JPS5889182A - 新規脱水素酵素及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 且つガラクタル酸（　ｇｓｌａｃｔａｒｌｃ　ａｃｉｄ
　）に対し基質特異性を有する新規脱水素酵素＾及びそ
の製造法に関するものである 従来、ガラフタル酸を特異的に資化利用する微生物を用
いてガラクタール酸に対し基質特異性を有する脱水凛帥
素を採取する方法及び該脱水素酵素について扛全く知ら
れていない。本発明者等は、先にガラフタル酸を含む培
地で、バチルス（　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　　属に属す
るガラフタル酸資化利用性薗を培養し、その培養物より
培誉醒体を回収することを特徴とする細菌菌体の製造法
を完成したが（特願昭５６−７３　、ｇ２／号明細書参
照）、その産生物質について鋭意研究した結果、ガラフ
タル酸に対し基質特異性の極めて商い新規脱水素酵素を
採取することに成功し、本発明を完成するに至った。

本発明において、「新規脱水素Ｓ素Ａ」とは、以下に記
載する理化学的性質を有する酵素で、特微的な性質とし
て最適作用ｐＨをは″ｉｇ、ｓ附近に有し、且つガラフ
タル酸に対し基質特異性の極めて高い新規脱水素酵素を
指称するものとする。

以下に、本発明について詳述する。

ガラフタル酸（ムチン酸）は１％ガラクトースの糖酸で
あり、木材などに含まれるガラクタン、及びガラクトー
ス、ラクトース、ラフィノース、ガラクトース、植物粘
液質などガラクトース又はその誘導体を含む物質を硝酸
酸化することにより大量に得られる物質である。

本発明方法に用いる微生物は、以下に詳述されるように
、ガラフタル−酸を資化利用するものであり、バチルス
属に属する菌種であって、この菌種として、前記バチル
ス・ニス♂−・Ｇ−／（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　Ｇ
−／　）　（以下、ｒＧ−／ＩＪと称する）及びバチル
ス中エスピー・Ｇ−２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　Ｇ
−２）　Ｃ以下、ｒＧ−ＪＩＪと称する）が挙げられる
。

なお、前記Ｇ−／菌及びＧ−２菌の他にその自然的又は
人為的変異種もガラフタル酸の資化利用性を有する限り
、本発明方法に用い得ることは当然である。

前記Ｇ−／曹及びＧ−２菌Ｆｉ、昭和５６年３月７９日
、工業技術院微生物工業技術研究所へ、それぞれ、微工
研菌寄第５９２３号及び倣工研菌寄ｔａｓ９２４号とし
て寄託された。前記Ｇ−／＠及びＧ−２＃ｉは、次の菌
学的性質をＭする。

なお下記の蘭学的緒性質の試験及び分類方法はすべて「
パージニーズ　マニュアル　オプ　デタミネイｉイブ　
パクテリオロジー」（第ｇ版、／９？！年）　（Ｂａｒ
ｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｌｎａ
−ｔｌＶｅ　５ａｃｔａｒ＋ｏ＋ｏｇｙ　（ｇ　ｔｌ’
＋　ａｄｌｔｌｏｎ、　／　９りｔＩ）〕に準拠して行
なわれた。

