JPH05508535A - 非構造植物ウイルス遺伝子配列による植物の形質転換 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 非構造植物ウィルス遺伝子配列による植物の形質転換タバコモザイクウィルス（ ＴＭＶ）のコート蛋白遺伝子で形質転換しそれを発現する植物がＴＭＶに抵抗性 を有することを示すｐ、ノ＜ウニルーアベル等の１９８６年の文献（サイエンス ２２３巻７３８頁参照）以来、種々のウィルス感染症から多数の作物種を保護す ることに関して疑もなく重要な示唆をもたらす数々の他の例が提供された。現在 までに、例えば、ウィルスコート蛋白が仲介する抵抗が、アルファルファモザイ クウィルス、タバコラットルウイルス、ポテトウィルスＸ１キウリモザイクウイ ルス、ポチウイルス類およびＰｖＸとＰＶＹの両者のコート蛋白で形質転換した 植物で示された。

ウィルスコート蛋白を暗号化するもの以外の植物ウィルス配列も、形質転換した 植物が形質転換後ウィルス感染に対する抵抗性を示すようにできるかどうかを決 めるために試験された。ＲＮＡＩおよび２のほぼ全長コピーを含むアルファルフ ァモザイクウィルスの正のセンス配列は、形質転換植物に抵抗性を導入しなかっ た（Ｃ，Ｍ、Ｐ、ファン・ダン等、ピロロジ−１６３巻５７２頁、１９８８年参 照）。

ＴＭＶコート蛋白配列のアンチセンス配列は、形質転換した夕！（コに低レベル の抵抗性を導入しくＰ、Ａ、パラエル等、ブロシーデインダス・オブ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ニーニスエイ８６巻６９４９頁、 １９８９年参照）、ポテトウィルスＸコート蛋白配列でもそうであり、（Ｃ，ヘ メンウェイ等、ＥＭＢＯジャーナル７巻１２７３頁、１９８８年参照）、また同 様にキラリモザイクウィルスゲノムで試験した３種の領域の１種（ＲＮＡ１の５ ”配列）からのアンチセンスＲＮＡも形質転換ラインの１種で低レベルの抵抗性 を付与した。

植物ウィルスのサテライトＲＮＡから得たＤＮＡで形質転換した植物を用（＼る 他の抵抗形態、例えばキラリモザイクウィルスのサテライトを使用するもの（Ｂ 。

Ｄ、ハリソン等、ネイチャー３２８巻７９９頁、１９８７年参照）、自己開発能 力をもつサテライトＲＮＡの配列に基づ（リボチームの想定（Ｊ、ハセロ７等、 ネイチャー３４４巻５８５頁、１９８８年参照）も報告されている。

ここに記載する発明は、１つの植物世代から別の植物世代へ移行され得る全（新 規な型のウィルス誘導抵抗を示すものである。この発明は、ウィルスゲノムのレ ブリカーゼ部分からとったコード化配列を含む形質転換植物がその後のウィルス 感染に抵抗を示すこと（以下の記載でＴＭＶからの５４にコード化配列の使用を 詳細に述べる）を開示する。例示したタバコでは、５４に配列の存在はＴＭＶ感 染に伴う局所的クロロシス（退緑）、ネクロシス（壊死）またはウィルス複製の 進行および全植物的症状またはウィルス複製の進行を阻害する。

ＴＭＶゲノムの構成は比較的よく理解され科学界で承認されている。しかし、充 分解明されていなかったゲノムストラテジーの１つの特徴として、ゲノムおよび サブゲノムＲＮＡ類の合成を担うレプリカーゼ酵素の正確な性質がある。このウ ィルスが４種の蛋白をコード化し、そのうち２種はゲノムＲＮＡによりコード化 され、２種は個々のサブゲノムＲＮＡ類によりコード化されていることが一般に 承認されているが、ウィルスが少なくとも１種の他の別の蛋白をコード化するこ とは一般に承認されていない。

Ｎ、　Ｄ、ヤング等は、２種の同時開始蛋白である１２６におよび１８３に蛋白 をコード化するゲノムＲＮＡ５’近傍領域がレプリカーゼの成分であると考えら れる旨発表した（ジャーナル・オブ・セル・サイエンス補遺７巻２７７頁、１９ ８７年参照）。１８３に蛋白は１２６に蛋白のＵＡＧ停止コドンを読み過すこと によって生成する。他の２種の蛋白（機能は既知）である３０に蛋白とコート蛋 白コドンは、各遺伝子が５゛近傍に位置する別のサブゲノムｍＲＮＡからそれぞ れ合成される。

しかし、一般に承認されていないものとして、我々が５４に蛋白と標識づけし、 １８３に遺伝子の読み過し部分中に解読枠中がある別の蛋白が存在するとの我々 の主張がある。この蛋白が存在する主な証拠は、ＴＭＶ感染植物に、ｌｌＲＮＡ と命名した、ＴＭＶゲノムのヌクレオチド残基３４０５から始まり５４に蛋白の 転写解読枠を含む第３のサブゲノムＲＮＡが存在するとの知見から得られる（Ｍ 。

Ａ、サルジンスキ等、ビｏｏジー１４５巻１３２頁、１９８５年参照）。ｍＲＮ ＡとしておよびサブゲノムＲＮＡとしてのその機能の根拠は、それがポリリポソ ーム上に見られ１１サブゲノムＲＮＡの２本鎖体に対応する大きさの２本鎖ＲＮ Ａが存在するとの観察結果に基づく（Ａ、ゼルサー等、ピロロジ−１３１巻４１ ７頁、１９８１年およびＰ、パルカイチス等、ピロロジ−１３１巻５３３頁、１ ９８３年参照）。

具体的に述べると、１８３に蛋白遺伝子の読み過し部分を含むＴＭＶゲノム領域 の下記配列である。

５’−ＧＣＡＧＧＡ−ＣＡＡＡＧＡＣＵＧＧＵＧＡＵＡＵＵＵＣＵＧＡＬＩＡ　 −Ａ　ＡＡ−３°−この配列は、ヌクレオチド残基を３４０５で始まる１１サブ ゲノムＲＮＡを示す（１８３に蛋白遺伝子の完全な配列はゴクレ等、プロシーデ ィンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ニ ーニスエイフ９巻５８１８頁、１９８２年にみられる。）この配列において、５ ４に転写解読枠はヌクレオチド残基３４９５−４９１９にまたがり、下線部は後 記実施例にさらに詳説する植物の形質転換に使用した配列を示す。

残念ながら、５４に蛋白は感染組織からみつかっていない。エシェリキア・コリ 中で発現された１２６に蛋白の読み過し物に特異的な４３２アミノ酸のβ−ガラ クトンダーゼ融合蛋白に対する抗体を製造しても、抗体が１８３に蛋白を検出で きる条件下のウェスタンプロットまたは免疫沈降の何れでもプロトプラスト抽出 物中に５４に蛋白は検出できなかった（Ｔ、サイトウ等、モレキュラー・アンド ・ゼネラル・フェネティックス２０５巻８２頁、１９８６年参照）。同様に、５ ４に蛋白は総蛋白に対して作成した抗血清を用いるウェスタンプロットでも、こ の蛋白がみられると期待されるゲノム領域に時々薄いバンドがみられるが、検出 されていない。しかし、総蛋白に対する抗血清は、５４に蛋白遺伝子のＴＭＶＲ ＮＡまたはＴ７転写物のインビトロ翻訳生成物から生じた５４に蛋白を沈殿する 能力がある。

５４に蛋白の機能を解明するため、我々はこの非構造ウィルス蛋白のコード化配 列でタバコを形質転換した。予期せざることに、この形質転換植物は５４に配列 の基となったＴＭＶの０１株の複製に完全に抵抗を示した。この抵抗は、植物に 高濃度のウィルスまたはウィルスＲＮＡの何れを接種しても出現した。

したがって、この発明の新規な特徴は、ウィルスゲノムのレプリカーゼ領域の部 分でその正常ゲノムをあらかじめ「センス」方向に形質転換した植物にウィルス 抵抗性を伝達することである。この特徴のさらに完全な理解およびこの発明の他 の特徴は、後記実施例および図面を参照すると可能となる。

添付の図において、 第１図は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびツバリンシンターゼポリアデニル 化部位開に挿入したＴＭＶ５４にコード化配列を含む植物発現ベクターを示す。

さらに具体的には、この図は、ｐＭＯＮ３１６ポリリンカー領域のＸｈｏ１１部 位またはＳａ＋ａ１部位にＴＭＶｃＤＮＡを挿入して生ずるプラスミドを示す。

これらのベクター中の番号はＴＭＶゲノム中のヌクレオチドに対応する。ＮＰＴ ＩＩ遺伝子は形質転換植物に、選択可能なカナマイシン耐性マーカーを与える。

実施例１ 植物およびウィルス株の培養および維持ＴＭＶ株Ｕ、は、ニー・アセリンら（ピ ロロジー、９１巻、１９３頁（１９７８年）参照）が報告したようにニコチアナ ・タバクムの感染栽培品種ツルキッシュ・サムスン（Ｎ、　ｔａｂａｃｕｍ　ｃ ｖ、　Ｔｕｒｋｉｓｈ　Ｓａｒｍｓｕｎ）植物から精製した。ウィルスＲＮＡは フェノール抽出およびエタノール沈殿により単離した。ニコチニア・タバクムの 栽培品種であるキサンチ・エヌエヌ（Ｎ、　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ、　Ｘａｎｔ ｈｉ　ｎｎ）はＴＭＶ−感受性全軍宿主として、ニコチニア・タバクムの栽培品 種キサンチ・エヌエシー（Ｎ、　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ、Ｘａｎｔｈｉ　ｎｃ） は局所病変宿生として使用した。植物は、２４時間中１４時開明サイクルの２４ ℃の温室または成育室で維持した。

実施例２ ５４に遺伝子のクローニング ＴＭＶ５４に遺伝子のクローンは、ＴＭＶＲＮＡ配列の４９０６から４９２３番 の塩基残基に相捕的な配列の５゛末端に結合したＢａｍＨ１部位を含む２２塩基 オリゴヌクレオチドプライマーを用いて得た。１本鎖ＤＮＡはＭ−ＭＬＶ逆転写 酵素により製造し、逆転写酵素およびクレノーでルーブーバック合成により引き 続いて処理することにより２本鎖を作った（ティー・マニティスら、モレキュラ ー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル（コールド・スプリング・ハ ーバ−、ニューヨーク）（１９８２年）参照）。２本鎖ｃＤＮＡはＢａｍＨｌで 消化し、Ｍ１３＋ｐ１８のＢａｍＨ１部位に連結した。調べられたクローンはプ ライマーによってもたらされたＢａｍＨ１部位を欠失していた。これは５４に終 了コドンの欠失および５４に蛋白のＣ−末端での５個のアミノ酸による伸長をも たらしている。挿入５４にはＨａｅｌｌで消化して除き、クレノーで処理して３ ′の突き出た部分を平滑末端にし、最後にＰ　ｓｔｌで消化した。挿入部はＰ　 ｓｔｌ／　Ｓ　ｍａｌ消化したｐＢＳ　（−）１ｍ連結し、ＴＭＶ　ＲＮＡ配列 の３４７２から４９１６のヌクレオチド残基由来のＴＭＶ配列を含むプラスミド ｐＲＴＴ−１が得られた。挿入部の配向は、第１図に示したようにＴ７プロモー ター由来の転写が（＋）センス転写物を生成する方向である。

ｐＲＴＴ−１に挿入されたＴＭＶ５４に配列は、Ｈｉｎｄｌｌおよび５ａｃｌで 消化して除き、クレノーで処理し平滑末端を作り、ｐＭＯＮ３１６のＳｍａｌｉ またはＸｈ。

１部位に連結した（ニス・ジー・ロジャースら、メソッズ・イン・エンザイムノ ロジー、１１８巻、６２７頁（１９８６年）参照）。ｐＭＯＮ３１６は、独特の Ｘｈｏ１部位を、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモータ ーおよびツバリンシンターゼ３゛−非翻訳部の間に存在するポリリンカ一部位に 含む。Ｓ　ｍａ１部位がポリリンカー領域およびｐＭＯＮ３１６のＴｉプラスミ ド相同領域内に含まれる。プラスミドＩ）ＴＳ５４１ＡはＴＭＶ配列をＳ鳳ａ１ 部位へ挿入することにより発生させ、これはツバリンシンターゼ３′−非翻訳部 位およびＴｌ相同部位の一部の欠失をもたらす。５４に配列をπシスまたは°ｒ レンチンス配向に含むクローンを同定分離した。各構築物は二親交配系によりｐ ＴｉＢ５Ｓ−３Ｅをもツアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｃｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｉｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３３ｉ（アーチ・ティー・フラ レーら、ビオ／テクノロジー、３巻、６２９頁（］、、　９８５年）参照）に移 送し、接合物はカナマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性により選択 した。

１８３に遺伝子配列の３′末端の４９００６から４９２３のヌクレオチド残基に 相補的な２２塩基プライマーを用いて合成したＴＭＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡク ローンにより、図１に示されるようにヌクレオチド４９１６で終了している５゛ 末端の追加的な２３個のヌクレオチドを有する５４Ｋ　ｃＤＮＡを合成した。

無傷の翻訳可能領域の存在がＴ７転写ベクター中へのＴＭＶ配列の挿入によって 証明された。Ｔ７転写物は網状赤血球溶解物系で合成され翻訳された。インビト ロの翻訳では、所望の５４に生成物が生成し、これは３４９５位のＡＵＧが開始 コドンとして機能しており、４９１９位のＵＡＡコドンは終止コドンとして機能 していることを立証するものである。生成物は５４に抗血清を用いる免疫沈降に よって所望の５４に蛋白質であることが証明された。

５４にコード化配列は、植物発現ベクターｐＭＯＮ３１６中にサブクローンした 。これには第２図に示されるようにＣａＭｖ３５Ｓプロモーターが先行し、バリ ンシンターゼ３′非翻訳領域が後続している。この構築物は最後にアグロバクテ リウム・ツメフェンシス−仲介葉ディスク形質転換によりタバコ植物中に転換さ れた。形質転換体はカナマイシン耐性およびツバリンシンターゼの産生に基づい て選択した。４種の転換植物はｐＴｓ５４１を用いて製造し、他の４種は３゛ツ バリンシンターゼ非翻訳領域および５４に翻訳可能領域の直ぐ下流にあるＴｉ相 同領域を欠いているｐＴｓ５４１Ａを用いて製造した。この欠損は植物ゲノム中 へのキメラＴＭＶ５４に遺伝子配列の組み込みをを阻害しない。後代種子をそれ ぞれ自己受精させた植物から集めた。さらに、植物を５４にアンチセンスＲＮＡ を生成させるキノ５フ ンス形質転換体を選択し、成熟植物中に再生させた。

実施例３ 植物形質転換 殺菌したＴＭＶ感受性ニコチアナ・タバクム（ｖ，キサンチｎｎ葉の切片をＴＭ Ｖ　５４にコード化配列を含むアグロバクテリウム・ツメフェンシスｃｖ３１１ １変種により、ホルシュ［サイエンス２２７　：１２２９　（１９８５）コに記 載と同様にして形質転換した。形質転換されたカリ（ｃａｌｌｉ）は３００μｇ ／ｍｌの濃度のカナマイシンで補足した再生培地上で選択した。耐性カリを誘導 し、新芽および根を再生させ、土壌に移し、温室で育成した。

実施例４ 核酸分析 ＤＮＡをムレおよびトムフラン修正法［ヌクレイツク・アシッド・リサーチ］８ 　：４３２１　（１９８０）参照コにより植物の葉から分離した。ＤＮＡを制限 酵素で消化し、１．０％アガロース・ゲル中で分離させ、ナイロン膜に移し、Ｔ ＭＶ　５４に配列に特異的な３！Ｐ−標識プローブとハイブリッド形成させた。

ＲＮＡを葉組織から分離し、全てのＲＮＡをホルムアルデヒドを含む１．２％ア ガロース・ゲルで分離し、ニトロセルローズ濾紙に移した。プロットを５４にコ ード化配列に組補的な！！ｐ−標識ブ標識プローブブリッド形成させた。

６種の独立して形質転換させた植物をキメラ遺伝子の発現につき分析した。ゲノ ムＤＮＡを、形質転換および非形質転換Ｎ．タバクムＣＶキサンチｎｎから分離 した。ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物を３２ｐ−標識ＴＭＶ５４に配列特異的 プローブとハイブリッド形成させた。３．Ｏｋｂフラグメントとのハイブリッド 形成は完全な長さの５４にコード化配列の存在を証明した。５４に配列の挿入は １。

４４ｋｂであり、別の１．５９ｋｂはフランキングベクターＤＮＡによるもので ある。５４に蛋白質遺伝子の複製体数は、異なるトランスジェニック植物間で２ 倍体ゲノム１個当たり複写体１〜５個で変化する。５４に配列の複写体は非形質 転換植物には検出されず、５４に配列の挿入を欠＜ｐＭＯＮ３１６で形質転換さ れた植物中にも検出されなかった。

形質転換植物から抽出されたＴＭＶ５４に転写物はＲＮＡにつきノザーン分析で も試験した。１．６ｋｂキメラＭＲＮＡの推定の長さは各トランスジェニック植 物から、全長ＲＮＡ中に同定された。３゛ツバリンシンターゼ非翻訳領域および Ｔｉ相同領域を欠く組み込みプラスミドを含む植物も１．６ｋｂ転写物を合成し た。さらに、通常ｎｏｓ３’配列による停止配列の欠如に由来すると思われるよ り大きい転写物が合成された。全ての植物により小さい未確認転写物が検出され た。このベクターのみを有する転写植物は、５４に配列プローブとハイブリッド 形成する転写物を産生じない。

また、トランスジェニック植物を実施例ＩＶに従ってＴＭＶ５４に蛋白質の発現 につき分析した。記載したウェスターンプロットまたは免疫沈降法を用いて分析 すると、５４に蛋白質は５４にトランスジェニック植物、または５４にトランス ジェニック植物または対照からは検出されなかった。

実施例５ 免疫学的分析 ５４に蛋白に対する抗血清は、５４に蛋白の中間部位、特に１６４から」−７９ アミノ酸残基を発現する合成ペプチドをウサギに注射することより作った。５４ に７７転写物のインビトロでの翻訳による生成物は、合成ポリペプチドに対する 抗血清で免疫沈降可能であった。ウェスタン・プロッティング法では、形質転換 および非形質転換植物の総抽出物は、５０ｍＭトリス・ＨＣＩ、ＤＨ７．５、】 ％ＳＤＳ，１０ｍＭ　２−メルカプトエタノール緩衝液中で葉のサンプルをホモ ジナイズし、その電気泳動を１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で行 ない、そしてニトロセルロース濾紙へ移すことにより調製した。濾紙を特異抗体 と共に最初にインキュベーションし、続いて、金および結合抗ウサギ抗体および 銀増感を行った。

５４に蛋白の研究実験中、１−２ｘ５０議鳳ＴＭＶ−感染トウルキッシュ・サム サンタバコ葉片をｌｌＩｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有１０ｍＭ　ＫＨ，Ｐ Ｏ４中ｌＯμＣ１１０ｉ１の濃度の３５５−メチオニンで真空浸透した。これを ２０時間２５℃でほの暗い光の中でインキュベーションした。プロトプラストも ａｓ３−メチオニンでラベルした。これらはニコチアナ・タバクム栽培品種であ るキサンチ・エヌエヌ（Ｎｉｋｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕＩＩｖｓ　Ｘａｎｔ ｈｉ　ＮＮ）葉から製造した。プロトプラスト（５から１０ｇＣ１／ａｌの３５ ５−メチオニン／ｍｌを含むもの約１５　０　０　０　０／ｍｌ）を２５℃、４ ０時間光の中でインキュベーションした。これらをそれから低速遠心により回収 し、２ｍＭ　ＥＤＴＡ％０．５％ＳＤＳ，０．２％β−メルカプトエタノールお よび１０ｐｇ／ｍ＋フェニルメチルスルホニルフロリドをプロテアーゼ阻害剤と して含む２０ｍＭトリス・ＨＣＩ緩衝液ｐＨ７−５中で溶解した。葉片は同様の 溶液から乳鉢中へ抽出したが、そのうち１個は阻害剤を含まなかった。

抽出物は、微量遠心機で遠心し、上清について５４に蛋白を測定した。５４に蛋 白の存在はラベルした葉またはプロトプラストの抽出物を抗血清と共にインキュ ベーションすることにより測定した。免疫沈降、ポリアクリルアミドゲル、およ びオートラジオグラフィーもまた行った。

抗血清は、５４に遺伝子転写によるイン・ビトロ翻訳産物により非常に活性化で あること、および５４に蛋白の製造に必要なＲＮＡを含むタバコ・モザイクウィ ルスから調製されたＲＮＡのイン・ビトロでの翻訳による産物から５４に蛋白を 容易に沈降できることが確認された。

実施例６ 形質転換植物の接種 自家受精した形質転換植物からのＲＩ実生は通常通り、研磨剤として添加したセ ライト１と５０ｍＭリン酸緩衝液１）Ｈ７．２　１ｍ１当たり１００ｇｇと、Ｔ ＭＶ−Ｕ，と共に、またはｐＨ８．６の５０ｍＭトリス・リン酸緩衝液中の濃度 ３００μｇ／−１であるＴＭＶ−Ｕ＋ＲＮＡと共に接種した。それぞれの植物の ２枚の葉に接種した。接種物の容量は、充分に広がるのに足りる量がある限り接 種物濃度が決定的要件であるので、標準化しなかった。続いての実験では、葉に 誘導される明るい黄色の症状がある結果として簡単に測定できる近緑ＴＭＶ変異 株−変真株ｂ６を、エフ・ガルンアーアレナルらがピロロジー、１３２巻、１３ １頁（１９８４年）記載のように使った。植物は、症状の程度を視覚的ＩＩ！寮 によって毎日測定した。いくつかの例では、接種植物中のウィルスの存在は、Ｔ ＭＶでラベルしたｃＤＮＡで葉抽出物を謂査することによって測定した。

ＴＭＶによる感染に対する遺伝子導入植物の感受性を決定するための第１の実験 ｌ二おいて、植物に５０μｇＴＭＶ−Ｕ　ｌ／ｍ１を接種した。５４にコード化 配列を含む８Ｎの独立して形質転換された植物それぞれから４４１の挿木苗、ベ クターのみで形質転換された対照および数個の非形質転換キサンチｎｎ変異株に 接種した。

植物は温室で維持し、病徴の発達について毎日監視した。接種後５日目に、形質 転換された植物が病徴の発達を示さないのに対して、遺伝子導入対照および非形 質転換対照は明らかに特徴的モザイク徴候を発達させた。実験が終了した接種後 ４８８日目遺伝子導入植物における症候の発達はなかった。これらの植物の接種 した葉と上方の葉のホモジネートを局所損傷宿主、エフ・タバクム・シービー・ キサンチ・エフシへに接種して、無徴候の感染が存在するかどうかを決定した。

局所損傷はなき、それらの植物中における検知可能なウィルスの不存在を示した 。

すべての再産生された植物が完全ｐＭＯＮ３１６ベクタ・−１またはｎｏｓ　３ 　’未翻訳領域およびＴｉ相同領域が欠けているｐ４ｓ５４１Ａへ挿入されたＴ ＭＶ配列を有するｐＴｓ５４１で形質転換されたかどうかにかかわらず、それら はＴＭＶに耐性であった。５４にアンチセンスＲＮＡの合成をもたらす方向でキ メラ遺伝子で形質転換された植物はＴＭＶでの感染に耐性でなかった。しかしな がら、それらの植物は、ベクター形質転換対照と比較して系の発達において遅滞 を示した。

これは単に徴候の発達にすぎないので、それらの植物はさらに試験しなかった。

自家受精遺伝子導入植物から後代実生苗は、耐性現象の遺伝性についてもまた分 析した。Ｒ１世代種子をカナマイシン３００　ｘｇ／ｍｌを含む組織培養培地で 発芽された。カナマイシン感受性実生苗は黄白化しており、子葉期以上には成長 しない。カナマイシン耐性を発現する実生苗のカナマイシン感受性の実生苗に対 する分離比は、元の形質転換体の各々において、ＮＰＴＩＩ遺伝子は多重遺伝子 座でとり込まれたことを示す。自家受精遺伝子導入植物からの種子はカナマイシ ン３００μｇ／ｗｌを含む培地で発芽させたとき、実生苗の９５％は、カナマイ シン耐性のものとして発現し、５％は黄白化する。遺伝子導入実生苗は１００１ １ｇ／ｍＬの濃度でＴＭＶ−ＴＪＩを接種したとき、それらの植物の２４％は病 徴を発達し、他方残りの７６％は、ウィルス感染への耐性を表した。即ち、ＴＭ Ｖへの耐性は約３．１（耐性：妃受性）比で分離し、一方実生苗はカナマイシン への耐性について約１９＝１の比で分離された。多数のカンマイシン耐性「エス ケーピー」の存在はこれをとり込まれたキメラ遺伝子の発現に対して信頼できな い後代実生苗のスクリーニング方法とする。すべての後続感染実験は５４１Ａ１ １系由来Ｒ，ｌ実生苗の分離群で行った。

