CN87102348A - 植物细胞中基因表达的反向调节 - Google Patents

植物细胞中基因表达的反向调节

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Abstract

通过整个一个处于启动子之转录控制下的基因，以达到对编码植物细胞基因组中之基因的表达控制，所说的启动子是在宿主中有功能活性的，并且其中DNA的被转录链与来自期望调节之内源基因的被转录的DNA链互补。已整合之基因提供了一段能结合于天然存在的RNA并抑制其表达的RNA序列，此时反向序列可结合于RNA的编码部分、非编码部分或编码与非编码两部分。可以多种方式将反向结构引入植物细胞内并整合到植物基因组中，以使此反向结构得以进行诱导下的或固有的转录。

Description

用遗传工程来改良植物已落后于分子生物学对单细胞微生物和哺乳动物细胞的了解和利用。用外来DNA对单细胞微生物或哺乳动物细胞进行稳定的转化已被证实为有效的技术，但尚未发现其对植物细胞也同样有效。因此，尽管涉及到单细胞微生物和哺乳动物细胞方面的工作已取得不少成就，但涉及植物细胞的成功却很少，而且研究其它类型生物体的成功经验也尚未付诸于研究植物细胞的实践。
在许多情况下，往往希望改良植物细胞的某一个现有的品质，而不是引入某一新的品质。为此，也可能希望改变某一种特定酶的活性，使某一个等位基因与其它相比更易于表达，如使某种同功酶与其它相比更易表达等等。许多情况下都只是希望降低结构基因的表达量，而不是抑制其完整表达。因此特别期望发展可允许直接改变特定植物细胞、植物组织或植物之表型的技术
Crowley等〔Cell（1985）43：633-641〕叙述了小盘基因（discoidin    gene）的反向（anti-sense）结构，当将它转染到网柱菌属（Dictyostelium）去时可抑制内源性小盘基因的表达（也可参见在该文中所引用的文献）。Rcsenberg等〔Nature（1985）313：703-706〕，Preiss等〔Nature（1985）313：27-32〕，Melton〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1985）82：144-148〕，Izant和Weintraub〔Science（1985）229：345-352〕以及Kim和Wold〔Cell（1985）42：129-138〕也记叙了反向调节。另外还可参见：Izant和Weintraub〔Cell（1984）36：1007-1015〕;Pestka等〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1984）81：7525-7528〕;Mizuno等〔杂志同上（1984）81：1966-1970〕;Coleman等〔Cell（1984）37：683-691〕;Travers〔Nature（1984）311：410〕和Weintraub等〔Trends    in    Genetics（1985）1：22-25〕。McGarry和Lindquist〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1986）83：399-403〕报告了由热诱导的反向RNA（核糖核酸，以下简称RNA）抑制热休克蛋白的合成。
植物细胞中表达的调节是通过向宿主植物细胞中整合入一段DNA序列来完成的，这段序列中包含一个基因，此基因中被转录的DNA序列至少有一部分与已由宿主细胞转录的DNA序列互补。这一已整合的外源性DNA将处于宿主植物细胞识别的转录起始区的转录控制之下。此已整合的外源DNA的转录将产生反向（anti-sense）RNA的多个拷贝，此反向RNA将与宿主细胞中的内源性RNA互补。这种反向的mRNA（信使核糖核酸，以下简称mRNA）将使天然存在之RNA的功能降低。
图1示出PCGN    1401的EcoRI-BamHI切点间的片段。此片段相当于P1的5′部分，它包含编码成熟的多聚半乳糖醛酸酶蛋白质之N-末端的区域。下加横线的氨基酸是由DNA序列推论而来，并且与对纯化的多聚半乳糖醛酸酶所作的化学序列分析之结果相一致。
图2是用各种质粒构建双载体PCGN783的构建流程图。
本发明提供了调节RNA的利用，特别是调节宿主植物细胞表型性质的方法和组合物。该组合物包括有转录起始区与终止区的转录构建物，转录起始区与终止区之间由一段与RNA上特别是信使RNA上的序列（内源性的）互补的序列所隔开。借此，各种植物宿主细胞中原有的过程将可能被改变，以使各别蛋白质的生产可能降低，多酶过程可能被改变，特定的代谢途径可能被改变或受到抑制，从而有利于一种或多种其它的代谢途径，非蛋白质产物的生产降低，细胞分化改变等等。
互补于信使RNA序列的序列通常至少约15个核苷酸，更常见的是至少20个核苷酸，较好是约30个核苷酸，更好是约50个核苷酸，也可能是100个或100个以上，但通常是少于5000个核苷酸，更多见的是少于2000个核苷酸，更尤其是少于1000个核苷酸。该序列可互补于mRNA序列的任何部位，亦即它可能邻近于5′末端或带帽状部位、带帽位点的下游区、处于带帽状位点与起始码之间，也可能覆盖非编码区的一部或全部，也可能处于连结非编码区与编码区之间区域，即或是互补于编码区的3′-末端，或是互补于mRNA的3′-非翻译区。
该信使RNA可能是经加工过的或未加工的，即包括内含子的。因此非编码区即可能包含5′或3′非编码的侧翼区和内含子。
反向序列结合的特定区域及反向序列的长度将根据想要达到的抑制程度而改变，也可根据序列的单一性（Uniqueness），反向序列的稳定性等来改变。因此，在一定程度上，这些因素要根据就某一特定反向序列所观察到的实际情况从经验上来加以确定。
这样的序列可是单一序列，也可是有二个或多个串联重复序列的重复序列，这时单一序列可与多个mRNA相结合。在某些情况下，异质重复结构可能比同质重复结构更适用，因为此时同一序列有对不同的mRNA的互补的区域，而对多种mRNA起抑制作用。
反向序列可与单一序列或重复序列互补，以提高结合的机率。因此，反向序列可能涉及到与单一序列、重复序列中的一个单位或是一段重复序列中的多个单位相结合。反向意义可能导致单个基因或多个基因表达的改变。
转录的结构将按转录的方向依次由下列部分组成：转录起始区，正向链上为反向RNA编码的序列以及转录终止区。
转录起始区可提供结构表达或调节表达。有许多在植物中具有功能的启动子可供利用。这些启动子可由Ti或Ri质粒、植物细胞、植物病毒、或其它其中启动基区表现有功能活性的植物宿主中得到。做为例证的启动子包括：章鱼碱合成酶启动子、nopaline合酶启动子、manopine合成酶启动子等，这些均为细菌来源的、在植物中具有功能的启动子。病毒的启动子包括花椰菜花花叶病毒的全长（35S）和Ⅵ区启动子等。内源的植物启动子包括核糖-1，6-二磷酸（RUBP）羧化酶小亚单位（ssu），β-conglycinin启动子，云扁豆蛋白启动子，ADH启动子，热休克启动子，组织特异性启动子（如与果实成熟有关的启动子）等。
转录起动区可能是天然存在的区域、没有调节区的RNA聚合酶结合区或是一个基因的RNA聚合酶结合区与另一个基因调节区的结合部分。调节区可能是对一种物理刺激起反应，如热休克基因对热起反应，如RUBP羧化酶SSU对光起反应等。另一种可能是调节区可能对分化信号敏感，例如β-conglgcinin基因，云扁豆蛋白基因等。第三类调节基因是对代谢物起反应。反向RNA表达的时间和水平可能对产生的表型有一定的效应。因此选用的启动子将决定反向RNA的效应。
可使用任何方便的终止区，如RNA聚合酶结合区的终止区或其它的终止区。多种不同的终止区均可利用，最主要的选择考虑是要方便，这样其前面的结构或DNA序列即可供利用。为方便起见，可用Opine的终止区，或内源性基因的终止区，例如前面已经谈到的基因。
各个片段可用连结子、转接子等进行连结;如有方便的内切酶位点可供利用，则也可进行直接的连结。DNA序列，特别是连接到复制系统的DNA序列可做分步连接，此时存在于复制系统上的标志可供用于进行选择。
发明的目的结构可通过多种方式引入到宿主细胞。特别重要的是用带原生质体的癌病土壤杆菌（A.tume    faciens）、受损伤的叶子或是其它分离块组织。其它可用的技术包括：与原生质体的电穿孔（electroporation），脂质体融合，微量注射技术等。对本发明来说，用来转化植物细胞的特定方法并不是很严格的。
本发明对任何植物都可应用，包括被子植物、裸子植物，单子叶植物和双子叶植物。重要的植物包括谷类，例如小麦、大麦、玉米、triticale等;水果类，如杏、橙、葡萄柚、苹果、梨、鳄梨;干果类，如胡桃、杏仁、欧洲榛、美洲山核桃等;蔬菜类，如胡萝卜、莴苣、西红柿、芹菜、萝卜、土豆、花茎甘蓝、芦笋等;木本植物，如白杨、松树、红杉、雪松、栎木等;观赏花卉;或其它经济植物，如烟草、希蒙得木属、油菜子、萼距花属、大豆、向日葵、糖甜菜等。对于每一品种，一般来说都要调节不同的基因，借以改变该宿主的表型。
在细胞被转化以后，即可使之再生成为植物。现有各种由细胞再生成植物的技术。由细胞可发育成愈创组织，愈创组织再被诱导以形成根，然后将根移入有合适营养的土壤中以产生植株。然后植物将会生长，并可在适宜条件下与其它植物杂交，以便经过许多代后确立其基因表型改变的稳定性。还可应用其它的无须授粉或受精即再生植物的技术。因为那些能经培养再生的植物表型不可能直接用作作物品种，所以此业经转化的植物可与另一种未转化的种质杂交，以将此性状传移到有合适的育种系内。
可在多种类型的植物内进行各种各样的修变。这些修变包括：改变脂肪酸源（如油菜子、萼距花属或希蒙得木属）的脂肪酸分布，推迟水果与蔬菜的成熟;改变水果与蔬菜的外观、贮存、包装、收摘和加工的性质;推迟花束（折断花枝的花朵）的开花或花谢过程;降低植物中一种或数种成份（如咖啡因、茶碱、尼古丁）的含量，改变花的颜色;增强植物的抗病能力或对工程病毒病的抗性。
用于改变脂肪酸的分布，靶植物可以是椰子树、棕榈树、萼距花属、油菜子等。最有关系的靶基因可以是乙酰转酰化酶基因、酰基载体蛋白基因、硫酯酶基因等。
用于改变尼古丁的量，靶品种可以是烟草。其靶基因可以是N-甲基丁二胺氧化酶基因或丁二胺甲基转移酶基因。
用于推进水果的成熟，靶品种可以是西红柿或鳄梨。靶基因则可以是多聚半乳糖醛酸酶基因或纤维素酶基因。
用于改变咖啡因的量，靶品种可以是咖啡（Coffea    ara-bica）。靶基因则可以是7-甲基黄嘌呤，3-甲基转移酶基因。
用于改变茶碱的量，靶品种可以是茶（Cemellia    sinen-sis）。靶基因则可以是1-甲基黄嘌呤3-甲基转移酶基因。
用于改变花的颜色，靶品种可以是牵牛花、玫瑰花、石竹或菊花等。靶基因则可能是苯基苯乙烯酮合成酶基因、苯丙氨酸氨裂合酶基因或脱氢堪非醇（黄酮）羟化酶基因等。
用于改变木质素的量，靶品种可以是火炬松、Douglas冷杉、杨属植物等。靶基因则可以是肉桂酰-CoA：NADPH还原酶基因或肉桂酰醇脱氢酶基因。
一般说来，在代谢途径的分枝点上降低某种酶的活性，可能使所形成的产物比例改变。
为增强植物对病毒疾病的抗御力，靶病毒/植物结合可能是：烟草或西红柿中的粘病毒;甜菜的坏死性黄叶脉病毒、糖甜菜中根茎病的病原体、草莓中的各种草莓病毒或几乎任何其它的结合。反向病毒RNA在植物细胞中的表达有可能降低病毒的感染能力或抑制其增殖。
在构建时为了进行操作和克隆，通常将转录构建物与复制系统，特别是细菌的复制系统相连接。复制系统可以是任何方便的复制系统，特别是在大肠杆菌中有功能、并且有一个或几个可用于检测转化之细胞的标志的复制系统。
当用癌病土壤杆菌（A.tumefaciens）或发根土壤杆菌（A.rhizogenes）转移DNA时，该结构也要至少与一个T-DNA的边缘相连结。因此，该结构将包含一个T-DNA边缘区，特别是右侧的T-DNA边缘区，或者也可夹在左和右侧的二个T-DNA边缘区之间。
现在有多种用Ti或Ri质粒做为转移工具转移构建物的技术。这些技术包括提供一个能在土壤杆菌属（Agrc    bacterium）中复制的质粒，这样在T-DNA中的构建物即可通过重组整合到Ti或Ri质粒中去。另一方法是使用双重载体，此时土壤杆菌属中的Ti或Ri质粒即可能有或可能没有与构建物的T-DNA同源的T-DNA区。在任一情况下，只要在内源性质粒中存在Vir基因，则T-DNA就能成功地被转染到植物中。
在表达的结构物中有做为其一部分的标志，特别是抗菌素抗性如卡那霉素抗性、潮霉素抗性、庆大霉素抗性、博来霉素抗性等的标志，这就能选择出保留有这种结构物并处于功能状况的植物细胞。在用双重载体并且在土壤杆菌属的Ti或Ri质粒中的T-DNA保留有癌基因时，可选择出无癌基因表达的形态学上正常的细胞。
当用电穿孔或微量注射技术时，无须考虑到菌瘿的形成，可以预期所得植物除改变了表型之外，形态上是正常的。
应用反向链的一个例子是西红柿中多聚半乳糖醛酸酶（PG）表达的调控。降低多聚半乳糖醛酸酶生产的能力可利于提高西红柿中固体物含量并改善西红柿加工。
为了控制西红柿果实中多聚半乳糖醛酸酶的表达，须制备了一个转录结构，其含有被转录的多聚半乳糖醛酸酶基因的反向链。无须应用包括侧翼区的整个基因，方便地应用CDNA或其片段即可。这个片段大约将是100到1000nt，更通常的是150到1000nt。
可望转录启动调节区而不是结构区可被诱导的，当破果时（成熟前的短时间内）特别活跃。为此，可应用多聚半乳糖醛酸酶基因的转录启动区，或在成熟期间与果实的发育有关的其它基因的启动区。
这里无须重复构建转录体系（transcription    cassette）的方法。一旦这一构建物被制成的，即可以常规方法引入西红柿植物细胞内，再由这些细胞再生成植物。
下面的例子用于说明而不是限制本发明。
实验
实例1
AroA反向
材料和方法
T4连接酶得自ProMega    Biotech。限制性内切酶、Klenow聚合酶片段和Bal    31购自Bethesda    Research    Laboratories（BRL）。
章鱼碱密码暗盒（Cassette）的构建，PCGN    451
