JPS60214797A - 新規な心房ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は有用なす）　ＩＪウム排排泄推進活性有する新
規の心房ペゾチＰに関する。

哺乳動物の心房の筋肉は無数の膜結合針＃顆粒を含有す
ることは公知である。ラット、犬、猫そしてヒトの心房
に観察されるこれらの特徴的な分泌顆粒は、ペプチドホ
ルモン産生細胞中のものとイリている。（たとえばＤｅ
Ｂｏｌｄら、Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、第２６巻、　１０９４−１１０２頁
（１９７８年）参照）。心房の筋肉の粗紹織抽出物を非
利尿ラットに静注すると、急速に強力なナトリウム排泄
亢進反応が起きたと報告されている（たとえばＤｅＢｏ
ｌｄら、Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、９２８巻、８９
−９４頁（１９８１年）参照）。短時間の煮沸工程とセ
ファデックス０による分画によりラットの心房ホモジエ
ネートの部分精製がＴｒ　１ｐｐｏｄｏらにより行なわ
れた［　Ｔｒｉｐｐｏｄｏら、　Ｐｒｏｃ、　ＳＯＣ。

Ｋｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍａｄ、　ＩＫ　１７０巻、５
０２−５０８頁（１９８２年）〕。これらの研究者たち
は総分子量３．６００−４４．０００１−”ルトンの範
囲に、そして３６．０００−４４．０００ドルトンの高
分子量節回と３，６００−５．５００ドルトンの低分子
量画分のところにナトリウム排泄活性を見出した。

最近の文献（Ｆｅａ、　ｐｒｏｃ、　第４２巻（３）、
抄録１８７０．６１１頁（１９８３年）〕でＤｅＢｏｌ
ｄらは、彼らが”　ｃａｒｄｉｏｎａｔｒｉｎ　■”と
名づけだ分子量。

５１５０ドルトンで４７個のアミノ酸の配列を有する心
房ナトリウム排泄亢進ペプチドの精製について報告して
いる。高速液体クロマトグラフィー法（ｎｐＬｃ　）に
よりナトリウム排泄亢進活性を有するさらに６つのピー
クが得られた。

さらにあとの文献［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ｒｅｓ。

Ｏｏｍｍ、第１１６巻（２）、６９６−７０３頁、１０
月６１日号、１９８６年）でＧｒａｍｍｅｒらは、分子
量が約６８００で６６個のアミノ酸残基な含有するラッ
トの心房す）　ｌ）ラム排泄充進因子の部分精製につい
て記載している。

ラットの心房抽出液は低分子量画分（＜、１０，０００
ドルトン）と高分子量画分（２０，，０００−５０，０
００ｒルトン）に分画され、いずれの画分も１ｎｖｉｔ
ｒｏで平滑筋を弛緩させ、ラットに静脈内投与すると強
力なナトリウム排泄先進作用があった［　Ｃ！ｕｒｒｉ
ｅら、５ｃｉｅｎｃｅ　、　！”　２２１巻、７１−７
９貞（１９８３年）参照）。

３、発明の詳細な説明 本発明は有用なナトリウム排泄亢進活性を示す新規なペ
プチドを供する。これらの生物活性を有１−るペプチド
は以下のアミノ酸配列のペプチド、又はその生理学的に
許容される塩、エステル又はアミドである： Ｒ１−Ｃ’ｆＢ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｇ；−
ｉｌ　ｅ−ａｓ　ｐ−ａｒｇ−１１ｅ−ｇ：ＬＹ−ａ　
ｌａ−ｇｌｎ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−１ｅｕ−ｇｌｙ−Ｃｙ
ｓ−ａｓｎ−Ｒ２Ｃ式中、Ｒ１”　Ｈ、ｓｅｒ　％５ｅ
ｒ−８ｅｒ　％汐びＲ２＝’ＯＨ、’　Ｓｅｒ　％ｓｅ
ｒ−ｐｈｅ−ａｒｇ　、Ｓｅｒ−ｐｈｅ−ａｒｇ−ｔｙ
ｒ　）。

このペプチドの柩造式の中でアミノ酸は普通用いられる
以下の略号で示しである。

アミノ酸　略　号 Ｌ−アラニン　ａｌａ Ｌ−アルギニン　ａｒｇ Ｌ−アスパラギン　ａｓｎ Ｌ−アスパラギン酸　ａｓｐ Ｌ−システィン　ｃｙｓ Ｌ−グルタミン　ｇｌｎ グリシン　ｇｌｙ Ｌ−イソロイシン　ｉｌｅ 万一ロイシン　１ｅｕ Ｌ−メチオニン　ｎｅｔ Ｌ−フェニルアラニン　ｐｈｅ Ｌ−プロリン　ｐｒ。

Ｌ−セリン　５ｅｒ Ｌ−チロシン　ｔｙｒ 本発明のベプチ−はこれを入手したラットの心筋にはも
ともと存在しなかったきわめて純粋な形で単離した。ｊ
なわちそれらは基本的に他のペプチドや細胞性物伸そし
て組ｌｌＸ物質を言まない形で調製された。これらの新
規な心房ペプチドは、細胞容量、す）　ＩＪＪウムび血
管抵抗性調節のための体ｔＬ注物質に関する心房の内分
泌系の研究において医学上の重要性を示鴨する生理学的
特質を示す。

特に本発明の新規なペプチＩＳはネ１１尿剤、ナトリウ
ム排泄光進剤、腎抽管拡張剤及び＋滑動弛緩剤として治
療に利用できることを示している。すなわちこれらのペ
プチドはナトリウム、尿量、腎面管拡張及び平滑筋の緊
張に多大の影響を与える。

簡単にいうと、これら新規なペプチドはラットの心房抽
出液のデル濾赤クロマトグラフィーによる分画によって
得られ、高分子量画分と低分子量画分を与え、そのいず
れもがナトリウム排泄活性を有している。低分子量ピー
クはす）　ＩＪウム排排泄推進活性有するピークと、賜
（ヒヨコの直腸）の筋肉片のみ優先的に弛緩させるか又
は血管（ウサギの大動脈）及び−の平滑筋調製物を弛緩
させるピークの２つのピークに分解された。この−平滑
筋弛緩物質は逆相高速液体クロマトグラフイー（ＨＰＬ
（！　）により４つのピークに分けられ、単一ピークに
なるまで精製した。配列解析によりこのセリン及びグリ
シンに富むペプチＰの構造が確立し、この４つの生物活
性を有するペプチドはそれぞれアミン末端とＣ床端の第
１Ｔｉ目と第２査目のセリンが欠如している点で互いに
異なることが証明された。このアミノ酸が２１個のペプ
チドをア）　ＩＪオペゾチンＩ（ａｔｒｉｏｐｅｐｔｉ
ｎ　Ｉ）と名づけ、腸切片を弛緩させす）　Ｉ）ラム排
泄先進作用及び抗利尿作用のあったが血管片に対して効
果のなかった他の６個のピークをそれぞれｄｅｓ−ｓｅ
ｒｌ−アトリオペプチンｉ　、ｄｅｓ−ｓｅｒｌ、　５
ｅｒ２−アトリオペゾチン■そしてａｅｓ−ｓｅｒ２１
−アトリオベプチンＩと名づけた。

同様にす）　ＩＪウム排泄充亢進抗利尿作用がより強力
であった血管平滑筋弛緩物軍はＨＰＬＣで２つの大きな
ピークに分かれた。意外なことにこの２つのウサギの動
脈弛緩物質のアミノ末端の２１個のアミノ酸は腸弛緩物
質と同じであったが、アミノ酸２６個のペプチド（アト
リオペゾチン■と命名）はｐｈｅ−ａｒｇを有し、アミ
ノ酸２４個のペプチド（アトリオペデチン■と命名）は
カルボキシ末端がｐｈｅ−ａｒｇ−ｔｙｒでのびていた
。この密接に関連したペプチドの群は伸側の高分子量前
駆体に由来てると考えられ、小さい方のペプチドの生物
学的選択性と活性は、限定的連続的な蛋白分解作用によ
り決まるのかもしれない。

短かい方のアばノ酸２１個のペプチド（アトリオペフ０
チン　Ｉ）と命名）は腸平滑筋を弛緩するが血管の平滑
筋を弛緩させず、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）でナト
リウム排泄亢進作用及び利尿作用がある。

２贅目のペプチド（ア）　ＩＪオペデチン■）は２６個
のアミノ酸を有しており、すなわち２１個のアミノ酸か
同じでＣ−末端にｐｈａ−ａｒｇがのびており、その結
果血管及び腸平滑筋を弛緩させると共にインビボで強力
なす）　ＩＪウム排泄先進−利尿作用のある物情が得ら
れる。

３、発明の詳細な説明 不発明は図面と共に示した好適な災施寒碌の詳細な説明
によりより一層坤解できる。

図１は本発明の態様中の新規な心房ペプチドの腸平滑筋
弛緩活性（ヒヨコの直腸弛緩、闘）の比較をグラフに示
したものである。

図２は別の態様における新規な心房ペプチドの血管平滑
筋の弛緩（ウサギの大動脈弛緩、闘）活性の比較をグラ
フにしたものである。

本発明のペラ０チドはもともと凍結したラットの心臓よ
り単離した。２５００個のラットの心臓から一連の工程
により目的のペプチドを単離した。

この単離工程を簡単に示すと下記の様になる：（ａｔ咄
乳動物の心房組織の粗ホモジエネートを調製し遠心分離
する、 （ｂ）上澄液を煮泗し遠心分離する。

（ｃｌセファデックス■Ｇ　−１５４ｉ１ｉ脂を用いる
ゲル滌過クロマトグラフィーにより上澄液の脱塩を行な
う、 （ｄｉセファデックス■Ｇ−７５Ｔｈ脂を用いて蛋白画
分のゲル濾過クロマトグラフィーを行なう。

（ｅｌｓＦ−セファデックス■−Ｃ−２５位１月Ｖを用
いて低分子量蛋白画分のイオン又侯クロマトグラフィー
を行なう、 （ｆ）２つの主要な蛋白画分の高速液体クロマトグラフ
ィーを行なう。

ｆｇ１分Ｍした心房ペプチＶ画分を回収する。

上記のセファデックスクロマトグラフィー樹脂は公知の
′４！／Ｊ質でありファルマシアファインケｉカルズ社
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
　）（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　、　ＮＪ　）より入手で
きる。

単離したベラ０チドリバイオアツセイはウサギの大動脈
片とヒヨコの直腸の切片を用いて生理学的に許容される
条件下で実施した。ノルエピネフリンを連続的に注入し
て緊張を維持させたウサギの大動脈切片は、信頼性の高
い感度の良い定量用組社であった。しかしカルバコール
（ムリカリン剤のひとつ）で収縮させた単離したヒヨコ
の１０腸調製物を使用１−ると迅速簡便に測定でき、大
忙の試料の試験が可能であった。

