JP2000023685A - 植物細胞における遺伝子の発現の調節方法 - Google Patents
植物細胞における遺伝子の発現の調節方法Info
- Publication number
- JP2000023685A JP2000023685A JP11177372A JP17737299A JP2000023685A JP 2000023685 A JP2000023685 A JP 2000023685A JP 11177372 A JP11177372 A JP 11177372A JP 17737299 A JP17737299 A JP 17737299A JP 2000023685 A JP2000023685 A JP 2000023685A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ser
- sequence
- plant cell
- lys
- ile
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
- C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なアンチセンス制御の方法の提供。
【解決手段】 植物細胞における遺伝子の発現を調節す
るための方法であって、配列表：１に示すアミノ酸配列
をコードする塩基配列を含むように特徴づけられたポリ
ガラクツロナーゼ（ＰＧ）ＤＮＡ配列の一部を含んで成
る組換えＤＮＡ構造体を前記植物細胞ゲノム中に組込
み、前記組込まれた構造体を含む前記植物細胞を増殖
し、それによって前記アンチ−センスＲＮＡが転写さ
れ、そして前記植物細胞におけるＰＧ ｍＲＮＡの発現
を調節することを含んで成る方法。
るための方法であって、配列表：１に示すアミノ酸配列
をコードする塩基配列を含むように特徴づけられたポリ
ガラクツロナーゼ（ＰＧ）ＤＮＡ配列の一部を含んで成
る組換えＤＮＡ構造体を前記植物細胞ゲノム中に組込
み、前記組込まれた構造体を含む前記植物細胞を増殖
し、それによって前記アンチ−センスＲＮＡが転写さ
れ、そして前記植物細胞におけるＰＧ ｍＲＮＡの発現
を調節することを含んで成る方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】遺伝子工学による植物の変性
は、単細胞生物及び哺乳類細胞の分子生物学の理解及び
利用に遅れをとって来た。外来性ＤＮＡによる単細胞微
生物又は哺乳類細胞の安定した形質転換のために効果的
だと立証された技法は、植物細胞に関しても有用な類似
法であるとは見出されてはいない。従って、単細胞微生
物及び哺乳類細胞に関与する多くの業績にもかかわら
ず、植物細胞に関する業績の数は、実質的に少なく、そ
して他のタイプの生物に関する経験内容を、植物細胞に
関する好結果をもたらす実施態様に容易に変えることは
できない。
は、単細胞生物及び哺乳類細胞の分子生物学の理解及び
利用に遅れをとって来た。外来性ＤＮＡによる単細胞微
生物又は哺乳類細胞の安定した形質転換のために効果的
だと立証された技法は、植物細胞に関しても有用な類似
法であるとは見出されてはいない。従って、単細胞微生
物及び哺乳類細胞に関与する多くの業績にもかかわら
ず、植物細胞に関する業績の数は、実質的に少なく、そ
して他のタイプの生物に関する経験内容を、植物細胞に
関する好結果をもたらす実施態様に容易に変えることは
できない。
【０００２】多くの場合、新しい形質を導入することよ
りもむしろ、植物細胞の存在形質を変性することが好ま
しいであろう。従って、他と比較して１つの対立遺伝子
の優先的な発現を提供する特定の酵素、他と比較して１
つのアイソザイム又は同様のものの活性を変性すること
が望まれるであろう。多くの場合、発現を完全に阻害す
るよりもむしろ、構造遺伝子の発現の量を減じることが
望まれる。従って、特定の植物細胞、植物組織又は植物
の表現型の指図された変性を可能にするであろう技法を
開発することが興味の対象である。
りもむしろ、植物細胞の存在形質を変性することが好ま
しいであろう。従って、他と比較して１つの対立遺伝子
の優先的な発現を提供する特定の酵素、他と比較して１
つのアイソザイム又は同様のものの活性を変性すること
が望まれるであろう。多くの場合、発現を完全に阻害す
るよりもむしろ、構造遺伝子の発現の量を減じることが
望まれる。従って、特定の植物細胞、植物組織又は植物
の表現型の指図された変性を可能にするであろう技法を
開発することが興味の対象である。
【０００３】
【従来の技術】Ｃｒｏｗｌｅｙなど、Ｃｅｌｌ（１９８
５）４３：６３３〜６４１は、ディクチオステリウム
（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）中にトランスフェクト
されたジスコイジン遺伝子のアンチ−センス構造体を使
用して、内在性ジスコイジン遺伝子の発現を抑制したこ
とを記載する。またこの中に引用された参考文献も参照
のこと。アンチ−センス調節がまた、Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇなど、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：７０３〜７
０６；Ｐｒｅｉｓｓなど、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３
１３：２７〜３２；Ｍｅｌｔｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：１４
４〜１４８；Ｉｚａｎｔ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ（１９８５）２２９：３４５〜３５２；及び
Ｋｉｍ及びＷｏｌｄ，Ｃｅｌｌ（１９８５）４２：１２
９〜１３８によって記載された来た。
５）４３：６３３〜６４１は、ディクチオステリウム
（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）中にトランスフェクト
されたジスコイジン遺伝子のアンチ−センス構造体を使
用して、内在性ジスコイジン遺伝子の発現を抑制したこ
とを記載する。またこの中に引用された参考文献も参照
のこと。アンチ−センス調節がまた、Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇなど、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：７０３〜７
０６；Ｐｒｅｉｓｓなど、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３
１３：２７〜３２；Ｍｅｌｔｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：１４
４〜１４８；Ｉｚａｎｔ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ（１９８５）２２９：３４５〜３５２；及び
Ｋｉｍ及びＷｏｌｄ，Ｃｅｌｌ（１９８５）４２：１２
９〜１３８によって記載された来た。
【０００４】また、Ｉｚａｎｔ及びＷｅｉｎｔｒａｕ
ｂ．Ｃｅｌｌ（１９８４）３６：１００７〜１０１５；
Ｐｅｓｔｋａなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：７５２５〜７５２８；
Ｍｉｚｕｎｏなど、前記（１９８４）８１：１９６６〜
１９７０；Ｃｏｌｅｍａｎなど、Ｃｅｌｌ（１９８４）
３７：６８３〜６９１；Ｔｒａｖｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ
（１９８４）３１１：４１０及びＷｅｉｎｔｒａｕｂな
ど、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８
５）１：２２〜２５も参照のこと。ＭｃＧａｒｒｙ及び
Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：３９９〜４０３は、
熱誘発性アンチ−センスＲＮＡによる熱ショックタンパ
ク質の阻害を報告する。
ｂ．Ｃｅｌｌ（１９８４）３６：１００７〜１０１５；
Ｐｅｓｔｋａなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：７５２５〜７５２８；
Ｍｉｚｕｎｏなど、前記（１９８４）８１：１９６６〜
１９７０；Ｃｏｌｅｍａｎなど、Ｃｅｌｌ（１９８４）
３７：６８３〜６９１；Ｔｒａｖｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ
（１９８４）３１１：４１０及びＷｅｉｎｔｒａｕｂな
ど、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８
５）１：２２〜２５も参照のこと。ＭｃＧａｒｒｙ及び
Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：３９９〜４０３は、
熱誘発性アンチ−センスＲＮＡによる熱ショックタンパ
ク質の阻害を報告する。
【０００５】
【発明の要約】植物細胞における発現の調節は、転写さ
れたＤＮＡ配列が宿主によってすでに転写されたＤＮＡ
配列に少なくとも一部相補的である遺伝子を含有するＤ
ＮＡ配列を植物細胞宿主中に組込むことによって達成さ
れる。組込まれた外因性ＤＮＡは、植物細胞宿主によっ
て認識された転写開始領域の転写調節下にあるであろ
う。この組込まれた外因性ＤＮＡの転写は、宿主細胞の
内因性ＲＮＡに相補的であろうアンチ−センスＲＮＡの
マルチコピーをもたらすであろう。このアンチ−センス
ｍＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの機能の減少をもた
らすであろう。
れたＤＮＡ配列が宿主によってすでに転写されたＤＮＡ
配列に少なくとも一部相補的である遺伝子を含有するＤ
ＮＡ配列を植物細胞宿主中に組込むことによって達成さ
れる。組込まれた外因性ＤＮＡは、植物細胞宿主によっ
て認識された転写開始領域の転写調節下にあるであろ
う。この組込まれた外因性ＤＮＡの転写は、宿主細胞の
内因性ＲＮＡに相補的であろうアンチ−センスＲＮＡの
マルチコピーをもたらすであろう。このアンチ−センス
ｍＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの機能の減少をもた
らすであろう。
【０００６】
【発明の実施の形態】ＲＮＡ利用の調節、特に植物宿主
細胞の表現型特性の調節のための方法及び組成物が提供
される。その組成物は、宿主に内在性のＲＮＡ、特にｍ
ＲＮＡ上に存在する配列に相補的である配列によって分
離された転写開始及び終結領域を有する転写構造体を含
む。この手段によって、植物宿主細胞に相補的な種々の
方法が調節され得、その結果、個々のタンパク質の産生
が減じられ、多くの酵素工程が調節され、特定の代謝経
路が１又はそれよりも多くの他の代謝経路よりはむしろ
調節され又は阻害され、非タンパク質性生成物の産生が
減じられ、細胞分化が変性され及び同様のものが生ぜし
められ得る。
細胞の表現型特性の調節のための方法及び組成物が提供
される。その組成物は、宿主に内在性のＲＮＡ、特にｍ
ＲＮＡ上に存在する配列に相補的である配列によって分
離された転写開始及び終結領域を有する転写構造体を含
む。この手段によって、植物宿主細胞に相補的な種々の
方法が調節され得、その結果、個々のタンパク質の産生
が減じられ、多くの酵素工程が調節され、特定の代謝経
路が１又はそれよりも多くの他の代謝経路よりはむしろ
調節され又は阻害され、非タンパク質性生成物の産生が
減じられ、細胞分化が変性され及び同様のものが生ぜし
められ得る。
【０００７】ｍＲＮＡの配列に相補的な配列は、普通少
なくとも約１５ヌクレオチド、より普通には少なくとも
約２０ヌクレオチド、好ましくは約３０ヌクレオチド及
びより好ましくは約５０ヌクレオチドであり、そして１
００ヌクレオチド又はそれ以上、普通約５０００ヌクレ
オチドよりも少なく、より普通には２０００ヌクレオチ
ドよりも少なく、そして好ましくは１０００ヌクレオチ
ドよりも少ない。
なくとも約１５ヌクレオチド、より普通には少なくとも
約２０ヌクレオチド、好ましくは約３０ヌクレオチド及
びより好ましくは約５０ヌクレオチドであり、そして１
００ヌクレオチド又はそれ以上、普通約５０００ヌクレ
オチドよりも少なく、より普通には２０００ヌクレオチ
ドよりも少なく、そして好ましくは１０００ヌクレオチ
ドよりも少ない。
【０００８】その配列はｍＲＮＡのいづれかの配列に相
補的であり、すなわち、それは５′−末端又はキャッピ
ング部位に近く、該キャッピング部位から下流に存在
し、該キャッピング部位と開始コドンの間に存在し、そ
して非コード領域のすべて又は一部のみを包含し、非コ
ード及びコード領域をブリッジし、該コード領域のすべ
て又は一部に相補的であり、該コード領域の３′−末端
に相補的であり又はｍＲＮＡの３′−非翻訳領域に相補
的であることができる。ｍＲＮＡに関しては、該ｍＲＮ
Ａはプロセス又はプロセスされず、すなわちイントロン
を含むことができる。従って、非コード領域は、５′又
は３′の非コードフランキング領域及びイントロンを含
むことができる。
補的であり、すなわち、それは５′−末端又はキャッピ
ング部位に近く、該キャッピング部位から下流に存在
し、該キャッピング部位と開始コドンの間に存在し、そ
して非コード領域のすべて又は一部のみを包含し、非コ
ード及びコード領域をブリッジし、該コード領域のすべ
て又は一部に相補的であり、該コード領域の３′−末端
に相補的であり又はｍＲＮＡの３′−非翻訳領域に相補
的であることができる。ｍＲＮＡに関しては、該ｍＲＮ
Ａはプロセス又はプロセスされず、すなわちイントロン
を含むことができる。従って、非コード領域は、５′又
は３′の非コードフランキング領域及びイントロンを含
むことができる。
【０００９】特定の部位にアンチ−センス配列が結合
し、そして該アンチ−センス鎖の長さは、目的とする阻
害度、配列のユニークさ、アンチ−センス配列の安定性
又は同様のものに依存して異なるであろう。従って、こ
れらの因子は、特定のアンチ−センス配列により観察さ
れた経験に基づいて多少決定されるであろう。配列は、
単一配列又は複数の反復配列をタンデムに有する反復配
列であり、ここで該単一配列は、多くのｍＲＮＡに結合
することができる。ある場合、ホモ二重鎖を提供するよ
りはむしろ、ヘテロ二重鎖が使用され得、ここでその同
じ配列は、異なったｍＲＮＡに相補的な領域を有するこ
とによって、多くのｍＲＮＡの阻害を提供することがで
きる。
し、そして該アンチ−センス鎖の長さは、目的とする阻
害度、配列のユニークさ、アンチ−センス配列の安定性
又は同様のものに依存して異なるであろう。従って、こ
れらの因子は、特定のアンチ−センス配列により観察さ
れた経験に基づいて多少決定されるであろう。配列は、
単一配列又は複数の反復配列をタンデムに有する反復配
列であり、ここで該単一配列は、多くのｍＲＮＡに結合
することができる。ある場合、ホモ二重鎖を提供するよ
りはむしろ、ヘテロ二重鎖が使用され得、ここでその同
じ配列は、異なったｍＲＮＡに相補的な領域を有するこ
とによって、多くのｍＲＮＡの阻害を提供することがで
きる。
【００１０】アンチ−センス配列は、結合の確率を高め
るために、非反復配列又は反復配列に相補的であること
ができる。従って、そのアンチ−センス配列は、非反復
配列の１つのユニットの反復配列又は多くのユニットの
反復配列結合に関与され得る。そのアンチ−センス配列
は、単一の遺伝子又は多くの遺伝子の発現の調節をもた
らすことができる。転写構造体は、転写に向かって、転
写開始領域、センス鎖上でアンチ−センスＲＮＡをコー
ドする配列及び転写終結領域から成るであろう。
るために、非反復配列又は反復配列に相補的であること
ができる。従って、そのアンチ−センス配列は、非反復
配列の１つのユニットの反復配列又は多くのユニットの
反復配列結合に関与され得る。そのアンチ−センス配列
は、単一の遺伝子又は多くの遺伝子の発現の調節をもた
らすことができる。転写構造体は、転写に向かって、転
写開始領域、センス鎖上でアンチ−センスＲＮＡをコー
ドする配列及び転写終結領域から成るであろう。
【００１１】その転写開始領域は、構成的な発現又は調
節された発現を提供することができる。植物において機
能的である多くの数のプロモーターを利用できる。これ
らのプロモーターは、Ｔｉ−Ｒｉ−プラスミド、植物細
胞、植物ウィルス又は他の宿主（ここで、プロモーター
は、植物中において機能的であるように思われる）から
得られる。例示的なプロモーターは、植物中で機能的な
細菌起源のプロモーターの例示として、オクトピンシン
テターゼプロモーター、ノパリンシンテターゼプロモー
ター、ナトピンシンテターゼプロモーター、等を含む。
節された発現を提供することができる。植物において機
能的である多くの数のプロモーターを利用できる。これ
らのプロモーターは、Ｔｉ−Ｒｉ−プラスミド、植物細
胞、植物ウィルス又は他の宿主（ここで、プロモーター
は、植物中において機能的であるように思われる）から
得られる。例示的なプロモーターは、植物中で機能的な
細菌起源のプロモーターの例示として、オクトピンシン
テターゼプロモーター、ノパリンシンテターゼプロモー
ター、ナトピンシンテターゼプロモーター、等を含む。
【００１２】ウィルスプロモーターは、カリフラワーモ
ザイクウィルスの完全な長さ（３５Ｓ）及び領域VIのプ
ロモーター、等を含む。内因性植物のプロモーターは、
リブロース−１，６−ビホスフェート（ＲＵＢＰ）カル
ボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、β−コングリ
シニンプロモーター、ファセオリンプロモーター、ＡＤ
Ｈプロモーター、熱ショックプロモーター、組織特異性
プロモーター、果実の成熟に関連するプロモーター、等
を含む。転写開始領域は、天然に存在する領域、調節領
域を欠くＲＮＡポリマラーゼ結合領域又は１つの遺伝子
からのＲＮＡポリマラーゼ結合領域及び異なった遺伝子
からの調節領域の組み合せであることができる。その調
節領域は、物理的刺激、たとえば熱（熱ショック遺伝子
に関する）、光（ＲＵＢＰカルボキシラーゼＳＳＵに関
する）又は同様のものに反応することができる。
ザイクウィルスの完全な長さ（３５Ｓ）及び領域VIのプ
ロモーター、等を含む。内因性植物のプロモーターは、
リブロース−１，６−ビホスフェート（ＲＵＢＰ）カル
ボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、β−コングリ
シニンプロモーター、ファセオリンプロモーター、ＡＤ
Ｈプロモーター、熱ショックプロモーター、組織特異性
プロモーター、果実の成熟に関連するプロモーター、等
を含む。転写開始領域は、天然に存在する領域、調節領
域を欠くＲＮＡポリマラーゼ結合領域又は１つの遺伝子
からのＲＮＡポリマラーゼ結合領域及び異なった遺伝子
からの調節領域の組み合せであることができる。その調
節領域は、物理的刺激、たとえば熱（熱ショック遺伝子
に関する）、光（ＲＵＢＰカルボキシラーゼＳＳＵに関
する）又は同様のものに反応することができる。
【００１３】他方、その調節領域は、分化シグナル、た
とえばβ−コングリシニン遺伝子、ファセオリン遺伝子
又は同様のものに敏感である。第三タイプの調節領域
は、代謝物に反応する。アンチ−センス配列ＲＮＡの発
現の時及びレベルは、産生された表現型に対して一定の
効果を有する。従って、選択されたプロモーターは、ア
ンチ−センスＲＮＡの効果を決定するであろう。いづれ
か便利な終結領域、すなわちＲＮＡポリマラーゼ結合領
域の終結領域又は異なった終結領域が使用され得る。種
々の終結領域が利用でき、そしてまず便利さからそれを
選択し、ここで従来の構造体又はＤＮＡ配列が利用でき
る。便利には、オピン終結領域又は内在性遺伝子、（た
とえば、前に記載された遺伝子）からの終結領域を、使
用することができる。
とえばβ−コングリシニン遺伝子、ファセオリン遺伝子
又は同様のものに敏感である。第三タイプの調節領域
は、代謝物に反応する。アンチ−センス配列ＲＮＡの発
現の時及びレベルは、産生された表現型に対して一定の
効果を有する。従って、選択されたプロモーターは、ア
ンチ−センスＲＮＡの効果を決定するであろう。いづれ
か便利な終結領域、すなわちＲＮＡポリマラーゼ結合領
域の終結領域又は異なった終結領域が使用され得る。種
々の終結領域が利用でき、そしてまず便利さからそれを
選択し、ここで従来の構造体又はＤＮＡ配列が利用でき
る。便利には、オピン終結領域又は内在性遺伝子、（た
とえば、前に記載された遺伝子）からの終結領域を、使
用することができる。
【００１４】種々のフラグメントを、リンカー、アダプ
ター又は同様のものによって、もしくは便利な制限部位
が利用できる場合、直接的に連結することができる。特
に複製システムに結合されるＤＮＡ配列は、段階的に連
結され、ここで、該複製システム上に存在するマーカー
は、選択のために使用され得る。本発明の構造体は、種
々の方法で宿主細胞中に導入され得る。プロトプラス
ト、傷つけられた葉又は体外培養組織に関しては、Ａ．
ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を特
に使用する。使用され得る他の技法は、プロトプラスト
によるエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒ
ａｔｉｏｎ）、リポゾーム融合、マイクロインジェクシ
ョン又は同様のものを含む。植物細胞を形質転換するた
めの特定の方法は、本発明で臨海的ではない。
ター又は同様のものによって、もしくは便利な制限部位
が利用できる場合、直接的に連結することができる。特
に複製システムに結合されるＤＮＡ配列は、段階的に連
結され、ここで、該複製システム上に存在するマーカー
は、選択のために使用され得る。本発明の構造体は、種
々の方法で宿主細胞中に導入され得る。プロトプラス
ト、傷つけられた葉又は体外培養組織に関しては、Ａ．
ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を特
に使用する。使用され得る他の技法は、プロトプラスト
によるエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒ
ａｔｉｏｎ）、リポゾーム融合、マイクロインジェクシ
ョン又は同様のものを含む。植物細胞を形質転換するた
めの特定の方法は、本発明で臨海的ではない。
【００１５】いづれかの植物、たとえば被子植物、裸子
植物、単子葉植物及び双子葉植物が、本発明に従って使
用され得る。対象の植物は、穀類、たとえば小麦、大
麦、トウモロコシ、トリチカル（ｔｒｉｔｉｃａｌ
ｅ）；果物類、たとえばアプリコット、オレンジ、グレ
ープフルーツ、リンゴ、ナシ、アボカド、等；堅果類、
たとえばクルミ、アーモンド、ムラサキハシバミ、ペカ
ン、等；野菜；たとえばニンジン、レタス、トマト、セ
ロリ、カブラ、ジャガイモ、ブロッコリィ、アスパラガ
ス、等；木質種、たとえばポプラ、松、セコイア、杉、
樫、等；装飾用花；又は他の金になる収穫物、たとえば
タバコ、ホホバ、ナタネの種子、クフェア（Ｃｕｐｈｅ
ａ）、大豆、ヒマワリ、破糖ダイコン、ベニバナ、等を
含む。おのおのの種に関しては、宿主の表現型を変える
ために、調節するための異なった遺伝子が一般的に存在
するであろう。
植物、単子葉植物及び双子葉植物が、本発明に従って使
用され得る。対象の植物は、穀類、たとえば小麦、大
麦、トウモロコシ、トリチカル（ｔｒｉｔｉｃａｌ
ｅ）；果物類、たとえばアプリコット、オレンジ、グレ
ープフルーツ、リンゴ、ナシ、アボカド、等；堅果類、
たとえばクルミ、アーモンド、ムラサキハシバミ、ペカ
ン、等；野菜；たとえばニンジン、レタス、トマト、セ
ロリ、カブラ、ジャガイモ、ブロッコリィ、アスパラガ
ス、等；木質種、たとえばポプラ、松、セコイア、杉、
樫、等；装飾用花；又は他の金になる収穫物、たとえば
タバコ、ホホバ、ナタネの種子、クフェア（Ｃｕｐｈｅ
ａ）、大豆、ヒマワリ、破糖ダイコン、ベニバナ、等を
含む。おのおのの種に関しては、宿主の表現型を変える
ために、調節するための異なった遺伝子が一般的に存在
するであろう。
【００１６】細胞が形質転換された後、その細胞は、植
物中に再生されるであろう。種々の技法が、細胞から植
物を再生するために存在する。カルスはその細胞から発
育され、そしてそのカルスは、新芽を形成するように誘
導され、そして次に植物を再生するために土壌中の適切
な栄養培地に移され得る。次に、その植物は成長し、そ
して多くの世代にわたって表現型の変化の安定性を確立
するために、他の植物と交差され得る。他の技法が、受
粉又は受精なしに植物を再生するために使用され得る。
培養物から再生され得るこれらの植物の遺伝子型は、収
穫物種類として直接的に適用できないので、形質転換さ
れた植物は、適切な育種系に形質を転換するために、他
の形質転換されていないジャームプラスマにより交差さ
れ得る。
物中に再生されるであろう。種々の技法が、細胞から植
物を再生するために存在する。カルスはその細胞から発
育され、そしてそのカルスは、新芽を形成するように誘
導され、そして次に植物を再生するために土壌中の適切
な栄養培地に移され得る。次に、その植物は成長し、そ
して多くの世代にわたって表現型の変化の安定性を確立
するために、他の植物と交差され得る。他の技法が、受
粉又は受精なしに植物を再生するために使用され得る。
培養物から再生され得るこれらの植物の遺伝子型は、収
穫物種類として直接的に適用できないので、形質転換さ
れた植物は、適切な育種系に形質を転換するために、他
の形質転換されていないジャームプラスマにより交差さ
