HUT62038A - Process for producing gene coding for ribosim rna sequence connected to "antisense" sequence - Google Patents

Process for producing gene coding for ribosim rna sequence connected to "antisense" sequence Download PDF

Info

Publication number
HUT62038A
HUT62038A HU906339A HU633990A HUT62038A HU T62038 A HUT62038 A HU T62038A HU 906339 A HU906339 A HU 906339A HU 633990 A HU633990 A HU 633990A HU T62038 A HUT62038 A HU T62038A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
rna
ribozyme
sequence
antisense
encoding
Prior art date
Application number
HU906339A
Other languages
English (en)
Other versions
HU906339D0 (en
Inventor
Hubert Muellner
Eugen Uhlmann
Peter Eckes
Rudolf Schneider
Bernadus Uijtewaal
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of HU906339D0 publication Critical patent/HU906339D0/hu
Publication of HUT62038A publication Critical patent/HUT62038A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás antisense szekvenciához kapcsolt ribozim-RNS-szekvenciát kódoló gén előállítására.
Alkalmas feltételek mellett az RNS-molekulák proteinek részvétele nélkül más RNS-molekulákon reakciókat katalizálhatnak, vagy saját molekulájukból autokatalitikus utón fragmenseket lehasithatnak. így például a Tetrahymena thermophila 23S rRNS-ának 3,-végéről autokatalitikusan 413 nukleotidot tartalmazó intron hasad le és gyűrűvé záródik. Ez foszforészter-transzfer-reakciók egész sorának az eredménye, mely reakciókban guanozin-kofaktorok is részt vesznek [Cech, T.R., Natúré 30, 578-583 (1983)]. Az RNS-szubsztrátumtól vagy a választott reakciókörülményektől függően az intron fajlagos ribonukleázként, terminális transzferázként, foszfortranszferázként vagy savas foszfatázként működhet. Egy RNS-molekula több reakciót katalizálhat, mig önmaga közben nem változik, e tekintetben enzimként viselkedik. Az ilyen tulajdonságokkal rendelkező RNS-molekulákat ezért ribozimnek nevezik.
Hasonló, proteinek közreműködése nélkül zajló reakciókat néhány viroid RNS és szatellita-RNS esetén is kimutattak. így például az Avocado Sunblotch viroid (ASBV) [Hutchins, C. J. és munkatársai, Nucleic Acids Rés. 14, 3627-3640 (1986)], a Tobacco Ringspot vírus (sTobRV) szatellita-RNS-a [Prody, G. A. és munkatársai, Science 231, 1577-1580 (1986)], valamint a Luzerné Transient Streak Vírus (sLTSV) [Forster A. C. és munkatársai, Cell 49, 211-220 (1987)] szatellita-RNS-a számára a self-processing nélkülezhetetlen reakciónak látszik a szaporodáshoz. A felsorolt
RNS-ak másolódása (replikációja) során valószínűleg gyürüalakú formák keletkeznek, amelyek templátum-ként túl hosszú RNS szintéziséhez vezetnek. Ezt az átmásolt RNS-t endonukleolitikus reakció vágja megfelelő genom-hosszra. Azt a szerkezetet, amelyet az RNS vágás közben valószínűleg felvesz, kalapács-fej-nek (hammerhead-nek) nevezték el [Forster A.C. és munkatársai, Cell 49, 211-220 (1987) ; Haseloff, J. és munkatársai, Natúré 334. 585-591 (1988)].
Az ilyen RNS-enzim vágóhelyei fajlagosak, és meghatározott szerkezeti feltételeknek kell eleget tenniük, hogy az enzim működjön.
Azt találtuk, hogy antisense-RNS-hoz kapcsolt ribozim-RNS-at kódoló DNS-at tartalmazó vektorral transzformált, tetszőleges szervezetből származó gazdaséjtekben az említett DNS kifejeződik.
Ismert, hogy az antisense-RNS prokariota és eukariota sejtek egész sorában, egyebek között növényi sejtekben is a gének kifejeződését gátolja [Green, P. J. és munkatársai, Ann. Rév. Biochem. 55, 569 (1986)]. A gátlás mechanizmusát még nem tisztázták; feltételezik, hogy eukariota rendszerekben kétszálú RNS képződik, amely az m-RNS-nak a citoplazma felé vezető vándorlását akadályozza.
Rezaian, M. és munkatársai [Plánt Mól. Bioi. 11,
463 (1988)] megvizsgálták, hogy az antisense-RNS a tök mozaikvirus (CMV) ellen alkalmazható-e antivirusos ágensként. A szerzők azonban azt tapasztalták, hogy az antisense-RNS virus elleni hatékonysága nem volt kielégítő.
A megfelelő ribozim-RNS és a megfelelő antisense-RNS spacer-en keresztül történő összekapcsolása azonban például hatékonyabb antivirusos aktivitást eredményez, mint amilyet Rezaian megfigyelhetett. Az RNS-molekulák ilyenfajta összekapcsolása nemcsak a növényekben kifejtett antivirusos aktivitást növeli, hanem egy adott szubsztrátum ellen irányúló aktivitást általánosan fokoz transzformált szervezetekben.