単一にしたペプチドのナトリウム排泄亢進活性は。

ラットに静注し尿中のナトリウムの割合に対する効゛呆
を演１定することによりめた。

本発明者らの研究グループが開発した生物活性の測定方
法（平滑筋弛緩とす）　＋１ウム排泄元進）は０ｕｒｒ
ｉｅらの５ｃｉｅｎｃｅ　ｉＥ　２２１巻、７１−７３
頁（１９８３年）に記載されている。

以下の実施例により本発明を説明するが、これらは決し
て本発明を限定するものではない。下記の例においてＯ
ＲＦはヒヨコの直腸因子でありＲＡＦはウサギの大動脈
因子を意味する。

実施例１ 方法 胸部大動脈のらせん形の切片とヒヨコの直腸切片を酸素
を供給したＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液（６７
°Ｃ）で１０ｍ１／分で潅流した。安静時の緊張は２Ｘ
１０−８Ｍノルエピネフリン（大動脈）か又は２　Ｘ　
１０−８Ｍカルバコール（Ｗ腸）で誘導したう試験物質
の効果は組織の上を流れている培地にマイクロピペット
で添加して、ニトログリセリン（大動脈）とイソゾロテ
レノール（［１１りを標準物質として用いて測定した。

カラムの画分は凍結乾燥し、残りはバイオアッセイ用＋
ｃ　＋７ン酸緩衝化生理食塩水に溶解した。

ナトリウム排泄先進　抽出液のナトリウム排泄冗進茫性
は２５０−３０ＯＮのオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌ
ｅｙラットをシアル−ウレタンで麻酔をかけて測定した
。採尿用に恥骨上シラスティック膀胱カテーテルを取り
つけ、５％デキストロース溶液中０．２２５％のＮａ（
Ｊ溶液を６８μｌ／分で潅流するために尾静脈カテーテ
ルを使用した。１時間の平衡化時１）１１の後に、１０
分間の基勤尿採取を２回行ない次に試験物質を急速に注
入し、さらに１ｏ分間の採尿を６回行なった。１時間の
再平衡化時間の後に試験物質の２回目の注入を行なう第
２回の探線を完了した。軍さを測っておいた容器中で重
さを測定して尿祉をめた。ナトリウム濃度は炎光光度計
で測定した。

２００匹のラットより得た約３０．９ずつの凍結されて
いる心房組織を１クオートのＷａｒｉｎｇデレンダー中
でリン酸緩衝化生理食塩水で組織重量に対し１０倍容量
になるように分散させた（１分）後、Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ
　ＰＴ　２０　ＳＴで最高速度で（２０秒）作拌しホモ
ジエネートを訓製した。浮遊液を２００ＸＩで１０分間
遠心分離した。熱処理（１８Ｘ　１５０ｍｍ試厭管中の
１０ｍ１を沸騰浴に１０分間浸した）の後、この上澄液
を再び１２００　ｏｘｇで１ｏ分間遠心分離した。次に
（氷）酢酸を０．５Ｍになるように上置液に添加し、得
られた浮遊液を最後にもう一度遠心分離（２７０００Ｘ
、！ｉ’で１５分［…）して活溌化させた。上置液をＧ
−１５セフアデツクスカラム（８Ｘ３６ｃｘ）を用いて
、０．５Ｍ酢酸を６０　ＯＮ／時間で流してクロマトグ
ラフィーを行ない、蛋白画分を凍結乾燥して濃縮した。

次に６００匹のラットから取った物情、を会わせて１つ
にして０．５　Ｍの酢酸に彪解し５　Ｘ　９０ｃｍのＧ
−７５セフアデツクスカラムにかけ、０．５Ｍ酢酸を９
６ｍｌ／時間で流して浴出させた。前述の文献［Ｃ！ｕ
ｒｒｉｅら、　Ｅｌｃｉｅｎｃｅ第２２１巻、７１−７
３頁（１９８３年）〕のアッセイ法により２つのピーク
に生物活性が認められた。それらは高分子計画分（２０
，０００−３０，０００）ト低分−１を画分（１０，０
００未ｉ？Ｉりの２つである。

イオン交撲りロマトグラフィー尾より低分子量画分をさ
らにＮＨした。１２００匹のラットより取った物質を合
わせて１つにしたものを２５ｍＭ酢酸アンモニウム／　
５００　ｍＭａｒ？！１２中のＳＰ−セファデックスＣ
−２５（乾燥重量２５ｇ、５×７（′−ｍカラム）にか
けた。酢酸は５００ｍＭに維持し。

流速は９６酎／時間で酢酸アンモニウムが２３．４ｍＭ
／時間で増加する直線濃度勾配によりクロマトグラムを
得た。生物活性は２つの主要画分にのみ児出された。ひ
とつは酢酸アンモニウム１５０　ｍＭで浴出されるＯＲ
Ｆと命名したピークでありヒヨコ直動弛緩因子（ＣＲＦ
　）を含有しており、もうひとつは匪酸アンモニウム２
７０　ｍＭで浴出されるＲＡＦと命名したピークであり
ウサギ大動脈弛抜内子（Ｆ、ＡＦ）を含有していた。両
面分ともナトリウム排泄亢進宿性が強かった。

最終的な精製工程ではＨＰＬＯを使用し２１５ｎｍでＵ
Ｖ吸収を追跡した。　ＳＰ−セファデックスカラムより
得たＣＲ７画分とＦｔＡＦｔ分は何度も凍結乾燥して揮
発性物質を除去し、０．１％トリフルオロ酢酸に再溶解
し、次にＢｒｏｗｎｌｅｅ　ＲＰ−３［］　ＱＡｑｕｏ
ｐｏｒｅカラム（４，６龍Ｘ　２５　ｃＷＬ）を用い１
．０ｍ７／分で下記の濃度勾配でＨＰＬ（！を行なった
。（ＪＦ　：　３．８分かけてＯ→１０％Ａ１次に６０
分かけて１０％Ａ→１４．８％Ａ、次［１００分かけて
１４．８％Ａ→１６．４％Ａｃ、ＯＲＦ活性を有する６
つのピークが１１３．８分に溶出した。ＲＡＦ　：　３
．６分かけて０→１６％Ａ、次に８０分かけて１６％Ａ
→２２．４％Ａ０ＲＡＦ活性のバンドは４８．８分に溶
出した。すべての場合で溶媒Ａ　＝　０．１％トリフル
オロ酢酸／アセトニトリルであり、Ｂ＝０．１％トリフ
ルオロ酢酸／Ｈ２０である。生物活性を有する画分はＶ
ｙｄａｃカラム（Ｃ１８、孔の大きさ３００Ａ、４．６
順×２５ｃｍ）に再注入し、５０分かける０→５ｏ％Ｃ
の濃度勾配を用いて１．ＯｍＪ／分で溶出させた。

ＯＲ？試料は大きな１つのピーク（０ＲＦ−Ｉ％２９．
６分）と、小さな２つのピーク（０ＦｔＦ−］’ｌ［と
０ＦＦ−ＩＩＩ’　。

２９．５分、２９．７分）に分離した。ＲＡＦ試料は大
きなピーク（ＲＡＰ−Ｉ　、３１．０分）と小さｔｃビ
ーク（ＲＡＦ４．６１．５分）を与えた。生成物は凍結
乾燥し一２０℃で保存すると良好な安定性を示した。

エドマン分解　上記の単離したポリペプチドはＨｕｎｋ
ａ　ｐ　ｉ　１１　ｅ　ｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌ、第９１巻（１）、第６６章、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　、　Ｎ、Ｙ、、１９８６年の方
法により、Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏ
ｄｅｌ　４７０　Ａガスフェーズシークエンサーを用い
て連続的に分解した。いくつか変更した部分は溶媒のひ
とつのベンゼンの使用をやめたこと、そして系の溶媒４
としてメタノールのかわりにア七ト二トリルを用いたこ
とである。さらに使用した変換か媒（試薬４）は２５％
トリフルオロ酢酸（Ｈ２０中Ｖ／、）である。結合時間
は全体で約６００秒に減少させ、分解時間は８５０秒の
ままであった。ＯＲＦ　（収率６６５ピコモル）、還元
／アルキル化（１！ＲＦ　（６００ピコモル）、そして
ＲＡＦ　（１１７８ピコモル）のそれぞれにつき１回分
解を行なう１回の火陥で、このサイクルを３０回以上繰
返した。

フェニルチオヒダントインアミノ酸はＨｕｎｋａｐｉｌ
ｅｒａｎｄ　Ｈｏｃｄ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、　第９１巻（１）％第４６章、　Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　’＋　Ｎ、Ｙ、＋　１９８５年
の方法を応用して亮速液体クロマトグラフィーを用いて
同定した。正統に定量するに値すると考えられるアミノ
酸誘導体について測定した平均的繰返し収率は９１％で
あった。

上記の方法は、１２００匹のラットの心臓の精製に用い
た一連の操作段階を与える。相対的生物活性をめるため
、心房抽出液の弛緩活性を、血管片（ウサギ大動脈）に
対するニトログリセリンの梗遵曲線と、胴切片（ヒヨコ
直＠）に対するイソプロテレノールに対して比較した。

ラットの心房の最初の粗ホモジェネートは汚染がひどく
て総括性がめられなかった。１０分間の煮梯を行なうと
、セファデックスＧ−１５カラムで脱塩する前に多量の
蛋白が除去されるため、精製がはかどった。ゲル濾過カ
ラムより得られた低分子量両分は、穂々の画分の８ン先
的釦、痙活性の差違ＩＣ基づきさらにイオン交伊クロマ
トグラフィーで分離した。

すなわち各画分の１ｏμｌを試験１−ると２゛っのペプ
チドか存在することが証明され、そのうちひとつは腸平
滑筋を優先的に弛緩さ一＋！：、もうひとつは低濃度で
血性切片を優先的に弛緩させた。しかしこの２つのピー
クの死金な用忙応答分析を行なうとヒヨコ面腸弛緩物質
は顕著な選択性を示し、このペプチドは高投与針でも面
前弛緩剤としては無効であった。一方第２のピークは胴
切片及び血管切片のいずれにも濃度依存性弛緩を示した
。Ｐｔ先先達選択性示１−ピーク、すなわちヒヨコ論腸
弛緩物質（これはｉｎ　ｖｉｖｏです）　ＩＩウム排排
泄推進利尿活性を有していた）を１記の如くさらに詳し
く調べた。

ＳＰセファデックスカラムより得られた凍結乾燥ヒヨコ
直腸活性因子（ＯＦＦ　）を逆相（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ０
１８）　ＨＰＬＯで分画した。ＯＦＦは６つの大きな画
分（Ｉ−１１１）に分離した。谷画分を凍結乾燥しＶＹ
ＤＡＯカラム（Ｃ１８，孔）大きさ３００Ａ）を用いて
ＨＰＬＣで再度クロマトグラフィーを竹なった。

