉ、１０７６５−１０７８２．１９８
８　）を用いることができる。ｐＯｃＡｌＢが有利に用
いられる。
Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａにおけるリホサイム生産のための付加
したＤＮＡフラグメントを有している植物プロモーター
を含んでなる得られたバイナリ−植物ベクターを、植物
の形質転換に用いる。これはエレクトロポレーションま
たはマイクロインジェクション等の技術を用いて行うこ
とができる。
好ましくは、プロトプラストの共培ｔｊ（ｃ。
ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）またはアクロバクテリアを用
いての葉片の形質転換を用いる。この目的のために、植
物ベクター構築物を、精製ＤＮＡによるまたは大腸菌Ｓ
　Ｍ　１０　（Ｓｉｍｏｎ　Ｒ，ら：　Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ　ｌ。
７８４−７９１．１９８３）なとのヘルパー株を介して
の形質転換によって、Ｔｉプラスミドを有するＡ　２８
２のようなアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ
ｇｒｏｂａｋｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）
中にトリペアレント交配（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ　ｍ
ａｔ、ｉｎｇ）を介して転移させる。直接的形質転換お
よびトリペアレント交配を、ｒＰＩａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ＭａｎｕａｌＪ　　（Ｋｌ
ｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　
Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、　１９８８）に記載のようにして
行った。
基本的に、本発明によって構築されるＤＮＡを有するバ
イナリ−植物ベクターによって全ての植物を形質転換さ
せることが可能である。双子葉植物、特に有用植物、例
えば澱粉、その他の炭水化物、タンパク質または脂質を
それらの器官に有用量に産生または貯蔵するもの、また
は果実および野菜を産生ずるもの、または香辛料、繊維
および実用的に有用な産生物または薬物、染料または蝋
を提供するもの、およびさらに家畜用植物などがあげら
れる。トマト、イチゴ、アボカド、および、例えばパパ
イヤ、マンゴ−などの熱帯産果実、さらにナシ、リンゴ
、ネクタリン、アンスまたはモモなどを例にあげること
ができよう。さらに、形質転換さるべき植物の例として
、全てのタイプの穀物、カブラ（ｔｕｒｎｉｐ　ｒａｐ
ｅ）　、西、洋アブラナ（ｒａｐｅ）、イモ類、大豆、
綿花、トウモロコシ、甜菜またはヒマワリなどをあげる
ことができよう。
形質転換された細胞を、選択培地を用いて選択して、カ
ルスにまで培養して、適当な培地（Ｓｈａｉｎら：　Ｔ
ｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　Ｑ、？７０−
７７０．１９８６、Ｍａｓｓｏｎ、　Ｊ−ら：　Ｐｌａ
ｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　５２、＋６７−１７６．１９８
７、Ｚｈａｎら：　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、
　ｋｌ、５５１−５５９．１９８８、ＭｃＧｒａｎａｈ
ａｍら：　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｅｌ、８０
〇−８０４，１９８８、Ｎｏｖｒａｔｅら：　Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１．１５４−１５９．１９８９
）上で植物体に再生させる。
得られる植物体は、構築されたオリゴヌクレオチドを用
いて、対応するＲＮＡが細胞中で発現されるように形質
転換させることによって変えられ、リボザイムＲＮＡを
［アンチセンスＪ　ＲＮＡとともにウィルスＲＮＡに対
して活性にすることか可能である。
以下の諸例によって、本発明はさらに説明される。
特に記載がなけれは、百分率は重量パーセントである。
１、　　ＲＮＡの発現のためのＤＮＡの合成リボザイム
のためのヌクレオチドの合成を、ＣＭＶ　ＲＮＡＩ配列
、５′末端にＸｂａＩリンカ−をおよび３′末端にＰｓ
ｔＩリンカ−を備えた位置３２４Ｂ−３２６４（Ｒｅｚ
ａｉａｎ　Ｍ、ら：　Ｅｕｒ。
Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｌｉＱ、　３３１−３３９．
１９８５）に基づいて行った。定常領域はりボザイムの
ために付記した図式から明かである。
ループの可変部分に５ａｌＩ部位を有するリボザイムの
発現のためのＤＮＡ： ５’−ＣＴＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴ
ＣＧＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＡＡＣＡＡＣＣＴＴＣＴＣＣ
Ａ−３ＴＣＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＴＡＣＴＣＡＧＣＡＧ
ＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＧＴＴＧＧＡＡＧまたは、 ５’−ＣＴＡＣ；ＡＴττＣＡＡＣＣ；ＧＴＡＣ；ＣＴ
ＣＣＴＧＡＴＧＡＣ；ＴＣＧＴＣ３’　　　　　ＴＡＡ
ＡにＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＴＡＣＴＣＡＧＧＡ
ＧＧＡＣＣ，ＡＣＧ八八へへＡＡＣＣＴＴＧＴＡＣ；Ｇ
ＡＴＧＴＣＴＧＣＡ−３’ＣＴＣ；ＣＴＧＣＴＴＴＧＴ
ＴＧＧ八八ＣＡＴＣＣＴＡＣＡへへ　　　　−５’アン
チセンスＲＮＡのためのヌクレオチドの合成を、５′末
端にＸｂａ　Ｉリンカ−を有し、３′末端にＰｓｔｌリ
ンカ−を有し、クローニングのための５ａ１１部位を作
出するためにこれらを埋填した、位置２１７９から２１
９３までのＣＭ　■ＲＮＡ４配列（Ｇｏｕｌｄ　１．ら
：　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ−皿、２１？−２
６，１９Ｂ２）に基づいて行った。
アンチセンスＲＮＡの生産のためのＤＮＡ：Ｓ’−ＣＴ
ＡＣＡＴＣＣ；ＴＣＴＣＣＴＴＡＴｆｌ；Ｃ；ＡにＡＡ
ＣＣＴＧＴｃＣＡＡＡＡｃＣＡＣＡＣ；ＣＴにＣＡ−３
’ＴＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＴＣＴＴＣ；ＧＡＣ
ＡＣＣＴＴＴＴＣ；Ｃ；ＴＣ；ＴＣＧまたは ５′−丁ＣＧＡＣＡＴ（１；Ｃ；ＴＣＴＣＣＴｒＡＴＧ
Ｃ；ＡＧＡＡＣＣＴＣ；ＴにＧＡＡＡＡＣＣＡＣＡにＣ
Ｇ−３’ＲＧ　ＣＴ　ＧＴＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡＴＡＣ
ＣＴＣＴＴＣ；ＧＡＣＡＣＣＴＴＴＴにＧＴＣ；ＴＣ（
１；ＣＡにＣ丁−５′２　、　　ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐ
ｔｓ　Ｋ十におけるクローニングおよび配列決定 プラスミドｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔｓ　Ｋ　＋（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ。
Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を、特定の
酵素で開環し、仔つシ腸管ホスファターセ（ＣＩＰ）で
処理した後に、５倍過剰の二本鎖燐酸化オリゴヌクレオ
チドと連結した。イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰ
ＴＣ；）を用いての誘導の後、ＸＬ−ブルー株（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）中の陽性クローンを、５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ
−ｇａｌ）を含むプレート上で白色コロニーとして同定
することが可能であった。
各々の場合、５個のコロニーを単離して、挿入されたオ
リゴヌクレオチドの位置方向を決定するためにジデオキ
シ法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ）によって配列決定した。
３、　　　ｐＤＨ５１におけるクローニングプラスミド
ｐＤＨ５１は、Ｐｉｅｔｒｚａｋら（Ｐｉｅｔｒｚａｋ