Ｏバチルスｅエスピー・Ｇ−／−の菌学的性質（ａ）　
　形態（肉汁寒天斜面培地） ＋１１　　細胞の大きさは、０．６〜０゜ｇμ×２．θ
〜３．０μの桿菌である。

１２）　　細胞の多形性はない。

ｌａｌ　　運動性があり鞭毛は周毛である。

＋４１　　胞子の大きさは０．７μ×０．７μで、胞子
のうけ細胞の端に形成される。

（５１グラム染色性は変動性である。

１６＋　　抗酸性は陰性である。

（ｂ）　　培地における生育状態 １１＋　　肉汁液体培地 曹環を形成し、沈漬を生じる。菌体は灰白色を呈する。

稽１　肉汁−天平板培地 発育は旺盛で、菌体は灰白色を呈するが、色素は培地中
に拡散しない。表面は平滑で、光沢があり、コロニーの
周縁は金縁−波状を呈−ｊ本。

（３１肉汁寒天斜面培地 （２）と同様の生育状態を示し、拡布状に生育する。

（４：　　ダルコース肉汁寒天平板培地（２）と同様で
ある。

＋５１　　肉汁ゼラチン穿刺培地 ｐｕ　？　ｉｃおいては、ゼラチンを液化して、表面で
発育し、菌体は灰白色を呈する。ｐＩ４１０においては
、ゼラチンを液化しない。

＋６＋　　４デトン水 ｐｔ＋　？およびｐＨ７０においては表面に鋼環を形成
して、沈漬を生じる。菌体は灰白色を呈するが、色素は
培地中に拡散しない。

（７：　　リトマ諷ミルク リドマス色素を僅かに赤変し、凝固する。

Ｌ８）　　バレイショ培地 菌体は灰白色を呈する。

（Ｃ）　　生理的性質 口１　硝酸塩の還元 還元する。

（２）　脱窒反応 陰　　　性 （３１メチルレッド（ＭＲ）試験 陰　　　性 １４＋　　フオーダス・プロスカラエル（■Ｐ）反応陰
　　　性 （５）　　インドールの生成 陰性 幡ν　硫化水素の生成 陽　　　性　　　。

（７）　　でんぷんの加水分解 陽　　　性 １８１　　クエン酸の利用性（にｏｓ・「培地及びＣｈ
ｒｌｓｔ＠ｎ５ｅｎの培地） いずれも利用しない。

１９）　　無機窒素源（アンモニウム塩、硝酸塩、尿素
等）の利用性 利用する。

１１（Ｉ　　色素の生成 色素は生成しない。

ａＤ　　リドマス、メチレンブルー、　２．ｌ、−ジク
ロルフェノール、インドフェノールなどの色素の還元 リドマスを僅かに赤変する他、変化なし。

ａり　ウレアーゼ 陰性 ａ３　　オキシダーゼ 陽　　　性 ・尋　カタラーゼの生成 陽　　　性 ０　生育の範囲 生育し得る条件は、ｐＨ７，０−／／、θ、温１１２　
Ｓ−４’　５”Ｃで好気的であり、最適生育条件＃ｉ％
ｐＨ９，ｓ近辺、温度３７℃前後である。

ａｓ　　酸素に対する態度 好気性 （１７）Ｏ−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法に
よる）酸化的並びに還元的に生育する。

好気的並びに還元的にガスの生成はない。

ａ９　　牛乳の凝固 凝固する。

＠９　アンモニアの生成 陰性 ■　ゼラチン、カゼインの液化 液化する。

（２１１塩化ナトリウムの耐性 ＳＬｓ塩化ナトリウム上で生育するが、１０チ以上の塩
化ナトリウム上では生育しない。

（ｄ）　　炭素源の利用性 １１１　　Ｌ−アラビノース　　　− 伐Ｉ　Ｏ−キシロース　　　　− ＋３１　０−グルコース　　　　＋ （４＋　０−マンノース　　　　＋ （５）０−フルクトース　　　＋ １６ＩＯ−ガラクトース　　　＋ （７）　　ラクトース　　　　　　− （８１マルトース　　　　　　＋ （９１サッカロース　　　　　＋ αＧ　トレハロース　　　　　＋ ａｓ　　Ｏ−ソルビット　　　　− Ｑり　０−マンニット　　　　＋ ａ３　　イノジット　　　　　　− ０　グリセリン　　　　　＋ む！１　　デンプン　　　　　　　＋ 特　ラフィノース　　　　　− Ｕη　イヌリン　　　　　　　− 舖　デキストリン゛　　　　　＋ 儀慟　繊維素　　　　　　　　− ■　サリシン　　　　　　　十 以上の炭素源より好気的並びに嫌気的にガスの生成はお
こなわない。

（注）二十　利用する（酸を生成する）−殆んど利用し
ない（酸を生成しな い） ０バチルス・エスピー・Ｇ−２１ｄの菌学的性質（ａ）
　　形態（肉汁寒天斜面培地） ｉｌ＋　　細胞の大きさは、０．６〜００ｇμ×ユ、θ
〜３．０μの桿−１菌である。

（２１細胞の多形性はない。

１３１　　運動性があり鞭毛は周毛である。

＋４１　　胞子の大きさは０．７μ×０．７μで、胞子
のうけ細胞の端に形成される。

１５１　　グラム染色性は変動性である。

１Ｂ＋　　抗酸性は陰性である。

（ｂ）　　培地における生育状態 ｉｌ＋　　肉汁液体培地 画壇を形成し、沈漬を生じる。菌体は灰白色を呈する。

（２）　肉汁寒天平板培地 発育は旺盛で、菌体は灰白色を呈するが、色素は培地中
に拡散しない。表面は平滑で、光沢があり、コロニーの
周縁は金縁−波状を呈する。

（３隻　肉汁寒天斜面培地 （２１と同様の生育状態を示し、拡布状に生育する。

（４リ　　グルコース肉汁寒天平板培地（２）と同様で
ある。

（５）　　肉汁ゼラチン穿刺培地 ｐＨ７においては、ゼラチンを液化して表面で発育し、
菌体は灰白色を呈する。ｐＨ１０においては、ゼラチン
を液化しない。

（６１ペプトン水 ｐＨりおよびｐＨｌＯにおいては表面に画境を形成して
沈渣を生じる。菌体は灰白色を呈するが、色素は培地中
に拡散しない。

（〕）　リドマスミルク 変化せず。

（８）バレイショ培地 菌体は灰白色を呈する。

（Ｃ）　　生理的性質 （１）　硝酸塩の還元 還元する。

（２）　　脱窒反応 陰性 １３１　　メチルレッド（ＭＲ）試験 陰　　　性 （４）　フォーク９ス・プロスカラエル（ＶＰ）反応陰
　　　性 （５：　　インドールの生成 陰　　　性 （６；　　硫化水素の生成 陰　　　性 （７）　　でんぷんの加水分解 陽　　　性 １８１　　クエン酸の利用性（Ｋｏｓｅｒ培地及びＣｈ
ｒｌｓｔ＠ｎ５ｅｎの培地） いずれも利用しない。

（９＋　　無機窃素源（アンモニウム塩、硝酸塩、尿素
尋）の利用性 利用する。

ａα　色素の生成 色素は生成しない。

ａＩｌ　　リドマス、メチレンブルー１コ、６−ジクロ
ルフェノール、インドフェノールなどの色素の還元 変化なし。

ｆｉｚ　　ウレアーゼ 陰　　　性 ａＳ　　オキシダーゼ 陽　　　性 ０　カタラーゼの生成 階柱 ａＳ　　生育の範囲 生育し得る条件は、ｐｕｔ、ｏ〜／／、０゜温度２　！
；　−４！　！ｒ　”Ｃで好気的であり、最適生育条件
は、ｐＨ９，５近辺、温度３７℃前後である。

６・　酸素に対する態度 好気性 １１７１０−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法に
よ゛る）酸化的並びに還元的に生育する。

好気的並びに還元的にガスの生成はない。

ａ９　　牛乳の凝固 凝固しない。

６９　　アンモニアの生成 陰　　　性 ■　ゼラチン、カゼインの液化 液化する。

＋２１１　　塩化ナトリウムの耐性 Ｓ％塩化ナトリ・ラム上で生育するが、１０チ以上の塩
化ナトリウム上では生育しない。

（ｄ）　　炭素源の利用性 ＋ＩＩ　　Ｌ−アラビノース　　　− （２）Ｏ−キシロース　　　　− （３１０−グルコース　　　　− （４：Ｏ−マンノース　　　　− （６）Ｄ−フルクトース　　　− １６＋　　Ｄ−ガラクトース　　　− （７）　　ラクトース　　　　　　　−（８）　　マル
トース　　　　　　− （９）サッカロース　　　　　− （１０）レバロース　　　　　− （ｉｌｌ　　Ｄ−ソルビット　　　　−＋１３　　Ｄ−
マンニット　　　　− Ｏイノジット　　　　　　− ａ番　グリセリン　　　　　− ａ９　　デンプン　　　　　　　− ０ラフィノース　　　　　− αり　イヌリン　　　　　　　− 帥　デキストリン　　　　　− ■　繊維素　　　　　　　　− ■　サリシン　　　　　　　− 以上の炭素源より好気的並びに嫌気的にガスの生成はお
こなわない。

（注）：十　利用する（酸を生成する）−殆んど利用し
ない（酸を生成しな い） 以上の微生物の菌学的諸性質から前記文献の分類方法に
従って使用微生物を検索するに当り、前記のＧ−／―及
びＧ−，２−をバチルス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ）属に属す
る公知の菌種と比較した。

前記Ｇ−／＠は、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　５ｕｂｔｌｌｌｓ　）、ノ４チルス・プミルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｌｌｕｓ　）　、バチルス・
すへニフォーミｘ　（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｌｌｃｈｓｎ
ｌｆｏｒｍｌｓ　）　、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｃｅｒ＋ｅｕｓ　）、バチルス・アンソラシ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｌｇ　）　、バ
チ／ｌ／　ス管スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　）　、バチルス・メガテ
リウム（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｌｕｍ　）
、／？？ルス１ステアロサーモフィラス（’　Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｔａａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｌｌｕｓ　）　
　及びバチルス中フィルマス（８ａｃｌｌｌｕｓ　ｆｌ
ｒｍｕｓ　）と類似している。