A találmány tehát az alábbiakra vonatkozik:
1. olyen eljárásra, amellyel antisense-RNS-szekvenciával spacer-en keresztül összekapcsolt ribozim-RNS-t kódoló gén állítható elő;
2. olyan eljárásra, amellyel gazdasejt a fent említett génnel transzformálható.
Az alábbiakban a találmányt, különösen előnyös kiviteli módozatait részletesen leírjuk és az igénypontokban definiáljuk.
A találmány szerint előállítható multifunkcionális RNS felépítése lényegében olyan, hogy a ribozimek az RNS-molekula 3/-, illetve 5/-végén helyezkednek el. Úgynevezett spacer-en keresztül antisense,'-RNS-egységek vannak közbeiktatva, amelyek - ha több egységről van szó - szintén spacer-eken keresztül kapcsolódnak egymáshoz. A multifunkcionális RNS-molekula előnyben részesített kiviteli alakjai például az alábbiak:
5/-ribozim RNS-spacer-(antisense-RNS)n-spacer-ribozim-3/, ahol n értéke 1 és 10 közötti, előnyösen 1 és 5 közötti, különösen előnyösen 1 és 3 közötti szám. Spacerként 20-25 nukleotidból álló láncot iktatunk be, amely teljes egészében, vagy legalább 8, előnyösen 10-20 nukleotidet kitevő résztartományban a ribozim szekvenciájával komplementer. Az RNS ribozim-szekvenciája igy a spacer mellé elhelyezkedhet és azt közvetlenül egy felismerési szekvencia mögött vághatja. Amennyiben n értéke 1-nél nagyobb, az antisense RNS-molekulák közé szintén egy-egy, ribozim-vágóhellyel rendelkező spacert iktatunk. Ribozim-vágóhelyként előnyösen GUC-vágóhelyet létesítünk. Az antisense-RNS olyan szubsztrátumok ellen irányúihat, mint például szelektálható jelzőgént (antibiotikum-rezisztencia) kódoló RNS, vagy tetszőleges sejtfunkciót (pl. dihidrofolát-reduktázt, timidin-kinázt, a poligalakturonáz, pektin-észteráz nevű érési enzimeket) kódoló RNS, a differenciálódást és a fejlődést elősegítő proteinek, vagy hormonreceptorok. Főleg növényeket károsító vírusfajták a találmány szerinti ribozim-antisense-rendszerrel előnyösen pusztíthatok. Más szubsztrátumok ellen irányúló ribozim-antisense-RNS-t analóg módszerrel szintet i z áIhatunk.
A multifunkcionális RNS-t kódoló DNS-oligonukleotideket mesterségesen állíthatjuk elő. Az antisense”-RNS oligonukleotidjeit a vírusos DNS-, illetve RNS-szekvenciák alapján szintetizálhatjuk. Ennek során alapjában véve a növényeket károsító vírusok bármelyikét vehetjük alapul. Előnyös vírusok a patogén RNS-virusok, főleg Cucumber Mo-saik Vírus, Alfalfa Mosaik Vírus, Brom Mosaik Vírus, Tabak Mo-saik Vírus, a burgonya X- és Y-virusa, a paradicsom Ringspot vírusa és Aspermy vírusa vagy a dohány Rattle vírusa.
A ribozim-RNS-t kódoló oligonukleotidek szintézise során mintá-nak előnyösen az adott vírus RNS-szekvenciájának a közepéből származó legalább 10, előnyösen 14-20 egymást követő nukleotidet használunk. Ez az RNS-szekvencia lehet egy RNS-virus genomja, de lehet egy DNS-virus DNSszekvenciájárói levezetett RNS-szakasz is. Különösen előnyösen a Cucumber Mosaik Vírus RNS1, RNS2 és RNS3 sz. szekvenciájából, vagy azok részeikből indulunk ki, amelyek Rezaian cikkeiben [Rezaian és munkatársai, Eur. J. Biochem. 150, 331-339 (1985); Eur. J. Biochem. 143, 277-284 (1984)] és Gould cikkében [Gould I. és munkatársai, Eur. J. Biochem. 126, 217-226 (1982)] találhatók.
A ribozimet kódoló oligonukleotidet úgy szintetizáljuk, hogy a legálább 5, előnyösen 7-10 nukleotidből állő kezdeti, illetve végszekvencia a gátolni kívánt vírus RNSével komplementer. A két vég közötti szakasz részben a ribozim működése által meghatározott fajlagos nukleotidekből, részben variálható nukleotidekből áll. A szubsztrátum-RNS-sal hibridizált ribozim például az alábbi lehet:
5-NNNNNNNNNNNNNGUC NNNNNNNNNNNNNN-3 —— Subttral-RNS 3-KKKKKKKKCA KKKKKKKK-5 λ
A C A U
Ribozim
VV « ···· · · * •··· · ··· ·«
- 7 ahol
N a szubsztrátum-RNS nukleotidjei (A, C, G vagy U) ,
K az N-nel komplemeter nukleotid a ribozimben,
V variálható nukleotidek (A, C, G vagy U) a ribozimben
VI variálható nukleotidek (A, C, G vagy U) a ribozim hurkában.