耐性のレベルの決定の実験において、実生苗にＴＭＶを様々な濃度で接種した。

耐性はＴＭＶ　５００　ｊｇ／ｍｌまでの濃度で観察した。耐性植物は徴候のそ の後の発達なしに、接種後３０日間維持された。葉ザンブルを接種された植物か ら取り出し、ウィルスの複製およびウィルスの広がりについて分析した。葉サン プルの抽出物は、精製ＴＭＶ　ＲＮＡから製造されたｃＤＮＡでプローブした。

ウィルスは耐性を表す植物の接種した葉中にも全素中にも検出され得なかったの で、耐性植物ではウィルスの複製がないことおよび耐性は完全であり、植物の全 体にウィルスの無症候性拡散をもたらす徴候の発達の抑制がないことを示した。

ＴＭＶ配列のないベクターのみを含む遺伝子導入植物および非形質転換植物を対 照として使用したが、ウィルスは対照植物の両方のタイプ、並びに徴候を発達さ せた後代分離系中に容易に検出され得た。

形質転換植物のウィルス感染に対する抵抗の最終的な評価として、いくつかの植 物を、５４に誘導ＴＭＶ抵抗性が温度感受性かどうか見るために、３１℃に維持 した生育器に接種直後に移した。５４に遺伝子配列を持っている７つの接種した 植物のうち５つは、３１℃で症候を認めなかったが、対照植物は全部２４℃に保 ったものに典型的な症候を示した。

結論として、前述したものはウィルスのＮプレカーゼ部位に結合したウィルスゲ ノムのコード化配列部分を含む形質転換植物は、はじめに獲得した断片が由来す るウィルスによる感染への抵抗性を有するとの本発明の新規な特徴を示す。

ウィルス外殻が導く抵抗性と比較して、多くの利点が本発明に存在する。例えば 、本発明で述べたようなＮプレカーゼ関連コード化配列を用いたウィルス感染に 対する抵抗性は、高濃度の接種物を使用したときに壊れてしまう蛋白誘導性抵抗 性のように“壊れ易い“物ではない。逆に本発明では、高濃度のウィルスまたは ウィルスＲＮＡで試してみて完全な抵抗性が観察される。ＴＭＶおよびＡＩＭＶ のコート蛋白により伝達される保護はウィルスＲＮＡの接種が打ち勝つことがで きるが、一方５４にコード配列を利用した本発明による抵抗性はウィルスＲＮＡ で試したときも損なわれなかった。５４に形質転換植物による抵抗性のレベルは 発現のレベルによるものとは思われない。すなわち遺伝子配列の１つのコピーの みを持つ植物が、ウィルスまたはウィルスＲＮＡに対して抵抗性の減少を示さな かった。ＴＭＶコート蛋白の１つのコピーはまた植物の保護に充分である一方Ａ ｉＭＶコート蛋白はそうではない。

このように、我々が、我々の発明の好ましい態様を説明し述べたが、本発明は変 化および修飾できることが理解されるべきで、それゆえ我々は、述べである細か い用語により限定を願ったり導いたりするものでなく、種々の用途および条件に 本発明を適応させる事が可能な我々に役立つ変化や修飾を望み導いている。従っ て、このような変化および修飾は均等物の範囲の内にあるように適切に導かれる 特性であり、それゆえ以下の請求の範囲の範囲内である。前述の詳述で使用した 用途および表現は説明のためのものであり、限定をするものではなく、それゆえ このような用語および表現を使用する際、示し述べである特色、またはその一部 の均等物を除外する意図はなく、本発明の範囲は以下の請求の範囲でのみ定義さ れ限定されることを認識すべきである。

例えば、このような修飾中には、上記の実施例で詳述した以外の植物形質転換ベ クターの代用がある。例えば、代替または均等範囲内にあるベクターは、とりわ けｐＢＩＮ１９、ｐＢｌ　１０１．ｐＲｏｋｌ、ｐＡＧｓ１３５、ｐＡＲＣ１２ 、ＰＧＡ４７０、ｐＲＡＬ３９４０およびｐｃＴＩＴ３のようなものである。

本発明はＴＭＶで説明されているが、ゲノム内のウィルスレブリカーゼ部位をも 含むキュウリモザイク、アルファルファモザイク、ポテクスウィルスの仲間、ブ ロモウィルス、ポチウィルスおよびルテオウィルスの属もまた本発明に、これら のウィルスのＮプレカーゼ部位に関する遺伝子配列で形質転換される宿生細胞と して含有される。ある植物および動物ＲＮＡウィルスの間の類似性を含めて、多 くの“無関係な′植物ウィルスのＲＮＡＮプレカーゼ（ポリメラーゼ）部位の間 に配列の類似性が存在することが知られているので（例えば、エフ・ハビリら、 ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、］７７巻９５４３頁（１９８９年）参照） 、これらの特性は均等とみなされ、それゆえ本発明の範囲に包含される。

このように完全、明確、簡潔に正確な用語で我々の発明および作り方および使用 の手順および過程を述べであるので、これを用いて関係ある当業者または最近接 分野の業者は本発明品を作り使用することが可能である。

第１図 要約書 この発明は、ゲノムのレプリカーゼ部分と結合したウィルスゲノムのフラグメン トを宿主に導入することによりウィルス抵抗性を植物宿主に伝達する新規方法に 関するものである。

国際調査報告 Ａｒｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　ＰＣＴＴｅｌｅｐｈｏｎｅ　Ｍｅｍｏｒａｎｄｕ ｍ　ｆｏｒ　ＰＣＴ／ＵＳ９１バ■６３１Ｇｒｏｕｐ　１．　ｃｌｉｍｓ　ト２ 　ａｎｄ　４−６．　ｄｒａｖｎ　ｔｏ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　ｐｌｍ ｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉモ■ ＶｅＣｔＯｒＳ、　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ＣｍＶｅｙｒｅｓｉｌｔｌｌｌｌｃ！ 、　１ｆｌｄ　ｔｒｕ＠ｆｃＫｍｅｄ　ｐｌａｎｔｓ　ａｎп@！ｅｅｄｓ Ｇｒｏｕｐ　Ｉｌ、　ｃｌＵｍ　３．　ｄｒｉｖｎ　ｌｏ　ｍ　５４　ｋＤ　ｐ ｒｏｔｅｉｎＩｎｖｅｎｔｉｏｎｓ　Ｉ　ａｎｄ　ＩＩ　ａｒｅ　ｒｅｌａｔｅ ｄ　ａｓ　ｍｕｔｕａｊｊｙ　ｅｘｄｕｓｉｖｅ　５−ｅｓ　１ｎｉｎｔ＠ｒｍ ＠ｄｉｓｔｅ（ｉｎａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｒｅｌｓ＋ｔｉｏｎｓ石ｐ、　Ｄｉ ｓｔｉｎｃｔｎｅｓｓ　ｉｓ　ｐｒｏｖｅｎ　窒盾煤@ｄａｊｍｓ　１ｎ ｔｈｉｓ　ｒｅｌ＠ｔｉｃｙｎｓｈｉｐηｌｈｅ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　 ｐｒｏｄｕｃＬ　ｉｓ　ｕｓｅｆｕ口ａｍ吐ｅ　ｏｔｈｅｒ@ｔｈａｎ　ｔｈｅ ｆｉｎａｌ　ｐｒｏｄｕｃｅ、　ａｎｄ　ｔｈｅ　５ｐｅｃ１ｅｓ　ｓｒｅ　ｐ ｉｔｅｎｔａｂｉｙ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ。

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Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．（１）ウイルスゲノムのレプリカーゼ部分と結合したウイルスＲＮＡフラグ メントを除去し、（２）細胞が挿入フラグメントで形質転換されるように上部除 去したフラグメントを宿主細胞に挿入し、（３）宿主細胞を増殖させ、分化させ て成熟借主にすることを含む、ＲＮＡウイルスに対する抵抗性を宿主に伝達する 方法。
2. ２．【配列があります】 〔但し、数値はＴＭＶゲノム中の配列位置を示す〕である、タバコモザイクウイ ルスゲノムのＩ１サプゲノムＲＮＡ配列。
3. ３．請求項２記載の配列により翻訳される５４Ｋ蛋白。
4. ４．ウイルスゲノムのレプリカーゼ部分と結合したＲＮＡまたはＤＮＡウイルス ゲノムのフラグメントを含む、形質転換植物。
5. ５．ＲＮＡウイルスゲノムのレプリカーゼ部分と結合したＲＮＡウイルスゲノム のフラグメントを含む、形質転換植物の種子。
6. ６．ＲＮＡウイルスゲノムのレプリカーゼ部分と結合したＲＮＡウイルスゲノム の配列のフラグメントを含む、植物発現ベクター。