しかしながら％　　Ｇ　　／　ｖａｎ、アラビノース及
びキシロースから酸の生成をせず、且つグルコースから
のアセトインの生成がないのＶＣ対し、バチルス、　）
ｅ’；Ｉｆ　１７ス及びバチルス・リヘニフォーミスは
共に、アラビノース及びキシロースからの酸の生成があ
り、且つグルコースからのアセトインの生成がある点、
バチルス・フィルマスは、アラビノース及び咥シロース
から酸の生成がある点、Ｇ−／菌は、でんぷんの加水分
解を行い、且つ硝酸塩の還元を行うのに対し、バチルス
・プミルスは、いずれも行わない点にそれぞれ特徴的な
差異を見出すことができる。

又ｓａ−／Ｔｌ１ｌｄミー／Ｔｌ１ｌｄバチルスｅセレ
ウスソラシス、バチルス・スリンジエンシス、バチルス
−ステアロサーモフィラス及びバチルス・メガテリウム
と比較して、菌体の大きさ、内生胞子の形態及びその位
置が異なり、更に、Ｇ−／［Ｌ％ｉンニットからの酸の
生成があるのに対し、上記いずれの菌種も、共に酸の生
成力１ない点において特徴的な差異を見出すことができ
る。

一方、前記Ｇ−コ菌は、バチルス・マロカナス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｍａｒｏｃｃａｎｕｓ　）、バチルス・ア
ルカロフイラス（Ｂｍｃｉｌｌｕｓ門１ｃａｌｏｐｈｌ
ｌｕｓ−）及び／セチルス、　ＭＦクロイデス−（日ａ
ｃｌｌｌｕｓ　ｍ５ｃｒｏｌｄ＠ｓ　）　　と類似して
いる。

しかしながら、Ｇ−２Ｐｌは、硝１１１塩を還元し、且
つでんぷんの加水分解をするのに対し、バチルス・アル
カロフイラスは、硝酸塩ｆｔ還元しない点、又バチルス
・マクロイデスは、硝り？塩の還元及びでんぷんの加水
分解のいずれも行わない点、Ｇ−２ｆ１４は、バチルス
・マロカナスと比較して、その一体の大きさが著しく異
なる点、又Ｇ−２菌は、上記いずれの菌種とも、その内
生胞子の形態及び位置が異なる点に特徴的な差異を見出
すことができる。

以上の検索結果を総括すると、Ｇ−／菌、Ｇ−２１１１
１Ｆｉ、形態その他の諸性質から、バチルス属に属する
微生物とすることが妥描であるカニ、前記のとおり種々
の特徴的な菌学的性質及びｐＨ’７．Ｑ〜／／、０の如
き広範囲のアルカリ性において生育する性質から判断し
て、明らかＩｆＣバチルス属に属する公知のｌ！！ｒａ
Ｉと区別されるため、これらを新菌種として設定するこ
とが適当であると゛結論された。

次に培養条件として重要な点け、培養液の１）１１で′
　ある。実験結果から前記Ｇ−／薗及びＧ−コ菌を培養
するに当ってその生育繁殖ＦｉｐＨ条件によって非常に
影響を受けるので、培地のｐＨは、はぼ７．０〜／／、
０の範囲から選ばれた値に調整することが必要であるこ
とが確かめられた。

かくて上記の培養条件の下に前記微生物を接種し、適当
な条件、例えば、１１時間、３７℃で振盪培養を行ない
、次いで、／　０　、００　Ｏｒ、ｐ、ｍ、で／θ分間
遠心分離後、水洗し、再度遠心分離して菌体を集め、蒸
留水で洗浄後、暑。ｖ、ｐＨｇ、、ｒのトリス緩衝液（
Ｔｒｌｓ　ｂｕｆｆ・「）で懸濁し、該懸濁液を超音波
処理して菌体内酵素系の抽出を行う。

この抽出液を再度、遠心分離法によって上澄液を分離し
て該上澄液を菌体内酵素液とし、次いで硫酸アンモニウ
、ムによる飽和分画を行い、次いでＤＥＡＥ−セルロー
ス、ウルトロダルＡｃＡを用いてカラムクロ！トゲラフ
イー及びグルＦ遇を行うことによって脱水素酵素の精製
標品を得ることができる。

なお、菌体の破砕に当っては超音波処理方法のみならず
、通常知られている物理的方法が適用し得ることは当然
である。

このようにして得られた脱水素酸素Ａ（以下、「本酵素
」という。）は、以下に１１ピ岐する如く、最適作用ｐ
）ｌがｉｘ’；：ｇ、ｓ附近で、ガラフタル酸に対する
基質特異性が極めて高い性質を有する既知文献未載の新
規脱水素酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｓ）であるこ
とが証明された。

０本酵素の理化学的性質 １作用及び基質特異性 本酵素は、前記Ｇ−／又（，１Ｇ−コ菌が、基活性測定
法１５＋により、多数の糖類及びその誘導体に対する本
酵素の基質特異性を調べたところ、第７表のとおりの結
果が得られた。この結果、特にガラフタル酸に対して基
質特異性が極めて高いことが明らかにされた。表中の数
値は、酵素活性単位を示す。

第　　ｌ　　表 λ最適−及び安定ｐｉ範囲 ／　０−’　Ｍ　）リス緩衝液を用い、３０℃にて各ｐ
Ｈにおける相対活性を調べたところ第１図のとおりの結
果が得られた、この結果、本酵素の最適ｐＨ＃ｉ、はぼ
Ｓ、５附近であることが明らかにされた。

又、本酵素液の種々のｐＨ溶液を３０℃、６０４間処理
した後％／　０−’　）　Ｑス緩＊＊でｐＭｔｒ、ｓと
し、本酵素の残存活性を調べたところ第２図のとおりの
結果が得られ、ｐｕｒ〜９の範囲に安定ｐＨが存在する
ことが明らかＫされた。

３、作用適温の範囲 本酵素液をｌｏ−’Ｍ）！Ｊス緩衝液によりｐｕｔｌ、
ｓとし、各温度における残存活性ｉ調ぺ九ところ、第３
図のとおりの結果が得られ、本酵素の最適作用温庫は％
ダＯ℃附近であることが明らかにされ九。

倶失活条件（温度安定性）。

本酵皐箪をｌｏ−１Ｍトリス緩衝液によりｐｕざ、ｊＫ
ｍｌ整し％２０〜６０℃の各温度にて１０分間処理後、
残存活性を測定したところ第１図のとおりの結果が得ら
れ２本酵素の温度安定性はダＳ℃以下であることが明ら
かにされた。

より価の測定法 本酵素の酵素活性は、３　ｘ　／　Ｏ−”ｕＮＡｏ駕Ｎ
＾ＤＰ　Ｏ−ｊ　１ｍ　ｆ’　ｔ　＠　ｊ　４　　／　
０−’　Ｍ　）リス緩衝液ｌｖ：水／、Ｏｕ：酵素液０
．１ｗ：／（ｒ’　Ｍ！５り１１に酸浴ｆＭＯ，！ａｔ
：３Ｘ／　０＝　Ｍ　ＭｇＳＯ４，りＨ，Ｏ溶液Ｑ、１
ａｌＪ：、りなる反応系を用いて、３’ｌＯｎｍ　の吸
光度の増加を測定し、／ｎモルＮＡＤＨＲ，Ｎ＾ＤＰ）
％生成／噌分をｌ単位（／　ｕｎｉｔ　）　　とした。

五阻害、活性化および安定化 本酵素は、ピラゾール、０−７エナンスロリン、９−メ
ルクリ安息香酸によって阻害され、ＭＡＤ又はＮＡＯＰ
を補酵素とし、ＭＩＩイオンによシ活性化される。安定
化は硫酸アンモニウムにより行われる。

り酵素の精製法 前記Ｇ−／又はＧ−コ菌の培養菌体を、遠心分離法によ
り集め、これをトリス緩衝液Ｃ９Ｈｇ、Ｓ＞Ｋ懸濁し、
超音波処理により菌体内酵素抽出を行う、再菫遠心分離
後上澄液を硫酸アンモニウムによる飽和画分の分画を・
行い、０ＥＡＥ−セルロースでカラムクロマトグラフィ
ーを行い、得られた溶出液をｒルー過することＫよつイ
最終酵素標品とする。