A Vl nukleotidek száma 0 és 500 között lehet.
Az antisense-RNS előállításakor hasonlóképpen járunk el, de a nukleotidek sorrendjét úgy választjuk meg, hogy az oligonukleotid ellenkező irányban orientálódó RNS-t kódoljon.
A ribozim-RNS oligonukleotid-szintézise során azonban teljesen tetszőleges szubsztrátumból is indulhatunk ki. Csak annak kell teljesülnie, hogy a spacer a ribozim szubstrátuma legyen és a megfelelő ribozim-vágóhelyekkel rendelkezzék. A ribozim és antisense-molekula összekapcsolását szolgáló spacert úgy szerkesztjük, hogy a megfelelő kifejeződött RNS - egészében vagy részben - a ribozimmel komplementer legyen; előnyös, ha a komplementer nukleotidek a ribozimmel vágható GUC-vágóhely körül csoportosulnak.
A szerkesztett oligonukleotideket megfelelő linkerrel látjuk el. Az ilyen linker például EcoRI, Sáli, BamHI, HindlII, EcoRV, Smal, Xhol, KpnI, előnyösen Xbal, illetve PstI restrikciós enzimek számára vágóhellyel rendelkezik.
Az összeillesztett oligonukleotideket a pUC19, püC18, vagy pBluescript (Stratagene, Heidelberg, Product Information) vektorok segítségével klónozzuk, majd szekvenciájukat ellenőrizzük.
» · « ·
- 8 Az ellenőrzött oligonukleotidet növényi propmotort tartalmazó átmeneti vektorba klónozzuk. Az ilyen vektorok példáiként az alábbiakat nevezzük meg: pPCV701 plazmid [Velten J. és munkatársai, EMBO J. 3, 2723-2730 (1984)], pNCN plazmid [Fromm M. és munkatársai, PNAS 82, 5824-5826 (1985)] vagy pNOS plazmid [An G. és munkatársai, EMBO J. 4, 277-276 (1985)]. Előnyösen az 35S-promotort tartalmazó pDH51 sz. plazmidot [Pietrzak, M. és munkatársai, NAR 14, 5857, (1986)] alkalmazzuk.
E. coli, pl. E. coli MC 1061, DH1, DK1, GM48 vagy XL-1 transzformálása után a pózitiv kiónokat ismert módon (Maniatis és munkatársai, Láb. Manual), igy a plazmid minipreparálás és megfelelő restrikciós enzimmel végzett hasítás utján azonosítjuk.
Ezt követően a pozitív kiónokat bináris növényi vektorba szubklónozzuk. Növényi vektor lehet például: pGV3850 [Zambrysky, P. és munkatársai, EMBO J. 2, 21432150 (1983)] vagy pOCA18 [Olszewski, N. és munkatársai, NAR 16, 10765-10782 (1988)]. Az utóbbit előnyben részesítjük.
A kapott bináris növényi vektor a T-DNS-ben növényi promotort és ehhez kapcsolva a fentiek szerint kialakított DNS-fragmenst tartalmazza; e vektorral növényeket transzformálunk. Ez elektroporálás vagy mikroinjekció segítségével történhet.
Előnyösen protoplasztok kokultiválását vagy levéldarabkák agrobaktériumokkal végzett transzformálását alkalmazzuk. E célból a fentiek szerint kialakított növényi vek····
tort tisztított DNS-val vagy segédtörzs, igy E. coli SM10 [Simon R. és munkatársai, Biotechnology 1, 784-791 (1983)] segítségével, a triparental mating módszer szerint Ti-plazmiddal együtt, Agrobacterium tumefaciens, igy az A 282 sz. törzsbe transzformáljuk. Mind a közvetlen transzformálást, mind a triparental mating transzformálást a Plánt Molecular Biology Manual (Kluwer Academic Publishers, Dardrecht 1988) kézikönyvben leírtak szerint végeztük.
Alapjában véve bármely növényt transzforrnáIhatunk a találmány szerint előállított DNS-t tartalmazó növényi vektorokkal. Előnyben részesítjük a kétsziküeket, főleg a haszonnövényeket, amelyek például keményítőt, szénhidrátot, fehérjét vagy zsírt termelnek és raktároznak el hasznosítható mennyiségben, vagy zöldséget, gyümölcsöt adnak, illetve fűszer, rostok, technikailag hasznosítható termékek vagy gyógyszerek, színezékek, viasz termelésére alkalmazhatók, valamint a takarmány növényeket.
Példaként az alábbiakat nevezzük meg: paradicsom, földieper, avocado, trópusi gyümölcsök, igy papaya, mangó, de körte, alma, nektarina, sárgabarack vagy őszibarack is. TranszforrnáIható növények továbbá az összes gabonafaj, a repce, burgonya, szójabab, gyapot, kukorica, cukorrépa vagy napraforgó. A transzformált sejteket szelektáló közeg segítségével szelektáljuk, kallusszá tenyésztjük, és alkalmas közegen növénnyé regeneráljuk [Shain és munkatársai, Theor. appl. Génét. 72, 770 (1986); Masson, J. és munkatársai, Plánt Science 53, 167-176 (1987); Zhan és munkatársai, Plánt. Mól.
