JP2001513647A - 植物の生物量を調節するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物の生物量を調節する方法に関し、この方法は、内因性植物シンナモイルCoA還元酵素遺伝子(CCR)の生成または機能を調節するDNAを、上記植物のゲノムへ組込む工程を含む。CCR遺伝子は、植物におけるリグニンの生成に関与する。その調節は、センスまたはアンチセンスのダウンレギュレーションまたはコサプレッションを介したジーンサイレンシングにより得られ得る。

Description

【発明の詳細な説明】 植物の生物量を調節するための方法 本発明は、植物の生物量を調節する方法に関する。 生物量は、生物学的材料の直接的または間接的な蓄積と定義される。これは、 デンプン、油、セルロース、および他の材料に影響を及ぼし得、そして物質の総 蓄積を含む。植物種において、セルロースは総生物量の高い割合を占め、そして リグニンに密接に連結される。植物におけるシンナモイル(cinnamoyl)CoA還元酵 素（CCR）は、リグニン生合成経路の第１の還元工程（ヒドロキシシンナモイルC oAエステル（p-クマロイル-CoA、フェルロイル-CoA、およびシナポイル-CoA）の それらの対応するアルデヒドへの変換）を触媒する。これは、リグニン前駆体合 成専門の第１の酵素である。リグニンは、植物二次細胞壁の構造的完全性を防水 し、補強し、そして維持する、複雑な芳香族生体高分子である（Boudetら、1995 ）。リグニンは植物の構造および発達に役割を有し、そして陸性生物量の主要な 成分を示し、そして大きな経済的および生態学的重要性を有すると考えられる（ Brown,1985,Journal of Applied Biochem.7.371-387頁）。特定の飼料作物の生 物量を利用する場合、リグニンは、消化率および栄養摂取収率に関する制限因子 である。反芻動物による飼料作物の消化率は、植物のリグニンレベルに反比例す ることが明らかに証明されている（Cherneyら、1991）。 内因性遺伝子の発現を抑制する２つの主な方法が知られる。これらは、「アン チセンスダウンレギュレーション」および「センスダウンレギュレーション」す なわち「コサプレッション」と当該分野で呼ばれる。これらの方法の両方は、標 的遺伝子発現の阻害（しばしば、「ジーンサイレンシング」と呼ばれる）を導き 得る。これに加えて、過剰発現は、選択された遺伝子の１つ以上の余分なコピー の挿入により達成され得る。他のより少なく使用される方法は、挿入される遺伝 子のより大きなまたはより小さな発現を達成するための、遺伝子制御エレメント （プロモーターおよび制御配列）の改変を含む。アンチセンスダウンレギュレー ションにおいて、標的遺伝子の全てまたは一部に相補的なDNAは、逆方向でおよ びその翻訳開始シグナルを伴わないでゲノムに挿入される。最も単純な理論は、 このようなアンチセンス遺伝子（転写可能であるが、翻訳可能でない）が、内因 性遺伝子から転写されるmRNA産物に配列が相補的なメッセンジャーRNA(mRNA)を 生成することである。次いで、そのアンチセンスmRNAは、天然に生成された「セ ンス」mRNAと結合して、天然mRNAのタンパク質への翻訳を阻害する２重鎖を形成 する。挿入されるアンチセンス遺伝子は、長さが内因性遺伝子配列に等しい必要 はなく、フラグメントが十分である。フラグメントの大きさは、特に重要である と思われない。40程度のヌクレオチドと同じくらい小さなフラグメントは、効果 的であると報告されている。一般的に、50ヌクレオチド領域くらいが、阻害効果 を得るのに十分であると認められる。しかし、より少ないヌクレオチドは非常に 良く働き得ると言われなければならず：完全長の同等物までのより大きな数は確 実に働く。50ヌクレオチド下流くらいに便利な制限酵素切断部位がある、フラグ メント長を単に使用することが通例である。遺伝子のフラグメントのみが必要と されることは、遺伝子の全てを配列決定する必要があるとは限らないことを意味 する。これはまた、一般的に、cDNAが十分であり、完全なゲノム配列を単離する 必要性を除くことを意味する。しかし、イントロン配列もまたジーンサイレンシ ングベクターの構築に必要とされ得る場合、ゲノム配列が所望され得る場合があ る。 アンチセンスフラグメントは、標的遺伝子の内因性相補鎖と正確に同じである 必要はない。