れ得る。
【００１７】広範囲の種類の変性が多くの型の植物に行
なわれ得る。これらの変性は、脂肪酸源、たとえばナタ
ネの種子、クフェア又はホホバの脂肪酸分布を変え、果
物及び野菜の成熟を遅らせ、果実及び野菜の官能的な貯
蔵、荷造、採集及び／又は加工を変え、花束のために切
られた花の開花又は老化を遅らせ、植物中における１又
はそれよりも多くの物質、たとえばカフェイン、テオフ
ィリン及びニコチンの量を減じ、耐病性を増強し、又は
植物における耐ウィルス病を増強することを含むことが
できる。
なわれ得る。これらの変性は、脂肪酸源、たとえばナタ
ネの種子、クフェア又はホホバの脂肪酸分布を変え、果
物及び野菜の成熟を遅らせ、果実及び野菜の官能的な貯
蔵、荷造、採集及び／又は加工を変え、花束のために切
られた花の開花又は老化を遅らせ、植物中における１又
はそれよりも多くの物質、たとえばカフェイン、テオフ
ィリン及びニコチンの量を減じ、耐病性を増強し、又は
植物における耐ウィルス病を増強することを含むことが
できる。
【００１８】脂肪酸分布を変えることに関しては、目的
とする種はココナッツ及びヤシの木、クフェア種、ナタ
ネの種子又は同様のものである。特定の対象の目的とす
る遺伝子は、アセチルトランスアシラーゼ、アシルキャ
リヤータンパク質、チオエステラーゼ、等である。ニコ
チンの量を変えることに関しては、目的とする種はタバ
コである。この目的とする遺伝子は、Ｎ−メチルプトレ
ッシンオキシターゼ又はプトレッシンＮ−メチルトラン
スフェラーゼである。果物の成熟を遅らせることに関し
ては、目的とする種は、トマト又はアボガドである。そ
の目的とする遺伝子は、ポリカラクツロナーゼ又はセル
ラーゼである。
とする種はココナッツ及びヤシの木、クフェア種、ナタ
ネの種子又は同様のものである。特定の対象の目的とす
る遺伝子は、アセチルトランスアシラーゼ、アシルキャ
リヤータンパク質、チオエステラーゼ、等である。ニコ
チンの量を変えることに関しては、目的とする種はタバ
コである。この目的とする遺伝子は、Ｎ−メチルプトレ
ッシンオキシターゼ又はプトレッシンＮ−メチルトラン
スフェラーゼである。果物の成熟を遅らせることに関し
ては、目的とする種は、トマト又はアボガドである。そ
の目的とする遺伝子は、ポリカラクツロナーゼ又はセル
ラーゼである。
【００１９】カフェインの量を変えることに関しては、
目的とする種はコーヒー〔コフェア・アラビカ（Ｃｏｆ
ｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）〕である。その目的とする遺
伝子は１−メチルキサンチン３−メチルトランスフェラ
ーゼである。テオフィリシンの量を変えることに関して
は、その種は茶〔カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌ
ａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）〕である。その目的とする遺伝
子は１−メチルキサンチン ３−メチルトランスフェラ
ーゼである。花の色を変えることに関しては、目的とす
る種は、ペチュニア、バラ、カーネーション又はキク等
である。その目的とする遺伝子は、カルコンシンテター
ゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ又はデヒドロ
ケンフェロール（フラボン）ヒドロキシラーゼ等であ
る。
目的とする種はコーヒー〔コフェア・アラビカ（Ｃｏｆ
ｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）〕である。その目的とする遺
伝子は１−メチルキサンチン３−メチルトランスフェラ
ーゼである。テオフィリシンの量を変えることに関して
は、その種は茶〔カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌ
ａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）〕である。その目的とする遺伝
子は１−メチルキサンチン ３−メチルトランスフェラ
ーゼである。花の色を変えることに関しては、目的とす
る種は、ペチュニア、バラ、カーネーション又はキク等
である。その目的とする遺伝子は、カルコンシンテター
ゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ又はデヒドロ
ケンフェロール（フラボン）ヒドロキシラーゼ等であ
る。
【００２０】リグニン含有量を変えることに関しては、
目的とする種は、タエダマツ、ドーグラスモミ、ポプラ
等である。その目的とする遺伝子は、シンナモイル−Ｃ
ｏＡ：ＮＡＤＰＨレダクターゼ又はシンナモイルアルコ
ールデヒドロゲナーゼ等である。植物における耐ウィル
ス病を増強することに関しては、目的とするウィルス／
植物の組み合せは、タバコ又はトマトにおけるタバコモ
ザイクウィルス、ビート壊死イエローベインウィルス、
テンサイにおけるリゾマニアの原因物質、イチゴにおけ
る種々のイチゴウィルス又はいづれか他の組み合せであ
る。植物細胞におけるアンチ−センスウィルスＲＮＡの
発現は、ウィルス感染を減じ又は増殖を阻害する。
目的とする種は、タエダマツ、ドーグラスモミ、ポプラ
等である。その目的とする遺伝子は、シンナモイル−Ｃ
ｏＡ：ＮＡＤＰＨレダクターゼ又はシンナモイルアルコ
ールデヒドロゲナーゼ等である。植物における耐ウィル
ス病を増強することに関しては、目的とするウィルス／
植物の組み合せは、タバコ又はトマトにおけるタバコモ
ザイクウィルス、ビート壊死イエローベインウィルス、
テンサイにおけるリゾマニアの原因物質、イチゴにおけ
る種々のイチゴウィルス又はいづれか他の組み合せであ
る。植物細胞におけるアンチ−センスウィルスＲＮＡの
発現は、ウィルス感染を減じ又は増殖を阻害する。
【００２１】転写構造体は普通、その構成の間、操作及
びクローニングのために複製システム、特に細菌の複製
システムに結合されるであろう。その複製システムは、
便利な複製システム、特にＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中
で機能的である複製システムであり、そして１又はそれ
よりも多くのマーカーが、形質転換された細菌を検出す
るために存在することができる。Ａ．ツメファシエンス
又はＡ．リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）がＤ
ＮＡを転移するために用いられる場合、その構造体はま
た、少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダーに結合される
であろう。従って、その構造体は、１つのＴ−ＤＮＡボ
ーダー、特に右のＴ−ＤＮＡボーダーを含むであろう
し、又は左及び右のＴ−ＤＮＡボーダーの間にはさまれ
得る。
びクローニングのために複製システム、特に細菌の複製
システムに結合されるであろう。その複製システムは、
便利な複製システム、特にＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中
で機能的である複製システムであり、そして１又はそれ
よりも多くのマーカーが、形質転換された細菌を検出す
るために存在することができる。Ａ．ツメファシエンス
又はＡ．リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）がＤ
ＮＡを転移するために用いられる場合、その構造体はま
た、少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダーに結合される
であろう。従って、その構造体は、１つのＴ−ＤＮＡボ
ーダー、特に右のＴ−ＤＮＡボーダーを含むであろう
し、又は左及び右のＴ−ＤＮＡボーダーの間にはさまれ
得る。
【００２２】種々の技法が、転移のための手段としてＴ
ｉ−又はＲｉ−プラスミドを用いて、前記構造体を転移
するために存在する。Ｔ−ＤＮＡにおける構造体が組換
えによってＴｉ−又はＲｉ−プラスミド中に組込まれる
ように成る場合、これらの技法は、アグロバクテリアム
中で複製できるプラスミドを提供することを含む。他
方、アグロバクテリアム中のＴｉ−又はＲｉ−プラスミ
ドが、構造体のＴ−ＤＮＡと相同のＴ−ＤＮＡ領域を有
するか又は有しない場合、二成分ベクターが使用され得
る。いづれにしても、ｖｉｒ遺伝子が内因性プラスミド
上に存在するかぎり、そのＴ−ＤＮＡは植物に好結果を
持って転移され得る。
ｉ−又はＲｉ−プラスミドを用いて、前記構造体を転移
するために存在する。Ｔ−ＤＮＡにおける構造体が組換
えによってＴｉ−又はＲｉ−プラスミド中に組込まれる
ように成る場合、これらの技法は、アグロバクテリアム
中で複製できるプラスミドを提供することを含む。他
方、アグロバクテリアム中のＴｉ−又はＲｉ−プラスミ
ドが、構造体のＴ−ＤＮＡと相同のＴ−ＤＮＡ領域を有
するか又は有しない場合、二成分ベクターが使用され得
る。いづれにしても、ｖｉｒ遺伝子が内因性プラスミド
上に存在するかぎり、そのＴ−ＤＮＡは植物に好結果を
持って転移され得る。
【００２３】発現構造体、特に耐抗生物質、たとえば耐
カナマイシン、耐ヒグロマイシン、耐ゲンタミシン、耐
ブレオマイシン、等の一部としてマーカーを有すること
によって、機能形で該構造体を保持しているこれらの植
物細胞について選択することができる。二成分ベクター
が用いられ、そしてアグロバクテリアムのＴｉ−又はＲ
ｉ−プラスミド中のＴ−ＤＮＡが腫瘍遺伝子を保持する
場合、腫瘍遺伝子の発現を欠く、形態学的に正常な細胞
について選択することができるであろう。エレクトロポ
レーション又はマイクロインジェクションが使用される
場合、瘤（ｇａｌｌ）形成についての関心は存在せず、
そして得られた植物の形態（但し、変性された表現型を
除く）が正常であろうと思われる。
カナマイシン、耐ヒグロマイシン、耐ゲンタミシン、耐
ブレオマイシン、等の一部としてマーカーを有すること
によって、機能形で該構造体を保持しているこれらの植
物細胞について選択することができる。二成分ベクター
が用いられ、そしてアグロバクテリアムのＴｉ−又はＲ
ｉ−プラスミド中のＴ−ＤＮＡが腫瘍遺伝子を保持する
場合、腫瘍遺伝子の発現を欠く、形態学的に正常な細胞
について選択することができるであろう。エレクトロポ
レーション又はマイクロインジェクションが使用される
場合、瘤（ｇａｌｌ）形成についての関心は存在せず、
そして得られた植物の形態（但し、変性された表現型を
除く）が正常であろうと思われる。
【００２４】アンチ−センス鎖の使用の例は、トマトに
おけるポリガラクツロナーゼの発現の調節である。ポリ
ガラクツロナーゼの産生を減じる能力は、トマト植物の
固形含有量に対して陽性の効果を有し、そしてトマトプ
ロセシングを改良することができる。トマト果実中にポ
リガラクツロナーゼの発現を調節するために、転写され
たポリガラクツロナーゼ遺伝子のアンチ−センス鎖を有
する転写構造体が調製される。フランキング領域を含む
完全な遺伝子は使用される必要はなく、便利にはｃＤＮ
Ａ又はそのフラグメントが使用され得る。そのフラグメ
ントは、約１００〜２０００nt、より普通には、１５０
〜１０００ntであろう。
おけるポリガラクツロナーゼの発現の調節である。ポリ
ガラクツロナーゼの産生を減じる能力は、トマト植物の
固形含有量に対して陽性の効果を有し、そしてトマトプ
ロセシングを改良することができる。トマト果実中にポ
リガラクツロナーゼの発現を調節するために、転写され
たポリガラクツロナーゼ遺伝子のアンチ−センス鎖を有
する転写構造体が調製される。フランキング領域を含む
完全な遺伝子は使用される必要はなく、便利にはｃＤＮ
Ａ又はそのフラグメントが使用され得る。そのフラグメ
ントは、約１００〜２０００nt、より普通には、１５０
〜１０００ntであろう。
【００２５】転写開始調節領域は、好ましくは誘導的で
あり、果実ブレーキング（成熟のすぐ前）の時で、構成
的であるよりはむしろ特に活性的である。この目的のた
めに、ポリガラクツロナーゼ遺伝子の転写開始領域が用
いられ、又はもう１つの遺伝子の転写開始領域が成熟の
間、果実の成長に関連する。転写カセットの構成方法
は、本明細書においてはくり返される必要はない。構造
体が調製された後、それは、従来の方法に従ってトマト
植物の細胞中に導入され、そして植物がその細胞から再
生される。
あり、果実ブレーキング（成熟のすぐ前）の時で、構成
的であるよりはむしろ特に活性的である。この目的のた
めに、ポリガラクツロナーゼ遺伝子の転写開始領域が用
いられ、又はもう１つの遺伝子の転写開始領域が成熟の
間、果実の成長に関連する。転写カセットの構成方法
は、本明細書においてはくり返される必要はない。構造
体が調製された後、それは、従来の方法に従ってトマト
植物の細胞中に導入され、そして植物がその細胞から再
生される。
【００２６】
【実施例】次の例は、例示的であって限的するものでは
ない。例１ ：Ａｒｏ Ａ アンチ−センス 材料及び方法 Ｔ４リガーゼは、ＰｒｏＭｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈから
得た。制限酵素、すなわちクレノウポリマラーゼフラグ
メント及びＢａｌ３１を、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｏ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）から得
た。
ない。例１ ：Ａｒｏ Ａ アンチ−センス 材料及び方法 Ｔ４リガーゼは、ＰｒｏＭｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈから
得た。制限酵素、すなわちクレノウポリマラーゼフラグ
メント及びＢａｌ３１を、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｏ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）から得
た。
【００２７】オクトピンカセット、ｐＣＧＮ４５１の構
成 ｏｃｓ ５′−ｏｃｓ３′カセットを、ｐＵＣ８〔Ｖｉｅ
ｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ（１９８
２）１９：２５９〜２６８〕の誘導体中に挿入し、ここ
でＸｈｏＩリンカー（CCTCGAGG）が、ＤＮＡポリマラー
ゼのクレノウフラグメントによりフィルインすることに
よって除去されたＨｉｎｄII部位及びＥｃｏＲＩ部位で
挿入された。
成 ｏｃｓ ５′−ｏｃｓ３′カセットを、ｐＵＣ８〔Ｖｉｅ
ｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ（１９８
２）１９：２５９〜２６８〕の誘導体中に挿入し、ここ
でＸｈｏＩリンカー（CCTCGAGG）が、ＤＮＡポリマラー
ゼのクレノウフラグメントによりフィルインすることに
よって除去されたＨｉｎｄII部位及びＥｃｏＲＩ部位で
挿入された。
【００２８】切除されたＢａｍＨＩ（１３７７４）〜Ｅ
ｃｏＲＩ（リンカー）フラグメントにＴ−ＤＮＡボーダ
ーを含む、オクトピンＴｉ−プラスミドｐＴｉＡ６〔Ｃ
ｕｒｒｉｅｒ ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｒ（１９７６）Ｊ．
Ｂａｃｔ．１２６：１５７〜１６５；Ｔｈｏｍａｓｈｏ
ｗなど、Ｃｅｌｌ（１９８０）１９：７２９〜７３９〕
からのＸｈｏＩ（１５２０８）−ＢａｍＨＩ（１３７７
４）フラグメントを連結することによって、オクトピン
シンテターゼカセットを、調製した〔密接に関連したＴ
ｉ−プラスミドｐＴｉ１５９５５のための番号は、Ｂａ
ｒＲｅｒ、など、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１
９８３）２：３３５〜３５０によってである〕。
ｃｏＲＩ（リンカー）フラグメントにＴ−ＤＮＡボーダ
ーを含む、オクトピンＴｉ−プラスミドｐＴｉＡ６〔Ｃ
ｕｒｒｉｅｒ ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｒ（１９７６）Ｊ．
Ｂａｃｔ．１２６：１５７〜１６５；Ｔｈｏｍａｓｈｏ
ｗなど、Ｃｅｌｌ（１９８０）１９：７２９〜７３９〕
からのＸｈｏＩ（１５２０８）−ＢａｍＨＩ（１３７７
４）フラグメントを連結することによって、オクトピン
シンテターゼカセットを、調製した〔密接に関連したＴ
ｉ−プラスミドｐＴｉ１５９５５のための番号は、Ｂａ
ｒＲｅｒ、など、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１
９８３）２：３３５〜３５０によってである〕。
【００２９】ＸｍｎＩ（１３５１２）によりｐＴｉＡ６
のＴ−領域のＥｃｏＲＩ（１３３６２）〜ＢａｍＨＩ
（１３７７４）サブクローンを消化し、次にＢａｌ３１
エンドヌクレアーゼにより再切除することによって切除
されたＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを得た。Ｅ
ｃｏＲＩリンカー（GGAATTCC）を添加し、そしておよそ
１３０bpゲルのＥｃｏＲＩ〜ＢａｍＨＩフラグメント
を、精製し、Ｍ１３ｍｐ９中にクローン化し、そして配
列決定した。ＥｃｏＲＩリンカーが転写開始点と翻訳開
始コドンとの間の１３６４２で挿入されたクローンを、
ｄｅ Ｇｒｅｖｅなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ
ｅｔ．（１９８２）１：４９９〜５１２の配列と比較す
ることによって同定した。
のＴ−領域のＥｃｏＲＩ（１３３６２）〜ＢａｍＨＩ
（１３７７４）サブクローンを消化し、次にＢａｌ３１
エンドヌクレアーゼにより再切除することによって切除
されたＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを得た。Ｅ
ｃｏＲＩリンカー（GGAATTCC）を添加し、そしておよそ
１３０bpゲルのＥｃｏＲＩ〜ＢａｍＨＩフラグメント
を、精製し、Ｍ１３ｍｐ９中にクローン化し、そして配
列決定した。ＥｃｏＲＩリンカーが転写開始点と翻訳開
始コドンとの間の１３６４２で挿入されたクローンを、
ｄｅ Ｇｒｅｖｅなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ
ｅｔ．（１９８２）１：４９９〜５１２の配列と比較す
ることによって同定した。
【００３０】ＥｃｏＲＩ切断部位は、ｍＲＮＡ出発部位
から下流の位置１３６３９であった。１１２０７でのＳ
ｍａＩ部位を、オリゴヌクレオチドリンカー（CCTCGAG
G）を用いてＸｈｏＩ部位に転換し、そしてＥｃｏＲＩ
（１２８２３）〜該転換されたＸｈｏＩ部位のオクトピ
ン遺伝子の３′末端をカセットに添加した。次に、オク
トピンシンテターゼの５′−領域（１５２０８〜１３６
３９）及び３′−領域（１２８２３〜１１２０７）を有
する得られた発現カセットを、変性されたｐＵＣ８のＸ
ｈｏＩ部位に挿入し、ｐＣＧＮ４５１を提供した。
から下流の位置１３６３９であった。１１２０７でのＳ
ｍａＩ部位を、オリゴヌクレオチドリンカー（CCTCGAG
G）を用いてＸｈｏＩ部位に転換し、そしてＥｃｏＲＩ
（１２８２３）〜該転換されたＸｈｏＩ部位のオクトピ
ン遺伝子の３′末端をカセットに添加した。次に、オク
トピンシンテターゼの５′−領域（１５２０８〜１３６
３９）及び３′−領域（１２８２３〜１１２０７）を有
する得られた発現カセットを、変性されたｐＵＣ８のＸ
ｈｏＩ部位に挿入し、ｐＣＧＮ４５１を提供した。
【００３１】ａｒｏＡ センス／アンチ−センスの二成
分プラスミドの構成 ｐＰＭＧ３８〔Ｃｏｍａｉなど、Ｎａｔｕｒｅ（１９８
５）３１７：７４１〜７４４〕をＢａｍＨＩにより消化
し、ａｒｏＡ遺伝子〔ヌクレオチド１３７７〜１２７０
４；ｓｔａｌｋｅｒなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
（１９８５）２６０：４７２４〜４７２８〕を含むフラ
グメントを得、そして該フラグメントを、ｍａｓプロモ
ーターに関してアンチ−センス（マイナスの方向）でｍ
ａｓ５′〜ｏｃｓ３′カセット、すなわちｐＣＧＮ４６
〔Ｃｏｍａｉなど、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１７：
７４１〜７４４〕のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＣＧＮ
９６４６を得た。ＥｃｏＲＩによるｐＣＧＮ４５１の消
化によりプラスミドｐＰＭＧ４５（ｏｃｓ−ａｒｏＡ）
を得た後、上記と同じａｒｏＡ遺伝子を、ｐＰＭＧ３８
からのＥｃｏＲＩフラグメントとして、オクトピンカセ
ットのｐＣＧＮ４５１に挿入した。
分プラスミドの構成 ｐＰＭＧ３８〔Ｃｏｍａｉなど、Ｎａｔｕｒｅ（１９８
５）３１７：７４１〜７４４〕をＢａｍＨＩにより消化
し、ａｒｏＡ遺伝子〔ヌクレオチド１３７７〜１２７０
４；ｓｔａｌｋｅｒなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
（１９８５）２６０：４７２４〜４７２８〕を含むフラ
グメントを得、そして該フラグメントを、ｍａｓプロモ
ーターに関してアンチ−センス（マイナスの方向）でｍ
ａｓ５′〜ｏｃｓ３′カセット、すなわちｐＣＧＮ４６
〔Ｃｏｍａｉなど、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１７：
７４１〜７４４〕のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＣＧＮ
９６４６を得た。ＥｃｏＲＩによるｐＣＧＮ４５１の消
化によりプラスミドｐＰＭＧ４５（ｏｃｓ−ａｒｏＡ）
を得た後、上記と同じａｒｏＡ遺伝子を、ｐＰＭＧ３８
からのＥｃｏＲＩフラグメントとして、オクトピンカセ
ットのｐＣＧＮ４５１に挿入した。
【００３２】ｐＡＣＹ１８０〔Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃ
ｏｈｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９７８）１３４：１１４
１〜１１５６〕の大ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩフラグメ
ントとＴｎ５〔Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎなど、Ｍｏｌｅｃ．
Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７９）１７７：６５〜７
２〕からの耐カナマイシン細菌遺伝子のＨｉｎｄIII −
ＢａｍＨＩフラグメントとを組み合せることからｐＣＧ
Ｎ５２５を得た。ｐＰＭＧ４５のＸｈｏＩフラグメント
を、ｐＣＧＮ５２５のＳａｌＩ部位に挿入し、ｐＣＧＮ
９６３を得た。ｐＣＧＮ９６３のＨｉｎｄIII 部位を、
ＸｈｏＩリンカー（CCTCGAGG）と交換し、そしてｍａｓ
−アンチ−センスａｒｏＡ構造体を含む、ｐＣＧＮ９６
４からのＸｈｏＩフラグメントを、新しいＸｈｏＩ部位
に挿入した。センス及びアンチ−センスａｒｏＡ遺伝子
の両者を含むこのプラスミドは、ｐＣＧＮ９６５であ
る。二成分ベクター、ｐＣＧＮ９７８を、ＢｇｌIIによ
る消化の後、ｐＣＧＮ９６５とｐＲＫ２９０〔Ｄｉｔｔ
ａなど、Ｎｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９８０）７７：７３４７〜７３５１〕とを連結す
ることによって構成した。
ｏｈｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９７８）１３４：１１４
１〜１１５６〕の大ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩフラグメ
ントとＴｎ５〔Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎなど、Ｍｏｌｅｃ．
Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７９）１７７：６５〜７
２〕からの耐カナマイシン細菌遺伝子のＨｉｎｄIII −
ＢａｍＨＩフラグメントとを組み合せることからｐＣＧ
Ｎ５２５を得た。ｐＰＭＧ４５のＸｈｏＩフラグメント
を、ｐＣＧＮ５２５のＳａｌＩ部位に挿入し、ｐＣＧＮ
９６３を得た。ｐＣＧＮ９６３のＨｉｎｄIII 部位を、
ＸｈｏＩリンカー（CCTCGAGG）と交換し、そしてｍａｓ
−アンチ−センスａｒｏＡ構造体を含む、ｐＣＧＮ９６
４からのＸｈｏＩフラグメントを、新しいＸｈｏＩ部位
に挿入した。センス及びアンチ−センスａｒｏＡ遺伝子
の両者を含むこのプラスミドは、ｐＣＧＮ９６５であ
る。二成分ベクター、ｐＣＧＮ９７８を、ＢｇｌIIによ
る消化の後、ｐＣＧＮ９６５とｐＲＫ２９０〔Ｄｉｔｔ
ａなど、Ｎｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９８０）７７：７３４７〜７３５１〕とを連結す
ることによって構成した。
【００３３】ｐＰＭＧ５４、すなちわａｒｏＡセンスプ
ラスミドの構成 ｐＰＭＧ４５からのａｒｏＡ遺伝子を、ＸｈｏＩフラグ
メントとして、ＳａｌＩにより消化されたｐＣＧＮ５１
７に挿入し、ｐＰＭＧ５４を得た。ｐＣＧＮ５１７は、
ＰｓｔＩ部位で挿入されたｐＵＣ５Ｋ〔Ｖｉｅｉｒａ
ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ．Ｇｅｎｅ（１９８２）１９：
２５９〜２６８〕からの、Ｔｎ９０３の耐カナマイシン
遺伝子を有するｐＨＣ７９〔Ｈｏｈｎ ａｎｄ Ｃｏｌ