• ··· • · · · ·
- 10 Bioi. 11. 551-559 (1988); McGranaham és munkatársai, Bio/Technology 7, 154-159 (1989)].
Az eredő növény a transzforrnálás során annyiban változott meg, hogy sejtjeiben a szerkesztett oligonukleotidek segítségével kifejeződő RNS a ribozim-aktivitás révén GUChelyeken vágva lesz, aminek során antisense-RNS szabadul fel, és a ribozim-RNS az antisense-RNS-val együtt virus-DNS, illetve virus-RNS ellen aktiválódhat.
Az alábbi példákkal a találmányt közelebbről ismertetjük.
1. példa
A multifunkcionális RNS kifejeződéséhez szükséges
DNS szintézise
A multifunkcionális RNS kifejeződéséhez szükséges DNS-szekvenciát (lásd 1. táblázat) az alábbiak szerint állittottuk elő:
a) I-es ribozim [1 - 46]: a CMV-homológ tartomány a publikált RNS-1 szekvencián [Rezaian M. és munkatársai, Eur. J. Biochem. 150, 331-339 (1985)] alapul, a 3248-3264. pozíció közötti szakasznak felel meg.
A ribozim állandó részei az 1. táblázatból vehetők ki; Haseloff publikációjából [Natúré 334, 585-591, (1988)] vezettük le.
b) Spacer [47 - 70] a publikált RNS-2 szekvencia [Rezaian és munkatársai, Eur. J. Biochem. 143, 277-226 (1984)] 2853 és 2870 közötti szakaszának felel meg.
c) l.antisense [71 - 243]: a publikált RNS-4 szekvencia • ··· ♦ · ···· f · ·· · • · · • · • ♦ · ·*· ··
- 11 [Gould I. és munkatársai, Eur. J. Biochem. 143, 217-226, (1098)] alapján, 2054-2193. pozíció.
d) Spacer [219 - 243]: mint a b) alatti spacer [47 - 70] esetén.
e) 2.antisense [244 - 313]: a publikált RNS-2 szekvencia (lásd fent) alapján; 71-134. pozíció.
f) Spacer [314 - 338]: mint a b) alatti spacer [47 - 70] esetén
g) 3. antisense [339 - 405]: a publikált RNS-4 szekvencia (lásd fent) alapján; 1200-1261. pozíció
h) Spacer [406 - 429]: a publikált RNS-1 szekvencia (lásd fent) alapján; 3248-3264. pozíciónak felel meg.
i) Ribozim [430 - 480]: a CMV-homológ szakasza az RNS-2 szekvencia (lásd fent) 2853-2870. pozíció közötti része alapján; az állandó szakaszok az 1. táblázat szerint (lásd a) alatt megadott irodalom).
A szögletes zárójelekben lévő számok az 1. táblázat szerinti DNS pozícióit adják meg.
A foszforamidit módszer segítségével az 1. táblázatban bemutatott oligonukleotideket gén-szintetizáló berendezésben szintetizáltuk. A fragmensek a szekvenciáról leolvashatók: az első a kezdeti Xmal-linkertől a KpnI-helyig terjed, a második a KpnI és BamHI közötti szakasz, a harmadik BamHI-tól Sacl-ig ér, és a negyedik a SacI és a Smal-átmenet közötti darab. Szintetizáltuk a szálat, az ellenszálat, és a kettőt klónozás előtt ekvimoláris mennyiségben elegyítettük.
2. példa
- 12 pBluescript SK+ vektorban történő klónozás és a szekvencia ellenőrzése
A pBluescript SK+ plazmidot (Stratagene, Product Information a megfelelő enzimekkel (Xmal/KpnI, Kpnl/BamHI, BamHI/SacI, Sacl/Smal) megnyitjuk, calf intestinal phosphatase-zal (CIP) kezeljük és a kétszálú, foszforilezett oligotidek ötszörös feleslegével ligáijuk. Pozitív kiónokat az XL-Blue (Stratagene) törzsben izopropil-tiogalaktoziddal (IPTG, Boehringer, Mannheim) végzett indukálás után LB-lemezeken, 5-bróm-4-klór-3-indolil-B-D-galaktoziddal (X-gal; Boehringer, Mannheim) mutattunk ki fehér telepek alakjában.
5-5 telepet izoláltunk, szekvenciájukat a didezoximódszerrel (Boehringer, Sequencing Kit) ellenőriztük. A várt szekvenciát tartalmazó telepek egyikéből az oligonukleotidet - a megfelelő enzimekkel végzett hasítás után - nagytisztaságú (low melt) agaróz-gélen (Gibco, Brueggenstein, NSZK) izoláltuk.
