JPH08506179A - 分析／分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 粒子に、進行波電界移動（ＴＷＦＭ）を作用させ、粒子を微小電極配置上で移動させる。変更された粒子は、元の粒子のＴＷＦＭ特性を変更するように元の粒子を処理することによって生成され、変更されたＴＷＦＭ特性は、変更された粒子の分析及び／又は分離に使用される。これらの粒子を、細胞、バクテリア、ウィルス、生体分子、又はプラスチック微粒子とすることができる。これらの粒子は、抗体／抗原又はオリゴ核酸などの選択的なリンク部を介して、金属微粒子などのリガンドに結合されることによって変更され、又は物理的若しくは化学的に処理される。

Description

【発明の詳細な説明】 分析／分離方法 本発明は、電界に応答する粒子の移動を観察することによる分析方法に関する 。 従来より、粒子は、これらに進行電界をかけることによって操作される。この ような進行電界は、好適な電圧を、適切に設計された微小電極に供給することに よって生成される。微小電極は、平行なバーからなる幾何学的な形態を備えてい る。当該平行なバーは、図１に示すように、チャネルを形成するスペースによっ て遮断され、また、プライス、バート アンド ペシング、バイオケミカ エト バイオフィジカ（Price，Burt and Pething，Biochemica et Biophysica）のV ol.964，221-230ページに記載されているような、標準的な金属スパッタリング 及び写真製版技術を使用して組み立てることができる。IEEE トランスアクショ ン オン インダストリー アプリケーションズ（Transactions on Industry A pplications）Vol.IA-23，474-480ページのマスダ、ワシズ及びイワダレによる 「不均一な進行電界によって液体中に懸濁している小粒子の分離（Separation o f small particles suspended in liquid by nonuniform travelling field）」 というタイトルの論文に記載されているように、進行電界は、好適な周波数及び 位相の電圧を電極に加えることによって生成される。マスダ及びその共働者は、 どのようにして（チャネルを有していない）進行電界を支持する一連の平行電極 が、粒子の電荷及びサイズ（重さ）に従って、粒子を分離するのに使用されるの かを記載している。しかしながら、マスダ等は、 このような粒子分離方法を実際に証明していない。 ハーゲドーン、フーア、ミュラー及びギムサによる「微粒子の進行波誘電伝達 （Travelling-wave dielectrophoresis）」というタイトルの論文（Electrophol esis，Vol.13，49-54ページ）では、生きている細胞や微視的寸法の人工物等の 誘電体粒子を、微小電極構造にわたって、当該電極によって境界が形成されるチ ャネル内で移動させるための方法が示されている。進行電界は、各電極に、隣接 電極間における位相推移が９０度の同一周波数の電圧を供給することによって生 成された。 ワイ ハング（Y Huang）、エックス−ビー ワン（X-B Wang）及びアール ペシング ジェイ． フィズ． ディー． アップル． フィズ．（R Pething J．Phys．D．Appl．Phys．26）１９９３１５２８−１５３５による「進行電界中 のコロイド粒子の動電気特性：イーストセルを使用しての研究（Electrokinetic behaviour of colloidal particles in travelling electric fields：Studies using Yeast cells）」において、ハゲドーン（Hagedorn）等（上記論文）によ って記載されている「進行波誘電伝達（travelling-wave dielectrophoresis） 」（ＴＷＤ）効果の実験によって裏づけられる分析が行われている。現象学的方 程式 は、ハン（Huang）等によって開発されたものであり、ＴＷＤ速度が粒子半径（ ｒ）の二乗、電界強度（Ａ(O)）の二乗、進行電界の 周期的波長（λ）、媒体の粘度（η）及び各複素誘電率ε_p ^*並びにε_m ^*によって 粒子並びに懸濁液の誘電特性を規定するクラウジウス−モソッティ・ファクタｆ （ε_p ^*，ε_m ^*）の虚数部分の関数であることを示している。この方程式によって 、まず第一に、粒子の操作及び分離のための進行波電極システムの設計のための 指針が提供される。 一般的に、問題の現象を「進行波誘電伝達」と称するが、粒子を並進運動を生 成させるために作用する力が、誘電伝達的な力ではなく、電気回転で作用するも のであるため、それが誤称であることをここで証明した。この力は、周囲媒体内 の粒子の分極率の虚数成分に関連するものである。しかしながら、以下で更に詳 細に説明するように、負の誘電伝達力を粒子に発生させる進行波周波数の場合、 粒子の移動のみが起こる。（誘電伝達力は、周囲媒体内の粒子の分極率の実数成 分に関連している。）これらの力は、粒子を、電極及び電極間のチャネルから引 き離すのに寄与する。従って、以前に「進行波誘電伝達」と称していたこの現象 を、「進行波電界移動（travelling wave field migration）」（ＴＷＦＭ）と 称する。ＴＷＦＭを達成するために、２つの独立の基準が満たされなければなら ないことを立証した。まず第一に、周波数は、当該周波数で、粒子に作用する誘 電伝達力が負となるように、すなわち粒子が電極から反発力を受けるように、選 択される。このため、粒子に誘起される双極子モーメントの実数成分を負としな ければならない。 第二に、周波数は、粒子に誘起される双極子モーメントの虚数成分が非ゼロ（ 正または負）で、電極アレイに沿って粒子を変位させる力を発生させるように、 選択されなければならない。 本発明は、粒子のＴＷＦＭ特性（すなわち、ＴＷＦＭの下で粒子が移動する方 向並びに速度、及び電極レイアウト並びに間隔、電圧、周波数並びにＴＷＦＭの 可能な懸濁液などの条件）が、関係する粒子の誘電体特性に作用を及ぼす方法を 選択することによって変更されるという観察結果に基づいている。 本発明は、粒子を処理し、当該元の粒子とは異なるＴＷＦＭ特性を有する変更 された粒子を形成する工程と、同一条件下で、前記変更された粒子の運動が、前 記元の粒子の運動と異なるような条件を用い、ＴＷＦＭによって、前記変更され た粒子を並進運動させる工程と、を備えている分析又は分離方法を提供するもの である。 粒子は、光学顕微鏡を使用して視覚可能な大きさ（微視的粒子）とすること、 又はより小さくすること（準微視的粒子）ができ、発光、蛍光、及び電磁放射吸 収ラベルなどのラベルを使用して検出することができる。 前者のタイプに属する粒子の例としては、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母菌細 胞、プラスチック製の微小ビーズ、減数分裂及び有糸分裂の最中の染色体、及び 、休眠状態の小生子（Cryptosporidium）などの卵母細胞が含まれる。 第２のタイプの例には、細菌細胞、ウイルス、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子、蛋白質 、その他の生体分子、染色体が含まれるであろう。 元の粒子を変更された粒子に変換するための方法は、粒子の種類 に応じて極めて多様である。その処理は、粒子とリガンドとの複合体形成を行う ものである。場合によっては、複合体は、粒子とリガンドをつないでいるリンク 部を有している。さらに、複合体は、当該リガンドにつながれたラベルを含んで いてもよく、その場合には第２リンク部を介していてもよい。複合体は、粒子に 付けられた多数のリガンドを有していてもよい。 リンク部の選択は、明らかに粒子とリガンドの性質によって決定されることに なる。例えば、核酸類（リガンド）をプラスチック微粒子（粒子）上に捕捉した い場合には、リンク部としては通常、リガンド又はその一部分に対して相補的な 配列を有する核酸又は核酸に類似のオリゴマーが選ばれることになる。 リンク部は、先ず最初に粒子に付けられると、リガンドに対する親和性を有す る種になり得る。リガンドに対するこの親和性は、粒子とリガンドからなる複合 体の形成が選択的に起こるような選択的親和性であることが好ましく、少なくと もリガンドを識別できる程度とする。この親和性は高い特異性を有していること が好ましく、従って、リガンドに対する選択的親和性を与える粒子に付けられる 上記リンク部は、抗体又は抗体活性を有する抗体断片、抗原、核酸プルーブ又は 相補的な核酸シーケンスに対する選択的親和性を有する核酸類似プルーブ、或い はアビジン又はストレプトアビジンのようなアビジン類似分子であってもよい。 抗体又は抗体活性を有する抗体断片は、特に好ましいものである。プラスチッ ク製微粒子のような当業者によく知られている粒子の表面に抗体を被覆するため には、既知の適切な技術がある。粒子に被 覆された抗体は、微生物細胞やその他のリガンド上に存在している対応する抗原 を認識し、結合することができる。 そのような微粒子にオリゴ核酸プルーブを結合するための方法も知られている 。好適な技術としては、ＰＣＴ出願番号ＧＢ９２／０１５２６に記載された例を 挙げることができる。リンク部が核酸プルーブ又は核酸類似プルーブである場合 には、生じた粒子は、相補的な核酸シーケンスの認識、結合に当然適したものと なっている。 リガンドは、粒子の可視性を向上し、或いは検出能を改善すると共に、ＴＷＦ Ｍ特性を変更するように選ぶことができる。例えば、蛍光剤又は染色剤を担持し ている抗体を粒子に付けると、形成された複合体は、ＴＷＦＭによって元の粒子 から区別でき、蛍光又は色彩によって検出できるようになる。 上記リガンドには、リガンドと粒子からなる複合体を形成する前、それと同時 、又は後で、ラベルを付けることができる。ラベルは、当該ラベルによって担持 される第２リンク部を有していてもよい。再び繰り返すが、第２リンク部によっ て得たリガンドに対する親和性は、選択的親和性であることが好ましく、高い特 異性を有していることが特に好ましい。そして第２リンク部も、抗体、抗体活性 を有する抗体断片、抗原、核酸プルーブ、核酸類似プルーブ、アビジン、又はア ビジン類似分子であって差し支えない。この種のラベルの使用は、複合体の迅速 な検出の補助のために、及び／又は、粒子とリガンドからなる複合体自身には充 分に区別可能なＴＷＦＭ特性がないために、複合体へのラベル導入によってＴＷ ＦＭをさらに変更させる場合に望まれる。この目的のために、ラベルは、蛍光剤 又 は染色剤、又は微生物、金属粒子、ポリマービーズ、又は磁気粒子であってもよ い。ＴＷＦＭ測定に使用するためには、ラベルは、誘電特性を有し、顕著な表面 電荷を獲得できるものであることが好ましい。特に好ましい材料はコロイド状の 金であり、これは容易に（上記第２の種としての）抗体に付けられてラベルを形 成する。コロイド状の金に付けられる抗体は商業的に入手可能であり、コロイド 状の金に抗体を結合させる方法は、例えば、ジョーヘイガン ダブリュ ディ等 、（１９７８）イムノル コム ７（Geohegan W.D．et al（1978）Immunol．Co mm 7 pl.）に記載されている。しかし、それ以外の金属粒子、例えば銀粒子及び 鉄粒子、を使用してもよい。 上記のようなラベルを使用することは、リガンドと粒子との複合体が十分に区 別可能なＴＷＦＭ特性を有し、このような観察される複合体を形成できる場合で さえ、好ましい。このような複合体のラベルを使用することによって、所定の場 合に、より高い識別特性が得られる。従って、例えば、抗原Ａを示す微生物を、 抗原Ａ及びＢを示す微生物から識別したいと思う場合もある。このことは、リン ク部としてＡに対する抗体を有する微粒子、及びリンク部としてＢに対する抗体 を有するラベルを使用することによって実現される。（微粒子、微生物及びラベ ルの）ラベル化された複合体と、（微粒子と微生物との）ラベル化されていない 複合体との速度の差が、観察され、抗体Ａのみを示す微粒子を、抗体Ａ及びＢを 示す微粒子から区別するのに使用する。 前記ラベルに磁気粒子を設け、前記ラベルが磁石に付着し、前記ラベルを有し ている複合体を集中させ、観察を容易にすることができる。場合によっては、ラ ベル化された複合体を磁石に付け、ラベ ル化されていない粒子を流し去り、リンク部を有しているが、通常存在するリガ ンド／ラベルを有していない粒子のバックグラウンドを除去できるようにしてい る。このための好適な磁気ラベルは、抗体のようなリンク部を担持している鉄微 粒子を有している。このような抗体被覆鉄粒子は、市販され、入手可能である。 細胞及びより小さな粒子のラベルは、例えば、ＦＩＴＣ若しくはローダミン等 の蛍光マーカー、染色材、発光マーカー、又は酵素分子を備え、検出可能な信号 を出力する。後者の例は、ルシフェラーゼ及びアルカリフォスファターゼである 。これらのマーカーは、当業者にとって良く知られた分光学的技術を用いて検出 される。リガンドと粒子との複合体の形成の前、同時、又は後に、ラベルをリガ ンドに付けることができる。細胞移入の場合、細胞と遺伝子生成物とでマーカー を形成する。例えば、蛍又はバクテリアシルフェラーゼの遺伝子が、細胞内に移 入され、移入された細胞を、発光信号によって、視覚化することができる。 元の粒子を変更するために、必ずしも複合体を形成する必要はない。例えば、 細胞のＴＷＦＭ特性は、加熱、又は細胞膜の有孔率を変更する試薬を用いての処 理によって変更することができる。従って、複合体にリガンドが物理的に存在す ることにより生じる変更以外の変更、又はこれに加わる変更が粒子自体に生じる 場合もある。両方の効果が組合わさって生じる場合もある。粒子を有している複 合体を形成するリガンドの物理的な効果は、ＦＷＴＭ特性に影響を及ぼし、また 、粒子との相互作用によって、粒子の固有のＴＷＦＭ特性に変化をもたらす。 本発明は、分析のために行われる上記のような方法、及び準備又は他の目的の ために行われるこのような方法を有している。 本発明による方法を、例えば、バクテリアの細胞、ほ乳動物の細胞、酵母菌の 細胞、及び虫の細胞又はウイルス粒子及び生体高分子を含むサンプルの分離及び 分析を含む幅広い分析的な適用範囲に使用することができる。例えば、フローセ ルサイトメトリーなどの現在の細胞分離方法は、高価な器具、熟練したオペレー タ、及びかなりの研究資源を必要とする。この技術は、分離される細胞固体群が 多数であり、且つ問題とする細胞が全体の数パーセントよりも少ない場合には限 界がある。変更された生体分子、又は生体分子の複合体の分離及び分析のために 使用される技術は、電気泳動、及びゲルろ過又は親和性クロマトグラフィーを用 いるクロマトグラフィー的な分離を使用する。場合によっては、これらは、十分 な分離度を提供するが、多くの適用例の場合、これらは時間がかかりすぎ、また その解像度には限界がある。さらに、これらの方法を使用することによって、生 体複合体間の平衡に影響を及ぼし得る。例えば、ゲルろ過によって、サンプルに かなりの希釈化が生じる。 本発明による後述の方法によれば、これらの問題点の一部または全てが解消さ れる。 本発明による分析方法で、粒子とリガンドとの複合体が生成される場合、リガ ンドそれ自体は、最終的に性質及び量が分析される存在を確立するための種であ る必要なない。このため、リガンドを、分析のための試薬とすることができ、ま た分析の対象とする種を、複合体の他の構成素子、例えばリンク部または粒子自 体とすること もできる。粒子が試薬を用いての処理によって変更される場合、これを、本質的 に研究される粒子または試薬とすることができる。 上述のＴＷＦＭプロセスは、通常、ＴＷＦＭ通路に沿って各４番目毎の電極の 位相が一致するように同期された電界を、線形な並列電極配置に作用させること によって行われる。この周期性は、生成される進行波電界の実効波長を規定する 。この波長は、ＴＷＦＭの下で移動する粒子の平均直径の約１０倍が好適であり 、例えば前記平均直径の５〜２０倍とし、８〜１２倍がさらに好ましいことを確 かめた。概略的にも円形とはいえない粒子の場合、ＴＷＦＭ移動と交差する方向 の長さが重要である。 標準的な技術を使用して、顕微鏡構造を製造することによって、所望の寸法に 応じて、電極を形成することができる。例えば、電極は、 スクリーン印刷、 以下のパターン化技術、 エッチング（例えば、ウェットケミカルエッチン グ、ドライプラズマエッチング、又は集束イオン エッチング）の後に行われる電子ビームを使用す る直接書き込み エッチングの後に行われる、写真製板によって生 成されるマスクを介しての露光による書き込み （マスクは、例えば、可視、紫外のＸ線、又は電 子ビームリソグラフィーによって生成される。） エクサイマーレーザアブレーション のいづれかの後に行われる（例えば、電気メッキ又はスパ ッタによる）電極材の堆積、 （Ｘ線ＬＩＧＡ処理のような）電極材の堆積の後に行われ るパターン化 によって製造される。 図１は、ＴＷＦＭの発生に使用される電極配置及び電圧位相の関係を示してい る。 図２は、図１に示す電極配置における粒子の可能な移動パターンを示している 。 図３は、電極間隔が列に沿って変化する電極配置の変形例を示している。 図４は、電極間隔が列と交差する方向に変化している電極配置の他の変形例を 示している。 図５は、電極間隔が列と交差する方向及び列に沿う方向に変化している電極配 置の他の変形例を示している。 図６は、図１〜図５に示す配置では存在している中心のチャネルを設けていな い電極配置を示している。 図７は、本発明による方法を実行し、これによってデータを収集するための装 置の構成部材を略図的に示している。 図８は、本発明の一例に使用される変更された粒子を構成する複合体を概略的 に示している。 図９は、本発明の一例に使用される変更された粒子を構成する３元複合体を概 略的に示している。 図１０は、本発明の一例に使用される変更された粒子を構成する他の３元複合 体を示している。 図１１は、本発明の一例に使用される変更された粒子を構成する他の２元複合 体を示している。 図１２は、本発明において使用される変更された粒子を構成する複合体を示し ているが、この複合体中の粒子は染色体である。。 図１３は、粒子に十分なＴＷＦＭ特性を提供し得る懸濁媒体及び周波数を決定 するのに有効な電極配置を示している。 図１４は、導電率が５×１０-４５ｍ-１の媒体内の生存している細胞の誘電特 性を示すグラフである。 図１５は、生存している酵母菌細胞の誘電特性を示すグラフである。 図１６は、同様の媒体内における、死亡している酵母菌細胞の誘電体特性を示 すグラフである。 分離効果を実現するための電極配置の例を、図１〜６に示す。 以下図面を参照して、本発明の実施例を説明する。 図１に、平行な２列の電極によって構成される電極配置を示す。各電極は、長 方形状であり、列方向に対して垂直な方法に延びている。２つの列は、所定幅の ギャップによって分離され、電極列の対の間隔は同一である。当該電極は、絶縁 基板上に配置された金属薄膜電極であり、スライドガラス上にプリントされた金 電極であることが好ましい。列間隔は、３０マイクロメートルであり、各列にお ける４つの電極からなるグループ毎のピッチは８０マイクロメートルである。進 行波の波長を規定する前記ピッチは、粒子サイズの５〜２０倍とすべきであり、 例えば、８〜１２倍とし、１０倍にする事が最も好ましい。 図２に示すように、以下に説明するこの種の進行波電界が作用する粒子のレス ポンスを変化させることができる。粒子を電極上に集め、粒子にスピンをかけ、 列間のギャップに沿って、または電極列上を移動できるようにしている。この最 終的な動きのタイブが、ＴＷＦＭである。作り出される動きのタイプは、粒子、 懸濁媒体、電極間隔、及び電界周波数に依存している。 図３では、電極間の周期的な長さを変化させ、上記方程式のパラメータλを調 整できるようにしている。例えば、電極の上部から下部に移動する進行波は、Ｔ ＷＦＭの下で移動する粒子を上方へ加速する。これは、例えば、ＴＷＦＭ通路に 沿ってさらに一様な分解能を作り出すために使用され、進行する距離が長くなる に連れて解像度が増加するといった自然な傾向を抑制する。図４では、チャネル 幅も変更している。このことによって、上記方程式の電界Ａ（０）を変化させる 。チャネル幅が減少するに連れて電界が大きくなるため、ＴＷＦＭの下での粒子 の移動が加速される。このため、サイズの異なる同様な物理的特性の２つの粒子 は、チャネルに沿って移動するに連れて、空間的に分離される。誘電体特性の異 なる粒子が、好適な媒体内を懸濁し、上記方程式のファクターＩｍ［ｆ（ε_p ^*， ε_m ^*）］の符号が粒子毎に異なるようにする。その後、粒子は、ＴＷＦＭの下で 、逆方向へ移動することによって分離される。 図５は、λ及びＡ（０）の作用を組み合わせるための電極設計である。進行電 界の作用下で、粒子をさらに平行な電極上に誘導することができる。また、他の 粒子加速を用い分離を実現する電極の幾何学的な配置を図６に示す。 粒子は、（ハングなどの論文に記載されているように、）正の誘電伝達によっ て捕らえられない限り、ＴＷＦＭの作用により移動する。このことによって、粒 子の誘電特性及びサイズに従って、粒子の選択的な捕捉能力及び分離能力が提供 される。 図７に示すように、本発明によって使用される装置は、レンズ１ ００によって略図的に示されている光学顕微鏡を備えている。当該光学顕微鏡１ ００は、慣用の電界照射光源１０３及びスライド支持台（図示せず）とともにＣ ＣＤカメラアタッチメント１０２を備えている。 ＣＣＤカメラ１０２は、信号処理装置１０４及び表示スクリーン１０６に接続 されている。本発明に使用される装置は、さらに、周波数発生器１０８を備えて いる。当該周波数発生器１０８は、使用中、顕微鏡スライド１１０上に設けられ た端子に接続される。顕微鏡スライド１１０は、図１にさらに詳細に示されてい る電極パターンを担持する。 電極は、例えば、金でプリントまたはコーティングされ、周波数発生器１０８ と接続するための端子と連絡しているトラックとともに、顕微鏡スライド１１０ 上にエッチングされる。周波数発生器は、電界を出力する。周波数発生器は、可 変出力を備え、オペレータがサイン波形出力の周波数及びピーク間電圧を設定で きるようにしている。 使用中、装置のディスプレイに現れる画像は、顕微鏡の電界内を極めてゆっく りと移動している多数のビーズであり、順次に各ビーズを観察している観察者に よって、３０秒程度の周期内で、移動速度が直接的に決定される。上記装置は、 以下の特定の例で証明されるように、十分に有効な結果を出し得るものであり、 人間の観察者が直接合理的に処理できるよりも多くのビーズに対して移動速度の 測定を行うことが一般的には好ましい。このため、この装置でビーズの移動の検 出及び測定を行うために、画像処理技術を使用するこ とが望ましい。ＣＣＤカメラアタッチメントより、多数の移動ビーズを含んでい る視野の画像が得られる。このような一連の画像またはフレームは、コンピュー タ内のフレーム・グラバー（frame-grabber）回路によって捕捉され、これらの 一連の画像は、画像処理ソフトウェアによって分析される。 このため、閾値処理は、例えば、カメラによって生成されるグレースケール画 像を、バイナリー画像に変換するのに使用される。独立の閾値処理が行われ、暗 すぎると見なされた画像領域を識別する。これらの領域は、ビーズのバイナリー 画像から除去される。画像中に残存する形状は、画像の残部から分離されて、領 域などの特性試験が行われ、ビーズを示していると思われるものを選択する。そ の後、固体の中心が決定され、それぞれ形状を限定する。中心位置が、連続する フレーム間で比較され、あるフレーム内における各ビーズが、次のフレーム内に 存在できるようにしている。１つのビーズが２つのフレームに存在するならば、 ビーズの位置の差が、直接、移動距離を示し、この距離から、移動速度が計算さ れ、いくつかのフレーム対において平均化される。このような自動化された技術 によって、任意の時刻における視野内の全てのビーズの移動速度が測定され、多 数の電界移動周波数を任意に使用して、ビーズの移動特性に関する統計的な画像 が表示される。 他の画像処理技術を使用して、粒子の位置を識別し、これらの移動、例えば、 相関関係、縁部検出、または形態学上の技術、を判定することができる。ニュー ラルネットワークを使用して粒子を識別することもできる。 粒子速度を決定するために、上記の種類の画像検出器を必ずしも使用する必要 ない。代案としての検出構成では、 フローサイトメータ（flow cytometer）などの、光散乱検 出器と、 標準的な蛍光検出装置と、 ＣＣＤまたは他の検出器を使用するルミネセンス検出と、 単一または複数の素子の分光器による光の測定と、 （例えば、位相差技術による）屈折率変調検出と、 表面またはバルク音響センサを使用しての（粒子質量に関 連する）音響インピーダンス測定による検出と、 電気的インピーグンス、容量またはインダクタンスと、 を備えている。 本発明による装置は、顕微鏡の視野内に、サンプル中の磁気ビーズを引き込む ように位置決めされた磁石（電磁石が好ましい。）を設けることによって変更す ることができる。その後、ビーズの移動特性が測定されている間、磁石は、取り 除かれ、または電源がオフされる。代案として、誘電伝達または電気泳動によっ て、粒子の位置を操作することができる。 図８に示すように、微粒子は、リンク部としての１又は２以上の抗体分子１４ を付けられたプラスチックビーズからなるものであってもよい。図は正確な拡大 率ではなく、また、実際には通常、多数の抗体分子によって被覆されているもの であることに留意すべきである。微粒子は、付けられている抗体との反応性があ る表面抗原を担持している微生物細胞１６にさらされると、微粒子と細胞の間で 複合体１０を形成する。微生物細胞としては、例えば、水中に存在する大腸菌や 大腸菌群、或いは食品中に存在するリステリア菌（listeria）やサルモネラ菌（ salmonella）のような病原性微生物を挙げることができる。適切に選ばれた条件 下でのそのような微粒子／微生物細胞複合体の移動速度は、微粒子単独の使用に よって得られる移動速度と区別できること、さらには、微粒子と生存している微 生物細胞との複合体によって得られる移動速度は、微粒子と死亡している同種の 微生物細胞との複合体によって得られる移動速度と区別できることが見いだされ た。 図９に示すように、３元複合体１０は、上記図８に示したのと同種の微粒子１ ２と、抗原１８と、ラベル２０とから生じる。このラベル２０は、ラベル部２２ と２次抗体２４からなるが、２次抗体２４は、抗体１４と同じであっても異なっ ていてもよい。このタイプの３元複合体は、抗原１８が小さすぎるか又は微粒子 １０のＴＷＦＭ特性に影響を与える程に充分な誘電特性を有していない場合や、 又は、１つの分析に２つの異なった抗体を使用することによってより高いレベル の特異性を得たい場合に利用される。抗原としては、例えば、食品中に汚染物質 として存在する毒素を挙げることができる。 図１０と図１１は、核酸、特にＰＣＲ法、ＬＣＲ法、３ＳＲ法のような増幅処 理の生成物として生産された核酸シーケンスの検出方法を説明したものである。 核酸増幅処理生成物を検出する既知の方法は、分析を行う前に、生成物に何らか の方式の精製及び／又は分離処理を施すことを要している。一般的に用いられて きた方法の一つに、アガロースゲル電気泳動による生成物の分析がある。この方 法は、増幅されたＤＮＡ断片と残留している全てのオリゴヌクレオチドプライマ ーを、サイズを基準にして分離する。サイズだけを基準にした生成物の分離では 、目的とする塩基配列を有するＰＣＲ生成物とそれとほぼ同じ長さを有する増幅 された混入物とを区別することができない。ＰＣＲ生成物をさらに識別するため には、ゲル電気泳動にさらに１工程を取り込んで、生成物にサザンブロット法を 施し、これによって、分離された断片をゲルからメンブランに、ゲル上の相対位 置のまま直接対応させて転写させることができる。そして、それらを、問題とす るシーケンスに対して相補的な塩基配列を有する単鎖ＤＮＡプルーブであってラ ベル化されたものを用いて、それらを精査する。プルーブのために用いられるラ ベルは、通常はビオチン又は³²ｐのような放射性同位元素である。サザンブロッ ト法は、比較的困難であり、また、適当な試験技術と共に試験装置や施設が求め られる。この方法は、多数のサンプルの迅速なスクリーニングや実験室外のサン プルのスクリーニングに用いるには不適当である。ドットブロット法は、サザン ブロット法のアガロースゲル分離工程を省略でき、ある程度は速くなるが、基本 的にはサザンブロット法と同様の欠点を有している。 図１１に示されているように、本発明の方法において、微粒子は捕捉プルーブ ２６（リンク部）としてのオリゴヌクレオチド又は合 成オリゴヌクレオチド類似体を含んでいてもよい。この捕捉プルーブ２６は、ポ リマービーズ表面に付けられており且つ予測される増幅処理生成物２８に対して 相補的なシーケンスを有している。リガンド核酸シーケンスの第２領域に対して 相補的な２次オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体３４に付けられ た上記のＴＷＦＭラベル化部３２からなるラベル３０が利用される。微粒子とラ ベルは、反応混合物に何らかの操作を行って増幅生成物を分離する前又は後に、 増幅反応生成物中に添加することができる。すると、微粒子／増幅生成物／ラベ ルからなる３元複合体のＴＷＦＭ特性が観察され、微粒子単独のそれとは区別さ れる。この操作の変法を図８に示す。図において、増幅処理で用いたプライマー の１つは適切なＴＷＦＭラベル部３２でラベル化されており、従って、このラベ ル部３２は増幅処理の核酸生成物に組み込まれる。そして、捕捉プルーブ２６を 担持している微粒子と増幅生成物とから２元複合体が生成し、複合体のＴＷＦＭ 特性が観察される。 図１２に示した図１１の変法において、リガンド核酸は染色体（核酸の複合体 ）であってもよく、そして、微粒子は例えば金属製（金）などのように、顕著な 誘電特性を有していてもよい。この態様は、ヒト（又は他種の）染色体を分離し ようとする際に、異なる染色体が同じサイズと誘電特性を有しているかも知れな い場合に特に有用である。フローサイトメトリーのような技術は、サイズを基準 とする染色体の仕分けに広く利用されており、そして、それゆえに同サイズの染 色体を区別することができない。ヒトの場合、染色体９〜１２は包括的なもので あり、同じサイズを有しているため、フローサイトメトリーでは容易に分離する ことができない。我々の手法に従えば、これらの染色体に誘電体マーカーで予め ラベル化す れば、その誘電特性を基準にして分離することができる。 実際には、この手法は、（例えば、加熱、化学的処理、或いは電気的処理など によって）染色体ＤＮＡを部分的に変性させ、次いで、（特定の核酸シーケンス に対して）相補的な核酸プルーブを複合させることによって成し遂げられる。核 酸プルーブは、少なくとも１５のヌクレオチドからなるのが好ましく、また、結 合剤に対する親和性があるものを用いて、それ自体に予めラベル化してもよい。 例えばラベルは、ヌクレオチドに合体できるか又はプルーブシーケンスの末端領 域に付加できるビオチンであってもよいが、これに限定されるわけではない。結 合剤は例えば、ラベルに対して特異性を有する抗体、また若しくは、選択したラ ベルに対して親和性を有する蛋白／酵素などであってもよい。結合剤は、微粒子 に順次付けることができ、これらは両方で誘電増幅体（付加的な誘電特性の増幅 による）及び／又は選択された染色体の検出に対する補助体となり得る。そして 複合体は、図９のように表わすことができる。リガンド染色体に誘電体ラベル化 を行うと、誘電特性の相違に基づいて他の染色体から分離できるようになる。実 際には、図１〜図３に示すように、異なる移動周波数又は選択性ある電極配置を 用いることによって、この手法が達成される。 また、上記方法を用いれば、染色体の選択的分離と同定が可能となることが理 解できる。この方法は、臨床的診断において、例えば、再配列／希釈（re-arran gements/dilutions）、ウイルスＤＮＡのような異種ＤＮＡの挿入（insertion） などの染色体変異を同定、検索することが重要な場合に実用性を有している。 若しくは、染色体は粒子であってもよく、その場合には、ラベルを担持した核 酸プルーブ（リガンド）との複合化処理が施される。このリガンドは、染色体の ＴＷＦＭ特性を変更するものであり、蛍光マーカーのような検出を補助するもの でもあることが最も好ましい。 同一条件下において未変更粒子と異なる運動をする変更された粒子についてＴ ＷＦＭを観察するためには、条件を注意して選ぶ必要がある。ＴＷＦＭを起こす ためには、粒子を電極上に浮かせて電極表面に引きつけられないように、粒子を 電極から反発させる必要があることが確立された。それと同時に、粒子を電界進 行波によって電極配置に沿って推進させる必要がある。粒子が電極に対して有す る反発力又は引力の原因となる誘電伝達力は、粒子中の誘起双極子モーメントの 実数成分によって決定される。電極配列に沿った粒子の推進力は、誘起双極子モ ーメントの虚数成分の大きさによって決定され、その移動方向は、その符号によ って決定される。これらの実数成分及び虚数成分は、電界周波数とともに変化し 、粒子及び懸濁媒体の性質にも依存している。変更された粒子と変更されていな い粒子との運動の相違を視覚できるようにするために、２つの粒子形態における 双極子モーメントの実数成分と虚数成分との関係を十分に相違させるような電界 条件及び懸濁媒体特性を見いださなければならない。このことは、以下のように してなされる。 特性が決定されている粒子が、選択された媒体内で懸濁し、図１３に示すよう な電極配置を底部に有するチャンバー内にピペットで移される。この電極配置に 、回転電界がかけられ、この回転電界の周波数が、所望の範囲、例えば１０〜１ ０¹⁰Ｈｚの範囲で段階的に 調整される。各周波数において、粒子内に生成される電気回転の角速度及び方向 は、誘起双極子の虚数成分の大きさとして示される。このことは、図１４に、ラ インＴＲＡＮＳとしてプロットされる。粒子が受ける誘電伝達力を示しているラ インＤＥＰは、粒子の複合体分曲率を考慮して、ラインＴＲＡＮＳから計算され るか、または同一の装置内で経験的に決定される。後者の場合、隣接電極の正弦 電圧の位相差が１８０度である電界が、電極にかけられる。粒子が電極間を中心 領域から遠ざかる方向へ移動する（正のＤＥＰ効果）、または中心領域へ移動す る（負のＤＥＰ効果）速度が、周波数に対してブロットされている。 赤血球または酵母菌細胞などの生存している細胞の一般的な結果を図１４に示 す。この曲線形状は、生存している細胞の典型的なものであり、周波数は細胞の 種類で変化する。ＴＷＦＭは、２つの領域ｆ１〜ｆ２及びｆ３〜ｆ４に見られる 。この領域での誘電伝達（ＤＥＰ）は負であり、粒子が電極から反発力を受け、 進行波との相互作用によって、電極配置に沿って正味の力が生成される（非ゼロ ＴＲＡＮＳ）。粒子の移動方向は、ＴＲＡＮＳが正であるか負であるかに依存し ている。 生存している酵母菌細胞及び死亡している酵母菌細胞の実際の曲線を図１５及 び１６に示す。生存している細胞の場合、ＴＷＦＭ領域は、ｆ１とｆ２との間に のみ存在することがわかる。さらに、死亡した（すなわち、変更された）細胞は 、元の細胞がこれらの周波数条件の下で移動している間、一定である。 懸濁媒体の導電率は、図１４〜図１６にプロットされている曲線 の形状に影響を与える。導電率を経験的に調整し、好適な形状の曲線を得ること ができる。図示されている周波数範囲は、通常、最も好適であるが、この範囲を 越える他のＴＷＦＭ領域を、一方向または両方向に設け、使用することができる 。 例 １ 選択操作、及び未処理酵母細胞と熱処理酵母細胞の分離 ベーカーの酵母細胞（ベルリンのフリー大学生物物理学部から提供されたサッ カロマイセス セレビシアのRXII株）（Saccharomyceｓ cerevisiae，strain RX II，Department of Biophysics，Free University，Berlin）を、ショ糖（５０ ｇ／ｌ）、酵母抽出物（５ｇ／ｌ）、ペプトン（５ｇ／ｌ）からなる水性培地中 で３０℃にて培養した。酵母培養の増殖曲線は、複光分光光度計を用いて、バッ チ培養の最中に酵母懸濁液の吸光度変化を測定することによって得た。細胞が増 殖の定常期に達したときに、それを採取して２８０ｍＭのマンニトールで４回洗 浄した。その細胞を、湯浴中で２０分間、９０℃に加熱することによって死亡さ せ、その後、上記と同様に２８０ｍＭのマンニトールで洗浄した。 細胞生存率は、メチレンブルー染色剤を用いて決定した。この染色剤は、次の ３つの貯蔵溶液から調製した：［１］２０ｍｌの蒸留水にメチレンブルー（０． ２５０ｇ／ｌ）を溶解した溶液、［２］ＫＨ₂ＰＯ₄（２．７２２ｇ）を１００ｍ ｌの蒸留水に溶解した溶液、［３］Ｎａ₂ＨＰＯ₄（０．２４８ｇ）を１０ｍｌの 蒸留水に溶解した溶液。調製液は、２ｍｌの［１］、９９．７ｍｌの［２］、 及び０．２５ｍｌの［３］を混合して作った。０．０２ｍｌ以上の酵母懸濁液に 、０．８ｍｌの懸濁媒体と０．０８ｍｌのメチレンブルーを混合した。死亡した 細胞は青色染料を取り込み、染色剤を自己の内部から排除する生存している細胞 と区別できた。生存している細胞と死亡している細胞の相対的な量が異なる懸濁 液は、混合されて、そして（ＮａＣｌを加えて調節した）導電率が１、１０、５ ０ｍＳ／ｍである２８０ｍＭのマンニトール中に入れられる。この導電率は、白 金黒電極及びＨＰ４１９２Ａインピーダンス分析機を用いて、５０ｋＨｚにて測 定したものである。 このような懸濁液からなる５０マイクロリットルのサンプルが、図１と同一形 状の標準的な写真製板を使用して構成され、ハン、ワン、タム及びペシング（Hu ang，Wang，Tame and Pething）の論文「進行電界中のコロイド粒子の動電的特 性：酵母菌細胞を使用しての研究（”Electrokinetic behaivour of colloidal particles in travelling electric fields：studies using yeast cells”J.Ph ys．D:Appl.Phys.26）（１９９３年）１５２８−１５３５」に記載され、進行電 界によって及ぼされる力が細胞にかかるように構成している幾何学的電気的な接 続の微小電極配置にピペットで移された。電極の幅は、公称値１４ミクロンであ り、隣接電極間のギャップは、６ミクロンのオーダであり、対抗する電極チップ 間のチャネルの両端の距離は３０ミクロンであった。電圧位相関係は、図１に示 す通りであり、進行電界の有効周期長λは、８０ミクロンである。これらの寸法 が選択されると、平均直径が６〜８ミクロンのオーダである酵母菌細胞などの粒 子に対して最も好適なＴＷＦＭ効果が提供された。進行波電界は、図１に示すよ うな位相が分離された正弦波電圧を電極に順次に作用させることによって、形成 された。供給され た電圧の大きさは、（ピーク間で）５ボルトであった。カバースリップが、懸濁 液上に配置され、細胞の最終的な動きが顕微鏡を介して観察された。 導電率が１ｍｓ／ｍの懸濁媒体で、生存している酵母菌細胞のＴＷＦＭを試験 する際、この生存している細胞は、調査された１ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの間の周波 数でＴＷＦＭを示さず、電極縁部及びチップに捕獲されたままであった。導電率 が１０ｍＳ／ｍの媒体の場合、生存している細胞は、８ｋＨｚ〜６０ｋＨｚの周 波数範囲でＴＷＦＭを示し、この時、電極チップ間のチャネルに沿って、進行電 界の作用する方向とは逆方向に移動した。導電率が５０ｍＳ／ｍの媒体の場合、 生存している細胞は、３ｋＨｚ〜３００ｋＨｚの間でＴＷＦＭを示し、この場合 にも、チャネルに沿って、進行電界の作用する方向とは逆方向へ移動した。しか し、青に着色されて識別される死亡している細胞の運動は、顕著に相違していた 。導電率が１ｍＳ／ｍ懸濁媒体の場合、死亡している細胞は、１ｋＨｚ〜２ＭＨ ｚの全ての周波数で捕獲されたままであるが、３ＭＨｚ〜１０ＭＨｚで、進行電 界と同一の方向へチャネルに沿って移動した。このため、導電率が１ｍＳ／ｍの 媒体の場合、死亡している細胞は、３ＭＨｚの周波数の進行電界を供給すること によって、細胞混合物の中の生存している細胞から選択的に除去される。導電率 が１０ｍＳ／ｍの媒体の場合、死亡している細胞は、３ＭＨｚ以上の周波数に対 してのみＴＷＦＭを示し、この時、進行電界の方向とは逆方向へ、チャネルに沿 って移動する。このため、懸濁媒体の導電率が１０ｍＳ／ｍの時、周波数３０ｋ Ｈｚの信号を供給することによって、生存している細胞は、進行電界とは逆方向 へ、チャネルに沿って選択的に移動した。一方、死亡している細胞は、周波数が ５ＭＨｚの場 合、進行電界と同一の方向へ、チャネルに沿って選択的に移動した。３０ｋＨｚ の進行電界を、５ＭＨｚの進行電界と同時且つ同一方向へ供給することによって 、生存している細胞と死亡している細胞との両方が、同時且つ逆方向へ、チャネ ルに沿って且つ電極上を移動させ、これらを互いに完全に分離できることが証明 された。媒体の導電率が５０ｍＳ／ｍの時、死亡している酵母菌細胞は、７０ｋ Ｈｚ〜７００ｋＨｚの周波数範囲において、比較的弱いＴＷＦＭを示し、これら は、チャネルに沿って、電界の方向とは逆方向へ移動した。このため、媒体の導 電率が５０ｍＳ／ｍの時、５０ｋＨｚの周波数の進行電界を供給すると、死亡し ている細胞は、電極に捕獲されたままであり、生存している細胞は、進行電界の 方向とは逆方向へチャネルに沿って移動した。