ｌｉｎｓ，Ｇｅｎｅ（１９８０）１１：２９１〜２９
８〕から調製される。
ラスミドの構成 ｐＰＭＧ４５からのａｒｏＡ遺伝子を、ＸｈｏＩフラグ
メントとして、ＳａｌＩにより消化されたｐＣＧＮ５１
７に挿入し、ｐＰＭＧ５４を得た。ｐＣＧＮ５１７は、
ＰｓｔＩ部位で挿入されたｐＵＣ５Ｋ〔Ｖｉｅｉｒａ
ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ．Ｇｅｎｅ（１９８２）１９：
２５９〜２６８〕からの、Ｔｎ９０３の耐カナマイシン
遺伝子を有するｐＨＣ７９〔Ｈｏｈｎ ａｎｄ Ｃｏｌ
ｌｉｎｓ，Ｇｅｎｅ（１９８０）１１：２９１〜２９
８〕から調製される。
【００３４】アグロバクテリアム ツメファシエンスへ
の接合及び瘤形成 ｐＣＧＮ９７８及びｐＰＭＧ５４を、Ａ．ツメファシエ
ンス株Ｋ１２｛菌株Ｋ１２は、菌株Ａ１１４（ＮＴＩ）
〔Ｓｃｉａｋｙなど、Ｐｌａｓｍｉｄ（１９７８）１：
２３８〜２５３〕中にｐＴｉＡ６を形質転換することに
よって得られた｝及びｐＲＫ２０７３〔Ｌｅｏｎｇな
ど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）２５７：８
７２４〜８７３０〕と共にそれぞれプレート接合した。
そのプレート接合法は、Ｃｏｍａｉなど、Ｐｌａｓｍｉ
ｄ（１９８３）１０：２１〜３０によって記載されてい
る。
の接合及び瘤形成 ｐＣＧＮ９７８及びｐＰＭＧ５４を、Ａ．ツメファシエ
ンス株Ｋ１２｛菌株Ｋ１２は、菌株Ａ１１４（ＮＴＩ）
〔Ｓｃｉａｋｙなど、Ｐｌａｓｍｉｄ（１９７８）１：
２３８〜２５３〕中にｐＴｉＡ６を形質転換することに
よって得られた｝及びｐＲＫ２０７３〔Ｌｅｏｎｇな
ど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）２５７：８
７２４〜８７３０〕と共にそれぞれプレート接合した。
そのプレート接合法は、Ｃｏｍａｉなど、Ｐｌａｓｍｉ
ｄ（１９８３）１０：２１〜３０によって記載されてい
る。
【００３５】ｐＣＧＮ９７８を担持するアグロバクテリ
アムを、２００μｇ／mlストレプトマイシン及び５０μ
ｇ／mlカラマイシンを添加されたＡＢプレート〔Ｃｈｉ
ｌｔｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９７４）７１：３６７２〜３６７６〕上
で選択し、そしてｐＣＧＮ９７８の存在をサザン分析に
よって確かめた。Ｋ１２のＴ−ＤＮＡ中に組込まれた、
ｐＧＭＧ５４を有する組換え体を、１００μｇ／mlカナ
マイシンを添加されたＡＢプレート上で選択し、そして
サザン分析によって確かめた。
アムを、２００μｇ／mlストレプトマイシン及び５０μ
ｇ／mlカラマイシンを添加されたＡＢプレート〔Ｃｈｉ
ｌｔｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９７４）７１：３６７２〜３６７６〕上
で選択し、そしてｐＣＧＮ９７８の存在をサザン分析に
よって確かめた。Ｋ１２のＴ−ＤＮＡ中に組込まれた、
ｐＧＭＧ５４を有する組換え体を、１００μｇ／mlカナ
マイシンを添加されたＡＢプレート上で選択し、そして
サザン分析によって確かめた。
【００３６】ｐＣＧＮ９７８×Ｋ１２及びｐＰＭＢ５４
×Ｋ１２の溶液｛ＭＧ／Ｌブイヨン〔Ｇａｒｆｉｎｋｅ
ｌ及びＮｅｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９
８０）１９４：７３２〜７４３〕中、約１０9 細菌／m
l｝中に含浸されたツマヨウジにより葉を傷つけること
によって、 瘤を３〜４ヵ月のカランチョ（Ｋａｌａｎ
ｃｈｏｅ）植物上に誘導した。瘤材料を、４週間後、そ
れぞれの構造体のために４種の植物から収穫し、そして
使用まで−７０℃で冷凍した。その 瘤材料をそれぞれ
の構造体のためにランダム化し、そしてウェスターン分
析によってａｒｏＡタンパク質について分析した。
×Ｋ１２の溶液｛ＭＧ／Ｌブイヨン〔Ｇａｒｆｉｎｋｅ
ｌ及びＮｅｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９
８０）１９４：７３２〜７４３〕中、約１０9 細菌／m
l｝中に含浸されたツマヨウジにより葉を傷つけること
によって、 瘤を３〜４ヵ月のカランチョ（Ｋａｌａｎ
ｃｈｏｅ）植物上に誘導した。瘤材料を、４週間後、そ
れぞれの構造体のために４種の植物から収穫し、そして
使用まで−７０℃で冷凍した。その 瘤材料をそれぞれ
の構造体のためにランダム化し、そしてウェスターン分
析によってａｒｏＡタンパク質について分析した。
【００３７】ウェスターン分析を、次のようにして行な
った：２．３ｇのｐＰＭＢ５４×Ｋ１２及び３．０ｇの
ｐＣＧＮ９７８×Ｋ１２の 瘤組織を、液体窒素中で錬
磨した。ポリビニルピロリドン０．３ｇ当り組織１ｇを
添加した。その組織を、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、
pH５．６，１０mMのＥＤＴＡ，０．１５ＭのＮａＣｌ，
０．０５％ Ｎｏｒｉｄｅｔ Ｐ−４０，２５mg／mlウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１mMジオトレイトール、
１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳ
Ｆ）、１０μＭロイペプチン（Ｓｉｇｍａ）及び１０mM
チオ尿素を含む溶液１．５ml当り１ｇの組織の割合で懸
濁した。
った：２．３ｇのｐＰＭＢ５４×Ｋ１２及び３．０ｇの
ｐＣＧＮ９７８×Ｋ１２の 瘤組織を、液体窒素中で錬
磨した。ポリビニルピロリドン０．３ｇ当り組織１ｇを
添加した。その組織を、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、
pH５．６，１０mMのＥＤＴＡ，０．１５ＭのＮａＣｌ，
０．０５％ Ｎｏｒｉｄｅｔ Ｐ−４０，２５mg／mlウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１mMジオトレイトール、
１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳ
Ｆ）、１０μＭロイペプチン（Ｓｉｇｍａ）及び１０mM
チオ尿素を含む溶液１．５ml当り１ｇの組織の割合で懸
濁した。
【００３８】その均質物を、４℃で１５分間、１５，０
００ｇで遠心分離した。ウサギ中に精製された３−エノ
ールピルビルシキメートホスフェート（ＥＰＳＰ）シン
テターゼをウサギに注射することによって調製された、
抗血清２５μｌ及びＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｎ
ｓ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の１０％（Ｗ／Ｖ）懸濁
液１２５μｌを、それぞれの上清液に添加し、そして室
温で１時間攪拌しながらインキュベートした。
００ｇで遠心分離した。ウサギ中に精製された３−エノ
ールピルビルシキメートホスフェート（ＥＰＳＰ）シン
テターゼをウサギに注射することによって調製された、
抗血清２５μｌ及びＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｎ
ｓ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の１０％（Ｗ／Ｖ）懸濁
液１２５μｌを、それぞれの上清液に添加し、そして室
温で１時間攪拌しながらインキュベートした。
【００３９】次に、サンプルを遠心分離にかけ（５００
０×ｇ，５分）、そしてそのペレットを、５０mMのＴｒ
ｉｓ（pH７．５），１mMのＥＤＴＡ，０．５ＭのＮａＣ
ｌ及び０．０５％ Ｈｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を含む溶
液により２度洗浄した。その得られたペレットを、０．
１２５ＭのＴｒｉｓ，pH６．８，４％ ＳＤＳ，２０％
グリセロール及び１０％ ２−メルカプトエタノール溶
液１００μｌ中に懸濁し、そして９０℃で２分間、加熱
した。次に、完全なサンプルを１０％アクリルアミドゲ
ル上で電気泳動処理した。分解されたペプチドを、Ｂｕ
ｒｎｅｔｔｅ．Ａｒａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８
１）１１２：１９５〜２０３によって記載されているよ
うなヒトロセルロース（ＢＡ ８５ Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に、Ｈｏｅｆｅｒ Ｔ
Ｅ４２トランスファーユニット中において１００Ｖで３
時間にわたって移した。
０×ｇ，５分）、そしてそのペレットを、５０mMのＴｒ
ｉｓ（pH７．５），１mMのＥＤＴＡ，０．５ＭのＮａＣ
ｌ及び０．０５％ Ｈｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を含む溶
液により２度洗浄した。その得られたペレットを、０．
１２５ＭのＴｒｉｓ，pH６．８，４％ ＳＤＳ，２０％
グリセロール及び１０％ ２−メルカプトエタノール溶
液１００μｌ中に懸濁し、そして９０℃で２分間、加熱
した。次に、完全なサンプルを１０％アクリルアミドゲ
ル上で電気泳動処理した。分解されたペプチドを、Ｂｕ
ｒｎｅｔｔｅ．Ａｒａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８
１）１１２：１９５〜２０３によって記載されているよ
うなヒトロセルロース（ＢＡ ８５ Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に、Ｈｏｅｆｅｒ Ｔ
Ｅ４２トランスファーユニット中において１００Ｖで３
時間にわたって移した。
【００４０】次に、ニトロセルロースフィルターを、Ｂ
ＬＯＴＴＯ（２０mMのＴｒｉｓ，pH７．５、脱水された
５％脱脂乳、０．５ＭのＮａＣｌ，０．１％消泡剤Ａ，
１０mMアシ化ナトリウム）中において室温で１時間イン
キュベートし、次に、抗−ＥＰＳＰシンテターゼ血清の
１：５０希釈液を含むＢＬＯＴＴＯ中において４℃で１
晩インキュベートした。フィルターを、２０mMのＴｒｉ
ｓ，pH７．５及び１５０mMのＮａＣｌ溶液中で１０分
間、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む同じ緩衝液中
で２０分間及び界面活性剤を含まない緩衝液中でさらに
１０分間、洗浄した。
ＬＯＴＴＯ（２０mMのＴｒｉｓ，pH７．５、脱水された
５％脱脂乳、０．５ＭのＮａＣｌ，０．１％消泡剤Ａ，
１０mMアシ化ナトリウム）中において室温で１時間イン
キュベートし、次に、抗−ＥＰＳＰシンテターゼ血清の
１：５０希釈液を含むＢＬＯＴＴＯ中において４℃で１
晩インキュベートした。フィルターを、２０mMのＴｒｉ
ｓ，pH７．５及び１５０mMのＮａＣｌ溶液中で１０分
間、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む同じ緩衝液中
で２０分間及び界面活性剤を含まない緩衝液中でさらに
１０分間、洗浄した。
【００４１】次に、 125Ｉによりラベルされたプロテイ
ンＡ（９μCi／mg；ＮＥＮ）の１０ 6 cpm／mlを含むＢ
ＬＯＴＴＯを、フィルターに添加し、そして室温で２時
間インキュベートした。そのフィルターを、５０mMのＴ
ｒｉｓ，pH７．５，１ＭのＮａＣｌ及び０．４％ラウリ
ルサルコシン溶液中で１晩、室温で洗浄し、そして次
に、５０mMのＴｒｉｓ，pH７．５，５mMのＥＤＴＡ，１
５０mMのＮａＣｌ，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０及び０．１％ ＳＤＳ溶液中で３時間、室温で洗浄し
た。すすぎ、そして乾燥せしめた後、フィルターを、増
強スクリーンを有するＤｕＰｏｎｔ Ｌｉｇａｔｎｉｎ
ｇを用いて、−７０℃でＫｏｄａｋ Ｘ−線フィルムに
照射した。
ンＡ（９μCi／mg；ＮＥＮ）の１０ 6 cpm／mlを含むＢ
ＬＯＴＴＯを、フィルターに添加し、そして室温で２時
間インキュベートした。そのフィルターを、５０mMのＴ
ｒｉｓ，pH７．５，１ＭのＮａＣｌ及び０．４％ラウリ
ルサルコシン溶液中で１晩、室温で洗浄し、そして次
に、５０mMのＴｒｉｓ，pH７．５，５mMのＥＤＴＡ，１
５０mMのＮａＣｌ，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０及び０．１％ ＳＤＳ溶液中で３時間、室温で洗浄し
た。すすぎ、そして乾燥せしめた後、フィルターを、増
強スクリーンを有するＤｕＰｏｎｔ Ｌｉｇａｔｎｉｎ
ｇを用いて、−７０℃でＫｏｄａｋ Ｘ−線フィルムに
照射した。
【００４２】ｐＣＧＮ９７８を含む瘤は、対照のｐＰＭ
Ｇ５４ 瘤の１０〜２０％活性のみを示した。組込まれ
たシステム対二成分システムにおけるａｒｏＡの発現の
初期比較は、二成分システムが組込まれたシステムの７
０〜８０％のみ有効であることを示した。従って、アン
チ−センス構造体がまた、存在する場合、６０％のａｒ
ｏＡ活性の全減少が観察される。
Ｇ５４ 瘤の１０〜２０％活性のみを示した。組込まれ
たシステム対二成分システムにおけるａｒｏＡの発現の
初期比較は、二成分システムが組込まれたシステムの７
０〜８０％のみ有効であることを示した。従って、アン
チ−センス構造体がまた、存在する場合、６０％のａｒ
ｏＡ活性の全減少が観察される。
【００４３】エレクトロポレーション実験のプラスミド
構造体についての実験 アンチ−センス５′ｍａｓ−ａｒｏＡ（３′から５′の
方向）−３′ｏｃｓ構造体、すなわちｐＣＧＮ９６４ｂ
を、上記のようにして構成した。センス５′ｍａｓ−ａ
ｒｏＡ（５′から３′の方向）−３′ｏｃｓ構造体、す
なわちｐＣＧＮ９６４ａを、同じ結合から得、そしてそ
のセンスの方向を選択した。
構造体についての実験 アンチ−センス５′ｍａｓ−ａｒｏＡ（３′から５′の
方向）−３′ｏｃｓ構造体、すなわちｐＣＧＮ９６４ｂ
を、上記のようにして構成した。センス５′ｍａｓ−ａ
ｒｏＡ（５′から３′の方向）−３′ｏｃｓ構造体、す
なわちｐＣＧＮ９６４ａを、同じ結合から得、そしてそ
のセンスの方向を選択した。
【００４４】植物材料 プロトプラスト供与体植物のニコチアナ・タバカムｃ
ｖ．キサンチ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ
ｃｖ．Ｘａｎｔｈｉ）を、（Ｆａｃｃｉｏｔｉａｎｄ
Ｐｉｌｅｔ，１９７９）に記載されているように、無菌
条件下でガラスジャーの中で増殖せしめた。頂端のシュ
ートを、０．７％ Ｇｉｂｃｏ Ｐｈｙｔａｇａｒ，３
０ｇ／ｌスクロース、１．０mg／ｌ ＩＡＡ及び０．１
５mg／ｌＫｉｎｅｔｉｎを含む寒天培地〔Ｍｕｒａｓａ
ｈｉｇｅ ａｎｄ ＳＫｏｏｇ（ＭＳ）培地〕１００ml
中に置いた（オートクレーブする前にpHを５．５５に調
節する）。その培養物を、暗／明レジム下で１２時間、
２３±２℃で保持した。
ｖ．キサンチ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ
ｃｖ．Ｘａｎｔｈｉ）を、（Ｆａｃｃｉｏｔｉａｎｄ
Ｐｉｌｅｔ，１９７９）に記載されているように、無菌
条件下でガラスジャーの中で増殖せしめた。頂端のシュ
ートを、０．７％ Ｇｉｂｃｏ Ｐｈｙｔａｇａｒ，３
０ｇ／ｌスクロース、１．０mg／ｌ ＩＡＡ及び０．１
５mg／ｌＫｉｎｅｔｉｎを含む寒天培地〔Ｍｕｒａｓａ
ｈｉｇｅ ａｎｄ ＳＫｏｏｇ（ＭＳ）培地〕１００ml
中に置いた（オートクレーブする前にpHを５．５５に調
節する）。その培養物を、暗／明レジム下で１２時間、
２３±２℃で保持した。
【００４５】次の段階を、消毒された溶液により無菌条
件下で行なった。若葉を、光合成サイクルの暗反応を間
に、４〜５週の植物から除去した。主脈を捨て、そして
残る葉組織を、縦に１度切った。これらの葉断片を、
０．４％ペクチナーゼ（Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ Ｙ−２
３，Ｓｅｉｓｈｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｃｏ．Ｌｔｄ．、日本）及び０．６％セルラーゼ（Ｏｎ
ｏｚｕｋａ ＲＳ，Ｙａｋｕｌｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、日
本）を含む６％ソルビトール溶液により浸透せしめた
（２００ミリトルへ）。２〜３時間のインキュベーショ
ンの後、その単離物を、ピペットで静かに取り、プロト
プラストを放し、そして５２μのナイロンフィルターを
通した。
件下で行なった。若葉を、光合成サイクルの暗反応を間
に、４〜５週の植物から除去した。主脈を捨て、そして
残る葉組織を、縦に１度切った。これらの葉断片を、
０．４％ペクチナーゼ（Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ Ｙ−２
３，Ｓｅｉｓｈｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｃｏ．Ｌｔｄ．、日本）及び０．６％セルラーゼ（Ｏｎ
ｏｚｕｋａ ＲＳ，Ｙａｋｕｌｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、日
本）を含む６％ソルビトール溶液により浸透せしめた
（２００ミリトルへ）。２〜３時間のインキュベーショ
ンの後、その単離物を、ピペットで静かに取り、プロト
プラストを放し、そして５２μのナイロンフィルターを
通した。
【００４６】そのプロトプラストを、５０xgで遠心分離
にかけることによってペレット化し、そして７％ソルビ
トール溶液により２度洗浄した。プロトプラストの密度
を、血球計数器〔１mm2 区画のグリッドを用いて、計数
された区画の平均（Ｘ１０4）は、１ml当りのプロトプ
ラストの合計数の推定値を与える〕の使用によって決定
した。計算された密度に基づいて、プロトプラストを、
緩衝液（１０mMのＨｅｐｅｓ，pH７．１，１４０mMのＮ
ａＣｌ，５mMのＣａＣｌ2 及び６％ソルビトールを含
む）中、２．２〜３．０ミリオン／mlの最終密度で懸濁
した。
にかけることによってペレット化し、そして７％ソルビ
トール溶液により２度洗浄した。プロトプラストの密度
を、血球計数器〔１mm2 区画のグリッドを用いて、計数
された区画の平均（Ｘ１０4）は、１ml当りのプロトプ
ラストの合計数の推定値を与える〕の使用によって決定
した。計算された密度に基づいて、プロトプラストを、
緩衝液（１０mMのＨｅｐｅｓ，pH７．１，１４０mMのＮ
ａＣｌ，５mMのＣａＣｌ2 及び６％ソルビトールを含
む）中、２．２〜３．０ミリオン／mlの最終密度で懸濁
した。
【００４７】エレクトロポレーション 緩衝液中に懸濁されたプロトプラストを、１mlアリコー
トに分けた。おのおののアリコートに、キャリアーＤＮ
Ａ（ニシンの精子ＤＮＡの形で）１mgを添加した。キャ
リアーＤＮＡの添加の後、プラスミドＤＮＡを目的とす
る濃度で添加した。そのプロトプラスト／ＤＮＡ混合物
を、エレクトロポレーションの前、５分間インキュベー
トし、そして続いて、エレクトロポレーションのため
に、アルミニウム箔によりライニングされた、１mlのプ
ラスチックキュベットに移した。
トに分けた。おのおののアリコートに、キャリアーＤＮ
Ａ（ニシンの精子ＤＮＡの形で）１mgを添加した。キャ
リアーＤＮＡの添加の後、プラスミドＤＮＡを目的とす
る濃度で添加した。そのプロトプラスト／ＤＮＡ混合物
を、エレクトロポレーションの前、５分間インキュベー
トし、そして続いて、エレクトロポレーションのため
に、アルミニウム箔によりライニングされた、１mlのプ
ラスチックキュベットに移した。
【００４８】そのエレクトロポレーションパルスは、１
５０ボルトに荷電された１２５０μＦコンデンサーによ
って得られた。パルス期間を、プロトプラストを欠いて
いる緩衝溶液を通して測定し、そしてそれは４０ｍ−秒
であることが見出された。エレクトロポレーションの
後、プロトプラストを、室温で１０分間、キュベット中
でインキュベートし、そして続いて、１０mlのプロトプ
ラスト培養培地（０．６mg／ｌのＮＡＡ，０．２mg／ｌ
の２，４−Ｄ，０．８mg／ｌのＫｉｎｅｔｉｎ，５．５
％ソルビトール及び３０ｇ／ｌのスクロースを含むＭＳ
塩）により希釈されたペトリ皿に移し、そして完全な暗
の中で２３±２℃で培養した。
５０ボルトに荷電された１２５０μＦコンデンサーによ
って得られた。パルス期間を、プロトプラストを欠いて
いる緩衝溶液を通して測定し、そしてそれは４０ｍ−秒
であることが見出された。エレクトロポレーションの
後、プロトプラストを、室温で１０分間、キュベット中
でインキュベートし、そして続いて、１０mlのプロトプ
ラスト培養培地（０．６mg／ｌのＮＡＡ，０．２mg／ｌ
の２，４−Ｄ，０．８mg／ｌのＫｉｎｅｔｉｎ，５．５
％ソルビトール及び３０ｇ／ｌのスクロースを含むＭＳ
塩）により希釈されたペトリ皿に移し、そして完全な暗
の中で２３±２℃で培養した。
【００４９】４８〜５０時間後、プロトプラストを、静
かに遠心分離することによって収穫し、上清液を除去
し、そしてプロトプラストを液体窒素により凍結し、そ
して−７０℃で保存した。その凍結されたプロトプラス
トペレットを、ウェスターン分析のために抽出緩衝液
（０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、１０mMのＥＤＴＡ，
１５０mMのＮａＣｌ，０．０５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ，２
５mg／mlのＢＳＡ，１mMのＰＭＳＦ，１０mMのＤＴＴ，
１０mMのチオ尿素及び１０μＭのロイペプチンを含む）
１ml中に懸濁した。０．０５ｇ／mlのポリビニルピロリ
ドン（Ｐｏｌｙ ＣｌａｒＡＴ，ＢＤＨ）を添加し、そ
してその混合物を、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモナイザーで３
０秒間、錬磨した。その上清液を集め、そしてウェスタ
ーン分析を上記のようにして行なった。
かに遠心分離することによって収穫し、上清液を除去
し、そしてプロトプラストを液体窒素により凍結し、そ
して−７０℃で保存した。その凍結されたプロトプラス
トペレットを、ウェスターン分析のために抽出緩衝液
（０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、１０mMのＥＤＴＡ，
１５０mMのＮａＣｌ，０．０５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ，２
５mg／mlのＢＳＡ，１mMのＰＭＳＦ，１０mMのＤＴＴ，
１０mMのチオ尿素及び１０μＭのロイペプチンを含む）
１ml中に懸濁した。０．０５ｇ／mlのポリビニルピロリ
ドン（Ｐｏｌｙ ＣｌａｒＡＴ，ＢＤＨ）を添加し、そ
してその混合物を、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモナイザーで３
０秒間、錬磨した。その上清液を集め、そしてウェスタ
ーン分析を上記のようにして行なった。
【００５０】実験 実験処理は、ｐＣＧＮ９６４ａ及びｐＣＧＮ９６４ｂ
（詳しいそれぞれの構造体のためのプラスミド構成に基
づくセクションを参照のこと）を使用した。それぞれの
実験においては、９６４ａ及び９６４ｂの両者を含む処
置を９６４ａ又は９６４ｂのみを含む処置と比較した：
（詳しいそれぞれの構造体のためのプラスミド構成に基
づくセクションを参照のこと）を使用した。それぞれの
実験においては、９６４ａ及び９６４ｂの両者を含む処
置を９６４ａ又は９６４ｂのみを含む処置と比較した：
【００５１】
【表１】
【００５２】すべての場合において、アンチ−センスＤ
ＮＡ（９６４ｂ）の添加が、ウェスターン分析によって
検出されたタンパク質レベルを減じた（９６４ａのみに
より得られたレベルと比較して）。平均５０％のレベル
の減少があった。タンパク質は、予定通り、９６４ｂの
みにおいては検出されなかった。
ＮＡ（９６４ｂ）の添加が、ウェスターン分析によって
検出されたタンパク質レベルを減じた（９６４ａのみに
より得られたレベルと比較して）。平均５０％のレベル
の減少があった。タンパク質は、予定通り、９６４ｂの
みにおいては検出されなかった。
【００５３】例２：ポリガラクツロナーゼ アンチ−センス構造体 細菌株
【表２】
【００５４】酵素及び放射性同位体 すべての酵素は、市販源から得られ、そして製造業者の
提案に従って使用された。放射性同位体は、ニューイン
グランド ニュークリアーから得られた。Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの単離 トマトｃｖ．ＣａｌｉＧｒａｎｄｅの成熟した果実を収
穫し、そして液体窒素中で凍結した。凍結された組織
を、液体窒素中でモーター及びペストルにより粉砕し、
そしてその得られた粉末を、Ｆａｃｃｉｏｔｔｉなど、
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８０）３：２４１
〜２４６によって記載された、緩衝液中Ｂｒｉｎｋｍａ
ｎポリトロンにより均質化することによって抽出した。
全ＲＮＡを、Ｃｏｌｂｅｒｔなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：２２
４８〜２２５２によって記載されているようにして調製
した。
提案に従って使用された。放射性同位体は、ニューイン
グランド ニュークリアーから得られた。Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの単離 トマトｃｖ．ＣａｌｉＧｒａｎｄｅの成熟した果実を収