Az izolált oligonukleotideket ligáltuk és nagytisztaságú (low melt) agaróz-gélen a nem ligáltaktól elkülönítettük. A várt 0,5 kilobázisnyi (kb) sávot kivágtuk és a túlnyúló Xmal-hely feltöltése után a pBluescript SK+ plazmid SmI-felismerő szekvenciájába illesztettük.
3. példa
Az összfragmens pDH51 plazmidban történő klónozása
A multifunkcionális RNS kifejeződéséhez szükséges fragmenst Smal enzimmel végzett emésztés segítségével a pBluescript szerkezetből elkülönítettük és Smal enzimmel • ♦ · · ·*·· • · · · · · • · · « · • ···· ·· ♦ ·«·« * ·«· ·· vágott pDH51 plazmidba építettük. A fragmens orientációját Hindin segítségével határoztuk meg.
A pDH51 plazmidot Pietrzak és munkatársai [NAR 14. 5857-5869 (1986)] reprodukáláshoz elegendő részletességgel leírták.
A pDH51 plazmiddal MC1061 sejteket transzformáltuk, és a sejtek DNS-éről minipreparatumokat készítettünk. Ezeket HindlII enzimmel vágtuk, igy felismertük a kívánt orientáció meglétét.
4. példa
Az összfragmens 35S-promotorral pOCA18 vektorban történő klónozása
A multifunkcionális RNS kifejeződését szolgáló
1,2 kbp-nyi fragmenst a 35S promotorral és terminátorral együtt a klónozott inzertet tartalmazó pDH51 plazmid EcoRI enzimmel végzett emésztése utján izoláltuk, majd EcoRI enzimmel vágott pOCA18 vektorral ligáltuk. A fragmenssel ligáit vektorral MC1061 sejteket transzformáltűk.
A pOCA18 plazmidot Olszewski és munkatársai [NAR 16.
10765-10782 (1988)] reprodukáláshoz elegendő részletességgel leírták.
A transzformált sejtek DNS-éből minipreparátumokat készítettünk. Az egyik telep a kívánt méretű EcoRI-sávot eredményezte.
5. példa
Agrobaktériumok transzformálása
A 35S promotort és az oligonukleotid-inzertet tártál
Λ
- 14 mázó pOCA18 vektort az A 282 agrobaktérium törzsbe (Pharmacia Freiburg, NSZK, vagy ATCC 37349, USA) vittük. Ez Triparental mating módszer szerint történt az E. coli SM10 törzs [Simon, R. és munkatársai, Bio/Technology 1, 784-791] segítségével, az alábbiak szerint. Mindkét baktériumból azonos mennyiséget együttesen szűrőre adtunk, egy éjszakán állni hagytuk, majd 2 ml 10 mM MgSC>4-oldattal leöblítettük, és a nyert folyadékkal tetraciklint és rifampicint tartalmazó YEB-lemezeket (YEB: 1 % élesztőkivonat, 1 % pepton, 0,5 % NaCl) oltottunk. Pozitív agrobaktériumokat hibridizálással mutattunk ki a következőképpen. A telepeket Gene Screen Plus szűrőre (New England Nuclear vittük, a szűrőket éjszakán át YEB-lemezen 28 °C-on inkubáltuk és a következő napon denaturáltuk, majd semlegesítettük. Végül a szűrőket a radioaktív jezést hordozó összfragmens 4xl05 cpm/nl mennyiségével hibridizáltuk 65 °C-on, egy éjszakán át. Utána a szűrőket egyszer lxSSCvel, kétszer 0,lxSSC/SDS-szel mossuk, 30-30 percen át 65 °Con. A mosott szűrőkön filmet exponáltunk 6 órán át; a pozitív telepek a film megfeketedéséből ismerhetők fel.
6. példa
Dohánynövények transzformálása
Az agrobaktériumokat tetraciklint és rifampicint tartalmazó YEB-közegben (1 % élesztőkivonat, 1 % pepton, 0,5 % NaCl) tenyésztettük, 20 ml tenyészlét centrifugáltuk, a baktériumokat YEB-közeggel mostuk és 20 ml 10 mM MgSO4~ oldatban szuszpendálva Petricsészébe tettük. Növényi anyagként Wisconsin 38 fajtájú Nicotiana tabacum növényeket al1· *·· • · • · * ♦ ♦· ··
- 15 kalmaztunk. A növényeket előzőén steril körülmények között 2MS-közegen [Murashige T. és munkatársai, Physiol. Plánt
15. 473-497 (1962)] 4 héten át tenyésztettük 25 °-on, naponta 16 óra megvilágítással. A növényekről 1 cm2 felületű levéldarabkékat vágtunk, a levéldarabkákat steril smirglivel felsértettük, majd 30 másodpercre a baktériumtenyészetbe mártottuk és 2 napra MS-közegen tartottuk 25 °C-on a fentiek szerint, utána folyékony 2MS-közeggel mostuk. Ezt követően a levéldarabkákat kanamicint tartalmazó MSC 10 közegből (egyezik az MS-közeggel, de 1,5 % agart tartalmaz) álló lemezekre telepítettük. 5-6 héttel később a regenerált növényeket nagyobb edényekbe ültettük, ahol 2-3 hét alatt gyökereket eresztettek.