５００ｋＨｚの他の進行電界を、 ５０ｋＨＺの進行電界とは逆方向へかけることによって、生存している細胞の移 動方向とは逆方向へ、死亡している細胞が移動することが観察されたが、この分 離効果は、かかる電界が３０ｋＨｚ〜５ＭＨｚで、媒体の導電率が１０ｍＳ^-1ｍ である場合に観察される分離効果ほど大きなものではなかった。 これらの結果は、「処理された」粒子を、「処理されていない」粒子から選択 的に識別し、分離できることを証明しており、懸濁媒体（液体またはゲル）の最 も有効な導電率、及び供給される進行電界の周波数並びに方向を選択するための 原理を提供している。 本発明の技術を使用可能な分析及び分離方法の他の例を以下に示す。 転写因子のような蛋白に結合している２鎖ＤＮＡ（変更された粒 子）は、その変更粒子のみが移動する条件を選択することによって、蛋白を欠い ているＤＮＡから分離することができ、その後、蛋白を解離して遊離させ、配列 し、研究することができる。 上記の変法において、蛋白−ＤＮＡ複合体は、同様の蛋白−ＤＮＡ複合体であ って付加的な蛋白をさらに付けたもの（変更された粒子）から分離することがで きる。 抗体、成長因子、神経伝達物質、その他の生化学的メッセンジャーのようなリ ガンドに対する受容体を表面に有する細胞は、適切なリガンドが付けられると、 同様の細胞から分離することができる。 適切に移入が行われて、細胞膜中に存在するであろう新しい遺伝子生成物を表 現するようにした細胞は、元の形態の細胞から区別することができる。 ファージが結合した細胞は、非感染細胞から区別できる。 細胞は、細胞分割の際に相補的なゲノムＤＮＡに結合して非分割細胞から独立 的に分割するために導入された金粒子のようなラベルに付けられたオリゴヌクレ オチドプルーブを有していてもよい。 検出方法は、顕微鏡検査法に限定されない。例えば、変更された粒子が染色剤 又は蛍光マーカーを含んでいる場合には、変更粒子の存在は適切な分光光度計に よって観察してもよい。 電極は、必ずしも線形の「はしご形状」にする必要はない。「は しご形状」とする代わりに、湾曲させてもよく、或いは非線形としてもよい。そ れは、らせん形状や蛇行路を形成してもよく、或いは粒子が周回する閉塞路であ ってもよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 15/10 Ａ 6928−2Ｊ 27/00 Ｚ 7707−2Ｊ 33/48 Ｍ 8310−2Ｊ 33/543 ５０１ Ｆ 8310−2Ｊ ５４１ Ｚ 8310−2Ｊ 33/58 Ｚ 8310−2Ｊ // Ｂ０３Ｃ 5/00 Ｚ 9344−4Ｄ (72)発明者 ヒュアン，イーン アメリカ合衆国，77030 テキサス州，ヒ ューストン，ピー．オー．ボックス 89, ホルクーム ボウレバード 15125，デパ ートメント オブ エクスペリメンタル パソロジー，エム．ディー．アンダーソン キャンサー センター，ユニバーシティ ー オブ テキサス (72)発明者 ウァン，シャオ−ボ アメリカ合衆国，77030 テキサス州，ヒ ューストン，ピー．オー．ボックス 89, ホルクーム ボウレバード 15125，デパ ートメント オブ エクスペリメンタル パソロジー，エム．ディー．アンダーソン キャンサー センター，ユニバーシティ ー オブ テキサス (72)発明者 ペシグ，ロナルド イギリス国，エルエル59 ５ディーティー ギネド，メニア ブリッジ，テルフォー ド ロード，リーン （番地なし) (72)発明者 マックグレガー，アラステイヤ，ロイ イギリス国，エスジー８ ７キューティー ハートフォードシャー，ロイストーン, フォゥルミール，スリップ ロゥ ロー ド，フィールド ハウス（番地なし) (72)発明者 ポラード−ナイト，デニス，ヴェラ イギリス国，エイエル４ ０アールエル セント アルバンス，ハイフィールド レ ーン，ハイフィールド ホール 20

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．元の粒子を処理し、当該元の粒子とは異なる電界移動特性を有する変更され た粒子を形成する工程と、 同一条件下で、前記変更された粒子の運動が、前記元の粒子の運動と異なるよ うな条件を用い、進行波電界移動（ＴＷＦＭ）によって、前記変更された粒子及 び／又は前記元の粒子を並進運動させる工程と、 を備えている分析又は分離方法。 ２．光学顕微鏡を使用して前記粒子を観察できる請求項１に記載の方法。 ３．前記粒子が小さすぎて、光学顕微鏡を使用して観察できない請求項１に記載 の方法。 ４．前記元の粒子とリガンドとの複合体を形成する工程を備えている処理によっ て、前記元の粒子から前記変更された粒子を形成する請求項１〜３のいづれか一 項に記載の方法。 ５．前記複合体が、前記粒子と前記リガンドを接続する第１のリンク部を備えて いる請求項４に記載の方法。 ６．前記複合体が、前記リガンドに接続されるラベルをさらに備えている請求項 ５に記載の方法。 ７．前記ラベルが第２のリンク部を介して前記リガンドに接続され ている請求項６に記載の方法。 ８．前記元の粒子とは異なる誘電特性を有する、前記元の粒子とリガンドとの複 合体を形成することによって変更された粒子を形成できるように、前記元の粒子 を処理し、且つ 前記複合体を、移動方向に対して垂直な方向に、電極から遠ざけるように変位 させ、且つ前記複合体の誘起双極子モーメントの虚数成分に依存して移動させる 条件下において、電極に対して移動する進行波電界を、前記複合体にかける請求 項１に記載の方法。 ９．前記元の粒子の固有の誘電特性を変更する処理によって、前記変更された粒 子を生成する請求項１〜３のいづれか一項に記載の方法。 １０．前記移動電界の実効波長を、ＴＷＦＭの下での移動方向に対して交差する 方向で測定された、変更された粒子の大きさの８〜１２倍とする請求項１〜９の いづれか一項に記載の方法。 １１．連続する電極間の間隔が、連続的に増加する電極列を備えているＴＷＦＭ に使用される電極配置。 １２．２つの独立な電極列を備え、当該２つの電極列の間隔が連続的に増加する ＴＷＦＭに使用される電極配置。