コ５Ｌ、テｆｆｉ白！’　６０　ｔｉｌｌ　（ｎ　ＣＲ
Ｆ−■、　２５　μｉのＣ！ＲＦ−■、そして２５μｇ
のＣＲＦ−Ｊ■が得られた。ｃｎＦ−Ｉ　ハ平滑筋弛緩
物質として定量すると濃度依存性弛緩を示したが、あら
かじめ収縮させた大動脈片を弛緩させなかった。Ｃ！Ｒ
Ｆ−Ｉ蛋白を静注すると尿中ナトリウム濃度が増加した
。

精製したＣＲ′Ｆ−■はガスフェーズシーフェンス法で
分析した。実施例１で測定した密接に関連した低分子量
鎮痙性／ナト１１ウム排泄光進性ペプチドの配列を下記
の表１ＶＣ示す。このペプチドには多数のセリンとグリ
シン残基が存在する。０ＲＦ４とａＲＦ−ｎＩはＣ！Ｒ
Ｆ−Ｉに存在する１つ又は２つのセリンが欠如している
のみなので、これらはアミノペゾチダーゼ分解産物であ
ることを示唆している。

０ＲＦ−■及びＩ：！ＩＲＦ−■ともに光分な生物活性
を有しているため、腸すセプターによる貼設はアミノ床
端における欠如について寛容であるようである。

血管平滑筋の後先的弛緩を示したＲＡＩＦ−１と命名し
た″Ｐ＃枦低分子量ペプチドをガスフェーズシークエン
チーターでさらに分析した。言外なことにＲＡＦ−■の
最初の２１個のアミノ酸はＣ！ＲＦ−ｉのアミノ酸と全
く同一であった。ペプチド中の大きな違いはカルボキシ
ル末端にあった。ＲＡＦ−Ｉはｉｎ　ｖｉｔｒｏで強力
な血管平滑筋弛緩剤であり、ｉｎ　ｖｉｖｏで選択的１
゛怖管拡張剤である。ＲＡＦ　−■はまたナトリウム排
泄先進剤としては０ＲＦ−）よりかなり類カンＬようで
ある。Ｃ！ＲＦ−ｉは多忙使用′ｆ６必要があり、ｉｎ
　ｖｉｖｏの応答において変動がある。

表　１ アミノ酸配列 Ｃ！ＲＦ−Ｉ　： Ｓｅｒ　−ｓ　ｅｒ　−Ｃ７ｓ−ｐｈｅ−ｇ−１ｙ−ｇ
　１ｙ−ａｒ　ｇ−１１ｅ−ａｓ　ｐ−ａｒ　ｇ　−ｉ
ｌｅ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｇｌｎ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−１ｅ
ｕ−ｇｌｙ−ｃｙｓ−ａｓｎ−Ｓｅｒ （！ＲＦ−，［：　ｄｅｓ−ｓｅｒｌ−Ｃ！ＲＦ（ＣＲ
Ｆ−１’ｌｌ　：　ｄｅｓ−ｓｅｒｌ、５ｅｒ２−ＯＲ
Ｆ−１ＲＡＦ（： ８ｅｒ−ｓｅｒ−ｃｙｓ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａ
ｒｇ−ｉｌｅ−ａｓｐ−ａｒｇ−ｉｌｅ−ｇｌｙ−ａｌ
ａ−ｇｌｎ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−１ｅｕ−ｇｌｙ−ｃｙｓ
−ａｓｎ−ｓｅｒ２１−ｐｈｅ−ａｒｇ２３ ＲＡＦ−ｉとＣＢＦ−■は電荷（イオン交換クロマトグ
ラフィーによる）と逆相ＨＰ　ＬＯによる易動度により
容易に区別される。これらのペプチドのカルボキシ末端
の配列が生物学的特異性を規定している。

０ＦＩＰ−Ｉはカルボキシ末端が短かくなっているため
その生物活性が一平滑筋の弛緩と弱いすｌ−ＩＪウム排
泄冗進活性に限定される。このペプチｒは通管切片を弛
緩させないし、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて腎抵抗性を低下
させない。一方ＲＡＦ−Ｉの輝−りなったカルボキシ末
端はＪｆｌＩ管リセゾす−認識とナトリウム先進作用と
利尿作用の開始に必要な榊造的特輸と含干、シている。

ＯＲＦとＲＡＦのアミノ末端の２１個のアミノ酸が同一
であ々ことはこれらのペプチドが同一の前駆体ペプチド
に由来することを強く示唆している。少なくとも最初の
２個のセリン残基のアミノベゾチダーゼ分解は生物活性
を大きく低下させることはない。しかしながら、心房ペ
デチーのカルボキシ剖）分の攻馨部位は九終的な生物学
的応答を指令しているようである。この蛋白分解酵素は
これらの鎖部性（ナト１１ウム排泄冗進性）ペプチドの
生理学的作用の理想的な調節ネ１１へ位を与える。

実施例２ 材料と方法 精製の概要 １４００個のラットの凍結心房（Ｂｉｏｔｒｏｌ　。

工ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ工Ｎ）の余分な組織、（１５
５，！ｉ’ｊＶ重量）をに去し、フッ化フェニルメチル
スルフォニル（１ｐ　／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　ｃｏｍｐａｎＶ、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ　、　ＭＯ）の存在下で１０１と量のリン酸
緩衝化生理食地水でホモジナイズし、２５００Ｘ、９で
１０分１Ｂ」遠心分離した。上＆ｍを１０ｍ＃ずつに分
注し、１００°ＣＬ：ｒ）湯浴に１０分曲浸しｔコ後、
１０．０００Ｘ、ｌｉ’、４°Ｃで１０分間爆心分離し
た。

上澄液を０．５Ｍ匪敵になるように調整し、セファデッ
クスＧ−１５カラム（８Ｘ３６鋼）にかけ、０．５Ｍの
酢酸で漂出（６００ｍｌ／時間）させた。

カラム漂出液を凍結乾燥した後０．５　Ｍ酢酸で掬元し
、セフ了デツクスＧ−７５カラム（ｂＸ９０ＣｒｒＬ）
にかけ９６ｍ／／時間で０．５月酢酸で溶出させた。

Ｇ−７５カラムより溶出した凍結乾燥低分子量画分を２
５ｍＭａ’＋−敵アンモニウム／　０．５　Ｍ　６酸中
ＳＰ−セファデックスＣ−２５（２０ｐｒル％５Ｘ７ｍ
カラム）にかけ、０．５Ｍ酢酢酸酸酢酸アンモニウム直
線濃度勾配（９６ｍｌ／時間で２３．４　ｍＭ　／時間
）により溶出させた。生物活性を有する２つの画分が溶
出しｔこ。ひとつは１６０ｍＭで溶出しこれ＋Ｘ腸平滑
筋切片を弛緩させたが、血管平滑筋切片は弛緩させなか
った。もうひとつは２７０　ｍＭで溶出し、これは血管
平滑筋切片及び腸平滑筋切片ともに弛緩させた。低分子
量ピークは凍結乾燥の後、溶媒Ａ（０，１％トリフルオ
ロ酢酸／アセトニトリル）と浴媒Ｂ　（０，１％トリフ
ルオロ酢酸／水）の混合液を１．０７Ｎ／分で用い、　
Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　ＲＰ−３００ａｇｕａｐｏｒｅカラ
ム（４，６醋Ｘ　２５　ｃｕｔ　）を用いる逆相液体ク
ロマトグラフィーにより、各ピークをひとつすつ精製し
た。

ＳＰ−セファデックスカラムから１６０　ｍＭの酢酸ア
ンモニウムで浴出した両分を３．８分かげて０−１０％
Ａ１次（ｃ６０分かけて１０−１４．８％Ａ、次Ｖ１０
０分かけて１４．８−１６．４Ａ％の濃度勾配で測定し
Ｔこ。アトリオペデチンＩは１５．６％Ａで経出し、　
ｄｅｓ−ｓｅｒ”−アト１１オペデチン■は１５．７％
Ａで浴出し％ｄｅｓ−ｓｅｒ１．５ｅｒ２−了トリオペ
フ′チン■は１５．７％ＡでｉＪ出し％ｄｅｓ−ｓｅｒ
”１−アトリオペプチン■は１５．８％で侵出した。

２７０　ｍＭで溶出したＳＰ−セファデックス画分はＨ
ＰＬＣ”’Ｃ’囲１じ１度勾配で分ト＋自し、アトリオ
ベプチンＩＮ！、５．８分力けて０−１６％Ａそして８
０分かけて１６−２２％の娘度勾配において１９．６％
Ａで回収し、ア）　ＩＪオペブチンＩＩは２１．１％Ａ
で回収した。生物活性のある画分はＶｙｄａＣオクタデ
カシリルカラム（孔の太ぎさ３００　Ａ、　４−６ｍｖ
ｒ×２５　（７ｑ、　）にかけ、τ谷媒Ａ（アセトニト
リル中０．０５％トリフルオロ酢酵）と船隊Ｂ（水中０
．０５％トリフルオロ訴絃）の混成を用い６０分かけて
０−３０％の濃度勾配で’１．ｏｍｌ１分で溶出させた
。２５分かける１０−３５％の誦明勾配でアトリオペゾ
チン■は２９．５％Ａで、　ｄｅｓ−ｓｅｒ、１アトリ
オベフ０チン■は２９．７％Ａで、ｄｅｓ−ｓｅｒｌ、
５ｅｒ２−アトリオベゾチン■は２９．７％Ａで、ｄｅ
ｓ−ｓｅｒ”−アトリオベプチンＨ’１２９．９％Ａで
、アトリオペフ０チン■は３１．５％Ａで、アトリオペ
フ０チンＩｎは６２％Ａで身ゎれた。尖７＃１り１１１
に記載のＢｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ｍｏｄｅｌ　４７　Ｑ　
Ａガスフェーズシークエンサーを応用して用い、これら
のペラ０チドヲ連続的に分す」りさせた。ｊＪ下の各化
合物につぎ１回の分解を行なう各実蕨で６０回以上のサ
イクルを行なった：還元及びアルキル化したア）　Ｉ＋
オベデチンＩ（Ｉｌ’Ｚ率６００ピコモル）　；　ｄｅ
ｓ−ｓｅｒｌ−アトリオベブチン１（６６０ビコモ／ｌ
／　）　；　ｄｅｓ−ｓｅｒ”１−７トリオペゾチンＩ
　（５２０ピコモル）　；　ｄｅｓ−ｓｅｒ’。