ｇ分子量 グル濾過法による本酵素の分子量は、約ｌざｏ　、ｏｏ
ｏと測定された。

９　本酵素は結晶化されていないので、結晶構造は明ら
かでない。

ＩＱ、元素分析 本酵素の元素分析値は次のとおりである。

Ｃ：Ｓコ、０％、Ｈ：り、１％、Ｎ：　／＋　、５％以
上のとおり、本発明は、前記Ｇ−／又ｔｆＧ−７菌の如
きバチルス属に属するガラフタル酸資化利用性曹を培養
し、その培警液よりｐＨｔ、！附近に最適ｐＨを有し、
且つガラフタル酸に対し極めて基質特異性の高い新規な
脱水素酵素及びその製造法を提供することを可能とする
ものである。

以下、本発明を実施例により評述する。

賽施例１ ｆラフタル酸を炭素源とした場合の使用培地Ｆｉ。

次の通シである。

Ｉラクタルａｉ　　　　　　１ｏｙ ４リペデトン　　　　　　／１１ 酵母エキス　　　　　　　／１ に　−雪ｐｏ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　／　　＃ｕｇｓｏ４・７Ｈ２００・３ｇ ＮＨ４Ｎ０．　　　　　　　　　／　１１Ｎａ２ＣＯ１
／　０１ 全容童　　　ｉｔ （培地のｐｍ＃ｉｉｏ、ｏで参る。） ３００８１容フラスコに上記の培地ＳＯｄをとり、これ
を殺菌し、前記Ｇ−／■（微工研曹寄第３９２Ｓ号）を
無菌的に接種して、３７℃でｉｔ時間振盪鳩養を行つ九
、得られた培養物を。

／　Ｏｅ　０００　ｒ　、ｐ　、ｍ　、で／Ｑ分間遠心
分離後、　水洗し、１０Ｍトリス緩衝液にｊＩ濁した。

この懸濁ｆｅｌｔｓ　１０ＫＣ，／Ｑ分間超音波処理し
て曹体内騨嵩の抽出を行い＊１０ｅ００θｒ、ｐ、ｍ、
で７０分間再度遠心分離して上澄液を分離した。この上
澄液を硫酸アンモニウムを用いてＯ−Ｏ，Ｓ飽和画分。

次いで０．Ｓ〜０．７の飽和画分の分画を行い。

後者の画分をｌＯＭトリス緩衝液（ｐｌＪｒ、ｊ）で平
衡化し九〇ＥＡＥ−セル四−スカラムを用い。

カラムり繋マトダラフイーを行った０次いで、得られ九
溶出液を接縮して、ウルトロｒル＾Ｃ＾、７４Ｃを用い
てｒル濾過を行って本酵素の精製―品を得た（収率３０
５４　）。

実施例コ 実ＩＩＩＡ例ノにおいて、Ｇ−、／＠に代えて、Ｇ−−
ＩＩ（徽工研曹寄第５９２６号）を用いて同様に培養、
精製を行つ九ところ、収率２Ｓ−で本酵嵩律品を得九。

【図面の簡単な説明】

ｔｓ１図は１本発明による＃素の最適−を示すグラフ、
第２図は、本発明による酵素の安定−を示すグラフ、第
３図は１本発明による＃素の最適作用温度を示すグラフ
及び第４図は９本発明による酵素の温度安定性を示すグ
ラフである。 第１図 ） （ Ｈ ０−０：ＮＡＤＰ ・−・：ＮＡＤ ζ ９　　　　　　１０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ｌ　最適作用ｐＨをは’：ｇ、ｓ附近に有し、且つガ
   、・ラフタル酸に対し基質特異性を有する新規脱水素酵
   素＾。 １２＋　　バチルス属に属するガラフタル酸資化利用性
   薗を培養し、その培養物より最適作用ｐＨを＃１ソｇ、
   Ｓ附近に有し、且つガラフタル酸に対し基質特異性を有
   する新規脱水素酵素＾を採取することを特徴とする新規
   脱水素酵素＾の製造法。 １３１　　Ｉｆチルス層に属するガラフタル酸資化利用
   性曹がバチルス中エスピーｅ　Ｇ　−／　（Ｂａｃｉｌ
   ｌｕｓｓｐ、Ｇ−／）（微工研菌寄第Ｓ９コ５号）であ
   る特許請求の範囲第１２）項記載の製造法。 ＋４１　　バチルス属に属するガラフタル酸資化利用性
   菌がノ寸チルス・エスピーｅ　Ｇ−２（Ｂａｃｉｌｌｕ
   ｓｓｐ、Ｇ−２）（微工研菌寄第ｓ９コロ号）である特
   許請求の範囲第（２１項記載の製造法。