将OCS5′-OCS3′片段插入到一个PUC    8的衍生物〔Vi-eira和Messing，Gene（1982）19：259-268〕中，并在因填入一段Klenow    DNA聚合酶片段而去掉了Hinc    Ⅱ位点和Eco    RI的位点处插入一XhoI连接子（CCTCGAGG）。通过将含有T-DNA边缘区的章鱼碱Ti-质粒PTiA6〔Currier和Nester（1976）J.Bact.126：157-165;Thoma-show等，Cell（1980）19：729-739）的Xho    I（15208）-Bam    HI（13774）片段连接到切下的Bam    HI至EcoRI（连接子）片段上（上列数码是由Barker等编排，Plant    Mol.Biol.（1983）2：335-350，为了与Ti质粒pTi    15955密切相联），以制备章鱼碱合成酶密码暗盒。切下的Bam    HI-Eco    RI片段是用XmnI（13512）消化pTiA6的T-区EcoRI至Bam    HI的亚克隆，之后再用Bal    31内切酶处理而得到。加上Eco    RI连接子（GGAATTCC）并将约长130bp的经凝胶电泳提纯的EcoRI至Bam    HI片段克隆到M13mp    9中，之后进行序列分析。通过与de    Greve等〔J.Mol.Appl.Genet.（1982）1：499-512〕发表的序列相比较，鉴定出一个在其中的转录起始点和翻译起始密码子之间的13642处插入了Eco    RI连接子的克隆。
Eco    RI切断位点位于13639处，mRNA起始位点的下游。用寡核苷酸连接子（CCTCGAGG）将11207位的SmaI识别位点转变成XhoI识别位点，并将章鱼碱基因的3′端（从EcoRI（12823）到转变来的Xho    I位点）加入到密码暗盒之中。之后将所得具有章鱼碱合成酶5′-区（15208-13639）和3′-区（12823-11207）的表达密码暗盒插入到修饰过的PUC    8的Xho    I识别位点，即构成了pCGN    451。
aroA正向/反向双重质粒的构建
用Bam    HI消化pPMG    38〔Comai等，Nature（1985）317：741-744），以提供含aroA基因〔核苷酸1377-2704，stalker等，J.Biol.chem.（1985）260：4724-4728〕的片段，将其插入到mas    5′-ccs    3′暗盒的Bam    HI识别位点，即pCGN46（Comai等，Nature（1985）317：741-744），（其对mas启动子来说是反向的（负方向），以提供pCGN    964b。
将上述的同一aroA基因，作为来自pPMG38的EcoRI片段，插入到在此章鱼碱密码暗盒的pCGN451中，用EcoRI消化pCGN451后，得到质粒pPMG45（ocs-aroA）。
将PACy184〔chang和Cchen，J.Bact.（1978）134：1141-1156〕的大的Hind    Ⅲ-BamHI片段与Tn    5〔Jorgensen等，Molec.Gen.Genet.（1979）177：65-72〕的细菌卡那霉素抗性基因的Hind    Ⅲ-Bam    HI片段相结合，得到pCGN525。将pPMG45的Xho    Ⅰ片段插入到pCGN    525的Sal    Ⅰ位点，以提供pCGN    963。用Xho    Ⅰ连接子（CCTCGAGG）取代PCGN    963的Hind    Ⅱ识别位点，并将含mas-反向aroA结构物的pCGN964的xho    Ⅰ片段插入到这个新的xho    Ⅰ识别位点中。这样一个同时含有正向和反向的aroA基因的质粒即是pCGN    965。
在用Bgl    Ⅱ消化之后，连接pCGN965与pRK290〔Ditta等，Proc    Natl.Acad.Sci.USA（1980）77：7347-7351）以构成pCGN978（双重载体）。
pPMG54（aroA正向质粒）的构建
将aroA基因作为pPMG45的一个xhoI片段，插入到经SalI消化的pCGN517中，以提供pPMG54。pCGN517是将来自pUC5K〔Vieira和Messing，Gene（1982）19：259-268〕的Tn903之卡那霉素抗性基因插入到pHC79〔Hohn和Collins，Gene（1980）11：291-298〕的pstI位点上而制得的。
与癌病土壤杆菌接合及菌瘿形成
使pCGN978和pPMG54每块板与癌病土壤杆菌K12〔K12的形成是将pTiA6转化到A114（NT1）中产生的，Sciaky等，Plasmid（1978）1：328-253〕和pRK2073〔Leong等，J.Biol.Chem.（1982）257：8724-8730〕接合。平板接合按Comai等〔Plasmid（1983）10：21-30〕所述的方法进行。土壤杆菌在加有200μg./ml链霉素和50μg/ml卡那霉素的AB板〔chilton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1974）71：3672-3676〕上选择带pCGN9788的土壤杆菌，再用Southern印迹法确证pCGN978的存在。在加有100μg/ml.卡那霉素的AB板上选择其中pPMG54已整合到K12之T-DNA中的重组体，并用Southern印迹法确证之。
用牙签将3-4月令的伽蓝莱属植物的受伤的叶子浸入到PCGN978×K12和pPMB54×K12的溶液中（在MG/L培养液〔Garfinkel和Nester，J.Bacteriol.（1980）194：732-743〕中，约109细菌/ml）以诱导菌瘿的形成。四周后由四个针对每一结构物的植物样品中收获菌瘿并保存于-70℃备用。对于每一结构物菌瘿物质都是随机化的，并可用Western印迹法分析aroA蛋白质。
Western印迹法按如下程序进行：取2.3克pPMB54×K12和3.0克pCGN978×K12菌瘿组织在液氮中磨碎。加入聚乙烯吡咯烷酮（0.3克/每克组织）。以1.5ml/g.组织的比例将组织悬浮于含10mM    EDTA、0.15M    Nacl、0.05%Nonidet    p-40、25mg/ml中血清白蛋白（BSA）、1mM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、10μm亮肽素（leu-peptin，Sigma）和10mM硫脲的0.1M柠檬酸钠溶液（pH5.6）中。匀浆以15，000g.离心15分钟（4℃）。将25μl经向兔体内注射纯化的3-磷酸烯醇式丙酮酰莽草酸（3-enolpyruvylshikimate    phosphate（EPSP））合成酶制得的抗血清和125μl    10%（w/v）金黄色葡萄球菌（Calbio-chem）悬浮液加到每份上清液中，室温下搅拌保温1小时。