５ｅｒ２−アトリオペプチンＩ　（６５ＬＪピコモル〕
；アトリオペプチンｎ（ｉ　１２００ピコモル）、及び
アトリオペゾチンＩｉ＋（８５０ｐモル）。０．４Ｍト
’）　ス６　（１７（Ｐ＋４９．０）中２％のＳＤＳ　
（ドデシル眺酸ナトリウム）９０μｌ中にこれらのアト
リオペゾチンを＃解して還元しアルキル化した。ＩＤ０
ｍＭジチオスレイトール１０μｌを添加し、Ｎ２を吹き
つけ、キャップをして６７°Ｃで６０分間インキュベー
トした。次ｒ１２ＤｍＭのヨードアセドアεド（６回再
結晶させた）の新鮮な酪液２ｏμｌを加え、Ｎ２を吹き
つけ、キャップをし室温で１０分間インキュベートした
。次に薫製させた透析チューブに移し、０．１％ＳＤＳ
で２８イＩ”ＦＩ＋透析し、−晩再透析した後凍結乾燥
を行なった。実施例１１／ｊ記載した高速数体クロマト
グラフィーを用いてフェ＝　）ｖ−ｌ−オヒダントイン
アミノ酸を同５．ｒ　した。各サイクルにつき平均的サ
イクル収率は９ｏ％見、上であり、その信号により正確
な定量が可能であった。精製したベデチ１の蛋白濃度は
Ｌｏｗｒｙら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　＋：ｂｅｍ。

第１９６巻、２６５−２７６頁（１９５１年）の方法を
用いて足せした。平滑筋バイオアッセイ法＆１　Ｃ！ｕ
ｒｒｉｅら％５ｃｉｅｎｃｅ第２２１巷、　７１−７３
頁（１９８３年）に記載の方法により実施した。簡単に
冨えは、ウサギの胸部大動脈とヒヨコの冶暢のらせん形
切片を、酸素添加したＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ
培地を用い１０駐／分で連続的（（超泡流した（３７°
０）。弛緩物質を検出するために、血管平滑筋調製物に
ノルエピネフリン（２Ｘ１０−８Ｍ）を注入して安静時
の緊張を誘導した。

基進コントロールのナトリウム排泄元進−利尿活性（Ｕ
Ｎａｖ）パーセントを測定した。ナトリウム排泄先進−
利尿作用の測定（基進コントロールのＵＮａ■パーセン
ト〕は、０．Ａ威のシアル−ウレタンで麻酔した２５０
−３００．？のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを
用いて実施した。恥骨上シラスティックカテーテルを尿
採取のため膀胱にとりつけ、５％デキストロース中０．
２２５％ＮａＣＪの注入（３８μｌ／分）用に尾静脈カ
テーテルを使用した。１時間の平衡化時間の後に１０分
間基血尿を採取し、次に試験物質を急速に静注し１０分
間の採尿をさらに６回行なった。１さを泗っておいＴこ
容器を用い尿の重さを測定して尿脩をめた。ナトリウム
濃度は炎光光度法により測定した。

配列解析に充分な純度のペプチドを得るための精製実験
計画を表２に示す。ラットの心房の最初の粗ホモジエネ
ートは汚染かひど（て組生物活性は定量できなかった。

１０分間煮沸すると、セファデックスＧ−１５カラムで
脱塩する前に多量の蛋白が除去されるため精製がはかど
った。ｒル濾過カラムより得られた低分子型画分は、種
々の両分の電荷と優先的鎮痙活性の差違に基づき、さら
にイオン交換クロマトグラフィーで分離した。こうして
谷分画を試験すると２つの太ぎなペプチド画分の存在が
証明され、そのうちの１つは腸平滑筋を優先的に弛緩さ
せ、もうひとつは低濃度で血管切片と腸切片を弛緩させ
た９８Ｐ−セファデックスカラムより得られた凍結乾燥
ヒヨコ直腸活性因子は逆相（Ｂｒ０Ｗｎ　ｌｅｅ　ｃ１
８　）　ＨＰＬＣを用いて４両分に分別した。同様に血
管弛緩活性を有するピークも２つの大きなぎ−ク（アト
リオペプ゛チン■とアトリオペゾチン■）に分かれ１こ
。谷画分を凍Ｍ乾燥しＶＹＤＡＣカラムのＨＰＬＣによ
り再度クロマトグラフィーを行ない配列解析を行なった
。この実施例２で測定した密接に関連した低分子量鎮痙
性／ナトリウム排泄先進ペプチドの配列を表６に示す。

これらのペプチドは多量のセリンとグリシン残基を含有
し、分子内ジスルフィド環を有する。選択的に腸平滑筋
に作用するが血管平滑筋には作用しない４つのペプチド
は、アミン末端におけるひとつ又は２つのセリン残基の
欠如、又はＣ末端セリンの欠如により、互いに区別され
る。腸鎮痙剤であるとともに強力な血管平滑筋弛緩剤で
あるこれらのペプチドは、アトリオペプチンＩＩではカ
ルボキシル末端にｐｈｅ−ａｒｇがのびており、アトリ
オペプチン■ではカルボキシル末端にｐｈｅ−ａｒｇ−
ｔｙｒがのびている。種々の心房ペプチドの生物活性を
定量的に比較すると、ｄｏｓ−ｓｅｒ　１−アトリオペ
プチンｌ及びｄｅｓ−８ｅｒ１．５ｅｒ２−アトリオペ
プチンともに活性ペプチドなので、腸すセプターの認識
はアミン末端における欠如に対して寛容であることがわ
かる。しかしカルボキシル末端にのびているｉｎ　ｖｉ
ｖｏにおけるナトＩＪウム排泄元進−利尿活性が低下す
る。アトリオペゾチン■とＩＩＩのｉｎ　ｖｉｔｒ○及
びｉｎ　ｖｉｖｏ活性は同程度であり、ａｒｇより先に
Ｃ−末端がのびても実質的に活性は変化しないかもしれ
ないことを示唆している。図１と図２は前述したように
ヒヨコの直腸とウサギの大ｋｉＩＪ脈を用いる定貞法に
より測定しムー心垢ペプチドの生物活性を定量的に比較
したものである。

６種類の心房ペゾチ１を２μｙ靜注してラットにおける
ｉｎ　ｖｉｖｏのす）　ＩＪウム排泄元進作用を試験し
た。ア）　ＩＪオペゾチン■と■の活性は同じであり、
アトリオペゾチンＩより若干強がった。Ｎ−末端又はＣ
−末端に８いてセリンが欠如して２１個のアミノ酸のベ
ゾチドがさらに短かくなるとナトリウム排泄亢進−利尿
活性が減少した。

このｉｎ　ｖｉｖｏ試験の結果を下記の表４に示す。

単離し潅流したラットの腎１凧でアトリオペプチン■と
アトリオペプチン■は譲度依存匪腎血管拡張作用を示し
た。ｐｈｅ−ａ、ｒｇ　Ｃ−末端の欠如したペプチド（
すなわちアトリオペプチン■族のペプチド）は腎血管拡
張剤としては活性は低い。

当業者は本発明の開示を読んだ後は本発明の精神と範囲
から逸脱することなく他の多くの例や以下の例の変更が
ａＪ能なことは明らかであり、そのような利や変更は全
て特許請求の範囲に含まれる。

すなわち生物活性に害を与えない、ペプチドの末４（Ｒ
１又はＲ２）の長さや組成の変化やペプチドの閏々のア
ミノ酸の変化は特許請求のｉｐｌ］、囲に宮まれる。

このよう１よ例や、ペプチドの末端基や個々のアミノ１
験が変化した例を説明するために以下の例を示す。

実施例６ 前述した４ｆ：／Ａ！８例２のラットのアトリオベプチ
ン■と■に対応するヒトの合成心房ペプチドを調製した
。このヒトアトリオペプチンは、ラットのアトリオペゾ
チンのイソロイシンのかわりに８位にメチオニンがある
ことを除いては、ＡｉＩ述した一般式で示されるアミノ
酸配列を有している。

Ｋａｎｇａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　、ａｎｄ　Ｅｉｏ
ｐｈｙｓ　、ＲＩ−ｓ　、Ｕｏｍｎｕｎ。

第１１８巻（１）、１５１−１３９貞、１月１６日号、
１９８４年は、ナトリウム排泄７ｃ進、利尿及び血管弛
緩活性を有するヒト心房抽出液からのアミノ酸２８個か
ら成るペプチドの梢製について記載している。このペプ
チドのアミノば配列はイソロイシンのかわりにメチオニ
ンがはいっていることを除（と、Ｆｌｙｎｎら、同上、
第１１７巻（３）、８５９−８６５頁、１２月２８日号
、１９８６年に日己載されているラット心房抽出液から
の２８個のアミノ酸から成る対応するペプチドのアミノ
は配列と同じである。従って２６１固及び２４１固のア
ミノ酸を有する本発明の合成ヒトアトリオペゾチン■と
ｌ１ｌ（ヒ）ＡＰ−ＩＩとＡＰ−１［）はＦ記の配列で
調製した。

ヒトＡＰ−ＩＩ ヒトＡＰ−１ｎ アトリオペプチン分子はＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの古典的
同相法による１％架橋ポリスチレン支持体上で合成した
。以下の文献を参照：　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ、Ａ
ｍｅｒ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　’ｉｆｆ、　８５　＠、２１４９
−５４頁（１９６３年）と５ｃｉｅｎｃｅ　第１５０巻
、１７８−８５頁（１９６５年）　；　Ｓｔｅｗａｒｔ
　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ。

”　５ｏｌｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ、”Ｗ、Ｈ。

Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　ｃｏ、、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｊ、
ｓｃｏ＋　１９６９年、と２９６貞、　Ｆ、Ｆ、Ｎｏ１
ｄ、Ｅｄ、、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｅｒｓ＋ＮｅｗＹｏｒｋ　＋　１９６９年中のＭｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄによる総説の章；そしてＥｒ１ｃｋｓｏ
ｎ　ａｎｄ　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　ＴｈｅＰｒＯｔ
ｅｌｎＳ　、第２巻、２５５　＠　（ｅｄ、ｉ＼Ｊｅｕ
ｒａｔｈ　ａｎｄＨｉｌｌ　）　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ　、　Ｎｆ３ＷＹＯｒｋ＋　１９７６年。

標準的合成サイクルは表５に記載しである。一般にＢｏ
ａ−アミノ酸（Ｎ−保護基ｔ−ブチルオキシカルボニル
を有する）とのびていくペプチド鎖との結合速度は基質
の性質によって変化するため、ペプチド樹脂をニンヒド
リン呈色反応で追跡し、反応が完了したか否かを決定し
た。−晩反応の後も反（６が不完全な場合は叫脂にＢｏ
ｃ−アミノ酸とカップリング剤ジシクロへキシルカルボ
ジイミド（ＤＣＣ）で再度結合させた。合ｂｔに使用し
たＮ−保護されたアミノ酸はＢｏｃ−８ｅｒ（Ｂｚｌ）
、Ｂｏａ−Ｃｙｓ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ
　％、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ　、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、
Ｂｏｃ−１１ｅ　、　Ｂｏｃ−Ｍｅｔ　、　Ｂｏａ−Ａ
ｓｐ（ＯＢｚｌ）、Ｂｏｃ−Ａ］、ａ　。

Ｂｏｃ−Ｇｌｎ　％　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ　１　Ｂｏｃ−Ａ
ｓｎ　、Ｅｏｃ−Ｔｙｒ−（２、＋　６−ｄｉ（ＪＢｚ
ｌ）である。使用した樹脂はペプチドの酸についてはク
ロロメチル化ポリスチレンであり、ペプチドのアミドに
ついては４−メチルベンズヒドリルアミンである。Ｔａ
ｍら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔ、ｔｅｖｓ　１９
８２年、２９６９頁に記載の２段階ＨＦ法によりペプチ
ドを脱保護し樹脂からはずし、Ｖｙｄａｃ逆相カラムを
用いる中圧クロマドグ７フイーで水中５％−５０％アセ
トニトリル（両溶媒とも０．１％トリフルオロ酢戚で緩
衝化されている）の濃度勾配で浴出して精製した。ペプ
チドの純度はｖｙｄａｃカラムを用いる分析用逆相ＨＰ
ＴＪ：で追跡した。精製したペプチドを空気にさらして
ｐＨ８，３の酢酸アンモニウム緩衝液中で攪拌してペプ
チドを環状化（システィン残基間のジスルフィド形成）
させた。環状化の進行は分析ＨＰＬＣで追跡し、完了し
たとき上記の中圧力ラムでペプチドを精製した。最終生
成物は６０％酢酸から凍結乾燥した。

生成物の構造はアミノ酸分析とガスフェーズシーフェン
ス法で証明した。生成物は２つの異なるカラム条件を用
いてＨＰＬＣで確認した。

ヒトアトリオペゾチン生戎物の活性は、血宜平滑筋（ウ
サギの大動脈）に対するインビトロ定量とイヌにおける
ｉｎ　ｖｉｖｏ定量法を用い、前者では平滑筋弛緩を後
者では利尿とナトリウム排ａ７ｃ進作用を追跡して測定
した。ヒトアトリオペプチン生成物と対応するラットア
トリオペプチン生成物（ラットアトリオペプチンＩ（Ｉ
＝１．０）との比較の結果を表６に要約しである。

前述の同相ペプチド合成に使用したＮ−保護アミノ酸は
下記のように規定する： Ｂｏｃ−８ｅｒ（Ｂｚｌ）　＝　ｔ−Ｂｏｃ−○−ペン
シルーＬ−セリンＢｏｃ−Ｐｈｅ　＝ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−
フェニルアラニンＢｏｃ−Ｇｌｙ　＝ｔ−Ｂｏｃ−グリ
クンＢＯｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）＝ｔ−Ｂｏｃ−Ｎｇ−ト
シルーＬ−アルギニンＢｏｃ−１１ｅ　＝ｔ−Ｂｏｃ−
Ｌ−インロイシンＢｏｃ−Ｍｅｔ　＝ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−
メチオニンＢｏｃ−Ａｌａ　＝ｔ−ＢｏＣ−Ｌ−アラニ
ンＢｏｃ−Ｇｌｎ　＝ｔ−Ｂｏａ−Ｌ−グルタミンＢｏ
ｃ−Ｌｅｕ　＝ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシンＢｏｃ−Ａｓ
ｎ　＝ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン表　６ アドリオペゾチンｉｌｌ　１．０　１．０　１．０　１
．０アトリオペプチンＩ　Ｏ，０１＜０．０１　＜０．
０１　１．０アトリオペノチンＩＩ　１．５　１．０　
１．０ヒトＡＰＩＩ［１・０ ヒトＡＰＩＩ　２．０　３．ＯＬ５ 注：イヌではな（ラットでＡＰＩにより４導した腎血流
と利尿は基本的にＡＰＩＩＩと同じである。

ＲＢＦ　＝腎血流 ＵＦ　＝尿流速 イヌの腎機能試験において、ベントパルピトー麻酔した
雑種犬にアトリオペゾチンな＠物の体１　ｋ１７当たり
５−６０μｇ／分で腎瞼脈内注射をした。ラットのアト
リオペプチン■とＩＩＩ及びヒトＡＰ　ＩＩは腎血流（
電磁式流速ゾローブ）とナトリウム排泄（Ｕ工Ｖ）で濃
度依存１生増加を示したが、アトリオベプチンＩは比較
的活性が弱かった。対照標準物−１ｉｌｔ＜ラットアト
リオペプチンｆｆ１＝１’、ｏ）では腎血ｉ　１５　ｔ
ｎｌ　／分の増加と、ナトリウム排泄２００％ノ擢〃口
させるのに必要な量は約３ナノモルであった。

実施例１と２及びＣｕｒｒｉｅら、５ｃｉｅｎｃｅ　−
４２２１巻、７１−７３龜（１９８５年）記載の方法に
より、ラットのアトリオペゾチン１ｌＩ−１，Ｃ１−コ
ントロールとして、ウサギの大動脈弛緩試験を実施した
。

実施例４ アミノ末端のセリン残基が欠σ口しており、８位と１４
位のアミノ酸がメチオニンとグルタミンではなくイソロ
イシンとグルタミン酸であることな除いては、上記実施
例５と同様のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの古典的固相法によ
り合成心房ペプチドＹ　＃１４ｔした。

この合成においては８位と１４位でのアミンばのカップ
リング配列の中でＮ−ｔ−Ｂｏａで保護したメチオニン
とグルタミンのかわりに、同等量のＮ　−ｔ−Ｂｏｃで
保護したイソロイシンとグルタミン酸を使用し、カップ
リングサイクルを短かくしてアミノ末端における最初の
セリン残基を除いた。こうして合成した本例の合成心房
ペプチド［ｄｅｓ−ｓｅｒ１＋−ｇ１ｕ１４］アトリオ
ペゾチン■は次の配列を有していた： ウサギの大動脈弛緩試験では、この心房ペプチドは対照
標準物質としてのラットのアトリオペノチン■の１．０
に対し、０．２であった。

実施例５ ８位のアミノ酸がメチオニンのかわりにインロイシンで
あり、カルざキシ末端のＯＨ＆のかわりにアミン（ＮＨ
２）基であることを除いては前述の実施例３と同様に、
Ｍｅｒｒｉ　ｆｌ’ｅｌの古典的固相法を用いて合成心
房ペプチドを調製した。ペプチＰアミド誘導体を得るた
めに、本例ではＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相支持体樹脂と
して１％架橋４−メチルベンズヒｒリルアミンを使用し
た。こうして調製した本例の合成心房ペプチげアトリオ
ペプチンー■−アミドは次の配列を有していた： 実施例５のように生物活性の試験を行なうと、対照標準
物質としてのラットのアトリオペプチン■の１．０に対
してこの心房ペプチドはウサギの大動脈弛緩試験で３．
０、イヌの腎皿流試験及び尿流速試験で５．０であった
。

実施例６ アミノ末端のセリン残基のかわりにアセチ′ルセリンを
入れたことを除いては前記の実施例５と同様に、Ｍｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄの古典的同相法により合成心房ペプチド
を調製した。このアセチルペプチド誘導体を得るために
、水性ＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液中（ｐ）１８　）で実施例
５の精製したアトリオペノチンー■−アミドを酢酸のＮ
−ヒ１０キクサクシニミドエステルと反応させ、得られ
たアセチル化生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した。こ
うして得られた本例の合成心房ペプチドは次の配列を有
していた。