穫し、そして液体窒素中で凍結した。凍結された組織
を、液体窒素中でモーター及びペストルにより粉砕し、
そしてその得られた粉末を、Ｆａｃｃｉｏｔｔｉなど、
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８０）３：２４１
〜２４６によって記載された、緩衝液中Ｂｒｉｎｋｍａ
ｎポリトロンにより均質化することによって抽出した。
全ＲＮＡを、Ｃｏｌｂｅｒｔなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：２２
４８〜２２５２によって記載されているようにして調製
した。
【００５５】多糖類を、４０mM酢酸ナトリウム及び０．
５エタノールにより全ＲＮＡ調製物から沈澱せしめた
〔Ｍａｎｓｓｏｎなど、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
（１９８５）２００：３５６〜３６１〕。Ｐｏｌｙ
（Ａ）＋ＲＮＡを、〔Ｍａｎｉａｔｉｓなど、（１９８
２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ〕によって記載され
ているようにして単離した。
５エタノールにより全ＲＮＡ調製物から沈澱せしめた
〔Ｍａｎｓｓｏｎなど、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
（１９８５）２００：３５６〜３６１〕。Ｐｏｌｙ
（Ａ）＋ＲＮＡを、〔Ｍａｎｉａｔｉｓなど、（１９８
２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ〕によって記載され
ているようにして単離した。
【００５６】ｃＤＮＡの合成 ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡからの合成を、Ｇｕｂｌｅｒ
ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ（１９８３）２５：
２６３〜２６９によって記載しているようにして、次の
変法により行なった：第１鎖の合成のための反応混合物
は、１mMのｄＧＴＰ，１mMのｄＡＴＰ，１mMのＴＴＰ，
０．５mMのｄＣＴＰ，０．５ユニット／μｌのＲＮａｓ
ｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ），４μｇのトマトｐｏｌｙ
（Ａ）＋ＲＮＡ、及び８０〜１００ユニットの逆転写酵
素を含んだ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。その反応
を、５００mMのＥＤＴＡ ２μｌにより停止し、次に、
ｔＲＮＡ １０μｇ，１vol の４Ｍ ＮＨ4 ＯＡｃ及び
２．５vol のエタノールによりドライアイス上で１晩沈
澱せしめた。第２鎖の合成を、およそ５００ngの第１鎖
反応生成物から行なった。第１及び第２鎖反応混合物の
アリコートを、別々にそれぞれの反応をモニターするた
めに、２０μCiの５′−〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰによりそ
れぞれ放射性ラベル化した。
ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ（１９８３）２５：
２６３〜２６９によって記載しているようにして、次の
変法により行なった：第１鎖の合成のための反応混合物
は、１mMのｄＧＴＰ，１mMのｄＡＴＰ，１mMのＴＴＰ，
０．５mMのｄＣＴＰ，０．５ユニット／μｌのＲＮａｓ
ｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ），４μｇのトマトｐｏｌｙ
（Ａ）＋ＲＮＡ、及び８０〜１００ユニットの逆転写酵
素を含んだ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。その反応
を、５００mMのＥＤＴＡ ２μｌにより停止し、次に、
ｔＲＮＡ １０μｇ，１vol の４Ｍ ＮＨ4 ＯＡｃ及び
２．５vol のエタノールによりドライアイス上で１晩沈
澱せしめた。第２鎖の合成を、およそ５００ngの第１鎖
反応生成物から行なった。第１及び第２鎖反応混合物の
アリコートを、別々にそれぞれの反応をモニターするた
めに、２０μCiの５′−〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰによりそ
れぞれ放射性ラベル化した。
【００５７】λｇｔ１１における二重鎖ｃＤＮＡのクロ
ーニング 二重鎖ｃＤＮＡを、製造業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）によって記載されているようにして
ＥｃｏＲＩによりメチル化した。エタノールによる沈殿
の後、そのｃＤＮＡ末端を、次の条件（６６mMのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，pH７．５，２０mMのＭｇＣｌ2 ，１００mM
のジチオトレイトール、１００μＭのｄＧＴＰ，ｄＡＴ
Ｐ，ＴＴＰ及びｄＣＴＰ、室温で１時間）下でＤＮＡポ
リマラーゼＩのクレノウフラグメントの３ユニットを用
いて、平滑化した。次に、そのＤＮＡを、エタノールに
より沈殿せしめた。
ーニング 二重鎖ｃＤＮＡを、製造業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）によって記載されているようにして
ＥｃｏＲＩによりメチル化した。エタノールによる沈殿
の後、そのｃＤＮＡ末端を、次の条件（６６mMのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，pH７．５，２０mMのＭｇＣｌ2 ，１００mM
のジチオトレイトール、１００μＭのｄＧＴＰ，ｄＡＴ
Ｐ，ＴＴＰ及びｄＣＴＰ、室温で１時間）下でＤＮＡポ
リマラーゼＩのクレノウフラグメントの３ユニットを用
いて、平滑化した。次に、そのＤＮＡを、エタノールに
より沈殿せしめた。
【００５８】平滑化した後、ＥｃｏＲＩによりリン酸化
されたリンカー２μｇを、リガーゼ緩衝液（５０mMのＴ
ｒｉｓ，pH７．５，１０mMのＭｇＣｌ2 ，２０mMのジチ
オトレイトール、１mMのＡＴＰ及び５mg／mlのウシ血清
アルブミン）１０μｌ中、ｃＤＮＡに添加した。Ｔ4 Ｄ
ＮＡリガーゼ（１Ｗｅｉｓｓユニット、Ｗｅｉｓｓ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９６８）２４３：４３４３，
Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、そして１５℃で６時間、イ
ンキュベートした。次に、リガーゼ緩衝液１０μｌ中、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（さらに、１Ｗｅｉｓｓユニット）
を添加し、そして１５〜１９℃で２４時間、インキュベ
ートした。
されたリンカー２μｇを、リガーゼ緩衝液（５０mMのＴ
ｒｉｓ，pH７．５，１０mMのＭｇＣｌ2 ，２０mMのジチ
オトレイトール、１mMのＡＴＰ及び５mg／mlのウシ血清
アルブミン）１０μｌ中、ｃＤＮＡに添加した。Ｔ4 Ｄ
ＮＡリガーゼ（１Ｗｅｉｓｓユニット、Ｗｅｉｓｓ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９６８）２４３：４３４３，
Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、そして１５℃で６時間、イ
ンキュベートした。次に、リガーゼ緩衝液１０μｌ中、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（さらに、１Ｗｅｉｓｓユニット）
を添加し、そして１５〜１９℃で２４時間、インキュベ
ートした。
【００５９】その反応を、フェノールにより抽出し、エ
タノールにより沈殿せしめ、そして６〜８時間にわたっ
て１００ユニットのＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏｌａｂｓ）により消化し、フェノールにより抽
出し、そしてエタノールにより沈殿せしめた。過剰のリ
ンカー及び５００塩基対よりも少ないｃＤＮＡを、Ｂｉ
ｏ−ｇｅｌ Ａ−５０ｍ（１００〜２００メッシュ）上
でクロマトグラフィー処理することによって除去し、そ
して分別されたｃＤＮＡを、Ｈｕｙｎｈなど（ＤＮＡク
ローニング：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ
ｈ，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ，４９〜７８ページ、ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８
５）によって記載されているようにしてＥｃｏＲＩによ
り切断されたλｇｔ１１ベクターＤＮＡ（Ｓｔａｔａｇ
ｅｎｅ）に連結した。
タノールにより沈殿せしめ、そして６〜８時間にわたっ
て１００ユニットのＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏｌａｂｓ）により消化し、フェノールにより抽
出し、そしてエタノールにより沈殿せしめた。過剰のリ
ンカー及び５００塩基対よりも少ないｃＤＮＡを、Ｂｉ
ｏ−ｇｅｌ Ａ−５０ｍ（１００〜２００メッシュ）上
でクロマトグラフィー処理することによって除去し、そ
して分別されたｃＤＮＡを、Ｈｕｙｎｈなど（ＤＮＡク
ローニング：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ
ｈ，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ，４９〜７８ページ、ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８
５）によって記載されているようにしてＥｃｏＲＩによ
り切断されたλｇｔ１１ベクターＤＮＡ（Ｓｔａｔａｇ
ｅｎｅ）に連結した。
【００６０】イン−ビトロでのパッキング反応を、Ｖｅ
ｎｄｏｒによって記載されているようにしてＧｉｇａパ
ック抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に行なった。
最初の試験連結及びイン−ビトロパッキングを、種々の
ｃＤＮＡの希釈度を用いて行ない、組換え体ファージの
調製のためのｃＤＮＡ／ベクターの最適割合を実験的に
決定した。Ｈｕｙｎｈなど、前記（１９８５）によって
記載されているようにして、イソプロピル−１−チオ−
β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）及び５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ
−ｇａｌ）の存在下で、パックされたλｇｔ１１ファー
ジを、Ｅ．コリＹ１０８８上にプレートし、組換え体の
数を決定した。９０％の挿入割合で、５×１０6 よりも
多い組換え体を、λｇｔ１１中に得た。
ｎｄｏｒによって記載されているようにしてＧｉｇａパ
ック抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に行なった。
最初の試験連結及びイン−ビトロパッキングを、種々の
ｃＤＮＡの希釈度を用いて行ない、組換え体ファージの
調製のためのｃＤＮＡ／ベクターの最適割合を実験的に
決定した。Ｈｕｙｎｈなど、前記（１９８５）によって
記載されているようにして、イソプロピル−１−チオ−
β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）及び５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ
−ｇａｌ）の存在下で、パックされたλｇｔ１１ファー
ジを、Ｅ．コリＹ１０８８上にプレートし、組換え体の
数を決定した。９０％の挿入割合で、５×１０6 よりも
多い組換え体を、λｇｔ１１中に得た。
【００６１】ライブラリィのスクリーニング 増幅されていないλｇｔ１１ライブラリィからのおよそ
２００，０００ファージを、Ｈｕｙｎｈなど、（１９８
５）によって記載されてるいようにして、宿主として
Ｅ．コリＹ１０９０を用いて、９cm2 プレート当り２
０，０００のプラーク形成単位の密度でスクリーンし
た。但し、ＮＺＹ培地〔１ｌ当り、ＮａＣｌ５ｇ，Ｍｇ
Ｃｌ2 ２ｇ，１０ｇのＮＺａｍｉｎｅタイプＡ（Ｓｈｅ
ｆｆｉｅｌｄＰｒｏｄｕｃｔｓ）、酵母抽出物５ｇ及び
寒天１５ｇ〕を使用した。プレートをインキュベート
し、そしてＨｕｙｎｈなど、（１９８５）、前記によっ
て記載されているようにして、ＩＰＴＧを含むニトロセ
ルロース シートによりおおった。
２００，０００ファージを、Ｈｕｙｎｈなど、（１９８
５）によって記載されてるいようにして、宿主として
Ｅ．コリＹ１０９０を用いて、９cm2 プレート当り２
０，０００のプラーク形成単位の密度でスクリーンし
た。但し、ＮＺＹ培地〔１ｌ当り、ＮａＣｌ５ｇ，Ｍｇ
Ｃｌ2 ２ｇ，１０ｇのＮＺａｍｉｎｅタイプＡ（Ｓｈｅ
ｆｆｉｅｌｄＰｒｏｄｕｃｔｓ）、酵母抽出物５ｇ及び
寒天１５ｇ〕を使用した。プレートをインキュベート
し、そしてＨｕｙｎｈなど、（１９８５）、前記によっ
て記載されているようにして、ＩＰＴＧを含むニトロセ
ルロース シートによりおおった。
【００６２】そのニトロセルロース シートは、０．５
ＭのＴｒｉｓ（pH８．０），０．１５ＭのＮａＣｌ，
０．０２％ ＮａＮ3 ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００及び５％脱脂粉乳溶液により飽和され、次に、
１：１０００に希釈された抗−ポリガラクツロナーゼ２
抗体（下記参照のこと）を含む同じ緩衝液と共に室温で
３０分間、インキュベートされた。結合された抗体を、
Ｖｅｎｄｏｒによって記載されるようにしてアルカリホ
スファターゼにより接合された第２抗体（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）により検出した。陽性のプラークを、連続プレーテ
ィングによって精製し、そしてファージＤＮＡを、Ｍａ
ｒｉａｔｉｓなど（１９８２）によって記載されている
ようにして調製した。
ＭのＴｒｉｓ（pH８．０），０．１５ＭのＮａＣｌ，
０．０２％ ＮａＮ3 ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００及び５％脱脂粉乳溶液により飽和され、次に、
１：１０００に希釈された抗−ポリガラクツロナーゼ２
抗体（下記参照のこと）を含む同じ緩衝液と共に室温で
３０分間、インキュベートされた。結合された抗体を、
Ｖｅｎｄｏｒによって記載されるようにしてアルカリホ
スファターゼにより接合された第２抗体（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）により検出した。陽性のプラークを、連続プレーテ
ィングによって精製し、そしてファージＤＮＡを、Ｍａ
ｒｉａｔｉｓなど（１９８２）によって記載されている
ようにして調製した。
【００６３】ｃＤＮＡ挿入体Ｐ１のサブクローニング及
び配列決定 陽性のプラークＰ１からのファージＤＮＡを、ＥｃｏＲ
Ｉにより消化し、そして得られたフラグメントを、イン
−ビトロでの結合によってＥｃｏＲＩにより消化された
ベクターＭ１３ Ｂｌｕｅ Ｓｃｒｉｂｅ Ｍｉｎｕｓ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローンした。初めの
ＤＮＡ配列決定を、製造業者によって記載しているよう
にして調製されたＢｌｕｅ Ｓｃｉｂｅ構造体からの一
重鎖鋳型を用いて行なった。すべてのＤＮＡ配列決定
を、Ｓａｎｇｅｒなど．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３又はＭ
ａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８０）６５：４９９〜５８０に
よって記載されているようにして行なった。
び配列決定 陽性のプラークＰ１からのファージＤＮＡを、ＥｃｏＲ
Ｉにより消化し、そして得られたフラグメントを、イン
−ビトロでの結合によってＥｃｏＲＩにより消化された
ベクターＭ１３ Ｂｌｕｅ Ｓｃｒｉｂｅ Ｍｉｎｕｓ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローンした。初めの
ＤＮＡ配列決定を、製造業者によって記載しているよう
にして調製されたＢｌｕｅ Ｓｃｉｂｅ構造体からの一
重鎖鋳型を用いて行なった。すべてのＤＮＡ配列決定
を、Ｓａｎｇｅｒなど．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３又はＭ
ａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８０）６５：４９９〜５８０に
よって記載されているようにして行なった。
【００６４】Ｂｌｕｅ Ｓｃｉｂｅ構造体からのＢａｍ
ＨＩ−ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ及びＢａ
ｍＨＩ−ＨｉｎｄIII フラグメント（Ｍａｒｉａｔｉｓ
など．、前記）を、Ｍ１３ ｍｐ１８〔Ｙａｎｉｓｃｈ
−Ｐｅｒｒｏｎなど、Ｇｅｎｅ（１９８５）５３：１０
３〜１１９〕及びＭ１３ ｍｐ１９〔Ｎｏｒｒａｎｄｅ
ｒなど、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：１０１〜１０６〕
中にサブクローニングすることによって、オーバラップ
配列を得た。
ＨＩ−ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ及びＢａ
ｍＨＩ−ＨｉｎｄIII フラグメント（Ｍａｒｉａｔｉｓ
など．、前記）を、Ｍ１３ ｍｐ１８〔Ｙａｎｉｓｃｈ
−Ｐｅｒｒｏｎなど、Ｇｅｎｅ（１９８５）５３：１０
３〜１１９〕及びＭ１３ ｍｐ１９〔Ｎｏｒｒａｎｄｅ
ｒなど、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：１０１〜１０６〕
中にサブクローニングすることによって、オーバラップ
配列を得た。
【００６５】タンパク質配列決定のためのポリガラクツ
ロナーゼの精製 細胞壁に結合された全タンパク質を、Ｃｒｏｏｋｅｓ
ａｎｄ Ｇｒｉｅｒｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．（１９８３）７２：１０８８〜１０９３によって記
載しているようにして、ｃｖ．Ｃａｌｉ Ｇｒａｎｄｅ
の成熟果実から調製した。その抽出物を、０．０２５Ｍ
のエタノールアミン溶液（pH９．４）に対して透析し、
そして０．０２５Ｍのエタノールアミン溶液（pH９．
４）により平衡化された、９×３００mmカラムのクロマ
トフォーカシングエクスチェンジャーＰＢＥ９４（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）にかけた。結合されたタンパク質を、
Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ９６（pH８．０）（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）により溶離した。
ロナーゼの精製 細胞壁に結合された全タンパク質を、Ｃｒｏｏｋｅｓ
ａｎｄ Ｇｒｉｅｒｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．（１９８３）７２：１０８８〜１０９３によって記
載しているようにして、ｃｖ．Ｃａｌｉ Ｇｒａｎｄｅ
の成熟果実から調製した。その抽出物を、０．０２５Ｍ
のエタノールアミン溶液（pH９．４）に対して透析し、
そして０．０２５Ｍのエタノールアミン溶液（pH９．
４）により平衡化された、９×３００mmカラムのクロマ
トフォーカシングエクスチェンジャーＰＢＥ９４（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）にかけた。結合されたタンパク質を、
Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ９６（pH８．０）（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）により溶離した。
【００６６】ポリガラクツロナーゼを含む画分をプール
し、そして硫酸アンモニウム（９０％飽和）により沈殿
せしめ、そしてさらに、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ
Ｔ）ＨＰＬＣカラムを通してクロマトグラフィー処理す
ることによって分別した。２mlの体積を、カラム上に入
れ、そして１０mM〜３５０mMのリン酸ナトリウム溶液
（pH６．８）の直線グラジェントを用いて１ml／分の速
度でクロマトグラフィー処理した。サンプルを、Ａ２８
０でモニターし、そして０．５mlの体積に分別した。ポ
リガラクツロナーゼを含む多くの試験から集められた画
分をプールし、そして６％酢酸に対して透析し、次に凍
結乾燥せしめた。
し、そして硫酸アンモニウム（９０％飽和）により沈殿
せしめ、そしてさらに、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ
Ｔ）ＨＰＬＣカラムを通してクロマトグラフィー処理す
ることによって分別した。２mlの体積を、カラム上に入
れ、そして１０mM〜３５０mMのリン酸ナトリウム溶液
（pH６．８）の直線グラジェントを用いて１ml／分の速
度でクロマトグラフィー処理した。サンプルを、Ａ２８
０でモニターし、そして０．５mlの体積に分別した。ポ
リガラクツロナーゼを含む多くの試験から集められた画
分をプールし、そして６％酢酸に対して透析し、次に凍
結乾燥せしめた。
【００６７】タンパク質の配列決定 上記のようにして調製されたポリガラクツロナーゼを、
Ｂｅｃｋｍａｎ ８９０ Ｍ Ｌｉｑｕｉｄ Ｐｈａｓ
ｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓにより
完全に配列決定した。次のＮ−末端配列：Ｇｌｙ−ｉｌ
ｅ−ｌｙｓ−ｖａｌ−ｉｌｅ−ａｓｎが得られた。
Ｂｅｃｋｍａｎ ８９０ Ｍ Ｌｉｑｕｉｄ Ｐｈａｓ
ｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓにより
完全に配列決定した。次のＮ−末端配列：Ｇｌｙ−ｉｌ
ｅ−ｌｙｓ−ｖａｌ−ｉｌｅ−ａｓｎが得られた。
【００６８】抗体産生のためのポリガラクツロナーゼの
精製 トマトの細胞壁に結合されたタンパク質を、Ｔｕｃｋｅ
ｒ ａｎｄ Ｇｒｉｅｒｓｏｎ，Ｐｌａｎｔａ（１９８
２）１５５：６４〜６７によって記載されているように
して、ｃｖ．ＵＣ８２Ｂの成熟果実から調製した。硫酸
アンモニウム沈殿物からのペレットを、１５０mMのＮａ
Ｃｌ溶液に溶解し、そして同じ緩衝液に対して一晩、透
析した。次に、そのタンパク質溶液を、１０mMのＮａＣ
ｌ及び１０mMのＴｒｉｓ（pH７．２）を含むインクラチ
ック グランジェントを用いるＴＳＫ３０００／２００
０ＨＰＬＣサイズカラム上で、０．５ml／分の流速で分
別した。
精製 トマトの細胞壁に結合されたタンパク質を、Ｔｕｃｋｅ
ｒ ａｎｄ Ｇｒｉｅｒｓｏｎ，Ｐｌａｎｔａ（１９８
２）１５５：６４〜６７によって記載されているように
して、ｃｖ．ＵＣ８２Ｂの成熟果実から調製した。硫酸
アンモニウム沈殿物からのペレットを、１５０mMのＮａ
Ｃｌ溶液に溶解し、そして同じ緩衝液に対して一晩、透
析した。次に、そのタンパク質溶液を、１０mMのＮａＣ
ｌ及び１０mMのＴｒｉｓ（pH７．２）を含むインクラチ
ック グランジェントを用いるＴＳＫ３０００／２００
０ＨＰＬＣサイズカラム上で、０．５ml／分の流速で分
別した。
【００６９】ポリガラクツロナーゼ活性〔Ｒｅｉｓｆｅ
ｌｄなど、Ｎａｔｕｒｅ（１９６２）１９５：２８１〜
２８３〕を含むＴＳＫ画分をプールし、そして１０mM〜
３５０mMのリン酸ナトリウム溶液（pH６．８）の直線グ
ランジェントを用いるヒドロキシアパタイトＨＰＬＣカ
ラムにより１ml／分の流速でさらに分別した。ポリガラ
クツロナーゼ活性を含むピーク画分を集め、そしてそれ
を用いて、抗体産生のためにウサギに注射した。
ｌｄなど、Ｎａｔｕｒｅ（１９６２）１９５：２８１〜
２８３〕を含むＴＳＫ画分をプールし、そして１０mM〜
３５０mMのリン酸ナトリウム溶液（pH６．８）の直線グ
ランジェントを用いるヒドロキシアパタイトＨＰＬＣカ
ラムにより１ml／分の流速でさらに分別した。ポリガラ
クツロナーゼ活性を含むピーク画分を集め、そしてそれ
を用いて、抗体産生のためにウサギに注射した。
【００７０】追加免疫注射のためのポリガラクツロナー
ゼが、細胞壁に結合されたタンパク質調製物をＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル上で分離することによって調製さ
れた。硫酸アンモニウムにより沈殿せしめられた材料
（上記参照のこと）を、１２．５％ポリアクリルアミド
を含む３mmの厚さ×１４mmの幅のゲル上で電気泳動にか
け〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２
７：６８０〜６８５〕、そしてタンパク質を、マークシ
ーブリリアントブルＲにより染色することによって可視
化した。ポリガラクツロナーゼ バンドに対応する領域
（およそ４０，０００〜４３，０００ドルトン）を、切
断し、凍結し、そして液体窒素により粉砕した。
ゼが、細胞壁に結合されたタンパク質調製物をＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル上で分離することによって調製さ
れた。硫酸アンモニウムにより沈殿せしめられた材料
（上記参照のこと）を、１２．５％ポリアクリルアミド
を含む３mmの厚さ×１４mmの幅のゲル上で電気泳動にか
け〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２
７：６８０〜６８５〕、そしてタンパク質を、マークシ
ーブリリアントブルＲにより染色することによって可視
化した。ポリガラクツロナーゼ バンドに対応する領域
（およそ４０，０００〜４３，０００ドルトン）を、切
断し、凍結し、そして液体窒素により粉砕した。
【００７１】抗体の調製 一匹のウサギに、１ヵ月にわたって、ポリガラクツロナ
ーゼを４回注射した（１２５μｇの注入）。次に、同じ
ウサギに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルから回収され
たポリガラクツロナーゼ（およそ１５０μｇ）により追
加免疫した。同じ追加免疫注射を第１回目から１週間
後、行なった。そのウサギを、血清源として２週間後、
採血した。
ーゼを４回注射した（１２５μｇの注入）。次に、同じ
ウサギに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルから回収され
たポリガラクツロナーゼ（およそ１５０μｇ）により追
加免疫した。同じ追加免疫注射を第１回目から１週間
後、行なった。そのウサギを、血清源として２週間後、
採血した。
【００７２】粗血清６mlを、０．１Ｍリン酸ナトリウム
溶液（pH７．０）６mlにより希釈し、そしてプロティン
Ａ−セファロース（Ｓｉｇｍａ）の６mlカラムにかけ
た。そのカラムを、０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液（pH
７．０）８０mlにより洗浄し、そして次に、０．１Ｍグ
リシン溶液（pH３．０）により溶離した。Ａ２８０での
最とも高い活性を有する画分をプールし、２０mMリン酸
ナトリウム（pH７．６）及び１５０mMのＮａＣｌ溶液に
対して透析し、そしてＡｍｉｃｏｎ ＸＭ８０膜上で濃
縮した。次に、グリセロールを添加し、４０％の最終濃
度にした。
溶液（pH７．０）６mlにより希釈し、そしてプロティン
Ａ−セファロース（Ｓｉｇｍａ）の６mlカラムにかけ
た。そのカラムを、０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液（pH
７．０）８０mlにより洗浄し、そして次に、０．１Ｍグ
リシン溶液（pH３．０）により溶離した。Ａ２８０での
最とも高い活性を有する画分をプールし、２０mMリン酸
ナトリウム（pH７．６）及び１５０mMのＮａＣｌ溶液に
対して透析し、そしてＡｍｉｃｏｎ ＸＭ８０膜上で濃
縮した。次に、グリセロールを添加し、４０％の最終濃
度にした。
【００７３】アフィニティークロマトグラフィーにより
精製された抗血清を、Ｖｅｎｄｏｒによって記載された
ようにして、Ｔｒｅｓａｃｒｙｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）アフィニティークロマトグラフィーマトリックスに
結合されたポリガラクツロナーゼと共にＩｇＧ画分をイ
ンキュベートすることによって調製した。タンパク質の
配列決定のために精製されたポリガラクツロナーゼを、
製造業者によって記載されているようにしてＴｒｅｓａ
ｃｒｙｌ樹脂４mlに連結した。
精製された抗血清を、Ｖｅｎｄｏｒによって記載された
ようにして、Ｔｒｅｓａｃｒｙｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）アフィニティークロマトグラフィーマトリックスに
結合されたポリガラクツロナーゼと共にＩｇＧ画分をイ
ンキュベートすることによって調製した。タンパク質の
配列決定のために精製されたポリガラクツロナーゼを、
製造業者によって記載されているようにしてＴｒｅｓａ
ｃｒｙｌ樹脂４mlに連結した。
【００７４】上記のようにして調製されたＩｇＧ ５ml
を、０．０１ＭのＴｒｉｓ（pH７．５），１５０mMのＮ
ａＣｌ及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）溶
液により希釈し、５０mlにし、そして４℃で一晩、前記
樹脂と共にインキュベートした。次に、その樹脂をＴＢ
ＳＴにより洗浄し、そして０．２Ｍグリシン（pH２．７
５）溶液により溶離した。Ａ２８０で高い活性を有する
画分をプールし、そして１０mMのＴｒｉｓ（pH８．０）
及び１５０mMのＮａＣｌ溶液に対して透析した。精製さ
れた抗体の最終体積は、元の血清の１：２希釈度を示す
１２mlであった。
を、０．０１ＭのＴｒｉｓ（pH７．５），１５０mMのＮ
ａＣｌ及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）溶
液により希釈し、５０mlにし、そして４℃で一晩、前記
樹脂と共にインキュベートした。次に、その樹脂をＴＢ
ＳＴにより洗浄し、そして０．２Ｍグリシン（pH２．７
５）溶液により溶離した。Ａ２８０で高い活性を有する
画分をプールし、そして１０mMのＴｒｉｓ（pH８．０）
及び１５０mMのＮａＣｌ溶液に対して透析した。精製さ
れた抗体の最終体積は、元の血清の１：２希釈度を示す
１２mlであった。
【００７５】結果 ポリガラクツロナーゼｃＤＮＡの同定 １２個の指定ポリガラクツロナーゼ クローンを、上記
抗体調製物との反応によってλｇｔ１１ライブラリィか
ら同定した。２個のクローンから精製された挿入体をプ
ローブとして用いてのノザシ法は、ｍＲＮＡをコードし
た１つのクローン（Ｃ３）が、ポリガラクツロナーゼｍ
ＲＮＡのために予期される方法及びサイズで、トマトの
発育の間、発現されることを示した。
抗体調製物との反応によってλｇｔ１１ライブラリィか
ら同定した。２個のクローンから精製された挿入体をプ
ローブとして用いてのノザシ法は、ｍＲＮＡをコードし
た１つのクローン（Ｃ３）が、ポリガラクツロナーゼｍ
ＲＮＡのために予期される方法及びサイズで、トマトの
発育の間、発現されることを示した。
【００７６】ポリガラクツロナーゼをコードする、さら
に推定のｃＤＮＡクローンを同定するために、ファージ
ＤＮＡを残る１０個のクローンから調製し、ＥｃｏＲＩ
及びＨｉｎｄIII により消化し、そしてプローブとして
クローンＣ３挿入体を用いて、サザン法（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓなど．、前記）にゆだねた。さらにｃＤＮＡクロー
ン（Ｐ１）をＣ３にクロスハイブリダイズし、そしてさ
らに、特徴化し、アンチ−センス発現のための配列を提
供した。ポリガラクツロナーゼｃＤＮＡクローンとして
のＰ１の同定を、該ＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸
配列と実際のポリガラクツロナーゼ タンパク質配列と
を比較することによって確認した。そのクローンは、成
熟したポリガラクツロナーゼ ポリペプチドのほぼＮ−
末端で始まり、そして３′非翻訳領域を含むカルボキシ
末端に延長するポリガラクツロナーゼ遺伝子の一部をコ
ードする。
に推定のｃＤＮＡクローンを同定するために、ファージ
ＤＮＡを残る１０個のクローンから調製し、ＥｃｏＲＩ
及びＨｉｎｄIII により消化し、そしてプローブとして
クローンＣ３挿入体を用いて、サザン法（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓなど．、前記）にゆだねた。さらにｃＤＮＡクロー
ン（Ｐ１）をＣ３にクロスハイブリダイズし、そしてさ
らに、特徴化し、アンチ−センス発現のための配列を提
供した。ポリガラクツロナーゼｃＤＮＡクローンとして
のＰ１の同定を、該ＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸
配列と実際のポリガラクツロナーゼ タンパク質配列と
を比較することによって確認した。そのクローンは、成
熟したポリガラクツロナーゼ ポリペプチドのほぼＮ−
末端で始まり、そして３′非翻訳領域を含むカルボキシ
末端に延長するポリガラクツロナーゼ遺伝子の一部をコ
ードする。
【００７７】アンチ−センス ポリガラクツロナーゼの
二成分プラスミドの構成 ファージＰ１ＤＮＡをＥｃｏＲＩにより消化し、そして
ｃＤＮＡ挿入体をＥｃｏＲＩにより消化されたＭ１３
Ｂｌｎｅ Ｓｃｒｉｂｅ Ｍｉｎｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）に結合し、ｐＣＧＮ１４０１を得た。ｐＣＧＮ
１４０１をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、Ｅ
ｃｏＲＩリンカーの７個の塩基（GAATTCC ）、ポリガラ
クツロナーゼ リーダー配列（ＡＴ）の２個の塩基、成
熟ポリガラクツロナーゼ タンパク質のＮ−末端アミノ
酸をコードするトリプレット（GGG ）及びＢａｍＨＩ部
位までのさらに２１０個の塩基を含む２１９bpのフラグ
メント（図１及び図２）得た。このフラグメントを、ｍ
ａｓ５′−ｏｃｓ３′カセット、すなわちｐＣＧＮ４６
〔Ｃｏｍａｉなど、Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３１７：
７４１〜７４４〕のユニークＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部
位に挿入した。これは、ｍａｓプロモーターへのアンチ
−センス（マイナスの方向）のフラグメントの挿入をも
たらし、ｐＣＧＮ４０２を得た。
二成分プラスミドの構成 ファージＰ１ＤＮＡをＥｃｏＲＩにより消化し、そして
ｃＤＮＡ挿入体をＥｃｏＲＩにより消化されたＭ１３
Ｂｌｎｅ Ｓｃｒｉｂｅ Ｍｉｎｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）に結合し、ｐＣＧＮ１４０１を得た。ｐＣＧＮ
１４０１をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、Ｅ
ｃｏＲＩリンカーの７個の塩基（GAATTCC ）、ポリガラ
クツロナーゼ リーダー配列（ＡＴ）の２個の塩基、成
熟ポリガラクツロナーゼ タンパク質のＮ−末端アミノ
酸をコードするトリプレット（GGG ）及びＢａｍＨＩ部
位までのさらに２１０個の塩基を含む２１９bpのフラグ
メント（図１及び図２）得た。このフラグメントを、ｍ
ａｓ５′−ｏｃｓ３′カセット、すなわちｐＣＧＮ４６
〔Ｃｏｍａｉなど、Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３１７：
７４１〜７４４〕のユニークＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部
位に挿入した。これは、ｍａｓプロモーターへのアンチ
−センス（マイナスの方向）のフラグメントの挿入をも
たらし、ｐＣＧＮ４０２を得た。
【００７８】次に、ｐＣＧＮ１４０２を、制限酵素Ｘｈ
ｏＩにより消化し、そして左及び右のボーダーの間に耐
植物カナマイシン マーカーを含む二成分プラスミドｐ
ＣＧＮ７８３のユニークＳａｌＩ部位にクローンした。
Ｅ．コリＣ２１１０中のこのプラスミドを、ポリガラク
ツロナーゼ アンチ−センスカセット及び耐カナマイシ
ン カセットを植物宿主の遺伝子に転移することができ
る非武装Ｔｉプラスミドを含むアグロバクテリアム・ツ
メファシエン中に接合した。使用されるアグロバクテリ
アム系は、Ａ．ツメファシエンＰＣ２７６０〔Ｇ．Ｏｏ
ｍｓなど、Ｐｌａｓｍｉｄ（１９８２），Ｎａｔｕｒｅ
（１９８３）３０３：１７９〜１８１；ヨーロッパ特許
出願第８４−２００２３９．６号、第２４２４１８３
号〕である。
ｏＩにより消化し、そして左及び右のボーダーの間に耐
植物カナマイシン マーカーを含む二成分プラスミドｐ
ＣＧＮ７８３のユニークＳａｌＩ部位にクローンした。
Ｅ．コリＣ２１１０中のこのプラスミドを、ポリガラク
ツロナーゼ アンチ−センスカセット及び耐カナマイシ
ン カセットを植物宿主の遺伝子に転移することができ
る非武装Ｔｉプラスミドを含むアグロバクテリアム・ツ
メファシエン中に接合した。使用されるアグロバクテリ
アム系は、Ａ．ツメファシエンＰＣ２７６０〔Ｇ．Ｏｏ
ｍｓなど、Ｐｌａｓｍｉｄ（１９８２），Ｎａｔｕｒｅ
（１９８３）３０３：１７９〜１８１；ヨーロッパ特許
出願第８４−２００２３９．６号、第２４２４１８３
号〕である。
【００７９】ｐＣＧＮ７８３の構成 ｐＣＧＮ７８３は、アグロバクテリアム・ツメファシエ
ンのオクトピンＴｉ−プラスミド、ｐＴｉＡ６〔Ｃｕｒ
ｒｉｅｒ ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｒ（１９７６）前記〕の
左及び右のＴ−ＤＮＡボーダー；ｐＰＨ１ＪＩ〔Ｈｉｒ
ｓｃｈなど、Ｐｌａｓｍｉｄ（１９８４）１２：１３９
〜１４１〕の耐ゲンタマイシン遺伝子；カリフラワーモ
ザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター〔Ｇ
ａｒｄｎｅｒなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．（１９８１）９：１８７１〜１８８０〕；Ｔｎ５
〔Ｊｏｒｇｅｒｓｅｎ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．（１９７９）
１７７：６５〕耐カナマイシン遺伝子；及びｐＴｉＡ６
〔Ｃｕｒｒｉｅｒ ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｒ（１９７６）
前記〕の転写７からの３′領域を含む二成分プラスミド
である。ｐＣＧＮ７８３の構成法は図３に概略されてい
る。
ンのオクトピンＴｉ−プラスミド、ｐＴｉＡ６〔Ｃｕｒ
ｒｉｅｒ ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｒ（１９７６）前記〕の
左及び右のＴ−ＤＮＡボーダー；ｐＰＨ１ＪＩ〔Ｈｉｒ
ｓｃｈなど、Ｐｌａｓｍｉｄ（１９８４）１２：１３９
〜１４１〕の耐ゲンタマイシン遺伝子；カリフラワーモ
ザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター〔Ｇ
ａｒｄｎｅｒなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．（１９８１）９：１８７１〜１８８０〕；Ｔｎ５
〔Ｊｏｒｇｅｒｓｅｎ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．（１９７９）
１７７：６５〕耐カナマイシン遺伝子；及びｐＴｉＡ６
〔Ｃｕｒｒｉｅｒ ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｒ（１９７６）
前記〕の転写７からの３′領域を含む二成分プラスミド
である。ｐＣＧＮ７８３の構成法は図３に概略されてい
る。
【００８０】ｐＣＧＮ７８９（二成分ベクター）の構成 耐ゲンタマイシン性マーカー得るために、耐性遺伝子
を、ｐＰＨＩＪＩ〔Ｈｉｒｓｃｈなど、１９８４、前
記〕の３．１kb ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントか
ら単離し、そしてｐＵＣ９〔Ｖｉｅｉｒａなど、Ｇｅｎ
ｅ（１９８２）１９：２５９〜２６８〕中にクローン化
し、ｐＣＧＮ５４９を得た。耐カゲンタマイシン遺伝子
を含むｐＣＧＮ５４９のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩフラ
グメントを、ｐＣＧＮ５８７（構成のためには前記を参
照のこと）のＨｉｎｄIII −ＢｇｌIIフラグメントと交
換し、ｐＣＧＮ５９４を得た。
を、ｐＰＨＩＪＩ〔Ｈｉｒｓｃｈなど、１９８４、前
記〕の３．１kb ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントか
ら単離し、そしてｐＵＣ９〔Ｖｉｅｉｒａなど、Ｇｅｎ
ｅ（１９８２）１９：２５９〜２６８〕中にクローン化
し、ｐＣＧＮ５４９を得た。耐カゲンタマイシン遺伝子
を含むｐＣＧＮ５４９のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩフラ
グメントを、ｐＣＧＮ５８７（構成のためには前記を参
照のこと）のＨｉｎｄIII −ＢｇｌIIフラグメントと交
換し、ｐＣＧＮ５９４を得た。
【００８１】ｏｃｓ−カナマイシン−ｏｃｓフラグメン
トを含むｐＣＧＮ５９４のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ領
域を、ｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｏｎ，
１９８５、前記）からのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩポリ
リンカー領域と交換し、ｐＣＧＮ７３９を得た。７２６ｃの構成 （１ＡＴＧ−カナマイシン−３′領域） ｐＣＧＮ５６６は、ｐＵＣ１３−ｃｍ（Ｋ．Ｂｕｃｋｌ
ｅｙ，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，ＵＳ−Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，１９８５）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII部位中に
挿入された。ｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏ
ｎ、前記）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII リンカーを含
む。ＯＲＦ１及び２〔Ｂａｒｋｅｒなど、（１９８３）
前記〕を含むｐＮＷ３１ｃ−８，２９−１〔Ｔｈｏｍａ
ｓｈｏｗなど、（１９８０）ｃｅｌｌ １９：７２９〕
のＨｉｎｄIII −ＢｇｌIIフラグメントを、ｐＣＧＮ５
６６のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位中にサブクローン
し、ｐＣＧＮ７０３を得た。
トを含むｐＣＧＮ５９４のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ領
域を、ｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｏｎ，
１９８５、前記）からのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩポリ
リンカー領域と交換し、ｐＣＧＮ７３９を得た。７２６ｃの構成 （１ＡＴＧ−カナマイシン−３′領域） ｐＣＧＮ５６６は、ｐＵＣ１３−ｃｍ（Ｋ．Ｂｕｃｋｌ
ｅｙ，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，ＵＳ−Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，１９８５）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII部位中に
挿入された。ｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏ
ｎ、前記）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII リンカーを含
む。ＯＲＦ１及び２〔Ｂａｒｋｅｒなど、（１９８３）
前記〕を含むｐＮＷ３１ｃ−８，２９−１〔Ｔｈｏｍａ
ｓｈｏｗなど、（１９８０）ｃｅｌｌ １９：７２９〕
のＨｉｎｄIII −ＢｇｌIIフラグメントを、ｐＣＧＮ５
６６のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位中にサブクローン
し、ｐＣＧＮ７０３を得た。
【００８２】ｐＴｉＡ６｛ｐＴｉ１５９５５〔Ｂａｒｋ
ｅｒなど、（１９８３）前記〕の塩基２３９６〜２９２
０に対応する｝からの、転写７の３′領域を含むｐＣＧ
Ｎ７０３のＳａｕ３Ａフラグメントを、ｐＵＣ１８〔Ｙ
ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎなど、（１９８５）前記〕
のＢａｍＨＩ部位中にサブクローンし、ｐＣＧＮ７０９
を得た。ｐＣＧＮ７０９のＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩポリリ
ンカー領域を、耐カナマイシン遺伝子（ＡＰＨ３′II）
を含む、ｐＣＧＮ５８７（製造のためには前記を参照の
こと）からのＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩフラグメントと交換
し、ｐＣＧＮ７２６を得た。
ｅｒなど、（１９８３）前記〕の塩基２３９６〜２９２
０に対応する｝からの、転写７の３′領域を含むｐＣＧ
Ｎ７０３のＳａｕ３Ａフラグメントを、ｐＵＣ１８〔Ｙ
ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎなど、（１９８５）前記〕
のＢａｍＨＩ部位中にサブクローンし、ｐＣＧＮ７０９
を得た。ｐＣＧＮ７０９のＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩポリリ
ンカー領域を、耐カナマイシン遺伝子（ＡＰＨ３′II）
を含む、ｐＣＧＮ５８７（製造のためには前記を参照の
こと）からのＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩフラグメントと交換
し、ｐＣＧＮ７２６を得た。
【００８３】ｐＣＧＮ７２６のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフ
ラグメント＋ｐＣＧＮ７３４のＢｇｌII−ＥｃｏＲＩフ
ラグメントを、ｐＵＣ８−ｐＵＣ１３−ｃｍ（耐クロラ
ムフェニコール、Ｋ，Ｂｕｃｋｌｅｙ，ＰｈＤ．Ｔｌｅ
ｓｉｓ，ＵＣ−Ｓａｍ Ｄｉｅｇｏ，１９８５）のＢａ
ｍＨＩ−ＳａｌＩ部位中に挿入し、ｐＣＧＮ７３８を得
た。ｐＣＧＮ７３４を構成するために、塩基３３９０〜
３２４１に対応する、ｐＴｉＡ６のＨｉｎｄIII −Ｓｐ
ｈＩフラグメント〔Ｂａｒｋｅｒなど、（１９８３）前
記〕を、Ｍ１３ ｍｐ１９〔Ｎｏｒｒａｎｄｅｒなど、
（１９８３）前記〕のＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ部位中に
クローンした。塩基３２８７〜３３００に対応するオリ
ゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡ合成を、この鋳型から
開始する。
ラグメント＋ｐＣＧＮ７３４のＢｇｌII−ＥｃｏＲＩフ
ラグメントを、ｐＵＣ８−ｐＵＣ１３−ｃｍ（耐クロラ
ムフェニコール、Ｋ，Ｂｕｃｋｌｅｙ，ＰｈＤ．Ｔｌｅ
ｓｉｓ，ＵＣ−Ｓａｍ Ｄｉｅｇｏ，１９８５）のＢａ
ｍＨＩ−ＳａｌＩ部位中に挿入し、ｐＣＧＮ７３８を得
た。ｐＣＧＮ７３４を構成するために、塩基３３９０〜
３２４１に対応する、ｐＴｉＡ６のＨｉｎｄIII −Ｓｐ
ｈＩフラグメント〔Ｂａｒｋｅｒなど、（１９８３）前
記〕を、Ｍ１３ ｍｐ１９〔Ｎｏｒｒａｎｄｅｒなど、
（１９８３）前記〕のＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ部位中に
クローンした。塩基３２８７〜３３００に対応するオリ
ゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡ合成を、この鋳型から
開始する。
【００８４】Ｓ１ヌクレアーゼ処理及びＨｉｎｄIII に
よる消化の後、得られたフラグメントを、ｐＵＣ１９
〔Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎなど、（１９８５）前
記〕のＨｉｎｄIII −ＳｍａＩ部位中にクローンした。
塩基３２８７〜３３９０〔Ｂａｒｋｅｒなど、（１９８
３）前記〕に対応するその得られたＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄIII フラグメントを、ｐＴｉＡ６（塩基３３９０〜４
４９４に対応する）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII フラグ
メントと共に、ｐＵＣ８〔Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄＭｅｓ
ｓｉｎｇ（１９８２）前記〕のＥｃｏＲＩ部位にクロー
ンし、ｐＣＧＮ７３４を得た。ｐＣＧＮ７２６ｃを、９
００bpのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを欠失す
ることによってｐＣＧＮ７３８から得た。
よる消化の後、得られたフラグメントを、ｐＵＣ１９
〔Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎなど、（１９８５）前
記〕のＨｉｎｄIII −ＳｍａＩ部位中にクローンした。
塩基３２８７〜３３９０〔Ｂａｒｋｅｒなど、（１９８
３）前記〕に対応するその得られたＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄIII フラグメントを、ｐＴｉＡ６（塩基３３９０〜４
４９４に対応する）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII フラグ
メントと共に、ｐＵＣ８〔Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄＭｅｓ
ｓｉｎｇ（１９８２）前記〕のＥｃｏＲＩ部位にクロー
ンし、ｐＣＧＮ７３４を得た。ｐＣＧＮ７２６ｃを、９
００bpのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを欠失す
ることによってｐＣＧＮ７３８から得た。
【００８５】ｐＣＧＮ７６６ｃの構成（３５Ｓプロモー
ター−３′領域） ＣａＭＶ−３５Ｓプロモーター、１ＡＴＧ−カナマイシ
ン遺伝子及びｐＴｉＡ６のＢａｍＨＩフラグメント１９
を含む、ｐＣＧＮ１６７（構成のためには前記を参照の
こと）のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐ
ＵＣ１９〔Ｎｏｒｒａｎｄｅｒなど、（１９８３）前
記；Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎなど、（１９８５）
前記〕のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 部位にクローンし、
ｐＣＧＮ９７６を得た。
ター−３′領域） ＣａＭＶ−３５Ｓプロモーター、１ＡＴＧ−カナマイシ
ン遺伝子及びｐＴｉＡ６のＢａｍＨＩフラグメント１９
を含む、ｐＣＧＮ１６７（構成のためには前記を参照の
こと）のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐ
ＵＣ１９〔Ｎｏｒｒａｎｄｅｒなど、（１９８３）前
記；Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎなど、（１９８５）
前記〕のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 部位にクローンし、
ｐＣＧＮ９７６を得た。
【００８６】ｐＣＧＮ９７６（３５Ｓプロモーター）の
０．７Kb ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩフラグメント及び
ｐＣＧＮ７０９（転写７：３′、構成のためには前記を
参照のこと）の０．５Kb ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグ
メントをｐＣＧＮ５６６のＨｉｎｄIII −ＳａｌＩ部位
に挿入することによって、転写７からの３５Ｓプロモー
ター及び３′領域を、成長せしめ、ｐＣＧＮ７６６ｃを
得た。
０．７Kb ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩフラグメント及び
ｐＣＧＮ７０９（転写７：３′、構成のためには前記を
参照のこと）の０．５Kb ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグ
メントをｐＣＧＮ５６６のＨｉｎｄIII −ＳａｌＩ部位
に挿入することによって、転写７からの３５Ｓプロモー
ター及び３′領域を、成長せしめ、ｐＣＧＮ７６６ｃを
得た。
【００８７】ｐＣＧＮ７８３の最終構成 ｐＣＧＮ７６６ｃ（ＣａＭＶ−３５Ｓプロモーター）の
０．７Kb ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩフラグメントを、
ｐＵＣ１１９（Ｊ．Ｖｉｅｉｒａ，Ｒｕｔｇｅｒｓ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎ．Ｊ．）のＨｉｎｄIII −Ｓａ
ｌＩ部位中の、ｐＣＧＮ７２６ｃの１．５Kb ＥｃｏＲ
Ｉ−ＳａｌＩフラグメント（１−ＡＴＧ−ＫＡＮ−３′
領域）に連結し、ｐＣＧＮ７８８を得た。ＣａＭＶ ３
５Ｓプロモーター（１−ＡＴＧ−ＫＡＮ−３′領域）を
含む、ｐＣＧＮ７８８のＨｉｎｄIII −ＳａｌＩフラグ
メントの２．２Kb領域を、ｐＣＧＮ７３９のＨｉｎｄII
I −ＳａｌＩポリリンカー領域と交換し、ｐＣＧＮ７８
３を得た。
０．７Kb ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩフラグメントを、
ｐＵＣ１１９（Ｊ．Ｖｉｅｉｒａ，Ｒｕｔｇｅｒｓ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎ．Ｊ．）のＨｉｎｄIII −Ｓａ
ｌＩ部位中の、ｐＣＧＮ７２６ｃの１．５Kb ＥｃｏＲ
Ｉ−ＳａｌＩフラグメント（１−ＡＴＧ−ＫＡＮ−３′
領域）に連結し、ｐＣＧＮ７８８を得た。ＣａＭＶ ３
５Ｓプロモーター（１−ＡＴＧ−ＫＡＮ−３′領域）を
含む、ｐＣＧＮ７８８のＨｉｎｄIII −ＳａｌＩフラグ
メントの２．２Kb領域を、ｐＣＧＮ７３９のＨｉｎｄII
I −ＳａｌＩポリリンカー領域と交換し、ｐＣＧＮ７８
３を得た。
【００８８】ｐＣＧＮ５８７の調製 ＡＰＨ３′II〔Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎなど、Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．（１９７９）１７７：６５〕のための完全な構造遺
伝子を含む、Ｔｎ５のＨｉｎｄIII −ＳａｌＩフラグメ
ントは、ＳｍａＩ部位にすぐ隣接してＥｃｏＲＩ部位が
存在するので、該フラグメントをＨｉｎｄIII −Ｅｃｏ
ＲＩフラグメント中に転換しながら、ｐＵＣ８〔Ｖｉｅ
ｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ（１９８
２）１９：２５９〕にクローンされた。次に、ＡＰＨ
３′II遺伝子の３′一部分を含むＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ
フラグメントを、ｐＵＣ７（ｐＣＧＮ５４６Ｗ）のＥｃ
ｏＲＩ部位中に、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ−
ＰｓｔＩリンカーと共に組み合せた。
ｎ．（１９７９）１７７：６５〕のための完全な構造遺
伝子を含む、Ｔｎ５のＨｉｎｄIII −ＳａｌＩフラグメ
ントは、ＳｍａＩ部位にすぐ隣接してＥｃｏＲＩ部位が
存在するので、該フラグメントをＨｉｎｄIII −Ｅｃｏ
ＲＩフラグメント中に転換しながら、ｐＵＣ８〔Ｖｉｅ
ｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ（１９８
２）１９：２５９〕にクローンされた。次に、ＡＰＨ
３′II遺伝子の３′一部分を含むＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ
フラグメントを、ｐＵＣ７（ｐＣＧＮ５４６Ｗ）のＥｃ
ｏＲＩ部位中に、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ−
ＰｓｔＩリンカーと共に組み合せた。
【００８９】この構造体は耐カナマイシンを付与しない
ので、ＡＰＨ３′II遺伝子のＢｇｌII−ＰｓｔＩフラグ
メントをＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位（ｐＣＧＮ５４６
Ｘ）中に挿入することによって、耐カナマイシンを得
た。この方法は、ＡＰＨ３′II遺伝子を再構成し、その
結果、ＥｃｏＲＩ部位がその遺伝子を端に有する。ＡＴ
Ｇコドンは、ＡＰＨ３′IIのＡＴＧ開始コドンから上流
に存在し、そして該コドンと読み枠を整合していなかっ
た。目的としないＡＴＧは、所望としないＡＴＧが、Ａ
ＰＨ３′IIの５′−末端からのＳａｕ３Ａ−ＰｓｔＩフ
ラグメント（該フラグメントは余分なＡＴＧを欠く）
を、ｐＣＧＮ５４６Ｗ ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位に挿
入することによって避けられ、プラスミドｐＣＧＮ５５
０が得られた。次に、ＡＰＨ３′II遺伝子を含む、ｐＣ
ＧＮ５５０のＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＵＣ８−ｐ
ＵＣ１３〔Ｋ．Ｂｕｃｋｌｅｙ（１９８５）前記〕のＥ
ｃｏＲＩ部位にクローンし、ｐＣＧＮ５５１を得た。
ので、ＡＰＨ３′II遺伝子のＢｇｌII−ＰｓｔＩフラグ
メントをＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位（ｐＣＧＮ５４６
Ｘ）中に挿入することによって、耐カナマイシンを得
た。この方法は、ＡＰＨ３′II遺伝子を再構成し、その
結果、ＥｃｏＲＩ部位がその遺伝子を端に有する。ＡＴ
Ｇコドンは、ＡＰＨ３′IIのＡＴＧ開始コドンから上流
に存在し、そして該コドンと読み枠を整合していなかっ
た。目的としないＡＴＧは、所望としないＡＴＧが、Ａ
ＰＨ３′IIの５′−末端からのＳａｕ３Ａ−ＰｓｔＩフ
ラグメント（該フラグメントは余分なＡＴＧを欠く）
を、ｐＣＧＮ５４６Ｗ ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位に挿
入することによって避けられ、プラスミドｐＣＧＮ５５
０が得られた。次に、ＡＰＨ３′II遺伝子を含む、ｐＣ
ＧＮ５５０のＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＵＣ８−ｐ
ＵＣ１３〔Ｋ．Ｂｕｃｋｌｅｙ（１９８５）前記〕のＥ
ｃｏＲＩ部位にクローンし、ｐＣＧＮ５５１を得た。
【００９０】次に、ＡＰＨ３′II遺伝子を含むＥｃｏＲ
Ｉフラグメントのそれぞれを、ｐＣＧＮ４５１のユニー
クＥｃｏＲＩ部位発現のためのオクトピンシンテターゼ
を含む）に例１に記載しているようにしてクローン化
し、ｐＣＧＮ５４８（２ＡＴＧ）及びｐＣＧＮ５５２
（１ＡＴＧ）を得た。適切な向方にｏｃｓ５′及びｏｃ
ｓ３′を有するプラスミドｐＣＧＮ４５１を、ＥｃｏＲ
Ｉにより消化し、そして完全な耐カナマイシン遺伝子を
含むｐＣＧＮ５５１からのＥｃｏＲＩフラグメントを、
ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、正しい方向に耐カナマイシン
遺伝子を有するｐＣＧＮ５５２を得た。
Ｉフラグメントのそれぞれを、ｐＣＧＮ４５１のユニー
クＥｃｏＲＩ部位発現のためのオクトピンシンテターゼ
を含む）に例１に記載しているようにしてクローン化
し、ｐＣＧＮ５４８（２ＡＴＧ）及びｐＣＧＮ５５２
（１ＡＴＧ）を得た。適切な向方にｏｃｓ５′及びｏｃ
ｓ３′を有するプラスミドｐＣＧＮ４５１を、ＥｃｏＲ
Ｉにより消化し、そして完全な耐カナマイシン遺伝子を
含むｐＣＧＮ５５１からのＥｃｏＲＩフラグメントを、
ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、正しい方向に耐カナマイシン
遺伝子を有するｐＣＧＮ５５２を得た。
【００９１】このｏｃｓ／ＫＡＮ遺伝子を用いて、トラ
ンス型の二成分ベクターｐＣＧＮ５８７のために選択可
能なマーカーを得た。構成されたオクトピンシンテター
ゼ プロモーター カセットの５′部分は、塩基対１５
２０８〜１３６４４でＸｈｏＩからのｐＴｉＡ６ ＤＮ
Ａからなり〔Ｂａｒｋｅｒなど、（１９８３）前記〕、
そしてまた、Ｔ−ＤＮＡのトランスファーに関連された
Ｔ−ＤＮＡ境界配列（ボーダー）を含む。プラスミドｐ
ＣＧＮ５８７においては、ｐＣＧＮ５５２からのｏｃｓ
／ＫＡＮ遺伝子は、右のオーダーもまた選択可能なマー
カーを提供する。初めに、左の境界領域を、ＭＢｍｐ９
中にＨｉｎｄIII −ＳｍａＩ断片（ｐＣＧＮ５０２）
（塩基対６０２〜２２１２）としてクローンし、そして
ｐＣＧＮ５６５中にＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント
として再クローンし、ｐＣＧＮ５８０を得た。
ンス型の二成分ベクターｐＣＧＮ５８７のために選択可
能なマーカーを得た。構成されたオクトピンシンテター
ゼ プロモーター カセットの５′部分は、塩基対１５
２０８〜１３６４４でＸｈｏＩからのｐＴｉＡ６ ＤＮ
Ａからなり〔Ｂａｒｋｅｒなど、（１９８３）前記〕、
そしてまた、Ｔ−ＤＮＡのトランスファーに関連された
Ｔ−ＤＮＡ境界配列（ボーダー）を含む。プラスミドｐ
ＣＧＮ５８７においては、ｐＣＧＮ５５２からのｏｃｓ
／ＫＡＮ遺伝子は、右のオーダーもまた選択可能なマー
カーを提供する。初めに、左の境界領域を、ＭＢｍｐ９
中にＨｉｎｄIII −ＳｍａＩ断片（ｐＣＧＮ５０２）
（塩基対６０２〜２２１２）としてクローンし、そして
ｐＣＧＮ５６５中にＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント
として再クローンし、ｐＣＧＮ５８０を得た。
【００９２】ｐＣＧＮ５６５は、ｐＵＣ８−Ｃｍに基づ
くクローニング ベクターであるが、しかしｐＵＣ１８
リンカーを含んでいる。ｐＣＧＮ５８０を、ＢａｍＨＩ
により直線にし、そしてそれを用いて、ｐＶＣＫ１０２
〔Ｋｎａｕｆ ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｒ，Ｐｌａｓｍｉｄ
（１９８２）８：４５〕の小さなＢｇｌＩフラグメント
を交換し、ｐＣＧＮ５８５を得た。ｐＣＧＮ５８５の小
さなＳａｌＩフラグメントとｏｃｓ／ＫＡＮ遺伝子を含
む、ｐＣＧＮ５５２からのＸｈｏＩフラグメントとを交
換することによって、ｐＣＧＮ５８７を得た。
くクローニング ベクターであるが、しかしｐＵＣ１８
リンカーを含んでいる。ｐＣＧＮ５８０を、ＢａｍＨＩ
により直線にし、そしてそれを用いて、ｐＶＣＫ１０２
〔Ｋｎａｕｆ ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｒ，Ｐｌａｓｍｉｄ
（１９８２）８：４５〕の小さなＢｇｌＩフラグメント
を交換し、ｐＣＧＮ５８５を得た。ｐＣＧＮ５８５の小
さなＳａｌＩフラグメントとｏｃｓ／ＫＡＮ遺伝子を含
む、ｐＣＧＮ５５２からのＸｈｏＩフラグメントとを交
換することによって、ｐＣＧＮ５８７を得た。
【００９３】ｐＣＧＮ１６７を構成するために、ＣｕＭ
ＶのＡｌｕＩフラグメント（bp７１４４〜７７３５）
〔Ｇａｒｄｎｅｒなど、ＮｕＣｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．（１９８１）９：２８７１〜２８８８〕をＡｌｕＩ
による消化によって得、そしてＭ１３ ｍｐ７〔Ｖｉｅ
ｉｒａ．Ｇｅｎｅ（１９８２）１９：２５９〕のＨｉｎ
ｅII部位にクローンし、Ｃ６１４を得た。Ｃ６１４のＥ
ｃｏＲＩ消化物は、３５Ｓプロモーターを含むＣ６１４
からのＥｃｏＲＩフラグメントを産生し、このフラグメ
ントを、ｐＵＣ８〔Ｖｉｅｉｒａなど、Ｇｅｎｅ（１９
８２）１９：２５９〕中にクローンし、ｐＣＧＮ１４６
を得た。
ＶのＡｌｕＩフラグメント（bp７１４４〜７７３５）
〔Ｇａｒｄｎｅｒなど、ＮｕＣｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．（１９８１）９：２８７１〜２８８８〕をＡｌｕＩ
による消化によって得、そしてＭ１３ ｍｐ７〔Ｖｉｅ
ｉｒａ．Ｇｅｎｅ（１９８２）１９：２５９〕のＨｉｎ
ｅII部位にクローンし、Ｃ６１４を得た。Ｃ６１４のＥ
ｃｏＲＩ消化物は、３５Ｓプロモーターを含むＣ６１４
からのＥｃｏＲＩフラグメントを産生し、このフラグメ
ントを、ｐＵＣ８〔Ｖｉｅｉｒａなど、Ｇｅｎｅ（１９
８２）１９：２５９〕中にクローンし、ｐＣＧＮ１４６
を得た。
【００９４】プロモーター領域を切断するために、Ｂｇ
ｌII部位（bp７６７０）を、ＢｇｌII及びＢａｌ３１に
より処理し、そして続いて、ＢｇｌIIリンカーを、Ｂａ
ｌ３１により処理されたＤＮＡに結合し、ｐＣＧＮ１４
７を得た。プロモーター領域、選択可能なマーカー（２
ＡＴＧを有するＫＡＮ）及び３′領域を含むｐＣＧＮ１
４８ａを、ＢｇｌIIによりｐＣＧＮ５２８（下記参照の
こと）を消化し、そしてｐＣＧＮ１４７からのＢａｍＨ
Ｉ−ＢｇｌIIプロモーターフラグメントを挿入すること
によって調製した。このフラグメントを、ｐＣＧＮ５２
８のＢｇｌII部位にクローンし、その結果、該ＢｇｌII
部位が、ｐＣＧＮ５２８のカナマイシン遺伝子に隣接し
た。
ｌII部位（bp７６７０）を、ＢｇｌII及びＢａｌ３１に
より処理し、そして続いて、ＢｇｌIIリンカーを、Ｂａ
ｌ３１により処理されたＤＮＡに結合し、ｐＣＧＮ１４
７を得た。プロモーター領域、選択可能なマーカー（２
ＡＴＧを有するＫＡＮ）及び３′領域を含むｐＣＧＮ１
４８ａを、ＢｇｌIIによりｐＣＧＮ５２８（下記参照の
こと）を消化し、そしてｐＣＧＮ１４７からのＢａｍＨ
Ｉ−ＢｇｌIIプロモーターフラグメントを挿入すること
によって調製した。このフラグメントを、ｐＣＧＮ５２
８のＢｇｌII部位にクローンし、その結果、該ＢｇｌII
部位が、ｐＣＧＮ５２８のカナマイシン遺伝子に隣接し
た。
【００９５】この構造体のために使用されたシャトルベ
クター、ｐＣＧＮ５２８を次のようにして製造した。カ
ナマイシン遺伝子を含むＴｎ５を含むプラスミド〔Ｊｏ
ｒｇｅｎｓｏｎなど、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．（１９７９）１
７７：６５〕をＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩにより消化
し、そしてそのカナマイシン遺伝子を含むＨｉｎｄIII
−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＡＣＹＣ１８４〔Ｃｈ
ａｎｇ ＆ Ｃｏｈｅｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
（１９７８）１３４：１１４１〜１１５６〕のテトラサ
イクリン遺伝子のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位に挿入
することによって、ｐＣＧＮ５２５を製造した。
クター、ｐＣＧＮ５２８を次のようにして製造した。カ
ナマイシン遺伝子を含むＴｎ５を含むプラスミド〔Ｊｏ
ｒｇｅｎｓｏｎなど、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．（１９７９）１
７７：６５〕をＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩにより消化
し、そしてそのカナマイシン遺伝子を含むＨｉｎｄIII
−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＡＣＹＣ１８４〔Ｃｈ
ａｎｇ ＆ Ｃｏｈｅｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
（１９７８）１３４：１１４１〜１１５６〕のテトラサ
イクリン遺伝子のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位に挿入
することによって、ｐＣＧＮ５２５を製造した。
【００９６】１９９ｆｐＴｉＡ６〔Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ
など、Ｃｅｌｌ（１９８０）１９：７２９〜７３９〕の
ＢａｍＨＩフラグメントをｐＣＧＮ５２５のＢａｍＨＩ
部位に挿入することによって、ｐＣＧＮ５２６を製造し
た。ｐＣＧＮ５２６から小さなＸｈｏＩフラグメントを
切断し、ＸｈｏＩにより消化し、そして再結合すること
によって、ｐＣＧＮ５２８を製造した。ｐＭＢ９Ｋａｎ
ＸＸＩからのＢａｍＨＩカナマイシン遺伝子をｐＣＧ
Ｎ１４８ａのＢａｍＨＩ部位にクローンすることによっ
て、ｐＣＧＮ１４９ａを製造した。
など、Ｃｅｌｌ（１９８０）１９：７２９〜７３９〕の
ＢａｍＨＩフラグメントをｐＣＧＮ５２５のＢａｍＨＩ
部位に挿入することによって、ｐＣＧＮ５２６を製造し
た。ｐＣＧＮ５２６から小さなＸｈｏＩフラグメントを
切断し、ＸｈｏＩにより消化し、そして再結合すること
によって、ｐＣＧＮ５２８を製造した。ｐＭＢ９Ｋａｎ
ＸＸＩからのＢａｍＨＩカナマイシン遺伝子をｐＣＧ
Ｎ１４８ａのＢａｍＨＩ部位にクローンすることによっ
て、ｐＣＧＮ１４９ａを製造した。
【００９７】ｐＭＢ９Ｋａｎ ＸＸＩは、ＸｈｏＩ部位
を欠くが、しかしアグロバクテリアム中において効果的
な選択を可能にするために、Ｔｎ９０３からの機能的な
遺伝子を含むｐＵＣ４Ｋ変異体〔Ｖｉｅｉｒａ ＆ Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ．Ｇｅｎｅ（１９８２）１９：２５９〜２
６８〕である。ｐＣＧＮ１４９ａを、ＢｇｌII及びＳｐ
ｈＩにより消化した。このｐＣＧＮ１４９ａの小さなＢ
ｇｌII−ＳｐｈＩフラグメントをＢａｍＨＩ及びＳｐｈ
Ｉによる消化によって単離されたＭＩ（下記参照のこ
と）からのＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩフラグメントと交換し
た。これは、完全な長さのＣａＭＶプロモーター、１Ａ
ＴＧ−カナマイシン遺伝子、３′末端及び細菌のＴｎ９
０３型カナマイシン遺伝子を含む構造体、すなわちｐＣ
ＧＮ１６７を産生する。ＭＩは、ｐＣＧＮ５５０（ｐＣ
ＧＮ５８７の構成を参照のこと）からのＥｃｏＲＩフラ
グメントであり、そして１ＡＴＧ−カナマイシン遺伝子
におけるＰｓｔＩ部位がＭ１３ ｍｐ９のポリリンカー
領域に隣接するように、Ｍ１３ ｍｐ９のＥｃｏＲＩク
ローニング部位にクローンされた。
を欠くが、しかしアグロバクテリアム中において効果的
な選択を可能にするために、Ｔｎ９０３からの機能的な
遺伝子を含むｐＵＣ４Ｋ変異体〔Ｖｉｅｉｒａ ＆ Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ．Ｇｅｎｅ（１９８２）１９：２５９〜２
６８〕である。ｐＣＧＮ１４９ａを、ＢｇｌII及びＳｐ
ｈＩにより消化した。このｐＣＧＮ１４９ａの小さなＢ
ｇｌII−ＳｐｈＩフラグメントをＢａｍＨＩ及びＳｐｈ
Ｉによる消化によって単離されたＭＩ（下記参照のこ
と）からのＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩフラグメントと交換し
た。これは、完全な長さのＣａＭＶプロモーター、１Ａ
ＴＧ−カナマイシン遺伝子、３′末端及び細菌のＴｎ９
０３型カナマイシン遺伝子を含む構造体、すなわちｐＣ
ＧＮ１６７を産生する。ＭＩは、ｐＣＧＮ５５０（ｐＣ
ＧＮ５８７の構成を参照のこと）からのＥｃｏＲＩフラ
グメントであり、そして１ＡＴＧ−カナマイシン遺伝子
におけるＰｓｔＩ部位がＭ１３ ｍｐ９のポリリンカー
領域に隣接するように、Ｍ１３ ｍｐ９のＥｃｏＲＩク
ローニング部位にクローンされた。
【００９８】宿主中に発現される遺伝子のｍＲＮＡに相
補的な配列の転写を提供することによって、植物宿主の
ゲノムにおける遺伝子の発現を調節することが可能であ
ることが上記結果から明らかである。この場合、種々の
過程が変性又は調節され、特定の生成物の産生の増強、
細胞分化及び発育の変化、生成物の形成の阻害、表現型
の変化又は同様のものが得られる。アンチ−センス調節
の使用は、特定の生成物の発現の実質的な阻害又は種々
の還元度を提供することができる。この場合、細胞の表
現型は、異質タンパク質の産生なしに及び特定の遺伝子
に対する特別な目標でもって変性され得る。
補的な配列の転写を提供することによって、植物宿主の
ゲノムにおける遺伝子の発現を調節することが可能であ
ることが上記結果から明らかである。この場合、種々の
過程が変性又は調節され、特定の生成物の産生の増強、
細胞分化及び発育の変化、生成物の形成の阻害、表現型
の変化又は同様のものが得られる。アンチ−センス調節
の使用は、特定の生成物の発現の実質的な阻害又は種々
の還元度を提供することができる。この場合、細胞の表
現型は、異質タンパク質の産生なしに及び特定の遺伝子
に対する特別な目標でもって変性され得る。
【００９９】前述の発明は、明確に理解するために例示
的及び例的にいくらか詳細に記載されているけれども、
特許請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができ
る。ｐＣＧＮ９７８×Ｋ１２を、１９８６年３月２５日
にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託し、そして寄託番号第６７０
６４号を得、そしてｐＣＧＮ１４０１を、１９８６年１
０月７日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託し、そして寄託番号
第６７２２７号を得た。
的及び例的にいくらか詳細に記載されているけれども、
特許請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができ
る。ｐＣＧＮ９７８×Ｋ１２を、１９８６年３月２５日
にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託し、そして寄託番号第６７０
６４号を得、そしてｐＣＧＮ１４０１を、１９８６年１
０月７日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託し、そして寄託番号
第６７２２７号を得た。
【０１００】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：７０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 Gly Ile Lys Val Ile Asn Val Leu Ser Phe Gly Ala Lys Gly Asp Gly 5 10 15 Lys Thr Tyr Asp Asn Ile Ala Phe Glu Gln Ala Trp Asn Glu Ala Cys 20 25 30 Ser Ser Arg Thr Pro Val Gln Phe Val Val Pro Lys Asn Lys Asn Tyr 35 40 45 Leu Leu Lys Gln Ile Thr Phe Ser Gly Pro Cys Arg Ser Ser Ile Ser 50 55 60 Val Lys Ile Phe Gly Ser 65 70
【０１０１】 配列番号：２ 配列の長さ：２１０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 GGGATTAAAG TGATTAATGT ACTTAGCTTT GGAGCTAAGG GTGATGGAAA AACATATGAT 60 AATATTGCAT TTGAGCAAGC ATGGAATGAA GCATGTTCAT CTAGAACACC TGTTCAATTT 120 GTGGTTCCTA AAAACAAGAA TTATCTTCTC AAGCAAATCA CCTTTTCAGG TCCATGCAGA 180 TCTTCTATTT CAGTAAAGAT TTTTGGATCC
【図１】図１は、ｐＣＧＮ１４０１からのＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩフラグメントを示す。このフラグメントは、
成熟したポリガラクツロナーゼ タンパク質のＮ−末端
をコードする領域を含むＰ１の５′−部分に対応する。
下線を引かれたアミノ酸は、ＤＮＡ配列から予測され、
そして精製されたポリガラクツロナーゼから科学的配列
決定によって決定されたアミノ酸配列と一致する。
ＢａｍＨＩフラグメントを示す。このフラグメントは、
成熟したポリガラクツロナーゼ タンパク質のＮ−末端
をコードする領域を含むＰ１の５′−部分に対応する。
下線を引かれたアミノ酸は、ＤＮＡ配列から予測され、
そして精製されたポリガラクツロナーゼから科学的配列
決定によって決定されたアミノ酸配列と一致する。
【図２】図２は図１の続きである。
【図３】図３は、二成分ベクターｐＣＧＮ７８３の構成
において使用される種々のプラスミドのフローチャート
である。
において使用される種々のプラスミドのフローチャート
である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年６月３０日（１９９９．６．３
０）
０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウイリアム アール．ハイアット アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，ブラックバーン 2760 (72)発明者 ビック ノーフ アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，エレンディル レーン 2454
Claims (8)
- 【請求項１】 植物細胞における遺伝子の発現を調節す
るための方法であって：下記アミノ酸配列： Gly Ile Lys Val Ile Asn Val Leu Ser Phe Gly Ala Lys Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Asn Ile Ala Phe Glu Gln Ala Trp Asn Glu Ala Cys Ser Ser Arg Thr Pro Val Gln Phe Val Val Pro Lys Asn Lys Asn Tyr Leu Leu Lys Gln Ile Thr Phe Ser Gly Pro Cys Arg Ser Ser Ile Ser Val Lys Ile Phe Gly Ser （配列番号：１）をコードす
る塩基配列を含むように特徴づけられたポリガラクツロ
ナーゼ（ＰＧ）ＤＮＡ配列の一部を含んで成る組換えＤ
ＮＡ構造体を前記植物細胞ゲノム中に組込み、 ここで前記配列は、植物において機能的な転写開始領域
に、発現のための標準の配向に対して反対の配向に連結
され、それによってアンチ−センスＰＧ ＲＮＡ配列が
前記構造体を操作可能的に担持する植物細胞において転
写され；そして前記組込まれた構造体を含む前記植物細
胞を増殖し、それによって前記アンチ−センスＲＮＡが
転写され、そして前記植物細胞におけるＰＧ ｍＲＮＡ
の発現を調節することを含んで成る方法。 - 【請求項２】 前記塩基配列が次の配列： GGGATTAAAG TGATTAATGT ACTTAGCTTT GGAGCTAAGG GTGATGGAAA AACATATGAT AATATTGCAT TTGAGCAAGC ATGGAATGAA GCATGTTCAT CTAGAACACC TGTTCAATTT GTGGTTCCTA AAAACAAGAA TTATCTTCTC AAGCAAATCA CCTTTTCAGG TCCATGCAGA TCTTCTATTT CAGTAAAGAT TTTTGGATCC（配列番号：２） である、請求項１に記載の方法。
- 【請求項３】 前記ＤＮＡ配列がＰＧ ｍＲＮＡの少な
くとも２００のヌクレオチドに相補的な鎖を含んで成る
請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 植物において機能し、そして前記ＰＧ
ＤＮＡ配列に向かって３′側に位置する転写終結領域を
含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 下記アミノ酸： Gly Ile Lys Val Ile Asn Val Leu Ser Phe Gly Ala Lys Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Asn Ile Ala Phe Glu Gln Ala Trp Asn Glu Ala Cys Ser Ser Arg Thr Pro Val Gln Phe Val Val Pro Lys Asn Lys Asn Tyr Leu Leu Lys Gln Ile Thr Phe Ser Gly Pro Cys Arg Ser Ser Ile Ser Val Lys Ile Phe Gly Ser （配列番号：１） をコードする塩基配列を含むように特徴づけられたポリ
ガラクツロナーゼ（ＰＧ）ＤＮＡ配列の一部を含んで成
る組換えＤＮＡ構造体を植物細胞ゲノム中に組込む植物
細胞であって、前記配列が、植物において機能的な転写
開始領域に、発現のための標準の配向に対して反対の配
向に連結され、それによってアンチ−センスＰＧ ＲＮ
Ａ配列が前記構造体を操作可能的に担持する植物細胞に
おいて転写されることを特徴とする植物細胞。 - 【請求項６】 前記塩基配列が次の配列： GGGATTAAAG TGATTAATGT ACTTAGCTTT GGAGCTAAGG GTGATGGAAA AACATATGAT AATATTGCAT TTGAGCAAGC ATGGAATGAA GCATGTTCAT CTAGAACACC TGTTCAATTT GTGGTTCCTA AAAACAAGAA TTATCTTCTC AAGCAAATCA CCTTTTCAGG TCCATGCAGA TCTTCTATTT CAGTAAAGAT TTTTGGATCC（配列番号：２） である、請求項５に記載の植物細胞。
- 【請求項７】 下記アミノ酸配列： Gly Ile Lys Val Ile Asn Val Leu Ser Phe Gly Ala Lys Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Asn Ile Ala Phe Glu Gln Ala Trp Asn Glu Ala Cys Ser Ser Arg Thr Pro Val Gln Phe Val Val Pro Lys Asn Lys Asn Tyr Leu Leu Lys Gln Ile Thr Phe Ser Gly Pro Cys Arg Ser Ser Ile Ser Val Lys Ile Phe Gly Ser （配列番号：１） をコードする塩基配列を含むように特徴づけられたポリ
ガラクツロナーゼ（ＰＧ）ＤＮＡ配列の一部を含んで成
る組換えＤＮＡ構造体を植物細胞ゲノム中に組込む植物
細胞に由来する植物であって、前記配列が、植物におい
て機能的な転写開始領域に、発現のための標準の配向に
対して反対の配向に連結され、それによってアンチ−セ
ンスＰＧ ＲＮＡ配列が前記構造体を操作可能的に担持
する植物細胞において転写されることを特徴とする植
物。 - 【請求項８】 前記塩基配列が次の配列： GGGATTAAAG TGATTAATGT ACTTAGCTTT GGAGCTAAGG GTGATGGAAA AACATATGAT AATATTGCAT TTGAGCAAGC ATGGAATGAA GCATGTTCAT CTAGAACACC TGTTCAATTT GTGGTTCCTA AAAACAAGAA TTATCTTCTC AAGCAAATCA CCTTTTCAGG TCCATGCAGA TCTTCTATTT CAGTAAAGAT TTTTGGATCC（配列番号：２） である、請求項７に記載の植物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84567686A | 1986-03-28 | 1986-03-28 | |
| US92057486A | 1986-10-17 | 1986-10-17 | |
| US920574 | 1986-10-17 | ||
| US845676 | 1986-10-17 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9122043A Division JPH1052283A (ja) | 1986-03-28 | 1997-05-13 | 植物細胞における遺伝子の発現の調節方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000023685A true JP2000023685A (ja) | 2000-01-25 |
| JP3670889B2 JP3670889B2 (ja) | 2005-07-13 |
Family
ID=27126594
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62071918A Expired - Lifetime JP2702921B2 (ja) | 1986-03-28 | 1987-03-27 | 植物細胞における遺伝子発現のアンチーセンス調節 |
| JP9122043A Pending JPH1052283A (ja) | 1986-03-28 | 1997-05-13 | 植物細胞における遺伝子の発現の調節方法 |
| JP17737299A Expired - Lifetime JP3670889B2 (ja) | 1986-03-28 | 1999-06-23 | 植物細胞における遺伝子の発現の調節方法 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62071918A Expired - Lifetime JP2702921B2 (ja) | 1986-03-28 | 1987-03-27 | 植物細胞における遺伝子発現のアンチーセンス調節 |
| JP9122043A Pending JPH1052283A (ja) | 1986-03-28 | 1997-05-13 | 植物細胞における遺伝子の発現の調節方法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0458367B1 (ja) |
| JP (3) | JP2702921B2 (ja) |
| CN (1) | CN87102348A (ja) |
| AR (1) | AR241938A1 (ja) |
| AT (2) | ATE207125T1 (ja) |
| AU (3) | AU618234B2 (ja) |
| CA (2) | CA1341601C (ja) |
| DE (2) | DE3752338T2 (ja) |
| ES (2) | ES2165348T3 (ja) |
| GR (1) | GR3015085T3 (ja) |
| IL (1) | IL81737A (ja) |
| NZ (1) | NZ219472A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004512020A (ja) * | 2000-06-23 | 2004-04-22 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 組換え構築物ならびにこれを遺伝子発現を減少させる際に用いる方法 |
Families Citing this family (79)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6617496B1 (en) * | 1985-10-16 | 2003-09-09 | Monsanto Company | Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs |
| EP0240332B1 (en) * | 1986-04-02 | 1995-07-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Virus resistant plants having antisense RNA |
| WO1988001645A1 (en) * | 1986-08-26 | 1988-03-10 | Macquarie University | Transformation of an organism using antisense rna or promoter occlusion technique |
| GB8626879D0 (en) * | 1986-11-11 | 1986-12-10 | Ici Plc | Dna |
| NZ224787A (en) * | 1987-05-26 | 1990-08-28 | Calgene Inc | A dna construct for specifically modifying the phenotype of fruit as distinct from other plant tissue |
| GB8811115D0 (en) * | 1988-05-11 | 1988-06-15 | Ici Plc | Tomatoes |
| US6255564B1 (en) | 1988-02-03 | 2001-07-03 | Paladin Hybrids, Inc. | Molecular methods of hybrid seed production |
| US5356799A (en) * | 1988-02-03 | 1994-10-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production |
| US5728926A (en) * | 1988-02-03 | 1998-03-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production |
| NZ227835A (en) * | 1988-02-03 | 1992-09-25 | Paladin Hybrids Inc | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production |
| US5741684A (en) * | 1988-02-03 | 1998-04-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Molecular methods of hybrid seed production |
| NL8800756A (nl) * | 1988-03-25 | 1989-10-16 | Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs | Genetisch gemanipuleerde plantecellen en planten, alsmede daarvoor bruikbaar recombinant dna. |
| DE3810286A1 (de) * | 1988-03-25 | 1989-10-12 | Max Planck Gesellschaft | Transgene pflanze mit modifizierter physiologie, morphologie und modifiziertem hormonmetabolismus, gewebekulturen dieser pflanze und verfahren zu ihrer herstellung |
| GB8818706D0 (en) * | 1988-08-05 | 1988-09-07 | Ici Plc | Dna constructs & plants incorporating them |
| WO1990002172A1 (en) * | 1988-08-18 | 1990-03-08 | Calgene, Inc. | Plant elongation factor, promoters, coding sequences and uses |
| JPH04504355A (ja) * | 1989-02-02 | 1992-08-06 | パラディン ハイブリッズ インコーポレーテッド | ハイブリッド種子生産の分子的方法 |
| GB8916213D0 (en) * | 1989-07-14 | 1989-08-31 | Ici Plc | Dna constructs,cells and plants derived therefrom |
| US5744364A (en) * | 1989-10-20 | 1998-04-28 | Zeneca Limited | PTOM36 constructs and tomato cells transformed therewith |
| GB8923716D0 (en) * | 1989-10-20 | 1989-12-06 | Ici Plc | Dna,constructs,cells and plants derived therefrom |
| AU644619B2 (en) * | 1989-12-21 | 1993-12-16 | Advanced Technologies (Cambridge) Limited | Modification of plant metabolism |
| FR2658988A1 (fr) * | 1990-03-02 | 1991-09-06 | Biosem | Betterave resistante a la rhizomanie. |
| DK0517833T4 (da) * | 1990-03-02 | 2008-11-17 | Bayer Bioscience Nv | Genetisk transformation og regenering af sukkerroer |
| US5168064A (en) * | 1990-04-20 | 1992-12-01 | The Regents Of The University Of California | Endo-1,4-β-glucanase gene and its use in plants |
| US5585545A (en) * | 1990-04-20 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of California | Endo-1,4-β-glucanase genes and their use in plants |
| GB9009307D0 (en) * | 1990-04-25 | 1990-06-20 | Ici Plc | Dna,constructs,cells and plant derived therefrom |
| US5668295A (en) * | 1990-11-14 | 1997-09-16 | Philip Morris Incorporated | Protein involved in nicotine synthesis, DNA encoding, and use of sense and antisense DNAs corresponding thereto to affect nicotine content in transgenic tobacco cells and plants |
| US5260205A (en) * | 1990-11-14 | 1993-11-09 | Philip Morris Incorporated | Method of purifying putrescine N-methyltransferase from tobacco plant extract with a polyamine |
| ATE331797T1 (de) * | 1990-11-29 | 2006-07-15 | Cropdesign Nv | Kontrolle von pflanzenzellvermehrung und - wachstum |
| JPH06505864A (ja) * | 1990-12-21 | 1994-07-07 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼイション | トマト酵素エンドポリガラクツロナーゼＰＧ１β−サブ単位の少なくとも１部をコードするＤＮＡ配列 |
| NZ241311A (en) * | 1991-01-17 | 1995-03-28 | Gen Hospital Corp | Rna sequence having trans-splicing activity, plant strains |
| NZ241310A (en) * | 1991-01-17 | 1995-03-28 | Gen Hospital Corp | Trans-splicing ribozymes |
| GB9109063D0 (en) * | 1991-04-26 | 1991-06-12 | Ici Plc | Modification of lignin synthesis in plants |
| GB9112645D0 (en) * | 1991-06-12 | 1991-07-31 | Cambridge Advanced Tech | Modification of starch production |
| WO1993007266A1 (en) * | 1991-10-07 | 1993-04-15 | Idaho Research Foundation, Inc. | Genetic construct for selection of homologous recombinants on a single selective medium |
| WO1993018643A1 (en) * | 1992-03-24 | 1993-09-30 | Rice Breeding Research Laboratories | Process for reducing seed storage proteins and process for transforming plants |
| JP2898499B2 (ja) * | 1992-03-26 | 1999-06-02 | 寳酒造株式会社 | エンド型キシログルカン転移酵素遺伝子 |
| US5516694A (en) * | 1992-03-26 | 1996-05-14 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Endo-xyloglucan transferase |
| CA2120258A1 (en) * | 1992-07-30 | 1994-02-17 | Marc Zabeau | Dna constructs, cells and plants derived therefrom |
| WO1994005795A1 (en) * | 1992-08-27 | 1994-03-17 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Dna sequences encoding peach polygalacturonase |
| EP0666922A1 (en) * | 1992-11-02 | 1995-08-16 | Mogen International N.V. | Plants with reduced susceptibility to plant-parasitic nematodes |
| GB9405768D0 (en) * | 1994-03-23 | 1994-05-11 | Univ Leicester | Viral replicon |
| US6013859A (en) * | 1994-07-14 | 2000-01-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Molecular methods of hybrid seed production |