然后将样品离心（5000g，5分钟）并用含50mM Tris（pH7.5）、1mM EDTA、0.5M NaCl和0.05% Nonidet P-40的溶液将沉淀瓶洗2次。再将沉淀悬浮在100μl含0.125M Tris（pH6.8）、4%SDS、20%甘油和10%2-巯基乙醇的溶液中并于90℃加热2分钟。然后将整个样品加在10%丙烯酰胺凝胶上电泳。将分离出的肽按Burnette的方法〔Anal.Biochem（1981）112：195-203〕在Hoefer TE4转移单元中以100V经3小时转移到硝酸纤维素滤膜上（BA85，Schlei-cher和Schuell）。然后再将硝酸纤维素滤膜在BLOTTO（20mM Tris（pH7.5），5%脱水脱脂乳，0.5M Nacl，0.1%消泡剂A，10mM重氮钠）中室温下保温1小时，再在含1∶50稀释之抗-EPSP合成酶抗血清的BLOTTO中于4℃保温过夜。将滤膜在含20mM Tris（pH7.5）、150mM NaCl溶液中洗10分钟，其后在含0.05%吐温-20的同一缓冲液中洗20分钟，再在无去污剂的同一溶液中洗10分钟。然后将含106cpm/ml125I标记之蛋白A（9μci/mg;NEN）的BLOTTO加到滤膜上，室温下保温2小时。滤膜在含50mM Tris（pH7.5）1M NaCl和0.4%月桂酰肌氨酸的溶液中冲洗过夜，然后再在含50mM Tris，（pH7.5）、5mM EDTA、150mM NaCl、0.5% Triton X-100和0.1% SDS的溶液中室温下洗3小时。在冲洗和干燥后，用DuPont    Lightning    Plus增感屏使滤膜在-70℃下对柯达XAR    X光底片爆光。
含菌瘿的PCGN    978仅显示为对照pPMG54之活性的10-20%。较早时候双重系统中aroA的表达与整合系统所作比较结果表明，双重系统的效率只有整合系统的70-80%。因此，在同时存在反向结构时，可观察到aroA活性总的降低60%。
电穿孔实验
质粒构建
反向5′mas-
Figure 87102348_IMG1
A-3′ocs结构物-PCGN 964b的构建如上所述。正向5′mas-
Figure 87102348_IMG2
-3′ocs结构物-PCGN 964a可由同样连接过程得到，但须选择正向定向。
植物材料
Nicotiana    tabacum    cv.Xanthi原生质体供体植物于无病菌条件（Faccioti和Pilet，1979）下生长在玻璃罐中。根尖置于100ml含0.7%    Gibco    phytagar、30g/l果糖、1.0mg/l    IAA和0.15mg/l激动素的琼脂培养基（Murasahige和Skoog（MS）培养基）中，培养基在高压灭菌前pH调到5.55。将培养物于12小时光照、12小时黑暗的规律条件下保存于23±2℃。
下列步骤用灭菌溶液在无菌条件下进行。
在循环的黑暗期内从4-5周令的植物上去掉年青的叶子。弃去主叶，将余下的叶组织沿长轴切一次。使含0.4%果胶酶（Pecto-lyase    Y-23，Seishin    Pharmaceutical    Co.Ltd.日本）和0.6%纤维素酶（Onozuka    RS，Yakult    Pharma-ceutical Industry Co.Ltd.日本）的6%山梨醇溶液渗入这些叶的切片内（达到200毫托）。温育2-3小时后，将浸透物轻轻吹吸以释放原生质体并使之通过一个52μ尼龙滤片。50g.离心收集原生质体沉淀物，并用7%山梨醇溶液洗2次。用血球计数器测定原生质的密度（计数1mm2的9个方格，每方格的均数乘以104即得到每毫升中原生质体的总数）。基于所计算出的密度，将原生质体以2.2-3.0×106/ml的密度悬浮于缓冲液（缓冲液含有：10mM Hepes（pH7.1），140mM Nacl，5mM CaCl2和6%山梨醇）中。
电穿孔
将悬浮于缓冲液中的原生质体分装成若干1ml等份。每份中加入1mg载体DNA（以青鱼精子DNA的形式）。加入载体DNA后，再加入预期浓度的质粒DNA。电穿孔前将原生质体/DNA混合物温育5分钟，然后移入到一排1ml铝箔接线的塑料池内进行电穿孔。电穿孔脉冲是由加有150伏电压的1250μF电容器释放的。脉冲持续时间通过没加原生质体的缓冲液测定的，发现为40毫秒。电穿孔后原生质体在小池内于室温下温育10分钟，然后移入Petri板上，用10ml.原生质体培养液（MS盐含有0.6mg/l    NAA、0.2mg/e（2，4-D、0.8mg/l激动素、5.5%山梨醇和30g/l蔗糖）稀释，并于完全黑暗的环境中于23±2℃培养。48-50小时后，低速离心（50g，6分钟）收获原生质粒，除去上清液，原生质体在液氮中冰冻并贮存于-70℃。晚些时候，将冰冻的原生质体沉淀物悬浮于1ml抽提缓冲液（含有：0.1M柠檬酸钠，10mM    EDTA，150mM    NaCl，0.05%Nonidet，25mg/ml    BSA，1mM    PMSF，10mM    DTT，10mM硫脲，10μM亮肽素）中作Western分析。加入聚乙烯吡咯烷酮0.05g/ml（Poly-clar    AT，BDH），并将此混合物在Polytron匀浆器中研磨30秒。收集上清，依上述方法进行Western印迹分析。
实验
实验处理使用pCGN    964a和pCGN    964b（参看有关各质粒构建部分）。将每个同时含有964a和964b的实验处理与仅单独含有964a或964b的实验处理进行比较：
50μ    964a∶0μ964b
50μ    964a∶10μ964b
50μ    964a∶25μ964b
50μ    964a∶50μ964b
50μ    964a∶100μ964b
0μ    964a∶50μ964b
在全部例子中，反向DNA（964b）的加入都降低了经蛋白印迹分析测得的蛋白水平（与仅用964a所得水平比较）。水平的降低平均为50%。如预期的一样，在仅有964b的情况未检测出蛋白。
实例2：
多聚半乳糖醛酸酶反向结构物
细菌菌株
表Ⅰ.细菌菌株（见下页）
表Ⅰ.细菌菌株
大肠杆菌
菌株名称    表型    来源/参考文献
7118 △1ac (Vieira和Messing)/(Gene（1982）19：259-268)
y1088 hsdR-hsdM+(Young和Davis)/(PNAS USA（1983）)
y1090    △lon    80：1194-1198
C2110 PclA (stalker等)/(PNAS USA（1983）)
80：5500-5504
酶和放射性同位素
所有的酶都由商品来源得到，并按照创造厂家的建议使用。放射性同位素则得自New    England    Nuclear。
PolY（A）+RNA的分离