A transzgén dohánynövényekből a CTAB-módszerrel DNS-t izoláltunk. Ennek során pontosan a Plánt Molecular Biology Manual (Kluwer Academic Publishers, Dordrecht 1988) előírásait követtük. 10 yg DNS-t EcoRI enzimmel hasítottunk és 1 %-os agaox-gélen szétválasztottuk, majd denaturálás után Gene Screen Plus membránra tettünk. A membránt 4xl05 cpm/nl radioaktívan jelölt fragmenssel 65 °C-on egy éjszakán át hibridizáltuk. A várt méretű fragmens mindegyik esetben kimutatható volt. A transzgén növényekből vett DNS-minták mindegyike az 1,2 kb EcoRI-sáwal történt hibridizációt mutatta.
7. példa
A multifunkcionális RNS kifejeződése dohénynövényekben • *
- 16 Transzgén dohánynövények feldarabolt leveleiből összRNS-t izoláltunk, a Plánt Molecular Biology Manual (Kluwer Academic Publishers, Dordrecht 1988) előírásai szerint. 10 Mg össz-RNS-t denaturálás után 2,2 M formaldehid tartalmú 1 %-os agaóz-gélen trisz-pufferrel (12 mM trisz, pH 7,5/0,1 mM EDTA) szétválasztottunk és Gene Screen Plus membránra vittünk. A membránt radioaktivan jelölt összfragmenssel hibridizáltuk. A transzgén növényekben a várt tulajdonságú RNS erősen kifejeződött.
8. példa
Transzgén dohánynövények CMV-virussal történő megfertőzése
A megfertőzés a CMV-virus Q-törzsével [Rezaian, M és munkatársai, Eur. J. Biochem. 150, 331 (1985); 143. 277 (1984); Gould, J. és munkatársai, Eur. J. Biochem. 126, 217 (1982)] történt, amelyet uborkalevelekből izoláltak. A fertőző anyagot csíszolószemcsék segítségével vittük a dohány növényekre. A választott fertőzési módszer mellett a kontrol növények 80 %-a erős megbetegedési tüneteket mutatott, igy az erek világosodtak, mozaikképződés és a levélperem szabálytalan növekedése lépett fel. A fertőzés fajlagosságát ELIZAteszttel igazoltuk.
A növények transzgén voltát olyan egyedeken vizsgáltuk, amelyek dúgvány szaporításból származtak. Amennyiben vetőmag képződött, az utódokat is vizsgáltuk.
Bebizonyosodott, hogy gyakorlatilag minden olyan növény esetén, amely a multifunkcionális RNS kifejeződését ί· · ♦· ·* * •· a a a «· a a ·««· a ♦· ··«· « ···
- 17 mutatta, a fertőződés valószinöőüsége erősen csökkent. A mindenkori egyedi transzformációs eseménytől függően a transzgén növények csak 10-50 %-a feljesztette a tipikus tüneteket.
Táblázat: egyértelmű tüneteket mutató fertőzött növények százalékában: 10-10 növény kiértékeléséből
12 nap 20 nap
Kontrol (dohány W38) 80 80
Transzgének: A-H3 20 30
A-H7 10 20
A-H15 40 50
A-H22 30 30
Az módszer tehát alkalmas növények vírusos fertőzéstől való védelmére. A rezisztencia további javítása érdekében meg lehet kísérelni, hogy a multifunkcionális RNS-hez még további elemeket kapcsoljunk.
Multifunkcionális RNS kitéleződését szolnáló szekvencia
1. táblázat
Xmal
9 18 27 36
CCG GGA GGT AGC TCC TGA TGA GTC CGT GAG GAC GAA ACA ACC
C CCT CCA TCG AGG ACT ACT CAG GCA CTC CTG CTT TGT TGG
45 54 63 72 81
TTG TCG TCG ACA AAA TGG TCA GTA TGC CCC TCG AGT GGT CTC
ACC AGC AGC TGT TTT ACC AGT CAT ACG GGG AGC TCA CCA GAG
90 99 108 117 KpnI 126
CTT ATG GAG AAC CTG TGG AAA ACC ACA GGC GGT ACC CGC ACT
GAA TAC CTC TTG GAC ACC TTT TGG TGT CCG CCA TGG GCG TGA
135 144 153 162
CTT GGT AAT ATC AGT GTA TTA CCG TGC ACG AGC TTC TCA CGA
GAA CCA TTA TAG TCA CAT AAT GGC ACG TGC TCG AAG AGT GCT
171 180 189 198 207
AGC CCT TCC GAA GAA ATC TAG GAG ATG ATT TCA AGG GTA GCT
TCG GGA AGG CTT CTT TAG ATC CTC TAC TAA AGT TCC CAT CGA
216 BamHI 225 234 243 252
CGA CAA CCT GGA TCC AAA ATG GTC AGT ATG CCC CCC ATG GCA
GCT GTT GGA CCT AGG TTT TAC CAG TCA TAC GGG GGG TAC CGT
261 270 279 288
ACA GAT TGG CGA ATG AGA AAG TGG GTG GAG GAC TTA TCA TAG
TGT CTA ACC GCT TAC TCT TTC ACC CAC CTC CTG AAT AGT ATC
297 306 315 324 333
TAA CAG AAG AGA GAC TAG AAC TGC AGA AAA TGG TCA GTA TGC
ATT GTC TTC TCT CTG ATC TTG ACG TCT TTT ACC AGT CAT ACG
342 351 360 369 SacI 378
CCC AGA TCT ACC GGA GGT TCT ACT AGC ATT GGG AGA GCT CGA
GGG TCT AGA TGG CCT CCA AGA TGA TCG TAA CCC TCT CGA GTC
387 396 405 414
TTT GTC CAT AGG CAC ACT GAG ACG CAA AAA GCT TAA GGT TGT
AAA CAG GTA TCC GTG TGA CTC TGC GTT TTT CGA ATT CCA ACA
423 432 441 450 459
CGA GCT ACC GGG GCC CAG GGC ATA CTC TGA TGA GTC CGT GAG
GCT CGA TGG CCC CGG GTC CCG TAT GAG ACT ACT CAG GCA CTC
468 477 Sma
GAC GAA ACC ATT TTG GG ; 3'
CTG CTT TGG TAA AAC CC ! 5’
:999 9

Claims (7)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás antisense-RNS szekvenciához kapcsolt ribozim-RNS-szekvenciát kódoló gén előállítására, azzal jellemezve, hogy
    a) a ribozim-kódoló oligonukleotid-DNS-t a gátolni kívánt szubsztrátum RNS-szekvenciája alapján szintetizáljuk oly módon, hogy a legalább 5 nukleotidból, előnyösen 7-10 nukleotidból álló, előnyösen a vírus szekvenciájának közepéből vett szekvenciák a gátolni szubsztrátum RNS-ével komplementer sorrendüek és a közöttük lévő szekvencia részben a ribozim működéséből adódóan adott nukleotidekből, részben variálható nukleotidekből áll,
    b) az antisense-kódoló oligonukleotid-DNS-t a gátolni kívánt szubsztrátum alapján szintetizáljuk oly módon, hogy az a megfelelő ellentétes orientációjú RNS-t kódolja, és
    c) a szintetizált oligonukleotideket spaceren keresztül összekapcsoljuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ribozim-RNS-szekvenciát kódoló gént az alábbi vázlat szerint szintetizáljuk:
    5f-ribozim-RNS - spacer - antisense-RNS (antisense-RNS - spacer - ”antisense-RNS)n - spacer - ribozim-RNS-3·, ahol n értéke 0 és 10 közötti szám, és spacer-ként 20-25 nukleotidből álló lánc van közbeiktatva, amely ribozim-vágóhellyel rendelkezik.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antisense-kódoló oligonukleotid-DNS-t :··»«
    - 20 úgy szintetizáljuk, hogy egy vírusos RNS komplementerjét kódolja.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ribozim m-RNS-t kódoló oligonukleotid-DNS-t úgy szintetizáljuk, hogy egy vírusos RNS komplementerjét kódolja.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. táblázat szerinti DNS-szekvenciát szintetizáljuk.
  6. 6. Eljárás multifunkcionális RNS szintézisére az
    1-5. igénypontok szerint.
  7. 7. Eljárás gazdasejt transzformálására, azzal jellemezve, hogy
    a) az 1-5. igénypontok bármelyike szerint szintetizált DNS-t promotort tartalmazó vektor segítségével közvetlenül vagy segédtörzs felhasználásával közvetve a sejtbe juttatjuk és
    b) a bejuttatott DNS a gazdasejtben a 6. igénypont szerinti RNS-sé átiródik.
HU906339A 1989-10-06 1990-10-04 Process for producing gene coding for ribosim rna sequence connected to "antisense" sequence HUT62038A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3933384A DE3933384A1 (de) 1989-10-06 1989-10-06 Multifunktionelle rna mit selbstprozessierungsaktivitaet, ihre herstellung und ihre verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU906339D0 HU906339D0 (en) 1991-04-29
HUT62038A true HUT62038A (en) 1993-03-29

Family

ID=6390949

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU906339A HUT62038A (en) 1989-10-06 1990-10-04 Process for producing gene coding for ribosim rna sequence connected to "antisense" sequence

Country Status (12)

Country Link
US (2) US5707840A (hu)
EP (1) EP0421376B1 (hu)
JP (1) JPH03210180A (hu)
KR (1) KR910008132A (hu)
AT (1) ATE121452T1 (hu)
AU (1) AU634289B2 (hu)
DE (2) DE3933384A1 (hu)
DK (1) DK0421376T3 (hu)
ES (1) ES2073491T3 (hu)
HU (1) HUT62038A (hu)
IE (1) IE67652B1 (hu)
NZ (1) NZ235562A (hu)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4002885A1 (de) * 1990-02-01 1991-08-08 Hoechst Ag Expression einer multigen rna mit self-splicing aktivitaet
CA2078134A1 (en) * 1990-03-12 1991-09-13 Milton Zaitlin Transformation of plants with non-structural plant virus gene sequences
US5633449A (en) * 1990-03-12 1997-05-27 Cornell Research Foundation, Inc. Induction of resistance to viral diseases in plants
US5596132A (en) 1990-03-12 1997-01-21 Cornell Research Foundation, Inc. Induction of resistance to virus diseases by transformation of plants with a portion of a plant virus genome involving a read-through replicase gene
GB9018646D0 (en) * 1990-08-24 1990-10-10 Imperial College Replication of a eukaryotic virus rna
US6087484A (en) * 1992-02-04 2000-07-11 University Of Massachusetts Worcester Enhancement of ribozyme catalytic activity by A 2'-O-substituted facilitator oligonucleotide
KR950700408A (ko) * 1992-02-04 1995-01-16 토루페터슨 인접한 촉진제 올리고누클레오티드에 의한 리보자임 촉매활성의 증강(enhancement of ribozyme catalytic activity by a neighboring facilitator oligonucleotide)
AU661124B2 (en) * 1992-02-04 1995-07-13 Worcester Foundation For Experimental Biology Enhancement of ribozyme catalytic activity by a neighboring facilitator oligonucleotide
DE4203441C1 (de) * 1992-02-06 1993-10-14 Max Planck Gesellschaft RNA- und DNA-Moleküle zur Erzeugung von Virusresistenzen
AU656676B2 (en) * 1992-04-17 1995-02-09 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Plant resistant to two or more viruses and preparation thereof
HUT71929A (en) * 1992-06-29 1996-02-28 Gene Shears Pty Ltd Nucleic acids and methods of use thereof for controlling viral pathogens
CA2150903A1 (en) * 1992-12-04 1994-06-23 American Home Products Corporation Compounds for the treatment of leukemias
FR2701960B1 (fr) * 1993-02-26 2002-09-13 Gene Shears Pty Ltd Polyribozyme apte à conférer, aux plantes, une résistance aux virus et plantes résistantes produisant ce polyribozyme.
JPH09505461A (ja) * 1993-07-22 1997-06-03 ジーン シェアーズ プロプライアタリー リミティド Ｄｎａウィルスリボザイム
GB9320548D0 (en) * 1993-10-06 1993-11-24 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5908779A (en) * 1993-12-01 1999-06-01 University Of Connecticut Targeted RNA degradation using nuclear antisense RNA
DE4420298A1 (de) * 1994-06-10 1995-12-14 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Modifizierte Satelliten-RNAs und Satelliten-Viren als Träger adaptierter Ribozyme
US5824519A (en) * 1995-11-08 1998-10-20 Medical University Of South Carolina Tissue-specific and target RNA-specific ribozymes
IT1283631B1 (it) * 1996-05-09 1998-04-23 Metapontum Agrobios Srl Metodo per la preparazione di piante transgeniche resistenti ad in- fezioni virali e piante cosi' ottenute
DE10212892A1 (de) * 2002-03-20 2003-10-09 Basf Plant Science Gmbh Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4987071A (en) * 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
ATE115999T1 (de) * 1987-12-15 1995-01-15 Gene Shears Pty Ltd Ribozyme.
AU661124B2 (en) * 1992-02-04 1995-07-13 Worcester Foundation For Experimental Biology Enhancement of ribozyme catalytic activity by a neighboring facilitator oligonucleotide

Also Published As

Publication number Publication date
ATE121452T1 (de) 1995-05-15
EP0421376B1 (de) 1995-04-19
HU906339D0 (en) 1991-04-29
ES2073491T3 (es) 1995-08-16
DE3933384A1 (de) 1991-04-18
NZ235562A (en) 1992-12-23
US5834265A (en) 1998-11-10
AU634289B2 (en) 1993-02-18
IE903579A1 (en) 1991-04-10
DE59008928D1 (de) 1995-05-24
AU6382790A (en) 1991-04-11
EP0421376A1 (de) 1991-04-10
IE67652B1 (en) 1996-04-17
DK0421376T3 (da) 1995-09-04
KR910008132A (ko) 1991-05-30
JPH03210180A (ja) 1991-09-13
US5707840A (en) 1998-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT62038A (en) Process for producing gene coding for ribosim rna sequence connected to "antisense" sequence
EP2267138B1 (en) Methods and means for obtaining modified phenotypes
Jorgensen et al. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences
AU783799B2 (en) Means and methods for modifying gene expression using unpolyadenylated RNA
US9441239B2 (en) Methods and means for obtaining modified phenotypes
US20070078105A1 (en) Methods and means for obtaining modified phenotypes
AU4701493A (en) Dna virus ribozymes
AU690896B2 (en) Plant virus resistance conferring polyribozyme and resistant plants producing same
HUT58794A (en) Process for producing rns of endonuclease- and antisense activity
KR100240356B1 (ko) 자가-접합 활성을 갖는 복유전자 알엔에이의 발현
Ampomah-Dwamena Genetic engineering for antibacterial activity in lettuce (Lactuca sativa L.)

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee