JPH1075785A - キシリトールオキシダーゼ遺伝子 - Google Patents
キシリトールオキシダーゼ遺伝子Info
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- JPH1075785A JPH1075785A JP8230952A JP23095296A JPH1075785A JP H1075785 A JPH1075785 A JP H1075785A JP 8230952 A JP8230952 A JP 8230952A JP 23095296 A JP23095296 A JP 23095296A JP H1075785 A JPH1075785 A JP H1075785A
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- xylitol oxidase
- xylitol
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- protein
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 組換えＤＮＡ法によるキシリトールオキシダ
ーゼの製造法を提供することを目的とする。 【解決手段】 キシリトールオキシダーゼ生産菌である
ストレプトミセス・エスピーＩＫＤ４７２の染色体ＤＮ
Ａからキシリトールオキシダーゼ遺伝子のクローニング
が可能であり、キシリトールオキシダーゼをコードする
全長ＤＮＡの塩基配列が明らかとなり、これを発現ベク
ターに導入し、宿主細胞を形質転換し、得られる形質転
換体を培養することにより、大量にキシリトールオキシ
ダーゼを製造することができる。
ーゼの製造法を提供することを目的とする。 【解決手段】 キシリトールオキシダーゼ生産菌である
ストレプトミセス・エスピーＩＫＤ４７２の染色体ＤＮ
Ａからキシリトールオキシダーゼ遺伝子のクローニング
が可能であり、キシリトールオキシダーゼをコードする
全長ＤＮＡの塩基配列が明らかとなり、これを発現ベク
ターに導入し、宿主細胞を形質転換し、得られる形質転
換体を培養することにより、大量にキシリトールオキシ
ダーゼを製造することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、キシリトールオキ
シダーゼ遺伝子に関する。更に詳細には、肝疾患等の臨
床診断薬として極めて有用であるキシリトールオキシダ
ーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベ
クター、及び該組換えベクターを用いたキシリトールオ
キシダーゼの製造法である。
シダーゼ遺伝子に関する。更に詳細には、肝疾患等の臨
床診断薬として極めて有用であるキシリトールオキシダ
ーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベ
クター、及び該組換えベクターを用いたキシリトールオ
キシダーゼの製造法である。
【０００２】
【従来の技術】キシリトールは、５炭糖の代謝経路であ
るウロン酸経路の中間代謝物であり、ヒト血中にも存在
し、その濃度は、肝疾患で上昇することから、肝臓病の
診断への利用が期待されているものである。従来、キシ
リトールの臨床分析法としては、試料を先ずアルカリで
処理して試料中の糖を分解除去し、過ヨウ素酸で残存す
るキシリトールを酸化した後、クロモトロープ酸を用い
て化学的に発色させて検出する方法（医学のあゆみ７８
４２０（１９７１））、ガスクロマトグラフ法（Ａｎ
ａｌ．Ｃｈｅｍ．３７ １６０２（１９６５））、液体
クロマトグラフ法（Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．２ １６５（１
９８６））、あるいは、Ｌ−キシルロースレダクターゼ
及びＤ−キシルロースレダクターゼを用い補酵素ＮＡＤ
Ｐの存在下にキシリトールを酸化し、還元されたＮＡＤ
ＰＨの吸光度を測定する酵素法（臨床病理２３ ３８１
（１９７５））などが知られている。しかしながら、こ
れらの何れの方法も、操作が複雑であるなどの問題を有
しており、また汎用型の自動生化学測定装置に適用でき
ないなどの難点を有していた。
るウロン酸経路の中間代謝物であり、ヒト血中にも存在
し、その濃度は、肝疾患で上昇することから、肝臓病の
診断への利用が期待されているものである。従来、キシ
リトールの臨床分析法としては、試料を先ずアルカリで
処理して試料中の糖を分解除去し、過ヨウ素酸で残存す
るキシリトールを酸化した後、クロモトロープ酸を用い
て化学的に発色させて検出する方法（医学のあゆみ７８
４２０（１９７１））、ガスクロマトグラフ法（Ａｎ
ａｌ．Ｃｈｅｍ．３７ １６０２（１９６５））、液体
クロマトグラフ法（Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．２ １６５（１
９８６））、あるいは、Ｌ−キシルロースレダクターゼ
及びＤ−キシルロースレダクターゼを用い補酵素ＮＡＤ
Ｐの存在下にキシリトールを酸化し、還元されたＮＡＤ
ＰＨの吸光度を測定する酵素法（臨床病理２３ ３８１
（１９７５））などが知られている。しかしながら、こ
れらの何れの方法も、操作が複雑であるなどの問題を有
しており、また汎用型の自動生化学測定装置に適用でき
ないなどの難点を有していた。
【０００３】このような従来のキシリトールの臨床分析
法の問題点を解決する分析法として、ストレプトミセス
属に属する菌株から単離精製されたキシリトールオキシ
ダーゼを利用した方法が提案されている（特開平８−８
９２４２号公報）。このキシリトールオキシダーゼはキ
シリトールを直接酸化して過酸化水素を生成するため、
過酸化水素を汎用型の自動生化学測定装置によって測定
可能であり、従ってこの方法は自動生化学測定装置に適
用可能なキシリトールの臨床分析法として期待されてい
るものである。
法の問題点を解決する分析法として、ストレプトミセス
属に属する菌株から単離精製されたキシリトールオキシ
ダーゼを利用した方法が提案されている（特開平８−８
９２４２号公報）。このキシリトールオキシダーゼはキ
シリトールを直接酸化して過酸化水素を生成するため、
過酸化水素を汎用型の自動生化学測定装置によって測定
可能であり、従ってこの方法は自動生化学測定装置に適
用可能なキシリトールの臨床分析法として期待されてい
るものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、キシリ
トールオキシダーゼの製造法としては、ストレプトミセ
ス属に属するキシリトールオキシダーゼ生産菌を培養し
てその培養物から得る方法が知られているのみであり、
またキシリトールオキシダーゼは菌体内生産量が極めて
少ないため、その大量生産が従来困難であり、大量に製
造する方法の開発が望まれていた。本発明は、上記実情
に鑑みなされたものであり、その目的は、肝疾患等の診
断薬として有用性の高いキシリトールオキシダーゼの大
量生産を可能とする、組換えＤＮＡ法によるキシリトー
ルオキシダーゼの製造法を提供することにある。また、
本発明の他の目的は、かかる組換えＤＮＡ法に用いるキ
シリトールオキシダーゼをコードする遺伝子、該遺伝子
を含有する組換えベクター及び該組換えベクターによっ
て形質転換された微生物を提供することにある。
トールオキシダーゼの製造法としては、ストレプトミセ
ス属に属するキシリトールオキシダーゼ生産菌を培養し
てその培養物から得る方法が知られているのみであり、
またキシリトールオキシダーゼは菌体内生産量が極めて
少ないため、その大量生産が従来困難であり、大量に製
造する方法の開発が望まれていた。本発明は、上記実情
に鑑みなされたものであり、その目的は、肝疾患等の診
断薬として有用性の高いキシリトールオキシダーゼの大
量生産を可能とする、組換えＤＮＡ法によるキシリトー
ルオキシダーゼの製造法を提供することにある。また、
本発明の他の目的は、かかる組換えＤＮＡ法に用いるキ
シリトールオキシダーゼをコードする遺伝子、該遺伝子
を含有する組換えベクター及び該組換えベクターによっ
て形質転換された微生物を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、組換えＤ
ＮＡ法によるキシリトールオキシダーゼの製造法を開発
することを目的として鋭意研究した結果、ストレプトミ
セス属に属するキシリトールオキシダーゼ生産菌の染色
体ＤＮＡからのキシリトールオキシダーゼをコードする
遺伝子のクローニングに成功し、かかる遺伝子を含有す
る発現ベクターで微生物を形質転換し得られる形質転換
体を培養することによってキシリトールオキシダーゼを
大量に製造できることを見出し、本発明を完成させた。
ＮＡ法によるキシリトールオキシダーゼの製造法を開発
することを目的として鋭意研究した結果、ストレプトミ
セス属に属するキシリトールオキシダーゼ生産菌の染色
体ＤＮＡからのキシリトールオキシダーゼをコードする
遺伝子のクローニングに成功し、かかる遺伝子を含有す
る発現ベクターで微生物を形質転換し得られる形質転換
体を培養することによってキシリトールオキシダーゼを
大量に製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】すなわち、本発明は、以下に示すアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ部分配列を５′末端側に含有す
る、キシリトールオキシダーゼをコードするＤＮＡに関
する。
配列をコードするＤＮＡ部分配列を５′末端側に含有す
る、キシリトールオキシダーゼをコードするＤＮＡに関
する。
【０００７】
【化６】 （ただし、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパ
ラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、
Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋ
はリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパ
ラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
ン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
リプトファン、Ｙはチロシンを示す。）
ラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、
Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋ
はリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパ
ラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
ン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
リプトファン、Ｙはチロシンを示す。）
【０００８】更に本発明は、以下に示すアミノ酸配列か
らなるキシリトールオキシダーゼをコードするＤＮＡ、
または該アミノ酸配列において１もしくは複数個のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列から
なりキシリトールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡに関する。
らなるキシリトールオキシダーゼをコードするＤＮＡ、
または該アミノ酸配列において１もしくは複数個のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列から
なりキシリトールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡに関する。
【化７】 （ただし、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパ
ラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、
Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋ
はリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパ
ラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
ン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
リプトファン、Ｙはチロシンを示す。）
ラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、
Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋ
はリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパ
ラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
ン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
リプトファン、Ｙはチロシンを示す。）
【０００９】更に本発明は、以下に示す塩基配列からな
るキシリトールオキシダーゼをコードするＤＮＡ、また
は該ＤＮＡとハイブリダイズしキシリトールオキシダー
ゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに関す
る。
るキシリトールオキシダーゼをコードするＤＮＡ、また
は該ＤＮＡとハイブリダイズしキシリトールオキシダー
ゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに関す
る。
【００１０】
【化８】
【００１１】更に本発明は、上記のいずれかのＤＮＡを
含有する、キシリトールオキシダーゼもしくはキシリト
ールオキシダーゼ活性を有するタンパク質を発現するた
めの組換えベクターに関する。更に本発明は、上記組換
えベクターによって形質転換された微生物に関する。更
に本発明は、上記の微生物を好適な培地中で培養し、培
養物中にキシリトールオキシダーゼもしくはキシリトー
ルオキシダーゼ活性を有するタンパク質を生成させるこ
とを特徴とするキシリトールオキシダーゼもしくはキシ
リトールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の製造法
に関する。
含有する、キシリトールオキシダーゼもしくはキシリト
ールオキシダーゼ活性を有するタンパク質を発現するた
めの組換えベクターに関する。更に本発明は、上記組換
えベクターによって形質転換された微生物に関する。更
に本発明は、上記の微生物を好適な培地中で培養し、培
養物中にキシリトールオキシダーゼもしくはキシリトー
ルオキシダーゼ活性を有するタンパク質を生成させるこ
とを特徴とするキシリトールオキシダーゼもしくはキシ
リトールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の製造法
に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明で対象とするキシリトール
オキシダーゼは、キシリトールを直接酸化して過酸化水
素を生成する作用を有するものであり、具体的には酸素
の存在下、キシリトールを酸化して過酸化水素及びＤ−
キシロースを生成する能力を有するものである。キシリ
トールオキシダーゼの詳細については特開平８−８９２
４２号公報に記載されている。キシリトールオキシダー
ゼをコードするＤＮＡのクローニングは、ストレプトミ
セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するキシリト
ールオキシダーゼ生産能を有する微生物、例えばストレ
プトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓ
ｐ．）ＩＫＤ４７２（工業技術院生命工学工業技術研究
所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１４３３９）のＤＮＡ染色
体から以下のようにして行うことができる。
オキシダーゼは、キシリトールを直接酸化して過酸化水
素を生成する作用を有するものであり、具体的には酸素
の存在下、キシリトールを酸化して過酸化水素及びＤ−
キシロースを生成する能力を有するものである。キシリ
トールオキシダーゼの詳細については特開平８−８９２
４２号公報に記載されている。キシリトールオキシダー
ゼをコードするＤＮＡのクローニングは、ストレプトミ
セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するキシリト
ールオキシダーゼ生産能を有する微生物、例えばストレ
プトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓ
ｐ．）ＩＫＤ４７２（工業技術院生命工学工業技術研究
所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１４３３９）のＤＮＡ染色
体から以下のようにして行うことができる。
【００１３】キシリトールオキシダーゼ生産菌の菌体か
ら染色体ＤＮＡ溶液を得るための公知の処理を実施して
染色体ＤＮＡ溶液を収得する。すなわち、例えば菌体を
リゾチーム等で処理してその細胞壁を破壊し、次いでプ
ロティナーゼＫ、ＲＮａｓｅなどで処理する通常の方法
により、菌体から染色体ＤＮＡ溶液を得ることができ
る。次いで染色体ＤＮＡを各種制限酵素を用いて完全消
化して各種のＤＮＡ断片を調製し、適当なプローブを用
いてキシリトールオキシダーゼをコードするＤＮＡを含
むＤＮＡ断片を検索する。ここで用いるプローブは、精
製したキシリトールオキシダーゼ中の適当なアミノ酸配
列部分をエドマン分解法により決定し、これらのアミノ
酸配列に基づいて作成することができる。プローブとし
ては、例えば以後に示す実施例で用いられている以下の
塩基配列を有する６６ｂｐのＤＮＡ断片を挙げることが
できる。
ら染色体ＤＮＡ溶液を得るための公知の処理を実施して
染色体ＤＮＡ溶液を収得する。すなわち、例えば菌体を
リゾチーム等で処理してその細胞壁を破壊し、次いでプ
ロティナーゼＫ、ＲＮａｓｅなどで処理する通常の方法
により、菌体から染色体ＤＮＡ溶液を得ることができ
る。次いで染色体ＤＮＡを各種制限酵素を用いて完全消
化して各種のＤＮＡ断片を調製し、適当なプローブを用
いてキシリトールオキシダーゼをコードするＤＮＡを含
むＤＮＡ断片を検索する。ここで用いるプローブは、精
製したキシリトールオキシダーゼ中の適当なアミノ酸配
列部分をエドマン分解法により決定し、これらのアミノ
酸配列に基づいて作成することができる。プローブとし
ては、例えば以後に示す実施例で用いられている以下の
塩基配列を有する６６ｂｐのＤＮＡ断片を挙げることが
できる。
【００１４】
【化９】 このＤＮＡ断片は、キシリトールオキシダーゼのＮ末端
および内部アミノ酸配列部分をエドマン分解法により決
定しこれらのアミノ酸配列に基づいて構築したものであ
り、キシリトールオキシダーゼをコードするＤＮＡの
５′末端側に位置すると考えられるものである。このＤ
ＮＡ断片をプローブとして、各種制限酵素で処理して調
製した染色体ＤＮＡの各種断片をサザンハイブリダイゼ
ーションにより検索し、キシリトールオキシダーゼをコ
ードする全長ＤＮＡを含むと考えられるＤＮＡ断片を決
定する。以後の実施例で示すように、ストレプトミセス
・エスピーＩＫＤ４７２の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓｐ
ｈＩとＳａｌＩで消化して得られる２．８ｋｂｐのＳｐ
ｈＩ−ＳａｌＩ断片中にキシリトールオキシダーゼをコ
ードする全長ＤＮＡが含まれていると考えられた。
および内部アミノ酸配列部分をエドマン分解法により決
定しこれらのアミノ酸配列に基づいて構築したものであ
り、キシリトールオキシダーゼをコードするＤＮＡの
５′末端側に位置すると考えられるものである。このＤ
ＮＡ断片をプローブとして、各種制限酵素で処理して調
製した染色体ＤＮＡの各種断片をサザンハイブリダイゼ
ーションにより検索し、キシリトールオキシダーゼをコ
ードする全長ＤＮＡを含むと考えられるＤＮＡ断片を決
定する。以後の実施例で示すように、ストレプトミセス
・エスピーＩＫＤ４７２の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓｐ
ｈＩとＳａｌＩで消化して得られる２．８ｋｂｐのＳｐ
ｈＩ−ＳａｌＩ断片中にキシリトールオキシダーゼをコ
ードする全長ＤＮＡが含まれていると考えられた。
【００１５】かくして決定されたＤＮＡ断片を対象とし
て以後クローニングを行う。すなわち、例えば上記の
２．８ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ断片を適当なベクタ
ー、例えばｐＵＣ１８に導入して組換えプラスミドを構
築し、大腸菌を形質転換し、得られる形質転換体につい
て、例えば上記した６６ｂｐのＤＮＡ断片をプローブと
してコロニーハイブリダイゼーションを実施して陽性ク
ローンを検出する。この陽性クローンからＤＮＡ断片を
回収して、通常の塩基配列決定法によりキシリトールオ
キシダーゼをコードするＤＮＡを決定することができ
る。
て以後クローニングを行う。すなわち、例えば上記の
２．８ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ断片を適当なベクタ
ー、例えばｐＵＣ１８に導入して組換えプラスミドを構
築し、大腸菌を形質転換し、得られる形質転換体につい
て、例えば上記した６６ｂｐのＤＮＡ断片をプローブと
してコロニーハイブリダイゼーションを実施して陽性ク
ローンを検出する。この陽性クローンからＤＮＡ断片を
回収して、通常の塩基配列決定法によりキシリトールオ
キシダーゼをコードするＤＮＡを決定することができ
る。
【００１６】かくして、以下に示す塩基配列を有するＤ
ＮＡが、キシリトールオキシダーゼをコードする全長Ｄ
ＮＡの５′末端側に位置する１−７２０位のＤＮＡ部分
配列であることが決定された。
ＮＡが、キシリトールオキシダーゼをコードする全長Ｄ
ＮＡの５′末端側に位置する１−７２０位のＤＮＡ部分
配列であることが決定された。
【００１７】
【化１０】 このＤＮＡ部分配列から、キシリトールオキシダーゼの
Ｎ末端側の１−２４０位のアミノ酸配列が以下の通りに
決定された。
Ｎ末端側の１−２４０位のアミノ酸配列が以下の通りに
決定された。
【００１８】
【化１１】 （ただし、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパ
ラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、
Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋ
はリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパ
ラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
ン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
リプトファン、Ｙはチロシンを示す。） キシリトールオキシダーゼをコードする全長ＤＮＡは、
上記したように、ストレプトミセス・エスピーＩＫＤ４
７２の染色体ＤＮＡの２．８ｋｂｐ ＳｐｈＩ−Ｓａｌ
Ｉ断片中から、６６ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして
用いて得ることができ、その全長ＤＮＡは１２４５ｂｐ
であって以下の塩基配列を有する。
ラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、
Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋ
はリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパ
ラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
ン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
リプトファン、Ｙはチロシンを示す。） キシリトールオキシダーゼをコードする全長ＤＮＡは、
上記したように、ストレプトミセス・エスピーＩＫＤ４
７２の染色体ＤＮＡの２．８ｋｂｐ ＳｐｈＩ−Ｓａｌ
Ｉ断片中から、６６ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして
用いて得ることができ、その全長ＤＮＡは１２４５ｂｐ
であって以下の塩基配列を有する。
【００１９】
【化１２】 この全長塩基配列から、キシリトールオキシダーゼは以
下に示すアミノ酸配列からなるタンパク質であることが
判明した。
下に示すアミノ酸配列からなるタンパク質であることが
判明した。
【００２０】
【化１３】 （ただし、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパ
ラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、
Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋ
はリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパ
ラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
ン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
リプトファン、Ｙはチロシンを示す。）
ラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、
Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋ
はリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパ
ラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
ン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
リプトファン、Ｙはチロシンを示す。）
【００２１】上記した塩基配列からなるキシリトールオ
キシダーゼをコードする全長ＤＮＡの他に、該ＤＮＡと
ハイブリダイズしキシリトールオキシダーゼ活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の範囲内のも
のである。すなわち、上記した全長ＤＮＡ配列におい
て、変異剤処理、ランダム変異、特定部位突然変異、欠
損あるいは挿入などによって部分的にＤＮＡ配列が変化
したものであっても、これらのＤＮＡ変異体が上記した
全長ＤＮＡ配列とハイブリダイズしキシリトールオキシ
ダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであ
れば同様に本発明の範囲内のものである。このようなＤ
ＮＡ変異体としては、キシリトールオキシダーゼ生産菌
において生じる退行変性によるもの、あるいは自然に生
じる変換体などが挙げられる。あるいはまた特定部位変
異誘発、エンドヌクレアーゼもしくは制限酵素などによ
るＤＮＡ断片の変異、欠失、連結等の人為的手段によっ
て構築される変換体であってもよい。ＤＮＡ変異体の変
異の程度は、上記全長ＤＮＡ配列と９０％以上の相同性
を有するものであればほぼ許容しうる範囲内である。ま
た、全長ＤＮＡとハイブリダイズする程度としては、例
えば通常の条件下（例えばＥＣＬランダムプライムＤＮ
Ａラベリング・検出システムにおいて、４２℃のハイブ
リダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、０．１％
〔ｗ／ｖ〕ＳＤＳ、０．５％〔ｗ／ｖ〕デキストラン硫
酸、全容量の１／２０量のリキッドブロック）中でハイ
ブリダイズさせ、６０℃の０．５×ＳＳＣ（０．１％
〔ｗ／ｖ〕ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条
件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウムである。））でサザンハイブリダ
イゼーションによりハイブリダイズするものである。
キシダーゼをコードする全長ＤＮＡの他に、該ＤＮＡと
ハイブリダイズしキシリトールオキシダーゼ活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の範囲内のも
のである。すなわち、上記した全長ＤＮＡ配列におい
て、変異剤処理、ランダム変異、特定部位突然変異、欠
損あるいは挿入などによって部分的にＤＮＡ配列が変化
したものであっても、これらのＤＮＡ変異体が上記した
全長ＤＮＡ配列とハイブリダイズしキシリトールオキシ
ダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであ
れば同様に本発明の範囲内のものである。このようなＤ
ＮＡ変異体としては、キシリトールオキシダーゼ生産菌
において生じる退行変性によるもの、あるいは自然に生
じる変換体などが挙げられる。あるいはまた特定部位変
異誘発、エンドヌクレアーゼもしくは制限酵素などによ
るＤＮＡ断片の変異、欠失、連結等の人為的手段によっ
て構築される変換体であってもよい。ＤＮＡ変異体の変
異の程度は、上記全長ＤＮＡ配列と９０％以上の相同性
を有するものであればほぼ許容しうる範囲内である。ま
た、全長ＤＮＡとハイブリダイズする程度としては、例
えば通常の条件下（例えばＥＣＬランダムプライムＤＮ
Ａラベリング・検出システムにおいて、４２℃のハイブ
リダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、０．１％
〔ｗ／ｖ〕ＳＤＳ、０．５％〔ｗ／ｖ〕デキストラン硫
酸、全容量の１／２０量のリキッドブロック）中でハイ
ブリダイズさせ、６０℃の０．５×ＳＳＣ（０．１％
〔ｗ／ｖ〕ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条
件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウムである。））でサザンハイブリダ
イゼーションによりハイブリダイズするものである。
【００２２】上記したキシリトールオキシダーゼのアミ
ノ酸配列も、そのアミノ酸配列において１もしくは複数
個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列であってもキシリトールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質であれば本発明のの範囲内のものである。ア
ミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、実質的にそのタン
パク質全体の構造及び活性に影響を与えない程度のもの
であり、例えばアミノ酸の置換としては同様の疎水性、
大きさ、電荷及び／又は芳香性を有するアミノ酸同志の
置換が挙げられる。このような置換としては、例えばグ
リシンとプロリン、チロシンとトリプトファン、アスパ
ラギンとセリンとの置換が挙げられる。これらのアミノ
酸の欠失、置換、付加の程度は、もとのアミノ酸配列と
の相同性が９０％以上のものが許容し得る範囲である。
ノ酸配列も、そのアミノ酸配列において１もしくは複数
個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列であってもキシリトールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質であれば本発明のの範囲内のものである。ア
ミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、実質的にそのタン
パク質全体の構造及び活性に影響を与えない程度のもの
であり、例えばアミノ酸の置換としては同様の疎水性、
大きさ、電荷及び／又は芳香性を有するアミノ酸同志の
置換が挙げられる。このような置換としては、例えばグ
リシンとプロリン、チロシンとトリプトファン、アスパ
ラギンとセリンとの置換が挙げられる。これらのアミノ
酸の欠失、置換、付加の程度は、もとのアミノ酸配列と
の相同性が９０％以上のものが許容し得る範囲である。
【００２３】以上に述べたキシリトールオキシダーゼも
しくはその活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を適当なベクターに導入して発現用の組換えベクターを
構築し、このベクターで微生物を形質転換し、得られる
形質転換体を培養することにより、その培養物からキシ
リトールオキシダーゼもしくはキシリトールオキシダー
ゼ活性を有するタンパク質を製造することができる。こ
こで用いられる適当なベクターとしては、例えば、ｐＵ
Ｃ１８（宝酒造社製）、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシ
ア社製）などの大腸菌での発現用プラスミドが挙げられ
る。これら以外にも、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属などの原核細
胞、あるいは酵母、動物細胞などの真核細胞中での発現
用に用いられる通常の発現用ベクターを用いることがで
きる。このような発現用ベクターにキシリトールオキシ
ダーゼもしくはその活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡが導入された組換えベクターとしては、以後の
実施例で構築されたプラスミドｐＸＹ０１０、ｐＸＹ０
２０、ｐＸＹ０３０などが例示される。これらの組換え
ベクター又は宿主に適するよう改変したベクターで原核
細胞、真核細胞などの微生物を通常の方法で形質転換し
得られる形質転換体を培養することによりキシリトール
オキシダーゼあるいはその活性を有するタンパク質を得
ることができる。
しくはその活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を適当なベクターに導入して発現用の組換えベクターを
構築し、このベクターで微生物を形質転換し、得られる
形質転換体を培養することにより、その培養物からキシ
リトールオキシダーゼもしくはキシリトールオキシダー
ゼ活性を有するタンパク質を製造することができる。こ
こで用いられる適当なベクターとしては、例えば、ｐＵ
Ｃ１８（宝酒造社製）、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシ
ア社製）などの大腸菌での発現用プラスミドが挙げられ
る。これら以外にも、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属などの原核細
胞、あるいは酵母、動物細胞などの真核細胞中での発現
用に用いられる通常の発現用ベクターを用いることがで
きる。このような発現用ベクターにキシリトールオキシ
ダーゼもしくはその活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡが導入された組換えベクターとしては、以後の
実施例で構築されたプラスミドｐＸＹ０１０、ｐＸＹ０
２０、ｐＸＹ０３０などが例示される。これらの組換え
ベクター又は宿主に適するよう改変したベクターで原核
細胞、真核細胞などの微生物を通常の方法で形質転換し
得られる形質転換体を培養することによりキシリトール
オキシダーゼあるいはその活性を有するタンパク質を得
ることができる。
【００２４】
【実施例】以下、本発明を実施例によって更に詳細に説
明するが本発明は以下の実施例のみに制限されるもので
はない。 実施例１キシリトールオキシダーゼ遺伝子のクローニング （１）ストレプトミセス・エスピーＩＫＤ４７２の染色
体ＤＮＡの調製 ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｓｐ．）ＩＫＤ４７２（工業技術院生命工学工業技
術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１４３３９）を２０
０ｍｌの培地に植菌し、５０℃で一晩振盪培養した後、
遠心分離により集菌した。菌体を１８ｍｌのＴＥＮ緩衝
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ〔ｐＨ８．０〕，１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、１０
ｍｇのリゾチームと８ｍｇのアクロモペプチダーゼを加
えて、３７℃で６０分間ゆるやかに振盪した。ついで、
１０％ＳＤＳ溶液０．５３ｍｌと１ｍｇのプロティナー
ゼＫを加え、３７℃で６０分間振盪した。ＴＥ溶液で飽
和したフェノール２０ｍｌを加え、ゆるやかに攪拌した
後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）し、上
清を回収した。この溶液に、フェノール・クロロホルム
・イソアミルアルコール（フェノール・クロロホルム・
イソアミルアルコール＝５：４：１）を等量加え、ゆる
やかに攪拌した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，５
ｍｉｎ）し、上清を回収した。この溶液に、クロロホル
ムを等量加え、ゆるやかに攪拌した後、遠心分離（１
２，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）し、上清を回収した。こ
の溶液に、２倍量の冷エタノールをゆっくり加え、ガラ
ス棒により繊維状の沈殿を巻き取り、７０％、８０％、
９０％のエタノールに順次、数分ずつ浸漬して洗浄した
後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ〔ｐＨ
８．０〕，１ｍＭＥＤＴＡ）２ｍｌに溶解した。この溶
液にＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ、株式会社ニッポンジ
ーン社製）５μｌを加え３７℃で６０分処理し、ストレ
プトミセス・エスピーＩＫＤ４７２の染色体ＤＮＡ溶液
として以下の実験に用いた。ＤＮＡ濃度は３９４μｇ／
ｍｌであった。
明するが本発明は以下の実施例のみに制限されるもので
はない。 実施例１キシリトールオキシダーゼ遺伝子のクローニング （１）ストレプトミセス・エスピーＩＫＤ４７２の染色
体ＤＮＡの調製 ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｓｐ．）ＩＫＤ４７２（工業技術院生命工学工業技
術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１４３３９）を２０
０ｍｌの培地に植菌し、５０℃で一晩振盪培養した後、
遠心分離により集菌した。菌体を１８ｍｌのＴＥＮ緩衝
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ〔ｐＨ８．０〕，１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、１０
ｍｇのリゾチームと８ｍｇのアクロモペプチダーゼを加
えて、３７℃で６０分間ゆるやかに振盪した。ついで、
１０％ＳＤＳ溶液０．５３ｍｌと１ｍｇのプロティナー
ゼＫを加え、３７℃で６０分間振盪した。ＴＥ溶液で飽
和したフェノール２０ｍｌを加え、ゆるやかに攪拌した
後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）し、上
清を回収した。この溶液に、フェノール・クロロホルム
・イソアミルアルコール（フェノール・クロロホルム・
イソアミルアルコール＝５：４：１）を等量加え、ゆる
やかに攪拌した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，５
ｍｉｎ）し、上清を回収した。この溶液に、クロロホル
ムを等量加え、ゆるやかに攪拌した後、遠心分離（１
２，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）し、上清を回収した。こ
の溶液に、２倍量の冷エタノールをゆっくり加え、ガラ
ス棒により繊維状の沈殿を巻き取り、７０％、８０％、
９０％のエタノールに順次、数分ずつ浸漬して洗浄した
後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ〔ｐＨ
８．０〕，１ｍＭＥＤＴＡ）２ｍｌに溶解した。この溶
液にＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ、株式会社ニッポンジ
ーン社製）５μｌを加え３７℃で６０分処理し、ストレ
プトミセス・エスピーＩＫＤ４７２の染色体ＤＮＡ溶液
として以下の実験に用いた。ＤＮＡ濃度は３９４μｇ／
ｍｌであった。
【００２５】（２）プローブの調製 精製キシリトールオキシダーゼのＮ末端および内部アミ
ノ酸配列をエドマン分解法により決定した。このアミノ
酸配列から対応する以下に示す２つの合成オリゴヌクレ
オチドをデザインした。
ノ酸配列をエドマン分解法により決定した。このアミノ
酸配列から対応する以下に示す２つの合成オリゴヌクレ
オチドをデザインした。
【化１４】 これをプライマーにして（１）で得られた染色体ＤＮＡ
を用いてＰＣＲを行った。増幅した遺伝子をシークェン
スしたところ、プライマーに相当するアミノ酸配列とそ
の他の内部アミノ酸配列が存在したので、キシリトール
オキシダーゼ遺伝子の一部と判断した。ここで得られた
以下に示す塩基配列を有する６６ｂｐのＤＮＡ断片を
３′−オリゴラベリングシステム（アマシャム社製）を
用いてフルオレセインラベルし、プローブ（１５．７ｎ
ｇ／μｌ）として以下の実験に用いた。
を用いてＰＣＲを行った。増幅した遺伝子をシークェン
スしたところ、プライマーに相当するアミノ酸配列とそ
の他の内部アミノ酸配列が存在したので、キシリトール
オキシダーゼ遺伝子の一部と判断した。ここで得られた
以下に示す塩基配列を有する６６ｂｐのＤＮＡ断片を
３′−オリゴラベリングシステム（アマシャム社製）を
用いてフルオレセインラベルし、プローブ（１５．７ｎ
ｇ／μｌ）として以下の実験に用いた。
【００２６】
【化１５】
【００２７】（３）サザンハイブリダイゼーション （１）で調製した染色体ＤＮＡを、各種制限酵素を用い
て完全消化し、１．５％アガロース電気泳動で泳動後、
サザンブロット法によりＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン
（アマシャム社製）にトランスファーした。このメンブ
レンを８０℃の乾燥機で２時間かけてＤＮＡを固定し
た。このメンブレンに対して、３′−オリゴラベリング
システム（アマシャム社製）を用いて（２）で調製した
プローブをハイブリダイズさせた。方法は以下の通り行
った。１４４ｃｍ2 のメンブレンを３′−オリゴラベリ
ングシステム（アマシャム社製）記載のハイブリダイゼ
ーションバッファー４８ｍｌに浸し、６５℃で３０分間
振盪水浴でプレハイブリダイゼーションを行った。プレ
ハイブリダイゼーションを行ったバッファーに（２）で
調製したプローブを５４．４μｌ加え、引き続き６５℃
で２時間振盪水浴でハイブリダイゼーションを行った。
次いで、メンブレンを充分量の５×ＳＳＣ（７５ｍＭク
エン酸ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム〔ｐＨ
７．０〕）−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液に浸し、室
温で５分間振盪後、新しい５×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ溶液に入れ替え、さらに室温で５分間振盪し
た。次いで、メンブレンを充分量の１×ＳＳＣ（１５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム〔ｐ
Ｈ７．０〕）−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液に浸し、
４２℃で１５分間振盪後、新しい１×ＳＳＣ−０．１％
（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液に入れ替え、さらに４２℃で１５
分間振盪した。その後の操作は、３′−オリゴラベリン
グシステム（アマシャム社製）記載の方法に従い、メン
ブレンをブロッキングした後、ＨＲＰ（ホースラディッ
シュパーオキシダーゼ）標識抗フルオレセイン抗体を結
合させた。さらに、メンブレンに検出液をかけ、ＨＲＰ
と検出試薬との反応により生ずる化学発光を、Ｈｙｐｅ
ｒｆｉｌｍ−ＥＣＬ（アマシャム社製）に感光させた。
以上の方法により、検出された断片のサイズからキシリ
トールオキシダーゼ遺伝子周辺の制限酵素地図を作成し
た（図１）。この結果より本酵素の全域を含むと思われ
る２．８ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ断片をクローニン
グすることとした。
て完全消化し、１．５％アガロース電気泳動で泳動後、
サザンブロット法によりＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン
（アマシャム社製）にトランスファーした。このメンブ
レンを８０℃の乾燥機で２時間かけてＤＮＡを固定し
た。このメンブレンに対して、３′−オリゴラベリング
システム（アマシャム社製）を用いて（２）で調製した
プローブをハイブリダイズさせた。方法は以下の通り行
った。１４４ｃｍ2 のメンブレンを３′−オリゴラベリ
ングシステム（アマシャム社製）記載のハイブリダイゼ
ーションバッファー４８ｍｌに浸し、６５℃で３０分間
振盪水浴でプレハイブリダイゼーションを行った。プレ
ハイブリダイゼーションを行ったバッファーに（２）で
調製したプローブを５４．４μｌ加え、引き続き６５℃
で２時間振盪水浴でハイブリダイゼーションを行った。
次いで、メンブレンを充分量の５×ＳＳＣ（７５ｍＭク
エン酸ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム〔ｐＨ
７．０〕）−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液に浸し、室
温で５分間振盪後、新しい５×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ溶液に入れ替え、さらに室温で５分間振盪し
た。次いで、メンブレンを充分量の１×ＳＳＣ（１５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム〔ｐ
Ｈ７．０〕）−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液に浸し、
４２℃で１５分間振盪後、新しい１×ＳＳＣ−０．１％
（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液に入れ替え、さらに４２℃で１５
分間振盪した。その後の操作は、３′−オリゴラベリン
グシステム（アマシャム社製）記載の方法に従い、メン
ブレンをブロッキングした後、ＨＲＰ（ホースラディッ
シュパーオキシダーゼ）標識抗フルオレセイン抗体を結
合させた。さらに、メンブレンに検出液をかけ、ＨＲＰ
と検出試薬との反応により生ずる化学発光を、Ｈｙｐｅ
ｒｆｉｌｍ−ＥＣＬ（アマシャム社製）に感光させた。
以上の方法により、検出された断片のサイズからキシリ
トールオキシダーゼ遺伝子周辺の制限酵素地図を作成し
た（図１）。この結果より本酵素の全域を含むと思われ
る２．８ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ断片をクローニン
グすることとした。
【００２８】（４）染色体ＤＮＡ断片の調製 （１）で調製した染色体ＤＮＡ２０μｇを制限酵素Ｓｐ
ｈＩとＳａｌＩ（いずれも宝酒造社製）を用いて消化
後、１％濃度のアガロースゲル電気泳動で分離し、エチ
ジウムブロマイド染色後、２．８ｋｂｐの染色体ＤＮＡ
断片に対応するゲルの位置を切り出して、ＥＡＳＹＴＲ
ＡＰ ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて目的ＤＮＡ断
片を回収した。
ｈＩとＳａｌＩ（いずれも宝酒造社製）を用いて消化
後、１％濃度のアガロースゲル電気泳動で分離し、エチ
ジウムブロマイド染色後、２．８ｋｂｐの染色体ＤＮＡ
断片に対応するゲルの位置を切り出して、ＥＡＳＹＴＲ
ＡＰ ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて目的ＤＮＡ断
片を回収した。
【００２９】（５）プラスミドベクターの調製 ｐＵＣ１８（宝酒造社製）３μｇを制限酵素ＳｐｈＩと
ＳａｌＩで完全消化後、１％ゲル濃度のアガロースゲル
電気泳動を行ない、エチジウムブロマイド染色後２．６
８ｋｂｐの直鎖状プラスミドＤＮＡ断片をゲルと一緒に
切り出し、ＥＡＳＹＴＲＡＰ ｖｅｒ．２（宝酒造社
製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。
ＳａｌＩで完全消化後、１％ゲル濃度のアガロースゲル
電気泳動を行ない、エチジウムブロマイド染色後２．６
８ｋｂｐの直鎖状プラスミドＤＮＡ断片をゲルと一緒に
切り出し、ＥＡＳＹＴＲＡＰ ｖｅｒ．２（宝酒造社
製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。
【００３０】（６）染色体ＤＮＡ断片とプラスミドベク
ターの結合 （４）で調製した染色体ＤＮＡ断片と（５）で調製した
プラスミドベクターとの混合物をエタノール沈殿し、沈
殿物を７０％エタノールで洗浄、真空乾燥後、ＴＥ緩衝
液４μｌに溶解した。これにＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＩ液を等量加
え、１６℃で３時間反応させ、染色体ＤＮＡ断片とプラ
スミドベクターを結合させた。
ターの結合 （４）で調製した染色体ＤＮＡ断片と（５）で調製した
プラスミドベクターとの混合物をエタノール沈殿し、沈
殿物を７０％エタノールで洗浄、真空乾燥後、ＴＥ緩衝
液４μｌに溶解した。これにＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＩ液を等量加
え、１６℃で３時間反応させ、染色体ＤＮＡ断片とプラ
スミドベクターを結合させた。
【００３１】（７）キシリトールオキシダーゼの遺伝子
のクローニング（Ｉ） （６）で調製した組み換えプラスミドを含む反応液を用
いて大腸菌の形質転換を行った。コンピテントセルＪＭ
１０９（宝酒造社製）１００μｌに（６）で調製した反
応液を加えて、０℃で３０分間放置後、４５℃で１分間
保ち、再び氷中に１分間放置した後、ＳＯＣ培地９００
μｌを加え、３７℃で３０分間培養した。この培養液を
塗布して、３７℃で一晩培養したＬＢプレートに、５６
５個のコロニーが生じた。これら一つ一つのコロニーを
ＬＢプレートにのせたＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン
（アマシャム社製）に爪楊枝を用いて接種し３７℃で一
晩培養した。このメンブレンを、プレートから剥がし
て、０．５Ｍ ＮａＯＨに浸した２枚のＷｈａｔｍａｎ
−３ＭＭ濾紙の上に、コロニーの接種面を上にして１５
分放置し、菌を溶菌させるとともに、ＤＮＡをメンブレ
ンに固定した。ついで、メンブレンを充分量の２×ＳＳ
Ｃ（３０ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナト
リウム〔ｐＨ７．０〕）溶液で２０分間振盪し、さらに
新しい２×ＳＳＣ溶液を入れ替えて２０分間振盪し洗浄
した。ついで、メンブレンを濾紙上で風乾した。このメ
ンブレンに対して、（２）で調製したプローブを用い、
（３）で行った方法に準じてコロニーハイブリダイゼー
ションを行ったところ、調べた１６７コロニー中４個が
陽性クローンであることが判明した。
のクローニング（Ｉ） （６）で調製した組み換えプラスミドを含む反応液を用
いて大腸菌の形質転換を行った。コンピテントセルＪＭ
１０９（宝酒造社製）１００μｌに（６）で調製した反
応液を加えて、０℃で３０分間放置後、４５℃で１分間
保ち、再び氷中に１分間放置した後、ＳＯＣ培地９００
μｌを加え、３７℃で３０分間培養した。この培養液を
塗布して、３７℃で一晩培養したＬＢプレートに、５６
５個のコロニーが生じた。これら一つ一つのコロニーを
ＬＢプレートにのせたＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン
（アマシャム社製）に爪楊枝を用いて接種し３７℃で一
晩培養した。このメンブレンを、プレートから剥がし
て、０．５Ｍ ＮａＯＨに浸した２枚のＷｈａｔｍａｎ
−３ＭＭ濾紙の上に、コロニーの接種面を上にして１５
分放置し、菌を溶菌させるとともに、ＤＮＡをメンブレ
ンに固定した。ついで、メンブレンを充分量の２×ＳＳ
Ｃ（３０ｍＭクエン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナト
リウム〔ｐＨ７．０〕）溶液で２０分間振盪し、さらに
新しい２×ＳＳＣ溶液を入れ替えて２０分間振盪し洗浄
した。ついで、メンブレンを濾紙上で風乾した。このメ
ンブレンに対して、（２）で調製したプローブを用い、
（３）で行った方法に準じてコロニーハイブリダイゼー
ションを行ったところ、調べた１６７コロニー中４個が
陽性クローンであることが判明した。
【００３２】これら４個の陽性クローンからアルカリ法
でプラスミドを調製し、各種制限酵素で分析したとこ
ろ、何れも２．８ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＳａｌＩの同一断
片を含むプラスミドであることが判明した。このプラス
ミドをｐＸＹ０１０と命名した。プラスミドｐＸＹ０１
０の構築図を図２に示した。ｐＸＹ０１０が導入された
形質転換大腸菌を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＸＹ０１０と呼
ぶことにする。ｐＸＹ０１０に挿入されたＤＮＡ断片を
シークェンスした結果、１２４５ｂｐからなるキシリト
ールオキシダーゼのオープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）が確認された。キシリトールオキシダーゼのＯＲ
Ｆの塩基配列を図３に示した（末尾記載のＴＧＡは終止
コドン）。またプラスミドｐＸＹ０１０中に挿入された
２．８ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡ断片の全塩
基配列を図４に示した。
でプラスミドを調製し、各種制限酵素で分析したとこ
ろ、何れも２．８ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＳａｌＩの同一断
片を含むプラスミドであることが判明した。このプラス
ミドをｐＸＹ０１０と命名した。プラスミドｐＸＹ０１
０の構築図を図２に示した。ｐＸＹ０１０が導入された
形質転換大腸菌を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＸＹ０１０と呼
ぶことにする。ｐＸＹ０１０に挿入されたＤＮＡ断片を
シークェンスした結果、１２４５ｂｐからなるキシリト
ールオキシダーゼのオープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）が確認された。キシリトールオキシダーゼのＯＲ
Ｆの塩基配列を図３に示した（末尾記載のＴＧＡは終止
コドン）。またプラスミドｐＸＹ０１０中に挿入された
２．８ｋｂｐのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡ断片の全塩
基配列を図４に示した。
【００３３】プラスミドｐＸＹ０１０はキシリトールオ
キシダーゼ遺伝子上流に余分の配列を含むことがわかっ
たので、Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏ
ｎＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて、デリーションを行っ
た。プラスミドｐＸＹ０１０をＳａｃＩ、ＸｂａＩで切
断し、ＸｂａＩ側からキシリトールオキシダーゼ遺伝子
上流の余分の配列のデリーションを行った。デリーショ
ンサンプルについてアガロースゲル電気泳動を行い、プ
ラスミドｐＸＹ０１０から約３００ｂｐ間隔で切り縮ま
った直鎖状プラスミドをそれぞれゲルから回収し、ＤＮ
Ａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社
製）を用いてライゲーション反応を行った。この反応液
を用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行ったところ、
２６個のコロニーが得られた。キシリトールオキシダー
ゼ活性を調べた結果、１６コロニーに活性が見られ、そ
のうち最も活性の高かった一株につきプラスミドを調製
して制限酵素分析を行った。このプラスミドはキシリト
ールオキシダーゼ遺伝子の全域を含む約４．３ｋｂｐの
プラスミドであることがわかった。このプラスミドをｐ
ＸＹ０２０と命名した。またｐＸＹ０２０が導入された
形質転換大腸菌を、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐ
ＸＹ０２０と呼ぶことにする。プラスミドｐＸＹ０２０
の構築図は図２に示されており、プラスミドｐＸＹ０２
０のＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩ部位に挿入されたキシリト
ールオキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を
図５に示した。
キシダーゼ遺伝子上流に余分の配列を含むことがわかっ
たので、Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏ
ｎＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて、デリーションを行っ
た。プラスミドｐＸＹ０１０をＳａｃＩ、ＸｂａＩで切
断し、ＸｂａＩ側からキシリトールオキシダーゼ遺伝子
上流の余分の配列のデリーションを行った。デリーショ
ンサンプルについてアガロースゲル電気泳動を行い、プ
ラスミドｐＸＹ０１０から約３００ｂｐ間隔で切り縮ま
った直鎖状プラスミドをそれぞれゲルから回収し、ＤＮ
Ａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社
製）を用いてライゲーション反応を行った。この反応液
を用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行ったところ、
２６個のコロニーが得られた。キシリトールオキシダー
ゼ活性を調べた結果、１６コロニーに活性が見られ、そ
のうち最も活性の高かった一株につきプラスミドを調製
して制限酵素分析を行った。このプラスミドはキシリト
ールオキシダーゼ遺伝子の全域を含む約４．３ｋｂｐの
プラスミドであることがわかった。このプラスミドをｐ
ＸＹ０２０と命名した。またｐＸＹ０２０が導入された
形質転換大腸菌を、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐ
ＸＹ０２０と呼ぶことにする。プラスミドｐＸＹ０２０
の構築図は図２に示されており、プラスミドｐＸＹ０２
０のＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩ部位に挿入されたキシリト
ールオキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を
図５に示した。
【００３４】（８）キシリトールオキシダーゼ遺伝子の
クローニング（ＩＩ） （７）で決定したストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）ＩＫＤ４７２のキシリトー
ルオキシダーゼ遺伝子の塩基配列より、ＯＲＦをはさむ
ように、上流と下流にそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩサイトをデザインした合成オリゴヌクレオ
チドを作成し、これをプライマーに（１）で得られたス
トレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．）ＩＫＤ４７２の染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲ
を行った。増幅ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化後アガロースゲル電気泳動で精製し、同様に制
限酵素処理・精製した発現用ベクターｐＫＫ２２３−３
（ファルマシア社製）に連結して、大腸菌ＪＭ１０９株
に導入した。ここで得られた組み換えプラスミドをｐＸ
Ｙ０３０、それを導入した大腸菌をエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９／ｐＸＹ０３０と呼ぶ。プラスミドｐＸＹ０
３０の構築図を図６に示した。またプラスミドｐＸＹ０
３０に挿入されたキシリトールオキシダーゼ遺伝子から
なるＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の塩基配列を図７
に示した。なお、上記組み換えプラスミドを導入した大
腸菌のうち、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＸＹ０
２０は、工業技術院生命工学工業技術研究所において、
ＦＥＲＭ Ｐ−１５８０４として、平成８年８月２３日
から寄託保管されている。
クローニング（ＩＩ） （７）で決定したストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）ＩＫＤ４７２のキシリトー
ルオキシダーゼ遺伝子の塩基配列より、ＯＲＦをはさむ
ように、上流と下流にそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩサイトをデザインした合成オリゴヌクレオ
チドを作成し、これをプライマーに（１）で得られたス
トレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．）ＩＫＤ４７２の染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲ
を行った。増幅ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化後アガロースゲル電気泳動で精製し、同様に制
限酵素処理・精製した発現用ベクターｐＫＫ２２３−３
（ファルマシア社製）に連結して、大腸菌ＪＭ１０９株
に導入した。ここで得られた組み換えプラスミドをｐＸ
Ｙ０３０、それを導入した大腸菌をエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９／ｐＸＹ０３０と呼ぶ。プラスミドｐＸＹ０
３０の構築図を図６に示した。またプラスミドｐＸＹ０
３０に挿入されたキシリトールオキシダーゼ遺伝子から
なるＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の塩基配列を図７
に示した。なお、上記組み換えプラスミドを導入した大
腸菌のうち、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＸＹ０
２０は、工業技術院生命工学工業技術研究所において、
ＦＥＲＭ Ｐ−１５８０４として、平成８年８月２３日
から寄託保管されている。
【００３５】実施例２ エシェリヒア・コリＪＭ１０９
／ｐＸＹ０１０によるキシリトールオキシダーゼの製造 エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＸＹ０１０をアンピ
シリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ培地５ｍｌに接
種し、３７℃で一晩培養した前培養液１ｍｌを、アンピ
シリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ培地５０ｍｌに
接種し、３７℃で６時間培養後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍ
Ｍになるように添加し、更に３時間培養した後、遠心に
より集菌した。集菌した菌体をリン酸カリウム緩衝液