收获西红柿（cv.CaliGrande）的成熟果实并在液氮中冰冻。冰冻的组织在液氮中用研钵研磨，所得的粉末在Facciott等〔Bio/Technology（1985）3：241-246〕所述的缓冲液中以Brinkman    Polytron匀浆器匀浆进行提取。按Colbert等的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1983）80：2248-2252〕制备总RNA。
用40mM醋酸钠和0.5体积乙醇从总RNA制品中沉淀出多糖〔Mansson等Mol.Gen.Genet.（1985）200：356--361〕。按Maniatis等〔（1982）Molecular Clon-ing：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，纽约〕的方法分离Poly（A）+RNA。
CDNA的合成
按Gulber和Hoffman〔Gene（1983）25：263-269〕所述的方法由Poly（A）+RNA合成cDNA，但有下列修正：合成第1条链的反应混合物包含：1mM dGTP，1mM dATP，1mM TTP，0.5mM dCTP，0.5单位/μl RNasin（Promega），4μg西红柿Poly（A）+RNA和80-100单位反转录酶（Life Sciences）。加入2μl 500mM EDTA以终止反应，然后加10μg tRNA，1倍体积4M NH4OAc和2.5倍体积乙醇在干冰中过夜沉淀。
从大约500ng第一条链的反应产物合成第二条链。用20μCi5′-〔α-32P〕dCTP分别标记第一条和第二条链的反应混合物，以分别监测每一反应。
在λgt11中克隆双链cDNA
将双链cDNA按制造厂介绍的方法（New England Biol-abs）作Eco RI甲基化。乙醇沉淀后，用3个单位的DNA聚合酶I的Klenow片段（Bethesda Research Laborato-ries）按下列条件将cDNA末端切成平头：66mM Tris-HCl（pH7.5），20mM MgCl2，100mM二硫苏糖醇，100μM dGTP.、dATP、TTP和dCTP，室温，1小时。然后用乙醇沉淀DNA。切成平头后，向溶解了cDNA的10μl连接酶缓冲液中（50mM Tris，pH7.5，10mM MgCl2，20mM二硫苏糖醇，1mMATP，每ml.加5mg牛血清白蛋白）加入2μgEcoRI磷酸化的连接子。加入T4DNA连接酶〔1 Weiss单位，Weiss，J.Biochem（1968）243：4543，Promega〕并15℃保温6小时。然后再加入溶于连接酶缓冲液中的T4DNA连接酶的Weiss单位并于15-19℃保温24小时。用酚提取反应物，用乙醇沉淀，用100单位EcoRI（New England BioLabs）清化6-8小时，再用酚提取，用乙醇沉淀。在Bio-gelA-50m柱（100-200目）上经层析除去过量的连接子及小于500碱基对的cDNA，并按Huyth等人所述的方法（DNA Cloning：A Practical Approach，Glover D.M.编，49-78页，IRL Press，Oxford，英国，1985），将大小适宜的cDNA连接到EcoRI酶切过的λgt11载体DNA（Statagene）上。
用Giga-pack提取物（Stratagene）按制造商提供的方法体外包装反应物。用不同稀释度的cDNA进行最初的实验连接和体外包装，以经验性地测定为产生重组体病毒所需的最适cDNA/载体比例。按Huynh等人（1985，上述文献）所述的方法，将包装的λgt11噬菌体接种到存在有异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-gal）的大肠杆菌Y1088平板上，以测定重组体的数量。结果得到5×106多个在λgt11中有90%插入率的重组体。
基因库的筛选
按照Huynh等人（1985）所述的方法，用大肠杆菌作为宿主，以每9cm2板上有20，000噬菌斑形成单位的密度，由未放大的λgt11库中筛选出大约200，000个噬菌体，但不同的是这里使用了NZY培养基〔每升含：5g NaCl，2g MgCl2，10g，Nzamine typeA（Sheffield产品），5g酵母提取物及15g琼脂〕。培养板按Huynh等〔（1985）.见前〕的方法保温并用含IPTG的硝酸纤维素纸覆盖。硝酸纤维素片用含0.5MTris（pH8.0）、0.15M NaCl、0.02% NaN3、0.1%Triton X-100和5%无脂肪干奶的溶液饱和，然后在室温下与含有1∶1000稀释的抗多聚半乳糖醛酸酶2抗体（见下文）的同样的缓冲液保温30分钟。按制造商提供的方法用碱性磷酸酶偶合的第二抗体（Promega）检测已结合的抗体。用连续平板接种法纯化阳性噬菌斑，并按Maniatis等的方法（1982）制备噬菌体。
cDNA插入物P1的再克隆和序列分析
用EcoRI消化由阳性噬菌斑P1得到的噬菌体DNA，通过体外连接将所得的片段再克隆到EcoRI消化的载体M13    Blue    Scribe    Minus（stratagene）内。用按照制造厂商介绍的方法由Blue    Scribe制得单链模板分析起始DNA的序列。所有DNA的序列分析均按Sanger等人〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1977）74：5463〕的方法或是Maxam与Gilbert〔Methods    Enzymol.（1980）65：499-580〕的方法进行。将来自Blue    Scribe的经纯化的BamHI-EcoRI，HinD    Ⅲ-EcoRI和Bam    HI-HinD    Ⅲ片段（Maniatis等，上述文献）再克隆到M13mp    18〔Yanis-ch-Perron等，Gene（1985）53：103-119〕和M13mp19〔Norrander等Gene（1983）26：101-106〕中得到重叠序列。
纯化多聚半乳糖醛酸酶以作蛋白质序列分析
按Crookes和Grierson所述的方法〔Plant Physiol.（1983）72：1088-1093〕由西红柿（cv.CaliGrande）的成熟果实中制备总的细胞壁结合蛋白。提取物对0.025M乙醇胺（pH9.4）透析，并加到已用0.025M乙醇胺、pH9.4平衡过的9×300mm层析聚焦交换剂PBE94（Pharmacia）柱上，用Polybuffer96（pH8.0）（Pharmacia）洗脱结合的蛋白质。合并含多聚半乳糖醛酸酶的部分，并用硫酸铵（90%饱和）沉淀，再进一步用羟基磷灰石（HAPT）HPLC柱分部分离之。用2ml样品上柱，以1ml/分的流速用10mM到350mM磷酸钠（pH6.8）的线性梯度进行层析。样品在A280处进行监测，并按每管0.5ml收集。合并从多次层析中所得的含有多聚半乳糖醛酸酶的各管，对6%醋酸透析，然后冻干。
蛋白质的序列分析
用Beckman    890M液相氨基酸序列分析仪对上述制得的多聚半乳糖醛酸酶进行完整地序列分析。得到下列的N-末端序列：
