DE69426008T2

DE69426008T2 - Verfahren zur Gewinnung von einzelnen Mikroorganismen und Anwendungen dieses Verfahrens

Info

Publication number: DE69426008T2
Application number: DE1994626008
Authority: DE
Inventors: Masahiro Kawaguchi; Akira Kuriyama; Takeshi Miyazaki; Etsuko Sugawa; Tetsuya Yano
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1993-11-15
Filing date: 1994-11-11
Publication date: 2001-05-17
Anticipated expiration: 2014-11-12
Also published as: EP0653492A3; DE69426008D1; EP0653492A2; EP0653492B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Trennen von Mikroorganismen-Populationen, die an einem Träger haften, oder die an anderen Mikroorganismen haften, in Individuen. Die Erfindung umfaßt desweiteren die Gewinnung getrennter Mikroorganismen, entweder als Bodenkörper bzw. Niederschlag oder in einer Flüssigkeit suspendiert, und die Durchführung verschiedener Operationen an diesen Mikroorganismen. Solche Operationen können das Zählen aller vorhandenen Mikroorganismen, die Bestimmung der Population eines bestimmten Typs von Mikroorganismus als Anteil an der Gesamtzahl und das Gewinnen von DNA-Material aus einzelnen Mikroorganismen einschließen.

IN BEZIEHUNG STEHENDER STAND DER TECHNIK

Es existiert die Forderung nach der Abtrennung einzelner Mikroorganismen aus Ölsuspensionen, aus belebtem bzw. aktiviertem Schlamm in Kläranlagen, aus Abwasser-Entsorgungstanks oder Schlamm am Boden eines Flusses, Sees oder dem Meer. In jeder dieser Umgebungen existiert eine große Population an Mikroorganismen verschiedener Arten und es existiert das Erfordernis, in der Lage zu sein, diese Organismen zu untersuchen und die in ihnen enthaltene Nukleinsäure zu extrahieren, nicht nur für die Grundlagenforschung in der Gentechnik, sondern auch für ihre Nutzung auf verschiedenen Gebieten angewandter Technologie.
Das Verfahren, das bislang hauptsächlich angewandt wurde, um eine Trennung von Mikroorganismen zu stande zu bringen, schloß die Bildung einer Suspension des Mikroorganismen enthaltenden Materials in einer geeigneten Pufferlösung und das Anfärben der Suspension auf einem Agar-Kulturmedium ein, das geeignete Wachstumsmaterialien enthielt. Die Platte wird einer Züchtung unterzogen und nachdem es zu einem Wachstum gekommen ist, wird eine Kolonie des Mikroorganismus, der untersucht werden soll, abgetrennt, weiter gezüchtet, bis zu einer hohen Konzentration und anschließend mittels Fliehkraftabscheidung bzw. Zentrifugaltrennung abgeschieden und gewonnen. Selbst wenn ein nützlicher Mikroorganismus in der Suspension, die als Probe verwendet wird, vorhanden ist, kann er jedoch möglicherweise mittels des vorstehenden Verfahrens nicht erfolgreich gewonnen werden. Nur ein kleiner Anteil der in der Suspension vorhandenen Mikroorganismen wird tatsächlich für einen Auftrag auf die Platte gewonnen und 99 bis 99,9% davon verbleiben an dem Boden oder dem aktivierten Schlamm oder dem Schlamm haftend in der Suspension, die als Probe genommen wurde. Eine auf dem verwendeten Agar-Kulturmedium auftretende Hyperplasie macht es schwierig, die Kolonien von Mikroorganismen individueller Typen zu trennen. Desweiteren können die Züchtungsbedingungen für das Wachstum aller in der Originalprobe vorhanden Mikroorganismen nicht geeignet sein, und es ist nicht im Voraus nicht bekannt, welche Züchtungsbedingungen für jeden interessierenden Mikroorganismus geeignet sind.
Bei der Probenentnahme von aktiviertem Schlamm in Abwasserschlamm-Entsorgungstanks sind die erforderlichen Züchtungsbedingungen relativ gut bekannt. Es ist jedoch wahrscheinlich, daß sich die Populationen der verschiedenen Arten von Mikroorganismen in dem Kulturmedium im Vergleich zu denjenigen, die im Originaltank auftreten, verändern, da feine Unterschiede in bezug auf die tatsächlichen Bedingungen in dem Tank und in dem Labor-Kulturmedium auftreten. Es stellt sich das Ergebnis ein, daß ein Mikroorganismus, der in hoher Population in dem aktivierten Schlamm auftritt, möglicherweise in der Kulturprobe nicht in hoher Population vorkommt.
Um dieses Problem zu überwinden, wurden Mikroorganismen aus einer Suspension aus Öl, aktiviertem Schlamm oder Schlamm auf dem Boden des Tankes direkt ohne ein dazwischen geschaltetes Züchtungsverfahren getrennt. Solch eine Mikroorganismen enthaltende Flüssigkeit unterscheidet sich von dem flüssigen Kulturmedium, in dem der Mikroorganismus gezüchtet wird, und enthält zusätzlich zu den interessierenden Mikroorganismen verschiedene Feststoffe. Als Konsequenz daraus ist die Gewinnung von Mikroorganismen aus der Flüssigkeit direkt durch Filtration oder eine Zentrifugalsedimentation schwierig. Desweiteren ist es dort, wo ein Mikroorganismus Sekrete erzeugt, durch die er entweder an eine feste Substanz anhaftet oder durch die einzelne Mikroorganismen zusammenhaften und eine Anhäufung bilden, schwierig, die einzelnen Mikroorganismen durch Flitration oder eine Zentrifugalsedimentation zu gewinnen. Bislang erfolgte die Trennung dadurch, daß die Suspension stark gerührt wurde, um eine physikalische Trennung des Mikroorganismus von den festen Substanzen zustande zu bringen. Die Suspension wurde mittels einer Schüttelmaschine, die sich hin- und her bewegt, eines Mischers, eines Homogenisators oder eines Ultraschall-Dispersionsgerätes gerührt. Es ist jedoch unklar, bis zu welchem Ausmaß die mittels dieses Verfahrens gewonnen Mikroorganismen für diejenigen der Originalprobe repräsentativ sind. Je länger und je heftiger die Suspension gerührt wird, desto mehr Mikroorganismen werden getrennt. Wenn jedoch ein zu starkes Rühren erfolgt, tritt das Risiko auf, daß die Mikroorganismen zerbrechen können, insbesondere im Falle von Hefe, kleinen Algen oder Protozoen, die relativ große Mikroorganismen darstellen und zerbrechlich sind.
Obwohl einige Mikroorganismen von den festen Materialien abgetrennt werden können, ist eine Gewinnung der Mikroorganismen mittels einer Zentrifugaltrennung schwierig. Es ist erforderlich, sich auf kleine Unterschiede in den Zentrifugiergeschwindigkeiten zwischen den Mikroorganismen und anderen festen Substanzen, die in der Testprobe vorhanden sind, zu verlassen. Eine sorgfältige Auswahl der Zentrifugierbedingungen ist erforderlich, was die Aufgabe noch schwieriger macht. Die Gewinnung der Mikroorganismen mittels eines alternativen Weges einer Absaugfiltration erfordert einen häufigen Wechsel des Filterpapiers, da dieses schnell durch das feste Material verstopft wird, so daß dieses Verfahren ebenfalls kompliziert durchzuführen und ineffizient ist. Alles in allem genommen gewinnen die existierenden Verfahren nicht wirkungsvoll alle Arten der vorhanden Mikroorganismen, liefern keine gewonnene Probe, in der die Population der verschiedenen Mikroorganismen die gleiche wie in dem untersuchten Material ist, neigen dazu, die etwas zerbrechlicheren Mikroorganismen als Ergebnis der für die Gewinnung des Mikroorganismus notwendigen Schritte abzutöten und können bei der Gewinnung nützlicher, im Boden vorhandener Mikroorganismen versagen, für die die notwendigen Bedingungen für eine erfolgreiche Züchtung nicht gegeben sind. Es tritt insbesondere ein Problem bei der Trennung von Mikroorganismen auf, die an einem festen Material haften, wie Boden, oder die eine Anhäufung bilden, da sie mittels Filtration oder einer Zentrifugaltrennung nicht wirkungsvoll getrennt werden können.
Es besteht das weitere Erfordernis, in der Lage zu sein, DNA und andere Nukleinsäuren aus Mikroorganismen zu gewinnen, die aus den Proben gewonnen wurden. Die Qualität und/oder Reinheit der gewonnen DNA ist für die anschließende Behandlung, zum Beispiel eine Zerlegung unter Verwendung eines Restriktionsenzyms, die Polymerase-Kettenreaktion oder eine Hybridisierung, sehr wichtig. Im Falle von Boden-Mikroorganismen können organische Materialien, wie Humus, an einem Träger, wie einem Bodenteilchen, auf dem der zu studierende Mikroorganismus ebenfalls anwesend ist, haften und die gewonnenen Mikroorganismen können übermäßige Mengen an diesen organischen Verunreinigen enthalten. Deshalb erfordert das gewonnene Material eine weitere Reinigung unter Anwendung eines Caesiumchlorid-Gleichgewicht-Dichtegradienten- Verfahrens oder unter Anwendung eines Zentrifugations- Reinigungsverfahrens, oder unter Anwendung der Gelfiltration, zum Beispiel der Hydroxyapatit-Säulenchromatografie. Diese Reinigungsverfahren sind in "Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION", J. Sambrook et al. Cold Spring Harbour Laboratory Press, S. 1.40 bis S. 1.48 und in "Seibutsu Kagaku Jikkenhou 11, Geru Rokaho (Biochemical Experimentation 11, Gel Filtration)", verfaßt von Kensuke Shimura et al., Gakkai Shuppan Center (Society Press Center), S. 181 bis 195 beschrieben. Die vorstehenden Verfahren schließen jedoch langwierige und komplizierte Aufgaben ein, z. B. eine Zentrifugaltrennung über eine Zeitdauer von 24 bis 48 Stunden unter Verwendung einer Ultrazentrifuge. Sie können die Verwendung von Ethidiumbromid erfordern, das ein Karzinogen ist, und die Ausbeute an DNA ist gering.
Zusätzlich zu der Notwendigkeit die einzelnen Mikroorganismen zu trennen und zu gewinnen, ist es auch wichtig, in der Lage zu sein, die Anzahl der in einer Suspension vorhandenen Individuen zu zählen, so daß der Zustand der Mikroorganismen in einem Bioreaktor oder einem biologischen System beurteilt werden kann. Ein weit verbreitetes Verfahren zum direkten Zählen der Anzahl von Mikroorganismen wurde von P. C. T. Jones und J. E. Molison entwickelt. Es schließt das Mischen der zu untersuchenden Suspension mit geschmolzenem Agar, das Rühren und das Fixieren als Film auf einem Haemozytometer ein. Der Film wird dann angefärbt oder farbig markiert, und unter Verwendung eines Mikroskops gezählt. Das Jones-Molison-Verfahren ist in "Dojo Biseibutsujikkenho (Soil Microorganism Experimentation)", herausgegeben von Dojo Biseibutsukenkyukai (Society for the Study of Soil Microorganisms), veröffentlicht von Yokensha, S. 143 bis 154 beschrieben. Dieses Verfahren weist den Vorteil auf, daß die Anzahl der Mikroorganismen selbst dann ermittelt werden kann, wenn nicht bekannt ist, was für Bedingungen notwendig sind, um sie zu züchten. Die erhaltenen Ergebnisse büßen jedoch an Gültigkeit ein, wenn die Mikroorganismen unzureichend getrennt wurden und nur ein Teil von ihnen gewonnen wurde. Im Falle von Bodensuspensionen, aktiviertem Schlamm oder Schlamm vom Grund eines Flusses, Sees oder des Meeres, oder einer Flüssigkeit aus einem Reaktor, die einen Träger einschließt, auf dem Mikroorganismen wachsen, oder in dem Fall, in dem Mikroorganismen an festen Materialien oder aneinander haften, und eine Anhäufung bilden, ist ein genaues Zählen unmöglich. Desweiteren ist es dort, wo viele Mikropartikel in der Probenflüssigkeit anwesend sind, unmöglich, einen nützlichen Agarfilm auf einem Haemozytometer zu bilden.
In Fällen, in denen die Bedingungen für die Züchtung der gewünschten Mikroorganismen bekannt sind, kann das Verdünnungsplatten-Zählen angewandt werden. Die zu zählende Suspension wird auf geeignete Weise verdünnt, die verdünnte Flüssigkeit wird auf ein Agar-Kulturmedium aufgebracht, und die Anzahl der Kolonien des Zielmikroorganismus, die gewachsen sind, wird gezählt. In diesem Verfahren kann die Wachstumsphase unter Verwendung einer Petrischale und eines Thermoregulators durchgeführt werden, und es ist einfacher als das Jones-Molison-Verfahren, in dem das Zählen direkt mittels eines Mikroskops erfolgt. Dieses Verfahren ist jedoch mit dem Problem verbunden, daß es einige Wochen erfordert, um den Züchtungsschritt durchzuführen, und es ist nur dann verfügbar, wenn die für eine Züchtung geeigneten Bedingungen für den Zielmikroorganismus bekannt sind. Desweiteren erzeugen alle Arten von Mikroorganismen, für die die Züchtungsbedingungen geeignet sind, Kolonien, so daß dieses Verfahren für Mikroorganismen unterschiedlicher Arten unempfindlich ist. Für die meisten Mikroorganismen in der untersuchten Probe sind die Bedingungen für ein Wachstum auf einem Agar- Kulturmedium nicht bekannt, so daß 90 bis 99,9% der vorhandenen Mikroorganismen nicht getrennt und ermittelt werden. Desweiteren liefert dieses Verfahren keine Information, die den Zustand der Verteilung eines bestimmten Organismus in dem mikroorganischen System betrifft, da es nicht alle vorhandenen Mikroorganismen zählt.
Die japanische Patentoffenlegungsschrift JP-A2-170053 offenbart ein Verfahren zur raschen Bestimmung des Auftretens eines Testmikroorganismus in einer Probe. Ein Teil der Probe wird mit einem markierten Antikörper behandelt, der an den gewünschten Mikroorganismus binden kann, falls dieser in der Probe anwesend ist. Nachdem die Reaktion stattgefunden hat, werden Fluoreszenzmessungen und geeignete statistische Berechnungen durchgeführt. Ein zweiter Teil der Testprobe wird nicht mit dem Antikörper umgesetzt, und geeignete spektroskopische Messungen werden durchgeführt, nach denen die gemessenen Daten erneut statistisch analysiert werden. Die Ergebnisse der beiden Berechnungen werden verglichen, um zu ermitteln, ob der betreffende Mikroorganismus anwesend oder nicht anwesend ist. Dieses Verfahren weist den Vorteil auf, daß der Zielmikroorganismus einfach und ohne die Notwendigkeit der Durchführung eines Mikroorganismus-Züchtungsschrittes ermittelt werden kann. Es ist jedoch unmöglich, die Gesamtzahl der Mikroorganismen in der Probe oder die Verteilung des Zielmikroorganismus in der Probe zu messen, da dieses Verfahren lediglich ermittelt, ob der gesuchte Mikroorganismus auftritt oder nicht. Eine der Gründe, warum dieses Verfahren keine Zählung der Mikroorganismen ermöglicht, besteht darin, daß die aneinander haftenden Anhäufungen aus Mikroorganismen zu dem Fluoreszenzsignal beitragen. Desweiteren besteht die Notwendigkeit nach der Herstellung einer Kontrollprobe, so daß die gewünschte Information nicht mittels einer einzigen Messung erhalten werden kann.
Es ist von beträchtlicher technologischer Bedeutung, in der Lage zu sein, die Anzahl der Mikroorganismen, die in einer Probe vorhanden sind, als Anteil der Gesamtzahl der Mikroorganismen, die in der Probe wachsen, zu messen, um die Wirkung unterschiedlicher Bedingungen auf die Population eines Zielmikroorganismus zu ermitteln. Beispielsweise ist es wichtig, in der Lage zu sein, die Aktivität eines Zielmikroorganismus in einem Bioreaktor zu untersuchen, in dem er in Symbiose mit einer Vielzahl anderer Arten von Mikroorganismen auftritt. Es kann auch erwünscht sein, die Veränderung der Verteilung der Enterobacteriaceae als Ergebnis einer pharmakologischen Wirkung zu untersuchen. Es ist auch von besonderem Vorteil, in der Lage zu sein, die Populationsverteilung schnell und korrekt unter Anwendung von lediglich einer einzigen Messung zu ermitteln.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß Mikroorganismen, die an festen Substanzen haften, oder aneinander haften und eine Anhäufung bilden, ohne einen Züchtungsschritt in freie Individuen getrennt werden können, mittels einer Behandlung, die das natürliche Material zersetzt, das den Mikroorganismus an die feste Substanz oder an die anderen Mikroorganismen bindet, wodurch die einzelnen Mikroorganismen getrennt und aus der flüssigen Suspension in hoher Ausbeute und mit hoher Reinheit gewonnen werden können.
Unter einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Trennung einzelner Mikroorganismen, die an einem Träger oder an anderen Mikroorganismen haften, zur Verfügung gestellt, daß die nachstehenden Schritte umfaßt:
Bereitstellung eines mikroorganischen Systems, in dem einzelne Mikroorganismen auftreten, die an einem Träger oder an andere einzelne Mikroorganismen haften; und
Zersetzung des natürlichen Materials, das den einzelnen Mikroorganismus an den Träger oder an andere Mikroorganismen bindet, um die einzelnen Mikroorganismen abzutrennen.
Andere bevorzugte Aspekte der Erfindung werden in den beigefügten Ansprüchen beansprucht, auf die hier hiermit verwiesen werden soll.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Nachstehend wird unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, wie die Erfindung ihre Wirkungen entfalten kann:
Fig. 1 ist eine Mikrofotografie (2000fach vergrößert), die Mikroorganismen und andere Teilchen in einer überstehenden Flüssigkeit zeigt, die mittels des Verfahrens des nachstehenden Beispiels 7 erhalten wurde;
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung eines senkrechten Schnittes durch einen im nachstehenden Beispiel 9 verwendeten Elektrophorese-Tank;
Die Fig. 3(a), (b) und (c) sind Darstellungen, die die Ergebnisse zeigen, die unter Verwendung eines Durchfluß-Fluoreszenzspektrometers in Beispiel 10 der Erfindung erhalten werden. Fig. 3(a) ist eine Punktauftragung, die die Fluoreszenzstreuung nach vorne bzw. die Fluoreszenzvorwärtsstreuung (FSC) und die Fluoreszenzstreunung zur Seite bzw. Seitenfluoreszenzstreuung (SSC) zeigt. Die Fig. 3(b) ist ein Fluoreszenzhistogramm, das den Bereich der gemessenen Signalstärke in einem Kanal FL1 (530 ±15 nm) zeigt. Die Fig. 3(c) ist ein weiteres Histogramm der gemessenen Fluoreszenzsignalstärke in einem Kanal FL3 (650 nm), wobei der Pfeil den Auslösepegel wiedergibt; und
die Fig. 4(a), (b) und (c) sind Diagramme, die die Haftung eines markierten Antikörpers an einen Zielmikroorganismus in dem Zählverfahren gemäß der Erfindung zeigen. Die Fig. 4(a) zeigt die Haftung eines fluoreszenz-markierten Antikörpers an den Mikroorganismus. Die Fig. 4(b) zeigt die indirekte Haftung eines fluoreszenz-markierten sekundären Antikörpers an dem Zielmikroorganismus. Die Fig. 4(c) zeigt die Haftung eines fluoreszierenden Farbstoffs an einem Zielmikroorganismus unter Verwendung eines biotinierten zweiten Antikörpers und fluoreszenz-markierten Avidins.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Mikroorganismen und ihre Enzymbehandlung

