JPH03210180A - 自己プロセシング活性を有する多機能性ｒｎａ、その製造およびその使用 - Google Patents

自己プロセシング活性を有する多機能性ｒｎａ、その製造およびその使用

Info

Publication number
JPH03210180A
JPH03210180A JP2269305A JP26930590A JPH03210180A JP H03210180 A JPH03210180 A JP H03210180A JP 2269305 A JP2269305 A JP 2269305A JP 26930590 A JP26930590 A JP 26930590A JP H03210180 A JPH03210180 A JP H03210180A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rna
ribozyme
spacer
antisense
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2269305A
Other languages
English (en)
Inventor
Hubert Muellner
ヒューベルト、ミュルナー
Eugen Dr Uhlmann
オイゲン、ウールマン
Peter Eckes
ペーター、エッケス
Rudolf Schneider
ルドルフ、シュナイダー
Bernadus Uijtewaal
ベルナドゥス、ウィジテワール
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst AG filed Critical Hoechst AG
Publication of JPH03210180A publication Critical patent/JPH03210180A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 適当な条件下で、ＲＮＡ分子は、タンパク質の関与なし
で他のＲＮＡ分子上の反応を触媒することまたは自触媒
作用的にそれら自身の分子からフラグメントを切断する
ことができる。したがって、４１３個のヌクレオチドを
有するイントロンは、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔ
ｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　ｌａ）の２
３Ｓ　　ｒＲＮＡの３′末端から自触媒作用的に除去さ
れ、環型へ変換される。これは、グアノシン補因子が関
与する多くのフォスフオニステル転移反応によって起き
る（Ｃｅｃｈ、　Ｔ。
Ｒ，：　Ｎａｔａｕｒｅ　３ｆｌ、５７８−５８３．１
９８３）。ＲＮＡ基質または選択される反応条件によっ
て、イントロンは特異的リボヌクレアーゼ、ターミナル
トランスフェラーゼ、フォスフオドランスフェラーゼま
たは酸フォスファターゼとして機能することができる。
これに関連して、ＲＮＡ分子はそれ自身を変化させるこ
となくいくつかの反応を行うことができ、この点で、酵
素のよっに挙動する。これらの性質を有するＲＮＡ分子
のために、リボザイム（ｒ　ｉ　ｂｏｚｙｍｅ）という
用語がしたがって導入された。
タンパク質の関与しない同様の反応は、いくつかのウィ
ロイドＲＮＡおよびサテライトＲＮＡでも可能である。
したがって、自己プロセシング（ｓｅｌｆ−ｐｒｏｃｅ
ｓｓｉｎｇ）は、アボカド日シミ（Ｓｕｎ−ｂｌｏｔｃ
ｈ）ウィロイド（ＡＳ　Ｂ　Ｖ）　　（ｌｌｕｔｃｈｉ
ｎｓ、　Ｃ。
Ｊ、ら：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｋ
ｌ、３６２７−３６４０゜１９８６）、タバコ輪斑（Ｒ
ｉｎｇｓｐｏｔ）ウィルスからのサテライトＲＮＡ　（
ｓ　Ｔ　ｏ　ｂ　ＲＶ）　（Ｐｒｏｄｙ、　Ｇ、Ａ。
ら：　５ｃｉｅｎｃｅ　ｍ、１５７７−１５８０．１９
８６）およびルゼルネー時線条ウィルス（Ｌｕｚｅｒｎ
ｅ　ＴｒａｎｓｉｅｎｔＳｔｒｅａｋ　Ｖｉｒｕｓ）か
らのサテライトＲＮＡ（ｓ　Ｌ　Ｔ　Ｓ　Ｖ　）　（Ｆ
ｏｒｓｔｅｒ、Ａ、Ｃ，ら：　Ｃｅ１ｌ　’Ｕ５１．２
１１−２２０．１９８７）の複製のための必須の反応の
よってある。鋳型として特別に長いＲＮＡの合成を導く
環型は、これらＲＮＡの複製中におそらく形成される。
これら転写物は、自己触媒のエンドヌクレアーゼ的（ｅ
ｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）反応によって適当な長
さのゲノムに切断される。
適応のためにこれらによって採用されると思われるＲＮ
Ａの構造はハンマー頭（ｈａｍｍｅｒ−ｈｅａｄ）（Ｆ
ｏｒｓｔｅｒ、　　Ａ、Ｃ，ら　コ　Ｃｅ１ｌ　　１４
５４　、２１１−２２０．　１９８７、Ｈａｓｅｌｏｆ
ｆ、Ｊ、ら：　Ｎａｔｕｒｅ　１３Ｊ、５８５−５９１
．１９８８）と記述されている。
プロセシングを可能にするために、これらＲＮＡ酵素の
切断部位は特異的で、ある構造的前提条件を有していな
ければならない。
アンチセンスＲＮＡに連結されたりボザイムＲＮＡをコ
ードするＤＮＡを含むベクターを用いて所望の任意の生
物の宿主細胞を形質転換することが可能で、それによっ
て該ＤＮＡを発現することができることが、いま見出さ
れた。
アンチセンスＲＮＡが、多くの原核および真核細胞、と
りわけ植物細胞、において遺伝子発現を阻害することが
知られている（Ｇｒｅｅｎ、　Ｐ、Ｊ、ら：Ａｎｎ、　
Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｃ＋＋＋−５５，５６９，１９８
６）。阻害の機序のほとんどはまだ明かではない。真核
生物系ではｍ　ＲＮ　Ａの細胞質への輸送を妨げる二本
鎖ＲＮＡが形成されることが考えられる。
Ｒｅｚａｉａｎら（Ｒｅｚａｉａｎ、　Ｍ、　　ら：　
Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ。
■、４６３．１９８８）は、例えば、アンチセンスＲＮ
Ａのキュウリモザイクウィルス（ＣＭＶ）に対する抗ウ
ィルス剤としての使用の可能性を調べた。しかし、著者
らは、アンチセンスＲＮＡの抗ウイルス効果は不十分で
あったことを観察した。
［発明の概要］ 適当なりボザイムＲＮＡの各々のアンチセンスＲＮＡへ
のスペイサ−を介しての連結は、しかし、いま・例えば
−、Ｒｅｚａｉａｎによって示し得たよりもより効果的
なウィルス抵抗性を生じる。ＲＮＡ分子のそのような連
結は、したがって、植物において抗ウィルス剤としての
活性の点でだけよりむしろ基質に向けられた形質転換さ
れた生物における高められた活性を一般にもたらす。
したがって、本発明は次のことに間する。
１、　アンチセンスＲＮＡ配列にスペイサ−を介して連
結させたりボザイムＲＮＡ配列をコードする遺伝子。
２、　　１で記載した遺伝子または対応するＲＮＡ配列
を含む生物。
３．　基質に向けられた生物における薬剤としての、ア
ンチセンスＲＮＡとスペイサ−を介して連結させたりボ
ザイムＲＮＡの使用。
［発明の詳細な説明］ 本発明は、特にその好ましい態様において、以下に詳細
に記述される。本発明はまた特許請求の範囲に定義され
る通りである。
本発明による多機能性ＲＮＡは、本質的に、各々の場合
にリボザイムがＲＮＡ分子の３′および５′末端にある
ように構成される。アンチセンスＲＮＡ単位は、いわゆ
るスペイサ−を介して間に挿入され、いくつかのＲＮＡ
単位が存在する場合は、ＲＮＡ単位は同様にお互いにス
ペイサ−を介して連結され得る。多機能性ＲＮＡ分子の
好ましい態様はパターンとして次のように示すことがで
きる。
５′−リボザイムＲＮＡ−スペイサー−（アンチセンス
ＲＮＡ）ｎ−スベイサーーリボザイムＲＮＡ−３’ここ
で、ｎは１〜１０、好ましくは１〜５、特に好ましくは
１〜３、の数である。全体としてまたは少なくとも８個
、好ましくは１０〜２０個のヌクレオチドからなる一部
分においてリボザイムの配列に相補的である２０〜２５
個のヌクレオチドの鎖を、スペイサ−として挿入する。
ＲＮＡのリボザイム配列は、このようにしてスペイサ−
と結合して、後者を認識配列の直後で切断することがで
きる。数ｎが１よりも大きい場合には、リボザイム切断
部位を有するこの種のスペイサ−は、同様に各々のアン
チセンスＲＮＡ分子間に挿入される。ＧＵＣ切断部位は
、好ましくはりボザイム切断部位として組み込まれる。
アンチセンスＲＮＡは、基質、例えば、°選択可能マー
カー遺伝子（抗生物質耐性）をコードするＲＮＡまたは
所望の任意の細胞機能、例えばジヒドロフオレートレダ
クターゼ、チミジンキナーゼ、成熟酵素ポリガラクツロ
ナーゼ、ペクチンエステラーゼ等、分化および発達に関
与するタンパク質またはホルモン受容体など、をコード
するＲＮＡのような基質に対して向けることができる。
特に、植物に有害な型のウィルスを、本発明によるリボ
ザイムーアンチセンス系を用いて有利に撃退することが
できる。この目的のために、例えば、次に記述するよう
な方法が実施される。他の基質に向けられたりボザイム
アンチセンスＲＮ　Ａもまた同様の方法で合成される。
多機能性ＲＮＡをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチド
を、合成的に調製することができる。アンチセンスＲＮ
Ａのためのオリゴヌクレオチドを、ウィルスＤＮＡおよ
びＲＮＡ配列を基にして合成することができる。このた
めに、原則的にはいかなる植物有害ウィルスをも用いる
ことができる。
好ましい型のウィルスとしては、病原性ＲＮＡウィルス
、特に、キュウリモザイクウィルス、アルファルファモ
ザイクウィルス、ブロウム（Ｂｒｏｍｅ）モザイクウィ
ルス、タバコモザイクウィルス、ポテトウィルスＸまた
はＹ、トマト輪斑ウィルス、トマトアスペルミ（Ａｓｐ
ｅｒ＋ａｙ）ウィルスまたはタバコラドル（Ｒａｔｔｌ
ｅ）ウィルスがあげられる。
リボザイムＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドの合
成の鋳型としては、少なくとも１０個の連続したヌクレ
オチド、特に１４〜２０個のヌクレオチド、有利には各
々のウィルスのＲＮＡ配列の中間部からのものが好まし
い。このＲＮＡ配列は、ＲＮＡウィルスのゲノムおよび
ＤＮＡウィルスのＤＮＡ配列に由来するＲＮＡ配列のい
ずれでもあり得る。Ｒｅｚａｉａｎら（Ｒｅｚａｉａｎ
、　Ｍ、ら：　Ｅｕｒ−Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｌｉ
Ｑ、　３３１−３３９．１９８５、Ｅｕｒ、　Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ＪｊＱ、２７？−２８４，１９８４
）およびＧｏｕｌｄら（Ｇｏｕｌｄ、　１．ら：　Ｅｕ
ｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｕｆｉ、２１７−２２
６．１９８２　）によって公表されている配列に対応す
る、キュウリモザイクウィルスの三つのＲＮＡ配列ＲＮ
ＡＩ　ＲＮＡ２およびＲＮＡ３またはその一部を基本と
して用いることは特に有利である。
リボザイムをコードするオリゴヌクレオチドは、各々少
なくとも５ヌクレオチド、好ましくは７〜１０個のヌク
レオチドからなる最初のおよび最終の配列が、阻害され
るべきウィルスのＲＮＡと相補的になるように合成され
る。閏に位置する配列の一部はりボザイムの機能性を予
め決定した特定のヌクレオチドからなり、また一部は可
変的ヌクレオチドからなる。基質ＲＮＡとハイブリダイ
ズしたりボザイムは、次のように図式化することができ
る。
基質ＲＮＡ ここで、 Ｎは、基質ＲＮＡのヌクレオチド、Ａ、Ｃ，ＧまたはＵ
であり、 Ｋは、リボザイム中のＮに相補的なヌクレオチドであり
、 ■は、リボザイム中の可変的なヌクレオチド、Ａ、Ｃ，
ＧまたはＵであり、 ｖＬは、リボザイムのループ中の可変的なヌクレオチド
、Ａ、Ｃ，ＧまたはＵである。
■Ｌヌクレオチドの数は、０〜５５０でよい。
アンチセンスＲＮＡの調製を対応的に行うが、オリゴヌ
クレオチドはそれらが対応するアンチセンス位置方向に
ＲＮＡをコードするように合成する。
しかし、リボザイムＲＮＡのためのオリゴヌクレオチド
合成の基礎は、いかなる所望の基質でもよい。原則的に
、スペイサ−がリボザイムの基質であり、適当なりボザ
イム切断部位を提供するようにだけは留意しなければな
らない。リボザイムとアンチセンス分子の連結のための
スペイサ−を、対応的に発現された全部のＲＮＡまたは
その部分が、リボザイムに相補的であるように、相補的
なヌクレオチドが有利にリボザイムのためのＧＵＣ切断
部位の近くに集まるように、構築する。
構築されたオリゴヌクレオチドは、適当なリンカ−とと
もに提供される。このタイプのリンカ−は、例えば、Ｅ
ｃ　ｏＲＩ、Ｓａ　ｌ　Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩ［
Ｉ、Ｅｃ　ｏＲＶ、Ｓｍａ　１．Ｘｈｏ　Ｉ、Ｋｐｎ　
Ｉ、好ましくはＸｂａＩまたはＰｓｔｌ、の切断部位を
有する。
集められたオリゴヌクレオチドを、ベクターｐＵｃ１９
、ｐＵｃｌＢまたはｐ　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ、　Ｈｅｉｄｅｌｈｅｒｇ、　Ｐｒｏｄ
ｕｃｔ　１ｎｆｏｒｖａｔｉｏｎ）を用いてクローニン
グしてから、配列決定をする。
確認されたオリゴヌクレオチドを、植物プロモーターを
有する介在ベクターにクローニングする。
このタイプのベクターの例としては、プラスミドｐ　Ｐ
　ＣＶ　７０１　（Ｖｅｌｔｅｎ、　Ｊ、ら：　ＥＭＢ
ＯＪ、　３．２７２３−２７３０．　１９８４）　　、
　　ｐＮＣＮ（Ｐｒｏ＋ｇｎ、　門、　ら：ＰＮＡＳ　
ｆｉ２．．５８２４−５８２６．１９８５）またはｐＮ
Ｏｓ（ＡｎＧ、ら：　ＥＭＢＯ、Ｌ　４．２７？−２７
６，１９８５）などがあげられる、３５Ｓプロモーター
を有するベクター　ｐ　Ｄ　Ｈ５１（Ｐｉｅｔｒｚａｋ
、　Ｍ、ら：　ＮＡＲ１１，５８５７，１９８６）が好
ましく用いられる。
続いての、例えば大腸菌ＭＣ１０６１，ＤＨＩ。
ＤＫＩ、０Ｍ４ＢまたはＸＬ−１などの、大腸菌の形質
転換の後、陽性のクローンを、プラスミドミニ調製およ
び適当な制限酵素による切断などの既知の方法（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら：　Ｌａｂ、　Ｍａｎｕａｌ）によって同
定する。
これら陽性クローンを、次いで、バイナリ−植物ベクタ
ーにサブクローニングする。ｐＧｖ３８５０　（Ｚａｍ
ｂｒｙｓｋｙ、　Ｐ、ら：　ＥＭＢＯＪ、　２．２１４
３−２１５０、１９８３）またはｐ　ＯＣＡ　１８　（
Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ、Ｎ、：　ＮＡＲＬｆｉ、１０７６
５−１０７８２．１９８８）を植物ベクターとして用い
ることができる。ｐＯｃＡ１８が好ましく用いられる。
Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａにおいて上記のように構築された付加
したＤＮＡフラグメントを有している植物プロモーター
を含む得られたバイナリ−植物ベクターを、植物の形質
転換に用いる。これはエレクトロポレーションまたはマ
イクロインジェクション等の技術を用いて行うことがで
きる。
好ましくは、プロトプラストの共培養（ＣＯ−ｃｕｌｔ
ｉｖａｔｉｏｎ）またはアゲロバクチリアを用いての葉
部細片の形質転換を用いる。この目的のために、植物ベ
クター構築物を、精１１ＤＮＡによるまたは大腸菌Ｓ　
Ｍ　１０　（Ｓｉｍｏｎ　Ｒ，ら：　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ　Ｌ、７８４−７９１．１９８３）などのヘ
ルパー株を介しての形質転換によって、Ｔｉプラスミド
を有するＡ２８２のようなアグロバクテリウム・ツメフ
ァシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｗ　ｔｕ＊ｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）中にトリペアレント交配（ｔｒｉｐａ
ｒｅｎｔａｌ　ｇＩａｔｉｎｇ）を介して転移させる。
直接的形質転換およびトリペアレント交配を、　ｒＰＩ
ａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎ
ｕａｌＪ（Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ、　Ｄａｒｄｒｅｃｈｔ。
１９８８）に記載のようにして行った。
基本的に、本発明によって構築されるＤＮＡを有するバ
イナリ−植物ベクターを用いて全ての植物を形質転換さ
せることが可能である。双子葉植物、特に有用植物、例
えば澱粉、炭水化物、タンパク質または脂質をそれらの
器官に有用量に産生または貯蔵するもの、または果実お
よび野菜を産生ずるもの、または香辛料、繊維および実
用的に有用な産生物または薬物、染料または蝋を提供す
るもの、等が家畜用植物と同様に好ましい。
トマト、イチゴ、アボカド、および、例えばパパイヤ、
マンゴ−などの熱帯産果実、さらにナシ、リンゴ、ネク
タリン、アンスまたはモモなどを例にあげることができ
よう。さらに、全てのタイプの穀物、西洋アブラナ、イ
モ類、大豆、綿花、トウモロコシ、甜菜またはヒマワリ
などを、形質転換さるべき植物の例としてあげることが
できよう。
形質転換された細胞を、選択培地を用いて選択して、カ
ルスにまで増殖させて、適当な培地（Ｓｈａｉｎら：　
Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　Ｚ２．７７
０−７７０．１９８６、Ｍａｓｓｏｎ、　Ｊ、ら：　Ｐ
ｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　５１．１６７−１７６．１
９８７、Ｚｈａｎら：　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ
ｌ、　ｕ、５５１−５５９．１９８８、ＭｃＧｒａｎａ
ｈａｓら：　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｆｉ、８
００−８０４．１９８８、Ｎｏｖｒａｔｅら：　Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７．１５４−１５９．１９８９
）上で植物体に再生させる。
得られる植物体は、構築されたオリゴヌクレオチドを用
いて発現されたＲＮＡがＧＵＣ切断部位上で細胞中のり
ボザイム活性によって切断される限り、形質転換によフ
て変えられ、アンチセンスＲＮＡはこの理由で放出され
、リボザイムＲＮＡがアンチセンスＲＮＡとともにウィ
ルスＤＮＡまたはＲＮＡに対して活性になることが可能
である。
以下の諸例によって、本発明はさらに説明される。
例 特に記載がなければ、百分率は重量パーセントである。
１、　多機能性ＲＮＡの発現のためのＤＮＡの合成 多機能性ＲＮＡの発現のための表１のＤＮＡ配列の合成
を、以下の記述のようにして行った。
ａ）リボザイムＩ［１−４６］：　　ＣＭＶと相同であ
る領域は、公表されたＲＮＡＩ配列（Ｒｅｚａｉａｎ　
Ｍ、ら：　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、　１５
１１．３３１−３３９．１９８５）の位置３２４８から
３２６４までに基づく。リボザイムのための定常領域は
表１に見ることができ、Ｈａｓｅｌｏｆｆら（Ｈａｓｅ
ｌｏｆｆ、　Ｊ、ら：Ｎａｔｕｒｅ　３ｉ４．５８５−
５９１．１９８８）による公表からのものであった。
ｂ）スペイサ−［４７−７０１：　　公表されたＲＮＡ
２配列（Ｒｅｚａｉａｎ、　Ｍ−ら：　Ｅｕｒ、　Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１３．２７？−２８４，１９８４
）の位置２８５３から２８７０までに基づく。
Ｃ）アンチセンス１［７１−２４３］：　　公表された
ＲＮＡ４配列（にｏｕｌｄ　１．ら：　Ｅｕｒ、　Ｊ−
Ｂｉｏｃｈｅｗ＋、　Ｌｕ、　２１７−２２６．１９８
２）の位置２０５４から２１９３までに基づく。
ｄ）スペイサ−［２１９−２４３１：　　ｂ）に記載の
スペイサ−［４７−７０１と同様。
ｅ）アンチセンス２［２４４−３１３１：　　公表され
たＲＮＡ２配列（上記を参照されたい）の位置７１から
１３４までに基づく。
ｆ）スペイサ−［３１４−３３８］：　　ｂ）に記載の
スペイサ−［４７−７０１と同様。
８）アンチセンス３［３３９−４０５コニ　公表された
ＲＮＡ４配列（上記を参照されたい）の位置１２００か
ら１２６１までに基づく。
ｈ）スペイサ−［４０６−４２９］：　　公表されたＲ
ＮＡＩ配列（上記を参照されたい）の位置３２４Ｂ−３
２６４までに基づく。
ｉ）リボザイム［４３０−４８０］：　　ＣＭＶに相同
の領域はＲＮＡ２配列（上記を参照されたい）の位置２
８５３から２８７０に基づくものであり、表１の定常領
域はａ）に記載の公表物を参照されたい。
カギ括弧は、多機能性ＲＮＡの発現のための付加したＤ
ＮＡ配列の位置に対応する（表１）。
ホスフォルアミド法を用いて、表１にあげたオリゴヌク
レオチドを合成機で合成した。断片は配列から認めるこ
とができる。第一のものは最初のＸｍａＩリンカ−から
ＫｐｎＩ部位まで、第二のものはＫｐｎＩからＢａｍＨ
Ｉまで、第三のものはＢａｍＨＩからＳａｃ　Ｉまでお
よび第四のものは５ａｃｌから最後のＳｍａｌ連結部ま
で、広がっている。各々の場合に鎖とそれに相補的な鎖
を合成し、これらをクローニングの前に等モル量で合わ
せた。
２　、　　ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔｓ　Ｋ＋におけるク
ローニングおよび配列決定 プラスミドｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔｓ　Ｋ　＋　（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ。
Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を、特定の
酵素（ＸｍａＩ／Ｋｐｎ　Ｌ　Ｋｐｎ　Ｉ／ＢａｍＨＩ
、ＢａｍＨ１／５ａｃｌ、５ａｃＩ／Ｓｍａｌ）で開環
し、仔ウシ腸管ホスファターゼ（ＣＩ　Ｐ）で処理した
後に、５倍過剰の二本鎖燐酸化オリゴヌクレオチドと連
結した。イソプロピルチオガラクトシド（Ｉ　Ｐ　Ｔ　
Ｇ、　Ｂｏｅｈｒｉｎ３ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によ
る誘導の後、陽性クローンを、５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−Ｄ〜ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ
）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含
むＬＢプレート上でＸＬ−ブルー株（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）中の白色コロニーとして同定することが可能であ
った。
各々の場合、５個のコロニーを単離して、ジデオキシ終
結法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇに
ｉｔ）によって配列決定した。適当な酵素による切断の
後、オリゴヌクレオチドを、高純度の（低融解）アガロ
ースゲル（Ｇｉｂｃｏ、　Ｂｒｕｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ
、西ドイツ）から期待される配列を有するコロニーから
単離した。
単離したオリゴヌクレオチドを連結して、非連結のもの
から高純度（低融解）アガロースゲル上で分離した。期
待される０、５ｋｂのバンドを切り出して、突き出てい
るＸｍａｒ部位を埋填した後にｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ
ｓ　Ｋ＋のＳｍａＩ認識配列中に挿入した。
第１図は、完全な断片が組み込まれたベクターｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔによって形質転換させたＸＬ−１ブルー
細胞からのプラスミド調製物の６個のコロニーを示す、
写真である。ゲルに載せる前にプラスミドをＳｍａＩで
切断した。コロニー１〜５ては、期待された大きさの断
片を検出することができる。
３、　全断片のｐＤＨ５１中へのクローニング多機能性
ＲＮＡの発現のための断片を、ＳｍａＩによる消化によ
ってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌ築物から単離して、Ｓ
ｍａＩで切断したｐＤＨ５１中に組み込んだ。）Ｉｉｎ
ｄＩＩＩによって断片の位置方向を決定することが可能
であった。
プラスミドｐＤＨ５１は、Ｐｉｅｔｒｚａｋら（Ｐｉｅ
ｔｒｚａｋ、　Ｍ−ら：　ＮＡＲ１４，５８５７−５８
６９，１９８６）によって再現できるように記述されて
いる。
第２図は、Ｓｍａ１部位に多機能性ＤＮＡ断片が組み込
まれたｐＤＨ５１による形質転換の後のＭＣｌ０６１！
Ｉ胞のＤＮＡミニ調製物を示す。
ＤＮＡミニ調製物は、Ｈｉｎｄｍで切断したものであっ
た。所望の位置方向を有する組み込み物は、調製物Ｌ　
３．５．８および９に認められる。
４、　　３５５プロモーターを有する全断片のｐＯｃＡ
１８中へのクローニング 多機能性ＲＮＡの発現のための１．２ｋｂの断片を、３
５Ｓブａモーターおよびターミネータ−とともに、クロ
ーニングされた挿入物を含むｐＤＨ５１のＥｃｏＲＩ−
消化によって単離した。単離した断片をＥｃｏＲＩで切
断したｐＯｃＡ１Ｂベクターと連結した。断片と連結し
たベクターを、形質転換によってＭＣ１０６１纏胞に移
した。プラスミドｐＯｃＡ１８は、Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ
ら（Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ、Ｎ。
ら：　ＮＡＲＬｆｉ、１０７６５−１０７８２．１９８
８）によって再現できるように記述されている。
第３図は、ＥｃｏＲＩ断片を連結したｐＯｃＡ１８で形
質転換されたＭＣ１０６１！Ｉ胞からのＤＮＡミニ調製
物を示す。ゲル上に載せる前に、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで
切断した（＋で表示）。加えて、同量の非切断ＤＮＡを
各々の場合に用いたく−で表示）。その結果、この実験
からのコロニー５が所望の大きさのＥｃｏＲＩバンドを
示した。
５、７グロバクテリアの形質転換 ３５Ｓプロモーター／オリゴヌクレオチド挿入物を含む
ベクターｐＯｃＡ１８を、アゲロバクチリアＡ２８２株
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、　西ドイ
ツまたはＡＴＣＣ３７３４９、ＵＳＡ）中に移した。こ
れは、大腸菌５Ｍｌ０株（Ｓｉｍｏｎ、　Ｒ，ら：　Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｌ、７８４−７９１．１
９８３）を用いるトリペアレント交配によって行った。
この目的のために、等量の細菌をともにフィルター上に
一装置いて、フィルターを２ｍｌのｌｏｍＭＭｇｓＯｎ
ですすいで、その等外部分をテトラサイクリンおよびリ
ファンピシンな含むＹＥＢプレート上に置いた（ＹＥＢ
：１％酵母エキス、１％ペプトン、０．５％ＮａＣ１）
。陽性のアゲロバクチリアをハイブリダイゼーションに
よって検出することが可能であった。この目的のために
、コロニーをシーンスクリーンプラス（Ｇｅｎｅ　５ｃ
ｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ）フィルター（ＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、１３０ｓｔｏｎ）に移す。フィル
ターを、ＹＥＢプレート上で２８℃で一晩培養してから
、次の日に変性させて、中和した。次いで、フィルター
を、４　Ｘ　１０５ｃｐｓ／ｎｌの放射性標識した全断
片と６５℃で一晩ハイブリダイズさせた。
フィルターを６５℃で１ｘｓｓｃで１回およびｏ、１ｘ
ＳｓＣ／ＳＤＳで２回それぞれ３０分間洗浄した。
第４図は、洗浄したフィルター上で６時閉露出させたフ
ィルムを示す。コロニー３は陽性である。
後者を、前の実験の結果を確認するために二重に供した
。
６、　　タバコの形質転換 アゲロバクチリアを、テトラサイクリンおよびリファン
ピシンを含むＹＥＢ培地（１％酵母エキス、１％ペプト
ン、０．５％ＮａＣ１）中で増殖させて、２０１の細菌
を遠心分離して、ＹＥＢ培地中で１回洗浄して、２０１
の１０ｗ＋Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４中に懸濁させて、ペト
リ皿に置いた。タバコ、ライスコンシン（Ｎｉｃｏｔｉ
ａｎａ　ｔａｂａｃｕ＋ｗ％Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）３８
を植物材料として用いた。植物体を滅菌条件下で２ＭＳ
培地（Ｍｕｒａｓｈｉ３ｅ、　Ｔ、ら：　Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ。
Ｐｌａｎｔ　１１．４７３−４９７．１９６２）上で２
５℃で１日１６時間光を当てて４週間培養しておいた。
これら植物体からＩＣＩＯ２の葉片を切り出して、滅菌
したエメリーペーパーで傷つけて、細菌培養中に３０秒
問浸漬させた。葉片を、上記の２ＭＳの場合と同様にし
てＭＳ培地上に２５℃で２日閏保持して、次いて液体２
ＭＳ培地を用いて洗浄した。葉片を、次いで、カナマイ
シンを含むＭＳＣＩＯ（１，５％の寒天を含むＭＳ）プ
レート上に置いた。５〜６週間後、再生した植物体をよ
り大きな容器に移植することが可能であって、そこでそ
れらは２〜３週間後に根を形成した。
ＤＮＡを、トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
）タバコ植物体からＣＴＡＢ法によって単離した。
これに間して、ｒＰＩａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ」　（にＩｕｗｅｒ　　Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ。
Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、　１９８８）のプロトコールに厳
密に従った。
１０μｇのＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断して、１％アガロ
ースゲル上で分離して、変性の後、シーンスクリーンプ
ラス膜上に移した。膜を、４Ｘ１０５ｃｐＩＩ／ｍｌの
放射性標識した断片と６５℃で一晩ハイブリダイズさせ
た。全ての場合で、期待される大きさの断片を検出する
ことが可能であった。
第５図は、１０μｇの全ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して
、全断片とハイブリダイズさせたものを示す。
トランスジェニック植物体からの全ＤＮＡ調製物が、期
待されるハイブリダイゼーションを１．２ｋｂＥ　ｃ　
ｏ　ＲＩバンドとして示している。
７・　　トランスジェニックタバコ植物体を用いての多
機能性ＲＮＡの発現 トランスジェニックタバコ植物体の葉片から全ＲＮＡを
単離した。これに間して、ｒＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ＭａｎｕａｌＪ　（にｌｕｗｅ
ｒ　Ａｃａｄｅｓ＋１ｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｄｏ
ｒｄｒｅｃｈｔ、　１９８Ｂ）のプロトコールに従った
。変性の後、ｌＯμｇの全ＲＮＡを１２＋ｎＭトリス（
ｐＨ７，５）１０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液中で２．２
Ｍホルムアルデヒド７１％アガロースゲル上で分画して
、シーンスクリーンプラス膜上に移した。膜を放射性標
識した全断片とハイブリダイズさせた。トランスジェニ
ック植物体は、期待される特異性を有する強いＲＮＡ発
現を示す。
８、　　トランスジェニックタバコ植物体のＣＭＶによ
る感染 感染は、キュウリの葉から得られたＣＭＶのＱ株（Ｒｅ
ｚａｉａｎ、　Ｍ、ら：　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｗ＋、　ＩＭｉ、３３１．１９８５および１４，１．
２７７．１９８４、Ｇｏｕｌｄ、Ｊ、ら：Ｅｕｒ、　Ｊ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｕｆｌ、２１７．１９８２）を
用いて行った。感染性の粒子を、カーボランダムを用い
てタバコ植物体に塗布した。選択した感染条件下で、対
照植物体の８０％が葉脈の光沢、モザイク形成および葉
端の不規則な成長からなる重篤な症状を呈した。ＥＬＩ
ＳＡによって感染の特異性を確認することが可能であっ
た。
トランスジェニック性（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｉｔｙ）
の試験を、予め切断によって増殖させておいた植物体上
で行った。種子が存在した場合には、後代（ρｒｏｇｅ
ｎｙ）についての確認を行った。
多機能性ＲＮＡの発現を示した全ての植物体において感
染確率の著しい低下が実際に認められた。
各々の場合の形質転換の特異性によって、約１０〜５０
％だけのトランスジェニック植物体において、典型的な
感染症状が認められた。
表：有意の症状を呈する感染植物体の百分率（各々の場
合に１０個の植物体を評価した）対照 タバコＷ３８ トランスジーン： （ｔｒａｎｓｇｅｎｅ） −Ｈ３ −Ｈ７ −Ｈ１５ −Ｈ２２ １２日 ２０日 したがって、用いた方法が植物体をウィルス感染から保
護するために適していることが証明された。抵抗性を改
善するために、多機能性ＲＮＡにさらに多くの要素を付
加することを試みることができる。
支　−− ヘ＜８ 哨υ０ へ０υ ０υ （Ｅ−４ ８べ ０ＬＩＯ）（（Ｊ　　　　　Ｈ＜　　　　　Ｌ）υｏｕ
　　ｒＳｏｈ　　　ｕｕ　　　（：）−１−−１：Ｆ）
Ｃ）ＬＩ　　　　Ｅ−４＜　　　　ｏｕ＝８８ へ００ 口Ｏ トベ （Ｅ−４ Ｈ（ ＬＩＬ） （Ｅ−４ ゆＯｏ ｍＦ−＋＜ ＱＬＩ ０゜ ＜８ ０υ Ｏｏ ＜← 口υ ０’１ＬＩＵ トトペ ＮＬＩυ Ｏ Ｏ トペ ０υ （ｊＯ Ｅ−４＜ ゆ＜日 へ＜８ ｎ＜ｈ （Ｅ−４ ０υ ＜８ （ＪＬ） Ｑ（Ｊ トベ 委ｌ ロゴ （）４ ０ ０ （）＋ ０８（ ％ＤＵＯ Ｆｌ（）４ ←（ （ＪＬ） ０ 士 べ８ １ｊ’１（Ｈ ｏ＜８ ぐ００ ０υ υＯ べ← ＜← ０ Ｅ−４＜ ｏ＜ｈ ０Ｕ ぐトベ ０ Ｅ−４＜ Ｏ （ト Ｅ−４＜ （）４ 鎖υ０ Ｎ（Ｊ口 ＮＥ−４＜ 口υ ト（ （ト 四七　粗８８ υ０ （８ υ０ ＯＬ）　　１０口 ８８　唄（ ％Ｄ＜ト Ｈ（− ＮＬ）Ｌｌ （Ｅ−４ ０ ０口 ）−１＜ ＜８ ０υ （）ｌ　　ｒ”−＜Ｅ＠ Ｌ）Ｌｌ　　　ｏ′１＜ｈ （日　へ？（ ００Ｎ（Ｅ−１ （Ｅ−４ぐＯｏ ＣＪＬＩ　　　Ｆｍ（Ｅ−１ ０ Ｌ）Ｑ ０ ０゜ Ｅ−４（ 口υ Ｅ−１，１１：　　ｔ’ｒ＜ｈ Ｅ−４＜　　ＮＬＩＬ） 日＜　ゆ００ Ｅ−４（ω（８ υロ　　ψ（Ｅ−４ ＬＩＣＪ　　　ゆ００ υＯ （ト ０υ
【図面の簡単な説明】
第１図は、例２において、完全な断片が組み込まれたベ
クターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔによって形質転換させた
ＸＬ−１ブルー細胞からのグラスミ５．ド調製物の６個
のコロニーを示す、説明図である・ 第２図は、例３において、ＳｍａＩ部位に多機能性ＤＮ
Ａ断片が組み込まれたｐＤＨ５１による形質転換の後の
ＭＣ１０６１！ｉ１胞のＤＮＡミニ調製物を示す、説明
図である。 第３図は、例４において、ＥｃｏＲＩ断片を連結したｐ
ＯｃＡ１８で形質転換させたＭＣ１０６１細胞からのＤ
ＮＡミニ調製物を示す、説明図である。 第４図は、例５において、放射性標識した全断片とハイ
ブリダイズさせたフィルター上で露出させたフィルムを
示す、説明図である。 第５図は、例６において、全ＤＮＡを ＥｃｏＲＩで消化して全断片とハイブリダイズさせたも
のを示す、説明図である。 図中： λ　ＰＳＴ 対照 Ａ−）１１ −Ｈ３ −Ｈ４ −Ｈ５ ７） ８） ９） ｉｏ） １１） １２） １３） −Ｈ６ −Ｈ７ −Ｈ９ −Ｈｌ０ −Ｈ１２ Ａ−１（１５ −８２２

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、スペイサーによってアンチセンスＲＮＡ配列と連結
    させたリボザイムＲＮＡ配列をコードする遺伝子。 ２、次のパターンを有する、請求項１に記載の遺伝子。 ５’−リボザイムＲＮＡ−スペイサー−アンチセンスＲ
    ＮＡ−（アンチセンスＲＮＡ−スペイサー−アンチセン
    スＲＮＡ）＿ｎ−スペイサー−リボザイムＲＮＡ−３’
    ここで、ｎは０〜１０の数であり、リボザイム切断部位
    を各々に含む２０〜２５個のヌクレオチドからなる鎖が
    スペイサーとして挿入されている。 ３、コードされるアンチセンスＲＮＡがウィルスＲＮＡ
    に対して相補的である、請求項１または２に記載の遺伝
    子。 ４、コードされるリボザイムｍＲＮＡがウィルスＲＮＡ
    に対して相補的である、請求項１〜３のいずれか１項に
    記載の遺伝子。 ５、表１に示されるＤＮＡ配列からなる、 請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子。 ６、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子によっ
    てコードされる、多機能性ＲＮＡ。 ７、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子を含む
    、宿主細胞。 ８、請求項６に記載のＲＮＡを含む、宿主細胞。 ９、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子を含む
    、植物体、植物細胞および植物体の部分または種子。 １０、請求項６に記載のＲＮＡを含む、植物体、植物細
    胞および植物体の部分または種子。 １１、請求項３および４に記載の遺伝子によってコード
    されるＲＮＡの、植物における抗ウィルス剤としての使
    用。
JP2269305A 1989-10-06 1990-10-06 自己プロセシング活性を有する多機能性ｒｎａ、その製造およびその使用 Pending JPH03210180A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3933384.1 1989-10-06
DE3933384A DE3933384A1 (de) 1989-10-06 1989-10-06 Multifunktionelle rna mit selbstprozessierungsaktivitaet, ihre herstellung und ihre verwendung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH03210180A true JPH03210180A (ja) 1991-09-13

Family

ID=6390949

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2269305A Pending JPH03210180A (ja) 1989-10-06 1990-10-06 自己プロセシング活性を有する多機能性ｒｎａ、その製造およびその使用

Country Status (12)

Country Link
US (2) US5707840A (ja)
EP (1) EP0421376B1 (ja)
JP (1) JPH03210180A (ja)
KR (1) KR910008132A (ja)
AT (1) ATE121452T1 (ja)
AU (1) AU634289B2 (ja)
DE (2) DE3933384A1 (ja)
DK (1) DK0421376T3 (ja)
ES (1) ES2073491T3 (ja)
HU (1) HUT62038A (ja)
IE (1) IE67652B1 (ja)
NZ (1) NZ235562A (ja)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4002885A1 (de) * 1990-02-01 1991-08-08 Hoechst Ag Expression einer multigen rna mit self-splicing aktivitaet
US5596132A (en) 1990-03-12 1997-01-21 Cornell Research Foundation, Inc. Induction of resistance to virus diseases by transformation of plants with a portion of a plant virus genome involving a read-through replicase gene
US5633449A (en) * 1990-03-12 1997-05-27 Cornell Research Foundation, Inc. Induction of resistance to viral diseases in plants
JPH05508535A (ja) * 1990-03-12 1993-12-02 コーネル・リサーチ・ファウンデーション・インコーポレイテッド 非構造植物ウイルス遺伝子配列による植物の形質転換
GB9018646D0 (en) * 1990-08-24 1990-10-10 Imperial College Replication of a eukaryotic virus rna
DK0625194T3 (da) * 1992-02-04 1996-05-28 Worcester Found Ex Biology Forøgelse af ribozym-katalytisk aktivitet med et tilstødende facilitator oligonukleotid
KR950700408A (ko) * 1992-02-04 1995-01-16 토루페터슨 인접한 촉진제 올리고누클레오티드에 의한 리보자임 촉매활성의 증강(enhancement of ribozyme catalytic activity by a neighboring facilitator oligonucleotide)
US6087484A (en) * 1992-02-04 2000-07-11 University Of Massachusetts Worcester Enhancement of ribozyme catalytic activity by A 2'-O-substituted facilitator oligonucleotide
DE4203441C1 (de) * 1992-02-06 1993-10-14 Max Planck Gesellschaft RNA- und DNA-Moleküle zur Erzeugung von Virusresistenzen
DE69331216T2 (de) * 1992-04-17 2002-07-25 Kirin Brewery Planze resistent gegen mindestens zwei viren und dessen preparation
ES2255703T3 (es) * 1992-06-29 2006-07-01 Gene Shears Pty Limited Acidos nucleicos y procedimientos para la utilizacion de los mismos para el control de patogenos viricos.
WO1994013793A1 (en) * 1992-12-04 1994-06-23 Apollon, Inc. Compounds and methods for the treatment of leukemias
FR2701960B1 (fr) * 1993-02-26 2002-09-13 Gene Shears Pty Ltd Polyribozyme apte à conférer, aux plantes, une résistance aux virus et plantes résistantes produisant ce polyribozyme.
EP0728199A1 (en) * 1993-07-22 1996-08-28 Gene Shears Pty Limited Dna virus ribozymes
GB9320548D0 (en) * 1993-10-06 1993-11-24 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5908779A (en) * 1993-12-01 1999-06-01 University Of Connecticut Targeted RNA degradation using nuclear antisense RNA
DE4420298A1 (de) * 1994-06-10 1995-12-14 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Modifizierte Satelliten-RNAs und Satelliten-Viren als Träger adaptierter Ribozyme
US5824519A (en) * 1995-11-08 1998-10-20 Medical University Of South Carolina Tissue-specific and target RNA-specific ribozymes
IT1283631B1 (it) * 1996-05-09 1998-04-23 Metapontum Agrobios Srl Metodo per la preparazione di piante transgeniche resistenti ad in- fezioni virali e piante cosi' ottenute
DE10212892A1 (de) * 2002-03-20 2003-10-09 Basf Plant Science Gmbh Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4987071A (en) * 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
MC2115A1 (fr) * 1987-12-15 1991-07-05 Gene Shears Pty Ltd Ribozynes
DK0625194T3 (da) * 1992-02-04 1996-05-28 Worcester Found Ex Biology Forøgelse af ribozym-katalytisk aktivitet med et tilstødende facilitator oligonukleotid

Also Published As

Publication number Publication date
IE903579A1 (en) 1991-04-10
HUT62038A (en) 1993-03-29
EP0421376A1 (de) 1991-04-10
ATE121452T1 (de) 1995-05-15
HU906339D0 (en) 1991-04-29
AU6382790A (en) 1991-04-11
NZ235562A (en) 1992-12-23
DE59008928D1 (de) 1995-05-24
EP0421376B1 (de) 1995-04-19
US5834265A (en) 1998-11-10
ES2073491T3 (es) 1995-08-16
KR910008132A (ko) 1991-05-30
US5707840A (en) 1998-01-13
AU634289B2 (en) 1993-02-18
IE67652B1 (en) 1996-04-17
DK0421376T3 (da) 1995-09-04
DE3933384A1 (de) 1991-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH03210180A (ja) 自己プロセシング活性を有する多機能性ｒｎａ、その製造およびその使用
JP5015373B2 (ja) 改良表現型を得るための方法及び手段
AU618234B2 (en) Anti-sense regulation of the genotype of plant cells
ES2374521T3 (es) Regulación mediada por arnbc de la expresión génica en plantas.
AU724942B2 (en) Transgenic potatoes having reduced levels of alpha glucan L- or H-type tuber phosphorylase activity with reduced cold-sweetening
CA2091243C (en) Recombinant acc synthase
EP0812917A1 (en) Cold-inducible promoter sequences
JPH09500274A (ja) 果実特異性プロモータ
PT1650306E (pt) Meios e métodos para modificar a expressão génica usando arn não poliadenilado
EP0784095A2 (en) Enhanced accummulation of trehalose in plants
CA2075209C (en) Virus/herbicide resistance genes process for producing same and their use
AU707753B2 (en) Papaya ringspot virus NIa protease gene
US5519164A (en) Expression of a multigene RNA having self-splicing activity
SK2042001A3 (en) Plastid-targeting nucleic acid sequence, beta-amylase sequence, a stimulus-responsive promoter and uses thereof
JPH09501313A (ja) 植物におけるトレハロースの生産
AU690896B2 (en) Plant virus resistance conferring polyribozyme and resistant plants producing same
Han et al. Ribozyme-mediated resistance to rice dwarf virus and the transgene silencing in the progeny of transgenic rice plants
CA2184741A1 (en) Processes for inhibiting and for inducing flower formation in plants
IE903825A1 (en) RNA having endonuclease and antisense activity, the preparation thereof and the use thereof
US5792926A (en) Virus/herbicide resistance genes, processes for producing same and their use
KR100240356B1 (ko) 자가-접합 활성을 갖는 복유전자 알엔에이의 발현
Stephens et al. Agrobacterium T-DNA mutation causes the loss of GUS expression in transgenic tobacco