実施例６のように生物活性の試験を行なうと、対照標準
物質としてのラットのアトリオペゾチン■の１．０に対
してこの心房ペプチドはウサギの大″ｉ１ｆｔＩｍｇ　
！　ａｍ　ｔｌ’　ｄ　＋１％　ｚ　ｎ　λ−ｆｆｌｎ
ｌｌｌｌ而ｍ　＃　ｍ　７ｂ面汀１ｍの流速試験で５．
０であった。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の新規な心房ペプチドの腸平滑筋（ヒヨコ
の直腸）弛緩活性を示す。 図２は本発明の新規な心房ペプチドの血管平滑筋（ウサ
ギの大動脈）弛緩活性を示す。 代理人　浅　村　皓 図面の浄書（内容に変￥４し） Ｆ１６．Ｉ Ａ′嬶トづ Ｆｌ＆・２・ 昭和６０年３　月２ｏ日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第２５６５４２号 ２、発明の名称 新規な心房ペプチド ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所 氏　名 （名称）　ワシントン　ユニパーシティ４、代理人 昭和６０年２　月２６日 ６、補正により増加する発明の数 １項のペプチドの調製法。 発明の詳細な説明 発明の背景 本発明は有用なナトリウム排泄元通活性を有する新規の
心房ペプチドに関する。 哺乳動物の心房の筋肉は無数の膜結合貯蔵顆粒を含有す
ることは公知である。ラット、犬、猫そしてヒトの心房
に観察されるこれらの特徴的な分泌顆粒は、ペプチドホ
ルモン産生細胞中のものと似ている。（たとえばドボー
ルド（ＤｅＢｏｌｄ　）も、ジャーナル・オプ・ヒスト
ケミストリイ・アンド・サイトケミストリイ（Ｊ、Ｈｉ
ｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　）第２６巻、
１０９４−１１０２頁（１９７８年）参照）。心房の筋
肉の粗組織抽出物を非利尿ラットに静注すると、急速に
強力なナトリウム排泄亢進反応が起きたと報告されてい
る（たとえばトポ−＃　ト（ＤｅＢｏｌｄ　）も、ライ
スサイエンシズ（Ｌｉｆｅ８ｃｉｅｎｃｅｓ　、　）第
２８巻、８９−９４貞（１９８１年）参照）。短時間の
煮沸工程とセファデックス■による分画によりラットの
心房ホモゾエネートのボッド（Ｔｒｉｐｐｏｄｏ　）ら
、プロシーディング・ンサイアテイ・エクスベリメンタ
ル・バイオロジカル・メデイシン（Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ
、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、）第１７０巻、５
０２−５０８頁（１９８２年）〕。 これらの研究者たちは総分子量３，６００−４４．００
０ドルトンの範囲に、そして３６，０００−４４，００
０ドルトンの高分子量範囲と３，６００−５，５００　
）’ルトンの低分子量範囲のところにナトリウム排泄活
性を見出した。 最近の文献〔フエデラル・プロシーディング（Ｆｅｄ、
Ｐｒｏｃ、　）第４２巻（ろ）、抄録１８７０．６１１
頁（１９８３年）〕でドボールド（ＤｅＢｏｂＬ）らは
、彼らが６カーデイオナトリン（Ｃａｒｄｉｏｎａｔｒ
ｉｎ）Ｉ”と名づけた分子量５１５０ドルトンで４７個
のアミノ酸の配列を有する心房ナトリウム排泄亢進ペプ
チドの精美について報告している。高速液体クロマトグ
ラフィー法（ＨＰＬＣ）によりナトリウム排泄九進活性
を有するさらに３つのピークが得られた。 さらにあとの文献〔バイオケミストリイ・バイオフィジ
ックス・リサーチ・コミユニティ（Ｂｉｄｃｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　）第１１６
巻（２）、６９６−７０３頁、１０月６１日号、１９８
６年）でグラ−ｒ　−（Ｇｒａｍｍｅｒ　）らは、分子
量が約３８００で３６個のアミノ酸残基を含有するラッ
トの心房ナトリウム排泄先進因子の部分精製について記
載している。 ラットの心房抽出液は低分子量画分（＜１０．（）Ｄ。 ドルトン）と高分子量画分（２０，０００−３０，００
０ドルトン）に分画され、いずれの両分も試験管内で平
滑筋を弛緩させ、ラットに静脈内投与すると強力なナト
リウム排泄亢進作用があった〔キュリー　（Ｃｕｒｒｉ
ｅ　）ら、サイエンス（Ｅｌｃｉｅｎｃｅ　）、第２２
１巻、７１−７９貞（１９８３年）参照〕。 本発明は有用ぎす）　ＩＪウム排泄元亢進性を示す新規
なペプチドを供する。これらの生物活性を有するペプチ
ドは以下のアミノ酸配列のペプチド、又はその生理学的
に許容される塩、エステル又はＪ　−（！ｙ　Ｅ３−　
ｐｈｅ−ｇｌｙ−Ｒ１７−ａｒｇ−ｉｌｅ　−ａ　Ｂ　
ｐ−ａ　ｒ（：ｉ−１１ｅ−Ｒ１７−ａｌａ−ｇｌ−１
１ｅ−Ｒ１７−１ｅｕ−ｇｌｙ−Ｃ７ｅ　ａｅｎ−Ｒ２
（式中、Ｒ１”　）Ｉ　、　Ｂｅｒ　、　８ｅｒ−８ｅ
ｒ　、及びＲ２＝ＯＨ−、Ｔｒ　、Ｅｌｅｒ−ｐｈｅ　
ａｒｃ）；、８ｅｒ−ｐｈｅ−ａｒｇ−ｔｙｒ　）。 このペプチドの構造式の中でアミノ酸は普通用いられる
以下の略号で示しである。 本発明者らの研究グループが開発した生物活性の測定方
法（平滑筋弛緩とナトリウム排泄光通）はキュリー（ｃ
ｕｒｒｉｅ）らのサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２２
１巻、７１−７３頁（１９８３年）に記載されている。 以下の実施例により本発明を説明するが、これらは決し
て本発明を限定するものではない。下記の例においてＣ
ＲＦはヒヨコの直腸因子でありＲＡＦはウサギの大動脈
因子を意味する。 実施例１ 方法 ゛、ソ等円での平滑筋の弛緩 バイオアッセイ　１ｇの張力をかけたウサギの胸部大動
脈のらせん形の切片とヒヨコの直腸切片を酸素を供給し
たＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ　浴液（３７℃）で
１０ｄ／分で潅流した。安静時の緊張は２　Ｘ　１０−
８Ｍノルエピネフリン（大動脈）か又は２　Ｘ　１０−
８Ｍカルバコール（直腸）で誘導した。試験物質の効果
は組織の上を流れている培地にマイクロピペットで株加
して、ニトログリセリン（大動脈）とインプロテンノー
ル（直腸）を標準物質として用されている心房組織を１
クオ一舐ｒｉｎｇ）ゾレンダー中でリン酸緩衝化生理食
塩水で組織重量に対し１０倍容量になるように分散させ
た（１分）後、Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ　ＰＴ　２Ｑ　ＳＴで
最高速度で（２０秒）攪拌しホモジエネートを調製した
。、浮遊液を２００×ｇで１０分間遠心分離した。熱処
理（１８Ｘ１５０ｍｍ試験管中の１０ｍＪを沸騰浴に１
０分間浸した）の後、この上澄液を再び１２０００Ｘ、
！ｉ’で１０分間遠心分離した。次に（氷）酢酸を０．
５　Ｍになるように上澄液に添加し、得られた浮遊液を
最後にもう一度遠心分離（２７０００Ｘ、９で１５分間
）して清澄化させた。上澄液をＧ−１５セフアデツクス
カラム（８Ｘ３６ｃＷＬ）を用いて、０．５　Ｍ酢酸を
６００ｒｒｔｅ　７時間で流してクロマトグラフィーな
行ない、蛋白画分を凍結乾燥して濃縮した。次に６００
匹のラットから取った物質を合わせて１つにして０．５
　Ｍの酢酸に浴解し５ｘ９０ｃｍのＧ−７５セフアデツ
クスカラムにかけ、０．５Ｍ酢酸を９６ｄ／時間で流し
て溶出させた。前述の文献〔キュ！ｊ　（Ｃｕｒｒｉｅ
）ら、ナイｘ　ｙ　ｙ、　（Ｓ　ｃ　ｉ　ｅｎ　ｃ　ｅ
　）第２２１巻、７１−７３頁（１９８３年）〕分）と
、小さな２つのピーク（ＣＲＦ−１１とＣＲＦ−ｌ、２
９．５分、２９．７分）に分離した。欝試料は大きなピ
ーク（ＲＡＦ−１，３１，０分）と小さなピーク（ＲＡ
Ｆ−Ｉｔ　、３１．５分）を与えた。生成物は凍結乾燥
し一２０℃で保存すると良好な安定性を示した。 エドマン分解　上記の単離したポリペプチドはバンカピ
ラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　）ら、メンッズ・イン
・エンずイモロゾイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、　）第９１巻（１）、第６６章、アカデミ−ツ
ク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）、Ｎ、
Ｙ、、１９８３年の方法により、アプライド・バイオシ
ステムズ・モデル（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　）　４７０　Ａガスフエーズシーク
エンサーを用いて連続的に分解した。 い（つか変更した部分は溶媒のひとつのベンゼンの使用
をやめたこと、そして系の溶媒４としてメタノールのか
わりにア七ト二トリルを用いたことである。さらに使用
した変換溶媒（試薬４）は２５％トリフルオロ酢酸（Ｈ
２０中″／）である。 ■ 結合時間は全体で約６００秒に減少させ、分解時間は８
５０秒のままであった。ＣＲＦ　（収率６６５ピコモル
）、還元／アルキル化ＣＲＦ　（６００ピコモル）、そ
してＲＡＦ（１１７８ピコモル）のそれぞれにつき１回
分解を行なう１回の実験で、このサイクルを３０回以上
繰返した。フェニルチオヒダントインアミノ酸はバンカ
ピラーとフッド（Ｈｕｎｋａｐｉｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏ
ｏｄ　）、メンッズ・イン・エンザイモロジイ（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）第９１巻（１）
、第４３章、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ　）　、　Ｎ、Ｙ、、　１９８３年の方法
を応用して高速液体クロマトグラフィーを用いて同定し
た。正確に定量するに値すると考えられるアミノ酸誘導
体について測定した平均的繰返し収率は９１％であった
。 上記の方法は、１２００匹のラットの心臓の精製に用い
た一連の操作段階を与える。相対的生物活性をめるため
、心房抽出液の弛緩活性を、血管片（ウサギ大動脈）に
対するニトログリセリンの標準曲線と、腸切片（ヒヨコ
直腸）に対するインゾロテレノールに対して比較した。 ラットの心房の最初の粗ホモジエネートは汚染がひどく
て総括性がめられなかった。１０分間の煮沸を行なうと
、セファデックスＧ−１５カラムで脱塩する前に多量の
蛋白が除去されるため、精製がはかどった。ゲル濾過カ
ラムより得られた低分子量画分は、種々の両分の優先的
鎮痙活性の差違に基づきさらにイオン交換クロマトグラ
フィーで分離した。 すなわち各画分の１０μｌを試験すると２つのペプチド
が存在することが証明され、そのうちひとつは腸平滑筋
を優先的に弛緩させ、もうひとつは低濃度で血管切片を
優先的に弛緩させた。しかしこの２つのピークの完全な
用量応答分析を行なうとヒヨコ直腸弛緩物質は顕著な選
択性を示し、このペプチドは高投与量でも血管弛緩剤と
しては無効であった。一方第２のピークは腸切片及び血
管切片のいずれにも濃度依存性弛緩を示した。優先的選
択性を示すピーク、すなわちヒヨコ直腸弛緩物質（これ
は生体内です）　ＩＪウム排泄冗進−利尿活性を有して
いた）を下記の如（さらに詳しく調べた。 ＳＰセファデックスカラムより得られた凍結乾燥ヒヨコ
直腸活性因子（ＣＲＦ　）を逆相（ＢｒｏｗｎｌｅｅＣ
１８）ＨＰＬＣで分画した。ｃＲＦは３つの大きな両分
（１’−１）に分離した。各画分を凍結乾凍しｖＹＤＡ
Ｃカラム（０１８、孔＋７）大きさ３００人）を用エン
チーターでさらに分析した。意外なことにＲＡＦ−１の