甘氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-门冬酰胺
纯化多聚半乳糖醛酸酶以制造抗体
按Tucker和Grierson〔Planta（1982）155：64-67〕的方法由cv.Uc82B的成熟果实制取西红柿细胞壁结合蛋白。经硫酸铵沉淀后，将所得沉淀物溶解于150mM    NaCl中并对同样的缓冲液透析过夜。
蛋白溶液然后在TSK    3000/2000    HPLC分子筛层析柱上做分部分离，用含10mM    NaCl和10mM    Tris（pH7.2）的同溶梯度洗脱，流速为0.5ml/分。
合并含多聚半乳糖醛酸酶活性〔Reisfeld等，Nature（1962）195：281-283〕的各管，再进一步在羟基磷灰石HPLC柱上分部分离，用10mM-350mM磷酸钠（pH6.8）的线性梯度洗脱，流速为1ml/分。收集含多聚半乳糖醛酸酶活性的峰并用以给家兔注射，以制备抗体。
用作加强注射的多聚半乳糖醛酸酶是将细胞壁结合蛋白制品溶解SDS聚丙烯酰胺凝胶上制得的。将用硫酸铵沉淀的物质（见上文）在厚3mm、宽14mm的含12.5%聚丙烯酰胺的凝胶上进行电泳〔Laemmli，Nature（1970）227：680-685〕，用考马斯亮兰R染色显现之。切下相应于多聚半乳糖醛酸酶（约40，000-43，000道而顿）的泳带，冰冻并在液氮中研磨。
抗体的制备
在1个月内对每只家兔注射4次多聚半乳糖醛酸酶（每次125μg.）。然后用由SDS聚丙烯酰胺凝胶上回收的多聚半乳糖醛酸酶（约150μg）作一次加强注射。第一次加强注射后一周再作一次同样的加强注射。2周后将动物处死并采集血清。
用6ml 0.1M磷酸钠（pH7.0）稀释原血清（6ml）。并在-6ml蛋白A-Sepharose（sigma）柱上上样。先用80ml 0.1M磷酸钠（pH7.0）洗柱，之后再用0.1M甘氨酸（pH3.0）洗脱IgG部分。合并A280最高的各管，对含20mM磷酸钠（pH7.6）、150mM NaCl的溶液透析并用Amicon XM80的膜超滤浓缩。然后加入甘油至终浓度为40%。
按制造商推荐的方法将IgG与连接在Tresacryl（pharama-cia）亲和基质上的多聚半乳糖醛酸酶一同保温，以制备亲和纯化的抗血清。将为测定蛋白质序列而纯化的多聚半乳糖醛酸酶连接到4mlTresacryl树脂上（按制造商推荐的方法）。用含0.01MTris（pH7.5）、150mM NaCl和0.1%Tween-20（TBST）的溶液将5ml上述制得的IgG稀释到50ml，并于4℃与树脂一同保温过夜。之后用TBST洗树脂并用0.2M甘氨酸（pH2.75）洗脱。收集A280峰值部分，对含10mM Tris（pH8.0）、150mM NaCl的溶液透析。经纯化之抗体的终体积为12ml，代表了原血清的1∶2稀释。
结果
多聚半乳糖醛酸酶cDNA的鉴定
经与上述的抗体制剂反应，从λgt11基因库中鉴定出12个假设的多聚半乳糖醛酸酶克隆。用这些克隆中的两个纯化的插入物做为探针，用Northern印迹法证实一个编码mRNA的克隆（C3）在西红柿发育期间可按预期表达多聚半乳糖醛酸酵mRNA的方式和大小被表达。
为了鉴定其它假设为编码多聚半乳糖醛酸酶的cDNA克隆，从余下的10个克隆制备噬菌体DNA，用EcoRI和HindⅢ消化并用C3克隆插入物为探针进行Southern印迹杂交分析（Mani-atis等，文献如上述）。又有一个cDNA克隆（P1）与C3交叉杂交并进一步定性以提供反向表达的序列。比较由DNA顺序推测的氨基酸序列与实际的多聚半乳糖醛酸酯酶序列，证实了P1是一个多聚半乳糖醛酸酶cDNA克隆。此克隆编码多聚半乳糖醛酸酶基因的一部分，大约从成熟的多聚半乳糖醛酸酶多肽的N-末端开始，延伸到包括3′不翻译的区域的羟基末端。
反向多聚半乳糖醛酸酶双重质粒的构建
用EcoRI消化噬菌体P1    DNA，并将cDNA插入物连接到EcoRI消化的M13    Blue    Scribe    Minus（Stratagene）中，产生pCGN1401。
用BamHI和EcoRI消化pCGN1401，以提供一个219bp的片段（图1），它包括EcoRI连接子的7个碱基（GAATTCC）、多聚半乳糖醛酸酶前导序列（AT）的2个碱基、编码成熟多聚半乳糖醛酸酶蛋白质（GGG）N-末端氨基酸的三联密码和附加到Bam    HI识别位点的210个碱基。将此片段插入到mas    5′-ocs    3′暗盒的唯一的Bam    HI-Eco    RI位点，即pCGN46〔Comai等，Nature（1983）317：741-744〕。这样就使该片段插入到对mas起动基因来说是反向（负方向）的位置，以产生pCGN1402。
然后用限制性内切酶Xho    I消化pCGN    1402，并克隆到在左侧和右侧边缘区之间含有植物卡那霉素抗性标志的双重质粒pCGN783的唯一的Sal    I位点上。这样就得到了pCGN1403。使这种在大肠杆菌C2110中的质粒连结到含有无效的Ti质粒的癌病土壤杆菌中，即能将多聚半乳糖醛酸酶反向密码暗盒和卡那霉素抗性密码暗盒转染到植物宿主基因组中去。
所应用的土壤杆菌系统是癌病土壤杆菌PC2760〔G.Ooms等，Plasmid（1982），Nature（1983）303：179-181;欧洲专利申请84-200239·6号，2424183号〕
pCGN783的构建
pCGN783是含癌病土壤杆菌章鱼碱Ti质粒pTiAb〔Currier和Nester（1976），文献同上〕之左侧和右侧T-DNA边缘区、pPH1JI之庆大霉素抗性基因〔Hirsch等，Plasmid（1984）12：139-141〕、花椰菜粘病毒（CaMV）之35S起动子〔Gardner等，Nucleic    Acid    Res.（1981）9：1871-1880〕、Tn5之卡那霉素抗性基因〔Jorgensen，Mol.Gen（1979）177：65〕以及PTiA6转录本7之3′区〔Currier和Nester（1976），见上文〕的双重质粒。pCGN783的构建路线参见图2。
pCGN739的构建（双重载体）
为了得到庆大霉素抗性标志，由pPHIJI（Hirsch等1984，见上文）的3.1kb    EcoRI-PstI片段分离抗性基因并克隆到pUC9〔Vieira等，Gene（1982）19：259-268〕中，得到pCGN549。
以含庆大霉素抗性基因的pCGN549    Hind    Ⅲ-BamHI片段取代pCGN587（其构建见下文）的HindⅢ-BglⅡ片段，得到pCGN594。
用pUC18（Yanlsch-Perron，1985，见上文）的HindⅢ-BamHI多聚连接子区取代含有ocs-卡那霉素-ocs片段的pCGN594    HindⅢ-BamHI区域，制成pCGN739。
726C的构建（1ATG-卡那霉素-3′区）
pCGN566含有插入到pUC13-cm（K.Buckley，博士论文，UC-San    Diegc，1985）之EcoRI-HindⅢ位点的pUC18（Yanisch-Perron，同上文）的EcoRI-HindⅢ连接子。