Das Verfahren der Erfindung ist auf einen breiten Bereich von Mikroorganismen mit unterschiedlichen Wachstums- und Lebensräumen verwendbar, einschließlich von Bakterien, Aktinomyzeten, Hefe, Schimmelpilzen, Pilzen, Mikroalgen und Protozoen, und es ist auf Mikroorganismen anwendbar, die in oder isoliert von der Natur auftreten, und auf Mikroorganismen, die in biochemischen Verfahren verwendet werden, oder durch den Einsatz von Biotechnologie erhalten werden. Es ist sowohl auf Mikroorganismen anwendbar, die an einem Träger haften, als auch auf Mikroorganismen, die im Boden leben, die im aktivierten Schlamm von Abwasser-Entsorgungstanks leben, und diejenigen, die im Schlamm des Bodens von Flüssen, Seen oder dem Meer leben. In diesen Umgebungen haften die lebenden Mikroorganismen im Allgemeinen an Bodenteilchen oder an andere Trägerteilchen. Die Erfindung kann auch für mikroskopische Proben eingesetzt werden, die aus lebenden oder toten Tieren oder Pflanzen entnommen wurden, und dort, wo die Mikroorganismen üblicherweise aneinander haften und eine Anhäufung bilden. Sie ist auch für Mikroorganismen einsetzbar, die sowohl aneinander haften und eine Anhäufung bilden als auch an einem Träger haften. In Bioreaktoren haften die Mikroorganismen gewöhnlicherweise an einem festen Träger, und solche Mikroorganismen können ebenfalls mittels des Verfahrens der Erfindung abgetrennt werden. Das Verfahren ist für die Behandlung lebender Mikroorganismen einsetzbar, und die einzelnen Mikroorganismen verbleiben, nachdem das Trennverfahren durchgeführt worden ist, lebend in Suspension.
Viele lebende Mikroorganismen sondern unlösliche organische Polymere ab, durch die sie an ein Substrat oder aneinander haften und eine Anhäufung bilden. Auf Grund dieses natürlichen Klebstoffes ist es schwierig, die einzelnen Organismen mittels physikalischer Maßnahmen, zum Beispiel unter Verwendung eines Mischers, zu trennen, und eine Trennung unter Verwendung eines chemischen Lösungsmittels verursacht leicht ein Auseinanderbrechen des Mikroorganismus. Die Erfindung beruht auf die Verwendung eines Enzymes, um den natürlichen Klebstoff zu zersetzen, da dieses Verfahren nicht zu einem Auseinanderbrechen des Organismus führt, und gefunden wurde, daß das Polymer auf wirksame Weise zersetzt und entfernt werden kann. Das Zersetzungsenzym kann zu dem Original-Mikroorganismen-System gegeben werden, wobei es aber bevorzugt ist, dies unter Bedingungen zu tun, unter denen die Population der Mikroorganismen nicht zu oder abnimmt, und sich der Anteil der vorhandenen einzelnen Mikroorganismen nicht ändert. Die verwendeten Enzyme und die angewandten Operationen hängen von der zu untersuchenden Probe und dem/den vorhandenen Mikroorganismus/ Mikroorganismen ab. Eine Form des in der Erfindung anwendbaren Trennverfahrens schließt die nachstehenden Schritte ein:
(a) Eine Probe, die aus einem mikroorganischen System, das untersucht werden soll, gewonnen wurde, wird in einem Puffer suspendiert, der auf den pH-Wert eingestellt wurde, bei dem das zu verwendende Enzym am besten arbeitet, um eine Suspension aus den Mikroorganismen und irgendwelchen assozierten Trägerteilchen zu liefern. Im Falle der Cellulase beträgt der optimale pH-Werte-Bereich 4 bis 6;
(b) Einstellen der Konzentration der Feststoffe auf 5 bis 20 Gew.-%;
(c) Zugabe eines Enzyms, das für die Zersetzung des natürlichen Klebstoffs wirksam ist und individuelle Teilchen freisetzt;
(d) Filtrieren und Entfernen grober suspendierter Feststoffe oder irgendwelcher Schwimmstoffe;
(e) Halten des Filtrates für ungefähr 2 bis 16 Stunden unter Rühren auf der Arbeitstemperatur des Enzyms, bevorzugt bei ungefähr 40 bis 50ºC im Falle der Cellulase; und
(f) Zentrifugieren des verdünnten mikroorganischen Systems, zum Beispiel bei 3000 bis 5000 Upm ungefähr 10 Sekunden bis 1 Minute lang, um vorhandene Mikroteilchen aus Boden und ähnlichem abzuscheiden, und ein anschließendes Gewinnen der überstehenden Flüssigkeit, die die Mikroorganismen enthält.
Wenn die Reaktionsdauer des Enzyms zu kurz ist, wird der natürliche Klebstoff unzureichend zersetzt und die einzelnen Mikroorganismen werden unvollständig freigesetzt. Die Population der Mikroorganismen kann zunehmen oder kann abnehmen und die einzelnen Mikroorganismen können zerstört werden. Die Auswahl geeigneter Reaktionsbedingungen ist in jedem einzelnen Fall eine Sache von Versuch und Irrtum. Nachdem die Umsetzung und Trennung der Mikroorganismen vollständig erfolgt ist, ist es erwünscht, unmittelbar zum nächsten Verfahren überzugehen, zum Beispiel dem Zählen der einzelnen vorhanden Mikroorganismen.
Das Enzymsystem, das in dem Verfahren der vorstehenden Erfindung verwendet werden kann, kann ein einzelnes Enzym oder eine Mischung aus Enzymen sein. Diese können aus polysaccharid-abbauenden Enzymen ausgewählt sein, wie Cellulase, Hemicellulase, Glucuronidase, Amylase, Glucanase und Xylanase, und aus Eiweiß abbauenden Enzymen, zum Beispiel Protease, Collaginase, und aus Pektin abbauenden Enzymen, zum Beispiel Pektinase und Pektin-Transeliminase. Die bevorzugtesten Enzyme sind Cellulase, Hemicellulase, Glucuronidase, Amylase, Protease und Pektinase. Eine besonders wirksame Mischung aus Enzymen umfaßt Cellulase als den Hauptbestandteil zusammen mit Zylanase und gegebenenfalls einem oder mehreren weiteren Enzymen. Eine weitere bevorzugte Mischung aus Enzymen umfaßt Cellulase zusammen mit Glucuronidase oder Cellulase zusammen mit Protease. Die Menge des zu der Probe zu gebenden Enzyms differiert in Abhängigkeit von der Natur des Enzyms, den Arten von Mikroorganismen, von denen angenommen wird, daß sie vorhanden sind, und/oder der Menge der vorhandenen lebenden Mikroorganismen. Im Falle der Cellulase beträgt die Menge, die zu der verdünnten Suspension gegeben werden soll, jedoch üblicherweise 1000 U/ml oder mehr der Cellulaseaktivität, bevorzugt 10000 U/ml oder mehr. Wenn es sich bei dem Enzym um Protease handelt, beträgt die zu der verdünnten Suspension zuzugebende Menge normalerweise 100 U/ml oder mehr der Proteaseaktivität, bevorzugt 1000 U/ml oder mehr. Die beiden Enzyme können als Mischung verwendet werden, wie vorstehend erklärt. Im Falle der Glucuronidase beträgt die vorhandene Menge normalerweise 10 mg/ml oder mehr des rohen Enzyms, bevorzugt 100 mg/ml oder mehr. Wenn die Menge des Enzyms unzureichend ist, werden die einzelnen Mikroorganismen durch die Zersetzung des natürlichen Klebstoffs in unvollständigem Maße freigesetzt. Für die Menge des Enzyms gibt es keine Obergrenze, wobei aber überschüssige Mengen des Enzyms nicht zu einem entsprechenden Zuwachs im Grad der Zersetzung führen.
Bislang war es schwierig, eine genaue Zählung der im Boden vorhandenen Bakterien durchzuführen. Es wird jedoch angenommen, daß mit dem vorliegenden Verfahren ungefähr 10 bis 90% aller im Boden vorhandenen Mikroorganismen in einzelne Mikroorganismen getrennt werden können. Das Verfahren ermöglicht die Gewinnung aller Arten von Mikroorganismen, die in der Probe vorhanden sind, so daß sich im Prinzip der Anteil der unterschiedlichen Arten von Mikroorganismen in der Probe sich nicht von denjenigen unterscheiden sollte, die im Original vorhanden sind. Mikroorganismen, die als Anhäufung zusammenhaften, können erfindungsgemäß in Individuen getrennt werden, was die Isolierung einer gewünschten Art aus der Mikroorganismenmischung lediglich durch ein Screening- Verfahren und ihre Züchtung unter Bedingungen, die dem Mikroorganismus angemessen sind, erleichtert.