標的遺伝子の阻害を達成するのに十分な配列類似性が単に存在しな ければならない。これは、別の種において効果的である、１つの種に由来する配 列の使用を可能にし、そして目的の個々の種それぞれに対するアンチセンスベク ターを構築する必要性を除くので、アンチセンス技術の重要な特色である。１つ の種から単離された配列は別の種において効果的であり得るが、例外を見出すこ とはよくあり、この場合、一方の種と他方の種との間の配列類似性の程度は得ら れる効果に不十分である。このような場合において、種特異的ホモログを単離す ることが必要であり得る。 アンチセンスダウンレギュレーション技術は、当該分野で十分に確立されてい る。これは、いくつかの教科書および多くの何百の雑誌刊行物の主題であった。 主な特許参考文献は、Calgene Inc.の名における欧州特許第240,208号である。 アンチセンス技術の有効性を疑う理由はない。これは、十分に確立され、世界中 の研究室において日常的に使用され、そして使用される製品は売り出されている 。 過剰発現およびダウンレギュレーションの両方は、「センス」技術により達成 され得る。標的遺伝子の完全長コピーがゲノムに挿入されれば、ある範囲の表現 型が得られ、いくつかは標的遺伝子を「過剰発現」し、いくつかは「過小発現」 する。次いで、この方法により作製された植物集団はスクリーニングされ得、そ して個々の表現型が単離され得る。 アンチセンスを用いた場合、挿入される配列は、翻訳開始シグナルが欠けてい る。アンチセンスとの別の類似点は、挿入される配列が完全長コピーである必要 はないことである。確かに、過剰発現表現型および過小発現表現型の分布は、過 小発現の方に曲げられることが見出されており、そしてこれは遺伝子阻害が所望 の効果である場合に有利である。過剰発現のために、挿入されるコピー遺伝子は 、その翻訳開始コドンを保持することが必要である。コサプレッションに関する 主な特許参考文献は、DNA Plant Technology Inc.の名における欧州特許第465,5 72号である。センス／コサプレッション技術の実施可能性を疑う理由はない。こ れは、十分に確立され、世界中の研究室において日常的に使用され、そして使用 される製品は売り出されている。 センスおよびアンチセンス遺伝子調節は、Biotechnology and Genetic Engine ering Reviews 9:207-227(1991)においてBirdおよびRayにより概説される。トマ トにおいて選択された遺伝子を制御するための、これらの技術の使用は、Plant Molecular Biology,第19巻,69-87頁においてGrayら、(1992)により記載された。 記載された方法のいずれかによる遺伝子制御は、形質転換による、適切なプロ モーターおよびポリアデニル化シグナルを含む終結配列を伴う、センスまたはア ンチセンス配列の標的植物種ゲノムへの挿入、続いて形質転換体の全植物への再 生を必要とする。形質転換方法が、大部分の植物種に存在するか、または利用可 能な方法の適用により得られ得ると言うことは恐らく正しい。 双子葉植物について、最も広く使用される方法は、Agrobacterium媒介形質転 換である。これは、全ての形質転換方法のうち、最もよく知られ、最も広く研究 され、従って、最もよく理解されている。根粒細菌Agrobacterium tumefaciens または関連するAgrobacterium rhizogenesは、これらの細菌により感染された植 物において、天然で、病気の徴候であるクラウンゴール腫瘍または毛根腫瘍の形 成を引き起こす特定のプラスミドを含む。病原においてAgrobacteriumにより使 用される機構の一部は、ライトボーダーおよびレフトボーダー領域により境界付 けられるプラスミドDNAの断片が、感染植物のゲノムに安定に移されることであ る。従って、外来DNAが、いわゆる「転移」領域（Ｔ領域）に、通常そこに存在 する遺伝子の代わりに挿入された場合、外来遺伝子は植物ゲノムに移される。雑 誌文献、教科書、および特許において多くの何百の参考文献があり、そしてこの 方法論は十分に確立されている。 単子葉植物細胞の核へのDNAの直接的挿入のための、種々の方法が知られる。 衝撃(ballistic)方法において、比較的不透明な物質（通常、金またはタング ステン）の微粒子が高速度で標的細胞にぶつけられ、ここで微粒子は細胞を貫通 し、細胞壁に穴を開け、これを通してDNAが侵入し得る。DNAは、微粒子にコート され得るか、または培養培地に添加され得る。 マイクロインジェクションにおいて、DNAは、極細の中空針を介して個々の細 胞への注射により挿入される。 単子葉植物および双子葉植物両方に適用可能な別の方法は、液対中に標的細胞 の懸濁物を作る工程、微小な針様材料（例えば、炭化珪素または窒化珪素「ホイ スカー(whisker)」）を添加する工程、および細胞およびホイスカーが衝突し、 そして液体に存在するDNAが細胞に侵入するように攪拌する工程を含む。 そこで、要約すると、センスおよびアンチセンス両方の技術に対する必要条件 は知られており、そして必要とされる配列が導入され得る方法は知られている。 そこで、相変わらずなことは、その調節が所望の効果を有すると期待される遺伝 子を同定すること、それらを単離するか、または十分に効果的な長さのフラグメ ントを単離すること、効果的なフラグメントがプロモーターと終結シグナルとの 間で挿入されるキメラ遺伝子を構築すること、および形質転換により構築物を標 的植物種の細胞に挿入することである。次いで、全植物は、形質転換細胞から再 生され得る。 Eucalyptus gunniiにおけるシンナモイルCoA：酸化還元酵素の精製および特徴 付けは、Plant Physiol.(1994),第106巻,625-632頁においてGoffnerらにより詳 述される。植物のリグニンレベルを調節するためのDNA配列の使用は、Centre Na tional de la Recherche Scientifiqueの名における公開された特許出願WO 9527 790の主題である。 本発明の目的は、非形質転換コントロールと比較した場合に、変化させられた 生物量を有するトランスジェニック植物の作製のための方法を提供することであ る。 本発明によれば、植物の生物量を調節する方法が提供され、この方法は、内因 性植物シンナモイルCoA還元酵素遺伝子の生成または機能を調節するDNAを、上記 植物のゲノムへ組込む工程を含む。 好ましくは、DNAは、内因性植物シンナモイルCoA還元酵素遺伝子に実質的に類 似するヌクレオチド配列を有する。上記のDNAは、センスまたはアンチセンス方 向で植物に挿入され得る。 あるいはまたはさらに、DNAは、内因性植物シンナモイルCoA還元酵素の酵素イ ンヒビターに実質的に類似するヌクレオチド配列である。 また、本発明によれば、配列中に、標的植物において作動可能なプロモーター 、内因性植物シンナモイルCoA還元酵素遺伝子に実質的に類似するコード領域、 および標的植物において作動可能な終結配列を含む、遺伝子構築物が提供される 。 プロモーターは、切換え可能であるか、または誘導性であるか、または組織、 器官、もしくは果実特異的であり得、そして特に、プロモーターはカリフラワー モザイクウイルスであり得る。 遺伝子構築物は、配列番号１または配列番号２または配列番号３に示されるヌ クレオチド配列と同一であるか、または実質的に類似する、コード領域を含み得 る。 上記の配列は、内因性植物シンナモイルCoA還元酵素遺伝子に対する選択的ハ イブリダイゼーションが可能な40ヌクレオチド以上のフラグメントを含むことが さらに好ましい。 本発明は、さらに、上記の植物のゲノム内に安定に位置する構築物を用いて形 質転換された植物を提供する。 本明細書中において、「生物量を調節する」は、非処理植物と比較して、生物 量を増加または減少させることを意味する。植物の生物量における任意の増加は 、植物総乾燥重量の少なくとも５％であることが好ましい。用語「ダウンレギュ レーション」は、植物に既に存在する遺伝子の発現レベルを減少させることを意 味する。 簡潔な言い方で、本発明は、内因性植物シンナモイルCoA還元酵素遺伝子の発 現の調節を必要とする。CCRのセンス構築物または余分なコピーの導入は、非処 置植物または非形質転換植物と比較した場合、低減した生物量を有する植物を提 供する上記の遺伝子の過剰発現、または植物生物量の増加を提供する活性の低減 のいずれかをもたらす。さらに、アンチセンス方向の配列を使用することは、非 処置植物または非形質転換植物と比較した場合、生物量の増加を有する植物を提 供する。 作物の植物生物量の増加は、特に生物量のために栽培される植物種に適用した 場合に、特に有利である。適切な例は、樹木および主な飼料作物（例えば、フェ ストゥーカ属の各種草本(fescue)、トウモロコシ、およびサイレージに使用され る飼料）を含む。生物量の増加はまた、これがより多量の回復可能な供給源を提 供するので、材木および製紙産業に有益であることもまた留意されるべきである 。 本発明はまた、通常CCRにより使用される基質を、植物内の他の生化学経路（ 例えば、植物色素の生成および防御関連化合物（例えば、フィトアレキシン）） にそらすことにより、内因性CCR酵素の抑制に関連する他の利点を提供する。 形質転換される植物種に依存して、種々の異なる植物形質転換ベクターが使用 され得る。形質転換に使用されるプラスミドの構築において使用される好ましい プラスミドは、Biolabsから入手可能なpUCに基づくベクター系を含む。そこで、 適切な場合、形質転換細胞は、新しい遺伝物質がゲノムに安定に組込まれている 全植物に再生され得る。作製され得る遺伝的に改変される植物の例は、飼料作物 、果実、および野菜（例えば、カノーラ(canola)、ヒマワリ、タバコ、テンサイ 、ワタ、ダイズ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、トマト、 マ ンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン 、レタス、キャベツ、アスパラガス、ヤマイモ、およびタマネギ）を含むが、そ れらに限定されない。 本発明は、今や例のために記載され、ここで： 配列番号１は、タバコ シンナモイルCoA還元酵素配列である。 配列番号２は、トウモロコシ シンナモイルCoA還元酵素配列である。 配列番号３は、ユーカリノキ シンナモイルCoA還元酵素配列である。 配列番号４および配列番号５は、PCRプライマー配列である。 図１．タバコ シンナモイルCoA還元酵素の構築物。 図２．温室順化後147日で低減したシンナモイルCoA還元酵素活性を示す初代形 質転換体におけるタバコ茎平均生重量(fresh weight)のグラフ図。 図３．形質転換後147日で低減したシンナモイルCoA還元酵素活性を示す初代形 質転換体におけるタバコ茎平均乾燥重量のグラフ図。 実施例１． タバコからのシンナモイルCoA還元酵素のクローニングおよび特徴付け。 λZAPIIベクター(Stratagene,Cambridge,UK)のEcoRI部位において構築された、 タバコ茎(Nicotiana tabacum cv Samsun)に由来するcDNAライブラリーを、ユー カリノキに由来する異種CCRプローブを用いてスクリーニングした。約400,000個 のプラークをスクリーニングし、そして４個の陽性クローンを検出した。それら をpBluescript(SK-)に切り出し、そして配列決定によりさらに特徴付けた。 実施例２． 形質転換およびベクター構築。 コード配列の大部分を含む618bp CCRフラグメントを、内部XbaI制限部位を有す るコード配列(位445bp〜1063bp)に対するPCRプライマーにより増幅した。正方向 プライマー(5'-tgtggtgtctagatcgtcaattgg-3')および逆方向プライマー(5'-ttga gtaggatctagaaggtgac-3')(O'Connellら、1997、非公開)。PCR産物をXbaIで制限 処理し、そしてXbaIで制限処理されたpJR1Ri(CaMV35Sプロモーターおよびノパリ ン合成酵素遺伝子(Smithら、1988)の3'末端を含む、Bin19由来ベクター)に直接 クローニングした。 実施例３． 植物形質転換および再生。 ベクターを、凍結融解技術(Anら、1988)を用いてAgrobacterium tumefaciensに 移し、そしてタバコを、リーフディスク法(Horshら、1985)の改変により形質転 換した。100mg/mlのカナマイシンを選択薬剤として使用し、そして500mg/mlのカ ルベニシリンを、インビトロ再生手順間に使用した。MS培地に、6-ベンジルアミ ノプリン(6-BAP)(Sigma)1mg/mlおよびナフタレン酢酸(NAA)(Sigma)(0.1mg/ml)を 補充した。カナマイシン耐性シュートを、6-BAPおよびNAAを含まない、100mg/ml のカナマイシンおよび200mg/mlのカルベニシリンを含む培地上での２回のスクリ ーニング後に選択した。３〜４間栽培した複製植物を、各シュートから作った。 実施例４． DNA分析。 葉組織の10cmディスクを、アッセイから検出された各々の低減CCR系統から採取 し、そしてゲノムDNA調製のために使用した。トランスジーンの存在を、実施例 ２において示されるような配列、CaMV35Sプロモーターおよび3'ノパリン合成酵 素ターミネーター(Lassnerら、1989)に対するプライマーを用いるポリメラーゼ 連鎖反応(PCR)により確認し、そしてトランスジーンのコピー数をサザンブロッ ト分析により決定した。タバコ葉のゲノムDNAをXbaIで消化し、そしてレーンあ たり20μgのDNAを用いて、0.8％アガロースゲルにおいて分離した。DNAを、アル カリトランスファーによりHybond-N膜に移し、そして80℃で２時間焼くことによ り固定した。膜を、最小ハイブリダイゼーション緩衝液（10％PEG、７％SDS、６ ×SSC、10mM P0₄ ^3-、５mM EDTA、変性剪断サケ精子(100μg/ml)）中で65℃一晩 、予め洗浄した。ブロットを、同じ新鮮な最小ハイブリダイゼーション緩衝液中 で一晩、32p標識npt11プローブとハイブリダイズさせた。 実施例５ CCR活性が低減した形質転換された初代形質転換体系統を、同じ植物系統のいく つかの複製を提供するためにクローン的に増殖させた。実験手順をまた、コント ロール植物を用いて繰り返した。生物量の計算を、温室における順化後147日で 、各植物系統の３つの複製の茎を採集することにより行った。図２における標準 偏差誤差棒を含むグラフ図は、非形質転換コントロールと比較して、より低いCC R活性を有して選択された形質転換植物の平均生重量を示す。植物系統CCR86は、 コントロールと比較して、茎生重量の有意な増加を示す。データを、表１におい て以下に示す。 「sd」は標準偏差を意味する。 実施例６． 次いで、生重量を計算した茎材料を、茎乾燥重量を計算し得るように凍結乾燥し た。図３において標準偏差誤差棒を含むグラフ図は、非形質転換コントロールと 比較して、より低いCCR活性を有して選択された形質転換植物の平均乾燥重量を 示す。植物系統CCR86およびCCR88は、コントロールと比較して、茎乾燥重量の有 意な増加を示す。データを、表２において以下に示す。「sd」は標準偏差を意味する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．植物の生物量を増加させる方法であって、該植物の内因性シンナモイルCoA 還元酵素遺伝子よるタンパク質の発現を阻害する工程を包含する、方法。 ２．請求項１に記載の植物の生物量を増加させる方法であって、前記内因性シン ナモイルCoA還元酵素遺伝子によるタンパク質の発現を阻害するDNA構築物を、該 植物のゲノムに組込む工程を包含する、方法。 ３．請求項２に記載の方法であって、ここで前記DNA構築物が、前記内因性植物 シンナモイルCoA還元酵素遺伝子の全てまたは一部に相補的なヌクレオチド配列 を含む、方法。 ４．請求項２に記載の方法であって、ここで前記DNA構築物が、内因性植物シン ナモイルCoA還元酵素の酵素インヒビターに実質的に類似するヌクレオチド配列 を含む、方法。 ５．請求項２から４のいずれかに記載の方法であって、ここで前記DNA構築物が 、配列中に、標的植物において作動可能なプロモーター、内因性植物シンナモイ ルCoA還元酵素遺伝子によりコードされるRNAに実質的に類似するか、または相補 的なRNAを特定する、前記コード配列、および標的植物において作動可能な転写 終結配列を含む、方法。 ６．請求項５に記載の方法であって、ここでプロモーターが、切換え可能である か、または誘導性であるか、または組織、器官、もしくは果実特異的である、方 法。 ７．請求項５に記載の方法であって、ここでプロモーターがカリフラワーモザイ クウイルスに由来するプロモーターである、方法。 ８．請求項６または請求項７に記載の方法であって、ここで前記コード領域が、 配列番号１または配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列に同 一であるか、または実質的に類似するか、または相補的である、方法。 ９．請求項５から８のいずれかに記載の方法であって、前記配列が、前記内因性 植物シンナモイルCoA還元酵素遺伝子に対する選択的ハイブリダイゼーションが 可能な40ヌクレオチド以上のフラグメントを含む、方法。