（２０ｍＭ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭジチオスレイトー
ル含有）で洗浄したのち、同緩衝液５ｍｌに懸濁した。
超音波破砕装置で菌体を破砕し、１５，０００ｒｐｍで
１５分間遠心分離し、上清を回収した。この上清につい
て、キシリトールオキシダーゼ活性を調べたところ、培
養液あたり０．００６４Ｕ／ｍｌのキシリトールオキシ
ダーゼ活性が確認された。キシリトールオキシダーゼ活
性の測定は、特開平８−８９２４２号公報に記載された
活性測定法１に従って実施した。
／ｐＸＹ０１０によるキシリトールオキシダーゼの製造 エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＸＹ０１０をアンピ
シリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ培地５ｍｌに接
種し、３７℃で一晩培養した前培養液１ｍｌを、アンピ
シリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ培地５０ｍｌに
接種し、３７℃で６時間培養後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍ
Ｍになるように添加し、更に３時間培養した後、遠心に
より集菌した。集菌した菌体をリン酸カリウム緩衝液
（２０ｍＭ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭジチオスレイトー
ル含有）で洗浄したのち、同緩衝液５ｍｌに懸濁した。
超音波破砕装置で菌体を破砕し、１５，０００ｒｐｍで
１５分間遠心分離し、上清を回収した。この上清につい
て、キシリトールオキシダーゼ活性を調べたところ、培
養液あたり０．００６４Ｕ／ｍｌのキシリトールオキシ
ダーゼ活性が確認された。キシリトールオキシダーゼ活
性の測定は、特開平８−８９２４２号公報に記載された
活性測定法１に従って実施した。
【００３６】実施例３ エシェリヒア・コリＪＭ１０９
／ｐＸＹ０２０によるキシリトールオキシダーゼの製造 エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＸＹ０２０をアンピ
シリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ培地１０ｍｌに
接種し、３７℃で一晩培養した前培養液１ｍｌを、アン
ピシリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ培地５０ｍｌ
に接種し、３７℃で４時間培養後、ＩＰＴＧを終濃度１
ｍＭになるように添加し、更に４時間培養した後、遠心
により集菌した。集菌した菌体を、リン酸カリウム緩衝
液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭジチオスレイト
ール含有）で洗浄したのち、同緩衝液４ｍｌに懸濁し
た。超音波破砕装置で菌体を破砕し、１５，０００ｒｐ
ｍで１５分間遠心分離して、上清を回収した。この上清
について、６０℃で２０分間の熱処理後、１５，０００
ｒｐｍで１５分間遠心分離して、上清を回収した。この
上清をリン酸カリウム緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ７．３、
０．１ｍＭジチオスレイトール含有）に対して透析後、
キシロースをリガンドとしたアフィニティクロマトにか
け、リン酸カリウム緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ７．３、０．
１ｍＭジチオスレイトール含有）で溶出した。溶出液を
セントリプレップ−１０（グレースジャパン株式会社
製）を用いて遠心濃縮し、電気泳動的に単一のバンドを
示すキシリトールオキシダーゼ１３．８ユニットを得
た。最終比活性は１９．７Ｕ／ｍｇ、活性収率は４３％
であった。得られたキシリトールオキシダーゼについ
て、分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）、最適温度、温度安定性、最適ｐＨ、ｐＨ安定性及
び基質特異性を調べたところ、ストレプトミセス・エス
ピーＩＫＤ４７２から精製した本来のキシリトールオキ
シダーゼ（特開平８−８９２４２号公報）との間に差は
認められなかった。
／ｐＸＹ０２０によるキシリトールオキシダーゼの製造 エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＸＹ０２０をアンピ
シリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ培地１０ｍｌに
接種し、３７℃で一晩培養した前培養液１ｍｌを、アン
ピシリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ培地５０ｍｌ
に接種し、３７℃で４時間培養後、ＩＰＴＧを終濃度１
ｍＭになるように添加し、更に４時間培養した後、遠心
により集菌した。集菌した菌体を、リン酸カリウム緩衝
液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭジチオスレイト
ール含有）で洗浄したのち、同緩衝液４ｍｌに懸濁し
た。超音波破砕装置で菌体を破砕し、１５，０００ｒｐ
ｍで１５分間遠心分離して、上清を回収した。この上清
について、６０℃で２０分間の熱処理後、１５，０００
ｒｐｍで１５分間遠心分離して、上清を回収した。この
上清をリン酸カリウム緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ７．３、
０．１ｍＭジチオスレイトール含有）に対して透析後、
キシロースをリガンドとしたアフィニティクロマトにか
け、リン酸カリウム緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ７．３、０．
１ｍＭジチオスレイトール含有）で溶出した。溶出液を
セントリプレップ−１０（グレースジャパン株式会社
製）を用いて遠心濃縮し、電気泳動的に単一のバンドを
示すキシリトールオキシダーゼ１３．８ユニットを得
た。最終比活性は１９．７Ｕ／ｍｇ、活性収率は４３％
であった。得られたキシリトールオキシダーゼについ
て、分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）、最適温度、温度安定性、最適ｐＨ、ｐＨ安定性及
び基質特異性を調べたところ、ストレプトミセス・エス
ピーＩＫＤ４７２から精製した本来のキシリトールオキ
シダーゼ（特開平８−８９２４２号公報）との間に差は
認められなかった。
【００３７】実施例４ エシェリヒア・コリＪＭ１０９
／ｐＸＹ０３０によるキシリトールオキシダーゼの製造 エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＸＹ０３０をアンピ
シリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ培地５ｍｌに接
種し、３７℃で１０時間培養した前々培養液３．２ｍｌ
をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ培地１
６０ｍｌに接種し、３７℃で一晩培養した。この前培養
液１６０ｍｌをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）の入っ
たＬＢ培地８Ｌに接種し、３７℃で３時間培養後、ＩＰ
ＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加し、更に４時間培
養した後、集菌した。集菌した菌体をリン酸カリウム緩
衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭジチオスレイ
トール含有）で洗浄したのち、同緩衝液約１６０ｍｌに
懸濁した。超音波破砕装置で菌体を破砕し、１５，００
０ｒｐｍで１５分間遠心分離して、上清を回収した。こ
の上清について、６０℃で２０分間の熱処理後、１１，
０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、上清を回収し
た。この上清をリン酸カリウム緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ
７．３、０．１ｍＭジチオスレイトール含有）で透析
後、キシロースをリガンドとしたアフィニティクロマト
にかけ、リン酸カリウム緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ７．３、
０．１ｍＭジチオスレイトール含有）で溶出した。溶出
液をセントリプレップ−１０（グレースジャパン株式会
社製）を用いて遠心濃縮し、電気泳動的に単一のバンド
を示すキシリトールオキシダーゼ４９５ユニットを得
た。最終比活性は２５Ｕ／ｍｇ、活性収率は４１．５％
であった。得られたキシリトールオキシダーゼについ
て、分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）、最適温度、温度安定性、最適ｐＨ、ｐＨ安定性及
び基質特異性を調べたところ、ストレプトミセス・エス
ピーＩＫＤ４７２から精製した本来のキシリトールオキ
シダーゼ（特開平８−８９２４２号公報）との間に差は
認められなかった。
／ｐＸＹ０３０によるキシリトールオキシダーゼの製造 エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＸＹ０３０をアンピ
シリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ培地５ｍｌに接
種し、３７℃で１０時間培養した前々培養液３．２ｍｌ
をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）の入ったＬＢ培地１
６０ｍｌに接種し、３７℃で一晩培養した。この前培養
液１６０ｍｌをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）の入っ
たＬＢ培地８Ｌに接種し、３７℃で３時間培養後、ＩＰ
ＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加し、更に４時間培
養した後、集菌した。集菌した菌体をリン酸カリウム緩
衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭジチオスレイ
トール含有）で洗浄したのち、同緩衝液約１６０ｍｌに
懸濁した。超音波破砕装置で菌体を破砕し、１５，００
０ｒｐｍで１５分間遠心分離して、上清を回収した。こ
の上清について、６０℃で２０分間の熱処理後、１１，
０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、上清を回収し