Verfahren zur Gewinnung und zur Reinigung der Mikroorganismen.

Zwei Hauptmechanismen zur Gewinnung und zur Reinigung von Mikroorganismen werden nun beschrieben. Einer davon beruht auf einer Zentrifugierung, und der andere beruht darauf, daß eine Mikroorganismen enthaltende Lösung einer Spannung ausgesetzt wird, die an Elektroden anliegt, und die Mikroorganismen, die sich in der Nähe einer der Elektroden befinden, gewonnen werden.
Das Zentrifugationsverfahren basiert auf dem Konzept der Suspendierung der Mikroorganismen in einem Medium mit identischer oder ziemlich ähnlichem spezifischen Gewicht (specific gravity). Andere suspendierte Feststoffe weisen normalerweise ein spezifisches Gewicht auf, das entweder größer oder kleiner als das des Mikroorganismus und des umgebenden Mediums ist, so daß die Wirkung der Zentrifugation zu ihrer Trennung führt, entweder mittels Flotation oder mittels Absinkens. Die Erfinder fanden, daß das spezifische Gewicht von Mikroorganismen im Boden, aktiviertem Schlamm, Schlamm aus Flüssen, Seen und den Meeren in einem Bereich von 1, 2 bis 1,3 liegt, wohingegen Feststoffe, die ebenfalls auftreten 2 oder mehrere unterschiedliche spezifische Gewichte aufweisen können, die außerhalb des vorstehenden Bereiche liegen. Es ist deshalb bevorzugt, das spezifische Gewicht der Suspension so einzustellen, daß es in einem Bereich von 1, 2 bis 1,5, bevorzugt von ungefähr 1,3 liegt. Wenn das spezifische Gewicht des Mediums außerhalb dieses Bereiches liegt, verringert sich die Wirksamkeit und Zuverlässigkeit der Mikroorganismentrennung. Eine Zentrifugation erfolgt normalerweise so, daß eine Kraft von 200.000 G oder mehr eingesetzt wird, da die festen Teilchen, obwohl sie normalerweise ein höheres spezifisches Gewicht als die Lösung aufweisen, eine geringe Sedimentationsgeschwindigkeit zeigen, da die Teilchen Submikrongröße aufweisen können. Die Lösung, in der die Materialien für eine Zentrifugation suspendiert sind, kann einen breiten Bereich an gelösten Stoffen enthalten, außer starken Säuren und starker Alkali, wobei auch schwache Säuren, zum Beispiel Citronensäure, akzeptabel sein können. Repräsentative Materialien schließen Saccharose, Caesiumchlorid, Caesiumsulfat und Ficoll (eingetragenes Warenzeichen) ein. Saccharose weist den Vorteil auf, daß sie billig ist und den pH-Wert des Materials, in dem sie gelöst ist, nicht verändert. Caesiumchlorid weist den Vorteil auf, daß es dicht ist und leicht in eine hochkonzentrierte Lösung umgewandelt werden kann.
Ein repräsentatives Zentrifugationsverfahren schließt die nachstehenden spezifischen Schritte ein. Eine Probe, die 4 ml oder mehr des Materials enthält, wird in ein aus einem Polyallomer gefertigtes Zentrifugenröhrchen eingebracht und das Röhrchen wird mit 10.000 bis 50.000 UpM, bevorzugt 50.000 UpM 1 bis 10 Stunden lang zentrifugiert, bevorzugt 1 bis 2 Stunden, um eine Abscheidung der Verbindungen mit einem hohen spezifischen Gewicht zu veranlassen. Die Umdrehungsgeschwindigkeit und die Dauer wird bevorzugt so ausgewählt, daß sie das Minimum für eine wirkungsvolle Entfernung der Mikroteilchen darstellen, und die in jedem Fall erforderlichen Bedingungen können durch Routineversuche ermittelt werden. Saccharoselösungen können viskos sein, so daß sie eine etwas längere Zentrifugationsdauer erfordern, und die Temperatur, bei der die Zentrifugation durchgeführt wird, ist die Raumtemperatur oder darüber, um eine optimale Reinheit der gereinigten und gewonnenen Mikroorganismen zu erhalten. Nachdem die Zentrifugation beendet worden ist, treten viele Mikroteilchen an der Festkörper/Flüssigkeits-Grenzfläche der zentrifugierten Probe auf, die dazu neigen, sich in die überstehende Flüssigkeit zu mischen, wenn diese Flüssigkeit mittels einer Pipette abgesaugt wird. Deshalb ist es bevorzugt, die überstehende Flüssigkeit vorsichtig von der oberen Schicht zu entfernen, und die Entnahme zu unterbrechen, wenn die Oberfläche der überstehenden Flüssigkeit ungefähr 5 mm von der Grenzfläche mit den abgeschiedenen Festkörpern entfernt ist. Die überstehende Flüssigkeit weist ein trübes Aussehen auf, das aus der selektiven Bewegung der Mikroorganismen in sie hinein resultiert und der gelöste Stoff, der verwendet wurde, um das spezifische Gewicht einzustellen, kann zusammen mit einigen organischen Verbindungen und Resten lebender Zellen ebenfalls vorhanden sein.
Für eine weitere Reinigung der gewonnenen Mikroorganismen wird die überstehende Flüssigkeit auf das 5 bis 10fache verdünnt, zum Beispiel mittels destillierten Wassers, um die Dichte auf ungefähr 1,05 g/ml einzustellen. Die überstehende Flüssigkeit wird dann zentrifugiert, zum Beispiel mit ungefähr 5000 bis 15000 UpM 10 bis 30 Minuten lang, um die Mikroorganismen abzuscheiden. Das Praezipitat kann einige male erneut suspendiert und erneut zentrifugiert werden, um eine wie erforderliche weitere Reinigung durchzuführen.
Dort, wo lediglich einige Mikroorganismen vorhanden sind, zum Beispiel 10&sup4; bis 10&sup5;, ist es bevorzugt, Polyethylenglykol (PEG) in einer Konzentration von 20% vor der Zentrifugation zu lösen, um die Wirksamkeit der Gewinnung zu vergrößern. Nachdem die Mikroorganismen gewonnen wurden, können sie, wenn es gewünscht ist, sie zu zählen, mit einem geeigneten Volumen an destilliertem Wasser verdünnt werden.
Ein alternatives Gewinnungs- und Reinigungsverfahren schließt die Anordnung von Elektroden in der Mikroorganismensuspension und das Anlegen einer Spannung an die Elektroden mit dem Ergebnis ein, daß sich der Mikroorganismus unter dem Einfluß des angelegten elektrischen Feldes bewegt. Solch ein Verfahren schließt die Schritte der Verdünnung der enzym-behandelten Suspension, wie vorstehend beschrieben, mit einem geeigneten Volumen an destilliertem Wasser und das Gießen in einen Tank, der die Elektroden enthält; das Anlegen einer Gleichspannung an die Elektroden, um den Mikroorganismus zu einer Bewegung zu einer oder beiden der Elektroden zu veranlassen; und das Gestatten einer Abscheidung der Feststoffe in der Suspension unter dem Einfluß der Schwerkraft ein, wobei die Gleichspannung aufrecht erhalten wird, um eine Trennung herbeizuführen, und eine anschließende Gewinnung der Mikroorganismen ein.
In dieser Variante des Gewinnungsverfahrens werden die Konzentration der Mikroorganismen in der Suspension, die mittels eines elektrischen Feldes getrennt werden sollen, die Betriebsbedingungen, wie die angelegte Spannung und ähnliches, in Abhängigkeit von den Eigenschaften des zu gewinnenden Mikroorganismus gewählt. Beispielsweise kann die angelegte Spannung einen Wert von einigen 10 bis einigen 100 V, bevorzugt 20 bis 150 V, für eine Zeitdauer von einigen Stunden aufweisen. Die Elektroden werden bevorzugt an dem oberen Teil eines Wassertankes angeordnet, dessen Tiefe bevorzugt ungefähr 1 bis 10 cm beträgt. Die in der Suspension vorhandenen Bodenteilchen scheiden sich unter dem Einfluß der Schwerkraft ab, so daß eine Trennung von Mikroorganismus und Bodenteilchen leicht zu erzielen ist. Das Volumen des Tankes kann bevorzugt ungefähr einige 100 ml betragen, worin das Probenvolumen nicht eingeschlossen ist, und wird im Allgemeinen während der Elektrophorese auf einer konstanten Temperatur gehalten.
Die mittels Elektrophorese gewonnenen Mikroorganismen können desweiteren durch eine Zentrifugation mittels einer geeigneten erneuten Suspension oder einer geeigneten Verdünnung in destilliertem Wasser und einer geeigneten Einstellung des spezifischen Gewichtes der Suspension gewonnen werden, und die abgeschiedenen Mikroorganismen können relativ leicht gewonnen werden.

Verfahren zum Zählen der Anzahl der einzelnen Mikroorganismen

Die getrennten Mikroorganismen können mittels eines Färbeverfahrens oder mittels eines Verdünnungs-Platten-Zählmechanismus gezählt werden. In dem Färbeverfahren wird die Mikroorganismen enthaltende Flüssigkeit, die mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens gewonnen und gereinigt wurde, wie erforderlich konzentriert, um beispielsweise eine Konzentration von ungefähr 10&sup7; Bakterien/ml zu ergeben. Anschließend wird die flüssige Bakteriensuspension mit dem gleichen Volumen an Formalin (ungefähr 4%) behandelt, um die Mikroorganismen zu fixieren. Die Mikroorganismen werden gefärbt oder mit einem Farbstoff, der unter ultraviolettem Licht Fluoreszenz aussendet, markiert, und Verunreinigungen werden in notwendigem Maße entfernt. Die Flüssigkeit, die die angefärbten Mikroorganismen enthält, wird in eine Zählkammer getropft und mittels eines Fluoreszenzmikroskops betrachtet, das es ermöglicht, die Anzahl der einzelnen Mikroorganismen zu zählen. Eine Vielzahl an Farbstoffen kann verwendet werden, um den Mikroorganismus für das Zählen anzufärben.
Vor dem Zählen werden aus der Probe bevorzugt Teilchen mit einer Größe von 100 um oder mehr mittels eines Filters entfernt, und es werden auch Teilchen mit einem geringeren spezifischen Gewicht als das der Mikroorganismen entfernt. Die Probe wird bevorzugt verdünnt oder konzentriert, um eine Mikroorganismenkonzentration in einem Bereich von 1 · 10² bis 1 · 10&sup9; Zellen/ml herbeizuführen. Um das Zählverfahren zu erleichtern, wird selektiv ein fluoreszierender Farbstoff an einen Zielmikroorganismus gebunden, oder eine fluoreszierende Verbindung wird unspezifisch an alle Mikroorganismen gebunden. Eine spezifische Bindung eines Farbstoffs an einen Mikroorganismus kann unter Verwendung eines Antikörpers erreicht werden, der selektiv an ein Antigen des Zielmikroorganismus bindet, und der einen Träger für den Farbstoff darstellt. Monoklonale oder polyklonale Antikörper können verwendet werden, wobei aber monoklonale Antikörper bevorzugt sind, da sie eine größere Selektivität aufweisen. Mikroorganismen weisen im Allgemeinen eine Vielzahl an Epitopen auf, so daß es möglich ist, eine Mischung monoklonaler Antikörper zu verwenden, um die Antiselektivität zu verringern.
In den vorliegenden Markierungsverfahren wird zunächst ein Antikörper A an einen Zielmikroorganismus befestigt, woraufhin, falls erforderlich, ein Antikörper B mit einer Spezifität für den Antikörper A an den Antikörper A befestigt wird. Wenn der Antikörper A markiert ist, ist es nicht erforderlich, den Antikörper B zu verwenden, und wenn der Antikörper B markiert ist, ist es nicht erforderlich, den Antikörper A zu markieren, wobei jedoch eine Zweistufenreaktion erforderlich ist. Auf den Antikörper B wird normalerweise als sekundärer Antikörper Bezug genommen. Ein Beispiel, in dem ein Fluoreszenzfarbstoff von einem spezifischen Mikroorganismus durch eine direkte Umsetzung mit einem fluoreszenz-markierten Antikörper getragen wird, ist in Figur A gezeigt. Fig. 4B ist ein Beispiel, in dem ein fluoreszenz-markierter sekundärer Antikörper an einem Zielmikroorganismus gebunden ist, und Fig. 4C ist ein Beispiel, in dem ein bitonierter (bitonated) sekundärer Antikörper und fluoreszenz-markiertes Avidin indirekt an dem Zielmikroorganismus gebunden sind.
Die monoklonalen Antikörper können durch herkömmliche Verfahren erhalten werden. Ein Tier wird den Mikroorganismen ausgesetzt, um in Abhängigkeit von dem Antigen des Mikroorganismus Antikörper entstehen zu lassen. Immunzellen, die den erforderlichen Antikörper herstellen, und aus dem Organismus gewonnen wurden, werden mit anderen Zellen verschmolzen, um eine unsterbliche Zellinie herzustellen. Es kann auch ein Verfahren, beziehungsweise es können Verfahren angewandt werden, in dem /denen ein Gen exprimiert wird, das den gewünschten Antikörper kodiert.
Farbstoffe zur Markierung des Antikörpers können bekannte Farbstoffe vom Fluoreszenztyp sein. Beispiele schließen Fluorescinisothiocyanat (FITC), Rhodamin X-Isothiocyanat (XRITC), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), Phycoerythrin (PE), Texasrot (Texas Red), Chlortetracyclin, einen Cyaninfarbstoff, einen Merocyaninfarbstoff, wie Merocyanin 540, Dansylchlorideosim, ein Oxonalfarbstoff, Fluorescamin, Anzilaziridin, 5-Iodacetoamidfluorescin, N-(1-Anilinonaphthyl-4)-maleimid und Eosin-5-iodoacetonamido. FITC, XRITC, TRITC, PE und Texasrot sind in Hinblick auf die maximale Fluoreszenzwellenlänge und/oder ihre Fluoreszenzstärke bevorzugt. Der Farbstoff und die Bedingungen seiner Verwendung können in Abhängigkeit von seinen Absorptionseigenschaften und der Fluoreszenzwellenlänge und auch in Abhängigkeit von dem Licht, das für die Bestrahlung des Farbstoffes verfügbar ist, ausgewählt werden.
Antikörper können mit den Fluoreszenzverbindungen mittels bekannter Verfahren markiert werden. Beispielsweise wird dort, wo ein Antikörper mit FITC markiert werden soll, eine Lösung, die den Antikörper enthält, auf einen pH-Wert von 8 bis 9 eingestellt, FITC-Pulver zu der Lösung gegeben, und eine Umsetzung über einen Zeitraum von vier Stunden bei 5ºC zugelassen, woraufhin der nicht-umgesetzte Fluoreszenzfarbstoff mittels Gelfiltration entfernt wird, um den gewünschten fluoreszenz-markierten Antikörper zu ergeben. Das Verknüpfungsverhältnis des Fluoreszenzfarbstoffes zu dem Antikörper (F/P-Verhältnis) kann 0,1 bis 20, bevorzugt 1 bis 6 betragen. Für die nicht-spezifische Fluoreszenzmarkierung von Mikroorganismen kann der verwendete Fluoreszenzfarbstoff jede Verbindung sein, die den Mikroorganismus anfärbt, aber keine Spezifität für andere vorhandene Teilchen aufweist. Ein mögliches Anfärbeverfahren besteht darin, die Verbindung an ein Protein zu binden, das auf der Oberfläche des Mikroorganismus angeordnet ist. Solche Farbstoffe zum Anfärben schließen 4,4- Diisothiocyano-2,2'-disulfonsäurestilben (DIDS), Hematoporphyrin und ähnliches ein. Fluoreszenzverbindungen, die eine Bindung mit der in dem Mikroorganismus vorhandenen Nukleinsäure eingehen, sind jedoch bevorzugt, und solche Fluoreszenzverbindungen können alleine oder als Mischung aus zwei oder mehreren verwendet werden. Bevorzugt schließen solche Verbindungen Thiazolorange, Proflavineripsin, Donomycin (Doxorobicinhydrochlorid), Acronol (Phloxin FES), 3,3'-Dimethylthiocarbocyanin, 3,3'-Diethylthiocarbocyanin, 3,3'-Diethyl-9-methylthiocarbocyaninbromid, 2-[γ-1'-ethyl- 4',5'-benzothiazolylidenpropenyl]-3-ethyl-4,5-benzothiazolumiodid, Astrazonrot 6B, Basischviolett 16, 2-(p-Dimethylaminostyryl)-3-ethyl-4,5-benzothiazoliumiodid, 2,4-Bis-(p-dimethylaminostyryl-1-ethyl)pyridiniumiodid, 2,6-Bis-(p-dimethylaminostyryl)-1-ethyl-pyridiniumiodid, Astrazonorange R, Auramin O, Acridinorange, Ethydiumbromid, Propidiumiodid, Neutralrot, Basischgelb 11, Acridinrot 3B, Rodamin S, Thiazolorange, Rodamin 6G, Rodamin B, Rodamin-19-perchlorat, Rodamin 123, Eosin Y, Cyanothin, Cresylechtviolett, Durolrot und ähnliches. Darunter sind Ethydiumbromid, Propidiumiodid, Acridinorange und Thiazolorange besonders bevorzugt, weil ihre Fluoreszenzstärke zunimmt, wenn sie an die Nukleinsäure eines Mikroorganismus binden. Diejenigen Farbstoffe können ausgewählt werden, die in Abhängigkeit von dem Licht, das verwendet wird, um sie zu bestrahlen, eine erwünschte Absorptionswellenlänge und eine erwünschte Fluoreszenzwellenlänge aufweisen.
Um eine Messung des von einem fluoreszierenden Farbstoff, der zur Markierung eines Zielantikörpers verwendet wurde, ausgesandten fluoreszierenden Lichtes bzw. Fluoreszenzlichtes zu ermöglichen, und ebenfalls des Fluoreszenzlichtes aus einer Verbindung, die nicht spezifisch an die Mikroorganismen gebunden ist, werden die Wellenlängenverteilungen des Farbstoffs und der fluoreszierenden Verbindung bevorzugt so gewählt, daß sie sich nur minimal überlappen. Wenn es zu einer signifikanten Überlappung ihrer Fluoreszenzbanden kommt, ist es schwierig, das unerwünschte Fluoreszenzlicht heraus zu filtern und das S/N-Verhältnis nimmt ab. Somit weist der zu verwendende Fluoreszenzfarbstoff bevorzugt eine maximale Fluoreszenzwellenlänge (λmax) auf, die sich von derjenigen der fluoreszierenden Verbindung um 20 nm oder mehr, bevorzugt 30 nm oder mehr, unterscheidet.
Die beiden Schritte, in denen zunächst ein Zielmikroorganismus selektiv mittels eines fluoreszenz-markierten Antikörpers markiert wird, und der Schritt, in dem eine fluoreszierende Verbindung nicht spezifisch an die vorhandenen Mikroorganismen gebunden wird, können in gewünschter Reihenfolge durchgeführt werden, oder sie können gleichzeitig durchgeführt werden. Somit können sowohl der fluoreszenz-markierte Antikörper als auch der fluoreszierende Farbstoff gleichzeitig zu einer Suspension gegeben werden, die die Organismen enthält, und es wird ihnen gestattet zu reagieren. Die Menge des fluoreszenz-markierten Antikörpers, die zugegeben werden soll, wird in Abhängigkeit von der Menge und der Art des Zielmikroorganismus und der gewünschten Reaktionsdauer eingestellt. Es ist jedoch bevorzugt, daß der Antikörper in großer Menge, zum Beispiel 0,01 bis 2 mg/ml, bevorzugt 0,05 bis 0,8 mg/ml zugegeben wird. Die Menge der fluoreszierenden Verbindung wird ebenfalls in Abhängigkeit von der Konzentration der Mikroorganismen in der Probe und der gewünschten Reaktionsdauer eingestellt. Die fluoreszierende Verbindung wird bevorzugt in großer Menge zugegeben, beispielsweise in einem Bereich von 5 bis 500 ug/ml, insbesondere 10 bis 100 ug/ml. Wenn die Menge der fluoreszierenden Verbindung zu gering ist, nimmt die Anzahl der Mikroorganismen, die gezählt werden können, ab, wohin gegen, wenn die Menge zu groß ist, das S/N-Verhältnis sich auf Grund von auftretendem fluoreszierendem Hintergrundlicht verschlechtert. Für die Zwecke der Markierung mit einem fluoreszierenden Antikörper und die Schritte des Anfärbens mit einem fluoreszierenden Farbstoffs können eine 2- bis 4%ige Formalinlösung und 90- bis 100%iges Ethanol oder Methanol zu der Probensuspension gegeben werden, um sie zu fixieren. Eine geeignete Menge einer 0,05 bis 2 M Phosphatpufferlösung oder Citratpufferlösung kann zugegeben werden, um den pH-Wert der Probe auf einen geeigneten Wert einzustellen.
Es wird nun ein Verfahren zur Ermittlung eines bestimmten Zielmikroorganismus unter der Gesamtpopulation von Mikroorganismen in der Probe mittels einer quantitativen Fluoreszenzzählung beschrieben. Eine Suspension, die den Mikroorganismus enthält, der mit dem fluoreszierenden Farbstoff markiert und mit der fluoreszierenden Verbindung angefärbt wurde, wird mittels Licht aus einem Argon-, Helium-, Neon-, Halbleiter- oder SHG-YAG-Laser bestrahlt, und das von dem Farbstoff und der Verbindung emittierte fluoreszierende Licht wird gemessen. Das fluoreszierende Licht und die fluoreszierende Verbindung werden so gewählt, daß ihre Wellenlängen zusammenpassen. Eine Photometrie unter Verwendung von Licht mit zwei verschiedenen Wellenlängen oder drei verschiedenen Wellenlängen unter Verwendung von zwei oder mehreren unterschiedlichen Lichtquellen mit unterschiedlichen Wellenlängenverteilungen wird bevorzugt angewandt, um die Empfindlichkeit der Messung oder die Anzahl verschiedener Mikroorganismen zu vergrößern, die unter Verwendung von Antikörpern mit entsprechenden unterschiedlichen Fluoreszenzeigenschaften gezählt werden können.
Die Erzeugung und Ermittlung von Fluoreszenzlicht kann unter Verwendung eines periodisch arbeitenden Photometers durchgeführt werden, in dem die Suspension, die geprüft werden soll, in einer optischen Zelle angeordnet wird. Getrennte Kalibrierungskurven werden in Bezug auf die Menge des Fluoreszenzlichtes von dem Zielmikroorganismus und der Menge des Fluoreszenzlichtes von der Gesamtpopulation der Mikroorganismen in Bezug auf die Konzentration des fraglichen Mikroorganismus erstellt. Anschließend ergibt die Messung der Stärke des Fluoreszenzlichtes direkt die Konzentration des Zielmikroorganismus und die Konzentration aller in der Probe vorhandenen Mikroorganismen. Signale können durch die Messung des vorwärts gestreuten Lichts, des seitlich gestreuten Lichts, des vorwärts gestreuten fluoreszierten Lichtes und des seitlich gestreuten fluoreszierenden Lichtes unter Anwendung einer Vielzahl optischer Detektoren erhalten werden.
Für eine genaue Zählung der Anzahl der Mikroorganismen ist es jedoch bevorzugt, zu veranlassen, daß die Suspension, die geprüft werden soll, durch eine optische Zelle fließt, die mit Licht bestrahlt wird und das Signal von jedem Teilchen zu ermitteln und eine statistische Analyse der ermittelten Signale durchzuführen, um die Anzahl der vorhanden Organismen zu ermitteln. Die Zählgenauigkeit des Zielmikroorganismus kann durch das Zählen eines jeden Signals verbessert werden, in dem sowohl das Fluoreszenzlicht von dem Farbstoff als auch das Fluoreszenzlicht von der Färbeverbindung zusammen ermittelt werden. Ein Gerät, das zu solch einer Messung geeignet ist, basiert auf der Fließzytometrie und wird bevorzugt verwendet. Das Fließzytometer ist ein Gerät, in dem Teilchen veranlaßt werden, in einem Flüssigkeitsstrom nacheinander zu fließen, wobei sie eine Prüfposition passieren, an der sie mit Laserlicht oder ultraviolettem Licht bestrahlt werden, um eine optische Reaktion zu erzeugen, wie eine Lichtstreuung oder Fluoreszenz, und die Größe und/oder Form und/oder Eigenschaften der Teilchen werden aus dem gestreuten oder fluoreszierenden Licht ermittelt. In dem vorliegenden Zählverfahren, in dem zwei oder mehrere unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe vorhanden sind, wird das Fluoreszenzlicht bevorzugt zu diskreten Bestandteilen gefiltert, die jedem Fluoreszenzpeak entsprechen und einzeln unter Verwendung eines entsprechenden Photodetektors nachgewiesen. Ein im Handel erhältliches Gerät für die Durchführung der vorstehenden Messung schließt das FACS-CAN-Gerät, das von Becton und Dickinson Co., Ltd. hergestellt wird, und das Epicsprofile 11-Gerät ein, das von Coulter hergestellt wird. Im Falle des FACS-CAN-Gerät wird das fluoreszierende Licht von der Probe beispielsweise in drei Bestandteile zerlegt, die aus FL1 (530 ±15 nm), FL2 (585 +21 nm) und FL3 (650 nm oder mehr) bestehen. Drei Fotodetektoren werden bereitgestellt, die jeweils einen der vorstehenden drei Fluoreszenzlichtbestandteile nachweisen. Wenn die Testflüssigkeit durch die Zelle fließt, erzeugen die einzelnen Mikroorganismen in den verschiedenen Zählkanälen Zählimpulse, und die relativen Intensitäten können zu einem Histogramm verarbeitet werden, das dazu verwendet werden kann, zu entscheiden, welche Signale in dem Kanal akzeptiert werden sollen. Die Zählimpulse in den Kanälen bestimmen die Anzahl der ermittelten Mikroorganismen fest. Desweiteren kann ein Detektor, der auf nach vorne gestreutes Licht anspricht, und ein Detektor, der auf seitlich gestreutes Licht anspricht, Informationen über die Teilchengröße und ähnliches liefern, und die Genauigkeit der Zählung kann durch ein außer Betracht lassen der Signale von zu großen Teilchen verbessert werden.
Desweiteren wird dort, wo ein Fließzytometer für normale Zwecke eingesetzt wird, ein Trigger bzw. Auslöser oder ein Durchlaß (gate) für das vorwärts gestreute Licht und/oder das seitlich gestreute Licht eingesetzt, und die Anzahl der Teilchen kann durch den Nachweis des von Teilchen gestreuten Lichtes gemessen werden. Signale, deren Stärke kleiner als ein Schwellenwert ist, werden durch die Einstellung des Auslösers eliminiert, und der Durchlaß wird so eingestellt, daß lediglich Signale, die in einen gewünschten Bereich der Intensität fallen, akzeptiert werden. Desweiteren werden in dem Fließzytometrie-Verfahren die Teilchen dazu veranlaßt, an dem Prüfpunkt hintereinander zu fließen.
Wenn die Mikroorganismen aufgrund des Antikörpers ein Aggregat bilden, wird die Zählung nicht mehr genau. Dort, wo solch ein Aggregat gebildet wird, nimmt die Stärke des Fluoreszenzlichtes zu, so daß das Aggregat aus der Stärke des nach vorne gestreuten Lichtes nachgewiesen werden kann. Das Aggregat wird jedoch bevorzugt zuvor getrennt, da dies den Zählschritt erleichtert. Solch eine Trennung kann unter Anwendung von Schwingungsenergie, zum Beispiel einer Kavitation mittels einer Ultraschallwelle, oder durch Anwendung von Scherenergie, die als Resultat eines Rührens entsteht, durchgeführt werden, und es ist keine Energie erforderlich, die ausreicht, um den Mikroorganismus aufzubrechen. Eine geeignete Ultraschallbehandlung kann bei 0,1 bis 10 Watt und 20 kHz über einen Zeitraum von 1 bis 10 Sekunden durchgeführt werden. Die Fluoreszenzmessung kann wirkungsvoll in einem Fließzytometer unter Anwendung des nachstehenden Verfahrens durchgeführt werden. Eine Probe wird angesaugt und in eine umhüllte Fließzelle eingebracht, und es wird der Probe gestattet, eine ausreichende Zeitdauer zu fließen, bis das erforderliche Volumen der Probe die Zelle passiert hat. Die Anzahl der Teilchen wird während des Flusses gezählt. In dem Fall, in dem die zu zählenden Teilchen aus Mikropartikeln mit einem Durchmesser von 5 um oder weniger, wie Bakterien, bestehen, oder wo merkliche Verunreinigungen mit der gleichen Größe wie die zu messenden Mikroorganismen auftreten, zum Beispiel Proteine, Lipide, Staub oder andere Teilchen, ist es schwierig, die Anzahl der Mikroorganismen einfach durch die Einstellung eines Auslösers zu zählen, der auf nach vorne gestreutem Licht oder auf seitlich gestreutem Licht beruht, wie er herkömmlicher Weise verwendet wird, da die Verunreinigungen, die nicht aus Mikroorganismen bestehen, ein Rauschen verursachen. Das Rauschsignal kann jedoch durch die Einstellung des Auslösers oder des Durchlasses, die auf einem Fluoreszenzlichtsignal beruhen, das von einem Farbstoff ausgesandt wird, der an eine Nukleinsäure bindet, herausgeschnitten werden. Fast die gesamten Verunreinigungen weisen keine Nukleinsäure auf oder zeigen einen sehr geringen Gehalt an Nukleinsäuren. Beispielsweise wird in dem vorstehend erwähnten Kanal FL3, wo das Fluoreszenzsignal durch alle vorhanden Mikroorganismen erzeugt wird, ein Signal, dessen Fluoreszenzstärke kleiner als die des Auslöse- oder Schwellenwertes ist, da es nicht von Mikroorganismen, sondern von Verunreinigungen stammt, außer Betracht gelassen. Es wird nun auf ein Signal in einem Kanal, wie FL1, Bezug genommen, der Fluoreszenzsignale aufzeichnet, die fluoreszenz-markierten Antikörpern entsprechen, die an einen Zielmikroorganismus gebunden sind, wobei dann, wenn auf Grund eines an eine Verunreinigung gebundenen fluoreszenz-markieren Antikörpers ein nicht korrektes Fluoreszenzlichtsignal auftritt, dieses Signal nicht mit einem Signal in Kanal FL3 übereinstimmt, da die Verunreinigung nicht mit der Fluoreszenzverbindung angefärbt worden sein dürfte. Deshalb kann der Aufwand, der mit der Datenverarbeitung verbunden ist, verringert werden und die erforderliche Zeitdauer kann reduziert werden, und sowohl die Gesamtzahl der vorhanden Mikroorganismen als auch die Anzahl des Zielmikroorganismus kann auf einfache Weise durch das Zählen des mit einem Auslöser oder einem Durchlaß eingestellten Signals ermittelt werden.
Um den Auslöser oder den Durchlaß einzustellen, wird die empfindliche Wellenlänge bevorzugt so ausgewählt, daß sie in der Nähe der maximalen Fluoreszenzwellenlänge der fluoreszierenden Verbindung liegt, die an die Mikroorganismen bindet. Beispielsweise können Wellenlängen von 10 bis 60 nm an jeder Seite der maximalen Fluoreszenzwellenlänge akzeptiert werden. Der Pegel des Auslösers oder des Durchlasses wird dann auf geeignete Weise in Abhängigkeit von der Stärke des Fluoreszenzlichtes, das von der fluoreszierenden Verbindung bei der Wellenlänge des Auslösers oder des Durchlasses emittiert wird, eingestellt. Es kann jedoch bevorzugt sein, den Auslösepegel in Abhängigkeit von der Signalstärke, die durch die Messung eines bekannten, zuvor mit einer Fluoreszenzverbindung markierten Mikroorganismus erhalten wurde, einzustellen. Die Verwendung eines Durchlasses, der wie vorstehend beschrieben eingestellt wurde, ermöglicht es, Signale, die von Mikroorganismen stammen, von denjenigen zu unterscheiden, die von Verunreinigungen stammen.
Desweiteren kann ein Fluoreszenzsignal, das von einem fluoreszierenden Farbstoff stammt, der spezifisch an einen Zielmikroorganismus gebunden ist, so eingestellt werden, daß es akzeptiert wird, wenn ebenfalls ein Signal auftritt, das in dem Auslöser oder dem Durchlaß des Kanals für die Fluoreszenzverbindung erscheint, so daß nur ein geringes Rauschen von Verunreinigungen und ähnlichem auftritt, wenn die Anzahl des Zielmikroorganismus gezählt wird. Es ist bevorzugt, Fluoreszenzlicht von dem Farbstoff durchzulassen, das in einem gewünschten Bereich liegt, der so ausgewählt werden kann, daß beinahe alle Signale, die auf dem fluoreszierenden Farbstoff basieren, akzeptiert werden, wobei aber andere Signale, die von Verunreinigungen stammen, zurückgewiesen werden. Zu diesem Zweck wird die Breite des Durchlasses bevorzugt in Abhängigkeit von der Verteilung der Intensität des Fluoreszenzlichtes, das von einem bekannten Mikroorganismus emittiert wird, der mit einer fluoreszierenden Verbindung markiert ist, eingestellt. Desweiteren kann die vorstehend beschriebene Operation selbst dann durchgeführt werden, wenn eine Vielzahl an mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörpern, die spezifisch an eine Vielzahl von Zielmikroorganismen binden, wobei die Bindung entweder eine direkte oder indirekte Bindung ist, auftritt.

Trennung der Nukleinsäure aus gewonnenen und gereinigten Mikroorganismen

Ausführungsformen der Erfindung liefern Suspensionen von Mikroorganismen, die ausreichend rein sind, damit die Gewinnung von Nukleinsäure mit einem ausreichenden Grad an Reinheit ermöglicht wird, die mittels eines Restriktionsenzyms ohne die Notwendigkeit einer Caesiumchlorid-Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugfation oder einer Gelfiltration, die bislang unverzichtbar waren, abgebaut werden kann.
In dem DNA-Extraktionsverfahren wird ein abgeschiedener Mikroorganismus, der mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurde, mit einem grenzflächenaktiven Mittel, wie SBS, behandelt, um den Mikroorganismus zu zerstören, woraufhin die DNA unter Verwendung von Phenol oder Formalin in die wäßrige Phase extrahiert wird, und die Nukleinsäuren unter Verwendung von Ethanol abgeschieden werden, um mikrobielle Nukleinsäure zu gewinnen. Wenn es erwünscht ist, aus der Suspension mikrobielle DNA zu gewinnen, wird sie bevorzugt mit RNAse behandelt. Wenn es erwünscht ist, die RNA zu erhalten, kann die Suspension statt dessen mit DNase behandelt werden.
Nachstehend wird die Erfindung detaillierter unter Bezugnahme auf die Beispiele erklärt.

BEISPIEL 1

Fähigkeit von Enzymen zur Freisetzung einzelner Mikroorganismen aus Bodenproben

10 g (Masse des feuchten Materials: ein Verhältnis des Feuchtigkeitsgehalts von 81,4) einer Bodenprobe wurden mit 15 ml einer ungefähr 0,1 M Natriumphosphatpufferlösung gemischt, die zuvor 30 Minuten lang bei zwei Atmosphären und 120ºC sterilisiert worden war. Dinatriumhydrogenphosphat und Natriumdihydrogenphosphat wurden zu der Mischung gegeben, die dann 30 Sekunden gerührt wurde, um eine Bodensuspension zu erzeugen, die einen pH-Wert von 4,6 aufwies. Eine 1 ml-Probe dieser Suspension, die 500 mg suspendierten Feststoff enthielt, wurde in ein mit einem Deckel versehenes 5 ml-Teströhrchen gegeben. Die Fähigkeit der Cellulase, die von einem Fadenpilz, der mit Trichoderma viride bezeichnet wird, erzeugt wird, zur Freisetzung einzelner Mikroorganismen aus der Bodenprobe wurde anschließend beurteilt. Ein pulveriges Enzym, von dem angenommen wird, daß sein aktiver Hauptbestandteil aus Cellulase besteht, und das von Meiji Seika Kaisha Ltd. unter der Bezeichnung Meiji Cellulase TP erhältlich ist, wurde in destilliertem Wasser in einem Anteil von 20 mg Enzym pro 1 ml destilliertem Wasser gelöst und ergab eine Cellulase-Aktivität von 12000 Einheiten. Die resultierende Lösung wurde durch einen Filter mit einem Durchmesser von 0,45 um filtriert, um die verbliebenen suspendierten Feststoffe zu entfernen.
Ein 1 ml-Anteil dieses gelösten Enzyms wurde in das Teströhrchen gegeben, das anschließend zwei Stunden lang bei 40ºC in einem Thermostaten geschüttelt wurde. Danach wurde das Röhrchen 30 Sekunden lang mit 5000 UpM zentrifugiert, um die Bodenteilchen abzuscheiden, woraufhin 1,5 ml der überstehenden Flüssigkeit entnommen wurden. Diese überstehende Flüssigkeit wurde 5 Minuten lang mit 15000 UpM zentrifugiert, um einen Niederschlag der vorhandenen Mikroorganismen zu erhalten, und die abgeschiedenen Mikroorganismen wurden in 50 ul destilliertem Wasser erneut suspendiert. Formalin (4%ig) wurde zu dieser Flüssigkeit gegeben, um die Mikroorganismen zu fixieren, woraufhin Ethidiumbromid, das bei der Bestrahlung mit ultraviolettem Licht ein fluoreszierendes Licht aussendet, zugegeben wurde, um die Mikroorganismen anzufärben. Die Lösung wurde eine Stunde stehen gelassen, um es jedem in der überstehenden Flüssigkeit verbliebenen Mikro- Bodenteilchen zu ermöglichen, sich abzuscheiden, woraufhin die Lösung auf geeignete Weise verdünnt, z. B. auf das 100fache, und tropfenweise in ein Haemozytometer eingebracht wurde. Eine Beobachtung der Flüssigkeit in dem Haemozytometer mittels eines Fluoreszenzmikrokops bestätigte, daß die vorhandenen Mikroorganismen nicht aneinander hafteten, sondern ohne Bildung einer Anhäufung frei schwimmen bzw. schweben, und die Anzahl der einzelnen vorhandenen Mikroorganismen wurde gezählt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß ungefähr 3 · 10&sup8; Bakterien aus 1 g Boden (Masse des feuchten Materials) gewonnen werden konnten.

BEISPIELE 2 BIS 5

Beurteilung der Fähigkeit anderer Enzyme zur Freisetzung von Mikroorganismen aus dem Boden

Die nachstehenden pulverigen Enzyme wurden unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens beurteilt und die nachstehend angegebenen Ergebnisse erhalten.
Die verwendete Glucuronidase ist unter der Handelsbezeichnung Abalone Aceton Powder von Sigma Chemical Company erhältlich und wurde mit einem Anteil von 100 mg Enzyms pro 1 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Protease ist im Handel unter der Bezeichnung Protease A Amano von Amano Pharmaceutical Co. Ltd. erhältlich und wurde mit einem Anteil von 50 mg pro 1 ml destilliertem Wasser gelöst, wodurch sich eine Proteaseaktivität von 500 Einheiten ergab. Die in Beispiel 4 verwendete Amylase ist unter der Handelsbezeichnung Termamyl von Novo Nordisk Bioindustry erhältlich und eine 500 ul-Probe des filtrierten Enzyms wurde zusammen mit 20 mg der in Beispiel 1 eingesetzten Celluloseacetatlösung verwendet. In Beispiel 5 wurden ein 20 mg-Anteil der in Beispiel 1 verwendeten Cellulaselösung zusammen mit 50 mg Protease verwendet, die unter der Bezeichnung Protease A. Amano von Amano Pharmaceutical Co. Ltd erhältlich ist. In jedem der vorstehenden Beispiele wurden, nachdem das beschriebene Verfahren durchgeführt worden war, keine Gruppen von Bakterien gefunden, und das Zählen der Bakterien erfolgte mittels eines wie vorstehend beschriebenen Fluoreszenzmikroskops.

VERGLEICHSBEISPIEL 1

Wiederholung in Abwesenheit eines Enzyms

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß keine Enzyme in das Teströhrchen eingebracht wurden. Eine Betrachtung der fixierten und angefärbten überstehenden Flüssigkeit mittels eines Fluoreszenzmikroskops zeigte, daß Gruppen von Bakterien vorhanden waren und ungefähr 3 · 10&sup7; Bakterien aus 1 g (Masse des feuchten Materials) Boden erhalten worden waren, was nur 10% der in Beispiel 1 beobachteten Anzahl, 6% der in Beispiel 2 beobachteten Anzahl und 15% der in Beispiel 3 beobachteten Anzahl darstellt.

VERGLEICHSBEISPIEL 2

Wiederholung mit einem deaktivierten Enzym

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß die Cellulase vor der Zugabe in das Teströhrchen durch ein 30minütiges Aufrechterhalten eines Drucks von zwei Atmosphären bei einer Temperatur von 120ºC deaktiviert wurde. Eine Beobachtung der angefärbten Suspension mittels eines Fluoreszenzmikroskops zeigte das Vorhandensein von Gruppen von Bakterien. Es wurde festgestellt, daß ungefähr 4 · 10~ Bakterien aus 1 g der feuchten Masse der Bodenprobe gewonnen wurden, was nur 13% der in Beispiel 1 beobachteten Anzahl der Bakterien und 7% der in Beispiel 2 beobachteten Anzahl darstellt.

BEISPIEL 6

Isolierung von Mikroorganismen, die an einem festen Substrat haften

100 g eines porösen Zeolithen mit einem Durchmesser von ungefähr 1 mm (Handelsname Rainbow Sand, von Sanko Kenso K. K. hergestellt) wurden in einen Bioreaktor mit einem Volumen von 300 ml eingebracht, der anschließend mit 200 ml einer Kulturflüssigkeit gefüllt wurde. Der Bioreaktor wurde ungefähr 10 Tage lang betrieben, woraufhin deutlich wurde, daß eine große Zahl von Mikroorganismen an den Zeolithen befestigt worden war.
Während der flüssige Inhalt in dem Bioreaktor gerührt wurde, wurde eine 10 ml-Probe der vorliegenden Suspension, die den Zeolithen einschloß, entnommen und in ein 30 ml-Teströhrchen mit einem Deckel eingebracht. Der Probe folgte 1 ml 1 M Natriumphosphat-Pufferlösung, die mit Natriumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat gemischt worden war, um den pH-Wert der Suspension in dem Teströhrchen bei ungefähr 4,6 zu halten. Anschließend wurden 40 mg Cellulase (Handelsname Meiji Cellulase TP; von Meiji Seika K. K. hergestellt), die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 in destilliertem Wasser gelöst und filtriert worden war, in das Teströhrchen eingebracht, das anschließend unter Rühren 2 Stunden lang in einem wärmeregulierten Raum bei 40ºC gehalten wurde. Die resultierende Suspension wurde angefärbt und die Zahl der einzelnen Mikroorganismen gezählt. Es wurde gefunden, daß die Bakterien als Einzelne und nicht in Gruppen auftraten, und es wurde gefunden, daß ungefähr 5 · 10&sup8; Bakterien in 1 ml der Probe auftraten, was eine Gesamtmenge von 1 · 10¹&sup0; Bakterien in dem Reaktor ergab.

VERGLEICHSBEISPIEL 3

Wiederholung in Abwesenheit von Cellulase

Eine zweite 10 ml-Probe der Suspension in dem Bioreaktor von Beispiel 6 wurde wie in diesem Beispiel beschrieben behandelt, außer daß keine Cellulase zugegeben wurde. Eine mikroskopische Betrachtung enthüllte, daß die Bakterien in Gruppen auftraten, und daß in 1 ml der Probe ungefähr 8 · 10&sup6; Bakterien erhalten worden waren, was nur ungefähr 2% der Anzahl in Beispiel 6 ausmachte.

VERGLEICHSBEISPIEL 4

Wiederholung mit einer verlängerten Enzymbehandlung

Eine dritte 10 ml-Probe wurde aus dem Bioreaktor von Beispiel 6 entnommen und wie beschrieben mit Cellulase behandelt, außer daß das Rühren 13 Stunden lang in einem wärmeregulierten Raum bei 40ºC fortgesetzt wurde. Danach wurde ein wie in Beispiel 6 beschriebenes Verfahren durchgeführt. Eine mikroskopische Betrachtung enthüllte, daß die Bakterien in Gruppen auftraten, und daß ungefähr 4 · 10³ Bakterien pro 1 ml der Probe erhalten worden waren, was nur 0,008% der in Beispiel 6 beobachteten Anzahl ausmachte.

BEISPIEL 7

Verwendung eines saccharosehaltigen Mediums

3 g Saccharose wurden in ein Teströhrchen mit einem Volumen von 5 ml eingebracht, das 1 ml einer wie in Beispiel 1 beschriebenen Bodensuspension enthielt. Das Teströhrchen wurde in einem wärmeregulierten Raum unter Rühren bei 40ºC solange aufbewahrt, bis die überstehende Flüssigkeit gesättigt war. Das spezifische Gewicht der Flüssigkeit betrug 1,3 oder mehr. Danach wurde eine wäßrige Lösung der Saccharose mit einem spezifischen Gewicht von 1,3 zu der Lösung gegeben, um ihr Volumen mittels sorgfältigen Rührens auf ungefähr 4 ml einzustellen. Das Teströhrchen wurde dann mit 50.000 UpM 2 Stunden lang zentrifugiert, woraufhin 3 ml der überstehenden saccharose-gesättigten Flüssigkeit gewonnen und mit ungefähr 20 ml destilliertem Wasser verdünnt wurden. Die verdünnte Lösung wurde mit 10000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, um die vorhandenen Mikroorganismen abzuscheiden. Der gesammelte Niederschlag wurde erneut in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert, um eine konzentrierte Flüssigkeit, die Bodenmikroorganismen enthält, herzustellen. Diese konzentrierte Flüssigkeit wurde mit 50 ml 4%igem Formalin fixiert und mit Ethidiumbromid angefärbt, das bei der Bestrahlung mit ultraviolettem Licht fluoreszierendes Licht aussendet. Nachdem die Lösung eine Stunde lang stehengelassen worden war, wurde sie sorgfältig gerührt und auf geeignete Weise (z. B. 100fach) verdünnt. Eine Probe wurde dann unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet, woraus hervorging, daß die Mikroorganismen als Individuen ohne Anordnung zu Anhäufungen suspendiert worden waren, und daß keine Bodenteilchen vorhanden waren. Die Anzahl der einzelnen Mikroorganismen wurde gezählt und lieferte das Ergebnis, daß aus 1 g (Masse des feuchten Materials) Boden 3 · 10&sup8; Bakterien gewonnen werden konnten. Fig. 1 ist eine Mikrofotografie der flüssigen Probe, in der Mikroorganismen A erkannt werden können, die aufgrund der hohen Dichte der Flüssigkeit nicht kollabierten. Außer den Mikroorganismen wurden nur einige wenige Mikroteilchen mit einer Größe von ungefähr 0,1 um gefunden, die durch den Bezugsbuchstaben B identifiziert wurden.

BEISPIEL 8

Isolierung der Mikroorganismen aus dem Boden mittels Zentrifugation und Abtrennung der DNA

1 ml der gleichen Bodensuspension wie in Beispiel 1 wurde in ein Teströhrchen eingebracht, gefolgt von 0,5 ml einer filtrierten Enzymlösung, die 40 mg der vorstehend erwähnten Cellulase pro ml und 100 mg (1000 U) der Protease enthielt. Die enzymhaltige Lösung wurde in einem wärmeregulierten Raum unter Rühren 2 Stunden lang bei 40ºC gehalten, woraufhin Saccharose auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 in die Mischung eingebracht wurde, um das spezifische Gewicht auf 1,3 einzustellen. Die resultierende Mischung wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde wie in Beispiel 1 entnommen, woraufhin die überstehende Flüssigkeit mit destilliertem Wasser verdünnt und zentrifugiert wurde, um den abgeschiedenen Mikroorganismus zu gewinnen. Der Niederschlag wurde in 500 ul einer 1%igen SDS-Lösung erneut suspendiert, die dann 1 Stunde lang bei 70ºC gehalten wurde, um die Mikroorganismen zu bakterialisieren (bacterialise). Die DNA wurde aus der resultierenden Flüssigkeit mittels Chloroform extrahiert, woraufhin die DNA mittels Ethanol aus dem Chloroform abgeschieden und gewonnen wurde. Die gewonnene DNA wurde in destilliertem Wasser gelöst, um eine Lösung herzustellen, die die in den Bodenmikroorganismen vorhandene DNA enthielt. Diese DNA-Lösung wurde einer Elektrophorese in einem Agarosegel unterzogen und ungefähr 5000 ng DNA, die eine Länge von 20 kbp oder mehr aufwies, wurde gewonnen.
Die gewonnene DNA wurde mit BamHI und EcoRI behandelt, bei denen es sich um typische Restriktionsenzyme handelt, und 2 Stunden lang bei 37ºC gehalten, woraufhin die Lösung einer Elektrophorese unterzogen wurde. Es wurde gefunden, daß die Länge der DNA um ungefähr 5 bis 10 kbp reduziert worden war, was darauf hindeutete, daß die Restriktionsenzyme die DNA wirkungsvoll zerlegt hatten. Die Bedingungen in dem Abbau- bzw. Zerlegungsschritt sind in der nachstehenden Tabelle 1 dargelegt:

TABELLE 1: Bedingungen für den Abbau der DNA

Wäßrige Lösung der gewonnenen DNA 2 ul
BamHI/EcoRI 1 ul
H. Pufferlösung für das Restriktionsenzym 1 ul
Destilliertes Wasser 6 ul
10 ul
Es ist deshalb ersichtlich, daß die aus den gewonnenen Bodenmikroorganismen extrahierte und mittels Zentrifugation und der Auswahl des spezifischen Gewichts gereinigte DNA für einen Abbau durch die Restriktionsenzyme ohne irgendwelche Reinigungsschritte ausreichend rein war.

BEISPIEL 9

Elektrophorese, gefolgt von einer DNA-Trennung

Sechs Teströhrchen mit Deckel wurden jeweils mit 6 ml der Bodensuspension von Beispiel 1 gefüllt, gefolgt von der zuvor beschriebenen filtrierten Lösung der Cellulase (Meji Cellulase TP). Die Teströhrchen wurden in einem wärmeregulierten Raum 2 Stunden lang bei 40ºC aufbewahrt, woraufhin die Bodensuspension in einen 250 ml-Elektrophorese-Tank (siehe Fig. 2) eingebracht wurde, der ungefähr 200 ml Pufferlösung mit der in Tabelle 2 gezeigten Zusammensetzung enthielt. Eine Elektrophorese wurde anschließend durch Anlegen einer direkten Spannung von 100 V (ungefähr 50 mA) an die Platinelektroden durchgeführt.

TABELLE 2: Zusammensetzung der Pufferlösung für die Elektrophorese

Tris 4,08 g
EDTA·2Na 0,74 g
Essigsäure 1,14 ml
H&sub2;O 1000 ml
4 Stunden später wurde deutlich, daß die Bodenteilchen sich in ausreichendem Maß abgeschieden hatten und die überstehende Flüssigkeit durchsichtig geworden war. 10 ml der Pufferlösung in der Nähe der positiven Platinelektrode wurden mittels einer Pipette entnommen. Die entnommene Probe wurde zentrifugiert und auf dem Boden des Zentrifugenröhrchens wurden abgeschiedene Mikroorganismen beobachtet. Dieser Niederschlag wurde entnommen und in ein Mikroröhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml eingebracht, woraufhin eine Lösung der Bodenmikroorganismen-DNA auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 hergestellt wurde. Die DNA-Lösung wurde einer Elektrophorese unter Verwendung eines Agarose-Gels unterzogen, woraufhin ungefähr 150 ng DNA, die eine Länge von 20 KbP oder mehr aufwies, gewonnen wurde. Die DNA wurde mit BamHI und EcORI auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 abgebaut und anschließend einer Elektrophorese unterzogen, woraufhin als Ergebnis gefunden wurde, daß die DNA abgebaut worden war und ihre Länge um 5 bis 20 KbP verkürzt worden war. Es ist deshalb ersichtlich, daß die Mikroorganismen mittels Elektrophorese gereinigt werden können, woraufhin sie gewonnen und die DNA daraus extrahiert werden kann, um eine Probe mit einer für den Abbau mit Restriktionsenzymen ausreichenden Reinheit ohne zusätzliche Reinigung zu erhalten.

VERGLEICHSBEISPIEL 5

Wiederholung ohne DNA-Reinigungsschritt

1 ml der gleichen Ölsuspension wie in Beispiel 1 wurde in ein Teströhrchen mit einem Deckel eingebracht, gefolgt von Cellulase (Meiji Cellulase TP), woraufhin die enzymhaltige Lösung in einem wärmeregulierten Raum unter Rühren bei 40ºC gehalten wurde. Das Teströhrchen wurde dann 30 Sekunden lang mit 5000 UpM zentrifugiert, um Bodenteilchen abzuscheiden, und 1,5 ml der überstehenden Flüssigkeit wurden entnommen und erneut 5 Minuten lang bei 1500 UpM zentrifugiert. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt, und in ein Mikroröhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml eingebracht, und eine DNA-Lösung der Bodenmikroorganismen wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 hergestellt. Diese DNA-Lösung wurde einer Elektrophorese auf einem Agarose-Gel unterzogen und ungefähr 150 ng DNA mit einer Länge von 20 KbP oder darüber wurden gewonnen. Ein Versuch die DNA mit BamHI und EcORI abzubauen, wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt und die abgebaute Lösung wurde einer Elektrophorese unterzogen. Es wurde jedoch gefunden, daß die abgebaute DNA beinahe die gleiche Länge wie die DNA vor dem Abbau aufwies, was darauf hindeutete, daß die Restriktionsenzyme nicht funktionierten. Aus dem Experiment geht hervor, daß selbst dort, wo ein Mikroorganismus unter Verwendung eines Enzyms in freie Individuen getrennt wird, die gewonnene DNA solange nicht von dem Restriktionsenzym abgebaut wird, solange Verunreinigungen nicht in ausreichendem Maße in dem Reinigungsschritt, z. B. mittels Extraktion in Chloroform und einer anschließenden erneuten Ausfällung, abgebaut wurden.

BEISPIEL 10

Verwendung alternativer Enzyme

Das Verfahren von Beispiel 8 wurde unter Verwendung der nachstehenden Enzymzubereitungen hergestellt:
(a) 500 ul (25000 U) einer flüssigen Enzymzubereitung, die hauptsächlich Amylase (Handelsname: Termamyl; von Novo Nordisk Bioindustry hergestellt) enthielt;
(b) Die vorstehend erwähnte Amylase in der angegebenen Menge zusammen mit 50 mg Cellulase;
(c) 50 mg eines Enzympulvers, das hauptsächlich Protease (Proteaseaktivität 500 U) enthielt, das unter der Handelsbezeichnung Protease A Amano, von Amano Pharmaceutical Co., Ltd. hergestellt, erhältlich ist;
(d) Eine Mischung aus Protease in der vorstehend beschriebenen Menge und Cellulase in der vorstehend beschriebenen Menge;
(e) 100 mg eines Enzympulvers, das hauptsächlich Glucuronidase enthält und unter der Handelsbezeichnung Abalone Aceton Powder verkauft wird; hergestellt von Sigma Chemical Co.; und
(f) Die vorstehend erwähnte Menge an Glucuronidase und die vorstehend erwähnte Menge an Amylase und/oder Protease.
Die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 8 wurden erhalten und insbesondere die Anzahl der getrennten einzelnen Mikroorganismen war in den Beispielen, in denen eine Mischung aus Enzymen verwendet wurde, hoch. Andererseits, wenn die Experimente in Abwesenheit der Enzyme oder unter Verwendung deaktivierter Enzyme wiederholt wurden, betrug die Anzahl der getrennten einzelnen Mikroorganismen nur 5 bis 10% derjenigen, von denen in den vorangegangenen Beispielen berichtet wurde.
In einer weiteren Reihe von Experimenten wurden die gleichen Enzyme oder Mischungen aus Enzymen zusammen mit Mikroorganismen verwendet, die an einem Zeolithen befestigt waren und mittels des in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrens erhalten worden waren, und die Experimente wurden sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit eines Enzyms durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß dann, wenn das Enzym vorhanden war, einzelne Mikroorganismen extrahiert worden waren und ihre Anzahl ungefähr das 100- bis 200fache der Anzahl betrug, die extrahiert wurde, wenn kein Enzym verwendet wurde. Dort, wo das Enzym vorhanden war, konnten die einzelnen Mikroorganismen rasch getrennt und gewonnen werden.

BEISPIEL 11

Ermittlung eines einzelnen Bakterientyps durch Antikörpermarkierung und Fluoreszenzzählung der markierten Bakterien

Eine Mischlösung aus einem Natriumphosphatpuffer, Boden und einem Enzym wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, woraufhin die Lösung 2 Stunden lang bei 40ºC in einem wärmeregulierten Raum geschüttelt wurde. Anschließend wurden 3 g Saccharose zu der Lösung gegeben, die gerührt wurde, bis die überstehende Flüssigkeit gesättigt worden war. Die Flüssigkeit wies ein spezifisches Gewicht von 1,3 oder darüber auf. Anschließend wurde unter sorgfältigem Rühren eine wäßrige Saccharoselösung mit einem spezifischen Gewicht von 1,3 zu der Originallösung gegeben, um ihr Volumen auf ungefähr 4 ml zu erhöhen. Das Teströhrchen, das die Lösung enthielt, wurde 2 Stunde lang mit 50.000 UpM zentrifugiert, woraufhin 3 ml der überstehenden, mit Saccharose gesättigten Flüssigkeit entnommen und mit 20 ml destilliertem Wasser verdünnt wurden. Die verdünnte Lösung wurde 10 Minuten lang mit 10.000 UpM zentrifugiert und der resultierende Niederschlag wurde gesammelt. Der Niederschlag wurde in 500 ul eines Mineralsalzmediums suspendiert. Eine Suspension der Bodenorganismen erfolgte durch ein erneutes Suspendieren des resultierenden Niederschlags in 500 ul des Mineralsalzmediums, das 1% Rinderserumalbumin, gepuffert mit Phosphorsäure, enthielt. Die Suspension wurde anschließend mit 0,5 ml einer Lösung behandelt, die 0,2 mg/ml eines Anti-P. Cepacia monoklonalen Antikörpers, der mit FITC markiert worden war, enthielt. Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei 0ºC gehalten, um eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattfinden zu lassen. Der Anti-P. Cepacia monoklonale Antikörper wurde durch die Auswahl einer Maus des KK01-Stammes (FERM BP-4235), das Immunisieren der Maus mittels herkömmlicher Verfahren, und das Verschmelzen der Antikörper erzeugenden Mauszellen erneut mittels herkömmlicher Verfahren erzeugt [(siehe: Japan J. Med. Bei. Biolo., 37, S. 151 bis 159 (1984)]. Der resultierende monoklonale Antikörper wurde mit FITC (die maximale Fluoreszenzwellenlänge beträgt 530 nm) durch Zugabe von FITC und des Antikörpers zu einer Carbonsäure-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 9,5 markiert, wobei ihm gestattet wurde, 1 Stunde zu reagieren, und anschließen wurde das freie FITC unter Verwendung einer Säule Sephadex G-25 (Eingetragenes Warenzeichen) entfernt (siehe "MENEKISEIKAGAKUKENKYUHO" [Immunity Biochemical Experimental Method], 1986, [herausgegeben von NIPPON SEIKAGAKUKAI (Society of Biochemistry), veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojinsha K. K.] S. 103 bis 105). Das Bindungsverhältnis von Fluoreszenzfarbstoff zu Antikörperprotein (F/P-Verhältnis) betrug 4,2.
Nach der Antikörperreaktion wurde 1 ml der Suspension 10 Minuten lang bei 4000 UpM zentrifugiert, woraufhin die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde. Anschließend wurde 1 ml mit Phosphat gepufferte Salzlösung, die 25 ug/ml Ethidiumbromid enthielt, zugegeben und der Mischung wurde es gestattet, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur zu stehen. Nach dieser Zeitdauer wurde die Flüssigkeit zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt. Dieser Reinigungsschritt wurde 3mal wiederholt, woraufhin die ausgefallenen Mikroorganismen erneut in 5 ml der mit Phosphat gepufferten Salzlösung suspendiert und auf das 10fache verdünnt wurden, um eine Meßprobe herzustellen. Die Probe wurde für eine Zeitdauer von 5 Sekunden Ultraschallwellen ausgesetzt, um die Teilchen darin zu dispergieren, woraufhin die Anzahl der Bakterien in der Probe mittels eines FACS-CAN-Zählers, der von Beckton & Dickinson Co., Ltd. hergestellt worden war, gezählt wurde. Die Art und Weise, wie das Gerät eingestellt wird, geht aus den Fig. 3(a) bis 3(c) hervor. Fig. 3(a) ist eine Graphik, in der die Vörwärtsstreuung gegen die Seitenstreuung aufgetragen ist. Fig. 3(b) ist ein Histogramm des Fluoreszenzlichtes FL1 bei 530 nm, das der Fluoreszenz des FITC in dem markierten Antikörper entspricht. FL3 entspricht der Fluoreszenz des als Anfärbemittels für die Bakterien verwendeten Ethidiumbromids und beträgt 650 nm. Es wurde der Probe gestattet, 1 Minute lang mit einer Geschwindigkeit von 12 ul pro Minute durch den Zähler zu fließen, und es wurden Beobachtungen durchgeführt, als die Teilchen den Zähler durchliefen. Die Signale FL3 stammten sowohl von den angefärbten Bakterien als auch von Verunreinigungen, die keine Nukleinsäuren enthielten, wie Proteine, Lipide oder Mikropartikel, wie vorhandener Staub,. Um den Hintergrund zu minimieren, wurde ein Auslöser oder ein Durchlaß in dem Kanal angeordnet, der dem Fluoreszenzlicht FL3 des Ethidiumbromid- Färbemittels zugeordnet ist, und dies ist als Pfeil in Fig. 3(c) angegeben. Gleichzeitig ermittelt der für die FL1- Fluoreszenz bei 530 nm empfindliche Kanal das getrennte Fluoreszenzlicht, das FITC entspricht, und dieses Signal wird mit einer gewünschten Breite des Signalpegels, wie in Fig. 3(b) gezeigt, durchgelassen. Die Breite des Durchlasses wird so eingestellt, daß das Fluoreszenzlicht mit der Stärke, wie es aus den FITC markierten Bakterien austritt, nachgewiesen werden kann. Impulse, die durch den Zähler während eines 1minütigen Zeitintervalls erzeugt werden, repräsentieren die Gesamtzahl der gefundenen Bakterien. Als Ergebnis wurde ermittelt, daß in 1 g Boden die Gesamtzahl der Bakterien 3,7 · 10&sup8; und die geschätzte Anzahl der P. Cepacia 4,1 · 10&sup6; betrug.

BEISPIEL 12

Ermittlung von zwei Arten von Bakterien mittels Antikörpermarkierung und Fluoreszenzzählung

Sechs Teströhrchen mit Deckel wurden bereitgestellt und 6 ml der gleichen Bodensuspension wie in Beispiel 10 wurden in jedes der 6 Teströhrchen eingebracht. Die Cellulaseenzymlösung von Beispiel 1 wurde in jedes Teströhrchen eingebracht, und sie wurden unter Rühren 2 Stunden lang in einem wärmeregulierten Raum bei 40ºC gehalten, wie vorstehend beschrieben. Die resultierende Bodensuspension wurde in einen 250 ml-Elektrophorese-Tank eingebracht, der 200 ml der Pufferlösung mit der in der vorstehenden Tabelle 2 gezeigten Zusammensetzung enthielt, und die Elektrophorese erfolgte unter Anlegen einer Gleichspannung von 100 Volt (ungefähr 50 mA) an die Platinelektroden. Nach 4 Stunden war klar zu erkennen, daß sich die Bodenteilchen in ausreichendem Maße abgeschieden hatten und die überstehende Flüssigkeit transparent geworden war. 10 ml der Pufferlösung, die sich in Nachbarschaft zu der positiven Platinelektrode befanden, wurden mittels einer Pipette entnommen und die Probe wurde zentrifugiert, um einen Niederschlag zu erhalten, der dann erneut in 500 ul einer Flüssigkeit suspendiert wurde, die eine 1%ige phosphat-gepufferte Salzlösung und 1% Rinderserumalbumin enthielt.
Ein mit PE markierter Anti-P. putida monoklonaler Antikörper wurde durch Mischen von PE (von PolySciences Company hergestellt) mit N-Succinimid-3-(2-pyridyldithio)propionsäure- Thiolgruppen und dem Anti-P. putida monoklonalen Antikörper, mit dem das thiolierte PE koppelte, hergestellt. Das F/P-Verhältnis betrug 1,7. Der als Ausgangsmaterial verwendete Anti- P. Cepacia monoklonale Antikörper wurde mittels des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 11 beschrieben hergestellt.
0,5 ml einer Lösung, die mit FITC markierten Anti-P. Cepacia monoklonalen Antikörper (0,2 g/ml wie in Beispiel 11 verwendet) enthielt, und 0,5 ml einer Lösung, die den mit PE markierten Anti-P. putida monoklonalen Antikörper (maximale Fluoreszenzwellenlänge 580 nm; 0,2 mg/ml) enthielt, wurde zu der Suspension gegeben und es wurde eine 1stündige Antigen- Antikörper-Reaktion bei 0ºC zugelassen. Anschließend wurde die resultierende Flüssigkeit 10 Minuten lang mit 4.000 UpM zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt. 1 ml einer PBS-Lösung, die 25 ug/ml Ethidiumbromid enthielt, wurde zu der überstehenden Flüssigkeit gegeben und es wurde eine zweistündige Umsetzung bei Raumtemperatur zugelassen, woraufhin die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde. Die abgeschiedenen Mikroorganismen wurden mit 5 ml PBS gewaschen und 3mal zentrifugiert, woraufhin der gereinigte Niederschlag erneut in 5 ml PBS suspendiert und auf das 10fache verdünnt wurde, um eine Meßprobe zu liefern. Die festen Materialien in der Probe wurden durch einen 5sekündigen Einsatz von Ultraschallwellen dispergiert, woraufhin die Anzahl der Bakterien in der Probe mittels eines FAS-CAN- Zählers unter Verwendung von 3 Kanälen gezählt wurde, wobei einer davon die Fluoreszenz maß, die von P. Cepacia-Bakterien stammte, die mit FITC (FL1: 530 + 15 nm) markiert worden waren, ein zweiter davon die P. putida bacteria-Bakterien zählte, die mit PE (FL2: 585 + 21 nm) markiert worden waren, und ein dritter davon (FL3) das Fluoreszenzlicht von dem Ethidiumbromid (FL3: 650 nm oder mehr) ermittelte. Der Probe wurde es gestattet, 1 Minute lang mit einer Geschwindigkeit von 12 ul/min zu fließen, wobei die Impulse in den entsprechenden Kanälen FL1 und FL2 gezählt wurden, um eine Angabe der Anzahl der beiden unterschiedlichen Arten von ermittelten Bakterien zu liefern. Dadurch wurde festgestellt, daß die Gesamtzahl der in 1 g Boden gewonnenen Bakterien 3,5 · 10&sup8; und die Population des P. Cepacia 4,0 · 10&sup6; betrug, wohingegen diejenige von P. putida 6,9 · 10&sup6; betrug.

VERGLEICHSBEISPIEL 6

Wiederholung ohne Enzyme

10 g der Bodenprobe wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, um eine Bodensuspension herzustellen, woraufhin die Suspension unter Verwendung eines Filters mit Löchern mit einem Durchmesser von 15 um filtriert wurde, um große suspendierte Bodenteilchen zu entfernen. Es erfolgte keine Enzymbehandlung oder Trennung und Gewinnung von Mikroorganismen. 50 ul des Filtrats wurden 10 Minuten lang mit 10.000 UpM zentrifugiert und der Niederschlag wurde gesammelt. Eine mit Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS), die 1% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, wurde zu dem Niederschlag gegeben, um ein Volumen von 500 ul zu liefern, woraufhin der Niederschlag erneut suspendiert wurde, um eine Boden enthaltende Flüssigkeit herzustellen. Die Flüssigkeit wurde mit Anti-P. Cepacia-Antikörpern behandelt, und beiden wurde es gestattet, zu reagieren. Eine Probe, die mit Ethidiumbromid angefärbt worden war, wurde hergestellt. Danach wurde ein Meßverfahren durchgeführt, in dem alle Schritte wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt wurden. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Gesamtzahl der gewonnenen Bakterien 4,1 · 10&sup6; betrug und es wurden 4,4 · 10&sup4; P. Cepacia ermittelt. Die Menge der ermittelten Bakterien betrug ungefähr ein Hundertstel derjenigen in Beispiel 1, was darauf zurückgeführt wird, daß beinahe alle davon an die Bodenteilchen haftend zurückblieben, oder aneinander hafteten und deshalb nicht gewonnen wurden.
Die vorstehenden Beispiele zeigen, daß ein Enzym verwendet werden kann, um das unlösliche organische Polymer, das als Sekret von dem Mikroorganismus abgegeben wird, zu zersetzen, wobei das Polymer dazu führt, daß die Mikroorganismen entweder an einem Träger oder an einem anderen Mikroorganismus haften. Die Zersetzung des Polymers, das als Bindemittel fungiert, ermöglicht es, daß einzelne Mikroorganismen getrennt und sehr leicht in kurzer Zeit und mit hohen Ausbeuten und hoher Reinheit aus einer Suspension oder aus einer Flüssigkeit in einem Bioreaktor gewonnen werden können, ohne die Notwendigkeit, daß ihre speziellen Züchtungsbedingungen bekannt sein müssen oder daß bestimmte Züchtungsschritte durchgeführt werden müssen. Die Polymer-Bindemittelverbindung, die den Mikroorganismus an dem Träger hält, oder die Mikroorganismen zusammenhält, kann in Abhängigkeit von den Mikroorganismenarten einen Bereich von Polysacchariden oder unlöslichen Proteinen umfassen. Die Trennwirkung kann durch die Auswahl eines Enzyms, oder einer Mischung von Enzymen, die die in Frage kommenden bestimmten Bindemittelverbindungen zersetzen können, verbessert werden. Solche Enzyme können aus Cellulase, Hemicellulase, Glucuronidase, Amilase, Protease und Pectinase ausgewählt sein. Das Verfahren der Erfindung kann für Boden oder ein Material angewandt werden, das beispielsweise aus einem Bioreaktor gewonnen wurde. Es ermöglicht, daß nützliche Mikroorganismen, die an einem Träger oder an andere Mikroorganismen haften, die im Boden oder auf dem Bioreaktor auftreten können, in einzelne Mikroorganismen getrennt werden können, die gewonnen werden können.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von einzelnen Mikroorganismen aus einem mikroorganischen System, in dem einzelne Mikroorganismen mittels eines natürlichen Klebstoffs, der von den einzelnen Mikroorganismen abgesondert wird, an einem Träger oder an andere einzelne Mikroorganismen gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren den Schritt der Behandlung des mikroorganischen Systems mit mindestens einem Enzym umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Enzymen, die Polysaccharide abbauen, Enzymen, die Proteine abbauen, und Enzymen, die Pectin abbauen, besteht, wodurch die einzelnen Mikroorganismen von dem Träger oder den anderen einzelnen Mikroorganismen abgetrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Cellulase, Hemicellulase, Glucuronidase, Amylase, Protease oder Pectinase oder eine Mischung davon umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das mikroorganische System eine Bodensuspension, eine Suspension von belebtem Schlamm oder eine Suspension von Schlamm aus Flüssen, Seen oder Meeren umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das mikroorganische System eine Reaktorflüssigkeit, die einen Träger zum Tragen der Mikroorganismen enthält, in einem Bioreaktor umfaßt.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die getrennten Mikroorganismen gereinigt und gewonnen werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen durch die Bildung einer Suspension, die die getrennten Mikroorganismen enthält und ein ähnliches spezifisches Gewicht wie das der Mikroorganismen aufweist, und das Zentrifugieren der Suspension und das Trennen der Suspension durch die Nutzung des Unterschieds des spezifischen Gewichts zwischen dem Dispersionsmedium und den zu trennenden Teilchen in eine überstehende Flüssigkeit, die die Mikroorganismen enthält, und einen Bodenkörper gereinigt und gewonnen werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Prozeß zum Reinigen und Gewinnen des Mikroorganismus die nachstehenden Schritte umfaßt:

Einstellen des spezifischen Gewichts der enzym-behandelten Suspension auf den gleichen Wert, den das spezifische Gewicht des Mikroorganismus aufweist, oder auf einen höheren Wert als den, den das spezifische Gewicht des Mikroorganismus aufweist, oder auf einen kleineren Wert als den, den das spezifische Gewicht des Trägers aufweist;

Zentrifugieren der Suspension, deren spezifisches Gewicht so eingestellt wurde, daß der Träger abgeschieden und eine überstehende Flüssigkeit erhalten wird, in der die Mikroorganismen suspendiert sind; und

Gewinnen des Mikroorganismus aus der überstehenden Flüssigkeit.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Gewicht der Suspension so eingestellt wird, daß es in einem Bereich von 1,2 bis 1,5 liegt.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Gewicht der Suspension durch Hinzufügen eines gelösten Stoffes eingestellt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der gelöste Stoff Saccharose umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der gelöste Stoff Cäsiumchlorid umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus mittels seiner elektrophoretischen Beweglichkeit gereinigt wird und gewonnen wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt der Reinigung und Gewinnung des Mikroorganismus unter Nutzung seiner elektrophoretischen Beweglichkeit die nachstehenden Schritte umfaßt:

Anlegen einer Gleichspannung an die Suspension des Mikroorganismus, nachdem sie mit dem Enzym behandelt worden ist; und

Gewinnen der Flüssigkeit, die den Mikroorganismus enthält, der in die Nähe der positiven und/oder der negativen Elektrode bewegt worden ist.

14. Verfahren zum Zählen der Anzahl der in einer Probe vorhandenen einzelnen Mikroorganismen, das die Schritte der Gewinnung einer Flüssigkeit, die die einzelnen Mikroorganismen enthält, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 getrennt wurden, und des Zählens der Anzahl der in der Flüssigkeit vorhandenen Mikroorganismen umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, in dem die Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 6 bis 13 getrennt, gereinigt und gewonnen wurden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, in dem das Zählen unter Anwendung eines Plattenverdünnungsverfahrens oder eines Färbeverfahrens erfolgt.

17. Verfahren zur Gewinnung einer Nucleinsäure, das das Extrahieren und das Gewinnen der Nucleinsäure eines Mikroorganismus aus einer Flüssigkeit umfaßt, die den Mikroorganismus enthält, der mittels des Verfahrens, wie es in einem der Ansprüche 6 bis 13 definiert ist, gewonnen wurde.

18. Verfahren zum Zählen der Verteilung eines bestimmten Mikroorganismus in einem mikroorganischen System, das eine Vielzahl von Arten von Mikroorganismen einschließt, in der mindestens ein bestimmter Mikroorganismus vorhanden ist, der an Teilchen, die in dem System auftreten, gebunden ist, oder mit anderen Mikroorganismen zusammenklebt, wobei das Verfahren die nachstehenden Schritte umfaßt:

Erhalt einer Suspension getrennter Mikroorganismen durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und Gewinnen der getrennten Mikroorganismen aus der Suspension;

Binden eines Antikörpers, der mit einem fluoreszierten Farbstoff markiert ist, an den bestimmten Mikroorganismus;

Binden einer fluoreszierenden Verbindung, deren maximale Fluoreszenz-Wellenlänge sich von der Wellenlänge des fluoreszierenden Farbstoffs unterscheidet, an die vorhandenen Mikroorganismen; und

Messen der Fluoreszenz, die von dem fluoreszierenden Farbstoff und der fluoreszierenden Verbindung emittiert wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, in dem die Fluoreszenz von dem fluoreszierenden Farbstoff und der fluoreszierenden Verbindung mittels der nachstehenden Maßnahmen gemessen werden:

Bildung eines Suspensionsstroms und Ermittlung der Fluoreszenz von dem Farbstoff und der Fluoreszenz von der Verbindung in dem Strom für jedes Teilchen, das den Strom passiert, und

statistisches Verarbeiten der ermittelten Daten, um die Verteilungsinformation zu gewinnen.

20. Verfahren nach Anspruch 20, in dem ein Auslöser oder Schaltelement so eingestellt wurde, daß er/es auf die Fluoreszenz von der fluoreszierenden Verbindung anspricht, um das Signal nur dann durchzulassen, wenn es eine bestimmte Schwelle überschreitet.

21. Verfahren nach Anspruch 18, Anspruch 19 oder Anspruch 20, das ferner den Schritt der Zufuhr von Schwingungsenergie oder Scherenergie zu der Suspension umfaßt, bevor die Fluoreszenz von dem fluoreszierenden Farbstoff und der fluoreszierenden Verbindung gemessen werden, um Gruppen von Mikroorganismen, die durch den Antikörper zusammenkleben, zu trennen.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, in dem die maximale Fluoreszenz-Wellenlänge des fluoreszierenden Farbstoffes um 20 nm oder mehr von der maximalen Fluoreszenz- Wellenlänge der fluoreszierenden Verbindung getrennt ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, in dem die Fluoreszenzverbindung ein Farbstoff ist, der eine Bindung mit der Nucleinsäure der Mikroorganismen eingeht.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, in dem der Schritt der Markierung mit dem Antikörper das Binden einer Vielzahl verschiedener Antikörper, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert sind, an eine Vielzahl verschiedener Arten von Mikroorganismen umfaßt.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, in dem die Antikörperbindung eine direkte ist.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, in dem die Antikörperbindung eine indirekte ist.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 26, in dem das mikroorganische System Boden, belebten Schlamm oder Meerschlamm aus frischem Wasser, Gezeiten- oder Salzwasser umfaßt.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 27, in dem das mikroorganische System eine Reaktionsmischung aus einem Bioreaktor umfaßt, der einen Träger in Suspension enthält, der einen Mikroorganismus trägt.