将含有ORF    1和2〔Barker等，（1983），见上文〕的pNW31c-8，29-1〔Thomashow等，（1980）Cell    19：729〕的HindⅢ-BglⅡ片段再克隆到pCGN566的HindⅢ-BamHI位点，产生pCGN703。
将含有pTiA6转录本7之3′-区〔相应于pTi15955（Barker等，1983，见上文）的碱基2396-2920〕的pCGN703的Sau    3A片段再克隆到PUC18〔Yanishe-Per-ron等（1985），见上文〕的BamHI位点，产生PCGN709。
用含有卡那霉素抗性基因（APH3′Ⅱ）的PCGN587（其产生方法见下文）的EcoRI-SmaI片段代替pCGN709的EcoRI-SmaI多聚连结子区，产生pCGN726。
将pCGN726的EcoRI-SalI片段加上pCGN734的BglⅡ-EcoRI片段插入到pUC8-pUC13-cm（氯霉素抗性，K.Buckley，博士论文，US-San    Diego，1985）的BamHI-Sal    Ⅰ位点，产生pCGN738。为了构建pCGN734，相应于碱基3390-3241之pTiA6的HindⅢ-Sph    Ⅰ片段〔Barker等（1983），见上文〕克隆到M13mp19〔Norran-der等，（1983），见上文〕的HindⅢ-Sph    Ⅰ位点。用相应于碱基3287-3300的寡核苷酸作模板以引导DNA合成。在S1核酸酶处理和HindⅢ消化后，将所得片段克隆到pUC19〔Yan-isch-Perron等（1985），见上文〕的HindⅢ-Sma    Ⅰ位点中。将所得相应于3287-3390碱基〔Barker等（1983），见上文〕的Eco    RI-HindⅢ片段与pTiA6（相应于3390-4494碱基）的EcoRI到Hind    Ⅲ的片段一起克隆到pUC8〔Vieira和MessiHg（1982），见上文〕EcoRI位点：，得到pCGN    734。pCGN    726C是由pCGN738缺失900bp的Eco    RI-EcoRI片段而衍生得到的。
pCGN    766c的构建（35S起动子-3′区）
将含有CaMV-35S启动子、1ATG卡那霉素基因和pTi6之Bam    HI片段19的pCGN167（其构建见下文）的Hind    Ⅲ-BamHI片段克隆到PUc19〔Norrander等（1983），见上文;Yanisch-Perron等（1985），见上文〕的Bam    HI-Hind    Ⅲ位点，产生pCGN976。
将pCGN976（35S启动基因）的0.7kb    Hind    Ⅲ-Eco    RI片段和pCGN709（转录本7∶3′，其构建见上文）的0.5kbEcoRI-Sal    Ⅰ片段插入到pCGN566的Hind    Ⅲ-Sal    Ⅰ位点，以扩展35S启动子和转录本7的3′区，产生pCGN766c。pCGN783的最终构建
pCGN766c的0.7kb的Hind    Ⅲ-EcoRI片段（CaMV-35S起动基因）连结到pCGN726c（1-ATG-KAN-3′区）的1.5kb的EcoRI-Sal    Ⅰ片段再克隆到pUC119（J.Vieira    Rutgrs大学，纽约）的Hind    Ⅲ-Sal    Ⅰ位点，产生pCGN778。
用pCGN778的2.2kb区，即含有CaMV    35S启动子（1-ATG-KAN-3′区）的Hind    Ⅲ-Sal    Ⅰ片段取代pCGN739的Hind    Ⅲ-Sal    Ⅰ多聚连结子区，以产生pCGN783。
pCGN587按下述方法制备：将含有APH3′Ⅱ〔Jorgen-sen等Mol.Gen.（1979）177：65〕全部结构基因的Tn5的Hind    Ⅲ-Sma    Ⅰ片段克隆到pUC8〔Vieira和Messing    Gene（1982），19：259〕中，因其中有一个EcoRI位点直接与此Sma    Ⅰ位点相邻，故此片段可转化成为Hind    Ⅲ-EcoRI片段。之后使含有APH′Ⅱ基因之3′-区的Pst    Ⅰ-EcoRI片段与EcoRI-BamHI-SalI-Pst    Ⅰ连接子结合到PUC7（pCGN546W）的Eco    RI位点。因为此结构物并不贡献卡那霉素抗性故可将APH3′II基因的Bgl    Ⅱ-Pst    Ⅰ片段插入到Bam    HI-Pst位点（pCGN546x）以获得卡那霉素抗性。这一过程再装配了APH3′Ⅱ基因，从而使Eco    RI位点接于基因侧翼。一个ATG密码子处于解读区及带有APH′Ⅱ之ATG起动密码子的读码区之上游。对此不希望要的ATG，可将ApH3′Ⅱ之5′-末端的Sau    3A-Pst    Ⅰ片段（该片段没有这一多余的ATG）插入到pCGN546W的Bam    HI-pst    Ⅰ位点以避免这个不需要的ATG拼接到序列内，从而得到质粒pCGN550。然后，将含有APH3′Ⅱ基因之pCGN550的EcoRI片段克隆到PUC8-PUC13〔K.Buckley（1985），见上文〕的EcoRI位点，得到PCGN551。
之后将每个含有APH3′Ⅱ基因的EcoRI片段克隆到含有供表达之章鱼碱合成酶密码暗盒的pCGN51的唯一EcoRI位点中，（如例1所叙的那样）以提供PCGN548（2ATG）和PCGN552（1ATG）。用EcoRI消化有呈适当定向之OCS5′和OCS3′的PCGN451质粒，并将含有完整卡那霉素抗性基因之PCGN551的EcoRI片段插入到EcoRI位点中，以提供在合适定向上有卡那霉素抗性基因的PCGN522。
用这个OCS/KAN基因为反型的双重载体PCGN587提供一个可供选择的标志。
工程化章鱼碱合成酶启动子暗盒5′部分由来自XhoI之15208-13644bp的pTiA6    DNA组成〔Bar    ker等（1983），见上文〕，它还含有卷入T-DNA转移的T-DNA边界区序列（边缘）。在质粒PCGN587中，PCGN552的OCS/KAN基因提供一个可选择的标志和右侧边缘区。而左侧边界区首先作为Hind    Ⅲ-Smal片段（PCGN502）（602-2212bp）被克隆到M13    mp    9中，之后再作为KpnI-EcoRI片段克隆到PCGN565中，以提供PCGN580。PCGN565是基于PUC8-cm的克隆化载体，但含PUC18连结子。用BamHI使PCGN580线性化，被用于代替PVCK102〔Knauf和Nester    Plasmid（1982）8：45〕的较小片段，以产生PCGN585。用来自含有OCS/KAN基因的PCGN55的xho片段代替pCGN585的较小的Sal    Ⅰ片段，可得到PCGN587。
为构建PCGN    167，用AluI消化CaMV得到CaMV的Alu    Ⅰ片段（bp7144-7735）〔Gardner等，Nucl.
Acids.Res（1981）9：2871-2888〕并将其克隆到M13mp7〔Vieira，Gene（1982）19：259〕的HincⅡ切点中，产生c614。C614经EcoRI消化产生含有35S启动子的C614的EcoRI片段，将其克隆到PUC8〔Vieira等，Gene（1982）19：259〕的EcoRI位点上，以产生PCGN146。
为修整启动子区，用BgiⅡ和Bal31处理BglⅡ位点（bp7670），之后将BglⅡ连结子接到Bal31处理的DNA上，产生PCGN147。
用BglⅡ消化PCGN528（见下）并插入一段来自PCGN147的BamHI-BglⅡ启动子片段，制得含有启动子区、可选择性标志（有2个ATG的KAN）和3′区的PCGN148a。将此片段克隆到PCGN528的Bgl    Ⅱ位点，以致Bgl    Ⅱ位点与PCGN528的卡那霉素基因相邻近。
用于这一构建的穿梭载体即PCGN528，可按下述方法制得用HindⅢ-BamHI消化含Tn5的质粒（Tn5中包含有卡那霉素基因〔Jorgenson等，Mol.Gen.（1979）133：65〕），并将此含卡那霉素基因的HindⅢ-BamHI插入到PACYC184〔chang和Cohen，J.Bacteriol.（1978）134：1141-1156〕之四环素基因中的HindⅢ-BamHI位点内得到pCGN525。将BamHI片段199fpTiA6〔Thomashow等，Cell（1980）19：729-739〕插入到PCGN525的BamHI位点，制成PCGN526。用XhoI消化和再连结，由PCGN526删除一小的Xho    Ⅰ片段即制得PCGN528。
将PMB9    KanXXI的BamHI卡那霉素基因克隆到PCCN148a的BamHI位点，制得PCGN149a。
PMB9KanXXI是一个PUC4K变异体〔Vieira和Mes-sing，Gene（1982）19：259-268〕，它失去了XhoI位点但含有来自Tn903的功能性卡那霉素基因，从而使之在土壤杆菌中得以有效地选择。
用Bgl    Ⅱ和SphI消化PCGN149a。之后用BamHI和SphI消化MI（见下文），分离出BamHI-SphI片段并以其取代PCGN149a的小的Bgl    Ⅱ-Sphl片段。这样就产生了PCGN167，该结构物含有全长的CaMV启动子、1ATG-卡那霉素基因、3′末端及细菌的Tn903型卡那霉素基因。MI是PCGN550（参看PCGN587的构建）的一个EcoRI片段，它被克隆到M13mp9的EcoRI克隆位点，克隆方式是使1ATG-卡那霉素基因中的PstI位点与M13mp9的多聚连接子区相邻。
由上述的结果可以看出，如能提供与宿主内表达之基因的mRNA互补的序列并使之转录，便有可能调节植物宿主基因组内基因的表达。通过这一途径，各种过程可得以改变或控制，从而导致提高特殊产物的产量、改变细胞的分化和发育、抑制某些产物的生成、并改变其表型等等。
应用反向控制的能使特定产物的表达有不同程度的降低或受到明显的抑制。通过这一途径，能够在没有外来蛋白的产生和针对某一特定基因的条件下改变细胞的表型。
为了清晰阐明本发明，虽通过前述的举例说明和实施例对本发明作了详尽的叙述，但是显然在不超出待批权利要求之范围的前提下，实践中是可作某些改变的。
Figure 87102348_IMG3

Claims (10)

1、一种调节植物细胞内基因表达的方法，其包括：
向所说的植物细胞基因组内整合一构建物，该构建物含有在所说的植物细胞中有功能的启动子、具有与所说细胞中内源性RNA互补之可转录链的dSDNA序列、以及在所说的细胞中有功能的终止区；
培养含有所说的构建物的所说的植物细胞，以使所说的互补链被转录并调节所说的内源性RNA在所说细胞中的功能。
2、根据权利要求1的方法，其中所说的内源性RNA是信使RNA。
3、根据权利要求2的方法，其中调节所说的功能可导致某一表型的性状被改变。
4、一种调节植物细胞中基因表达的方法，其包括：
向所说的植物细胞基因组中整合-构建物，该构建物包括在所说的植物细胞中有功能的启动子、包含多聚半乳糖醛酸酶基因之至少200bp可转录部分及与多聚半乳糖醛酸酶信使RNA互补之可转录链的dsDNA序列，以及一个在上所说的细胞中有功能的终止区;
培养含有所说的已整合之构建物的所说的植物细胞，以使所说的互补链被转录并在所说的植物细胞中调节所说的多聚半乳糖醛酸酶的表达。
5、根据权利要求1的方法制备的植物细胞。
6、一种DNA构建物，该构建物包括在植物细胞中有功能的转录起始区、包含与植物细胞内源性RNA序列互补的可转录链的ds-DNA序列以及转录终止区。
7、根据权利要求6的DNA构建物，其包括编码一种在植物细胞中能进行选择之标志的序列。
8、包含一个在原核宿主中有功能的复制系统和一个根据权利要求6的DNA的质粒。
9、包含一个在土壤杆菌属中有功能的复制系统及一个根据权利要求6的DNA构建物的质粒。
10、根据权利要求1的方法产生的细胞衍生的植物。
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