た。この上清をリン酸カリウム緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ
７．３、０．１ｍＭジチオスレイトール含有）で透析
後、キシロースをリガンドとしたアフィニティクロマト
にかけ、リン酸カリウム緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ７．３、
０．１ｍＭジチオスレイトール含有）で溶出した。溶出
液をセントリプレップ−１０（グレースジャパン株式会
社製）を用いて遠心濃縮し、電気泳動的に単一のバンド
を示すキシリトールオキシダーゼ４９５ユニットを得
た。最終比活性は２５Ｕ／ｍｇ、活性収率は４１．５％
であった。得られたキシリトールオキシダーゼについ
て、分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）、最適温度、温度安定性、最適ｐＨ、ｐＨ安定性及
び基質特異性を調べたところ、ストレプトミセス・エス
ピーＩＫＤ４７２から精製した本来のキシリトールオキ
シダーゼ（特開平８−８９２４２号公報）との間に差は
認められなかった。
【００３８】
【発明の効果】本発明により、キシリトールオキシダー
ゼ生産菌の染色体ＤＮＡよりキシリトールオキシダーゼ
遺伝子のクローニングに成功した。かかるキシリトール
オキシダーゼ遺伝子を用いて組換えＤＮＡ法によるキシ
リトールオキシダーゼの大量生産が可能となり、本発明
は極めて意義深いものである。
ゼ生産菌の染色体ＤＮＡよりキシリトールオキシダーゼ
遺伝子のクローニングに成功した。かかるキシリトール
オキシダーゼ遺伝子を用いて組換えＤＮＡ法によるキシ
リトールオキシダーゼの大量生産が可能となり、本発明
は極めて意義深いものである。
【図１】ストレプトミセス・エスピーＩＫＤ４７２の染
色体ＤＮＡにおけるキシリトールオキシダーゼ遺伝子周
辺の推定制限酵素地図を示す。
色体ＤＮＡにおけるキシリトールオキシダーゼ遺伝子周
辺の推定制限酵素地図を示す。
【図２】プラスミドｐＸＹ０１０およびｐＸＹ０２０の
構築図を示す。
構築図を示す。
【図３】キシリトールオキシダーゼ遺伝子のオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）の塩基配列を示す（末尾
記載のＴＧＡは終止コドン）。
ーディングフレーム（ＯＲＦ）の塩基配列を示す（末尾
記載のＴＧＡは終止コドン）。
【図４】プラスミドｐＸＹ０１０中に挿入された２．８
ｋｂのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡ断片の塩基配列を示
す。
ｋｂのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡ断片の塩基配列を示
す。
【図５】プラスミドｐＸＹ０２０中に挿入されたキシリ
トールオキシダーゼ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ
ＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
トールオキシダーゼ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ
ＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
【図６】プラスミドｐＸＹ０３０の構築図を示す。
【図７】プラスミドｐＸＹ０３０中に挿入されたキシリ
トールオキシダーゼ遺伝子からなるＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片の塩基配列を示す。
トールオキシダーゼ遺伝子からなるＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片の塩基配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 岡本 英里 広島県福山市柳津町2271−142 (72)発明者 小村 啓悟 広島県福山市南松永町２−179−２ (72)発明者 古谷 祐治 広島県深安郡神辺町十三軒屋20−９
Claims (9)
- 【請求項１】 以下に示すアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ部分配列を５′末端側に含有する、キシリトールオ
キシダーゼをコードするＤＮＡ。 【化１】 （ただし、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパ
ラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、
Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋ
はリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパ
ラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
ン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
リプトファン、Ｙはチロシンを示す。） - 【請求項２】 ＤＮＡ部分配列が以下に示す塩基配列を
有する請求項１のＤＮＡ。 【化２】 - 【請求項３】 キシリトールオキシダーゼ産生能を有す
るストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｓｐ．）ＩＫＤ４７２（工業技術院生命工学工業
技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１４３３９）の染
色体ＤＮＡの２．８ｋｂｐ ＳｐｈＩ−ＳａｌＩ断片中
から、以下の塩基配列を有する６６ｂｐ ＤＮＡ断片を
プローブとして用いて得ることができる、全長１２４５
ｂｐのＤＮＡである請求項１または２のＤＮＡ。 【化３】 - 【請求項４】 以下に示すアミノ酸配列からなるキシリ
トールオキシダーゼをコードするＤＮＡ、または該アミ
ノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、
置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなりキシリト
ールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする
ＤＮＡ。 【化４】 （ただし、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパ
ラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、
Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋ
はリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパ
ラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニ
ン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、Ｗはト
リプトファン、Ｙはチロシンを示す。） - 【請求項５】 以下に示す塩基配列からなるキシリトー
ルオキシダーゼをコードするＤＮＡ、または該ＤＮＡと
ハイブリダイズしキシリトールオキシダーゼ活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡ。 【化５】 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかのＤＮＡを含有
する、キシリトールオキシダーゼもしくはキシリトール
オキシダーゼ活性を有するタンパク質を発現するための
組換えベクター。 - 【請求項７】 プラスミドｐＸＹ０１０、ｐＸＹ０２０
またはｐＸＹ０３０である組換えベクター。 - 【請求項８】 請求項６または７の組換えベクターで形
質転換された微生物。 - 【請求項９】 請求項８の微生物を好適な培地中で培養
し、培養物中にキシリトールオキシダーゼもしくはキシ
リトールオキシダーゼ活性を有するタンパク質を生成さ
せることを特徴とするキシリトールオキシダーゼもしく
はキシリトールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8230952A JPH1075785A (ja) | 1996-08-30 | 1996-08-30 | キシリトールオキシダーゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8230952A JPH1075785A (ja) | 1996-08-30 | 1996-08-30 | キシリトールオキシダーゼ遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1075785A true JPH1075785A (ja) | 1998-03-24 |
Family
ID=16915898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8230952A Pending JPH1075785A (ja) | 1996-08-30 | 1996-08-30 | キシリトールオキシダーゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1075785A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007054203A3 (de) * | 2005-11-08 | 2007-07-19 | Henkel Kgaa | Enzym / subtstrat sytem zur generierung von wasserstoffperoxid enthaltend sorbitol oxidase aus streptomyces c0elic0l0r und sorbitol |
-
1996
- 1996-08-30 JP JP8230952A patent/JPH1075785A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007054203A3 (de) * | 2005-11-08 | 2007-07-19 | Henkel Kgaa | Enzym / subtstrat sytem zur generierung von wasserstoffperoxid enthaltend sorbitol oxidase aus streptomyces c0elic0l0r und sorbitol |
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