| US6010904A (en) * | 1995-06-07 | 2000-01-04 | The General Hospital Corporation | Cell ablation using trans-splicing ribozymes |
| US6448474B1 (en) | 1995-06-07 | 2002-09-10 | University Of Hawaii | Purified proteins, recombinant DNA sequences and processes for controlling the ripening of coffee plants |
| GB9514435D0 (en) * | 1995-07-14 | 1995-09-13 | Danisco | Inhibition of gene expression |
| GB9525353D0 (en) | 1995-12-12 | 1996-02-14 | Nat Starch Chem Invest | Potato soluble starch synthase |
| US6075184A (en) * | 1996-03-26 | 2000-06-13 | University Of Hawaii | Purified proteins, recombinant DNA sequences and processes for producing caffeine free beverages |
| CA2280230A1 (en) | 1997-02-21 | 1998-08-27 | Danisco A/S | Antisense intron inhibition of starch branching enzyme expression |
| WO1998042848A1 (en) * | 1997-03-24 | 1998-10-01 | University Of Hawaii | Purified proteins, recombinant dna sequences and processes for producing caffeine free beverages |
| US6586661B1 (en) | 1997-06-12 | 2003-07-01 | North Carolina State University | Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid |
| AUPP249298A0 (en) | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
| ATE526406T1 (de) | 1998-03-20 | 2011-10-15 | Commw Scient Ind Res Org | Kontrolle der genexpression |
| US20040214330A1 (en) | 1999-04-07 | 2004-10-28 | Waterhouse Peter Michael | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
| US8598332B1 (en) | 1998-04-08 | 2013-12-03 | Bayer Cropscience N.V. | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
| CN1202246C (zh) * | 1998-04-08 | 2005-05-18 | 联邦科学和工业研究组织 | 获得修饰表型的方法和措施 |
| US7019195B1 (en) | 1998-05-26 | 2006-03-28 | Syngenta Participations Ag | Method for conferring resistance or tolerance aganist furovirus, potyvirus, tospovirus, and cucomovirus to plant cells |
| AR020078A1 (es) | 1998-05-26 | 2002-04-10 | Syngenta Participations Ag | Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta |
| GB9827152D0 (en) | 1998-07-03 | 1999-02-03 | Devgen Nv | Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition |
| DE19836098A1 (de) * | 1998-07-31 | 2000-02-03 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke |
| US7148400B1 (en) | 1999-04-20 | 2006-12-12 | Bayer Bioscience N.V. | Methods and means for delivering inhibitory RNA to plants and applications thereof |
| US6423885B1 (en) | 1999-08-13 | 2002-07-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) | Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells |
| JP2004507250A (ja) | 2000-08-30 | 2004-03-11 | ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ | タンパク質含量を変化させる分子デコイを含有するトランスジェニック植物 |
| ATE539608T1 (de) | 2000-11-09 | 2012-01-15 | Commw Scient Ind Res Org | Gerste mit reduzierter ssii-aktivität und stärkehaltige produkte mit reduziertem amylopectingehalt |
| SG132542A1 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-28 | Vector Tobacco Ltd | Modifying nicotine and nitrosamine levels in tobacco |
| US7576262B2 (en) | 2002-03-14 | 2009-08-18 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization | Modified gene-silencing RNA and uses thereof |
| DE10212892A1 (de) | 2002-03-20 | 2003-10-09 | Basf Plant Science Gmbh | Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression |
| ATE517994T1 (de) | 2003-06-30 | 2011-08-15 | Commw Scient Ind Res Org | Weizen mit veränderter verzweigungsenzymaktivität sowie daraus erhaltene stärke und stärkehaltige produkte |
| JP5638736B2 (ja) | 2004-12-30 | 2014-12-10 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション | 腸の健康を改善する方法および手段 |
| AU2007205935B2 (en) | 2006-01-17 | 2013-07-11 | Synthon Biopharmaceuticals B.V. | Compositions and methods for humanization and optimization of N-glycans in plants |
| WO2007141790A2 (en) | 2006-06-07 | 2007-12-13 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Plant expression constructs and methods of utilizing same |
| EP2554674B1 (en) | 2007-12-21 | 2014-11-05 | Keygene N.V. | Trichome specific promoters |
| EP2100962A1 (en) | 2008-03-12 | 2009-09-16 | Biogemma | Plants having improved resistance to pathogens |
| BRPI1010843A2 (pt) | 2009-06-08 | 2015-09-08 | Nunhems Bv | plantas tolerantes à seca |
| NL2004624C2 (en) | 2010-04-28 | 2011-11-01 | Stichting Dienst Landbouwkundi | A new glycosyltransferase protein and its role in the metabolism of phenylpropanoid volatiles in tomato. |
| MX344585B (es) | 2010-05-28 | 2016-12-20 | Nunhems Bv | Platas con un tamaño de fruto incrementado. |
| NL2014107B1 (en) | 2015-01-09 | 2016-09-29 | Limgroup B V | New methods and products for breeding of asparagus. |
| JP6978152B2 (ja) | 2015-09-04 | 2021-12-08 | キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ | 複相胞子生殖遺伝子 |
| US11066681B2 (en) | 2016-08-26 | 2021-07-20 | Lesaffre Et Compagnie | Production of itaconic acid |
| EP3533878A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-04 | Dutch DNA Biotech B.V. | Process for producing citramalic acid employing aspergillus |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4771002A (en) * | 1984-02-24 | 1988-09-13 | Lubrizol Genetics, Inc. | Transcription in plants and bacteria |
| DE3650756T2 (de) * | 1985-03-21 | 2001-10-04 | Cornell Res Foundation Inc | Vom parasit abgeleiteter widerstand |
| US6617496B1 (en) * | 1985-10-16 | 2003-09-09 | Monsanto Company | Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs |
| US6608241B1 (en) * | 1985-10-29 | 2003-08-19 | Monsanto Technology Llc | Protection of plants against viral infection |
| EP0240332B1 (en) * | 1986-04-02 | 1995-07-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Virus resistant plants having antisense RNA |
| ATE123528T1 (de) * | 1986-07-25 | 1995-06-15 | Univ Louisiana State | Verfahren zum verleihen bei pflanzen eines widerstands gegen krankheiten und pest sowie neue gene in pflanzen die hierfür kodieren. |
| WO1988001645A1 (en) * | 1986-08-26 | 1988-03-10 | Macquarie University | Transformation of an organism using antisense rna or promoter occlusion technique |
| AU7918387A (en) * | 1986-08-26 | 1988-03-24 | Macquarie University | Transformation of an organism using antisense rna or promoter occlusion technique |
| GB8626879D0 (en) * | 1986-11-11 | 1986-12-10 | Ici Plc | Dna |
-
1987
- 1987-03-03 IL IL81737A patent/IL81737A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-03-03 NZ NZ219472A patent/NZ219472A/xx unknown
- 1987-03-18 CN CN87102348A patent/CN87102348A/zh active Pending
- 1987-03-19 DE DE3752338T patent/DE3752338T2/de not_active Revoked
- 1987-03-19 DE DE3750755T patent/DE3750755T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-19 ES ES91109006T patent/ES2165348T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-19 AT AT91109006T patent/ATE207125T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-03-19 EP EP91109006A patent/EP0458367B1/en not_active Revoked
- 1987-03-19 EP EP87302367A patent/EP0240208B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-19 ES ES87302367T patent/ES2066759T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-19 AT AT87302367T patent/ATE114168T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-03-25 AU AU70597/87A patent/AU618234B2/en not_active Withdrawn - After Issue
- 1987-03-27 CA CA000617172A patent/CA1341601C/en active Active
- 1987-03-27 JP JP62071918A patent/JP2702921B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-27 CA CA000533209A patent/CA1341579C/en active Active
- 1987-03-27 AR AR87307141A patent/AR241938A1/es active
-
1992
- 1992-03-19 AU AU13017/92A patent/AU1301792A/en not_active Abandoned
-
1993
- 1993-08-06 AU AU44470/93A patent/AU4447093A/en not_active Abandoned
-
1995
- 1995-02-16 GR GR950400303T patent/GR3015085T3/el unknown
-
1997
- 1997-05-13 JP JP9122043A patent/JPH1052283A/ja active Pending
-
1999
- 1999-06-23 JP JP17737299A patent/JP3670889B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004512020A (ja) * | 2000-06-23 | 2004-04-22 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 組換え構築物ならびにこれを遺伝子発現を減少させる際に用いる方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3670889B2 (ja) | 2005-07-13 |
| ATE207125T1 (de) | 2001-11-15 |
| ES2066759T3 (es) | 1995-03-16 |
| AR241938A1 (es) | 1993-01-29 |
| JP2702921B2 (ja) | 1998-01-26 |
| ES2165348T3 (es) | 2002-03-16 |
| ATE114168T1 (de) | 1994-12-15 |
| EP0240208A2 (en) | 1987-10-07 |
| AU618234B2 (en) | 1991-12-19 |
| EP0240208A3 (en) | 1989-05-03 |
| AU7059787A (en) | 1987-10-01 |
| EP0458367B1 (en) | 2001-10-17 |
| CA1341601C (en) | 2010-03-09 |
| NZ219472A (en) | 1990-08-28 |
| DE3750755D1 (de) | 1994-12-22 |
| EP0240208B1 (en) | 1994-11-17 |
| AU1301792A (en) | 1992-09-03 |
| JPH1052283A (ja) | 1998-02-24 |
| DE3750755T2 (de) | 1995-05-18 |
| CN87102348A (zh) | 1987-12-09 |
| AU4447093A (en) | 1993-12-09 |
| GR3015085T3 (en) | 1995-05-31 |
| IL81737A0 (en) | 1987-10-20 |
| CA1341579C (en) | 2008-07-29 |
| JPS62296880A (ja) | 1987-12-24 |
| DE3752338D1 (de) | 2001-11-22 |
| EP0458367A1 (en) | 1991-11-27 |
| IL81737A (en) | 1992-11-15 |
| DE3752338T2 (de) | 2002-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2000023685A (ja) | 植物細胞における遺伝子の発現の調節方法 | |
| US5107065A (en) | Anti-sense regulation of gene expression in plant cells | |
| US5453566A (en) | Antisense regulation of gene expression in plant/cells | |
| US5750385A (en) | Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes | |
| US4943674A (en) | Fruit specific transcriptional factors | |
| EP0316441B1 (en) | Fruit-specific transcriptional factors | |
| US6080914A (en) | Strawberry promoters and genes | |
| JP2580499B2 (ja) | ハロアリ―ルニトリル特異性細菌ニトリラ―ゼおよびその製法 | |
| Lacombe et al. | Characterization of cis‐elements required for vascular expression of the Cinnamoyl CoA Reductase gene and for protein–DNA complex formation | |
| CA2006454C (en) | Potatoe tuber specific transcriptional regulation | |
| JP3288395B2 (ja) | プラスミド、トランスジェニック植物の製法、トランスジェニック植物、及び特異ｄｎａ配列を含有する植物細胞もしくは植物 | |
| JPH04506155A (ja) | 初期種子形成において優先的に発現される新規配列およびそれに関連する方法 | |
| EP0812917A1 (en) | Cold-inducible promoter sequences | |
| JPH10507913A (ja) | ジャガイモ由来のプロモーター配列 | |
| JPH07500970A (ja) | 植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の生産方法 | |
| WO1991001373A1 (en) | Fruit-specific transcriptional factors | |
| DE4447387A1 (de) | Debranching-Enzyme aus Pflanzen und DNA-Sequenzen kodierend diese Enzyme | |
| JP2001520522A (ja) | トランスジェニック植物におけるフルクトース１，６ビスリン酸アルドラーゼの発現 | |
| US5177307A (en) | Compositions and methods for modulation of endogenous cytokinin levels | |
| EP0409628B1 (en) | Compositions and methods for modulation of endogenous cytokinin levels | |
| US6281410B1 (en) | Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes | |
| JPH044877A (ja) | エンドヌクレアーゼおよびアンチセンス活性を有するｒｎａ、その製造およびその使用 | |
| JP5833827B2 (ja) | 植物の油脂生産性を増大させる遺伝子及びその利用方法 | |
| JPH05506358A (ja) | 植物組織のエチレンレベルを変更する方法及び組成物 | |
| WO2000018930A1 (en) | Plant promoter |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20010605 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040908 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20040908 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20040908 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20040913 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040908 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20040908 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041208 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050310 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050415 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |