DE69428000T2

DE69428000T2 - Analysen- und trennungsverfahren

Info

Publication number: DE69428000T2
Application number: DE69428000T
Authority: DE
Inventors: Ying Huang; Alastair Roy Macgregor; Adrian Parton; Ronald Pethig; Denise Vera Pollard-Knight; Xiao-Bo Wang
Original assignee: Scientific Generics Ltd
Current assignee: Scientific Generics Ltd
Priority date: 1993-01-21
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 2002-04-04
Anticipated expiration: 2014-01-22
Also published as: DK0680380T3; EP1092477A1; ATE204211T1; JPH08506179A; US5653859A; US5993631A; DE69409788T2; GB9301122D0; EP0815942A1; DK0815942T3; EP0815942B1; WO1994016821A1; EP0680380A1; DE69409788D1; EP0680380B1; DE69428000D1; ATE165255T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft analytische Verfahren, die auf die Beobachtung der Migration von Teilchen als Reaktion auf ein elektrisches Feld gestützt sind.
Im Hinblick auf den technischen Hintergrund sei darauf hingewiesen, dass sich Teilchen dadurch manipulieren lassen, dass sie elektrischen Wanderwellenfeldern ausgesetzt werden. Derartige Wanderwellenfelder werden in der Weise erzeugt, dass geeignete Spannungen in Anordnungen von Mikroelektroden, die für diesen Zweck in passender Weise konzipiert sind, angelegt werden. Die Mikroelektroden weisen dabei die geometrische Form einer Art von parallelen Lamellen auf, die durch entsprechende Abstände so voneinander getrennt sein können, dass durch sie Kanäle gebildet werden, wie sie in der Abb. 1 dargestellt sind; deren Herstellung kann dabei in der Weise erfolgen, dass das Standardverfahren der Kathodenzerstäubung ("Sputtern") sowie Techniken, die auf der Photolithographie beruhen, zum Einsatz gebracht werden, wie sie von Price, Burt und Pethig in Biochemica et Biophysica, Bd. 964, Seiten 221-230 beschrieben wurden. Die Wanderwellenfelder werden dadurch erzeugt, dass Elektroden mit Spannungen einer geeigneten Frequenz und jeweils passenden Phase beaufschlagt werden, wie dies in einem Dokument mit dem Titel: "Abtrennung kleiner Teilchen voneinander, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, durch ein nicht homogenes Wanderwellenfeld" beschrieben wurde, wobei das Dokument von Masuda, Washizu und Iwadare in IEEE Transactions on Industrial Applications, Bd. IA - 23, Seiten 474-480 stammt. Masuda und seine Mitarbeiter beschreiben darin, auf welche Weise eine Reihe paralleler Elektroden (ohne Kanäle), durch welche ein elektrisches Wanderfeld unterstützt wird, im Prinzip dazu benutzt werden kann, Teilchen in Einklang mit ihrer elektrischen Ladung und Größe (Gewicht) voneinander zu trennen. Masuda et alii lieferten jedoch keine Beschreibung über eine praktische Vorführung eines derartigen Verfahrens zur Abtrennung von Teilchen in der Praxis.
In einem Dokument mit dem Titel: "Wanderwellen - Dielektrophorese von Mikroteilchen", von Hagedorn, Fuhr, Müller und Gimsa in Electrophoresis, Bd. 13, Seiten 49-54, wird ein Verfahren vorgestellt, das dazu dient, dielektrische (die Elektrizität nicht leitende) Teilchen in Bewegung zu versetzen, wie zum Beispiel Teilchen in Form von lebenden Zellen und künstlichen Gegenständen mit mikroskopischen Abmessungen, über Strukturen auf Basis von Mikroelektroden und Kanälen, welche über die Elektroden miteinander verbunden sind, fortbewegt werden. Das Wanderwellenfeld wurde in der Weise erzeugt, dass jede Elektrode jeweils mit einer Spannung der gleichen Frequenz beaufschlagt wurde, wobei zwischen den benachbarten Elektronen eine Phasenverschiebung von 90º erfolgte.
Gemäß der Publikation "Elektrokinetisches Verhalten kolloidaler Teilchen in elektrischen Wanderwellenfeldern: Untersuchungen unter Einsatz von Hefezellen", von Y. Huang, X-B. Wang und R. Pethig in J. Phys. D. Appl. Phys., Bd. 26, Seiten 1528 bis 1535, (1993), wird eine durch ein Experiment gestützte Analyse der Auswirkung der "Dielektrophorese mittels Wanderwellen" (TWD) durchgeführt, welche von Hagedorn et alii (gemäß dem oben stehend angeführten Dokument) beschrieben wurde. Die Gleichung für dieses Phänomen
wurde von Huang et alü für den Zweck entwickelt, aufzuzeigen, dass die Geschwindigkeit der Dielektrophorese im Wanderfeld (in TWD) eine Funktion des Quadrats des Teilchenradius (r), des Quadrats aus der elektrischen Feldstärke [A(0)], der Periodenlänge des Wanderfeldes (λ), der Viskosität des Milieus (η) und des imaginären Anteils des Clausius-Mosotti-Faktors f (&epsi;p*, &epsi;m*) darstellt, wodurch die dielektrischen Eigenschaften des Teilchens und das Suspensionsmilieu im Hinblick auf deren jeweilige komplexe absolute Dielektrizitätskonstanten &epsi;p* und &epsi;m* definiert sind. Durch diese Gleichung wird zum ersten Mal eine praktische Anleitung zur Verfügung gestellt, um Elektrodensysteme für Wanderwellen zur geschickten Handhabung und Abtrennung von Teilchen zu konzipieren.
Obschon das in Frage stehende Phänomen für gewöhnlich als "Dielektrophorese mittels Wanderwellen" bezeichnet wird, konnte von uns nunmehr aufgezeigt werden, dass dieses Verfahren eine Art von irrtümlicher Bezeichnung darstellt, und zwar deswegen, weil die Kraft, welche auf die Teilchen einwirkt, um eine translationale Bewegung herbeizuführen, nicht die eigentliche dielektrophoretische Kraft, sondern vielmehr eine Einwirkung in Form einer Elektrorotation darstellt. Diese Kraft hat eine Beziehung zu der imaginären Komponente der Polarisierbarkeit des Teilchens innerhalb seines umgebenden Milieus. Allerdings läuft die Migration der Teilchen, wie unten stehend in ausführlicherer Weise diskutiert wird, nur im Zusammenhang mit solchen Frequenzen der Wanderwellen ab, die bei den Teilchen eine negative dielektrophoretische Kraft hervorrufen. (Die dielektrophoretischen Kräfte stehen in Beziehung zu der realen Komponente der Polarisierbarkeit des Teilchens innerhalb seines umgebenden Milieus.) Diese Kräfte sind dafür verantwortlich, dass das Teilchen von den Elektroden und dem Kanal zwischen den Elektroden abgehoben wird. In Einklang mit diesem Phänomen, das früher als "Dielektrophorese mittels Wanderwellen" bezeichnet wurde, ziehen wir es vor, dieses mit der Bezeichnung "Migration mittels eines Wanderwellenfeldes" (TWFM) zu belegen. Es wurde von uns aufgezeigt, dass zur Erzielung einer TWFM zwei voneinander unabhängige Kriterien erfüllt sein müssen. Erstens muß eine Frequenz ausgewählt werden, bei welcher die Kraft der Dielektrophorese, die auf die Teilchen einwirkt, negativ ist, das heißt, so beschaffen ist, dass die Teilchen entlang der Anordnung der Elektroden abgestoßen werden.
Dieser Umstand macht es gemäß unseren Feststellungen erforderlich, dass die reale Komponente des Dipolmoments, welches in den Teilchen induziert wird, negativ ist.
Zweitens muss die ausgewählte Frequenz von solcher Beschaffenheit sein, dass die imaginäre Komponente des Dipolmoments, welches in den Teilchen induziert wird, von Null verschieden ist (ganz gleich, ob positiv oder negativ), um eine Kraft zu erzeugen, durch welche die Teilchen entlang der Elektrodenanordnung verschoben werden.
In der WO-A-92/07 657 sind Anordnungen von Elektroden zur Anwendung bei der Erzeugung einer Migration von Teilchen mittels Wanderwellen offenbart.
In der EP-A-718 038 (die Veröffentlichung erfolgte nach dem Prioritätstag in dieser Anmeldungsakte) sind weitere Gruppierungen von Elektroden offenbart; dabei ist gemäß der Abb. 4 eine Anordnung mit eingeschlossen, bei welcher der jeweilige Abstand zwischen den aufeinander folgenden Elektroden in einer "Leiter" von Elektroden in Richtung der Migration der Teilchen in zunehmender Weise immer größer wird.
Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zum Transport von Teilchen unter Einbeziehung des Vorgangs geschaffen, Teilchen einer Migration mittels eines Wanderfeldes (Wanderwellenfelds) in einem Kanal gemäß Definition zwischen zwei Reihen von Elektroden zu unterziehen, die durch den genannten Kanal voneinander getrennt sind, worin die Breite des Kanals in Richtung der Teilchenmigration in fortschreitender Weise (progressiv) immer weiter abnimmt.
Das Verfahren lässt sich dann zum Einsatz bringen, wenn die Teilchen eine Größe besitzen, die dazu noch ausreicht, durch die Verwendung eines Lichtmikroskops eine (optische) Auflösung zu erzielen, oder auch dann anwenden, wenn die Teilchen zu klein sind, als dass sie mittels eines Lichtmikroskops (optisch) noch aufgelöst werden könnten.
Die Teilchen können einen Komplex umfassen, der aus einem ursprünglichen Teilchen und einem Liganden gebildet wurde.
Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zum Transport von Teilchen unter Einbeziehung des Vorgangs mit ein, Teilchen einer Migration mittels eines Wanderwellenfelds in einem Kanal gemäß Definition zwischen zwei Reihen von Elektroden zu unterziehen, die durch den genannten Kanal voneinander getrennt sind, und worin sich der jeweilige Abstand zwischen den einzelnen genannten, aufeinander folgenden Elektroden in jeder Reihe in Richtung der Teilchenmigration in fortschreitender Weise immer weiter verringert und worin auch die Breite des Kanals in Richtung der Teilchenmigration immer weiter abnimmt.
In der Erfindung ist auch eine Elektrodenanordnung zur Anwendung bei der TWFM (Migration in einem Wanderfeld) mit eingeschlossen, wobei diese Anordnung eine erste Reihe von Elektroden umfaßt, bei der sich der jeweilige Abstand zwischen den einzelnen aufeinander folgenden Elektroden in der genannten ersten Reihe immer weiter verringert und worin die Anordnung noch eine zweite Reihe von Elektroden aufweist, bei der sich der jeweilige Abstand zwischen den einzelnen aufeinander folgenden Elektroden in der genannten zweiten Reihe (ebenfalls) immer weiter verringert, und wobei die genannte erste Reihe und die genannte zweite Reihe auf den einander gegenüberliegenden Seiten in einem solchen Abstand zueinander im Hinblick auf den Kanal angeordnet sind, dass die Reihen voneinander getrennt sind, und wobei ferner die Breite dieses Kanals in fortschreitender Weise abnimmt, während sich der jeweilige Abstand zwischen den aufeinander folgenden Elektroden in fortschreitender Weise verringert.
Das vorliegend beschriebene Verfahren zum Transport von Teilchen läßt sich auch bei Techniken zur Abtrennung von Teilchen zum Einsatz bringen, wie sie in dem Europäischen Patent EP-B-0 680 380 beschrieben sind, und zwar unter Einbeziehung von Verfahren zur Abtrennung, die das Behandeln eines Teilchens zur Bildung eines veränderten Teilchens mit umfassen, wobei das veränderte Teilchen solche Eigenschaften im Zusammenhang mit TWFM aufweist, die im Vergleich zu den Eigenschaften des ursprünglichen Teilchens einen Unterschied aufweisen; dabei wird eine translationale Bewegung des genannten veränderten (modifizierten) Teilchens anhand von TWFM erzeugt, wobei Bedingungen zur Anwendungen gelangen, unter denen die Fortbewegung des veränderten Teilchens von jener Bewegung verschieden ist, welche an sich unter Einsatz des ursprünglichen Teilchens unter identischen Bedingungen erzielt worden wäre.
Das Teilchen kann eine Größe aufweisen, die für die Sichtbarkeit ausreicht, wenn ein Lichtmikroskop zum Einsatz gelangt (ein mikroskopisches Teilchen) oder auch kleiner sein (ein submikroskopisches Telichen), wobei es sich unter Anwendung von Markierungsmitteln, wie zum Beispiel durch lumineszierende oder fluoreszierende Markierungsmittel und durch solche Mittel zum Markieren erkennen lässt, die elektromagnetische Strahlung absorbieren.
Beispiele für den zuerst genannten Typ von Teilchen schließen Säugerzellen, Pflanzenzellen, Hefezellen, Mikrokügelchen aus Kunststoff, Chromosomen, die sich im Zustand der Meiose und Mitose befinden, sowie Oozyten, zum Beispiel solche von Cryptosporidium mit ein.
Beispiele für den zweiten Typ könnten Bakterienzellen, Viren, DNS - oder RNS - Moleküle, Proteine, andere biologische Moleküle und Chromosomen mit einschließen.
Die Art und Weise der zur Anwendung gelangenden Behandlung, das ursprüngliche Teilchen in ein verändertes (modifiziertes) Teilchen umzuwandeln, kann entsprechend der Art des Teilchens ein breites Spektrum aufweisen. Die Behandlung kann die Bildung eines Komplexes aus dem Teilchen und einem Liganden mit umfassen. In einigen Fällen kann der Komplex einen Bindungsanteil mit einschließen, wodurch das Teilchen und der Ligand miteinander verknüpft werden. Der Komplex kann ferner ein Markierungsmittel mit umfassen, das mit dem genannten Liganden verknüpft ist, je nach Wunsch auch noch über einen zweiten Bindungsanteil damit verbunden ist. Der Komplex kann zahlreiche Liganden mit einschließen, die an das Teilchen gebunden sind.
Die Auswahl des Molekülanteils mit der Fähigkeit zu einer Verknüpfung wird ganz offensichtlich von der Art des Teilchen und des Liganden abhängig sein. So zum Beispiel sollte der Molekülanteil mit der Bindungsfähigkeit in dem Falle, dass das Abfangen einer Nukleinsäurespezies (des Liganden) auf einem Mikrokügelchen aus Kunststoff (dem Teilchen) erwünscht ist, im Normalfall so ausgewählt werden, dass er in Form einer Nukleinsäure oder in Form eines analogen Oligomers der Nukleinsäure vorliegt; dabei weist dieses Oligomer eine Sequenz auf, die im Hinblick auf die Sequenz des Liganden oder eines Teiles davon komplementär ist.
Der Molekülanteil mit der Bindungsfähigkeit mag zuerst an das Teilchen gebunden werden, wobei jener im Anschluss daran in Form einer Spezies mit einer Affinität für den Liganden vorzuliegen vermag. In bevorzugter Weise stellt die genannte Affinität für den Liganden eine selektive Affinität dar, so dass die Bildung des Komplexes zwischen dem Teilchen und dem Liganden selektiv ist, wobei zum Mindesten ein gewisses Ausmaß an Identifizierungsmöglichkeit des Liganden zur Verfügung gestellt wird. Vorzugsweise ist die genannte Affinität höchst spezifisch, wobei in Einklang damit der genannte Molekülanteil mit einer Bindungsfähigkeit, der an das Teilchen gebunden ist und somit die selektive Affinität für den Liganden bereitstellt, vorliegen kann wie folgt: in Form eines Antikörpers oder eines Fragments eines Antikörpers mit einer Antikörperaktivität, eines Antigens, einer Nukleinsäuresonde oder einer Sonde aus einer analogen Verbindung einer Nukleinsäure, die eine selektive Affinität für komplementäre Nukleinsäuresequenzen aufweist, oder auch in Form von Avidin oder eines dem Avidin ähnlichen Moleküls, wie zum Beispiel in Form von Streptavidin.
Antikörper und Fragmente von Antikörpern mit Antikörpereigenschaften sind besonders bevorzugt. Es gibt bekannte Techniken, die sich zum Beschichten von Antikörpern auf der Oberfläche von Teilchen eignen, wie zum Beispiel auf Mikrokügelchen aus Kunststoff, die den Fachleuten wohlbekannt sind. Die mit den Antikörpern beschichteten Teilchen weisen die Fähigkeit auf, die entsprechenden Antigene, die sich auf den Zellen von Mikroorganismen oder einigen anderen Liganden präsentieren können, zu erkennen und an sich zu binden.
Es sind auch Verfahren zur Anbindung von Sonden aus Oligonukleinsäure an derartige Mikrokügelchen bekannt. In der PCT - Anmeldung Nr. GB 92/01 526 sind geeignete Methoden in Form von Beispielen beschrieben. In dem Falle, dass der für die Verknüpfung verantwortliche Molekülanteil eine Sonde aus Nukleinsäure oder eine Sonde aus einer analogen Verbindung einer Nukleinsäure darstellt, wird das erhaltene Teilchen natürlich für die Erkennung und Anbindung an komplementäre Nukleinsäuresequenz geeignet sein.
Der Ligand kann so ausgewählt sein, dass die Sichtbarkeit des Teilchens verbessert wird, oder dass seine Erkennbarkeit auf andere Art und Weise erhöht wird, oder dass auch seine TWFM - Eigenschaften verändert werden. Es lassen sich zum Beispiel Antikörper, die Fluorophore oder Chromophore tragen, an das Teilchen binden, so dass der auf diese Weise gebildete Komplex mittels TWFM von dem Ausgangsteilchen unterschieden und mit Hilfe von Fluoreszenz oder Farbe aufgespürt werden kann.
Das Markierungsmittel lässt sich mit dem genannten Liganden entweder vor, gleichzeitig oder nach der Bildung des Komplexes aus dem Liganden und dem Teilchen verknüpfen. Das Markierungsmittel kann einen zweiten für die Verknüpfung verantwortlichen Molekülanteil, mit welchem das genannte Markierungsmittel beladen ist, mit umfassen. Es sei nochmals darauf hingewiesen, dass die Affinität für den Liganden, welche sich im Besitz des für die Verknüpfung verantwortlichen Molekülanteils befindet, selektiv ist; in bevorzugter Weise ist sie sogar höchst selektiv, wobei der für die Verknüpfung verantwortliche Molekülanteil auch in Form eines Antikörpers, eines Fragments eines Antikörpers, eines Antigens, einer Nukleinsäuresonde, einer analogen Nukleinsäuresonde, in Form von Avidin oder einem dem Avidin ähnlichen Molekül vorliegen kann. Der Einsatz eines Markierungsmittels mit diesen Eigenschaften kann erwünscht sein, um eine leichte Erkennung des Komplexes zu unterstützen und / oder es kann ein Wunsch dafür in dem Falle bestehen, dass der Komplex aus dem Teilchen und dem Liganden nicht aus sich selbst heraus hinreichend unterscheidende TWFM-Eigenschaften aufweist, so dass die TWFM weiter durch die Einbeziehung in den Komplex des Markierungsmittels modifiziert werden kann. Für diesen Zweck kann das Markierungsmittel in Form eines Fluorophors oder Chromophors, aber auch als ein Mikroorganismus, ein Metallteilchen, ein Polymerkügelchen oder ein magnetisches Teilchen vorliegen. Für den Einsatz in Verbindung mit Messungen auf Basis von TWFM weist das Markierungsmittel vorzugsweise dielektrische Eigenschaften auf und ist dazu befähigt, eine signifikante Oberflächenladung aufzunehmen. Ein ganz besonders bevorzugtes Materal stellt kolloidales Gold dar, welches leicht an Antikörper (in Form der genannten zweiten Spezies) zur Bildung eines Markierungsmittels gebunden wird. Die an kolloidales Gold gebundenen Antikörper sind im Handel erhältlich; Verfahren zur Bindung von Antikörpern an kolloidales Gold sind beispielsweise in W. D. Geohegan et alii, (1978), Immunol. Comm. 7 pl. beschrieben. Es können allerdings auch andere Metallteilchen zum Einsatz gebracht werden, zum Beispiel Silberteilchen und Eisenteilchen.
Der Einsatz eines Markierungsmittels der oben beschriebenen Art kann sogar in dem Falle bevorzugt sein, dass ein Komplex aus dem Liganden und einem Teilchen hinreichend unterscheidende TWFM - Eigenschaften besitzt, um die Bildung eines derartigen zu beobachtenden Komplexes möglich zu machen. In bestimmten Fällen lässt sich ein höherer Grad an Spezifität durch die Verwendung eines Markierungsmittels in einem derartigem Komplex erzielen. So kann zum Beispiel der Wunsch bestehen, einen Mikroorganismus mit der Fähigkeit der Expression eines Antigens A von einem Mikroorganismus, der die Antigene A und B exprimiert, zu unterscheiden. Dies kann durch den Einsatz von Mikroteilchen noch verfeinert werden, wobei diese Teilchen als einen für die Verknüpfung verantwortlichen Molekülanteil einen gegen A gerichteten Antikörper sowie ein Markierungsmittel aufweisen, das einen Molekülanteil in Form eines gegen B gerichteten Antikörpers aufweist. Der Unterschied in der jeweiligen Geschwindigkeit des markierten Komplexes (zwischen dem Mikroteilchen, dem Mikroorganismus und dem Markierungsmittel) sowie dem nicht markierten Komplex (aus dem Mikroteilchen und dem Mikroorganismus) lässt sich beobachten und dazu heranziehen, Mikroorganismen mit der Fähigkeit, einzig und allein das Antigen A zu exprimieren, von solchen Mikroorganismen, welche (die Antigene) A und B exprimieren, zu unterscheiden.
Das Markierungsmittel kann ein magnetisches Teilchen in der Weise mit einschließen, dass das Markierungsmittel von einem Magneten angezogen werden kann, so dass die Komplexe mit einem Gehalt an dem genannten Markierungsmittel zur erleichterten Beobachtung angereichert werden. In einigen Fällen kann die Möglichkeit bestehen, dass markierte Komplexe von einem Magneten angezogen und nicht markierte Teilchen in der Weise ausgewaschen werden, dass der "Hintergrund" aus Teilchen zum Verschwinden gebracht wird, und zwar im Hinblick auf solche Teilchen, welche zwar Molekülanteile tragen, die für die Verknüpfung verantwortlich sind, aber keinen Liganden / Markierungsmittel aufweisen, welche im Normalfall vorhanden wären. Geeignete magnetische Markierungsmittel für diesen Zweck dürften Mikroteilchen aus Eisen mit einschließen, welche solche Molekülanteile tragen, die für die Verknüpfung verantwortlich sind, wie zum Beispiel Antikörper. Derartige, mit einem Antikörper beschichtete Eisenteilchen sind im Handel erhältlich.
Die Markierungsmittel sowohl für Zellen als auch für kleinere Teilchen können fluoreszierende Markierungsmittel, wie zum Beispiel FITC (Fluorescein - Isothiocyanat) oder Rhodamin, Chromophore, lumineszierende Markierungsmittel oder Moleküle auf Basis von Enzymen, die in der Lage sind, ein feststellbares Signal zu erzeugen, mit einschließen. Beispiele für das zuletzt genannte schließen Luciferasen und die alkalische Phosphatase ein. Diese Markierungsmittel lassen sich unter Verwendung von spektroskopischen Methodiken aufspüren, die in der Fachwelt zum Stand der Technik wohlbekannt sind. Das Markierungsmittel könnte an den genannten Liganden entweder vor, gleichzeitig oder nach der Bildung des Komplexes zwischen dem Liganden und dem Teilchen gebunden werden. Im Falle einer Transfektion von Zellen, sind die Zellen in der Lage, ein Markierungsmittel zusammen mit dem Genprodukt zu ko-exprimieren. Beispielsweise lässt sich ein Gen für die Feuerfliege oder die bakterielle Luciferase in Zellen ko-transfizieren, so dass die transfizierten Zellen die Fähigkeit erlangen, durch ein Lumineszenzsignal sichtbar gemacht zu werden.
Bei der Modifizierung des ursprünglichen Teilchens braucht keine Bildung eines Komplexes mit einbezogen sein. Zum Beispiel lassen sich die TWFM - Eigenschaften einer Zelle durch Erhitzen oder eine Behandlung mit einem Reagenz modifizieren, das die Porosität der Zellmembran verändert. In Einklang damit kann die Modifizierung schon in dem Teilchen selbst begründet sein, wobei diese Veränderung somit weniger in dessen Umbau oder zusätzlich zu einem Umbau im Hinblick auf die physikalische Anwesenheit eines Liganden in einem Komplex begründet sein kann. Beide Effekte können jedoch auch in Kombination miteinander vorhanden sein. Ein Ligand, der einen Komplex mit einem Teilchen bildet, kann einen physikalischen Effekt auf die TWFM - Eigenschaften ausüben, wobei dieser auch durch eine Wechselwirkung mit dem Teilchen eine Veränderung bei den immanenten TWFM - Eigenschaften des Teilchen herbeiführen kann.
In der Erfindung sind auch Verfahren zum Transport von Teilchen mit eingeschlossen, die zum Zwecke der Analytik zum Einsatz gelangen, ebenso wie Verfahren, die für präparative oder andere Zwecke durchgeführt werden.
Die Verfahren gemäß der Erfindung lassen sich in einem breiten Spektrum analytischer Anwendungen einschließlich der Abtrennung und Analyse von Proben zum Einsatz bringen, die beispielsweise einen Gehalt an Zellen von Bakterien, Säugern, Hefe und Insekten oder Virusteilchen sowie biologischen Makromolekülen aufweisen. Aktuelle Verfahren zur Abtrennung von Zellen, wie zum Beispiel die Cytometrie auf Basis der Durchflusszelle, machen eine teure Instrumentierung, geschickte Laborwerker und eine bedeutende Ausstattung des Labors erforderlich. Die Methoden sind auch im Hinblick darauf beschränkt, dass zahlreiche, voneinander unterschiedliche Zellpopulationen vorliegen können, die aufzutrennen sind, oder die interessierenden Zellen lediglich in einer Menge von weniger als ein paar Prozent vorliegen. Die zur Anwendung gelangenden Methoden zur Abtrennung und Analyse der modifizierten biologischen Moleküle oder Komplexe aus biologischen Makromolekülen schließen die Elektrophorese und die chromatographische Auftrennung unter Einsatz der Gelfiltration oder Affinitätschromatographie mit ein. Obschon diese Verfahren in einigen Fällen eine angemessene Auftrennung in bezug auf zahlreiche Anwendungen ermöglichen, können sie viel Zeit in Anspruch nehmen, wobei sie auch nur eine beschränkte Auflösung bieten. Darüber hinaus kann der Einsatz dieser Verfahren das Gleichgewicht zwischen biologischen Komplexen beeinträchtigen. So führt zum Beispiel die Gelfiltration zu einer bedeutsamen Verdünnung der Probe.
Die im Folgenden beschriebenen Verfahren in Einklang mit der vorliegenden Erfindung machen es möglich, sich mit einigen oder sämtlichen dieser Nachteile auseinander zu setzen.
In dem Falle, dass im Zusammenhang mit einem analytischen Verfahren gemäß der Erfindung ein Komplex aus dem Teilchen und einem Liganden erzeugt wird, braucht der Ligand selbst nicht in Form der Spezies vorliegen, welche das Vorhandensein, die Art oder Menge dessen begründet, was den eigentlichen Zweck der Analyse darstellen soll. Somit kann der Ligand als Reagenz bei der Analyse vorliegen, wobei die interessierende Spezies bei der Analyse ein anderer Bestandteil des Komplexes sein kann, zum Beispiel in Form des für die Verknüpfung verantwortlichen Molekülanteils oder des Teilchens selbst vorliegen kann. In dem Falle, dass ein Teilchen durch die Behandlung mit einem Reagenz verändert wird, kann es sich um das Teilchen selbst oder das Reagenz handeln, das im wesentlichen untersucht werden soll.
Das vorstehend beschriebene TWFM - Verfahren wird unter Einsatz einer Anordnung linearer, zueinander paralleler Elektroden durchgeführt, an welche elektrische, phasengesteuerte Felder angelegt werden, und zwar im Regelfalle in einer Art und Weise, dass sich jede vierte Elektrode entlang des TWFM - Pfads in Phase befindet. Durch diese Periodizität ist die wirksame Wellenlänge des erzeugten Wanderfelds festgelegt. Wir konnten aufzeigen, dass diese Wellenlänge in einem optimalen Fall in etwa das Zehnfache des durchschnittlichen Durchmessers des Teilchens beträgt, das mittels TWFM fortbewegt werden soll, wie zum Beispiel wenigstens 5 bis zu 20 Mal größer oder in bevorzugterer Weise 8 bis 12 Mal größer ist als der genannte Durchmesser. Was solche Teilchen anbelangt, die in grober Annäherung keinen kreisförmigen Umfang aufweisen, ist die Länge in der Richtung quer zu der Bewegung auf Basis der TWFM von wesentlicher Bedeutung.
Die Elektroden zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung lassen sich in Abhängigkeit von den erforderlichen Abmessungen und unter Einsatz von ganz beliebigen Standardverfahren der Bildgebung und Erzeugung von mikroskopischen Strukturen ausbilden. So lassen sich die Elektroden beispielsweise durch die folgenden Verfahren herstellen:
Siebdruck;
Abscheiden von Elektrodenmaterial (zum Beispiel durch Elektroplattieren oder Aufbringen durch Sputtern (Kathodenzerstäubung)), wonach eines der folgenden Verfahren zur Bildgebung angeschlossen wird:
Direktes "Beschreiben" unter Einsatz eines Elektronenstrahls und nachfolgendes Ätzen (zum Beispiel chemisches Nassätzen, trockenes Ätzen mit Plasma oder Ätzen mit einem fokussierten Ionenstrahl);
Beschreiben durch eine photolithographisch erzeugte Maske hindurch und anschließendes Ätzen, wobei die Maske beispielsweise durch Lithographie mit Hilfe von sichtbarem Licht, durch UV - Licht, Röntgenstrahlen oder einen Elektronenstrahl erzeugt werden kann;
Abtragung durch einen Excimer - Laser;
an die Bildgebung schließt sich die Abscheidung des Elektrodenmaterials an (wie zum Beispiel bei dem Röntgenverfahren auf Basis von LIGA).
Die Erfindung soll durch die folgende Beschreibung der Apparatur und Vorgehensweise unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen weiter dargelegt und erläutert werden:
In der Abb. 1 ist eine Anordnung der Elektroden dargestellt, bei welcher der jeweilige Abstand in der Querrichtung der Anordnung variiert ist;
in der Abb. 2 ist eine weiter modifizierte Anordnung der Elektroden dargestellt, bei welcher der jeweilige Abstand der Elektroden sowohl in der Querrichtung als auch in der Längsrichtung der Anordnung variiert ist.
Beispiele für Konzipierungen der Elektroden zur Erzielung von Abtrennungseffekten sind in den Abb. 1 und 2 dargestellt.
In der Abb. 1 wird die Anordnung der Elektroden durch zwei parallele Reihen von Elektroden gebildet, wobei jede Elektrode rechteckig ist und ihre Längsrichtung sich quer zur Richtung der Ausdehnung der Reihen erstreckt. Die beiden Reihen sind durch eine Lücke voneinander getrennt, wobei der jeweilige Trennungsabstand zwischen jedem Elektrodenpaar in jeder Reihe der gleiche ist. Die Elektroden sind aus einem dünnen Metallfilm auf einem isolierenden Substrat gebildet; sie sind in passender Weise aus Gold, das auf einen Glas-Objektträger aufgedruckt ist. Der Trennungsabstand zwischen den Reihen nimmt in fortschreitender Weise allmählich ab. Das Maß für den sich immer weiter vergrößernden Abstand bzw. Zwischenraum zwischen den Gruppen von jeweils 4 Elektroden in jeder Reihe beträgt 80 um. Eine zweckdienliche Vorschrift besteht darin, dass im allgemeinen das Maß für den genannten, sich immer weiter vergrößernden Abstand, durch den die Wellenlänge des Wanderfeldes festgelegt ist, zwischen 5 bis 20 Mal die Größe der Teilchen ausmachen sollte, wie zum Beispiel von 8 bis 12 Mal größer oder in der am meisten bevorzugten Weise 10 Mal größer.
Die Reaktion der Teilchen, die einem Wanderfeld der unten stehend beschriebenen Art ausgesetzt sind, lässt sich variieren. Die Teilchen lassen sich an den Elektroden abnehmen, sie können auch zum Eindrehen veranlasst und dazu gebracht werden, entlang der Lücke zwischen den Reihen oder über die Reihen hinweg zu wandern. Diese Wanderbewegung (Migration) wird TWFM genannt. Der jeweils erzeugte Typ von Fortbewegung ist von der Art des Teilchens, dem Suspensionsmedium, dem Abstand der Elektroden und der Frequenz des Feldes abhängig.
Gemäß der Abb. 2 variiert die periodische Länge zwischen den Elektroden in der Weise, dass der Parameter λ aus der oben stehend vorgestellten Gleichung ins Spiel gebracht wird. So wird zum Beispiel eine Wanderwelle, die sich von den oberen Elektroden in Richtung der unteren Elektroden bewegt, ein Teilchen, das sich unter der TWFM nach oben bewegt, beschleunigen. Dieser Umstand lässt sich zum Beispiel zur Erzeugung einer gleichförmigeren Auflösung entlang des TWFM - Pfads einsetzen, wobei dem natürlichen Trend einer erhöhten Auflösung mit der zurückgelegten Strecke entgegengewirkt wird. Gemäß den Abb. 1 und 2 variiert auch die Breite des Kanals, wobei durch diesen Umstand auch noch die Variation des Feldes A (0) der oben genannten Gleichung ins Spiel gebracht wird.
Ein Teilchen, das sich unter dem Einfluss der TWFM fortbewegt, wird als Ergebnis der stetig wachsenden Feldstärke im Hinblick auf die sich gleichzeitig verringernde Kanalbreite beschleunigt. Auf diese Weise sollten zwei Teilchen unterschiedlicher Größe, aber ansonsten ähnlicher physikalisch - chemischer Eigenschaften im Verlauf ihrer Fortbewegung im Kanal räumlich voneinander getrennt werden. Teilchen mit unterschiedlichen dielektrischen Eigenschaften könnten so in einem geeigneten Medium suspendiert werden, so dass der Faktor Im [f (&epsi;p*, &epsi;m*)] in der oben stehenden Gleichung in Bezug auf jedes Teilchen über ein unterschiedliches Vorzeichen verfügt. Unter diesen Gegebenheiten dürfte die Frequenz der Sinuswelle des jeweiligen Outputs und die Spannung von Spitze zu Spitze durch die Teilchen festgelegt sein.
Während der Anwendung wird durch das Bild, das auf dem Schirm der Apparatur erscheint, eine Anzahl von Kügelchen in dem Gesichtsfeld des Mikroskops dargestellt, wobei die Kügelchen mit hinreichend langsamer Geschwindigkeit wandern, so dass die Migrationsrate innerhalb einer Periode von 30 Sekunden von einer beobachtenden Person, die jedes Kügelchen abwechselnd betrachtet, direkt ermittelt werden kann. Obschon die oben stehend beschriebene Apparatur dafür ausreichend ist, nutzbringende Ergebnisse zu liefern, ist es jedoch im allgemeinen vorzuziehen, die Messungen der Wanderungsgeschwindigkeit an mehr Kügelchen durchzuführen, als sie unter vernünftigen Umständen ein menschlicher Beobachter bei direkter Betrachtung verarbeiten könnte. Zu diesem Zweck dürfte der Wunsch bestehen, Techniken auf der Basis von Bildverarbeitung einzusetzen, um die Wanderung der Kügelchen in der Apparatur zu erkennen und zu messen. Über eine CCD - Kamera besteht die Möglichkeit, die Einzelbilder aus einem Gesichtsfeld mit einer Anzahl von Kügelchen aufzunehmen. Eine Reihe von Bildern oder deren kompletter Aufbau könnte mittels eines Schaltkreises zum Aufzeichnen der Bilddateien in einem Computer gespeichert und die Reihe der Einzelbilder mittels einer Software für die Bildverarbeitung analysiert werden.
Auf diese Weise lässt sich ein Verfahren zum Diskriminieren (Klassifizieren) zum Einsatz bringen, um zum Beispiel das Bild in Graustufen, das von der Kamera geliefert wird, in ein binäres Bild umzuwandeln. Es wird dabei ein separater Diskriminatorprozess (Berechnung von Schwellenwerten) zur Identifizierung jedes einzelnen Bildbereiches, der jeweils als zu dunkel befunden wird, durchgeführt; dabei werden derartige (dunkle) Bereiche aus dem binär aufgezeichneten Abbild der Kügelchen entfernt. Die verbleibenden Formen im Bild können vom Rest des Bildes abgetrennt und einer Überprüfung auf eine oder mehrere Eigenschaften unterzogen werden, zum Beispiel im Hinblick auf die Fläche, um solche (Bereiche) auszuwählen, bei denen eine Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie in Form von Kügelchen vorliegen. Sodann kann der Massenmittelpunkt im Hinblick auf die qualifizierende Form bestimmt werden. Die jeweiligen Lagepunkte der Zentren können so zwischen den aufeinander folgenden Bilddateien in der Weise miteinander verglichen werden, dass jedes Kügelchen in einem Einzelbild auch in dem nächsten Bild lokalisiert werden kann. In dem Moment, in dem ein Kügelchen in zwei Einzelbildern lokalisiert worden ist, soll der Unterschied in den Positionen des Kügelchens die zurückgelegte Strecke direkt im Hinblick auf die Migration ergeben; anhand dieser Werte kann dessen Migrationsgeschwindigkeit berechnet und deren Durchschnittswert über mehrere Paare der Einzelbilddateien hinweg ermittelt werden. Mittels derartiger automatisierter Methoden lässt sich die jeweilige Migrationsgeschwindigkeit sämtlicher Kügelchen innerhalb des Gesichtsfeldes zu jedem Zeitpunkt messen und ein statistisches Abbild der Wanderungscharakteristika der Kügelchen entwickeln, wobei je nach Wunsch eine Anzahl von Frequenzen des Wanderfeldes zum Einsatz gelangt.
Es lassen sich auch andere Techniken zur Bildverarbeitung zur Anwendung bringen, um die Lagepunkte der Teilchen zu identifizieren und so deren Bewegung zu bestimmen, zum Beispiel anhand von Korrelationsberechnungen oder der Erkennung von Kanten; dazu gehören auch morphologische Verfahren oder die Subtraktion von Bildern. Zur Identifizierung von Bildern lassen sich auch neuronale Netzwerke einsetzen.
Es ist nicht immer notwendig, einen Bilddetektor des oben stehend beschriebenen Typs zum Einsatz zu bringen, um die jeweilige Geschwindigkeit der Teilchen zu bestimmen. Alternative Konfigurationen zur Erkennung schließen die folgenden Nachweisverfahren mit ein:
Detektoren (Messfühler) auf Basis von Lichtstreuung, wie zum Beispiel in einem Durchflusszytometer;
standardisierte Anordnungen zum Erkennen auf Basis einer Fluoreszenz;
Erkennung auf Basis von Lumineszenz unter Einsatz von CCDs oder anderen Detektoren; spektroskopische Messungen auf Basis von optischen Einfach- oder Vielfachelementen; Erkennung mittels Modulation auf Basis eines refraktären Index (zum Beispiel Verfahren auf Basis von Phasenkontrast);
Erkennung auf Basis der akustischen Impedanzmessung (die eine Abhängigkeit von der Masse des Teilchen zeigt) unter Verwendung von akustischen Messfühlern für die Oberfläche oder Größenausdehnung;
Messung der elektrischen Impedanz, Kapazität oder Induktivität.
Die Apparatur lässt sich weiterhin auch durch die Einbeziehung eines Magneten, in passender Weise durch einen Elektromagneten modifizieren; dieser wird so positioniert, dass er in der Probe jedes einzelne magnetische Kügelchen bis in das Gesichtsfeld des Mikroskops zieht. Der Magnet wäre im Anschluss daran zu entfernen oder abzuschalten, während dessen die Charakteristika der Migration der Kügelchen zu messen wären. Alternativ lassen sich die Teilchen so geschickt lenken, dass sie durch eine Dielektrophorese oder Elektrophorese in Position gebracht werden können.
Ein Mikroteilchen kann ein Kunststoffkügelchen mit umfassen, an das ein oder mehrere Antikörper - Moleküle in Form eines für die Verknüpfung verantwortlichen Molekülanteils gebunden sind. Im Normalfall werden die Kügelchen aus Kunststoff praxisnah mit einer Vielzahl von Antikörper - Molekülen beschichtet sein. Die Mikroteilchen können auch mit Zellen von Mikroorganismen in Kontakt gebracht werden, die Oberflächenantigene tragen, welche mit dem angekoppelten Antikörper eine Reaktion eingehen können, so dass ein Komplex zwischen dem Mikroteilchen und der Zelle gebildet wird. Bei den Zellen der Mikroorganismen kann es sich um E. coli oder dem E. coli ähnliche (koliforme) Organismen handeln, die im Wasser vorhanden sind; oder es kann sich um pathogene Mikroorganismen handeln, die sich in Lebensmitteln befinden, wie zum Beispiel Listerien oder Salmonellen. Es wurde auch der Befund erhoben, dass die Geschwindigkeit der Migration derartiger Komplexe aus einem Mikroteilchen und einer Zelle unter Bedingungen, die in geeigneter Weise ausgewählt wurden, einen Unterschied gegenüber der jeweiligen Geschwindigkeit der Migration zeigen, die unter Einsatz von Mikroteilchen alleine erzielt wurde; ferner hat es sich herausgestellt, dass die jeweilige Geschwindigkeit der Migration, die im Hinblick auf Komplexe aus Mikroteilchen und lebenden Zellen von Mikroorganismen erzielt wurde, von der jeweiligen Migrationsgeschwindigkeit unterschieden werden kann, die im Hinblick auf solche (Komplexe) zwischen Mikroteilchen und ähnlichen, nicht am Leben befindlichen Zellen erzielt wurde.
Es lässt sich auch ein ternärer Komplex zwischen einem Mikroteilchen, einem Antigen und einem Markierungsmittel erzeugen, wobei darin ein für die Verknüpfung verantwortlicher Molekülanteil und ein zweiter Antikörper mit einbezogen ist, wobei der zweite Antikörper mit dem ersten Antikörper identisch oder davon verschieden sein kann. Ein ternärer Komplex dieses Typs kann in dem Falle zur Anwendung gelangen, dass das Antigen zu klein ist oder oder auch in dem Falle, dass ihm die dielektrischen Eigenschaften überhaupt fehlen, wobei in diesen Fällen die Auswirkung auf die Eigenschaften der TWFM des Mikroteilchens nicht ausreichend ist; dieser letztgenannte (ternäre Komplex) Typ kann auch dann verwendet werden, wenn der Wunsch besteht, ein höheres Ausmaß an Spezifität durch den Einsatz von zwei verschiedenen Antikörpern in einer einzigen Analyse zu erzielen. Bei dem Antigen kann es sich beispielsweise um ein Toxin handeln, das als Verunreinigung in einem Nahrungsmittel vorhanden ist.
Gemäß der Erfindung sind auch Verfahren zur Erkennung von Nukleinsäuren, insbesondere Sequenzen von Nukleinsäuren, die als Produkte aus Vermehrungsverfahren, wie zum Beispiel aus Methoden auf Basis von PCR (Polymerase - Kettenreaktion), LCR (Ligase - Kettenreaktion) und 3SR, mit eingeschlossen. Bekannte Verfahren zur Erkennung von Produkten aus Vermehrungsverfahren für Nukleinsäuren sind darauf gestützt, dass eine bestimmte Form eines Reinigungsprozesses und / oder eine Abtrennungsoperation angewendet wird, bevor deren Analyse vorgenommen wird. Bei einem in verbreiteter Weise etablierten Verfahren ist die Analyse von Produkten durch die Gel - Elektrophorese auf Basis von Agarose mit inbegriffen. Dadurch werden die vermehrten Fragmente der DNS und sämtliche verbleibenden Primer (Starter - DNS), bestehend aus Oligonukleotiden der Größe nach voneinander getrennt. Die auf Basis ihrer Größe abgetrennten Produkte alleine bieten (den Fachleuten) keine Möglichkeit, zwischen den Produkten der erforderlichen Basensequenz auf Basis von PCR und einer vermehrten Verunreinigung von annäherungsweise der gleichen Länge zu unterscheiden. Zur weiteren Identifizierung von Produkten auf Basis von PCR, kann die Gel - Elektrophorese dadurch einen Schritt weiter geführt werden, dass das Produkt daraus mit der Methode auf Basis von Southern - Blotting (Southern - Transfer) weiter bearbeitet wird, bei der die abgetrennten Fragmente von dem Gel auf eine Membran überführt werden, und zwar in direkter Entsprechung zu deren relativen Lagepunkten auf dem Gel. Im Anschluss daran werden sie mit einer markierten einsträngigen DNS - Sonde mit einer Basensequenz sondiert, welche zu der interessierenden Sequenz komplementär ist. Das für die Sonde verwendete Markierungsmittel stellt für gewöhnlich das Biotin oder ein Radioisotop dar, wie zum Beispiel das ³²P. Die Southern - Blotting - Technik ist verhältnismäßig arbeitsintensiv, stellt mäßige Anforderungen an das Geschick bei den Laborarbeiten und die Ausstattung des Labors wie auch die verschiedenen Einrichtungen. Es eignet sich nicht für eine Verwendung zur raschen systematischen Austestung von Proben außerhalb des Labors. Das Verfahren des "dot" ('Tüpfel") - Blotting, bei dem der Schritt der Auftrennung auf Basis des Southern - Transfers mittels eines Gels aus Agarose weggelassen wird, ist etwas zügiger; es krankt aber an den gleichen Nachteilen wie das Southern - Blotting.
Gemäß einem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung kann ein Mikroteilchen auch ein Oligonukleotid oder synthetisches analoges Oligonukleotid in Form einer Sonde (eines zu einer Bindung fähigen Molekülteils) zum Abfangen mit einschließen, wobei dieses Oligonukleotid an die Oberfläche eines polymeren Kügelchens gebunden ist und eine Sequenz aufweist, die zu der Sequenz des erwarteten Vermehrungsprodukts komplementär ist. Es wird ein Markierungsmittel, das einen TWFM markierenden Molekülteil umfasst, wie er oben stehend beschrieben ist, zum Einsatz gebracht; dieses Mittel ist mit einer zweiten Sequenz eines Oligonukleotids oder synthetischen analogen Oligonukleotids verknüpft, die zu einer zweiten Region des Liganden in Form der Nukleinsäuresequenz komplementär ist. Die Mikroteilchen und das Markierungsmittel lassen sich zu dem Vermehrungsprodukt vor oder nach einer Aufarbeitung des Reaktionsgemisches nach Belieben zwecks Auftrennung der Vermehrungsprodukte hinzufügen. Die TWFM - Eigenschaften des ternären Komplexes aus dem Mikroteilchen, dem Vermehrungsprodukt und dem Markierungsmittel lassen sich sodann beobachten und von jenen der Mikroteilchen alleine unterscheiden. Gemäß einer Variante dieser Vorgehensweise wird einer der Primer, der bei dem Vermehrungsverfahren verwendet wird, mit einem geeigneten, zur TWFM - Markierung befähigten Molekülteil markiert, wodurch ein kovalenter Einbau in das Nukleinsäureprodukt aus dem Vermehrungsverfahren erfolgt. Im Anschluss daran wird ein binärer Komplex aus einem Mikroteilchen erzeugt, das eine Sonde 26 zum Abfangen trägt, wonach das Vermehrungsprodukt und die TWFM - Eigenschaften des Komplexes beobachtet werden.
Der Nukleinsäureligand kann in Form eines Chromosoms (komplexe Nukleinsäure) vorliegen, wobei das Mikroteilchen diskrete dielektrische Eigenschaften aufweisen kann, zum Beispiel metallisch sein (aus Gold) usw. Dies ist ganz besonders bei der Abtrennung menschlicher Chromosomen (und anderer Spezies) dann von Nutzen, wenn die verschiedenen Chromosomen eine jeweils unterschiedliche Größe und auch unterschiedliche Eigenschaften aufweisen. Techniken, wie zum Beispiel die Durchflusszellzählung (Zytometrie) werden aktuell dazu verwendet, die Chromosomen nach ihrer Größe zu klassifizieren; diese Techniken verfügen aus diesem Grunde nicht über die Fähigkeit, Chromosomen ähnlicher Größe voneinander zu unterscheiden. Im Falle menschlicher Probanden lassen sich die Chromosomen 9 - 12 einschließlich durch die Durchflusszytometrie aufgrund ihrer Ähnlichkeit hinsichtlich ihrer Größe nicht so einfach voneinander trennen.
In Einklang mit unserer Philosophie jedoch können diese Chromosomen in dem Falle, dass sie zuvor mit einem dielektrischen Markierungsmittel markiert worden sind, auf der Basis ihrer dielektrischen Eigenschaften aufgetrennt werden.
In der Praxis wird dieses Ziel dadurch erreicht, dass die chromosomale DNS teilweise denaturiert wird (beispielsweise durch Hitze, eine chemische oder elektrische Behandlung), wonach im Anschluss daran eine komplementäre Nukleinsäuresonde (die mit einer definierten Nukleinsäuresequenz komplementär ist) hybridisiert wird. Die Nukleinsäuresonde kann in bevorzugter Weise aus mindestens 15 Nukleotiden bestehen, wobei sie selbst zuvor mit einer Entität markiert worden sein kann, die eine Affinität zu einem Mittel zum Verknüpfen aufweist. So kann das Markierungsmittel zum Beispiel in Form von "Biotin" vorliegen, jedoch nicht in ausschließlicher Weise; dieses Markierungsmittel kann in ein Nukleotid eingebaut oder an die endständige Region der Sondensequenz angefügt werden. Das Verknüpfungsmittel kann zum Beispiel in Form eines Antikörpers vorliegen, der über eine Spezifität für das Markierungsmittel verfügt; alternativ kann das Verknüpfungsmittel auch ein Protein / Enzym darstellen, welches eine Affinität für das Markierungsmittel der Wahl aufweist. Das Mittel zum Verknüpfen kann andererseits an ein Mikroteilchen gebunden sein, das sowohl die Rolle eines dielektrischen Verstärkers (durch die Verstärkung zusätzlicher dielektrischer Eigenschaften) als auch / oder die Rolle eines Hilfsmittels bei der Erkennung von Chromosomen der Wahl spielen könnte. Im Gefolge der "dielektrischen Markierung" des Chromosoms als Ligand kann es dann von den anderen Chromosomen auf der Basis der unterschiedlichen dielektrischen Eigenschaften abgetrennt werden.
Somit ist es möglich, ins Auge zu fassen, die selektive Auftrennung und Identifizierung von Chromosomen dadurch zu verwirklichten, dass das oben stehende Verfahren zum Einsatz gebracht wird. Dieses findet eine praktische Anwendung bei klinischen Diagnosevorgängen, bei denen die Identifizierung und Charakterisierung von Veränderungen bei den Chromosomen, so zum Beispiel bei erneuten Anordnungen oder Verdünnungen, der Einfügung fremder DNS, zum Beispiel einer viralen DNS, von Bedeutung ist.
Alternativ kann es sich bei dem Chromosom um das Teilchen als Ergebnis der Behandlung mittels der Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde handeln, wobei letztere ein Markierungsmittel (den Liganden) trägt, das (der) die TWFM - Charakteristika des Chromosoms verändert und in optimaler Weise auch zu seiner Erkennung, zum Beispiel in Zusammenhang mit einem fluoreszierendem Markierungsmittel, beiträgt.
Weitere Einzelheiten der vorliegend beschriebenen Anordnungen der Elektroden finden sich in der EP-A-0 680 380.
Beispiele für mögliche Analysen und Auftrennungen unter Einsatz der Verfahren gemäß der Erfindung stellen die folgenden dar:
Ein doppelsträngiges Molekül aus DNS, mit welchem ein Protein, wie zum Beispiel ein Transkriptionsfaktor (ein verändertes Teilchen), verknüpft ist, lässt sich von einer DNS, welcher das Protein fehlt, abtrennen, und zwar durch die Auswahl von Bedingungen, unter denen einzig und allein das veränderte Teilchen wandert, wobei im Anschluss daran das Protein abgespalten, isoliert, sequenziert und untersucht werden kann.
Gemäß einer Variante der oben stehenden Ausführungen lässt sich der Komplex aus einem Protein und einer DNS von ähnlichen Komplexen aus einem Protein und einer DNS, mit welchen ein zusätzliches Protein verknüpft wurde (verändertes Teilchen), abtrennen.
Es lässt sich auch eine Zelle, die auf ihrer Oberfläche einen Rezeptor für einen Liganden, wie zum Beispiel einen Antikörper, Wachstumsfaktor, Neurotransmitter oder einen anderen biochemischen Botenstoff trägt, von ähnlichen Zellen, mit denen der geeignete Ligand verknüpft wurde, abtrennen.
Weiter lassen sich Zellen, die erfolgreich in einer Art und Weise transfiziert wurden, dass sie ein neues Genprodukt exprimieren, das möglicherweise in der Zellmembran lokalisiert ist, im Hinblick auf die ursprüngliche Form der Zelle differenzieren.
Solche Zellen, die mit einem Phagen verknüpft wurden, lassen sich von nicht infizierten Zellen differenzieren.
Die Zellen können auch eine Sonde aus einem Oligonukleotid aufweisen, die mit einem Markierungsmittel verknüpft wurde, wie zum Beispiel einem Teilchen aus Gold, das in die Zellen eingebracht wurde, um während der Zellteilung mit der komplementären DNS des Genoms eine Verknüpfung zum Zwecke der Abtrennung der sich teilenden von den sich nicht teilenden Zellen herzustellen.
Die Verfahren zur Erkennung sind nicht auf die Mikroskopie beschränkt. So lässt sich zum Beispiel in dem Falle, dass das veränderte Teilchen ein Markierungsmittel aus einem Farbstoff oder fluoreszierendem Stoff mit einschließt, die Anwesenheit von veränderten Teilchen mittels eines geeigneten Spektrophotometers laufend überwachen.
Die Elektroden brauchen nicht in Form eines Paares linearer "Leitern" angeordnet werden. An Stelle dieser Anordnung kann jede "Leiter" der Elektroden in gebogener oder in anderer Weise nicht linearer Form vorliegen. Die "Leiter" kann auch in Form einer Spirale oder eines Pfads nach Art einer Serpentine ausgebildet sein.

Claims

1. Verfahren zum Transport von Teilchen unter Einbeziehung des Vorgangs, Teilchen einer Migration mittels eines Wanderwellenfelds einem zwischen zwei Reihen von Elektroden begrenzten Kanal zu unterziehen, die durch den genannten Kanal voneinander getrennt sind, wobei die Breite des Kanals in Richtung der Teilchenmigration in fortschreitender Weise abnimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Teilchen eine Größe aufweisen, die dazu ausreicht, durch den Einsatz eines Lichtmikroskopes eine (optische) Auflösung zu erzielen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Teilchen zu klein sind, als daß sie mittels eines Lichtmikroskopes (optisch) noch aufgelöst werden könnten.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Teilchen einen Komplex mit umfassen, der aus einem ursprünglichen Teilchen und einem Liganden gebildet worden ist.

5. Verfahren zum Transport von Teilchen unter Einbeziehung des Vorgangs, Teilchen einer Migration mittels eines Wanderwellenfelds in einem zwischen zwei Reihen von Elektroden begrenzten Kanal zu unterziehen, die durch den genannten Kanal voneinander getrennt sind, wobei sich der jeweilige Abstand zwischen den einzelnen genannten, aufeinander folgenden Elektroden in jeder Reihe in Richtung der Teilchenmigration in fortschreitender Weise verringert und wobei die Breite des Kanals in Richtung der Teilchenmigration in fortschreitender Weise abnimmt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Teilchen eine Größe aufweisen, die dazu ausreicht, eine (optische) Auflösung durch den Einsatz eines Lichtmikroskopes zu erzielen.

7. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Teilchen zu klein sind, als daß sie mittels eines Lichtmikroskopes (optisch) noch aufgelöst werden könnten.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, bei dem die Teilchen einen Komplex mit umfassen, der aus einem ursprünglichen Teilchen und einem Liganden gebildet ist.

9. Elektrodenanordnung zur Anwendung bei TWFM (bei der Migration mittels eines Wanderwellenfeldes), wobei diese Anordnung eine erste Reihe von Elektroden umfaßt, bei der sich der jeweilige Abstand zwischen den einzelnen aufeinander folgenden Elektroden in der genannten ersten Reihe immer weiter verringert, und worin die Anordnung eine zweite Reihe von Elektroden aufweist, bei der sich der jeweilige Abstand zwischen den einzelnen aufeinander folgenden Elektroden in der genannten zweiten Reihe immer weiter verringert, und wobei die genannte erste Reihe und die genannte zweite Reihe auf einander gegenüberliegenden Seiten eines Kanalabstands, der die Reihen voneinander trennt, angeordnet sind, und wobei die Breite dieses Kanals in fortschreitender Weise (progressiv) abnimmt, während sich der jeweilige Abstand zwischen aufeinander folgenden Elektroden in fortschreitender Weise verringert.