最初の２１個のアミノ酸はＣＲＦ−１のアミノ酸と全（
同一であった。ペプチド中の大きな違いはカルボキシル
末端にあった。ＲＡＦ−１は試験管内で強力な血管平滑
筋弛緩剤であり、生体力で選択的腎血管拡張剤である。 ＲＡＦ−１はまたナトリウム排泄亢進剤としてはＣＲＦ
−１よりかなり強力なようである。ＣＲＦ−１は多量使
用する必要があり、１ｎｖｉｖｏの応答において変動が
ある。 表　１ アミノ酸配列 ＣＲＦ−１： Ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｃｙｓ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａ
ｒｇ−ｉｌｅ−ａｓｐ−ａｒｇ−ｉｌｅ−ｇｌｙ−ａｌ
ａ−ｇｌｎ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−１ｅｕ−ｇｌｙ−ｃｙｓ
−ａｓｎ−Ｓｅｒ ＣＲＦ−１１：　ｄｅｓ−ｓｅｒｌ−ＣＲＦ−１ＣＲＦ
−１：　ａｅｓ−ｓｅｒｌ、５ｅｒ２−ＣＲＦ−１ＲＡ
Ｐ−１： Ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｃｙｓ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａ
ｒｇ−ｉｌｅ−ａｓｐ−ａｒｇ−ｉｌｅ−ｇＬｙ−ａｌ
ａ−ｇｌｎ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−１ｅｕ−ｇｌｙ−ｃｙｓ
−ａｓｎ−ｓｅｒ”−ｐｈｅ−ａｒｇ” ＲＡＦ−１とＣＲＦ−１は電荷（イオン交換クロマトグ
ラフィーによる）と逆相ＨＰＬＣによる易動度により容
易に区別される。これらのペプチドのカルボキシ末端の
配列が生物学的特異性を規定している。 ＣＲＦ−１はカルボキシ末端が短か（なっているためそ
の生物活性が腸平滑筋の弛緩と弱いナトリウム排泄元通
活性に限定される。このペプチドは血管切片を弛緩させ
ないし、生体内において背低抗性を低下させない。一方
ＲＡＦ−１の長くなったカルボキシ末端は血管リセプタ
ー認識とナトリウム亢進作用と利尿作用の開始に必要な
構造的特徴と含有している。ＣＲＦとＲＡＦのアミノ末
端の２１個のアミノ酸が同一であることはこれらのペプ
チドが同一の前駆体ペプチドに由来することを強（示唆
している。少な（とも最初の２個のセリン残基のアミノ
ペプチダーゼ分解は生物活性を大き（低下させることは
ない。しかしながら、心房ペプチドのカルボキシ部分の
攻撃部位は最終的な生物学的応答を指令しているようで
ある。この蛋白分解酵素はこれらの鎮痙性　（ナトリウ
ム排泄亢進性）ペプチｒの生理学的作用の理想的な調節
部位を与える。 実施例２ 材料と方法 精製の概要 １４００個のラットの凍結心房（Ｂｉｏｔｒｏｌ、Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ　ＩＮ　）の余分な組織（１５３
ｇ湿重゛、ｔ）を除去し、フッ比フェニルメチルスルフ
ォニル（１μ／ｄ、シグマ化学会社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、
ＭＯ）の存在下で１０倍量のリン酸緩衝化生理食塩水で
ホモジナイズし、２５００ｘｇで１０分間遠心分離した
。上澄液を１０ｄずつに分注し、１００℃の湯浴に１０
分間浸した後、１０．０００）ｌ、４℃で１０分間遠心
分離した。 上澄液を０．５Ｍ酢酸になるように調整し、セファデッ
クスＧ−１５カラム（８Ｘ３６ｃｍ）にかけ、かけて０
−３０％の濃度勾配で１．０ｔｔｔｌ１分で溶出させた
。２５分かける１　０−３５％の濃度勾配でアトリオペ
ノチンＩは２９．５　％　Ａで、ｄｅｓ−ｓｅｒｌ　−
アトリオペゾチンＩは２９．７１　Ａで、ｄｅｓ−ｓｅ
ｒｌ　。 ｓｅｒ”−アトリオペゾチンＩは２９．７％Ａで、ｄｅ
ｓ−ｓｅｒ”−アトリオペプチンＩは２９．９％Ａで、
アトリオペプチンハは６１．５％Ａで、アトリオペプチ
ンＩは３２％Ａで現われた。実施例１に記載のバイオシ
ステム、モデル（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ｍｏｄｅｌ　）
４７０Ａガスフエーズシークエンサーを応用して用い、
これらのペプチドを連続的に分解させた。 以下の各化合物につき１回の分解を行なう各実験で６０
回以上のサイクルを行なった：還元及びアルキル化した
アトリオペゾチンＩ（収率６００ビニｌ　−ｒ−／ｌ／
　）　；　ｄｅｓ−ｓｅｒ”−アトリオペゾチ７１　Ｃ
６６０ビニモル）　；　ｄｅｓ−ｓｅｔ”−アトリオペ
ノチｙｌ（５２０ビコモＡ／　）　；　ｄｅｓ−ｓｅｒ
ｌ、５ｅｒ２−アトリオペプチンＩ（６５０ビコモ／ｌ
／）；アトリオペゾチンＩｆ（１２００ピコモル）、及
びアトリオペプｆ７１　（８５０Ｐ−Ｔ−ル）。０．４
Ｍトリス酢＃（ＰＨ９．０）中２％の５ＤＳ（ドデシル
硫酸ナトリウム）９０μｌ中にこれらのアトリオペゾチ
ンを溶解して還元しアルキル化した。１００ｍＭジチオ
スレイトール１０μｌを添加し、Ｎ２を吹きつけ、キャ
ップをして３７°Ｃで６０分間インキュベートした。 次に１２０劇のヨードアセトアミド（３回再結晶させた
）の新鮮な溶液２０μｌを加え、Ｎ２を吹きつげ、キャ
ップをし室温で１０分間インキユベートシた。次に煮沸
させた透析チューブに移し、０．１　Ｔｏ　ＳＤＳで２
時間透析し、−晩再透析した後凍結乾燥を行なった。実
施例１に記載した高速液体クロマトグラフィーを用いて
フェニルチオヒダントインアミノ酸を同定した。各サイ
クルにつき平均的サイクル収率は９０％以上であり、そ
の信号により正確な定量が可能であった。精製したペプ
チドの蛋白濃度はローリイＬｏｗｒｙら、ジャーナル。 オシ、バイオロジカル、クミストリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
。 Ｃｈｅｍ、　）第１９３巻、２６５−２７６頁（１９５
１年）の方法を用いて定量した。平滑筋バイオアッセイ
法はキュリー（Ｃｕｒｒｉｅ　）　ｂ、サイエンス（５
ｃｉｅｎｃｅ　）第２２１巻、７１−７３頁（１９８３
年）に記載の方法により実施した。簡単に言えば、ウサ
ギの胸部大動脈とヒヨコの直腸 生体内におけるす）　ＩＪウム排泄充亢進利尿活性が低
下する。アトリオペゾチン■とＩの試験管内及び生体内
活性は同程度であり、ａｒｇより先にＣ−末端がのびて
も実質的に活性は変化しないかもしれないことを示唆し
ている。図１と図２は前述したようにヒヨコの直腸とウ
サギの大動脈を用いる定量法により測定した心房ペプチ
ドの生物活性を定量的に比較したものである。 ６種類の心房ペプチドを２μ９靜注してラットにおける
生体内のナトリウム排泄元通作用を試験した。アトリオ
ベゾチン■と置の活性は同じであり、アトリオペゾチン
Ｉより若干強かった。Ｎ−末端又はＣ−末端においてセ
リンが欠如して２１個のアミノ酸のペプチドがさらに短
かくなるとナトリウム排泄元通−利尿活性が減少した。 この生体内試験の結果を下記の表４に示す。 トリオペゾチンのインロイシンのかわりに８位にメチオ
ニンがあることを除いては、前述した一般式で示される
アミノ酸配列を有している。カンガワ（Ｋａｎｇａｗａ
　）ら、バイオケミストリイ・アンド・バイオフィジッ
クス・リサーチ・コミユニティ巻（１１，１３１−１３
９頁、１月１６日号、１９８４年は、ナトリウム排泄亢
進、利尿及び血管弛緩活性を有するヒト心房抽出液から
のアミノ酸２８個から成るペノチドの精製について記載
している。 このペゾチドのアミノ酸配列はインロイシンのかわりに
メチオニンがはいっていることを除（と、フリン（Ｆｌ
ｙｎｎ　）ら、同上、第１１７巻（３）、８５９−８６
５頁、１２月２８日号、１９８３年に記載されているラ
ット心房抽出液からの２８個のアミノ酸から成る対応す
るペノチドのアミノ酸配列と同じである。従って２６１
１１ｉｌ及び２４個のアミノ酸を有する本発明の合成ヒ
トアトリオペプチン■とＩ（ヒ）　ＡＰ−ＩｔとＡＰ−
１）は下記の配列で調製した。 ヒトＡＰ　−Ｉｆ ヒトＡＰ−１ アトリオペプチン分子はメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ）の古典的固相法による１チ架橋ポリスチレン
支持体上で合成した。以下の文献を参照：メリフィール
ド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）　、ジャーナル・オプ・
アメリカン・ケミカル・ンサイエテ−５４頁（１９６３
年）とサイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）第１５０巻、１７
８−８５頁（１９６５年）；スチュアートとヤングＳｔ
ｅｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ　、ンリツド・フェー
ズ・ペプチド・シンセシス（５ｏ１１Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　）、ダブリュー・エ
イチ・フリーマン・アンド・カンパニイ（Ｗ、　Ｈ。 Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、　）、サンフランシスコ、
１９６９年とアドバンシズ・イン・エン枦イモロゾイ（
Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）第
６２巻、２２１−２９６頁、エフ・エフ・ノールド（Ｆ
、　Ｆ、Ｎ０１ｄ）著、インターサイエンス・パブリツ
シャーズ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｅｒｓ　）、ニューヨーク、１９６９年中のメリフィー
ルド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）による総説の章；そし
てエリクスンとメリフィールド（Ｅｒ１ｃｓｏｎ　ａｎ
ｄ　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）、ザ・プロテインズ（Ｔ
ｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　）、第２巻、２５５頁（ノイ
ラスとヒル（Ｎｅｕｒａｔｈ　ａｎｄ　Ｈｉｌｌ　）、
アカデミツクプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ　
）、ニューヨーク、１９７６年。標準的合成サイクルは
表５に記載しである。一般にＢｏｃ−アミノ酸（Ｎ−保
護基１−ブチルオキシカルボニルを有する）とのびてい
くペプチド鎖との結合速度は基質の性質によって変化す
るため、ペプチド樹脂をニンヒドリン呈色反応で追跡し
、反応が完了したか否かを決定した。 −晩反応の後も反応が不完全な場合は樹脂にＢｏｃ−ア
ミノ酸とカップリング剤ゾシクロへキシルカルボシイミ
ド（ＤＣＣ）で再度結合させた。合成に使用したＮ−保
護されたアミノ酸はＢｏａ−８ｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ
−Ｃｙｓ　（４−ＭｅＢｚｌ　）、Ｂｏａ−Ｐｈｅ　、
　Ｂｏａ−Ｇｌｙ。 Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−１１ｅ　、ＩＢｏ
ｃ−Ｍｅｔ　ＸＢｏＣ−Ａｓｐ（ＯＢＺＩ）、ＢＯＣ−
Ａｌａ　％Ｂｏａ−Ｇｉｎ　、　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ　、　