、　Ｍ、ら：　ＮＡＲＬＡ、　５８５７−５８６８．１
９８６）によって再現できるように記述されている。
１％低融解アガロースゲル中での断片分画の後にオリゴ
ヌクレオチＦ’　Ｄ　Ｎ　Ａを単離し得るために、オリ
ゴヌクレオチドを含むプラスミド ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｓ　Ｋ＋をＸｂａ　Ｉおよび
Ｐｓｔｌで消化した。
単離したオリゴヌクレオチドをｐ、ＤＨ５１のＸｂａ／
Ｐｓｔ部位に５倍過剰にして鞘み込んだ。
陽性クローンを、大腸菌Ｍ０１０６１細胞を形質転換さ
せてコロニーをニトロセルロースフィルターに移した後
に３２　ｐ−標識オリゴヌクレオチドＤＮＡとハイブリ
ダイズさせてからフィルターをＳ　ＳＣ（１）Ｉ　ＸＳ
　５Ｃ１２）０．ｌＸ５ＳＣ１３）０、ｌＸ５ＳＣ２各
：３０分間）で６５℃で洗浄することによって、検出す
ることが可能であった。
アンチセンスオリゴヌクレオチドＤＮＡの合成のための
ＤＮＡ配列を、ヘクターにクローニングし・て新たに作
出した５ａｌｌ切断部位を介して、このようにして作成
した。
大腸菌ＭＣ１０６］細胞の形質転換の後に、コロニーを
ニトロセルロースフィルターに画線して、適当なｐＢＩ
ｕｅｓｃｒｉｐｔｓ　Ｋ十から単離した３２　ｐ−標識
オリゴヌクレオチ）：’　Ｄ　Ｎ　Ａとともに一晩ハイ
フリダイスさせた。上記のようにフィルターを洗浄した
。陽性クローンをオートラジオクラフィーによって同定
した。
４、　　　ｐＯｃＡ１８におけるクローニングプラスミ
ドｐＯｃＡ１８は、Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉら（Ｏｌｓｚｅ
ｗｓｋｉ、Ｎ、ら：　’ＪＡＲ１６，１０７６５−１０
７８２，１９８８）によって再現できるように記述され
ている。
３５Ｓプロモーターの後にオリゴヌクレオチドを有する
ｐＤＨ５１からの約ｉ、ｏｋｂの長さのＥｃｏＲＩ断片
を、ＣｓＣ１勾配上で単離して、ＥｃｏＲＩ消化から得
られた０、８ｋｂの断片をｐＯｃＡｌＢのＥｃｏＲＩ切
断部位に組み入れた。
陽性クローンを、ＤＮＡ調製および続いてのＥｃｏＲＩ
工程によって同定した。
５、７グロバクテリアの形質転換 ３５Ｓプロモーター／オリゴヌクレオチド挿入物を含む
ベクターｐＯｃＡ１Ｂを、アゲロバクチリアＡ２８２株
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、　西ドイ
ツまたはＡＴＣＣ３７３４９、ＩＪｓＡ　）中りこ移し
た。これは、大ＨＭＳＭＩＯ株（Ｓｉｍｏｎ、Ｒ９ら：
　Ｂｉｏ／ＴｅｃｈｎｏｌｏｇＹ　Ｌ、７８４−７９１
．１９８３）を用いるトリペアレント交配によって行っ
た。この目的のために、等量のＩＩＭをともにフィルタ
ー上に一装置いて、２８℃でインキュへ−１−Ｌ、て、
フィルターを２ｍｌの１０　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａで
すすいて、陽性りａ−ンを選択するためにその等分部分
をテトラサイクリンおよびリファンピシンを含む酵母抽
出物（ＹＥＢ：１％酵母エキス、１％ペプトン、０．５
％Ｎ　ａ　Ｃ１）上に置いた。続いて、ニトロセルロー
ス膜上に移しておいたコロニーを放射性標識したオリゴ
ヌクレオチドＤＮＡとハイプリダイスさせることによっ
て、陽性クローンの存在か再び示された。
６、　　タバコの形質転換 アクロバクテリアを、テトラサイクリンおよびリファン
ピシンを含むＹＥＢ培地中で増殖させて、２０ｍ１の細
菌を遠心分離して、ＹＥＢ培地中で１回洗浄して、２０
ｍ１の１０　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏを中に懸濁させて、
ペトリ皿に置いた。植物材料は、タバコ、ライスコンシ
ン（Ｎｉｃｏｔ、１ａｎａ　ｔａｂａｃｕｍＳＷｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ）３８を用いた。植物体を滅菌条件下で２Ｍ
Ｓ培地（Ｍｕｒａｓ＋＋ｉ３ｅ、、Ｔ、ら：　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ　Ｌ５．４７３−４９７．１９６
２）上で２５℃で１日１６時間光を当てて４週間培養し
ておいた。これら植物体からＩＣ＋Ｔ１２の葉片を切り
出して、滅菌したエメリーペーパーて傷つけて、−吟＊
菌培養物中に３０秒間浸漬させた。
葉片を、上記の２ＭＳの場合と同様にしてＭＳ培地上に
２５℃で２日間保持して、次いて液体２ＭＳ培地を用い
て洗浄した。葉片を、次いて、カナマイシンを含むＭＳ
Ｃ１０プレート（１，５％の寒天を含むＭＳ培地）上に
置いた。５〜６週間後、再生した植物体をより大きな容
器に移植することが可能であって、そこでそれらは２〜
３週間後に根を形成した。
トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎ　ｉ　ｃ）植物
対における所望のＲＮＡの発現を、ゲル（２，２Ｍホル
ムアルデヒドを含む１％アガロースゲル）中で分画して
おいた全ＲＮＡ（１０μｇ）のニトロセルロースフィル
ターへの移動および続いての放射性活性オリゴヌクレオ
チドＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって検出し
た。
７、　形質転換の検出 ＤＮＡを約８週経過の形質転換タバコ植物体から標準法
（Ｍａｎｉａｔｉｓら：　Ｌａｂ、　Ｊｏｕｒｎａｌ）
によって？Ｉ／Ｌ離して、ＥｃｏＲＩで切断して、１０
μ８のＤＮＡをニトロセルロース膜に各々、移して、３
２　ｐ−標識したオリゴヌクレオチドＤＮＡとハイブリ
ダイズさせた。トランスジェニック植物体のＤＮＡにお
ける所望の配列の組み込みは、特徴的なＥｃｏＲＩＤＮ
Ａとのハイブリダイゼーションによって検出可能であっ
た。
８、　　ＲＮＡ発現の検出 上記のタバコ植物体からの第二の葉片試料からＲＮＡを
単離して、ホルムアルデヒドゲルからニトロセルロース
へ移して、上記のようにハイブリダイズさせた。期待さ
れる大きさを示すハントを検出することが可能であった
。
９、多機能性ＲＮ　Ａのインビトロ活性の検出反応混合
物（Ｓｔｒａｔａ３ｅｎｅ、　Ｐｒｏｄｕｃｔｎｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ＳＫ＋）においてＴ３またはＴ
７ボリメラーセを加えることによって、挿入した全オリ
ゴを含むｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔｓ　Ｋ＋クローンから
ＲＮＡを産生させて、単離した。このＲＮ　Ａと３２　
ｐ−標識ＣＭＶ　　ＲＮＡとのハイブリダイゼーシ、ｉ
シここよって、ウィルスＲＮ　Ａの切断が４くされた。
１０．　　ＣＭＶＱ株むＪよる感染 約８Ａ経過のタバコ植物体を、カーボランダムを用いて
、ＣＭ　ＶＯ２株（Ｒｅｚａｉａｎ、　Ｍ、ら：　Ｅｕ
ｒ。
ｊ、　Ｒ＋ｏｃｈｅｍ、　Ｌ５ｆｆｌ、３３１．１９８
５および〕］、３．２７７．１　！、１８４、Ｇｏｕｌ
ｄＪ、ら：　Ｅｕｒ、　ｊ。Ｂｉｏｅｈｅｍ、　１２ｆ
ｉ、２１７、＋９８２）て感染さゼ、た。月曜植物体は
、１２＝１５日後ζこ顕著な症状を呈した。これら植物
体からウィルス粒子を検出することが可能であった。ト
ランスジェニック植物体は、種々の程度にウィルスζこ
対して抵抗性であることが証明された。
表二表記日数経過後に顕著な症状を呈する感染植物体の
百分率（各クローンそれぞれ１０個の植物体を一緒ζこ
感染させて評価１）た） １２日 ２０１］

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、アンチセンスＲＮＡ配列に連結された ループ中のリボザイムＲＮＡ配列をコードする遺伝子。 ２、コードされるＲＮＡがウィルスＲＮＡ に相補的である、請求項１に記載の遺伝子。 ３、請求項１または２に記載の遺伝子によ ってコードされる、ＲＮＡ。 ４、請求項１または２に記載の遺伝子を含 む、宿主細胞。 ５、請求項３に記載のＲＮＡを含む、宿主 細胞。 ６、請求項１または２に記載の遺伝子を含 む、植物体、植物細胞および植物体の部分または種子。 ７、請求項３に記載のＲＮＡを含む、植物 体、植物細胞および植物体の部分または種子。 ８、請求項１に記載の遺伝子によつてコー ドされるＲＮＡの、宿主細胞における、基質に対する作
    用物としての使用。 ９、請求項２に記載の遺伝子によってコー ドされるＲＮＡの、抗ウィルス剤としての使用。
JP2288280A 1989-10-25 1990-10-25 エンドヌクレアーゼおよびアンチセンス活性を有するｒｎａ、その製造およびその使用 Pending JPH044877A (ja)

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DE3935473.3 1989-10-25

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