Ｂｏｃ−Ａｓｎ％Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−（２、６−ｄｉ　Ｃ
ｊＢｚｌ　）である。 使用した樹脂はペプチドの酸についてはクロロメチル化
ポリスチレンであり、ペプチドのアミドについては４−
メチルベンズヒドリルアミンである。 タム（Ｔａｍ　）ら、テトラヒドロン・レターズ（Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｖｓ　）　１９８２年
、２９３９頁に記載の２段階ＨＦ法によりペプチドを脱
保護し樹脂からはずし、Ｖ％ａｃ逆相カラムを用いる中
圧クロマトグラフィーで水中５％−５０％アセトニトリ
ル（両溶媒とも０．１１　）リフルオロ酢酸で緩衝化さ
れている）の濃度勾配で溶出して精製した。ペプチドの
純度はＶｙｄａｃカラムを用いる分析用逆相ＨＰＬＣで
追跡した。精製したペプチドを空気にさらしてｐＨ８，
３の酢酸アンモニウム緩衝液中で攪拌してペプチドを環
状化（システィン残基間のジスルフィド形成）させた。 環状化の進行は分析ＨＰＬＣで追跡し、完了したとき上
記の中圧力ラムでペプチドを精製した。最終生成物は３
０％酢酸から凍結乾燥した。生成物の構造はアミノ酸分
析とガスフエーズシークエ／ス法で証明した。生成物は
２つの異なるカラム条件を用いてＨＰＬＣで確認した。 ヒトアトリオペノテン生成物の活性は、血管平滑筋（ウ
サギの大動脈）に対するインビトロ定量とイヌにおける
生体内定量法を用い、前者では平滑筋弛緩を後者では利
尿とナトリウム排泄元通作用を追跡して測定した。ヒト
アトリオペプチン生成物と対応するラットアトリオペプ
チン生成物（ラットアトリオペプチン鳳＝１．０）との
比較の結果を表６に要約しである。 前述の固相ペプチド合成に使用したＮ−保護アミノ酸は
下記のように規定する： Ｂｏｃ−８ｅｒ（Ｂｚｌ）　＝　ｔ−Ｂｏｃ−０−ベン
ジル−Ｌ−セリンＢｏｃ−Ｐｈｅ　＝　ｔ−Ｂｏａ−Ｌ
−フェニルアラニンＢｏａ−Ｇｌｙ　＝　ｔ−Ｂｏｃ−
グリシンＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）＝　ｔ−Ｂｏｃ−Ｎ
ｇ−）シルーＬ−アルギニンＢｏｃ−１１ｅ　−ｔ−Ｂ
ｏｃ−Ｌ−インロイシンＢｏｃ−Ｍｅｔ　＝　ｔ−Ｂｏ
ｃ−Ｌ−メチオニンイヌの腎機能試験において、ペンド
パルビ）　−ル麻酔した雑種犬にアトリオペゾチンを動
物の体重１ｋｇ当たり５−６０〜／分で腎動脈的注射を
した。ラットのアトリオペゾチン■と■及びヒトＡＰ■
は腎血流（電磁式流速プローブ）とナトリウム排泄（Ｕ
Ｎａ■）で濃度依存性増加を示したが、アトリオペプチ
ンＩ′は比較的活性が弱かった。対照標準物質（ラット
アトリオペゾチンＩＩＩ　＝　１．０　）では腎血流１
５ｄ／分の増加と、ナ）　ＩＪウム排泄２００チ増加さ
せるのに必要な量は約６ナノモルであった。 実施例１と２及びキュリー（０ｕｒｒｉｅ　）ら、サイ
エンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）第２２１巻、７１−７３頁
（１９８３年）記載の方法によシ、ラットのアトリオペ
ノチンＩ　＝　１．０をコントロールとして、ウサギの
大動脈弛緩試験を実施した。 実施例４ アミノ末端のセリン残基が欠如しており、８位と１４位
のアミノ酸がメチオニンとグルタミンではなくイソロイ
シンとグルタミン酸であることな除いては、上記実施例
６と同様のメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）
の古典的固相法により合成心房ペゾチドを調製した。こ
の合成においては８位と１４位でのアミノ酸のカップリ
ング配列の中でＮ−ｔ−Ｂｏｃで保護したメチオニンと
グルタミンのかかわシに１同等量のＮ−ｔ−Ｂｏｃで保
護したイソロイシンとグルタミン酸を使用し、カップリ
ングサイクルを短かくしてアミノ末端における最初のセ
リン残基な除いた。こうして合成した本例の合成心房ペ
ゾチド（ｄｅｌｉｌ−８ｅｒ１＋　−ｇ１ｕ１４　）ア
トリオペプチン■は次の配列を有していた： Ｓ【 １．１ ウサギの大動脈弛緩試験では、この心房ペゾチドは対照
標準物質としてのラットのアトリオペノチン■の１．０
に対し、０．２であった。 実施例５ ８位のアミノ酸がメチオニンのかわりにイソロイシンで
あり、カルボキシ末端のＯＨ基のかわりにアミン（ＮＨ
２）基であることを除いては前述の実施例６と同様に、
メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）の古典的同相
法を用いて合成心房ペプチドを調製した。ベゾチドアミ
ド誘導体を得るために、本例ではメリフィールド（Ｍｅ
ｒｒｉｆｉｅｌｄ　）固相支持体樹脂として１％架橋４
−メチルベンズヒドリルアミンを使用した。こうして調
製した本例の合成心房ペプチドアトリオペプチンー■−
アミドは次の配列を有していた： 実施例６のように生物活性の試験を行なうと、対照標準
物質としてのラットのアトリオペプチン用の１．０に対
してこの心房ペプチドはウサギの大動脈弛緩試験で６．
０、イヌの腎血流試験及び尿流速試験で５．０であった
。 実施例６ アミノ末端のセリン残基のかわシにアセチルセリンを入
れたことを除いては前記の実施例５と同様に、メリフィ
ールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）の古典的固相法によ
シ合成心房ペゾチドを調製した。このアセチルペプチド
誘導体を得るために、水性ＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液中（ｐ
Ｈ８）で実施例５の精製したアトリオペプチンー■−ア
ミドな酢酸のＮ−ヒドロキシサクシニミドエステルと反
応させ、得られたアセチル化生成物を逆相ＨＰＬＯによ
り精製した。こうして得られた本例の合成心房ペプチド
は次の配列を有していた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記のアミノ酸配列より成る強力なナトリウム排
   泄亢進活性を有するペプチド、又はその生理学的に許容
   できる塩、エステル又はアミド：Ｊ−ＣｙＳ−ｐｈｅ−
   ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ｉｌｅ−ａｓｐ−ａｒｇ　ｉ
   ｌｅ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｇｌｎ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−１ｅ
   ｕ−ｇｌｙ−ａｙｓ−ａｓｎ−Ｒ２（式中％Ｒ１＝Ｈ、
   ＳＱｒ、　８ｅｒ−８ｅｒ　、及びＲ２＝　ＯＨ、ｓｅ
   ｒ　、　ｓｅｒ−ｐｈｅ−ａｒｇ　。 ａｅｒ−ｐｈｅ−ａｒｇ−ｔｙｒ　）。 （２１Ｒ１は５ｅｒ−ｓｅｒでありＲ２はｓｅｒである
   。腸平滑筋弛緩活性を示す、特許請求の範囲第１項記載
   のペプチド。 ＋３Ｊ　Ｒ，はｓｅｒであり、Ｒ２はｓｅｒである、腸
   平滑筋弛緩活性を示す、特許請求の範囲第１項記載のペ
   プチド。 （４）Ｒ工はＨであり、Ｒ２はｓｅｔである％腸平滑筋
   弛緩活性を示′−ｆ、特許請求の範囲第１項記載のペプ
   チド。 （５１Ｒ１は５ｅｒ−ｓｅｒであり、Ｒ２はＯＨである
   、腸平滑筋弛緩活性を示す、特許請求の範囲第１項記載
   のペプチド。 ＋６１　Ｒ１は５ｅｒ−ｓｅｒでありｂ　Ｒ２はｓｅｒ
   −ｐｈｅ−ａｒｇである。血管平滑筋弛緩活性を示す、
   特許請求の範囲第１項記載のペプチド。 （７１Ｒ１は５ｅｒ−ｓｅｒであり、Ｒ２はｓｅｒ−ｐ
   ｈｅ−ａｒｇ−ｔｙｒである、血管平滑筋弛緩活性を示
   す、特許請求の範囲第１項記載のベプチＰ０ （８）治療上有効量の特許請求の範囲第１填記載のペプ
   チドより成る。利尿又はナトリウム排泄亢進作用を示す
   治療用組成物。 （９）　治療上有効量の特許請求の範囲第２項より第５
   項までのいずれか１項記載のペプチドより成る、―平滑
   筋弛緩活性を示す治療用組成物。 （１０１治療上有効量の特許請求の範囲第６項又は第７
   項記載のペプチドより成る、血管平滑筋弛緩活性を示す
   治療用組成物。 （Ｉｌ＋　特許請求の範囲第１項に定義したペプチドの
   ひとつの治療学的に有効量を哺乳動物に投与することよ
   り成る、哺乳動物において利尿又はナトリウム排泄先進
   作用を引き起こす方法。 ０２、特許請求の範囲第２項より第５項までのいずれか
   １項に定義したペプチドのひとつの治療学的に有効量を
   哺乳動物に投与することより成る、哺乳動物において腸
   平滑筋弛緩作用を引き起こす方法。 Ｑ３１　特許請求の範囲第６項又は第７項に定義したペ
   プチドのひとつの治療学的に有効量を哺乳動物に投与す
   ることより成る。哺乳動物において血管平滑筋弛緩作用
   を引き起こす方法。 α４）　特許請求の範囲第１項記載のペプチドの調製方
   法において （ａｌ　哺乳動物の心房組織の粗ホモジエネートを調製
   し遠心分離し、 （ｂｌ　上澄液を煮沸し遠心分離し、 （ｃｌ　セファデックス■Ｇ−１５樹脂を用いるゲル濾
   過クロマトグラフィーにより上＆液を脱塩し。 （ｄｌ　セファデックス■Ｇ−７５樹脂を用いて蛋白画
   分のゲル濾過クロマトグラフィーに供し、（ｅｌ　ｓｐ
   −セファデックス■ＣＣ−２５１ｔ脂を用い、低分子量
   蛋白画分をイオン交侯りロマトグラフィ家供し、 （ｆ）２つの主蛋白画分を高速液体クロマトグラフィー
   に供し、 そして （ｇｌ　分離した心房ペプチド画分を回収することを特
   徴とする、上記調製方法。 ＋１５）　Ｒ２がｓｅｒ−ｐｈｅ−ａｒｇ又はｓｅｒ−
   ｐｈｅ−ａｒｇ−ｔｙｒである特許請求の範囲第１項に
   定義したペプチドのひとつの治療上有効量より成る、腎
   ＪｆＩＩ　Ｗ拡張作用を示す治療用組成物。 １６１　Ｒ１が５ｅｒ−ｓｅｒである特許請求の範囲第
   １５項に定義したペプチドのひとつの治療上有効量より
   成る、腎血管拡張作用を示す治療用組成物。 αｎ　Ｒ２がｓｅｒ−ｐｈｅ−ａｒｇ又はｓｅ　ｒ−ｐ
   ｈｅ−ａｒｇ−１’ｙｒである特許請求の範囲第１項に
   定義したペプチドのひとつの治療学的に有効蓋を哺乳動
   物に投与することより成る、哺乳動物において腎血管拡
   張作用を引き起こす方法。 （１８１Ｒ１が５ｅｒ−ｓｅｒである特許請求の範囲第
   １７項に定義したペプチドのひとつの治療学的に有効量
   を哺乳動物に投与することより成る、哺乳動物において
   腎血管拡張作用を引き起こす方法。 α９　アミノ酸第８位のｉｌｅがｍｅｔで置換されてい
   る、特許請求の範囲第６項記載のにプチド。 （イ））　アミノ酸第８位のｉｌｅがｍｅｔで置換され
   ている、特許請求の範囲第７項記載のペプチド。 Ｇａ１ｌ　Ｒ１がｓｅｒであり％Ｐ２がｓｅｒ−ｐｈｅ
   −ａｒｇであり。 ｇｌｎ　ｈ″−ｇｌｕで置換されている、面管平溺筋弛
   緩活性を示す、特許請求の範囲第１項記載の−ｉ′ゾチ
   ド。 （２２カルボキシ末端のＯＨがアは）基で置換されてい
   る。特許請求の範囲第６項記載のペプチド。 （ハ）　アミノ末端のセリン残基がアセチルセリンで置
   換されている。特許請求の範囲第２２項記載のペプチド
   。 （２）特許請求の範囲第１項に示した配列でアミノ酸を
   結合させることよｒ′成る％特許請求の範囲第１項のベ
   デチげの調製法。